CN108220399B - 一种基于通用探针技术的荧光定量pcr方法 - Google Patents

一种基于通用探针技术的荧光定量pcr方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及荧光定量PCR领域，提供了一种基于通用探针技术的荧光定量PCR方法，该方法既有Taqman探针特异性高的优点，又降低了开发成本，具有良好的推广价值。两种通用探针技术是本发明的核心部分，端通用探针技术的探针为双标记探针，探针与上游组合特异引物的特定序列互补，中间特异引物起到类似Taqman探针特异性的作用，并引发探针的水解和信号释放。中间通用探针技术的探针为3’端单标记荧光探针，探针与中间组合特异引物的特定序列互补，中间组合特异引物起到类似Taqman探针特异性的作用，同时该引物5’端标记有淬灭基团，当该引物在PCR反应中水解后，淬灭基团游离，探针的信号即可释放。

Description

一种基于通用探针技术的荧光定量PCR方法
技术领域
本发明涉及荧光定量PCR领域，特别是涉及荧光探针技术的优化，利用一个或少数几个通用探针联合中间特异引物，即可做到荧光定量PCR反应的特异性，并降低了实验成本。
背景技术
荧光定量PCR是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新的核酸定量实验技术，它的原理是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，通过对产物量的实时分析，最终能够对模板的初始浓度，核酸种类、基因突变类型等信息作出准确的判定。目前，荧光定量PCR在生物学研究及个体化医学基因检测领域有着广泛的应用，其最特异的核酸标记方法为荧光探针标记法，即Taqman探针法，该标记方法特异性强，实验结果稳定性好，不易产生假阳性，是荧光定量PCR用于医学基因检测的首选核酸标记方法。然而Taqman探针合成费用较高，当检测多个位点或基因时，需要合成多条Taqman探针，将增加大量的实验成本，这也是限制荧光定量PCR技术临床推广的主要原因。本专利就针对这一现象，设计了两种类型的通用探针，分别结合于上游引物或中间特异引物上，所有荧光定量PCR实验都可利用已有的通用探针进行，这将大大降低研发和生产成本，有利于荧光定量PCR在医学基因检测领域的应用。
发明内容
本发明提供了一种基于通用探针技术的荧光定量PCR方法，提出了两种通用探针技术，分别是端通用探针技术和中间通用探针技术，以用于不同检测目的的需要。
两种通用探针技术是本发明的核心部分，它既包含了基于Taqman探针荧光定量PCR特异性高的优点，又弥补了其开发成本高、反应条件优化复杂等的缺陷。端通用探针技术所涉及的探针为双标记探针，原理同于Taqman探针，只是把探针结合的序列转移至上游组合特异引物上，同时设计一条中间特异引物，该引物起到类似Taqman探针特异性的作用，由这条特异引物引发端通用探针的水解，以实现荧光信号的释放。中间通用探针技术所涉及的探针为3’端单标记荧光探针，探针结合的序列在中间组合特异引物上，中间组合特异引物具有与模板结合的特异序列，起到类似Taqman探针特异性的作用，同时该引物5’端标记有淬灭基团，当该引物在PCR反应中水解后，淬灭基团游离，与之结合的通用探针荧光信号即可释放。
基于端通用探针的荧光定量PCR反应分为两个阶段，第一个阶段为普通PCR反应，用到的引物为上游组合特异引物和下游特异引物，反应条件与一般PCR反应相同；第二阶段为荧光定量PCR反应，模板是经核酸外切酶纯化或琼脂糖凝胶纯化后的第一阶段的PCR产物，引物有中间特异引物，上游通用引物和端通用探针，反应条件同于一般荧光定量PCR反应。
基于端通用探针的荧光定量PCR反应可以用于基因突变的检测，在该应用中，上游组合特异引物的3’端的碱基可以按照ARMS-PCR引物的设计方法进行设计，这样在第一阶段的同一个反应体系中，可以混合同一位点两种及两种以上的基于ARMS方法设计的上游组合特异引物，也可以混合不同位点的两种及两种以上的基于ARMS方法设计的上游组合特异引物，不同位点的上游组合特异引物的通用探针反向互补序列也各不相同，以便在第二阶段中利用反应管中特定的中间特异引物引发不同通用探针水解产生的荧光信号进行突变位点的鉴别，实现在一管中鉴别同一位点基因突变的基因型及突变比例，提高了ARMS-PCR方法的准确度和灵敏度。
基于端通用探针的荧光定量PCR反应可以用于基因拷贝数的检测，包括DNA和RNA拷贝数检测，通过控制第一阶段反应的循环数，在指数增长期，如15～25个循环周期，纯化回收扩增产物，进行第二阶段荧光定量PCR反应，即可得到基因拷贝数的鉴定。
基于端通用探针的荧光定量PCR反应还可以用于开发基于平面反应的荧光定量芯片技术，即在玻璃或硅芯片上，按一定密度固定中间特异引物，引物种类可以达数百、数千甚至数万种以上，以用于高通量基因突变、基因拷贝数及基因测序等检测项目上，反应过程依旧分为两个阶段，首先是普通PCR扩增或建库反应，然后是基于平面的荧光定量PCR反应，只是信号采集系统需要重新设计与制造；其中用于测序建库的接头不同于目前二代测序反应，该接头与上游组合特异引物相似，由三部分组成，5’端为15个碱基左右的与上游通用引物相同的序列，中间为20个碱基左右的与端通用探针反向互补的序列(相当于index)，3’端为与模板DNA平末端相连接的一段通用序列，长度在5个碱基左右
基于中间通用探针的荧光定量PCR反应只有一个阶段，其引物组合为，上游特异引物，下游特异引物，中间组合特异引物及中间通用探针，反应条件同于一般荧光定量PCR反应。
