FI88932C - Framstaellning av funktionellt maenskligt urokinasprotein - Google Patents

Description

1 88932

Funktionaalisten ihmisen urokinaasiproteiinien valmistus Tämä keksintö koskee ihmisen urokinaasia, sen uusia muotoja ja sitä sisältäviä koostumuksia ja erityisesti kei-5 noja ja menetelmiä ihmisen urokinaasin funktionaalisen pro-teiinilajin valmistamiseksi in vitro.

Tämä keksintö perustuu osittain luonnollisen urokinaasin samoin kuin urokinaasimolekyyliin liittyvien osien, joiden on havaittu olevan funktionaalisia, biologisesti ak-10 tiivisia ryhmiä, DNA-jakson ja siitä johdetun aminohappojärjestyksen keksimiseen. Tämä löytö teki mahdolliseksi valmistaa eri muodoissa olevaa urokinaasia soveltamalla yhdis-telmä-DNA-tekniikkaa, mikä puolestaan teki mahdolliseksi tuottaa riittävän paljon ja kyllin hyvälaatuisia materiaa-15 leja, joilla voitiin tehdä tarvittavat biologiset kokeet molekyylien biologisesti toimivien ja siten käyttökelpoisten ryhmien identifioimiseksi. Kun ne oli määritetty, oli mahdollista valmistaa "räätälintyönä" urokinaasin funktionaalisia lajeja geneettisen manipulaation ja in vitro -muok-20 kauksen avulla, jolloin tehokkaasti saadaan tähän asti saavuttamattomia kaupallisesti merkittäviä määriä aktiivisia tuotteita. Tämä keksintö koskee näitä aiheeseen liittyviä toteutusmuotoja kaikissa suhteissa.

Julkaisut ja muu materiaali, joita tässä käytetään 25 valaisemaan keksinnön taustaa ja, erityistapauksissa, antamaan sen käytännön toteuttamista koskevia lisäyksityis-kohtia, annetaan tässä viitteeksi ja ne on mukavuuden vuoksi annettu numeroituina seuraavassa tekstissä ja koottu vastaavasti liitteenä olevaan kirjallisuusluetteloon.

30 A. Ihmisen urokinaasi

Fibrinolyyttinen järjestelmä on dynaamisessa tasapainossa hyytymisjärjestelmän kanssa, mikä pitää yllä koskematonta, avointa verisuonikerrosta. Hyytymisjärjestelmä saos-taa fibriinin matriisiksi, joka palauttaa hemostaasitilan.

35 Fibrinolyyttinen järjestelmä poistaa fibriiniverkoston sen jälkeen, kun verenvuoto on tyrehtynyt. Fibrinolyyttisen prosessin saa aikaan proteolyyttinen entsyymi, plasmiini, 2 88932 joka syntyy plasman proteiiniesiasteesta, plasminogeenista. Plasminogeenin muuttaa plasmiiniksi aktivaattori.

Urokinaasi on tällainen aktivaattori. Sitä ja toista aktivaattoria, streptokinaasia, on kaupallisesti saatavana.

5 Molempia käytetään akuuttien verisuonisairauksien, kuten sydäninfarktin, -halvauksen, keuhkoveritulpan, sisälaski-moiden tukoksien, ääreisvaltimoiden tukkeutumien ja muiden verisuonitukosten hoitoon. Nämä sairaudet muodostavat ryhmänä merkittävän terveysriskin.

10 Näiden sairauksien taustalla olevana syynä on joko osittainen tai, vakavissa tapauksissa, täydellinen verisuonen tukkeutuminen, jonka aiheuttaa verihyytymä - tukko tai veritukkotulppauma. Perinteinen antikoagulanttihoito, kuten hepariinilla ja kumariinilla, ei suoraan edistä tukkojen 15 tai veritukkotulppaumien liukenemista. Streptokinaasia ja urokinaasia on käytetty käytännöllisinä ja tehokkaina trom-bolyyttisinä aineina. Tähän asti kummallakin on kuitenkin ollut vakavia rajoituksia. Kumpikaan ei ole osoittanut suurta affiniteettia fibriiniä kohtaan; niin ollen molemmat ak-20 tivoivat verenkierrossa olevaa ja fibriiniin sitoutunutta plasminogeenia suhteellisen rajoittamattomasti. Verenkierrossa muodostunut plasmiini neutraloituu melko nopeasti ja on menetetty käyttökelpoisen trombolyysin kannalta. Jään-nösplasmiini hajottaa useita hyytymistekijäproteiineja, 25 esimerkiksi fibrinogeenia, tekijää V ja tekijää Vili, aiheuttaen verenvuototaipumuksen. Lisäksi streptokinaasi on voimakkaasti antigeeninen ja potilailla, joilla vasta-ainetaso on korkea, on heikko vaste hoitoon, eikä heitä voi pitää jatkuvassa hoidossa. Urokinaasihoito on kallista, koska 30 se vaatii aineen eristämistä ihmisen virtsasta tai kudos-viljelmästä, eikä sitä siksi käytetä yleisesti kliinisesti. Urokinaasia on tutkittu paljon, katso esimerkiksi viitteet 1-9. Tällä hetkellä saatavissa oleva urokinaasi on, kuten mainittiin, eristetty ihmisen virtsasta tai kudosviljelmäs-35 tä, esimerkiksi munuaissoluista (9A, 9B).

Urokinaasimolekyyli esiintyy useissa biologisesti aktiivisissa muodoissa, molekyylipainoltaan suurena (noin 3 88932 54 000 daltonia) ja alhaisena (noin 33 000 daltonia), joista kumpikin muodostuu joko yksi- tai kaksiketjuisesta materiaalista. Molekyylipainoltaan pieni muoto syntyy suuri-molekyylisestä muodosta entsymaattisen irtoamisen kautta.

5 Biologisesti aktiivinen materiaali sisältää nk. seriinipro-teaasiosan, joka on aktiivisessa muodossaan sitoutuneena toiseen ketjuun disulfidisillan kautta. Suurimolekyylisen materiaalin mahdollisen aktiivisuuden uskotaan johtuvan samanlaisesta kahden toisiinsa sitoutuneen ketjun läsnä-10 olosta, strategisesta disulfidisillasta ja häiriöstä ami-nohappojaksossa, joka häiriö epäilemättä sijaitsee molekyylien seriiniproteaasiosassa (ks. kuvio A). Joka tapauksessa, tähän keksintöön saakka oli noin 21 000 daltonin tähteen identiteetti ja siten toiminta tuntematon eikä ak-15 tiivisuuden liittäminen jompaankumpaan urokinaasin tunnetuista ryhmistä ollut kiistattomasti mahdollista.

Vähän aikaa sitten on kuvattu toista urokinaasipep-tidin muotoa, jolla on alhainen, mutta spesifinen aktiivisuus (10, 10A). Spekuloitiin, että tämä materiaali vastai-20 si luonnon urokinaasia, yllä kuvatun, aiemmin eristetyn aktiivisen lajin esimuotoa, joka mitä todennäköisimmin muodostuu yhdestä ketjusta.

Aiempien yritysten kloonata urokinaasia vastaava geeni siihen liittyvine toiveineen ilmentymisen aikaan-25 saamisesta mikrobi-isännässä ei uskottu olevan menestyksekkäitä (11, 11A). Katso myös (6).

Huomattiin, että yhdistelmä-DNA-tekniikan ja siihen liittyvien menetelmien käyttö, olisi sittenkin tehokkain tapa saada aikaan vaadittavia suuria määriä hyvälaatuista, 30 biologisesti aktiivista ihmisen urokinaasia, joka on suurin piirtein vapaata ihmisen proteiinista sekä sen johdannaisia, joissa funktionaalinen biologinen aktiivisuus säilyy tehden siten mahdolliseksi näiden aineiden käytön kliinisesti erilaisten verisuonitilojen tai -sairauksien hoidossa. 35 B. Yhdistelmä-DNA/proteiinibiokemia-tekniikka

Yhdistelmä-DNA-tekniikka on saavuttanut jonkinasteisen taidon vaiheen. Molekyylibiologit pystyvät yhdistämään 4 88932 erilaisia DNA-jaksoja melko helposti luoden uusia DNA-ko-konaisuuksia, jotka pystyvät tuottamaan merkittäviä määriä eksogeenista proteiinituotetta transformoiduissa mikrobeissa ja soluviljelmissä. Hallitaan yleiset keinot ja menetel-5 mät erilaisten tylppäpäisten (blunt ended) tai "tarttuva päisten DNA-jaksojen liittämiseksi in vitro, jolloin syntyy tehokkaita ilmentämisvektoreita, jotka ovat käyttökelpoisia tiettyjen organismien transformoinnissa ja ohjaavat siten niiden tehokasta halutun eksogeenisen tuotteen syntee-10 siä. Lähdettäessä kuitenkin yhden nimenomaisen tuotteen pohjalta tämä tie on edelleen jonkin verran hankala eikä tiede ole kehittynyt sille tasolle, että voitaisiin tehdä säännönmukaisia ennusteita onnistumisesta. Itse asiassa ne, jotka lupaavat onnistuneita tuloksia ilman taustalla ole-15 vaa kokeellista perustaa, tekevät sen ottaen huomattavan epäonnistumisriskin.

Välttämättömien elementtien DNA:iden yhdistäminen, so. replikoitumislähteen, yhden tai useamman fenotyyppiva-lintaominaisuuden, ilmentämispromoottorin, heterologisen 20 geenisiirrännäisen ja vektorin loppuosan liittäminen, tehdään yleensä isäntäsolun ulkopuolella. Tuloksena oleva rep-likoituva yhdistelmä-ilmentämisvektori, eli plasmidi, viedään soluihin transformoimalla ja saadaan suuria määriä yhdistelmävektoria kasvattamalla transformaattia. Silloin, 25 kun geeni on oikeassa asemassa niihin osiin, jotka säätävät kooditetun DNA-viestin transkriptiota ja translaatiota, nähden, on tuloksena oleva ilmentämisvektori käyttökelpoinen tuottamaan todella sitä polypeptidijaksoa, jota siirretty geeni koodittaa; tätä prosessia kutsutaan ilmentämisek-30 si. Tuloksena oleva tuote saadaan talteen hajottamalla, mikäli välttämätöntä, isäntäsolu mikrobisysteemeissä ja eristämällä tuote puhdistamalla se asianmukaisesti muista proteiineista.

Käytännössä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen voi-35 daan ilmentää kokonaan heterologisia polypeptidejä, nk. suora ilmentäminen tai vaihtoehtoisesti voidaan ilmentää he-terologinen polypeptidi fuusioituneena osaan homologisen 5 88932 polypeptidin aminohappojaksosta. Jälkimmäisessä tapauksessa haluttu biologisesti aktiivinen tuote pysyy biologisesti inaktiivisena fuusioituneessa homologisessa/heterologi-sessa polypeptidissä, kunnes se vapautuu solun ulkopuoli-5 sessa ympäristössä. Katso viitteet (12) ja (13).

Samoin on solu- tai soluviljelmälaji, jota käytetään genetiikkaa tutkittaessa, hyvin tunnettu. Hallitaan keinot ja menetelmät pysyvien solulinjojen, jotka on valmistettu peräkkäisillä sarjasiirrostuksilla eristetyistä 10 normaalisoluista, ylläpitämiseksi. Tällaisia tutkimustarkoituksiin käytettäviä solulinjoja ylläpidetään kiinteällä alustalla nestemäisessä kasvualustassa tai kasvattamalla suspensiossa, joka sisältää alustan ravintoaineet. Mittakaavan suurentamisessa laajoja valmistuksia varten näyttää olevan 15 vain mekaanisia ongelmia. Tarkempia taustatietoja saadaan viitteistä (14) ja (15).

