JPH0284186A - プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質をコードするポリデオキシリボヌクレオチド、それを含むベクター及びそれを含む形質転換体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は人間のプラスミノーゲンアクチベーター遺伝子
に関するデオキシリポ核ｌ！ｌ！（ＤＮＡ　）セグメン
ｌ提供するものである。このＤＮＡ部分をプラスミドベ
クターに組入れるとこのベクターは次いでバクテリアま
たは他の微生物にとり込ませることができる。次いでこ
のバクテリアを培養して人間のウロキナーゼの性質を有
するプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質を製造する
ことができる。

静脈および動脈の凝血、肺塞栓、心臓内の血栓および組
織塞栓などの急性血栓症候群は処理の困難なものである
。

閉塞自体のための現在の医学的治療には抗血液凝固が含
まれる。現在の医学的アプローチはその基本的辿程を停
止させ、そして血液の誇れを回復して血管の閉塞または
組織の破壊の程度を限定するための通常の生理学機構に
依存しＣいる。血栓溶解作用または血栓溶解の治療は不
快な血栓を溶解させるための手段としてかなり興味ある
ものといえる。

抗血液凝固と血栓溶解治療との双方を使用することによ
って、医学的実施は血栓を迅速に溶解してその再発を防
ぐ手段をもつことになるであろう。最近、血栓溶解治療
への数種のアプローチが観察されており、その一つは天
然に産するｍ＃ｔｗ分解酵素系（ｆｌｂｒｉｎｏｌｙｔ
ｉｅ　　ｅｎｚｙｒｎｅｓｙｓｔｅｍ　）　の活性剤の
組織内注入によるものである。広範な研究の行われ六こ
のような試剤はウロキナーゼである。

ウロキナーゼはプラスミノーゲンからプラスミンへの転
化を通して活性な血栓溶解剤である。プラスミノーゲン
は天然に産するプラズマ前駆体であり、このものは活性
剤の存在下、線維素（ｆｉｂｒｉｎ）を加水分解しうる
蛋白分解酵素たるプラスミンに転化する。ウロキナーゼ
は構造未知の複雑な蛋白質であり、人尿中に痕跡ｍ：見
出される。ウロキナーゼは有力な血栓溶解剤であり、血
液中に自然に依存する素よりも遥かに多ｔを注射すると
血栓溶解全促進する。ウロキナーゼＶ′ｉ、１９５１年
にはじめて記載され、その後人尿からのウロキナーゼの
分離および精製のための方法が開発された。ウロキナー
ゼの分離および精製法は多くの刊行物、たとえば米国特
許第４９８３，６４７号；同第λ２５６．１５８号；同
第３，４７７．９１０号〜第λ４７７．９１３号および
第３．５４４，４２７号、Ｋ記載されているう然しなか
ら、尿の収集と処理の業務はウロキナーゼのこの資源を
非実用的なものにしている。４００万ＣＴＡ単位（ＣＴ
ＡはＣｏｍｍ１ｔｔｓｅ　ｏｎ　Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔ
ｔｅ　Ａｇｅｎｔｓの略語）のウロキナーゼは約１，５
００１Ｊツトルの尿の処理を必要とするからである。後
に人間の腎臓細胞の培養中に線維素分解活性が発表され
、そしてこの活性は尿のウロキナーゼと免疫学的に区別
がつかないことが見出された。組織培養法を使用してさ
え、生産コストが高くつき、その結果、ウロキナーゼの
製造のための他の方法が望まれている５本発明は、人間
のウロキナーゼに関するプラスミノーゲンアクチベータ
ーをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を組入れた
修飾プラスミドを提供するものである。この修飾プラス
ミドはバクテリアまたは他の微生物に導入することがで
き、次いでこのものを培養して抗生物質化合物の製造と
同じようにしてウロキナーゼ様物質を製造することがで
きる。この修飾プラスミドはプラスミド中のヌクレオチ
ド配列の直接掃作によってえられる。記述の九めに、本
発明をバクテリウムＥ、　Ｃｏ１１　Ｋ−１２菌株Ｘ１
７７Ｓｆｉらびにプラスミドおよびそこからのベクター
＞ＢＲ３２２をを参照して以下に述べる。前者はＲａマ
ｅｎ　Ｐｒｅｓ８（ＮＩＳＷＹｏｒｋ）発行、Ｂｅｅｒ
ｓ、　Ｒ，Ｆ、およびＢａ５ｓｅｔｔ、Ｅ、Ｇ。

共著ｒ　Ｒｅｅｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ
、　　Ｉｍｐａｃｔ　ｏｎＳｅｉｅｎｅｓ　ａｎｄ　５
ｏｃｉｅｔｙ　Ｊ　　（１９７７年）第４５頁に記載さ
れており、後者ｔｌＢｏｌｌｖａｒら（Ｇｅｎｅ、　　
２、第９５頁、１９７７年）によって記述されている。

本発明者は人間のプラスミノーゲンアクチベーターであ
るウロキナーゼをコードするＤＮＡセグメン）ｔ−ノζ
クチリアに組入九た。このようにしてこの微生物は人間
の胎生腎臓細胞の組織培養から分離したウロキナーゼと
類似の免疫学的なおよびプラスミノーゲン活性剤の性質
を有するプラスミノーゲンアクチベーターを製造する新
しい能力を獲得するっこの遺伝子工学の方法は簡単にい
うと、（１）人間の胎生腎臓細胞からのメツセンジャー
リボ核酸（ｍＲＮＡ）の分離、（２）分離したｒｎＲＮ
Ａの存在の実証、（３）組換えＤＮＡ合成に適するｍＲ
ＮＡからの相補ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）の実験的合成、（４
）上記（３）で合成したＤＮＡとベクターまたはプラス
ミドＤＮＡとを含む組換えＤＮＡの合成、（５）この組
換えＤＮＡによるバクテリアの形質転換ならびにプラス
ミノーゲンアクチベーター生産のため形質転換細胞の検
出および選択、および（６）形質転換細胞からのゾラス
ミノーケンアクチベーターの分離と化学的および生物学
的性質の特性の記述からなる。

