CN109609551A

CN109609551A - 一种利用CRISPR/Cas9+AAV制备通用型CAR-T细胞的方法

Info

Publication number: CN109609551A
Application number: CN201811602586.3A
Authority: CN
Inventors: 邱壮伟; 丘力功; 符美娟; 李润明; 倪世明; 郝宇
Original assignee: GUANGZHOU BAIYUNSHAN BAIDI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU BAIYUNSHAN BAIDI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2019-04-12

Abstract

本发明涉及一种利用CRISPR/Cas9+AAV制备通用型CAR‑T细胞的方法，属于免疫细胞治疗领域。本发明利用CRISPR/Cas9+AAV敲除免疫检查点PD‑1、人类白细胞抗原(HLA)以及TCR，多基因敲除制备通用型CAR‑T细胞，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行精确基因敲除，同时与腺相关病毒(AAV)融合运用，代替慢病毒实现精确基因敲入，避免慢病毒随机整合潜在的风险。本发明的方法可以实现多靶点基因敲入和敲除，构建通用型CAR‑T细胞用于异体治疗，解决传统CAR‑T细胞治疗存在的慢病毒随机插入性突变风险、自体CAR‑T的设计及培养制备成本过高、制备周期长，细胞数量及扩增能力不足等问题。

Description

一种利用CRISPR/Cas9+AAV制备通用型CAR-T细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种利用CRISPR/Cas9+AAV制备通用型CAR-T细胞的方法，属于免疫细胞治疗领域。

背景技术

嵌合型抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)是通过基因改造后获得靶抗原单克隆抗体单链可变区(scFv)的T细胞。CAR-T通过抗原抗体结合的原理特异性识别肿瘤细胞表面的抗原，因此无主要组织相容性复合体(MHC)限制性，还可以避免因肿瘤细胞MHC下调或丢失导致的免疫逃逸。而且通过在嵌合基因设计时增加共刺激分子信号，可增强CAR-T细胞的肿瘤杀伤活性。经过20多年的发展，CAR-T的设计已经越来越完善，手段也越来越多。

据统计，国内近几年B淋巴细胞白血病和淋巴瘤的年新发病率约为10万人，绝大多数异常增生的B淋巴细胞表面都表达CD19分子，抗CD19构建的CAR-T对血液系统恶性肿瘤展现出显著疗效，如对晚期复发难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的完全缓解率(CR)可达到90％，对慢性淋巴细胞白血病(CLL)和部分B细胞淋巴瘤的CR达到50％以上。

但目前CAR-T技术普遍存在以下问题：(1)需要更长的时间观察病毒载体是否会带来有害的插入性突变：CAR序列是CAR-T细胞最核心的部件，目前制造CAR-T主要采用的方法是利用慢病毒作为载体将CAR序列随机整合到T细胞基因组中，从而实现外源CAR序列的内源化；但由于慢病毒整合的位点具有随机性，存在一定的随机整合潜在风险，导致转导后T细胞的癌变、随机表达不相关的基因或者是渐渐不表达抗原受体等；(2)CAR-T的设计及培养制备成本过高：由于每个病人的CAR-T都需要个性化制备，治疗费用高达几十万美元，同时也无法采用统一的标准进行质量监控；(3)自体CAR-T的制备需要3-4周的时间，这对于“时间就是生命”的癌症患者来说是非常长的等待期；(4)很多患者在经历了多轮治疗后，自体T细胞活性很差或者扩增能力有限，这直接影响了CAR-T的疗效，甚至有些患者根本无法获得能扩增制备CAR-T的细胞。

腺相关病毒(AAV)的优势：转染效率高，很多细胞都能达到近99％；只作为转染载体，不随机整合，安全性高；一般不需要助转剂，避免助转剂对宿主细胞的损伤。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种利用CRISPR/Cas9+AAV制备通用型CAR-T细胞的方法，该方法不仅可以精确编辑基因序列，提高产品的安全性和可控性，又可实现异体治疗、产业化生产和统一质量控制标准，有效降低治疗时间成本和资金成本，促进CAR-T细胞治疗的运用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种利用CRISPR/Cas9+AAV制备通用型CAR-T细胞的方法，包括以下步骤：