Samalla tavoin on proteiinibiokemia käyttökelpoinen, itse asiassa välttämätön täydentäjä biotekniikalle. Solut, jotka tuottavat haluttua proteiinia, tuottavat myös satoja 20 muita proteiineja, solun aineenvaihdunnan endogeenisia tuotteita. Nämä kontaminoivat proteiinit, samoin kuin muut yhdisteet, ellei niitä poisteta halutusta proteiinista, saattaisivat osoittautua myrkyllisiksi annettuina eläimelle tai ihmiselle halutulla proteiinilla annettavan hoidon ai-25 kana. Siten proteiinibiokemian menetelmiä käytetään suunniteltaessa käytettävälle nimenomaiselle systeemille soveltuvia erotusmenettelyjä ja valmistettaessa haluttuun käyttöön turvallinen homogeeninen tuote. Proteiinibiokemia todistaa myös halutun tuotteen identiteetin karakterisoimal-30 la sen ja varmistamalla, että solut ovat tuottaneet sitä uskollisesti ilman mitään muunnoksia ja mutaatioita. Tätä tieteenhaaraa tarvitaan myös suunniteltaessa biologisia kokeita, stabiilisuustutkimuksia ja muita menettelyjä, jotka ovat välttämättömiä ennen onnistuneita kliinisiä kokeita 35 ja markkinointia.

Tämä keksintö perustuu siihen havaintoon, että yh-distelmä-DNA/proteiinibiokemia-tekniikkaa voidaan käyttää 6 88932 menestyksellisesti tuottamaan ihmisen urokinaasia biologisesti toimivan varta vasten valmistetun lajin muodossa. Tämä keksintö tarjoaa käytettäväksi aktiivisen urokinaasi-proteiinin, joka soveltuu käytettäväksi kaikissa muodois-5 saan ihmisten erilaisten verisuonitilojen ja -sairauksien ennaltaehkäisyssä ja hoidossa. Kukin näistä muodoista sisältää biologisesti aktiivisen ryhmän, so. luonnon materiaalin entsymaattisen osan, jonka uskotaan sijaitsevan kaksiket-juisella alueella, joka muodostaa seriiniproteaasiosan.

10 Keksinnön mukaisesti voidaan valmistaa sarja aktiivisia uro-kinaasituotteita joko suoraan biologisesti aktiivisessa muodossa tai, mikä merkille pantavaa, muodossa, joka voidaan muokata in vitro biologisesti aktiiviseksi tuotteeksi. Tämä keksintö tarjoaa myös keinot ja menetelmät täyspitkien 15 luonnon urokinaasimolekyylien tuottamiseksi biologisesti aktiivisessa tai biologisesti aktivoituvassa muodossa, jolla on suurena etuna spesifinen affiniteetti fibriinin suhteen, jollaista ei tähän mennessä ole ollut millään luonnon lähteistä eristetyllä urokinaasituotteella. Siten kek-20 sintö tarjoaa ihmisen urokinaasituotteen, jolla on uutena potentiaalisena ominaisuutena spesifinen aktiivisuus olemassa olevia tukoksia kohtaan. Vastaavaa tuotetta koodattavaa yhdistelmä-DNA:ta sisältävän soluviljelmän tuottaessa tuotetta, ovat hallinnassa keinot ihmisen urokinaasin 25 tuottamiseksi paljon tehokkaammin kuin on ollut mahdollista, ja muodoissa, joiden biologisesti merkittävät ominaisuudet ovat paremmat. Lisäksi, isäntäsolusta riippuen, keksinnön mukainen urokinaasiaktivaattori saattaa sisältää siihen liittyvää glykosylaatiota suuremmassa tai pienemmässä mää-30 rin luonnon materiaaliin verrattuna.

Tämä keksintö muodostuu täten valmistetuista ihmisen urokinaasituotteista sekä tuotantokeinoista ja -menetelmistä. Tämä keksintö koskee lisäksi replikoitavissa olevia DNA-il-mentämisvektoreita, jotka sisältävät ilmennettävissä ole-35 via, ihmisen urokinaasin entsymaattista osaa koodittavia geenijaksoja. Lisäksi keksintö koskee yllä kuvatuilla il-mentämisvektoreilla transformoituja mikro-organismikantoja 7 88932 tai soluviljelmiä ja tällaisten transformoitujen kantojen tai viljelmien mikrobi- tai soluviljelmiä, jotka ovat kykeneviä ohjaamaan keksinnön mukaisten ihmisen urokinaasi-tuotteiden tuotantoa. Lisäksi keksintö koskee vielä eri-5 laisia menetelmiä, jotka ovat käyttökelpoisia mainittujen urokinaasi-geenijaksojen, DNA-ilmentämisvektoreiden, mikro-organismikantojen ja soluviljelmien valmistuksessa sekä niiden erityissovellutuksia. Vielä lisäksi keksintö koskee mainittujen mikro-organismien ja soluviljelmien fermentoin-10 tiviljelmien valmistusta.

Ilmaus "ihmisen urokinaasi" tarkoittaa tässä biologisesti aktiivisessa muodossa olevaa polypeptidiä, jota tuottaa mikrobi- tai soluviljelmä tai jota mahdollisesti valmistetaan käsittelemällä in vitro ja joka sisältää natiinia ma-15 teriaalia vastaavan entsyymiosan. Keksinnön mukaisesti valmistetaan siten ihmisen urokinaasia 1) täyspitkänä, päinvastoin kuin tähän mennessä luonnon lähteistä eristetty materiaali tai 2) muissa biologisesti aktiivisissa muodoissa, jotka sisältävät ne entsyymiosan kohdat, jotka on 20 havaittu välttämättömiksi plasminogeenin aktivoinnissa tai 3) sellaisena, että se sisältää metioniinin ensimmäisenä aminohappona tai signaalipolypeptidin tai konjugoituneen polypeptidin, joka on muu kuin signaalipolypeptidi, fuusioituneena entsyymiosan N-päähän, jolloin metioniini, sig-25 naali- tai konjugaattipolypeptidi on spesifisesti irrotettavissa solun sisäisessä tai ulkopuolisessa ympäristössä (ks. viite 12). Joka tapauksessa tällä tavalla tuotetut ihmisen urokinaasipolypeptidit eristetään ja puhdistetaan siten, että ne soveltuvat käytettäviksi erilaisten sydämen ja 30 verisuonten tilojen ja sairauksien hoidossa.

A. Mikro-organismit/soluviljelmät 1. Bakteerikannat/promoottorit Tässä kuvattu työ tehtiin käyttäen mm. mikro-organismeja E. coli K-12, kanta GM 48 (thr , leu , , IacYl, 3 5 gal K12, gal T22, ara 14, ton A31, tsx 78, Sup E44, darn 3, dcm 6), joka on tallennettu American Type Culture Collection-iin 1982-04-09 (ATCC nro 39099) ja E. coli K-12 kanta 294 8 88932 (end A, thi , hsr , ^hsm+), jota on kuvattu viitteessä (16), ja joka on tallennettu American Type Culture Collectioniin, ATCC-numeroila 31446, 1978-10-28. Monet muut mikrobikannat ovat kuitenkin käyttökelpoisia, esimerkiksi 5 tunnetut E. coli -kannat, kuten E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC-numero 31537, tallennettu 1979-07-03) ja E. coli W 3110 (F , A. , protrooppinen) (ATCC-numero 27325, 1972-02-10) tai monet muut mikrobikannat, joista monet on tallennettu ja (mahdollisesti) saatavissa tunnustetuista mikro-organismien 10 tallennuslaitoksista, kuten American Type Culture Collection-ista (ATCC) - vertaa ATCC-luettelot. Katso (17) . Näitä muita mikro-organismeja ovat esimerkiksi basillit, kuten Bacillus subtilis ja muut enterobakteerit, joista voidaan mainita esimerkkeinä Salmonella typhirum, Serratia marcesans 15 ja Pseudomonas, jotka käyttävät hyväkseen plasmideja, jotka voivat replikoitua ja ilmentää heterologisia geenijaksoja.

Esimerkiksi beta-laktamaasi- ja laktoosipromoottori-systeemejä on käytetty menestyksellisesti aloittamaan ja pitämään yllä mikrobien heterologisten polypeptidien tuotan-20 toa. Näiden promoottorisysteemien valmistusta ja rakennetta koskevia yksityiskohtia on saatavissa viitteistä (18) ja (19). Vähän aikaa sitten on kehitetty järjestelmä, joka perustuu tryptofaanireittiin, nk. trp-promoottorijärjestelmä. Tämän järjestelmän valmistusta ja rakennetta koskevat yksi-25 tyiskohdat on saatavissa viitteistä (20) ja (21). Monia muita mikrobipromoottoreita on keksitty ja käytetty hyväksi ja niiden nukleotidijaksoja koskevat yksityiskohdat, jotka tekevät asiantuntijalle mahdolliseksi liittää niitä funk-tionaalisesti plasmidivektorien sisään, on julkaistu - kat-30 so (22) .

2. Hiivakannat/hiivapromoottorit Tässä ilmentämisjärjestelmässä voidaan käyttää myös plasmidia, joka pystyy valintaan ja replikoitumiseen E. colirssa ja/tai hiivassa, Saccharomyces cerevisiae:ssa.

35 Hiivassa tapahtuvaa valintaa varten plasmidi voi sisältää TRP1-geenin (23, 24, 25), joka komplementoi (sallii kasvun tryptofäänin poissa ollessa) hiivaa, joka sisältää hiivan 9 88932 kromosomissa IV olevassa tässä geenissä mutaatioita (26). Käyttökelpoinen kanta on RH218 (27), joka on tallennettu rajoittamattomasti American Type Culture Collectioniin 1980-12-08 (ATCC-nro 44076). On kuitenkin selvää, että mikä 5 tahansa Saccharomyces cerevisiae -kanta, joka sisältää mutaation, joka tekee solun trp1-tyyppiseksi, on periaatteessa tehokas ympäristö ilmentämissysteemin sisältävän plas-midin ilmentämiselle, esimerkiksi kanta pep4-1 (28). Tällä tryptofaaniauksotrofisella kannalla on myös mutaatiokohta 10 TRP1-geenissä.

Sijoitettuna muun kuin hiivageenin 5'-sivulle voi hiivaageenin 5'-sivun DNA-jakso (promoottori) (koodattii alkoholidehydrogenaasi 1:a) edistää vieraan geenin ilmentämistä hiivassa, kun se sijoitetaan hiivan transformointiin 15 käytettävään plasmidiin. Promoottorin lisäksi muun kuin hiivageenin ilmentäminen hiivassa oikealla tavalla vaatii toista hiivan jaksoa sijoitettuna muun kuin hiivageenin 3'-päähän plasmidissa, mikä tekee mahdolliseksi asianmukaisen transkription päättämisen ja polyadenylaation hiivassa. 20 Edullisissa toteutusmuodoissa hiivan 3-fosfoglyseraattiki-naasigeenin 5'-sivun jakso (29) sijoitetaan rakennegeenin edelle, jota rakennegeeniä seuraa jälleen DNA, joka sisältää terminaatio-polyadenylaatiosignaalit, esimerkiksi TRP1-geeni (23-25) tai PGK-geeni (29).

25 Koska hiivan 5'-sivun jakso (yhdessä hiivan 3'-ter- minaatio-DNA:n kanssa) (infra) voi toimia edistäen vieraiden geenien ilmentymistä hiivassa, näyttää todennäköiseltä, että minkä tahansa hiivageenin 5'-sivun jaksoja voitaisiin käyttää tärkeiden geenituotteiden ilmentämiseen, esimerkik-30 si glykolyttisien geenien, kuten esimerkiksi enolaasi-, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi-, heksokinaasi-, pyruvaattidekarboksylaasi-, fosfofruktokinaasi-, glukoosi- 6-fosfaatti-isomeraasi-, 3-fosfoglyseraattimutaasi-, pyru-vaattikinaasi, trioosifosfaatti-isomeraasi-, fosfoglukoosi-35 isomeraasi- ja glukokinaasigeenien, ilmentämiseen. Mitä tahansa näiden geenien 3'-sivun jaksoa voitaisiin myös käyttää asianmukaiseen terminaatioon ja mRNA-polyadenylaatioon tällaisessa ilmentämissysteemissä.