ヌクレオチド配列のこの新しい操作技術は、−菌株もし
くｉ！種からの周知のもしくは同定されたヌクレオチド
配列を別のものへ導入しこれによって所望の性質を付与
することを可能にする。ＤＮＡの二重らせん構造に関し
て、ＤＮＡ分子のからみ合った相補性のストランドはホ
スフェート基を通して結合する４つのデオキシリボヌク
レオチド即ちデオキシ−リボアデノシン−５′−ホスフ
ェート（ａ＊ＭＰ）、チミジン−５′−ホスフェート（
’ｒＭＰ）、デオキシ−リボグアノシン−５′−ホスフ
ェ−４（ａｃＭｐ）およびデオキシ−リボシチジン−５
′−ホスフェ−）（ｄＣＭＰ）から作られている。それ
ぞれのストランドの遺伝子情報はデオキシリボヌクレオ
チドの特定の配列において具体化される。

あるＤＮＡ分子中のヌクレオチドの配列はある特定の蛋
白質の配列を決定し、そしてアミノ酸の配列はまた蛋白
質の構造と機能とを確立する。それ故、ＤＮＡのヌクレ
オチド配列は有機体の性質を作る蛋白質を正確に規定す
る。

組換えＤＮＡの操作はバクテリアから分離される制限エ
ンドヌクレアーゼ酵素として知られる蛋白質によるＤＮ
Ａのストランドの開裂により始まる。その酵素はＤＮＡ
鎖を特定の配列部位で切断する。その切断は必ずしも二
つのストランドの同じ位置で起きるとはいえないので、
その分けられたストランドは相補性の末端を持ちそのた
め適当な条件下で一緒に結合して端部対端部でそれらが
結合しうる。

２種の異なった資源からのＤＮＡ　（その両者は適切な
標識配列をもつ）について同一の制限酵素を使用するな
らば、結合性の端部を有する配列がその結果生ずるであ
ろう。それ故、任意の資源からの２つの配列を組換えて
単一のＤＮＡ分子にすることができる。組換え用ＤＮＡ
を取得する別の方法は、メツセンジャーＲＮＡ’ｉ二重
ストランド相補ＤＮＡに逆転写することである。合成さ
れ＊ＤＮＡは次いでこれ全以下に述べるようにしてプラ
スミド中に組入れることができる。ＤＮＡ取得のこの方
法は好ましいものである。それは、哺乳動物染色体のＤ
ＮＡの遺伝子が蛋白質を伝達しない配列を多くの場合金
み、そのためＤＮＡから蛋白質への遺伝子情報伝達の直
線性が中断されるからである。Ｅ。

Ｃｏ１１のようなバクテリアの場合、その単純な円形染
色体に加えて、それは細胞の染色体から物理的に分離し
ている遺伝子単位であるプラスミドもしくは余分の染色
体要素として知られる一個またはそれ以上の独立に複製
されるサークル状物をもつこともできる。これらのプラ
スミドもしくはベクターはバクテリアから分離すること
ができ、制限酵素によって開口もしくは開裂することが
でき、そして組換えの一成分として使用することができ
る。組入れるべきＤＮＡをプラスミドＤＮＡに接合した
後、この円形プラスミドはこれを閉じることができ、そ
してプラスミドは細胞にもどされうる。そこでそれはそ
れ自身の自然のヌクレオチド配列のみならず加えたもの
をも転写しつつ複製を再び始めるであろう。それ故、見
られるバクテリアの菌株はバクテリアの繁殖の際に、組
入れたヌクレオチド配列のコピーを維持するであろう。

本発明は添付の図面を参照して更によく理解されるであ
ろう。

第１図はウロキナーゼに関連したプラスミノーゲンアク
チベーター蛋白質を伝達するプラスミド含有ＤＮＡの制
限地図を図式的に説明するものである。

第２図は形質転換細胞からのウロキナーゼ様物質の親和
クロマトグラフから見られたデータを説明するグラフで
ある。

プラスミドは二重ストランドＤＮＡからなり少なくとも
１つの転写位置を含むものと信じられている。添付の第
１図を参照して、そこにはウロキナーゼに関連したプラ
スミノーゲンアクチベーターをコードするＤＮＡセグメ
ントを組入れたＥ、Ｃｏ１１　プラスミドｐＢ１３２２
を図式的に示しておる。このプラスミドもしくはベクタ
ーｐＢＲ３２２はＢｏｌｔｖａｒらによって記述されて
いる（Ｇｅｎｅ、２、第９５頁、１９７７年）。第１図
に示すように、この７７ＢＲ３２２プラスミドはＰａｔ
　　Ｉの位置として以後に述べる位置において制限酵素
によって開裂されており、プラスミノーゲンアクチベー
ターをコードするＤＮＡセグメントがそこに組入れられ
ている。一つのストランド上の配列が相補的に直接向き
合って存在するため結合が起こる。その相補性はそれぞ
れヌクレオチド類シトンンおよびグアニンまたはアデニ
ンおよびチミンの間の化学的親和性に依存する。

ストランドの長さにそってくりかえされるこれらの結合
の合計はストランド同志を保持する。２つのＤＮＡ断片
を結合する別法はりガーゼを使用するプラント末端の連
結（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ　ｌｉｇａｔｉｏｎ）による方
法である。第１図に示す数値はそこに示す位置の間の塩
基はアの数（実際には近似値）である。たとえば、ｐＢ
Ｒ３２２プラスミドのもとのＰｓｔ　　１位置の間に組
入れられた塩基はアの数は約４．２００である。第１図
の直径にそった場所もしくは位置は特定配列のヌクレオ
チドが生じ且つ特定の制限エンドヌクレアーゼ酵素によ
って開裂しうる場所を示す。第１図中の記号はそれぞれ
の位置の大体の場所ならびにヌクレオチドの特定配列に
おいてＤＮＡストランドを切断する特定の制限酵素を示
す。