(1)采用磁珠分离获得高纯度的CD3+T细胞，进行活化处理；

(2)利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，构建CAR表达载体；

(3)用腺相关病毒包装步骤(2)所得的CAR表达载体，扩增，得到携带CAR的腺相关病毒，并侵染T细胞；

(4)T细胞扩增培养，得CAR-T细胞。

本发明技术的工作原理是gRNA-tracrRNA/crRNA的gRNA通过碱基配对与T细胞的目的序列结合，tracrRNA/crRNA复合物引导核酸酶Cas9蛋白在目的序列靶位点剪切双链DNA；然后通过设计带有左右臂并含有CAR序列的腺相关病毒，利用左右臂与T细胞TRAC基因配对，并通过腺相关病毒将CAR整合到T细胞基因组中，同时实现免疫排斥反应相关基因敲除和CAR-T的基因敲入工作。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，基因编辑包括利用CRISPRgRNA/Cas9敲除T细胞的PD-1，利用CRISPR gRNA/Cas9敲除人类白细胞抗原(HLA)相关基因β2-microglobulin(B2M)，利用CRISPR gRNA/Cas9敲除细胞受体TCRα(TRAC)。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，所述CAR表达载体中携带的CAR基因包含KOZAC-scFv CD19 fmc63(19)-CD8a-CD28-CD137(4-1BB)-CD3zeta片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述KOZAC-scFv CD19 fmc63(19)-CD8a-CD28-CD137(4-1BB)-CD3zeta片段由KOZAC基因片段、scFv CD19 fmc63(19)基因片段、CD8a基因片段、CD28基因片段、CD137(4-1BB)基因片段、CD3zeta基因片段依次连接而成，所述KOZAC基因片段、scFv CD19 fmc63(19)基因片段、CD8a基因片段、CD28基因片段、CD137(4-1BB)基因片段、CD3zeta基因片段的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，腺相关病毒为腺相关病毒AAV6，侵染T细胞为将携带CAR的腺相关病毒通过同源整合到宿主T细胞TRAC基因位点。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，利用磁珠负筛法筛选出通用型的CAR-T细胞。

第二方面，本发明提供了上述制备方法制得的CAR-T细胞。

第三方面，本发明提供了上述CAR-T细胞在异体细胞治疗中的应用。

第四方面，本发明提供了上述CAR-T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明利用CRISPR/Cas9+AAV敲除免疫检查点PD-1、人类白细胞抗原(HLA)以及TCR，多基因敲除制备通用型CAR-T细胞，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行精确基因敲除，同时与腺相关病毒(AAV)融合运用，代替慢病毒实现精确基因敲入，避免慢病毒随机整合潜在的风险；

(2)本发明的方法可以实现多靶点基因敲入和敲除，构建通用型CAR-T细胞用于异体治疗，解决传统CAR-T细胞治疗存在的慢病毒随机插入性突变风险、自体CAR-T的设计及培养制备成本过高、制备周期长，细胞数量及扩增能力不足等问题；

(3)本发明的方法可以精确编辑基因序列，提高产品的安全性和可控性，又可实现异体治疗、产业化生产和统一质量控制标准，有效降低治疗时间成本和资金成本，促进CAR-T细胞治疗的运用。

附图说明

图1为实施例2中的电泳检测图。

图2为实施例2中的细胞毒性检测统计图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1通用型CD19 CAR-T的制备

(1)通用型CD19 CAR-T的制备流程：

分离纯化CD3+T细胞→静置培养→活化→CRISPR/Cas基因编辑→腺相关病毒侵染T细胞→磁珠分选去除TCRαβ阳性的细胞→分装保存。

(2)选取功能区基因序列：通过NCBI(National Center for BiotechnologyInformation，美国国立生物技术信息中心)查找KOZAC、scFv CD19 fmc63(19)、CD8A、CD28、CD137(4-1BB)、CD247(CD3-zeta)的功能区编码序列。