基于中间通用探针的荧光定量PCR可用于基因突变的检测，上游特异引物的3’端的碱基可以按照ARMS-PCR引物的设计方法进行设计，这样在一个反应体系中可以混合不同突变位点的单一上游特异引物(即野生型位点一个反应管，突变型位点一个反应管)，不同突变位点的上游特异引物的通用探针反向互补序列各不相同，以便在利用不同序列不同荧光的通用探针进行突变位点的鉴别。
基于中间通用探针的荧光定量PCR可用于基因拷贝数的检测，包括DNA和RNA拷贝数检测，与普通荧光定量PCR反应相似，进行35～50个循环反应，适时进行荧光信号的采集，即可得到基因拷贝数的鉴定；
基于中间通用探针的荧光定量PCR还可用于病原微生物定性与定量的鉴定，包括细菌、病毒、真菌及原生生物等病原的检测，过程与普通荧光定量PCR反应相似，进行35～50个循环反应，适时进行荧光信号的采集，即可得到检测结果，该过程极易受到气溶胶的污染，因此环境控制尤为重要。
附图说明
图1为基于端通用探针的荧光定量PCR反应过程示意图；
图2为利用端通用探针荧光定量PCR方法检测rs671多态位点的结果图；
图3为基于中间通用探针的荧光定量PCR反应过程示意图；
图4为利用中间通用探针荧光定量PCR方法检测大肠杆菌核酸含量的结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进一步说明。
实施例1：
利用端通用探针荧光定量PCR方法检测ALDH2的多态位点rs671[A/G]，该实施例用到的基于端通用探针的荧光定量PCR反应过程如图1所示，反应分为两个阶段。
第一个阶段是针对多态位点的普通PCR扩增，根据模板序列1设计引物，上游组合特异引物2的序列分为野生型和突变型两种，见表1SEQ ID NO.1和2，下游特异引物3序列见表1SEQ ID NO.3。20μL反应体系，包括TaKaRa Taq HS(5U/μl)0.2μL，10×PCR Buffer 2μL，dNTP Mixture(各2.5mM)1μL，体系中三种引物按1:1:2的摩尔比进行混合，每种引物终浓度在200～500nM之间，三种经一代测序已知基因型的人基因组为模板(AA，GG，AG)，模板终浓度为0.5ng/μL，去离子水补足至20μL，反应条件为95℃5min；95℃20sec，62℃30sec，72℃20sec共30个循环，反应产物4经2％琼脂糖凝胶电泳跑胶并纯化回收后，用200μL超纯水稀释，作为第二阶段的模板5备用。
第二阶段反应的引物为，上游通用引物6，通用探针7(与野生型位点上游引物互补的标记为FAM/BHQ1，与突变型位点上游引物互补的标记为Cy3/BHQ1)，中间特异引物8，分别见表1SEQ ID NO.4～7。20μL反应体系，包括TaKaRa Taq HS(5U/μl)0.2μL，10×PCRBuffer2μL，dNTP Mixture(各2.5mM)1μL，每种引物终浓度在200～500nM，探针终浓度在100～200nM，模板为第一阶段纯化产物2μL，去离子水补足至20μL，反应条件为95℃5min；95℃20sec，62℃30sec，72℃20sec+信号采集共40个循环。当有目的基因扩增时，探针被水解，标记的荧光基团10与淬灭基团9游离，经相应波长激发光激发后，荧光基团10的光信号即可被检测器检测到。
结果见图2所示，上左图仅出现FAM信号的扩增曲线，说明该基因型为纯合野生型AA，上右图仅出现Cy3信号的扩增曲线，说明该基因型为纯合突变型GG，下左图同时出现FAM与Cy3信号的扩增曲线，且Ct值基本一致，说明该基因型为杂合型AG，下右图为超纯水为模板的结果，既没有FAM信号也没有Cy3的信号，说明该实验结果可靠。利用该方法，可以在一个管中鉴定同一位点的野生型与突变型基因类型，且不易产生假阳性结果，在鉴定基因多态位点方面，比现有ARMS方法具有明显的优越性。
实施例2：
利用中间通用探针荧光定量PCR方法检测大肠杆菌核酸的含量，该实施例用到的基于中间通用探针的荧光定量PCR反应过程如图3所示。根据大肠杆菌基因组特异序列1设计引物，上游特异引物12的序列见表1SEQ ID NO.8，下游特异引物3序列见表1SEQ IDNO.9，中间组合特异引物14序列见表1SEQ ID NO.10，中间通用探针13序列见表1SEQ IDNO.11。20μL反应体系中四种引物按2:2:1:1的摩尔比进行混合，每种引物终浓度在100～400nM之间，模板终浓度分别为1ng/20μL、0.1ng/20μL、0.01ng/20μL、0.001ng/20μL，并加一管阴性对照，其余试剂还有TaKaRa Taq HS(5U/μl)0.2μL，10×PCR Buffer 2μL，dNTPMixture(各2.5mM)1μL，去离子水补足至20μL。反应条件为95℃5min；95℃20sec，65℃30sec，72℃20sec+信号采集共40个循环。当有目的基因扩增时，中间组合特异引物被水解，淬灭基团9游离，探针荧光基团10的光信号即可被检测器检测到。
表1引物序列表
Figure GDA0004115852800000041
结果见图4所示，出现4条FAM信号的扩增曲线，Ct值具有明显的浓度梯度依赖性，且阴性对照管没有出现假阳性扩增曲线，说明该方法能有效检测大肠杆菌核酸的含量。该方法，只对中间组合特异引物进行单端标记，探针为通用探针，节省了实验费用，同时闭管操作，不易产生气溶胶污染，在鉴定病原微生物方面，具有较好的应用前景。