第１図は本発明の一態様を示すものであり、ウロキナー
ゼ様物質をコードするＤＮＡを組入れたＥ、Ｃｏ１１　
　プラスミドを例示するものである。組換えＤＮＡ、す
なわちウロキナーゼ様物質をコードするＤＮＡを含む再
構成されたプラスミドはＥ、　Ｃｏ１１　Ｋ−１２菌株
Ｘ１７７６として例示されているような適当な宿主有機
体すなわち単一細胞宿主にもどされる。そこではその有
機体はそれ自身の自然の配列のみならず組入れた配列を
も転写しつつ複製を始める。

他の適当な有機体はエシエリシア属、サツカロ１イセス
属、バチルス属、ニューロスポラ属またはストレプトマ
イセス属からえらぶことかできる。このように単一細胞
宿主を使うことができる。適当な微生物の秤を例示すれ
ば、エシエリシアコリイ（Ｅ、Ｃｏ１１　）　、サツカ
ロマイセスセレビシアエ、バチルスサブチリスおよびニ
ューロスボラクラサである。

本発明は、免疫学的および化学的性質においてウロキナ
ーゼに関連するプラスミノーケンアクチに一ター蛋白質
を生産する適当なプラスミドを含有させたエシエリシア
属からのバクテリアを特に提供するものである。Ｅ．Ｃ
ｏｌｉＸ１７７６　ｐＡＢＢ　２６の培養物は米国イリ
ノイ州はオリアの米国農務省のＡＲ８力ルチュアーコレ
クションに寄託され、寄託番号Ｂ　　１２Ｉ２２が付せ
られた。

実施例　１゜ 人間の胎生腎臓細胞からのｍ　ＲＮ　Ａの分離ウロキナ
ーゼ生産細胞から全ｍＲＮＡを次のとおり分離した。１
０％の胎生子牛血清を含むイーグル媒質（Ｅ１９９）中
で入間の胎生腎臓（ＨＥＫ）細胞を合計７〜１０日間組
織培養により生成させた。収集前に更に７日間この細胞
を血清なしで蛋白質加水分解物質中に保持した。ＦＩＥ
Ｋ細胞をローラボトルからこすり取り、ヘパリン（１０
単位／−）含有塩水中で洗い、グアニジン塩による抽出
をリン酸塩で緩衝した水（ＰＢＳ）緩衝液中でｐＨ７，
０で行なった以外はウルリツヒらのグアニジンチオシア
ネート法（Ｓｃｉｅｎｃｅ。

１９６、第１３１３頁、１９７７年）により全ＲＮＡを
分離した。このＲＮＡをエタノールにニジ沈澱させ、３
３ｍＭのＮ−２−ヒドロキシーエチルピはラジンーＮ′
−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液に溶解し
た。デーレイらの（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２
５２、第８３１０頁、１９７７年）記述のようにポリウ
リジル酸（Ｐｏｌｙ　Ｕ）セファデックスＧ−１０カラ
ム上の親和クロマトグラフにより全ＲＮＡからｍ　ＲＮ
　Ａを含有するポリアデニル酸（ＰｏｌｙＡ）を分離し
た。カラム物質はファインらの方法（Ｊ、　Ｍｏｌ　、
−Ｂｉｏｌ。

８６、第３７３頁、１９７４年）に従い合成した。ＲＮ
Ａをカラム中に２回通して全ｍ　ＲＮ　Ａをえ７’ｃ（
全ＲＮＡ３９ηから１．　Ｉ　Ｑ　）。ウロキナーゼｍ
ＲＮＡを更に濃縮し、シュクロース密度傾斜遠心分離に
より全ｍＲＮＡから分離したつ全ＲＮＡをＴＥＳ−２緩
衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ、ｐＨ７，４：　
２０ｍＭ　ＮａＣ１；　０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ　；　０
．４％のナトリウムドデシルサルフェート）Ｋ約１０　
Ａ２ａｏ／ｒｄのｍ度でとかした。このＲＮＡ′ｆ：６
５℃で１５分間加熱し、ベック−ｒ：ｙＬ５−６５超遠
心分離器中テ２５．０００　ｒｍｐにおいて２０℃で１
２時間５Ｗ２７０−タ中で線状（１０〜３０チ）シュク
ロース傾斜および遠心分離に付した。次いで傾斜物を各
フラクション（０，５ｄ／フラクシヨン）に分け、Ａｔ
５ｏの読みを決定し六。２８Ｓより大きいＲＮＡをプー
ルし、エタノールで沈澱させ、７０％エタノール中の３
３　ｍＭ　Ｎａ　Ｃ１で洗い、次いで９５％エタノール
で洗った。これを乾燥し、ｐＴ（７，０の３３ｍＭのＨ
ＥＰＥＳにとかした。傾斜に付したＲＮＡの１２から、
２８Ｓより大きいＲＮＡ７３にりをえた。このＲＮＡを
使用１〜て無細胞蛋白質合成でウロキナーゼｍＲＮＡの
存在を実証しそしてｃＤＮＡの合成を行なった。

実施例　λ ゼｒｎＲＮＡの存在の実証 ウサギの網内皮細胞からの無細胞蛋白質合成系をはルヘ
ムおよびジャクソンの方法（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃ
ｈｓｍ、、　　６７、第２４７頁、１９７６年）Ｋより
ヌクレアーゼ処理して内生のｍＲＮＡを消化処理した。