(3)全基因合成CAR基因序列，包括：BstXⅠ酶切位点+TRAC左同源臂+KOZAC+CD19的单克隆抗体fmc63(19)的单链可变区+铰链+跨膜区CD8a+共刺激分子CD137(4-1BB)+胞内信号传导区CD247(CD3-zeta)+终止密码子+TRAC右同源臂+BamHⅠ酶切位点。

(4)通过酶切位点接入载体pAAV-MCS，完成表达载体质粒构建。

(5)腺相关病毒包装、扩增、侵染：采用转染试剂Express In将上述表达载体质粒与辅助质粒pAAV-RC\pAAV-Helper转入293T细胞进行包装、扩增，24h后收集腺相关病毒颗粒，-80℃保存备用。

(6)gRNA设计：以PD-1、TRAC、B2M基因的第一个外显子序列为设计对象，按照PAM原则，通过http://crispr.mit.edu网站设计gRNA，gRNA序列如下：

PD-1 gRNA sequence.5′-CGGCTTCCGTGTCACACAACTGCC-5′

3′-GCCGAAGGCACAGTGTGTTGACGG-5′

TRAC gRNA sequence.5′-GGGTGTCTATAGGTCTTGGGAC-3′

3′-CCCACAGATATCCAGAACCCTG-5′

B2M gRNA sequence.5′-GGCCACGGAGCGAGACATCTTT-3′

3′-CCGGTGCCTCGCTCTGTAGAAA-5′

Cas9 mRNA：SEQ ID NO:8。

(7)CD3+T细胞分离活化：抽取50ml全血，按1：1缓慢加入淋巴细胞分离液，400g离心20min，吸取第二层白色絮状层，经MidiMACS Starting Kit(LS)CD3+分选试剂盒分选，获得纯度大于95％的CD3+T细胞，培养24小时后加入20iu/ml的IL，1:1000加入T CellTransAct，37℃5％CO₂连续培养4天后进行基因编辑工作。

(8)CRISPR/Cas基因编辑技术：采用Lipofectamine CRISPRMAX转染试剂盒的方法，将分别带有PD-1\HLA\TCR引导序列的gRNA和Cas9 mRNA转入T细胞(5μg RNA/3×10⁶细胞)，7℃5％CO₂培养4h。

(9)CAR序列融合：带有目的质粒的腺病毒载体侵染(8)中的T细胞，7℃5％CO₂培养3天，通过TRAC的左右臂将CAR序列整合到T细胞的TCRα中，利用其表达系统表达和递呈CAR，完成通用型CAR-T的改造。

实施例2质量检测

(1)错配酶法(Surveyor法)检测CRISPR/Cas9活性或突变效率，评估基因编辑成功率。

DNA提取与PCR扩增：提取基因编辑后的T细胞DNA，进行PCR扩增，分别以PD-1、TRAC、B2M gRNA作为引物，

扩增条件：94℃预变性10min，94℃变性30秒，63℃退火20秒，72℃延伸1min，扩增3～5个循环，最后72℃延伸7min，PCR产物4℃保存备用。

DNA杂交：未编辑的T细胞DNA扩增产物与待测样本扩增产物等体积混合，95℃变性5min，然后以每4秒钟下降0.1℃的速度逐渐降温至25℃。

SURVEYOR酶切：DNA杂交形成的同源双链或异源双链600ng作为底物与SURVEYOR酶在下列反应体系中孵育：20mM Tris-HCl，pH7.4，25mM KCl，10mM MgCl2，600ng DNAsubstrate，1 ul SURVEYOR Nuclease Enhancer W，1 ul SURVEYOR Nuclease W。反应液，总反应体积60ul，42℃水浴28 min后加入6ul终止液混匀，置-20℃保存。