Claims (1)

1.一种基于端通用探针技术的荧光定量PCR方法，其特征在于：
基于端通用探针的荧光定量PCR反应分为两个阶段，第一个阶段为普通PCR反应，引物包括，上游组合特异引物，下游特异引物，反应条件同于一般PCR反应；第二阶段为荧光定量PCR反应，利用第一阶段的PCR纯化产物作为模板，引物有中间特异引物，上游通用引物和端通用探针，反应条件同于一般荧光定量PCR反应；
所述上游组合特异引物，该引物分为三部分，5’端为15个碱基左右的与上游通用引物相同的序列，中间为20个碱基左右的与端通用探针反向互补的序列，3’端为与模板DNA结合的上游特异引物序列；所述上游组合特异引物序列如SEQ ID NO:1-2所示；
所述下游特异引物，该引物同于一般PCR引物，是与模板DNA结合的下游特异引物序列，与上游组合特异引物搭配，完成第一阶段PCR反应，产物长度在70-2000bp之间为佳；所述下游特异引物序列如SEQ ID NO:3所示；
所述端通用探针，该通用探针基于Taqman探针原理，一端为荧光基团，另一端为淬灭基团，其序列与上游组合引物的一段序列反向互补，以使得在第二阶段由中间特异引物引发水解而产生荧光；所述端通用探针序列如SEQ ID NO:5-6所示；
所述上游通用引物，是一段15个碱基左右的固定序列的引物，与上游组合特异引物的5’端序列相同，作为第二阶段的上游引物与中间特异引物配合完成第二阶段的PCR反应；所述上游通用引物序列如SEQ ID NO:4所示。
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