無細胞での蛋白質の合成および免疫沈澱をローデスらの
方法（Ｊ、　Ｂｊｏｌ、　Ｃｈａｍ、。

２４８、第２０３１頁、１９７３年）に従い実施した。

２０％（Ｖｏｌ／Ｖｏｌ）の網内皮細胞溶解物、２ｍＭ
のアゾンシントリホスフェート（ＡＴＰ）、０．２　Ｍ
のグアニジントリホスフェ−）　（ＧＴＰ）、１０ｍＭ
のクレアチンホスフェート、２ｗ９のクレアチンキナー
ゼ、３ｍＭのジチオスレイトール、７５　ｍＭのＫＣｔ
、　３ｍＭのＭｇ　Ｃ１，，３０ｍＭのＨＥＰＥＳ％ｐ
Ｈ７，６，２０ｕＭのアミノ醸混合物（メチオニンなし
）、５ｕＣ１”Ｓ−メチオニンおよびｌｕｆの精製メツ
センジャーＲＮＡを含む最終容量４５ｕｔ中で培養を行
なった。混合物を２５℃で１時間培養し、次いで冷却お
よび０．１Ｍメチオニン、１０％トリトンＸ−１００お
よび１０％ナトリウムデオキシコレートからなる液２５
ｕＬの添加によシ停止しもＳｕｌづつの分別ｉを０．３
ＭＭメチオニンを含むトリクロル酢酸（ＴＣＡ）中で洗
うことにより、とり込まれたもの全体のトリクロル酢酸
不溶解カウントをえた。次いでこのは−ノモーディスク
を同じＴＣＡ−）　チオ＝ン溶液中で９０’Ｃで１５分
間加熱し、シンチレーションカウンターでカウントする
前に乾燥しｆｃ。

合成し六ＭＯＢ−はプチドの免疫沈澱をローデスらの方
法（上記文部参照）により行なった。ただし、それぞれ
の抗原−抗体沈澱物を０．５Ｍシュクロース、１％トリ
トンＸ−１００，１％ナトリウムデオキシコレートおよ
び０．２　ＭのＤＬ−メチオニンからなる液２００　ｕ
ｔからなるシュクロ−フラクション中を沈降させるとい
う変形を用いた。精製ウロキナーゼ（０゜５１Ｌり）を
キャリヤーとして反応混合物に加え、ウサギの抗ウロキ
ナーゼ（ＩｇＧフラクション）の５〜１０％ｇを加える
ことによって免疫沈澱を行なった。

第二抗体（ヤギの抗つサぎＩｇＧ、１００〜２００％Ｆ
）を加え、反応混合物を更に４℃で１８時間培養した。

最終の沈澱物を洗い、ＩＯＭの尿素、５％ＳＤＳおよび
５％メルカプトエタノール中で再懸濁させて６０℃で３
０分間加熱した。分別量をシンチレーションカウンター
中でカウントして３ＳＳ　とり込み量を求めた。ウロキ
ナーゼ特異ｍＲＮＡのカウントＩＴｃＡにより沈澱され
た全カウント分の免疫沈澱カウントのパーセントとして
表示した。この反応条件において、精製ウサギのグロビ
ンのメツセンジャーＲＮＡのｌｕｆを反応混合物中に使
用するときに反応混合物１１Ｌｔ当りｌＸ１０’ｃｐｍ
がＴＣＡ！７Ｃより沈澱しうる。

１チ以下の放射能がウサギのヘモグロビンｍＲＮＡコン
トロール中でウロキナーゼ抗体によって免疫沈澱された
。−方、人間の胎生腎［（ＨＫＫ）細胞からのＰｏ１ｙ
　Ａを含むｍＲＮＡは免疫沈澱しうるカウントとして１
０％のＴＣＡ不溶性放射能を与えた。シュクロース密度
傾斜遠心分離による２８３より大きいメツセンジャーＲ
ＮＡＵウロキナーゼ抗体により４０〜６０チのＴＣＡ不
溶性放射能が免疫沈澱したことを示した。

加えたｍＲＮＡに依存する無細胞での蛋白質の合成はま
たロバーツおよびピーターソン（ＰＮＡＳ、７０、第２
３３０頁、１９７３年）によって述べられている小麦発
芽系中で行なった。ウサギの網内皮細胞系中で上述の如
く免疫沈澱を行なった。シュクロース密度傾斜からの２
８８より大きいメツセンジャーＲＮＡＨ免疫沈澱しうる
カウントとしてＴＣＡ不溶性カウントの９０％をも与え
た。

実施例　λ ｍＲＮＡから相補ＤＮＡ　（ｅＤＮＡ）の合成フリート
マンおよびロスノシツシュの方法（ＮｕｃｌｅｌｅＡｃ
ｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　　４、第３４５５頁、１９７７年
）に従いｍＲＮＡの逆転写によって単一ストランドｅＤ
ＮＡを合成した。ただし次の変形を用いたつｍＲＮＡで
オリコ゛ｄＴゾライマーをアニール化するための反応混
合物（５００１Ｌｔ）ｔｊ２０ｍＭのＴｒｌｓ−ＨＣｌ
、ｐＨ８，５，２０ｍＭのＫＣｌ　。

４ｍＭのＭｇ　ＣＬ、、２０　ｗｆのＰｏ１ｙＡ含有の
ｍＲＮＡおよび１．５ｔりのｄＴ３゜を含んでいた。ｃ
ＤＮＡ合戊の合成の最終反応混合物（ｌｄ）ｔ’ｊ：５
０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ７゜ｐｉ（８，５，５０ｍＭの
ＫＣｌ、　１０　ｒｎＭのＭｇＣ６ｔ、　　１０ｍＭの
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０ｕ２のアクチノマ
イシンＤ、各１ｍＭのデオキシアデノシントリホスフエ
ー）　（ｄＡＴＰ）、デオキシグアニジントリホスフェ
−）　（ｄＧＴＰ）、チミジントリホヌフエート（ＴＴ
Ｐ）、８００ｕＭＣα−３２ｐ）ｄＣＴＰおよび３２５
単位のＡＭＶ逆転写酵素を含んでいた。４２℃で３０分
間培養後、酵素３２５単位を別に加えた。２時間の培養
後、０．５Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の
５０ｗｔを加えることによって反応を停止した。この溶
液にＩＯＭのＮａＯＨの４０　ｗｌを加え、次いで室温
で１８〜２０時間培養した。