,0 889:-2

Lopuksi, hiivapromoottorit sisältävät myös transkription kontrollin, joten ne voidaan "kytkeä päälle tai pois" vaihtelemalla kasvuolosuhteita. Joitakin esimerkkejä tällaisista hiivapromoottoreista ovat geenit, jotka tuotta-5 vat seuraavia proteiineja: alkoholidehydrogenaasi II, hap-pofosfataasi, typpiaineenvaihduntaan liittyvät hajottavat entsyymit, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi sekä entsyymit, jotka vastaavat maltoosin ja galaktoosin hyväksikäytöstä (30). Tällainen säätelyalue voisi olla hyvin hyö-10 dyllinen kontrolloitaessa proteiinituotteen ilmentämistä -erityisesti silloin, kun niiden tuotanto on hiivalle myrkyllistä. Pitäisi olla myös mahdollista yhdistää yhden 5'-sivun jakson kontrollialue 5'-sivun jaksoon, joka sisältää promoottorin ja on peräisin voimakkaasti ilmennetystä gee-15 nistä. Tämä johtaisi hybridipromoottoriin ja tämän pitäisi olla mahdollista, koska säätelyalue ja promoottori näyttävät olevan fysikaalisesti erillisiä DNA-jaksoja.

3. Soluviljelmäsysteemit/soluviljelmävektorit

Selkärankaisten solujen kasvatuksesta viljelmässä 20 (kudosviljelmässä) on viime vuosina tullut rutiinimenetel-mä. (Katso 31). Käyttökelpoinen isäntä heterologisen proteiinin tuottamiseen on apinan munuaisen sidesolujen COS-7-linja (32). Tässä keksinnössä voidaan kuitenkin käyttää mitä tahansa solulinjaa, joka pystyy soveltuvan vektorin 25 replikoimiseen ja ilmentämiseen, esimerkiksi solulinjoja WI38, BHK, 3T3, CHO, VERO ja HeLa. Lisäksi ilmentämisvek-torilta vaaditaan replikoitumislähde ja promoottori, jotka sijaitsevat ilmennettävän geenin edessä, sekä mahdolliset välttämättömät ribosobien sitoutumiskohdat, RNA-pilkkoutu-30 miskohdat, polyadenylaatiokohta ja transkription terminaat-torijaksot. On selvää, että tämä keksintö, vaikka sitä kuvataan tässä edullisen toteutusmuodon avulla, ei rajoitu vain näihin jaksoihin. Voitaisiin esimerkiksi käyttää muiden virusvektoreiden (esimerkiksi Polyoma, Adeno, VSV, 35 BPV, jne.) repiikoitumislähteitä, samoin kuin DNA:n repli-koitumislähteitä, samoin kuin DNA:n replikoitumisen solu-lähteitä, jotka voivat toimia ei-integroidussa tilassa.

n 88932 Tällaisissa selkärankaissoluisännissä voi urokinaa-situotteen geneettinen ilmentämisvektori sisältää myös sekundaarisen geneettisen kooditusjakson, joka on saman promoottorin ohjauksen alaisena. Sekundaarinen jakso toimii 5 hyvänä merkkiaineena tutkittaessa sekä transformaatteja yleensä että transformaatteja, jotka ilmentävät tehokkaasti primaarista jaksoa, samoin kuin kontrollivälineenä, jolla halutun urokinaasipolypeptidin ilmentymistä voidaan säätää, useimmiten edistää.

10 Tämä on erityisen merkittävää, sillä molempia pro teiineja syntyy erikseen valmiissa muodossa. Koska molempia DNA-kooditusjaksoja kontrolloi sama transkriptiopro-moottori, niin että muodostuu fuusioitunut viesti (mRNA), niitä erottaa ensimmäisen jakson translaation lopetussig-15 naali ja toisen jakson aloitussignaali, jolloin muodostuu kaksi itsenäistä proteiinia.

On havaittu, että ympäristöolosuhteet ovat usein tehokkaita säädeltäessä solujen tuottamien tiettyjen entsyymien määrää tietyissä kasvuolosuhteissa. Edullisessa toteu-20 tusmuodossa käytetään hyväksi tiettyjen solujen herkkyyttä metotreksaatille (MTX), joka on dihydrofolaattireduktaasin (DHFR) inhibiittori. DHFR on entsyymi, jota tarvitaan epäsuorasti synteesireaktioissa, joihin liittyy yhden hiilen sisältävien yksiköiden siirto. DHFR-aktiivisuuden puute ai-25 heuttaa solujen kyvyttömyyden kasvaa ellei läsnä ole yhdisteitä, jotka muuten vaativat yhden hiilen sisältävien yksiköiden siirtoa omaa synteesiään varten. Solut, joista DHFR puuttuu, kasvavat kuitenkin glysiinin, tymidiinin ja hypoksantiinin yhdistelmän läsnäollessa.

30 Tiedetään, että metotreksaatti inhiboi soluja, jotka normaalisti tuottavat DHFR:a. Useimmiten asianomaisten me-totreksaattimäärien lisääminen normaaleihin soluihin johtaa solujen kuolemaan. Jotkut solut säilyvät kuitenkin hen- ____: gissä metotreksaattikäsittelyssä valmistamalla suurempia 35 määriä DHFR:a ylittäen siten metotreksaatin tätä entsyymiä inhiboivan kapasiteetin. Viime aikoina on osoitettu, että tällaisissa soluissa on suurempi määrä DHFR-jaksoa koodittavaa 12 88932 mRNA:ta. Tämä selitetään olettamalla, että tätä lähetti-RNA:ta koodittavan DNA:n määrä lisääntyy geenimateriaalissa. Itse asiassa metotreksaatin lisääminen aiheuttaa DHFR-geenin vahvistumisen. Geenijaksot, jotka ovat fysikaalises-5 ti liittyneinä DHFR-jaksoon, vaikka eivät ole saman promoottorin ohjaamia, vahvistuvat myös. Siten on mahdollista käyttää metotreksaatin lisäämisestä johtuvaa DHFR-geenin vahvistumista vahvistamaan samanaikaisesti toisen proteiinin, tässä tapauksessa halutun urokinaasipolypeptidin, 10 geeniä.

Lisäksi, jos isäntäsoluista, joihin sekundaarinen DHFR-jakso viedään, itsestään puuttuu DHFR, DHFR toimii hyvänä merkkiaineena valittaessa menestyksellisesti trans-fektoituja soluja. Jos DHFR-jakso on voimakkaasti liittynyt 15 halutun peptidin jaksoon, voidaan tätä ilmiötä käyttää hyväksi myös merkkinä onnistuneesta transfektiosta halutulla jaksolla.

B. Vektorisysteemit 1. Ilmentäminen bakteerisysteemeissä 20 Bakteereissa, esim. E. colissa, käytettävät ilmentä- misplasmidit, valmistetaan tavallisesti käyttäen vektorina BR322:a (37) ja sijoittamalla asianmukaisesti heterologi-nen geenijakso yhdessä translaation aloitus- ja lopetussig-naalien kanssa toimivaan lukufaasiin, jossa on funktionaa-25 linen promoottori, käyttäen hyväksi joko tavallisia tai synteettisesti valmistettuja restriktiokohtia. Vektori sisältää yhden tai useamman karakteristisen fenotyypin valinta-geenin ja repiikoitumislähteen vahvistumisen takaamiseksi isännässä. Heterologinen siirrännäinen voidaan jälleen liit-30 tää siten, että se ilmentyy yhdessä fuusioituneen esijak-son kanssa, joka on saatavissa esimerkiksi trp-systeemin geeneistä.

2. Ilmentäminen hiivassa

Heterologisen geenin, kuten ihmisen urokinaasi-35 cDNA:n, ilmentämiseksi hiivassa on välttämätöntä konstruoida plasmidivektori, joka sisältää neljä komponenttia.

Yksi komponentti on osa, joka tekee mahdolliseksi sekä 13 88932 E. coli että hiivan transformaation ja jonka tulee siten sisältää valittavissa oleva geeni kummastakin organismista. Tämä voi olla E. coliin ampisilliiniresistenssigeeni ja hiivan TRP1-geeni. Tämä komponentti vaatii myös replikoi-5 tumislähteen kummastakin organismista pidettäväksi yllä plasmidi-DNA:n kummassakin organismissa. Tämä voi olla E. coli -lähde pBR322:sta ja ars1-lähde hiivan kromosomi II:sta.

Toisena komponenttina on plasmidissa 5'-sivun jakso, 10 joka on peräisin hiivageenistä ja joka edistää jäljempänä olevan rakennegeenin transkriptiota. 5'-sivun jakso voi olla hiivan 3-fosfoglyseraattikinaasigeenin (PGK-geenin) jakso. Tämä fragmentti konstruoidaan siten, että poistetaan ATG PGK-rakennejaksosta ja korvataan se jaksolla, jo-15 ka sisältää vaihtoehtoiset restriktiokohdat, kuten restrik-tiokohdat Xbal ja EcoRI, jotta saataisiin helposti liitetyksi tämä 5'-sivun jakso rakennegeeniin.

Systeemin kolmantena komponenttina on rakennegeeni, joka on konstruoitu siten, että se sisältää sekä translaa-20 tion aloitus-ATG-signaalin että translaation lopetus-ATG-signaalin.

Neljäntenä komponenttina on hiivan DNA-jakso, joka sisältää hiivan geenin 3'-jakson, joka sisältää asianmukaiset transkription lopettamista ja polyadenylaatiota kos-25 kevät signaalit.

3. Ilmentäminen nisäkässoluviljelmässä

Heterologisen peptidin syntetoimisen strategia nisäkässoluvil jelmässä perustuu siihen, että kehitetään vektori, joka kykenee itsenäisesti sekä replikoimaan että ilmen-30 tämään vierasta geeniä heterologisen transkriptioyksikön ohjauksessa. Tämän vektorin replikoituminen kudosviljelmässä saadaan aikaan käyttämällä DNA:n replikoitumislähdettä (kuten SV40-viruksesta saatavaa) ja ottamalla käyttöön apufunktio (T-antigeeni) viemällä vektori solulinjaan, joka ____ 35 ilmentää endogeenisesti tätä antigeeniä (33, 34). SV-40- viruksen myöhempi promoottori edeltää rakennegeeniä ja varmistaa geenin transkription.

14 88932 Käyttökelpoinen vektori ilmentymisen aikaansaamiseksi muodostuu pBR322-jaksoista, mikä tarjoaa valittavissa olevan merkitsijän E. colissa tapahtuvaa valintaa varten (ampisilliiniresistenssi) samoin kuin DNA:n replikoi-5 tumisen E. coli -lähteen. Nämä jaksot ovat johdettavissa plasmidista pML-1. SV40-lähde on johdettavissa 342 emäspa-rin PvuII-Hindlll-fragmentista, joka pitää sisällään tämän alueen (35, 36) (molemmat päät ovat muutettavissa EcoRI-päiksi). Nämä jaksot, sen lisäksi, että ne muodostavat 10 DNA:n replikoitumisen viruslähteen, koodittavat sekä aiemman että myöhemmän transkriptioyksikön promoottoria. SV40-lähdealueen orientoituminen on sellainen, että myöhemmän transkriptioyksikön promoottori on lähinnä interferonia koodittavaa geeniä.

15 Kuvio A on urokinaasipolypeptidin kaaviokuva. Pieni molekyylinen urokinaasi alkaa aminohaposta 136 ja päättyy aminohappoon 412. Sekä pieni- että suurimolekyylisen yksi-ketjuisen muodon muuttaminen biologisesti aktiiviseksi kaksiketjuiseksi muodoksi tapahtuu katkeamisen kautta ami-20 nohappojen 158 ja 159 välistä. Pre-urokinaasi alkaa aminohaposta 20. Kuvattu disulfidisidosten konformatiivinen sijainti perustuu analogisesti muihin seriiniproteiineihin.

Kuviot 1A-1C esittävät pienimolekyylistä, 33 000 daltonin, biologisesti aktiivista urokinaasiproteiinia 25 varten olevan plasmidi-pD2-cDNA-siirrännäisen nukleotidi-järjestystä ja restriktio-endonukleaasikarttaa. Synteettisen deoksioligonukleotidi CB6B-osan nukleotidiosa on alleviivattu .