电泳检测：1.2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切后条带分布情况如图1所示，其中，M表示mark，1表示PD-1未编辑，2表示PD-1编辑，3表示TRAC未编辑，4表示TRAC编辑，5表示B2M未编辑，6表示B2M编辑。未编辑的T细胞DNA经过PCR扩增后，未形成错配的异源双链，错配核酸内切酶未能将其剪切，故电泳条带为一条母带；而经过基因编辑后的T细胞DNA能在特定位点DNA序列发生变异，在杂交过程中，变异的DNA链会与未编辑的DNA链形成错配的异源双链，错配核酸内切酶识别突变位点并将其剪切，故电泳为一条母带及两条剪切后条带。由图1可知，本发明的CRISPR/Cas9基因编辑方法能够实现3个特异基因位点的编辑，编辑效率符合预期。

(2)杀伤功能和细胞毒性检测

PD-1(-)TRAC(-)B2M(-)CAR-T细胞、CD19 CAR-T细胞、T细胞、空白对照与Daudi细胞共培养24h，监测细胞表面CD107a，用以评估CAR-T细胞对CD19+细胞的杀伤功能。同时通过ELSA检测细胞分泌IFNγ来反应CAR-T CD19的细胞毒性，结果如图2所示。由图2可知，PD-1(-)TRAC(-)B2M(-)CAR-T细胞与传统慢病毒制备CAR-T细胞的细胞毒性没有明显差异。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州白云山拜迪生物医药有限公司

<120> 一种利用CRISPR/Cas9+AAV制备通用型CAR-T细胞的方法

<130> 20181220

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1597

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

accauggatg gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga 60

cagagtcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca 120

gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg 180

agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa 240

cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac 300

gttcggaggg gggactaagt tggaaataac acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat 360

cttcccacca cagagcatcc agtaatggct ccacctctgg atccggcaag cccggatctg 420

gcgagggatc caccaagggc gaggtgaaac tgcaggagtc aggacctggc ctggtggcgc 480

cctcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta cccgactatg gtgtaagctg 540

gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga gtaatatggg gtagtgaaac 600

cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc atcaaggaca actccaagag 660

ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac acagccattt actactgtgc 720

caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt 780

caccgtctcc tcagcgaagc ccaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggccgg 840

gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg 900

gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt 960

ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttaca ggagtaagag 1020

gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg 1080

caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaaacgggg 1140

cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca 1200

agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag 1260

agtgaagttc agcaggagcg cagagccccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta 1320

taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg 1380

ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga 1440

actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg 1500

gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta 1560

cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 1597

<210> 2

<211> 7

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

accaugg 7

<210> 3

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggactaagt tggaaataac acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 360

tccagtaatg gctccacctc tggatccggc aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag 420

ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc 480

gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag 540

cctccacgaa agggtctgga gtggctggga gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat 600

aattcagctc tcaaatccag actgaccatc atcaaggaca actccaagag ccaagttttc 660

ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac acagccattt actactgtgc caaacattat 720

tactacggtg gtagctatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 780

tca 783

<210> 4

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 60

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 120

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 180

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tac 213

<210> 5

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 6

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 7

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agagtgaagt tcagcaggag cgcagagccc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacaagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatggaggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 8

<211> 4047

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgaaaagcg aaaaaaaata ttatatcgga ttggatgtag gtactaatag tgtaggatgg 60