次いで、ゆっくりかきまぜなからＨΣＰＥＳを加えるこ
とによって溶液をｐＨ８，５に中和した。次いでこの溶
液をフェノール抽出、セファクリルＳ−３００ゲル濾過
および高分子量のｃＤＮＡを含有する排除フラクション
をメタノール沈澱に付した。収率は１５〜２５チでめっ
た。ｃＤＮＡ生成物を７Ｍ尿素中の３．５％ポリアクリ
ルアミド−スラブゲル（２０ｘ４０Ｘ０．３ｃ１ｎ）中
の電気泳動に付した。長さのマーカーとしてラムダＤＮ
ＡのＨｉｎｄ　ＩＩＩエンドヌクレアーゼ消化を使用し
た。ゲルの放射線写真後、主たる種として３．０００〜
６，０００のヌクレオチド残基を有する単一ストランド
ｃＤＮＡ’ｉ検出した。

ジャコブセンらによって述べられた反応条件（Ｅｕｒ、
Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　４５、第６２３頁、１９７４年）
に類似して、イーコリイからのＤＮＡポリメラーゼの大
きな断片を使用することによって、ｃＤＮＡの第二のス
トランドを合成した。反応は反応容１ｔ２００ｕｊ中に
１．４ｎモルのｅＤＮＡ、０．１ＭのＨＥＰＥＳ％ｐＨ
７，０、それぞれ４００　ｕＭのｄＡＴＰ、デオキシシ
トシントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、ｄＧＴＰおよび
ＴＴＰ、１０ｍＭのＭｇ　ＣＬ、、１０ｍＭのジチオス
レイトールならびに７０　ｍＭのＫＣｔを含んでいた。

１５℃で１．５時間培養を行かった。次いで０．５Ｍの
ＥＤＴＡの２０ｕｌを加え、そしてＤＮＡをフェノール
抽出およびエタノール沈澱によって精製し六。

次いで上述の二重ストランドｃＤＮＡを、３０　ｍＭの
酢醒ナトリウム、ｐＨ４，６，１ｍＭ　ｆ）　Ｚｎ　Ｓ
　０４．２５０ｍＭのＮａ　Ｃ１および１００１Ｌｆ／
−のイーコリイｔＲＮＡの存在下において、１５℃で３
時間ｓＩヌクレアーゼ（１２５０年位）により処理した
。ＤＮＡの約５８％（はぼ０．５ｕｙ）が処理後に回収
された。ベックマンＬ５−７５超遠心分離器中の４０．
００　Ｏｒｐｍ揺動バケッ５Ｗ４０ロータ中の線状シュ
クロース密度傾斜［１０ｍＭのＮａＣｔ１０　ｍＭのＴ
ｒｉｍ　　ｐＨ８，０，１ｍＭのＥＤＴＡからなる塩水
−Ｔｒｌｓ−ＥＤＴＡ（ＳＴＥ）中１５〜３０チ〕中で
２０℃で１６時間ＤＮＡを遠心分離した。ｚｏｏｏ個の
塩基はアより大きいＤＮＡをプールし、エタノール沈澱
して、組換えＤＮＡ合成のためＰｏ１ｙ　０束をつける
のに使用した。

実施例　４゜ 二重ストランドｅＤＮＡへのホモポリマー束の添加をロ
イコウドハリイら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ
、、　　３、第８６３頁、１９７６年）によって述べら
れているようにエキソヌクレアーゼを使用することなし
に行なった。反応混合物（３００ｕｔ）Ｆｉｌｏｏｒｎ
ＭのカリウムカコジレートｐＨ６，９，３０ｍＭのＴｒ
ｉｇ塩基、１ｍＭのＣｏＣｌ２．２００　ｕＭのＤＴＴ
、６ｎモルの二重ｃＤＮＡ（全ヌクレオチド残基中）、
１００　ｕＭの［α−３２ｐ″１ｄｃＴＰおよび２４０
単位のターミナルトランスフェラーゼを含んでいた。２
０分後に０．５ＭのＥＤＴＡの３０　ｕｔおよび中和し
たフェノール３００ｓ４を添加して反応を停止した。十
分に混合した後、内容物を１５００ｘｆで１０分間遠心
分離して水性層を除いた。１００　ｍＭのＮａＣｔ（ｐ
Ｈ８，０）の１Ｑｕｔによυフェノール層を二回抽出し
、また集めた水性層をエーテル抽出し、エタノール沈澱
した。

二重ストランドｃＤＮＡ中に３’−０）！端部のほぼ２
０ｐモルから、１４００９モルまでの［３２ｐ：］ｄｃ
ＭＰがとり込まれた。これ１１ｍＤＮＡストランド当り
７０個のｄ　ＣＭＰ残基が添加されることを示すもので
あった。線状プラスミドを次の如くしてえた。反応混合
物（１００ｕｔ）は１０ｍＭのＴｒｌｓ−ＨＣｔ、　ｐ
’Ｈ７，８，１０ｍＭのＭｇ　ｃｚ、、１０　ｍＭのＤ
ＴＴ、５０ｍＭのＮｔＣｌ、　１０１ＬｆのＰＢＲ３２
２ＤＮＡおよび５単位のＰｓｔ　　Ｉを含んでいた。反
応混合物の一分別：１（５ｓｔ）をアガロースゲル電気
泳動により分析して消化の完全なことを調べた。次いで
線状ＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈澱により
分離した。