Kuviot 2A-2B esittävät kuvion 1 cDNA-jaksosta joh-30 dettua aminohappojärjestystä; cDNA-siirrännäisosan aminohapot on numeroitu yhdestä 279:ään.

Kuviot 3A-3C esittävät täyspitkän ihmisen urokinaa-siproteiinin cDNA:n nukleotidijärjestystä ja restriktio-endonukleaasikarttaa. CB6B-osa on samoin alleviivattu.

35 Kuviot 4A-4B esittävät kuvion 3 cDNA-jaksosta joh dettua täyspitkää urokinaasia koodittavaa aminohappojärjestystä .

,5 88932

Kuvio 5 esittää pitkän fuusio-33 000 daltonia -proteiinin ilmentämistä varten olevan plasmidin pUK33trpLEL konstruoimista.

Kuvio 6 esittää lyhyen fuusio-33 000 daltonia -pro-5 teiinin ilmentämistä varten olevan plasmidin pUK33trpLEg konstruoimista.

Kuvio 7 esittää 33 000 daltonin proteiinin suoraa ilmentämistä varten olevan plasmidin konstruoimista.

Kuvio 8 esittää 33 kilodaltonin proteiinin suoraa 10 ilmentämistä varten olevan plasmidin toisenlaista konstruoimista .

Kuviot 9 ja 10 esittävät 54K-urokinaasin ja 54K-uro-kinaasiprekursorin suoraa ilmentämistä varten olevan plasmidin konstruoimista.

15 Kuvio 11 plasmidin (p-pEH3-Ba114-preUK54), joka on tarkoitettu 54K-urokinaasin ilmentämiseen eukarioottisissa soluissa, konstruoimista.

Kuvio 12 esittää ajasta riippuvaa tässä kuvatulla tavalla valmistetun urokinaasin aikaansaamaa ja sitä vaati-20 vaa plasminogeenin aktivoitumista plasmiinikokeessa.

Kuvio 13 esittää keksinnön mukaisten urokinaasmuutteiden plasminogeenia aktivoivaa vaikutusta ja tämän vaikutuksen inhiboitumista luonnon urokinaasin vasta-aineiden vaikutuksesta.

25 A: Urokinaasi-mRNArn lähde

Detroit 562 (ihmisen nielusyöpä) -soluja (38) (ATCC-nro CCL 138) kasvatetaan yhtenäiseksi Eagle's minimum essential medium -alustalla (39), jota oli täydennetty siten, että se sisälsi 3 % natriumbikarbonaattia (pH 7,5), 30 1 % L-glutamiinia (Irvine), 10 % naudan sikiön seerumia, 1 % natriumpyruvaattia (Irvine), 1 % ei-välttämättömiä aminohappoja (Irvine), 2,4 % HEPES (pH 7,5), 50 ,ug/ml gara-mysiiniä ja inkuboitiin 37 C:ssa 5 % CC^a sisältävässä ilmakehässä. Yhteensulautuneet solut kerättiin sentrifu-35 goimalla, kun ne oli käsitelty 0,25 %:lla trypsiiniä 15 minuutin ajan 37°C:ssa.

16 88932 B. Lähetti-RNA:n eristäminen

Detroit 562 -solujen kokonais-RNA uutettiin suurinpiirtein Lynchin et ai. kuvaamalla tavalla (40). Solut pel-letoitiin sentrifugoimalla ja noin 1 g soluja suspendoitiin 5 sitten uudelleen 10 ml:aan liuosta, joka oli 10 mM NaCl:n, 10 mM Tris.HCl:n (pH 7,4) ja 1,5 mM MgCl2:n suhteen. Solut hajotettiin lisäämällä ei-ionista detergenttiä NP-40 siten, että sen loppupitoisuus oli 1 %. Tumat poistettiin sentrifugoimalla ja RNA puhdistettiin edelleen uuttamalla kahdes-10 ti fenoli(uudelleen tislattu)/kloroformi/isoamyylialkoholi-seoksella 4°C:ssa. Vesifaasi tehtiin 0,2-molaariseksi NaCl:n suhteen ja kokonais-RNA saostettiin lisäämällä kaksinkertainen tilavuus 100-%:ista etanolia ja pitämällä yön yli -20°C:ssa. Sentrifugoinnin jälkeen polyA-mRNA puhdistettiin 15 kokonais-RNA:sta oligo-dT-selluloosakromatografiaa käyttäen (41). Saannot 1 g:sta soluja olivat tyypillisesti 10-15 mg kokonais-RNA:ta, josta noin 2 % oli polyA-RNA:ta.

C. polyA-mRNA:n fraktiointi koon mukaan polyA-mRNA:n (200 ^ug) fraktiointi koon mukaan teh- 20 tiin elektroforeesilla käyttäen happo-urea-geeliä, joka sisälsi 1,75 % agaroosia ja oli 25 mM natriumsitraatin (pH 3,8) ja 6M urean suhteen (40, 42). Elektroforeesi kesti seitsemän tuntia 25 mA:n virralla 4°C:ssa. Sitten geeli jaettiin osiin käsin partakoneenterää käyttäen. Erilliset 25 geeliviipaleet sulatettiin 70°C:ssa, laimennettiin 12 ml :11a liuosta, joka oli 10 mM NaCl:n, 10 mM Tris.HCl:n (pH 7,4), 1,5 mM MgCl2:n suhteen ja sisälsi 0,1 % SDS ja uutettiin kahdesti vedellä kyllästetyllä, uudelleen tislatulla fenolilla ja kerran kloroformilla. Fraktiot saostettiin sitten 30 etanolilla ja niille tehtiin sen jälkeen translaatio in vitro (43) aikaan saadun koon mukaisen fraktioinnin ja polyA-mRNA:n muuttumattomuuden määrittämiseksi.

D. 01igo-dT-pohjäisen pesäkekirjaston, joka sisältää urokinaasi-DNA-jaksoja, valmistus 35 PolyA-mRNA fraktioitiin koon mukaan happo-urea-gee- leillä. mRNA-fraktioita, jotka olivat suurempia kuin 12S yhdistettiin ja niitä käytettiin mallina kaksoisrihma-cDNA:n 17 88932 oligo-dT-pohjäisessä valmistuksessa tavanomaisia menetelmiä käyttäen (44, 45). cDNA fraktioitiin koon mukaan 6-%: isella polyakryyliamidigeeli-elektroforeesilla ja elektro-eluoimalla saatiin 132 ng kaksoisrihma-DNA:ta, joka oli pi-5 dempää kuin 350 emäsparia. 30 ng:n osa kaksoisrihma-cDNArsta (ds-cDNA) pidennettiin deoksi-C-tähteillä käyttäen termi-naali-deoksinukleotidyylitransferaasia (46) ja liitettiin 200 ng:aan plasmidia pBR322 (37), jonka pää oli pidennetty samalla tavalla deoksi-G-tähteillä Pstl-kohdassa (4 6) . Ku-10 takin yhdistettyä seosta käytettiin sitten transformoitaessa E. coli K12, kanta 294 (ATCC-nro 31446). Saatiin noin 10 000 tetrasykliiniresistenttiä, ampisilliinille herkkää transformaattia.

E. Synteettisten DNA-oligomeerien valmistus käytet-15 täviksi urokinaasin tutkimisvälineinä

Kahdeksan synteettistä DNA-oligomeeriä, jotka olivat 14 emäksen mittaisia, suunniteltiin täydentämään mRNA:ta, joka perustuu urokinaasin syanogeenibromidipolypeptidifrag-mentin, jota merkitään CB6:ksi, aminohappojaksoon Met-Tyr-20 Asn-Asp-Pro. Nämä kahdeksan deoksioligonukleotidia synte-toitiin fosfotriesterimenetelmällä (17) seuraavissa kahden ryhmissä: (CB6A) 5' GGGTCGTTA/GTACAT 3', (CB6D) 5' GGATCGTTA/ GTACAT 3', (CB6C) 5' GGGTCATTA/GTACAT 3', (CB6D) 5' GGATCATTA/ GTACAT 3'. Kukin kahden oligomeerin ryhmä fosforyloitiin 25 sitten radioaktiivisesti seuraavasti: 250 ng deoksioligonukleotidia yhdistettiin 25 ^ul:aan liuosta, joka oli 60 mM Tris.HCl:n (pH 8), 10 mM MgCl_:n ja 15 mM beta-merkapto- ^ 3 2 etanolin suhteen ja sisälsi 100 ^uCi (y- P) ATP:ta (Amersham, 5000 ci/mmol). Lisättiin viisi yksikköä T4-polynukleotidi-30 kinaasia, reaktion annettiin edetä 37°C:ssa 30 minuuttia ja päätettiin lisäämällä EDTAa pitoisuudeksi 20 mM.

F. Oligo-dY-pohjäisen pesäkekirjaston urokinaasi-jaksojen tutkiminen

Noin 10 000 pesäkettä inokuloitiin yksitellen mikro-35 maljojen syvennyksiin, jotka sisälsivät LB-alustaa (48) + 5 ^ug/ml tetrasykliiniä ja pidennettiin -20°C:ssa sen jälkeen, kun oli lisätty DMS0:a pitoisuudeksi 7 %. Tämän is 88932 kirjaston yksittäiset pesäkkeet siirrostettiin Schleicher and Schuell BA85/20 -nitroselluloosasuodattimille ja kasvatettiin agarmaljoilla, jotka sisälsivät LB-alustaa + 5 yug/ml tetrasykliiniä. Kun pesäkkeitä oli kasvatettu 5 noin 10 tuntia 37°C:ssa, suodattimet siirrostettiin agarmal joille, jotka sisälsivät LB-alustaa + 5 ^ug/ml tetrasykliiniä ja 12,3 ,ug/ml kloramfenikolia ja inkuboitiin

O

sitten yön yli 37 C:ssa. Kunkin pesäkkeen DNA denaturoitiin sitten ja kiinnitettiin suodattimelle käyttäen muun-10 nelmaa Grunstein-HogneSS-menetelmästä (49). Kutakin suodatinta pidettiin kolme minuuttia liuoksessa, joka oli 0,5N NaOH:n ja 1,5M NaCl:n suhteen pesäkkeiden hajottamiseksi ja DNA:n denaturoimiseksi ja neutraloitiin sitten pitämällä 15 minuuttia liuoksessa, joka oli 3M NaClrn ja 0,5 Tris.HClrn 15 (pH 7,5) suhteen. Sitten suodattimia pidettiin vielä 15 minuuttia 2XSSC:ssa ja sen jälkeen kaksi tuntia vakuumiuu-nissa 80°C:ssa. Suodattimia esihybridisoitiin noin kaksi tuntia huoneen lämpötilassa liuoksessa, joka oli 0,9M NaCl:n, 1X Denhardts'n, 100 mM Tris.HCl:n (pH 7,5), 5 mM 20 Na-EDTA:n, 1 mM ATP:n, 1M natriumfosfaatin (kaksiemäksinen) ja 1 mM natriumpyrofosfaatin suhteen ja sisälsi 0,5 % NP-40:a ja 200 ^ug/ml E. coli -tRNArta ja hybridisoitiin samassa liuoksessa yön yli suurinpiirtein Wallacen et ai. menetelmällä (50) käyttäen noin 40 x 10^ cpm kutakin kinaa-25 sikäsiteltyä 2:n CB6-deoksioligonukleotidin ryhmää. Kun suodattimet oli pesty huolellisesti 6XSSC/0,1 % SDS-liuok-sella, ne kehitettiin Kodak XR-5-föntgenfilmille DuPont Lightning-Plus-intensiteetin parantajien avulla 16-24 tuntia -80°C:ssa. Kaksi pesäkettä osoitti hybridisoitumista 30 kahdeksan tutkimisvälineen seoksella: UK513dT69D2 (pD2) ja UK513dT73Dl2 (pD12).

