CN110923314B - 一组检测SNP位点rs9263726的引物、crRNA序列及其应用 - Google Patents

一组检测SNP位点rs9263726的引物、crRNA序列及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测HLA‑B*5801基因SNP位点rs9263726的体系，包括检测SNP位点rs9263726的引物，以及2条crRNA序列、两种不同的CRISPR/cas13蛋白体系和带有不同荧光标记的报告探针。通过本发明的体系检测HLA‑B*5801基因SNP位点rs9263726的突变类型，操作简便，每个检测样品只需单管进行；反应全程在37℃左右的温度下进行，不需要如PCR扩增那样需要精细的温控元件及复杂的温度变化，适合基层单位用相对廉价的即时检测设备进行检测；与PCR技术相比速度更快，可在30min内可有明显的检测信号；检测结果特异性高，可轻易地判断等位基因类型。

Description

一组检测SNP位点rs9263726的引物、crRNA序列及其应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一组检测PSORS1C1基因多态位点rs9263726的扩增引物及其应用。
背景技术
别嘌呤醇是治疗痛风的一线药物，是目前惟一的黄嘌呤氧化酶抑制剂。该药可引起严重副反应，包括Stevens-John综合征(SJS)及中毒性表皮坏死症(TEN)。HLA-B*5801等位基因与别嘌呤醇引发的SJS或TEN的强相关性首先由中国台湾学者在汉族人群中发现，并被泰国、新加坡和中国多个研究小组在汉族人群中证实，汉族人中HLA-B*5801等位基因频率为9-15％(呈地域差异)。研究表明，HLA-B*5801等位基因与别嘌呤醇引发的严重皮炎副反应呈现很强的相关性，尤其在汉族人中高达100％，几乎所有副反应的患者都是HLA-B*5801的携带者，而别嘌呤醇耐受者中只有15％左右的HLA-B*5801携带者，检测HLA-B*5801等位基因可以预防别嘌呤醇引发的SJS或TEN。因此在使用别嘌呤醇前，应对严重过敏反应的高危人群，建议进行HLA-B*5801等位基因检测。然而，由于HLA-B*5801等位基因较为复杂，直接对其检测很不方便。有研究进一步证实，对于亚洲人种，包括中国和日本，PSORS1C1基因的SNP位点(rs9263726)与HLA-B*5801等位基因存在直接相关性，且相关性达到100％，因此，可以检测与HLA-B*5801等位基因关联的SNP位点来反映携带者是否携带HLA-B*5801等位基因。中国发明专利CN106701934A(可视化HLA B*5801基因分型检测试剂盒)公开了一种通过检测PSORS1C1基因的SNP位点(rs9263726)的方法，其技术要点为：第一阶段：模板的PCR扩增：通过引物对、扩增酶的参与，实现对目标模板的高灵敏扩增；第二阶段：通过探针和内切酶的参与，实现对目标模板向信号分子的高效率转化；第三阶段：通过纳米金探针实现对信号分子的高分辨识别。其技术手段本质是PCR扩增和探针杂交技术相结合，检测时间仍较长。且通过此技术手段判断rs9263726野生型和突变型仍需要双管进行。另外PCR扩增需要精密的控温组件，设备成本高，无法随到随检，很大程度限制了该技术的广泛应用。
近年来，一种发展起来的以成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clusteredregularly interspaced short palindromic repeat sequences，CRISPR)为特征的基因检测技术发展起来。CRISPR是发现于细菌和古细菌的调控型RNA，含与特定基因互补序列的CRISPR和CRISPR相关蛋白(Cas)形成的复合体具有针对特定基因的内切酶效应，是近年来十分热门和有前景的基因编辑工具。在CRISPR/Cas系统中，Cas蛋白在CrRNA(CRISPR-derivedRNA，其基本构成为：锚定序列+向导序列)的引导下，识别目标序列后启动“附带切割”活性。一般的CRISPR/Cas系统用于DNA靶序列切割，2016年张锋研究组首次描述了RNA靶向CRISPR酶，现在称为Cas13a，可以用于切割细菌细胞中的特殊RNA序列。Cas13a与DNA靶向CRISPR酶(如Cas9和Cpf1)不同，这种酶在切割其靶向RNA后可保持活性，而且可能表现“旁切割”(collateral cleavage)，继续切割其它非靶向RNA。这意味着Cas13a检测到其靶标后可攻击所有RNA。这种活性可以被用作一个自动放大检测器，作为一种低成本的诊断已成为一种可能。到目前为止，共发现来源于三种不同种属来具有的旁切割效应的Cas13蛋白，包括：PsmCas13b、LwaCas13a和Cca13b，而且它们之间还有不同的旁切割碱基序列的偏好性。这也意味着不同的CRISPR/Cas13可以联合使用，实现单管多重基因检测。研究结果表明：CRISPR/Cas13和RPA扩增技术(等温扩增技术)结合起来的新系统能够以极低浓度检测单RNA和单DNA分子，可将检测的灵敏度提高到埃摩尔(aM)。