gctgtgactg acgaattcta taatattctt agagccaaag gaaaagattt gtggggagta 120

agattatttg aaaaagcaga cactgcagca aacacaagaa tatttagaag tggtagaaga 180

agaaacgaca gaaaaggtat gcgtcttcaa attttgagag aaatttttga agatgaaatc 240

aaaaaggttg acaaagactt ctatgacaga cttgatgaaa gcaaattctg ggctgaagac 300

aagaaagtat ctgggaaata ttcgttattt aatgataaaa atttcagcga caagcaatat 360

tttgaaaagt ttcctactat ttttcatctt agaaaatatt taatggaaga acatggaaaa 420

gtagacatta gatactattt tctagctatc aatcaaatga tgaaaagaag gggacatttt 480

ctaatagatg gtcagatttc tcacgttaca gatgataaac cattaaaaga acaacttatt 540

ctattaataa atgatttatt aaaaatcgaa ttagaagaag agcttatgga ttcgatattt 600

gaaattttgg cggatgtgaa cgagaaaaga acagacaaga aaaacaatct aaaagagctt 660

ataaaaggac aagattttaa taaacaagaa ggtaacatcc taaactcgat ttttgaatca 720

atagttactg gtaaagcaaa aataaaaaat ataatttcag atgaagacat tcttgaaaaa 780

ataaaggaag ataacaagga agatttcgtt cttacaggag atagctacga ggaaaatctc 840

caatattttg aggaagtttt acaagaaaac ataacattgt ttaacacact taaatcaaca 900

tatgattttt taatccttca atctatttta aaaggtaaga gcacactttc tgatgcacaa 960

gtcgaacgat acgatgaaca taaaaaagac ctcgaaatac ttaaaaaagt aataaaaaaa 1020

tacgatgaag atggaaaatt gttcaagcaa gtattcaagg aagataatgg aaatggatat 1080

gtttcatata ttggatatta tttgaacaaa aacaaaaaga ttaccgcaaa gaagaaaata 1140

tcaaatattg aatttacaaa atacgttaaa ggaattcttg aaaaacaatg cgactgtgaa 1200

gatgaagatg ttaagtattt attggggaaa atagaacaag aaaactttct attaaaacaa 1260

atatcatcca taaattcggt tattccacat caaattcacc tttttgaatt agataaaata 1320

ttggaaaact tagccaaaaa ctaccctagc tttaataata agaaggaaga atttacaaaa 1380

atagaaaaga tcagaaaaac atttacattt aggattccat attatgttgg accattaaat 1440

gattatcaca aaaacaatgg cggaaatgct tggatattca gaaataaagg cgaaaaaata 1500

agaccatgga attttgaaaa aatagttgat cttcataaaa gtgaagaaga atttatcaaa 1560

agaatgctaa atcaatgcac ttatcttcca gaagagacag ttcttcctaa atcttctatt 1620

ctttattcag aatatatggt gctaaatgaa ttgaataatt tgaggattaa tggaaagcca 1680

ctagataccg atgttaagtt gaaattaatt gaagaattat tcaagaaaaa gacaaaagtc 1740

actctcaaat cgatcagaga ttatatggta aggaataact ttgcagataa agaagacttt 1800

gataattcag agaaaaactt ggaaatagca tccaatatga aatcatatat tgattttaac 1860

aatatattag aagacaagtt tgacgtagaa atggtggaag atctcattga gaaaattaca 1920

attcatacgg gaaataagaa acttttgaaa aaatacatcg aggaaactta tcccgattta 1980

tcaagttctc aaattcaaaa aattatcaac cttaaataca aagattgggg aagattatca 2040

agaaaattat tagacggaat aaaaggaaca aaaaaagaaa cagaaaagac tgatactgta 2100

attaatttct tgagaaattc aagtgacaat ttgatgcaaa taattggaag ccaaaattac 2160

agctttaatg aatatattga taagttaagg aaaaaatata ttcctcaaga aataagttat 2220

gaagtggttg aaaatcttta cgtatctcca tctgtaaaaa agatgatatg gcaagttata 2280

agagttacag aagaaatcac aaaggttatg ggatatgacc cggataaaat cttcatagaa 2340

atggcaaaat ctgaagagga aaaaaagacg acaatttcta gaaaaaataa attactagac 2400

ctatataagg cgataaaaaa agatgaaaga gatagtcaat atgaaaagct attaacaggg 2460

ttgaataaat tagacgatag cgatcttaga agcagaaaac tttatcttta ctacactcaa 2520