このＤＮＡを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｔ、　ｐＨ０，
８および０．５ｍＭのＥＤＴＡからなる液の１００　ｕ
ｔ中に懸濁させ、１００　ｕＭの［３Ｈ］ｄＴＴＰおよ
び２４０単位のターミナルトランスフェラーゼを含む上
述のターミナルトランスフエラーゼ緩衝液中で培養した
。４２℃で０分、１分、２分、３分、４分および５分の
間隔で分別物（各５ｕｔ）を酸不溶性放射能についてモ
ニターした。培養５分後の残りの溶液をフェノール抽出
しそしてエタノール沈澱した。

この期間中、全１３０ｐモルのｄＧＭＰ残基がとり込ま
れた。３’−ＯＨ末端の５．４ｐモルを含むこのＤＮＡ
サンプルに、ｐＢＲ３２２ＤＮＡのストランド当シ平均
２４個の残基を付加した。

ポリデオキシシチジル酸＜ｐｏｌｙ　ｄｃ）　（約０．
１５ｐモル）をつけた大きな二重ストランドｅＤＮＡを
容ｔ１００ｕｌの０．１ＭのＮａＣ１中で当量のポリデ
オキシグアニリジン酸（ｐｏｌｙ　ｄＧ）をテイル付加
したｐＢＲ３２２ＤＮＡにアニール化した。混合物を６
５℃で３時間加熱して４２℃で１６時間放置してこのＤ
ＮＡ調製物をアニール化した。

実施例　５゜ イーコリイの形質転換 カーチスらの方法（ＣＲＣプレス発行、１９７８年、Ｃ
ｈａｒｋｒａｂａｒｔｙ、んＭ、編集の「Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅ−ｒｉｎｇ　ＪのＷ、５ａｌｓｅｒ
による第３章、第３頁に記載の方法）を使用してアニー
ル化したＤＮＡ混合物によりＸ１７７６（Ｆ−ｔｏｎ　
Ａ　５３　ｄａｐ　Ｄ８ｍｉｎ　ＡＸ　ｍｉｎ　Ｂ２　
ＳｕｐＥ４２ｇａ、１△４０−　　ｒｆｂ−２ｎａｌ　
Ａ２５　ｏｍｓｔ−２ｔｈｙ　Ａ５７　ｍｅｔ　Ｃ６５
ｏｍａ−１（ｂｉｏ　Ｈ−ａｓｄ）△２９　ｅｙｅ　Ｂ
２　ｅｙｅ　Ａｌ　ｈｓｄ　Ｒ２）を形質転忰した。

補充り液（ジアミノピメリン酸１００ｕり／−、ナリジ
キシン酸２５　ｕｆ／−およびチミン４０Ｒｆ／ｍ）中
で細胞を３７℃で０．３Ａｓｏｏにまで生育し、室温で
１０分間１７００ｘｆで遠心分離してベレットを集めた
。

細胞を１０　ｍＭ　’７）　Ｎａ　Ｃ１（”／２容量）
中に！！！濁させ、遠心分離し、再びに容量のＣ＆緩衝
液（７５ｍＭのＣａＣ１２、、１４０ｍＭのＮａＣｊ、
　１０ｍＭのＴｒｌｓ　ＨＣｌ。

ｐＨ７，０）中に懸濁させた。室温で３０分後、細胞を
遠心分離し、再び１／１０容量のＣａ緩衝液に懸濁し、
そして０℃に冷却した。２容量の細胞を１容邦のＤＮＡ
と混合し。

０℃で３０分間保ち、４２℃で１分間加熱し、そして室
温で十分量放置し、１０容量の補充り液と混合し、そし
て３７℃で１００分間培養した。培養物を少しづつピは
ットにより２１ＲｔのソフトＬ−カンテン（０，６％）
中に移しそのプレート上に敷くことによって、細胞’１
ｌＺ５ｕｆのテトラサイクリンを含有する補充し一カン
テン上にプレート状においた。このプレートを３７℃で
２日間培養したう全３２種類のテトラサイクリン耐性形
質転換体をえた。これらのうち、４種類はアンピシリン
感受性（ＡＭＰｓ）であり、そのプラスミド中に組換え
体をもっていた。３種類は約４．２キロの塩基はアの類
似組換え体をもっていた。これらのプラスミドの一つの
制限地図を第１図に示す。

実施例　６゜ 組換えＤＮＡを含有するアンピシリン感受性、テトラサ
イクリン耐性イーコリイ形質転換体をえらんで免疫学的
検知方法を使用してウロキナーゼ様物質の可能な発現を
スクリーニングした。プラスチックミクロタイタープレ
ートを使用する固相放射性免疫試験（ＲＩＡ）ｉヒッツ
エマンらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ　：　ＲｅｃｏｍｂｔｎａｎｔＤＮＡ、１９
７９年）に従い、ただしゃ−変形して行なった。シアノ
ーケンプロマイドにより活性化したは−・ミーを使用す
る直接ＲＩＡ法において、ウロキナーゼもしくはウロキ
ナーゼ様物質をシアノーケンブロマイドにより活性化し
たは−パーと直接反応させ、次いで１２３　Ｉで標識し
た抗ウロキナーゼ抗体の結合によって検出した。

細胞溶解物にスイーバーグらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　
２７６、第７９５頁、１９７８年）により調製した。イ
ーコリイ形質転換体の５００−を−夜生育し、１０．０
ＯＯｘｆで１０分間遠心分離することにより細胞を集め
た。細胞を１０ｍＭのＴｒｉｓ　（ｐＨ８，０）および
１ｍＭのＥＤＴＡで洗い、同じ緩衝液５．〇−中に再び
懸濁させた。リゾチーム（５′ｌｑ／ｍｅ）の０．５コ
を添加した後、混合物を氷上に３０分間保った。Ｍｇ　
Ｃ！、を加えて量線濃度１０ｍＭ［：それぞれ０．１−
のＤＮアーゼ（１η／ゴ）、ＲＮアーゼ（５■／−）お
よびＭＰ−４０（５％）〕にした。培養を４℃で１時間
進行させ、混合物を遠心分離（１０，０００ｘ９．２０
分、０℃）により清澄にした。上澄み液を使用してウロ
キナーゼ様物質のスクリーニングを行なった。