以CRISPR/Cas13为核心的基因SNP位点检测有两种方法，第一种是双管检测模式，即每管含相对特异的一种CrRNA，通过两管间信号的相对强弱判断SNP具体碱基；另一种是通过同一管添加不同种类的Cas13蛋白和对应针对不同的靶SNP序列的CrRNA，利用不同CRISPR/Cas13之间旁切割碱基序列的偏好性实现单管多重SNP位点检测。为了增强检测特异性，现有做法是CrRNA的SPACER区(即靶ssRNA序列互补决定区，一般为28位)的第3个碱基位点(从靠近direct repeat区的一端为开始方向)为SNP位点(突变位点)外，第5个碱基位点为非互补错配对点(容错点)。这样的方法在双管检测时显示一定的特异性，但某些情况下，特别是在杂合体存在的情况下检测不同等位基因(allele)差异仍不显著，很难直观地判断检测样品等位基因类型。而第二种方法主要用于不同基因的多重检测，但在SNP位点(野生型/突变型)上很难实施。除了因不同SNP位点靶ssRNA间高度同源性对特异响应产生干扰外，不同Cas13间旁激活响应强度亦有明显区别；另外，不同Cas13蛋白的旁切割碱基序列的偏好性或特异性并非绝对，会非特异切割亦降低响应的特异性。这几个方面的叠加使操作者很难直观地通过不同萤光的信号强度来判断检测品具体的SNP类型。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一组检测HLA-B*5801基因SNP位点rs9263726的引物，以及一种检测HLA-B*5801基因SNP位点rs9263726的体系。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明提供了一组检测HLA-B*5801基因SNP位点rs9263726的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO：3～4所示。
本发明还提供了一种检测HLA-B*5801基因SNP位点rs9263726的体系，包括检测SNP位点rs9263726的引物，以及crRNA序列和两种不同的CRISPR/cas13蛋白体系和带有不同荧光标记的报告探针。
优选地，所述crRNA序列包括锚定序列和向导序列；所述锚定序列与CRISPR/cas13蛋白体系中的cas13蛋白结合；所述向导序列与rs9263726靶向序列片段特异结合。
优选地，所述rs9263726靶向序列片段核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示的。
优选地，所述引物序列如SEQ ID NO：3～4所示。
优选地，所述crRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示。
优选地，所述crRNA序列的锚定序列核苷酸序列如SEQ ID NO：7和9所示。
优选地，所述crRNA序列的向导序列如SEQ ID NO：8和10所示。
优选地，所述如SEQ ID NO：7的crRNA序列的锚定序列与LwaCas13a蛋白结合，如SEQ ID NO：8的crRNA序列的向导序列与如SEQ ID NO：1所示的rs9263726靶向序列片段结合；所述如SEQ ID NO：9的crRNA序列的锚定序列与PsmCas13b蛋白结合，如SEQ ID NO：10的crRNA序列的向导序列与如SEQ ID NO：2所示的rs9263726靶向序列片段结合。
本发明在RPA等温扩增靶基因序列并转录成ssRNA检测底物的基础上，利用两种不同的CRISPR/cas13蛋白体系，通过标记不同萤光基团标记的单链RNA检测探针的激发萤光强度比对，检测患者基因组DNA中的SNP位点(rs9263726)单核苷酸多态性位点，从而判断服用别嘌呤醇药物的临床携带者发生SJS/TEN的风险。其中，其中一种crRNA所述锚定序列(direct repeat area)与LwaCas13a蛋白结合，向导序列(spacer area)与所述rs9263726野生型(G)靶向序列片段特异结合反应；另一种crRNA所述锚定序列与PsmCas13b蛋白结合，向导序列与所述rs9263726突变型位点(A)靶向序列片段特异结合反应。
本发明检测的特异性通过不同的crRNA锚定序列组合实现。LwaCas13acrRNA锚定序列(spacer area)共23位，其中SNP互补位点位于第3位，第5个为非靶序列互补的错配点；PsmCas13b crRNA锚定序列共25位，其中SNP互补位点位于第3位，第7个为非靶序列互补的错配点。