atgggtagag atatgtacac tggcgaaaag attgacctgg ataaattatt cgattctaca 2580

cactacgata aagaccacat aatacctcaa agtatgaaaa aagatgattc gataataaac 2640

aacttggtat tagtaaataa aaatgcaaac caaaccacaa aaggcaacat ataccctgta 2700

ccatccagta taagaaacaa tccaaagatt tacaattact ggaagtattt gatggaaaaa 2760

gagttcatca gcaaagaaaa atacaataga ttaataagaa atacaccact aacaaatgaa 2820

gaacttggcg gattcatcaa cagacaactt gtagaaacaa gacaatcaac aaaagcaatc 2880

aaagaattat ttgaaaagtt ctaccaaaaa tcaaaaataa tacctgtaaa agcaagtctt 2940

gcaagtgatt tgagaaaaga catgaatacc cttaaatcca gagaagtaaa tgaccttcac 3000

catgctcacg atgcgttttt gaatattgta gcaggagatg tgtggaatcg agagttcaca 3060

tcaaatccaa taaattatgt caaagaaaac agagaaggtg acaaggtaaa atattcgtta 3120

agcaaagatt ttacaagacc tcgtaaatcc aaaggaaaag ttatctggac acctgaaaaa 3180

ggtagaaaat tgattgtaga tacattgaat aaaccatcag ttctaatcag caatgaaagt 3240

catgtaaaaa aaggagagtt attcaacgct accattgcag ggaaaaagga ttacaagaaa 3300

ggtaaaatat atcttccact aaaaaaagac gatagattac aagatgtatc gaaatatgga 3360

ggatataagg ctataaatgg agcgttcttt ttcttggtag agcatactaa aagcaagaaa 3420

agaataagaa gcatagaatt atttccgtta catttgctta gtaaatttta tgaagataaa 3480

aatacagtat tagattatgc gataaatgta ttgcaattac aagatccaaa gataataata 3540

gacaaaatta attatcgtac agaaataatt atagataatt ttagttattt aatatccact 3600

aaatcgaatg atggtagtat aactgttaaa ccaaatgagc aaatgtattg gagagttgat 3660

gaaatttcga atttgaaaaa aatagaaaat aaatacaaaa aagatgccat attaacagaa 3720

gaggatagaa aaattatgga gagttatatt gataaaatct atcaacaatt caaggcagga 3780

aaatacaaga atagacgcac tactgataca ataatagaaa aatatgaaat aatcgatcta 3840

gacactctag ataataaaca attataccaa ttactggtag cttttatttc actttcatat 3900

aaaacatcaa ataatgcagt ggactttact gtaattggac taggtactga atgtggaaag 3960

ccaagaatta cgaatttacc tgacaacaca tatctagtat ataaatcaat aacaggaata 4020

tatgaaaaga ggataagaat aaaataa 4047

Claims

1.一种利用CRISPR/Cas9+AAV制备通用型CAR-T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用磁珠分离获得高纯度的CD3+T细胞，进行活化处理；

(2)利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，构建CAR表达载体；

(4)T细胞扩增培养，得CAR-T细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，基因编辑包括利用CRISPRgRNA/Cas9敲除T细胞的PD-1，利用CRISPR gRNA/Cas9敲除人类白细胞抗原相关基因β2-microglobulin，利用CRISPR gRNA/Cas9敲除细胞受体TCRα。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述CAR表达载体中携带的CAR基因包含KOZAC-scFv CD19 fmc63(19)-CD8a-CD28-CD137(4-1BB)-CD3zeta片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述KOZAC-scFv CD19 fmc63(19)-CD8a-CD28-CD137(4-1BB)-CD3zeta片段由KOZAC基因片段、scFv CD19 fmc63(19)基因片段、CD8a基因片段、CD28基因片段、CD137(4-1BB)基因片段、CD3zeta基因片段依次连接而成，所述KOZAC基因片段、scFv CD19 fmc63(19)基因片段、CD8a基因片段、CD28基因片段、CD137(4-1BB)基因片段、CD3zeta基因片段的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，腺相关病毒为腺相关病毒AAV6，侵染T细胞为将携带CAR的腺相关病毒通过同源整合到宿主T细胞TRAC基因位点。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，利用磁珠负筛法筛选出通用型的CAR-T细胞。

6.如权利要求1～5任一项所述的制备方法制得的CAR-T细胞。

7.如权利要求6所述的CAR-T细胞在异体细胞治疗中的应用。

8.如权利要求6所述的CAR-T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。