G. pD2- ja pD12-plasmidi-DNA:n karakterisointi Plasmidi-DNA:lie, joka oli eristetty E. coli -pesäkkeistä UK513dT69D2 ja UK513dT73D12 nopealla miniscreen-mene-35 telmällä (51), tehtiin Pstl-restriktioendonukleaasianalyy-si. Analyysin tulos viittasi vahvisti siihen, että pD2 ja pD12 ovat identtisiä. Kussakin plasmidi-DNA:ssa on 3 PstI- 19 88932 restriktiofragmenttia, jotka siirtyvät mukana tehtäessä elektroforeesi 6-%:isella polyakryyliamidigeelillä· Plas-midi-pD2-cDNA-siirrännäisen täydellinen nukleotidijärjestys määritettiin dodeoksinukleotidi-ketjun päättämismene-5 telmällä (52) sen jälkeen, kun Pstl-restriktiofragmentit oli alikloonattu M13-vektoriin mp7 (53). Kuvio 1 esittää pD2:n cDNA-siirrännäisfragmentin nukleotidijärjestystä ja kuvio 2 samaa järjestystä, jolle on tehty translaatio. Pienimolekyylisen (33K) urokinaasin koko kooditusalue eris-10 tettiin tästä suuresta pD2-fragmentista. CB6B (51GGATCGTTA/ GTACAT)-deoksioligonukleotidin nukleotidijakso sisältää nukleotidit 466-479 tämän kartan mukaan. Tyypillinen serii-niproteaasin aktiivinen kohta (gly asp ser gly gly pro) sijaitsee aminohappojen 222 ja 227 välissä. Kooditusalue muo-15 dostuu suurimolekyylisen (54K) urokinaasin karboksyylipäät-teisen osan 838 emäsparista eli 279 aminohaposta. Pääteko-doni UGA aminohapon 280 kohdalla aloittaa noin 935 nukleotidin 3'-kääntämättömän jakson, joka jatkuu polyA-jaksoon asti. Koska pD2:n cDNA-jaksoon asti. Koska pD2:n cDNA-20 siirrännäinen kooditti vain 31413 daltonia koko urokinaasin pituudesta, oli välttämätöntä konstruoida lisää pesäke-pankkeja, jotka sisälsivät urokinaasijaksoja, suurimolekyylisen urokinaasin identifioimiseksi.

H. Kahden erilaisen erityispohjäisen pesäkepankin 25 konstruointi olemassa olevan urokinaasikloonin aminopään pidentämiseksi

Ensimmäisessä erityispohjäisessä cDNA-pankissa käytettiin 45 emäsparin urokinaasi-DNA-restriktioendonukleaa-sifragmenttia, joka alkoi Haell-kohdasta 225 ja loppui 30 Accl-kohtaan 270 (kuvio 1), pohjana oligo-dT^ 2_-| g:n sijasta. Tämä fragmentti denaturoitiin lämmöllä fraktioimatto-man Detroit 562 -polyA-mRNA:n (20 ^ug) läsnäollessa ja cDNA valmistettiin kohdassa D kuvatuin menetelmin. 11,5 ng kak-soisrihma-cDNA:ta, joka oli pituudeltaan yli 200 bp, elek-35 troeluoitiin 6-%:isesta polyakryyliamidigeelistä ja käytettiin valmistettaessa noin 6 000 kloonia E. coli 294:ään.

20 8 8 9 3 2

Toinen erityisesti pohjustettu noin 4 000 pesäkkeen cDNA-pankki, jota kutsuttiin UK89CB6:ksi, konstruoitiin käyttäen 4 ^ug happo-urea-agaroosigeeligraktion 8 polyA-mRNArta ja 4 ^,ug fraktion 9 poly-mRNA:ta yhdistettyinä 5 (kohta C). 250 ng kutakin deoksioligo-nukleotidi-yhdistel-mää (kohta E) käytettiin pohjana oligo-dT^g:n sijasta.

I. Täyspitkiä jaksoja sisältävän pesäkepankin tutkiminen Täyspitkää cDNA:ta sisältäviä pesäkkeitä siirros-10 tettiin suoraan nitroselluloosasuodattimille ja kasvatettiin sitten 37°C:ssa. Pesäkkeet hajotettiin ja DNA denaturoitiin ja kiinnitettiin suodattimille kohdan F mukaisesti 32 (49). Valmistettiin P-merkitty DNA-tutkimisväline (54) 143 emäsparin restriktioendonukleaasifragmentista Hinfl-15 Haell, joka oli saatu pD2:n cDNA-siinnärräisestä ja hybri-disoitiin (55) suodattimelle kiinnitetyn tayspitkän cDNA:n kanssa. 8x10^ cpm:ää vastaava määrä välinettä hybridisoi-tiin 16 tuntia, pestiin sitten kuvatulla tavalla (55) ja kehitettiin röntgenfilmille. Kahdella pesäkkeellä esiintyi 20 voimakasta hybridisoitumista: A3:11a ja E9:llä.

J. Täyspitkien urokinaasi-cDNA:iden pA3:n ja pE9:n karakterisointi A3-plasmidi-DNA:n Pstl-restriktioanalyysi osoitti cDNA-siirrännäisfragmentit noin 360 bp ja noin 50 bp ja 25 E9-plasmidi-DNA:n analyysi yhden, noin 340 bp:n fragmentin. Kunkin plasmidi-DNA:n kaksoisrestriktiot (PstI,

EcoRI) osoitti yhteisen noin 190 bp:n cDNA-siirrännäisfrag-mentin, kuten oli odotettukin, jolloin kukin plasmidi-DNA kooditti urokinaasijaksoa 51-suuntaan pöhjafragmenttiin 30 Haell-Accl nähden. Plasmidilla pA3 on ylimääräinen 185 bp:n cDNA-siirrännäisfragmentti Pstl-EcoRI ja E9:llä ylimääräinen 160 bp:n fragmentti. pA3:n suurempi, noin 360 bp:n Pstl-cDNA-siirrännäisfragmentti alikloonattiin M13-vekto-riin mp7 (53) ja sekvenssianalyysi tehtiin dideoksinukleo-35 tidi-ketjun päättämismenetelmällä (52). pA3 :n urokinaasia koodittava jakso sijaitsee suunnilleen asemien 405 ja 785 välissä täyspitkää urokinaasiproteiinia koodittavassa cDNA:ssa (kuvio 3).

21 88932 K. Urokinaasipesäkepankin UK89CB6 tutkiminen

Noin 1900 cDNA-siirrännäisiä sisältävän UK89CB6- pesäkkeen DNA denaturoitiin ja kiinnitettiin nitroselluloo- 32 sasuodattimille kohdan F mukaisesti. P-merkitty DNA-tut-5 kimisväline valmistettiin (54) pA3:n cDNA-siirrännäisfrag- g mentin 146 bp:n fragmentista Pstl-Hingl. 40 x 10 cpm:ää vastaava määrä tätä välinettä hybridisoitiin sitten suodat-timelle kiinnitettyyn UK89CB6-pesäkkeiden DNA:han 16 tunnin ajan, pestiin kuvatulla tavalla (55) ja kehitettiin 10 röntgenfilmille. Kaksi hybridisoitumista osoittavaa pesäkettä olivat UK89CB6F1 (pFl) ja UK89CB6H10 (pHlO).

L. pF1- ja pH10-urokinaasi-cDNA:iden karakterisointi pF1:n restriktio Pstl:lla osoittaa siinä olevan noin 450 bp:n ja noin 125 bp:n cDNA-siirrännäisfragmentit, ja 15 pHl0:ssä on yksi Pst-cDNA-siirrännäisfragmentti, jonka pituus on noin 500 bp. pF1:n kaksoisrestriktio Pstl:lla ja EcoRI:lla osoittaa, ettei läsnä ole yhtään EcoRI-restrik-tiokohtaa ja cDNA-siirrännäisfragmentit ovat samat kuin pelkällä Pstl-restriktiolla saatavat. pHlOrssa on EcoRI-20 restriktiokohta, josta ovat tuloksena cDNA-siirrännäis-fragmentit noin 375 bp ja noin 110 bp. Tämä pH10:n EcoRI-kohta on todennäköisesti sama kuin asemassa 627 havaittu (kuvio 3). pF1:n cDNA-siirrännäinen ei sisällä tätä EcoRI-restriktiokohtaa.

25 pF1, jolla pidempi cDNA-siirrännäisfragmentti kuin pHl0:11a, valittiin sekvenssianalyysin kohteeksi. Molemmat pF1-cDNA-siirrännäisen Pstl-restriktiofragmentit analysoitiin alikloonaamalla M13:een ja tekemällä dideoksi-sek-venssianalyysi. pF1:n, pA3:n ja pD2:n UK-cDNA-siirrännuis-30 ten yhdistetty nukleotidijakso, joka koodittaa suurimole-kyylisen täyspitkän urokinaasin koko aminohappojaksoa, on kuviossa 3. pF1:n urokinaasia koodattava jakso ulottuu asemasta 1 noin asemaan 570. pD2:n urokinaasia koodattava jakso sijaitsee asemien 532 ja 2304 välissä kuviossa 3.

35 Aminopään seriini aminohappoasemassa 1, joka määri tettiin aminohappojärjestysanalyysillä, näkyy kuvioissa A ja 4. Edeltävät aminopään 20 aminohappoa alkaen metiotii- 22 88 932 nistä ja päättyen glysiiniin toimivat todennäköisesti sig-naalijaksona jäljellä olevien suurimolekyylisen urokinaa-sin 411 aminohapon eritykselle. Tällä oletetulla signaali-jaksolla on piirteitä, kuten koko ja hydrofobisuus (56, 5 57), jotka ovat yhteisiä muiden karakterisoitujen signaali- jaksojen kanssa.

Trypsiini-katkeamiskohdat, jotka erottavat 33K:n kaksiketjuisen pienimolekyylisen urokinaasin suurimolekyy-lisestä urokinaasista, ovat seuraavat: lys asemassa 136 on 10 lyhyen ketjun aminopään päätehappo ja ile asemassa 159 on pitkän ketjun aminopää (kuviot A, 4).

M. Urokinaasin pienimolekyylisten johdannaisten ilmentäminen E. colissa 1. Pitkä trp-LE-fuusiogeeni (kuvio 5) 15 Konstruoitiin plasmidi (pNCV, 58), jolla oli seuraa vat ominaisuudet: 1) plasmidi on pBR322:n johdannainen ja sitä on läsnä noin 20 kopiota solua kohden; 2) plasmidi tekee E. coli -isäntänsä resistentiksi tetrasykliinille; 3) plasmidi sisältää indusoitavissa olevan tryptofaanipro-20 moottorin, joka ohjaa proteiinin, joka muodostuu trp-pep-tidiesijakson ja trp-E-rakennegeenin fuusiotuotteesta (LE-fuusiogeeni), synteesiä; 4) trp-E-geeniin konstruoitiin ainutlaatuinen Pstl-restriktiokohta, jota voidaan käyttää kloonattaessa Pstl-DNA-fragmentteja, muuttamalla plasmidin 25 pSOM7 1 4 LE-geenin kauemmassa päässä oleva EcoRI-kohta

Pstl-kohdaksi, jonka sivuilla on kaksi EcoRI-kohtaa, käyttäen synteettistä jaksoa:

AATTCTGCAG

GACGTCTTAA.

30 DNA-fragmentti, joka sisälsi trp-promoottorin ja LE-geenin, pakattiin sitten plasmidiin pBR322, jolloin saatiin plasmidi pNCV (47A).

Urokinaasin Pstl-fragmentti nukleotidiasemasta 5 (PstI-5'-irtoamiskohta) nukleotidiasemaan 1130 (kuvio 1) 35 kloonattiin pNCV:n Pstl-kohtaan siten, että fuusioprote-iini valmistetaan indusoimalla trp-promoottori. N-pään osa on trp-LE ja C-pään osa on pienimolekyylinen urokinaasi.