本发明实现的效果为：1、操作简便，每个检测样品只需单管进行；2、反应全程在37℃左右的温度下进行，不需要如PCR扩增那样需要精细的温控元件及复杂的温度变化，非常适合基层单位用相对廉价的即时检测(POCT)设备进行检测；3、与PCR技术相比速度更快，可在30min内可有明显的检测信号；4、检测结果特异性高，可轻易地判断等位基因类型(包括杂合体)，从而在更短的时间内轻易判断服用别嘌呤醇药物的临床携带者发生SJS/TEN的风险。
本发明的有益效果：1、本发明操作简便，每个检测样品只需单管进行；2、反应全程在37℃左右的温度下进行，不需要如PCR扩增那样需要精细的温控元件及复杂的温度变化，非常适合基层单位用相对廉价的即时检测(POCT)设备进行检测；3、与PCR技术相比速度更快，可在30min内可有明显的检测信号；4、检测结果特异性高，可轻易地判断等位基因类型(包括杂合体)，从而在更短的时间内轻易判断服用别嘌呤醇药物的临床携带者发生SJS/TEN的风险。
附图说明
图1为实施例4检测rs9263726SNP位点灵敏度和特异性验证结果示意图。
图2为实施例5检测临床样品rs9263726SNP位点检测结果示意图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1合成RPA引物
根据HLA-B*5801基因SNP位点rs9263726邻近序列设计特异性RPA扩增引物，具体下文描述。RPA引物用无RNA酶纯化水溶解成母液(24μM)，分装后贮存于-20℃备用。
(1)rs9263726野生型片段RPA扩增模板
(2)rs9263726突变型RPA扩增模板
注：方框为SNP位点；下划线为RPA引物互补序列
(3)委托广州博徕斯公司根据上述序列合成RPA引物，具体引物序列如表1所示。合成的RPA引物无RNA酶纯化水溶解成母液(24μM)，分装后贮存于-20℃备用。
表1：扩增SNP位点rs9263726的RPA引物序列
实施例2、合成crRNA
(1)委托广州博徕斯公司根据上述的序列合成crRNA，crRNAs序列信息见表2。合成的crRNA用无RNA酶纯化水溶解成10X母液(225nM)，分装后贮存于-20℃备用。
表2：合成的CrRNAs序列
(2)CrRNAs与靶RNA的碱基配对信息如下：
实施例3、合成本发明Cas13酶使用的ssRNA报告探针：委托广州博徕斯合成两种ssRNA报告探针。序列具体信息见表3。合成的ssRNA报告探针分别用无RNA酶纯化水溶解成母液(1.25μM)，分装后贮存于-20℃备用。
表3：Cas13蛋白酶使用的报告探针具体序列信息
实施例4一步法检测rs9263726SNP位点的灵敏度和特异性验证，具体操作如下：
1、建立反应体系，见表4：
表4:反应体系的组成(50μL/管)
注:待检样本临用时加入
2、检测荧光值信号
分别合成并提取含实施例1所示的rs9263726SNP位点基因片段的两种质粒(野生型简称G质粒、突变型简称A质粒)：委托苏州泓迅分别合成上述两种基因片段(基因5’端添加入EcoR I酶切位点，在3’端添加Hind III酶切位点片段)，双酶切后克隆至同样双酶切处理的pMD18-T质粒中，转入DH5α克隆菌扩增，并用碱裂解法提取并纯化。
分别稀释G质粒和A质粒浓度为10e4copy/ul、10e3copy/ul、10e2copy/ul、10e1copy/ul、10e0copy/ul共5个梯度作为模拟纯合子标准待检样本。同等稀释浓度的G质粒和A质粒等体积混合，作为杂合子标准待检样本。同时配制空白质粒样品(10e4copy/ul)作为阴性对照，检测样本新型如表5。取各检测样品1μL加入上述反应体系中，使用ABI7500荧光检测仪，在37℃的条件下于30min内各管检测反应产生的FAM、HEX萤光信号。
表5：纯合子、杂合子标准待检样本信息
No. 样品 拷贝数/ul
1 G 1e4
2 G 1e3
3 G 1e2
4 G 1e1
5 G 1e0
6 A 1e4
7 A 1e3
8 A 1e2
9 A 1e1
10 A 1e0
11 G/A 5e3/5e3
12 G/A 5e2/5e2
13 G/A 5e1/5e1
14 G/A 5e0/5e0
15 negative 1e4
16 blank 0
3、结果
结果如图1所示，图中纵坐标为荧光信号强度。实验结果显示，使用本发明的检测试剂无论是rs9263726SNP位点纯合体或杂合子，都能特异性检出。检测灵敏度达到10copy/反应管。
实施例5一步法检测临床样品rs9263726SNP位点检测结果
rs9263726纯合子和杂合子临床样品来源于广州百旺生物科技有限公司，样品为宿主DNA抽提物，DNA浓度约为50ng/ml。按实施例2的方法检测，结果见图2。
结果显示按本发明方法配制的反应试剂可特异性检测出rs9263726SNP位点纯合体或杂合子临床样品。其中，A/A纯合体和A/G杂合体代表具有与HLA-B*5801基因关联的风险。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州白云山拜迪生物医药有限公司