（ａ）　　溶解物の分別物をシアノーケンブロマイドペ
ーパー（直接ＲＩＡ法）上に滴下してヒッツエマンらの
方法（上記参照）により前述の如（１１ＳＩ−ウロキナ
ーゼと反応させた。既知量のウロキナーゼも陽性のコン
トロールとして滴下した。組換えＤＮＡ、ｐＡＢＢ　２
６を内蔵している一種の形質転換体は強い陽性反応を示
した。

（ｂ）　　溶解物の分別物を緩衝液（０，１Ｍのカリウ
ムホスフェート、ｐＨ７，０および０．４ＭのＮａＣｔ
）で１０倍にうすめ、１×５−のベンツアミジン親和カ
ラム（ホルムパークら、ＢＢＡ　４４５、第２１５頁、
１９７６年）上に充てんした。このかラムをＡ２ｍ０の
読みがバックグラウンドに達するまで緩衝液で十分に洗
った。とのカラムを溶出緩衝液（０，１Ｍの酢酸ナトリ
ウム、ｐＨ４，０、および０．４ＭのＮａＣ１）で溶出
してフラクションを集め次。それぞれのフラクションか
らの分別物を固相ＲＩＡで分析した。

形質転換体Ｘ１７７６　（ＰＡＢＢ　２６）からの細胞
溶解物がベンツアミジン親和カラム中を通運するとき、
溶解物からの若干の人□。物質がカラム中に保持され、
低いｐＨおよび高度の塩によってのみ溶出された。これ
らの保持物質はウロキナーゼの固相ＲＩＡにおいて陽性
反応を示したが、形質転換体Ｘ１７７６　（ｐＢＲ３２
２）がらのコント。

ローＡ溶解物は陰性であった（第２図）。ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動およびそれにつづくシアノー
ケンプＯ？イド活性化は−パー上へのフィルター親和性
移動（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５４、第１２
２４０頁、１９７９年）により、生成物をその分子の大
きさについて更に特徴づけた。１３５Ｉ−標識のウロキ
ナーゼ−特異抗体はおおよその分子８３２，０００，５
２，０００．８７，０００゜１２４．０００および１５
４，０００の５種の別々の大きさのプラスミノーゲンア
クチベーター蛋白質を示した。

プラスミノーゲンアクチベーターの活性は、アンヶレス
らの方法（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｓｄ、、　　１３７、第
８５〜１１１頁、１９７３年）から変形した敏感な１！
１１１フィブリツリシス分析を使用して測定した。硬質
ミクロタイタープレートをＵＳ　１　　フィブリノーゲ
ン（２ｓｒｓ　１０’　ｅｐｍ、／ｗｅｌｌ　）で被覆
し、このフィブリノーゲンをプラスミノーゲンのないト
ロンビン（０，１単位／　ｗｅ　１１　）を使用してフ
ィブリンクロットに転化した。０．１ＭのＴｒｉｔ　Ｈ
Ｃ２，ｐＨ８，１，０，０２５％の人間の血清のアルブ
ミン、およびリジンセファロース上の親和クロマトグラ
フによって調製したＺ５ｕｆ／−１のゾラスミンのない
プラスミノーゲンを含む全容量？　Ｏｗｅ中で分析を行
なった。分析の範囲は０．０５プロウグ（Ｐｌｏｕｇ）
単位／−から１０単位／−であったが、０．００２単位
まで検出することはできた。イーコリイの粗溶屑物はこ
の分析で阻害されているので、形質転換体調製物はイオ
ン交換クロマトグラフまたはペンツアミジンーセファロ
ース上の親和クロマトグラフによって、分析前に部分的
に精製した（第１表）。

形質転換細胞Ｘ１７７６（ｐＡＢＢ　　２６）のウロキ
ナーゼ親和カラム溶出物をこの分析を使用して試験した
とき、かなりの線維素溶解活性が検出され六がｐＢＲ３
２２により形質転換したＸ１７７６からの試料はこのよ
うな活性を示たなかった。更に、人間のウロキナーゼに
特有な抗血清による免疫化＃はこの活性を溶液から除く
ことができた。

これは形質転換細胞Ｘ１７７６　（ｐＡＢＢ　　２６）
からのプラスミノーゲンアクチ−ニーターと人間のウロ
キナーゼとの間の免疫化学的関連の離間を与えるもので
ある（第１表参照）。

第１表 バックグラウンド （ｐＢＲ３２２） （ｐＡＢＢ　２６） 抗ＵＫ Ｒ８ 抗ＵＫ Ｎ　Ｒｓ（ｃ） ４．６ （ａ）　　プラスミノーゲンアクチベーターの活性は実
施例６に記載のとおりにして測定し六。

（ｂ）ＰＢＳの指示したウサギ抗血清の１：１０希釈液
１０　ｕｌを氷上で３０分間試料溶液２５ｕｔに加えた
。ケスラーの方法（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、、　
　１１５、第１６１７頁、１９７５年）に従い、ゲルメ
ールアルデヒドで固定したニペアウレウスの１０　％　
（ｖ／／ｖ）懸濁液２５　ｕｔを使用して、免疫錯体を
溶液から清澄化したうえられた上澄液の３５　ｕｔを分
析した。