23 88932

Kuvion 5 mukaisesti 5 ^ug plasmidia pUK513dT69D2 (pD2) käsiteltiin 20 yksiköllä Pstl:ä ja 1125 bp:n cDNA:n siirrännäisfragmentti, joka koodittaa pienimolekyylistä urokinaasia, eristettiin tekemällä elektroforeesi 6-%:isel-5 la polyakryyliamidigeelillä. Noin 1 ^,ug tätä siirrännäistä elektroeluoitiin geelistä, uutettiin fenolilla ja kloroformilla ja saostettiin etanolista. 1 yUg vektoriplasmi-dia pNCV (58) käsiteltiin 10 yksiköllä Pstltä ja saostettiin etanolista fenoli/kloroformi-uuton jälkeen. Noin 100 ng 10 tätä 1125 bp:n fragmenttia yhdistettiin noin 100 ng:aan

Pstl-käsiteltyä pNCV:tä 20 yUl:ssa liuosta, joka oli 20 mM Tris.HCl:n (pH 7,5) , 10 mM MgC^sn, 10 mM DTT:n ja 2,5 mM ATP:n suhteen ja sisälsi 30 yksikköä T4~DNA-ligaasia.

Yön yli kestäneen ligaation 14°C:ssa jälkeen käy-15 tettiin puolet seoksesta E. coli K12 kannan 294 transformaatioon. 12 transformaatin DNA:n BamHI-restriktio osoitti, että 3 transformaatilla oli oikea orientaatio. Tämän plas-midin (pUK33trpLE ) ilmentäminen (kuvio 5) E. colissa tuot-

J-J

ti pitkän trp-LE-fuusioproteiinin, joka sisältää 33 000-20 urokinaasin. 33 000-urokinaasi aktivoituu katkaisemalla ketju trypsiinin kaltaisella aktiivisella entsyymillä asemien 3 ja 4 ja asemien 26 ja 27 välistä (ks. kuvio 2).

2. Lyhyt trp-LE-fuusiogeeni (kuvio 6)

Konstruoitiin plasmidi pINCV. Se on kaikissa suh-25 teissä pNCV:n kal-ainen (ks. supra.), paitsi että suurin osa trp-E-geenistä puuttuu. Tässä plasmidissa muutettiin Bglll-kohta Pstl-kohdaksi ja tämän uuden Pstl-kohdan ja alkuperäisen Pstl-kohdan välinen alue poistettiin. Noin 100 ng pINCVrtä käsiteltiin Pstlrllä ja Hindllltlla, uu-30 tettiin fenolilla ja kloroformilla ja saostettiin etanolista. Noin 3 yug pUK33trpLEL:ä (kuvio 6) käsiteltiin täydellisesti Hindlllrlla ja osittain Pstl:llä, jolloin saatiin PstI-HindIII-DNA-fragmentti (1 150 bp), joka puhdistettiin tekemällä elektroforeesi 6-%:isella polyakryyliamidigeelil-35 lä ja sen jälkeen elektroeluoimalla. Rakenne-UK-geenin sisällä olevaa Pstl-kohtaa ei käsitelty restriktioentsyymil-lä. Kaikki Pstl-Hindlll-käsitelty pINCV sekoitettiin noin 24 88932 50 ngraan pUK33trpLEL:n HindII:lla ja osittain Pstl:llä käsiteltyä fragmenttia (1 150 bp) ja ligaation annettiin tapahtua yön yli 14°C:ssa. Tällä seoksella transformoitiin sitten E. coli K12 kanta 294. BamHI-käsittely vahvisti tä-5 män plasmidin (pUK33trpLEg) oikean rakenteen (kuvio 6). Tämän plasmidin ilmentyminen E. colissa tuotti fuusioproteii-nia, josta 33 000-urokinaasi aktivoituu, kuten edellä kuvattiin .

3. 33K-urokinaasin suora ilmentäminen (kuviot 7 ja 9) 10 Urokinaasi-DNA-fragmentti, joka alkaa nukleotidista 16 (kuvio 1), kloonattiin pBR322-johdannaiseen, mikä johti rakenteeseen, jossa trp-promoottori sijaitsee välittömästi tämän pienimolekyylistä urokinaasia koodittavan urokinaa-sifragmentin edessä. Plasmidi pLeIFAtrp108 (kuvio 7) on 15 plasmidin pLeIFA25 (58) johdannainen, jossa kauempana LelFA-geenistä sijaitseva EciRI-kohta on poistettu (59). 10^,ug pLelFAtrpI03:a (kuvio 7) käsiteltiin 20 yksiköllä EcoRI:a, uutettiin fenolilla ja kloroformilla ja saostettiin etanolista. Plasmidi-DNA-molekyylien umpinaiset EcoRI-päät pi-20 dennettiin avoimiksi päiksi käyttäen 12 yksikköä DNA-poly-meraasi I:ä 50 yUlrssa reaktiosoesta, joka sisälsi 60 mmol/1 NaCl, 7 mmol/1 MgCl2, 7 mmol/1 Tris.HCl (pH 7,4) ja 1 mmol/1 kutakin ribonukleotiditrifosfaattia. Reaktio-seosta inkuboitiin 37°C:ssa yksi tunti, uutettiin fenolil-25 ia ja kloroformilla ja saostettiin etanolista. DNA suspen-doitiin uudelleen 50 ^ulsaan seosta, jossa oli 10 mmol/1 Tris.HCl (pH 8) ja 1 mmol/1 EDTA ja käsiteltiin 500 yksiköllä Bacterial Alkaline Phosphatase -entsyymiä 30 minuuttia 65°C:ssa, uutettiin kahdesti ja saostettiin etanolista. 30 Kun seosta oli käsitelty Pstl:llä, sille tehtiin elektroforeesi 6-%:isella polyakryyliamidigeelillä ja noin 3 900 bp:n vektorifragmentti elektroeluoitiin.

Plasmidilla pUK33trpLEL transformoitiin E. coli K12 kanta GM48 (deoksiadenosiinimetyldasi ), jotta tästä 35 e. coli -kannasta puhdistettu DNA voitaisiin käsitellä restriktioendonukleaasilla Bell (60). 4 ^ug tätä DNA:ta käsiteltiin yksi tunti 50°C:ssa kuudella yksiköllä 25 88 932

Bcllrä (liuoksessa, joka sisälsi 75 imnol/1 KC1, 6 mmol/1 Tris.HCl (pH 7,4), 10 iranol/1 MgC^ ja 1 mmol/1 DTT) , sitten liuos tehtiin 50 mM:ksi NaCl:n suhteen ja käsiteltiin 10 yksiköllä Pstl:ä. Tehtiin elektroforeesi 6-%:isella gee-5 Iillä ja 914 bp:n fragmentti elektroeluoitiin.

Syntetoitiin 14 nukleotidin DNA-jakso, joka koodit-taa aminohappojaksoa met lys lys pro, fosfotriesterimene-telmällä (47); jakso oli seuraava:

MetLysLysPro 10 5' CTATGAAAAAGCCC 3' 500 ng tätä jaksoa fosforyloitiin 5'-päästä 10 yksiköllä T4-DNA-kinaasia 20 ^ulissa reaktioseosta, joka sisälsi 0,5 mmol/1 ATP:ta. pUK33trpLEL:n (kasvatettu E. coli GM48:ssa) 264 bp:n Pstl-AccI-cDNA-siirrännäisfragmentti eristettiin.

15 Noin 500 ng tätä fragmenttia suspendoituna uudelleen 10 ,ul:aan deionisoitua vettä sekoitettiin 20 ,ul:aan fos-foryloitua jaksoa, pidettiin 95 C:ssa kolme minuuttia ja jäädytettiin nopeasti hiilihappojää/asetonihauteessa. Denaturoituun DNA-liuokseen lisättiin 60 mmol/1 NaCl, 7 mmol/1, 20 7 mmol/1 Tris.HCl (pH 7,4), 1 mmol/1 kutakin deoksiribo- nukleotiditrifosfaattia ja 12 yksikköä DNA-polymeraasi I:tä (large fragment). Kun tätä reaktioseosta oli inkuboitu kaksi tuntia 37°C:ssa, se uutettiin fenolilla ja CHCl^:lla, saostettiin etanolista ja käsiteltiin täydellisesti Bcllrllä 25 50°C:ssa. Reaktioseokselle tehtiin sitten elektroforeesi 6-%:isella polyakryyliamidigeelillä ja noin 50 ng 200 bp:n fragmenttia tylpästä aminopäästä (blunt end) Bcll:een elektroeluoitiin. Sen jälkeen tehtiin ligaatio noin 50 ng:lla em. fragmenttia (blunt-BclI), noin 100 ng:lla karboksipään 30 fragmenttia BclI-PstI ja noin 100 ng:lla noin 3 900 bp:n vektorifragmenttia yön yli 14°C:ssa ja transformoitiin yhdistelmällä E. coli 294. Lukuisten transformaattien EcoRI-käsittely osoitti, että rakenne on oikea ja DNA-sekvenssi-analyysi osoitti, että jakso on haluttu, tämän uuden plas-35 midin, pUK33trp103:n (kuvio 7), initiaatiokodonin kautta. Tässä rakenteessa N-pään metioniinia seuraa kaksi lysiiniä, joita puolestaan seuraa aminohappojakso 5-279, kuten 26 88932 kuviosta 2A ilmenee. Tämän plasmidin ilmentyminen E. colis- sa tuotti pienimolekyylisen urokinaasin. Tätä proteiinia aktivoi trypsiinin kaltainen aktiivinen entsyymi, kuten edellä kuvattiin, joka irrottaa N-pään lysiiniparin ja kat- 5 kaisee jakson asemassa 26 olevan lysiinin ja asemassa 27 olevan isoleusiinin välistä (kuvio 2A).

Havaitsimme toivottavaksi valmistaa pUK33trp103:n johdannaisplasmidi, joka tekisi isäntäsolunsa tetrasyklii-

R R

niresistentiksi. Kuvio 8 esittää seuraavaa pUK33trp103Ap -Te :n 10 konstruoimista. 5 ^ug pHGH207-1:a (ks. infra) käsiteltiin Hpal:llä ja PvuII:lla. Vektorifragmentti eristettiin ja puhdistettiin. 5 yug pUK33trp103:a käsiteltiin Hpal:llä ja BamH1:llä, tehtiin elektroforeesi 6-%:isella polyakryy-liamidigeelillä ja 846 bp:n DNA-fragmentti puhdistettiin.

15 Toinen 5 ^ug:n erä pUK33trp103:a käsiteltiin Bamhl:llä ja PvuII:lla 119 bp:n DNA-fragmentin eristämiseksi ja puhdistamiseksi. Yhtä suuret moolimäärät näitä kolmea DNA-frag-menttia ligatoitiin yön yli 14°C:ssa ja käytettiin E. coli 294:n transformointiin. Usean ampisilliiniresistentin trans- 20 formaatin restriktioendonukleaasianalyysi vahvisti

R

pUK33trp103Ap oikean rakenteen ja kääntymisen trp-pro-moottori/UK33:a koodattavan DNA:n orientoitumisessa.

Noin 5 ^,ug pBR322-DNA:ta käsiteltiin EcoR1:llä ja kiinteät päät täytettiin Klenow Pöllillä. Kun tätä oli kä-25 sitelty Pst1:llä, eristettiin ja puhdistettiin suuri vektorif ragmentti, joka sisältää tetrasykliiniresistenssiä, replikoitumislähdettä ja osaa ampisilliiniresistenssigee- p nistä koodittavan DNA:n. Noin 5 ^,ug pUK3 3trp103Ap :ä käsiteltiin BamHl:llä ja Pst1:llä. DNA-fragmentti, joka koo-30 dittaa ampisilliiniresistenssigeenin loppuosaa, trp-pro-moottoria ja suurinta osaa pienimolekyylisestä urokinaa-sista, puhdistettiin. Suurinpiirtein yhtä suuria moolimää- p riä näitä kahta DNA-fragmenttia ja pUK33trp103Ap :n 119 bp:n DNA-fragmenttia BamH1-PvuII ligatoitiin yön yli 14°C 35 pUK33trp103Ap Te :n konstruoimisen loppuun saattamiseksi.

Tätä plasmidia käytettiin konstruoitaessa plasmidia, joka 27 8 8 9 j 2 oli suunniteltu ilmentämään suurmolekyylistä täyspitkää urokinaasia (ks. kohta N ja kuvio 9).