<120> 一组检测SNP位点rs9263726的引物、crRNA序列及其应用
<130> 12.26
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 125
<212> DNA
<213> 合成
<400> 1
ctttacaagg accccagctc cttaacacag atcccagctc cgaggaaact cgtccccccc 60
acgttaatcc tgaccgactt tgccacatgg agccagcaaa ccatttctgg tgagagccaa 120
atgca 125
<210> 2
<211> 125
<212> DNA
<213> 合成
<400> 2
ctttacaagg accccagctc cttaacacag atcccagctc cgaggaaact catccccccc 60
acgttaatcc tgaccgactt tgccacatgg agccagcaaa ccatttctgg tgagagccaa 120
atgca 125
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 合成
<400> 3
gaaattaata cgactcacta tagggcttta caaggacccc agctccttaa caca 54
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成
<400> 4
tgcatttggc tctcaccaga aatggtttg 29
<210> 5
<211> 59
<212> RNA
<213> 合成
<400> 5
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacgacg uguuuccucg gagcuggga 59
<210> 6
<211> 61
<212> RNA
<213> 合成
<400> 6
gucaggauua acguggggcg gaugaguugu agaagcuuau cguuuggaua gguaugacaa 60
c 61
<210> 7
<211> 23
<212> RNA
<213> 合成
<400> 7
gacguguuuc cucggagcug gga 23
<210> 8
<211> 36
<212> RNA
<213> 合成
<400> 8
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaac 36
<210> 9
<211> 25
<212> RNA
<213> 合成
<400> 9
gucaggauua acguggggcg gauga 25
<210> 10
<211> 36
<212> RNA
<213> 合成
<400> 10
guuguagaag cuuaucguuu ggauagguau gacaac 36

Claims (2)

1.一种检测HLA-B*5801基因SNP位点rs9263726的体系，其特征在于，包括检测SNP位点rs9263726的引物，以及2条crRNA序列、两种不同的CRISPR/cas13蛋白体系和带有不同荧光标记的报告探针；所述crRNA序列包括锚定序列和向导序列；所述锚定序列与CRISPR/cas13蛋白体系中的cas13蛋白结合；所述向导序列与rs9263726靶向序列片段结合；
所述引物序列如SEQ ID NO：3~4所示；所述rs9263726靶向序列片段核苷酸序列如SEQID NO：1~2所示；
所述crRNA序列的锚定序列和导向序列分别如SEQ ID NO：7和8所示，或者所述crRNA序列的锚定序列和导向序列分别如SEQ ID NO：9和10所示；
所述如SEQ ID NO：7的crRNA序列的锚定序列与LwaCas13a蛋白结合，如SEQ ID NO：8的crRNA序列的向导序列与如SEQ ID NO：1所示的rs9263726靶向序列片段结合；
所述如SEQ ID NO：9的crRNA序列的锚定序列与PsmCas13b蛋白结合，如SEQ ID NO：10的crRNA序列的向导序列与如SEQ ID NO：2所示的rs9263726靶向序列片段结合；
所述LwaCas13a蛋白使用的报告探针为：/5’-FAM/rUrUrUrUrU/3’-IABkFQ/；
所述PsmCas13b蛋白使用的报告探针为：/5’-HEX/rArU/3’-IABkFQ/。
2.如权利要求1所述的检测HLA-B*5801基因SNP位点rs9263726的体系，其特征在于，所述crRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：5~6所示。
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