（ｃ）ＮＲ８・・・ふつうのウサギの血清実施例　７゜ イーコリイ菌株Ｘ１７７６　（ｐＡＢＢ　　２６）の生
育イーコリイ形質転換体Ｘ１７７６　（ｐＡＢＢ　２６
）の細胞を１２−５Ｗｆ／−のテトラサイクリン塩酸塩
を含むＬ−液（Ｊ、Ｈ，Ｍｌｌｉｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔＦＩｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃ
ｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ。

１９７２年）中で生育した。更に、０５チカザミノ酸、
０．５％グルコース、０．５ｕｆのＤ−ビオチン、１０
０ｕｆのし一ジアミノピメリン酸、４０ｔ２のナルジキ
シン酸およびＩＺ５ｕｆのテトラサイクリン塩酸塩（す
べて−轟り）を含むＭ９媒質（Ｊ、Ｈ，Ｍｌｌｉｅｒ、
　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｓｎ＠ｔＳｃｓ、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　１９７２年→も生
育および上記苗株からのプラスミノーゲンアクチベータ
ーの製造のために使用した。振とうしながら細胞？、３
７℃で生育し、十分な生育達成後に、プラスミノーゲン
アクチ−ニーターを検出する目的で回収した。

【図面の簡単な説明】

第１図はウロキナーゼに関連したプラスミノーゲンアク
チベーター蛋白質をコードするプラスミド含有ＤＮＡの
制限地図を図式的に説明するものであり、円内の数値は
そこに示す位置の間の嬉基はアの数を示し１円外の記号
はそれぞれの位置においてＤＮＡを切断する特定の制限
酵素を示し、Ｐｓｔ　　なる記号で示す太い円周部分は
プラスミノーゲンアクチーニーターをコードするＤＮＡ
部分の組入れられる場所である。 図面の浄書（内容に変更なし） 第２図は変態菌からのウロキナーゼ様物質の親和クロマ
トグラフから見られたデータを示すグラフでろハ、横軸
はフラクション数を示し、縦軸は毎分のカウント数を示
す。 実線のグラフは形質転換細胞からの溶解物のデータを示
し、破線のグラフはコントロールからの溶解物のデータ
を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質をコードす
   るポリデオキシリボヌクレオチドセグメントを組入れた
   プラスミドベクターからなることを特徴とする微生物宿
   主の形質転換に適合させた組換えプラスミド。 ２、プラスミドベクター源がエシエリシア属、サッカロ
   マイセス属、バチルス属、ニューロスポラ属およびスト
   レプトマイセス属からなる群からえらばれた微生物であ
   る特許請求の範囲第１項記載の組換えプラスミド。 ３、微生物がエシエリシアコリイ種、サッカロマイセス
   セレビシアエ種、バチルスサブチリス種およびニューロ
   スポラクラサ種からえらばれる特許請求の範囲第２項記
   載の組換えプラスミド。 ４、ベクターがＥ．ＣｏｌｉプラスミドｐＢＲ３２２か
   らなる特許請求の範囲第３項記載の組換えプラスミド。 ５、Ｐｓｔ＾＊ I 制限エンドヌクレアーゼ位置を含む
   特許請求の範囲第４項記載の組換えプラスミド。 ６、ポリデオキシリボヌクレオチドセグメントが約４，
   ２００の塩基ヌクレオチドのペアからなる特許請求の範
   囲第５項記載の組換えプラスミド。 ７、実質的に第１図に示される特許請求の範囲第６項記
   載の組換えプラスミド。 ８、プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質をコードす
   るポリデオキシリボヌクレオチドセグメントを組入れた
   プラスミドベクターからなる組換えプラスミドを含む形
   質転換微生物。 ９、微生物がエシエリシア属、サッカロマイセス属、バ
   チルス属、ニューロスポラ属およびストレプトマイセス
   属からなる群からえらばれる特許請求の範囲第８項記載
   の形質転換微生物。 １０、微生物がエシエリシアコリイ種、サッカロマイセ
   スセレビシアエ種、バチルスサブチリス種およびニュー
   ロスポラクラサ種からなる群からえらばれる特許請求の
   範囲第９項記載の形質転換微生物。 １１、微生物がＥ．Ｃｏｌｉである特許請求の範囲第１
   ０項記載の形質転換微生物。 １２、プラスミドベクターがＥ．Ｃｏｌｉプラスミドｐ
   ＢＲ３２２を含む特許請求の範囲第１１項記載の形質転
   換微生物。 １３、プラスミドベクターがＰｓｔ I 制限エンドヌク
   レアーゼ位置を含む特許請求の範囲第１２項記載の形質
   転換微生物。 １４、組入れたポリデオキシリボヌクレオチドセグメン
   トが約４，２００の塩基ペアからなる特許請求の範囲第
   １３項記載の形質転換微生物。 １５、実質的に第１図に示される特許請求の範囲第１４
   項記載の形質転換微生物。 １６、微生物がＥ．ＣｏｌｉＫ−１２菌株Ｘ１７７６で
   ある特許請求の範囲第１１項記載の形質転換微生物。 １７、プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質をコード
   するポリデオキシリボヌクレオチドセグメント。 １８、末端に制限エンドヌクレアーゼ開裂を有し且つそ
   れら末端群間にプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質
   の発現をコードする遺伝子を有することを特徴とするプ
   ラスミノーゲンアクチベーター蛋白質をコードするポリ
   デオキシリボヌクレオチドセグメント。 １９、遺伝子が約４，２００の塩基ヌクレオチドのペア
   を含む特許請求の範囲第１８項記載のポリデオキシリボ
   ヌクレオチドセグメント。 ２０、遺伝子が実質的に第１図に示されるものである特
   許請求の範囲第１９項記載のポリデオキシリボヌクレオ
   チドセグメント。 ２１、プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質をコード
   するポリデオキシリボヌクレオチドセグメントによつて
   発現され且つ実質的にウロキナーゼの特性を有するプラ
   スミノーゲンアクチベーター蛋白質生成物。