N. Urokinaasin suurimolekyylisten johdannaisten ilmentäminen 5 1. 54K-urokinaasin suora ilmentäminen

Kuvio 10 esittää täyspitkän urokinaasin konstruoimista. Plasmidi pHGH207-1, jossa on yksi trp-promoottori, saatiin poistamalla pHGH207:sta, jossa on kaksinkertainen lac-promoottori ennen yksinkertaista trp-promoottoria, kak-10 sinkertainen lac-promoottori. Tämä tehtiin seuraavasti: 310 bp:n trp-promoottori-DNA-fragmentti saatiin pFIFtrp69:stä (20) käsittelemällä EcoRI:llä. Tämä fragmentti sijoitettiin pHGH107:ään (44), joka oli avattu EcoRIrllä. Siten saatiin plasmidi (pHGH207), jossa oli kaksinkertainen lac-promoot-15 tori ennen trp-promoottoria, EcoRI-kohtien reunustamana.

Siten saatu pHGH207 käsiteltiin BamHI:llä; tämä käsiteltiin osittain EcoRIrllä ja suurin fragmentti eristettiin. Tässä fragmentissa on siten kokonainen trp-promoottori. pBR322 eristettiin suurin EcoRI-BamHI-fragmentti. Fragmenteille 20 tehtiin ligaatio ja seosta käytettiin transformoitaessa E. coli 294. Tetr-Ampr-pesäkkeet eristettiin ja suurimmalla osalla niistä oli plasmidi, jonka rakenne on sama kuin pHGH207-1:lie esitetty. Plasmidi pHGH207-1 on siten plas-midin pHGHl07 (44) johdannainen ja sillä on seuraavat omi-- . 25 naisuudet: 1) ihmisen kasvuhormonigeeni on tryptofaanipro- moottorin vieressä eikä lac-promoottorin, kuten pHGH107:ssä, 2) plasmidi saa aikaan resistenssin amplisilliinille ja tet-rasykliinille ilmennettynä E. colissa (ks. myös 47A).

20 g pHGH207-1:ä käsiteltiin osittain EcoRI:llä ja 30 täydellisesti BglII:llä. Suuri vektoritragmentti puhdistettiin käsittelemällä elektroforeettisesti 5-%:isella po-lyakryyliamidigeelillä, elektroeluoimalla, uuttamalla fenolilla ja kloroformilla ja saostamalla etanolista. 14 ^ug pF1 :ä käsiteltiin BglII:llä ja Tagl:llä ja 236 bp:n frag-35 mentti eristettiin ja puhdistettiin 6-%:isella polyakryy-liamidigeelistä. Seuraavat täydentävät DNA-fragmentit syn-tetoitiin fosfotriesterimenetelmällä (47): 28 88 932

MetSerAsnGluLeuHisGlnValPro 5' AATTATGAGCAATGAATTACATCAAGTTCCAT

TACTCGTTACTTAATGTAGTTCAAGGTAGC 5' 5 Kuten ilmenee, aminohappojakso Met Ser Asn Glu Leu His Gin Vai Pro koodittaa initiaatiokodonia, ATG ja suurimolekyy-lisen urokinaasin kahdeksaa aminopään aminohappoa. 50 ng kutakin synteettistä DNA-fragmenttia fosforyloitiin ja fragmentit sekoitettiin, pidettiin 65°C:ssa minuutti ja 10 annettiin jäähtyä huoneen lämpötilassa viisi minuuttia.

10 ng fosforyloituja ja sekoitettuja synteettisiä DNA-frag-mentteja yhdistettiin noin 200 ng:aan BglII:llä ja osittain EcoRIrllä käsiteltyyn pHGH207-1-vektorifragmenttiin ja noin 50 ng:aan 236 bp:n BglII-TagI-DNA-fragmenttia, ligaasi teh-15 tiin pitämällä yön yli 14°C:ssa ja seos käytettiin E. coli 294:n transformaatiossa. Yksittäisiä plasmidi-DNA:itä 24 ampisilliiniresistentistä pesäkkeestä käsiteltiin EcoRI:llä ja BglII:llä ja yksi plasmidi (plntl), jolla oli oikea rakenne, valittiin DNA-sekvenssianalyysiin. Tämä analyysi to-20 disti oikean DNA-jakson ATG-initiaatiokodonin ja suurimo-lekyylisen urokinaasin aminopään osan kautta.

4 ^,ug pNCV:tä (kohta M) käsiteltiin BglII:llä ja Clalrllä ja suuri vektorifragmentti eristettiin ja puhdistettiin 5-%:isella polyakryyliamidigeelistä. 30 ^ug pF1:ä 25 käsiteltiin Pstlrllä ja BglII:llä ja sille tehtiin elektroforeesi 6-%:isella polyakryyliamidigeelillä. 44 bp:n DNA-fragmentti elektroeluoitiin, uutettiin fenoli/kloroformi-seoksella ja saostettiin etanolista. 4 ^ug pA3-DNA:ta käsiteltiin Pstlrllä ja Taglrllä ja 192 bprn DNA-fragmentti 30 puhdistettiin 6-%:isesta polyakryyliamidigeelistä. Noin 100 ng BglII-ClaI-vektori-DNA-fragmenttia, noin 10 ng 192 bprn fragmenttia ja noin 50 ng 44 bprn fragmenttia yhdistettiin, ja ligaasi tehtiin pitämällä yön yli 14°Crssa ja tuote käytettiin E. coli 294 m transformaatioon. Usei-35 den tetrasykliiniresistenttien transformaattien plasmidi-DNA: iden Bglll-Clal-kaksoiskäsittely osoitti tämän uuden, plnt2:ksi nimetyn, plasmidin oikean rakenteen.

29 88 932 E. coli GM48:ssa (ATCC 39099, 1982-04-09) kasvatet-tua pUK33trp103Ap^Tc^:ä (5 ^ug) käsiteltiin Bell:llä ja Sal1:llä, tehtiin elektroforeesi 6-%:isella polyakryyliami-dilla ja 1701 bp:n fragmentti, joka sisälsi täyspitkän 5 urokinaasin karboksipään ja tetrasykliiniresistenssigeenin aminopään, puhdistettiin. Noin 5 ^ug pint1-DNA:ta käsiteltiin BglII:llä ja Sall:llä, tehtiin elektroforeesi 6-%:isel-la polyakryyliamidilla ja suuri vektorifragmentti, joka sisälsi tetrasykliiniresistenssigeenin karboksyylipään, rep-10 likoitumislähteen, ampisilliiniresistenssigeenin, trp-pro-moottorin, ATG-initiaatiokodonin ja täyspitkän urokinaasin aminopään, puhdistettiin. Noin 100 ng vektorifragmenttia ja noin 100 ng 1701 bp:n fragmenttia yhdistettiin, ligatoi-tiin yön yli 14°C:ssa ja käytettiin E. coli 294:n trans-15 formaatioon. Tetrasykliini- ja ampisilliiniresistentin pesäkkeen plasmidi, jolla oli oikea PvuII-restriktioendonuk-leaasimalli, identifioitiin ja se varmisti täyspitkän urokinaasin rakenteen trp-promoottorista eteenpäin. Tämä on plasmidi pUK54trp207-a. Täyspitkää urokinaasia syntyy tämän 20 plasmidin ilmentyessä E. coli 294:ssä.

2. Pre-UK 54K:n suora ilmentäminen E. colissa (kuvio 10)

Seuraavaa menettelyä käytettiin konstruoitaessa plasmidi preUK54:n ilmentämiseksi suoraan. Fosfotriesterimene-25 telmällä (47) syntetoitiin kaksi täydentävää DNA-fragmenttia, jotka koodittavat aminohappojakson initiaatiokodonia ATG ja sitä seuraavia urokinaasiesijakson kolmea ensimmäistä N-terminaalista aminohappoa Arg Ala Leu, seuraavasti:

EcoRi MetArgAlaLeu Bgl1 30 5' AATTATGCGTGCCCTGC

TACGCACGGG5 *

Restriktioendonukleaasi-katkeamiskohdat EcoR1 ja Bgl1 ovat tämän esijakson osan sivuilla. 50 ng kutakin synteettistä DNA-fragmenttia fosforyloitiin. Fosforyloidut fragmentit 35 sekoitettiin, pidettiin 65°C:ssa minuutti ja annettiin jäähtyä huoneen lämpötilaan. 5 ^ug pF1-DNA:ta käsiteltiin Bgl1:llä ja Bgl2:lla ja 310 bp:n UK-DNA-fragmentti 30 88932 eristettiin ja puhdistettiin. Noin 50 ng 310 bp:n UK-DNA-fragmenttia, noin 150 ng BglII:llä ja osittain EcoRIillä käsiteltyä vektori-DNA-fragmenttia pHGH207-1:stä (ks. kohta N) ja 10 ng fosforyloituja ja sekoitettuja synteettisiä 5 DNA-fragmentteja ligatoitiin yön yli 14°C:ssa ja käytettiin E. colin transformaatioon. Useita ampisilliiniresistenteis-tä transformaateista eristetyt yksittäiset plasmidi-DNA:t analysoitiin ja ne vahvistivat suurimolekyylisen urokinaa-sin esijakson oikean rakenteen ja nukleotidijärjestyksen.

10 Eräs oikea plasmidi nimettiin plnt4:ksi. 5 ^ug pInt4-DNA:ta käsiteltiin BglII:llä ja EcoRv:llä, jotta saataisiin eristetyksi ja puhdistetuksi vektori-DNA-fragmentti, joka sisältää pre-UK54:n N-terminaaliset nukleotidit, trp-promoottorin, ampisilliiniresistenssigeenit, replikoitu-15 mislähteen ja osan tetrasykliiniresistenssiä koodittavasta DNA:sta. 5 ,ug pUK54trp207-1-DNA:ta käsiteltiin BglII:llä ja EcoRv:llä. BglII-EcoRv-DNA-fragmentti, joka koodittaa UK54:n loppuosaa sekä tetrasykliiniresistenssiä koodittava DNA eristettiin, puhdistettiin ja ligatoitiin Bglll-EcoRv-20 vektori-DNA-fragmentin kanssa plasmidin p-preUK54trp207-1 konstruoimisen loppuunsaattamiseksi.

O. (Pre-)urokinaasin suora ilmentäminen kudosviljel- mässä

Kuvio 11 esittää preurokinaasia koodittavan geenin 25 pakkaamista eukarioottiseen ilmentämisvektoriin P342E (62), jolla on kyky replikoitua ja ilmentää preurokinaasia soveltuvissa apinan soluissa. 10 ^ug p342E-DNA:ta käsiteltiin XBA1:llä ja noin 100 bp:tä poistettiin kumpaankin suuntaan käyttäen Ba131-nukleaasia (fragmentti 1). 100 ng fosfotri-30 esterimenetelmällä (47) syntetoitua Hindlll-liittäjä 5'CTCAAGCTTGAG:a fosforyloitiin, pidettiin minuutti 65°C:ssa ja annettiin jäähtyä huoneen lämpötilaan. Fosforyloitu liittäjä ja fragmentti 1 ligatoitiin yön yli 14°C:ssa ja tuotteella transformoitiin E. coli 294. Yhden pEH3-Bal14:ksi 35 nimetyn transformaatin restriktioendonukleaasianalyysi osoitti Hindlll-restriktioendonukleaasikohdan mukaan tulon ja XBA1-kohdan poistumisen. 5 ^,ug pEH3-BAL14-DNA:ta si 88932 käsiteltiin HindIII:llä ja Hpa1:llä. Kiinni olevat päät pidennettiin tylpiksi (blunt ends) käyttäen Klenow Pollrtä. DNA käsiteltiin BAP:lla ja vektorifragmentti, joka sisälsi SV-40-varhaispromoottorin, ampisilliiniresistenssigeenit ja 5 replikoitumislähteen, eristettiin ja puhdistettiin (fragmentti 2). 5 yug ppreUK54trp207-1:tä käsiteltiin Cla1:llä ja XBa1:llä. Umpinaiset päät pidennettiin Klenow Pöllillä ja preUK54:ä koodittava DNA-fragmentti eristettiin ja puhdistettiin (fragmentti 3). Noin 100 ng fragmenttia 2 ja 10 noin 100 ng fragmenttia 3 ligatoitiin yön yli 14°C:ssa ja käytettiin E. coli transformaatioon. Erään transformaatin plasmidi-DNA:n, pEH3-BAL14 preUK54:n, restriktioendonukleaa-sianalyysi vahvisti oikean rakenteen. pEH3-BALl4 preUK54-DNA:ta käytettiin siten transfektoitaessa soveltuvia apinan 15 soluja (62) ilmentämään preUK54:ä ja eristämään täyspit-kää suurimolekyylistä urokinaasia.

P. Eristäminen ja karakterisointi

Urokinaasia sisältävä jäännös eristettiin E. colista. Jäännös liuotettiin 5M guanidiinihydrokloridiin, joka sisäl-20 si 50 mmol/1 Tris-puskuria (pH 8,0). Liuos laimennettiin 1M guanidiinihydrokloridilla, joka sisälsi 50 mmol/1 Tris. HCl:a (pH 9), proteiinipitoisuuteen 1 ng/ml. Liuokseen lisättiin sitten pelkistettyä glutationia (GSH) pitoisuudeksi 2 mmol/1 ja hapetettua glutationia (GSSG) pitoisuudeksi 25 0,2 mmol/1 ja inkuboitiin yön yli huoneen lämpötilassa. Tu loksena oleva liuos, joka sisälsi proteiinia, dialysoitiin sitten vesiväliainetta vastaan. Tuloksena oleva liuos sisälsi urokinaasia, jonka aktiivisuus oli 100 PU/mg.

Tavanomaisin menetelmin tehdyn puhdistuksen jälkeen 30 proteiini karakterisoidaan ja sillä on odotettu N-terminaa-linen jakso molemmissa pienimolekyylisen, biologisesti aktiivisen aineen ketjuissa, C-pään analyysissä saadaan myös oikea jakso kummallekin ketjulle. Proteiini liikkuu mole-kyylipainoa noin 30 000 daltonia vastaavalla tavalla. Sen 35 ominaisaktiivisuus on noin 170 000 PU/mg (225 000 ky(mg), olettaen, että pitoisuudessa 1 mg/ml 0D2go = "*'*· 32 88932 Q. Kokeet urokinaasin ilmentymisen havaitsemiseksi 1. Kromogeeninen substraatti a. Teoria

Koe perustuu tripeptidin proteolyyttiseen irrotta-5 miseen kromoforisesta ryhmästä. Irtoamisnopeus voi olla suorassa suhteessa tutkittavan proteaasin spesifisyyteen ja pitoisuuteen. Urokinaasi lohkaisee kromogeenisen substraatin S244 (myyjä Kabi Group Inc., Greenwich, CT). Seuraamalla kromoforin syntymistä voidaan määrittää näytteessä 10 olevan funktionaalisen urokinaasin määrä. Urokinaasi syn-tetoidaan epäaktiivisena esiastemuotona ja aktivoituminen tapahtuu lohkeamisella ryhmän 26 (lysiini) ja 27 (isoleu-siini) välistä (numerointi perustuu proteaasiklooniin, kuvio 2A). Joidenkin urokinaasipreparaattien havaittiin au-15 toaktivoituneen ja/tai aktivoituvan E. coli -proteaasien vaikutuksesta. Urokinaasin aktivoitumisen takaamiseksi, mikä tekee mahdolliseksi havaitsemisen tällä kromogeenime-netelmällä, tarvitaan näytteen käsittelemistä pienillä määrillä trypsiiniä. Trypsiini on proteaasi, joka pystyy uro-20 kinaasin aktivoitumisen vaatimaan lysiini-isoleusiini-si-doksen katkaisuun. Trypsiini voi kuitenkin lohkaista kro-mogeenistä substraattia ja sen takia se täytyy eliminoida kokeesta. Soijapaputrypsiini-inhibiittori (STI) on proteiini, joka inaktivoi trypsiinin vaikuttamatta ollenkaan uro-25 kinaasiin. Siten koe muodostuu urokinaasin aktivoinnista trypsiinillä, trypsiinin inhiboinnista STI:llä ja lopuksi kromogeenisen substraatin lisäämisestä läsnä olevan funktionaalisen urokinaasin mittaamiseksi.

b. Menettely 30 Koe tehdään seuraavasti: 0,2 ml 0,1M Tris-puskuria (pH 8,0), 50 ^ul tutkittavaa näytettä ja 5 ^ul trypsiiniä (0,1 mg/ml 0,1M Tris- (pH 8,0) ja 0,25M CaC^-liuoksessa) lisättiin koeputkeen ja näytettä inkuboitiin 10 minuuttia 37°C:ssa. Trypsiini inaktivoitiin lisäämällä 2 ^,ul STI:tä 35 (10 mg/ml 0,1M Tris-puskurissa, pH 8,0). Urokinaasin aktii visuus määritettiin lisäämällä 50 ,ul S244-liuosta (1 mmol/ 1 vedessä) ja inkuboimalla reaktioseosta 10 minuuttia 37 C.

33 88932

Lisättiin etikkahappoa (50 yul) reaktion pysäyttämiseksi, liuos sentrifugoitiin sakan poistamiseksi ja mitattiin ab-sorbanssi aallonpituudella 405 nm. Urokinaasin todellinen määrä voidaan laskea vertaamalla näytteen antamaa absor-5 banssia ja tunnettuja urokinaasimääriä sisältävien standar-diliuosten (Calbiochem, San Diego, CA) absorbansseja keskenään .

2. Plasmiinin muodostumisen suora mittaaminen a. Teoria 10 Urokinaasin paljon herkempi mittaaminen saadaan ai kaan seuraamalla urokinaasin katalysoimaa plasminogeenin muuttumista plasmiiniksi. Plasmiini on entsyymi, jota varten on olemassa kromogeeninen substraatti-kokeita, jotka perustuvat edellä kohdassa 1 esitettyihin periaatteisiin.

15 Kokeen perustana on muodostuneen plasmiinin määrän mittaaminen sen jälkeen, kun urokinaasia sisältävää liuosta on inkuboitu plasminogeeniliuoksen kanssa. Mitä suurempi urokinaasin määrä on, sitä suurempi on muodostuneen plasmiinin määrä.

20 b. Menettely Näyte sekoitetaan 0,10 ml:aan liuosta, joka sisältää 0,7 mg/ml plasminogeenia; 0,5 mmol/1 Tris.HCl, pH 7,4 ja 0,12 mmol/1 NaCl ja täytetään 0,15 mlrksi. Seosta inkuboi-daan 37°C:ssa useita kertoja (kuvatulla tavalla), lisätään 25 0,35 ml S2251 (1,0 mM liuos yllä mainitussa puskurissa) ja reaktion annetaan jatkua viisi minuuttia 37°C:ssa. Lisätään etikkahappoa (25 ^ul) reaktion päättämiseksi ja mitataan absorbanssi aallonpituudella 405 nm. Aktiivisuuden määrä saadaan selville vertaamalla standardiurokinaasiliuosten 30 laimennoksien antamiin mittaustuloksiin.

3. Plasmiinin muodostumisen epäsuora mittaaminen a. Teoria

On kehitetty herkkä urokinaasin aktiivisuuden mittausmenetelmä (61). Menetelmä perustuu plasmiinin muodos-35 tumisen määrittämiseen mittaamalla se, miten paljon plasmiini hajottaa fibriiniä agarmaljassa, joka sisältää fib-riiniä ja plasminogeenia. Plasmiini saa aikaan kirkkaan 34 38932 hajotusvyöhykkeen fibriinimaljalle. Tämä hajotusvyöhykkeen pinta-ala voidaan suhteuttaa näytteen sisältämän urokinaa-sin määrään.

b. Menettely 5 Granelli-Pipernon ja Reichin menetelmän (61) mukai sesti maljoja inkuboitiin 1-3 tuntia 37°C:ssa ja hajotus-vyöhykkeet mitattiin. Vertailusarjaksi tehtiin sama määritys standardiurokinaasiliuoksen laimennoksilla.

R. Urokinaasiaktiivisuuden havaitseminen 10 1. Bakteerien kasvu ja urokinaasinäytteen valmistus E. coli -kanta (W3110) transformoitiin käyttäen uro-kinaasifuusioproteiinia sisältävää plasmidia (pUK33trpLEs). Tätä ilmentämisvektoria (lyhyt trpLE-fuusiogeeni) kuvattiin edellä. Soluja kasvatettiin minimialustalla yön yli opti-15 seen tiheyteen 1,2 (550 nm). Lisättiin vielä 200 ml alustaa. Indoliakryylihappoa, yhdistettä, joka ilmeisesti edistää tryptofaanin kontrolloimien geenien ilmentämistä, lisättiin pitoisuudeksi 10 ^ug/ml. Soluja inkuboitiin kaksi tuntia ja ne kerättiin. Alustalta (400 ml) saadut solut suspendoitiin 20 veteen ja lisättiin guanidiinia pitoisuudeksi 7 mmol/ml (lopputilavuus 40 ml). Liuosta inkuboitiin 90 minuuttia huoneen lämpötilassa. Liukenematon materiaali poistettiin sentrifugoimalla. Supernatanttia dialysoitiin 0,01M Tris. HCl:ää (pH 7,5), joka sisälsi 0,1 mol/1 NaCl, vastaan neljä 25 tuntia. Liukenematon materiaali poistettiin sentrifugoimalla ja näytettä dialysoitiin 2,5 tuntia 0,01M Tris.HCl:ää (pH 7,5) vastaan.

Näyte laitettiin 3,9 x 9 cm:n DE-52-kolonniin, joka oli saatettu tasapainoon 0,01M Tris.HCl:llä (pH 7,5), ko-30 lonni pestiin samalla puskurilla ja eluoitiin 0,01 Tris.

HCl:llä (pH 7,5), joka sisälsi 0,15 mol/1 NaCl. Aktiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja käytettiin kaikkiin seuraaviin kokeisiin.

2. Aktiivisuuden mittaaminen 35 Kuvio 12 esittää tuloksia, jotka saatiin aktivoimal la suoraan plasminogeeniä fraktioiduilla E. coli -uutteilla, tutkimusolosuhteiden ollessa samanlaiset kuin kuvattiin 35 88932 kohdassa Q.2. Syntyy aktiivisuus, joka on riippuvainen plas-minogeenin läsnäolosta. Siten mitattava aktiivisuus on plas-minogeenistä riippuvaa aktiivisuutta. Mittauksen kohteena oleva aktiivisuus myös kasvaa ajan kuluessa, mikä osoittaa 5 ajasta riippuvaa plasmiinin syntymistä. Nämä ominaisuudet, so. plasminogeenin katalyyttinen aktivoiminen, sopivat yhteen urokinaasin ominaisuuksien kanssa. Samanlaiset uutto-olosuhteet toteutettuina E. colille, joka ei sisällä uro-kinaasiplasmidia, eivät synnytä plasminogeenia näissä olo-10 suhteissa.

Uutteet tutkittiin myös yllä kuvatuin kokein uroki-naasiaktiivisuuden havaitsemiseksi ja mittaamiseksi. Kuvio 13 esittää bakteerien kautta tuotettujen fraktioiden erilaisten määrien vaikutusta kohdassa Q.2 kuvatussa kokeessa 15 aktivoimisajan ollessa 10 minuuttia. Saatuja tuloksia verrataan standardiurokinaasiliuoksella saatuihin (Plough Unitage determination). Plasminogeenin aktivoitumisen suuruus on suoraan verrannollinen lisättyyn kloonatun urokinaasin määrään.

20 Puhdistetun luonnon urokinaasin vasta-aineiden tie detään alentavan luonnon urokinaasin aktiivisuutta. Näiden vasta-aineiden vaikutus, kun niitä lisättiin tässä kokeessa hetkellä 0, näkyy myös kuviossa 13. Havaitaan selvää E. coli -peräisen materiaalin inhiboitumista. Tämä osoittaa, 25 että E. colista peräisin olevalla materiaalilla on samat antigeenikohdat kuin luonnon urokinaasilla ja se on siten todella mikrobien kautta syntetoitu urokinaasi.

Samanlaisia aktiivisuuden havaitsemis- ja vasta-aine-inhibitiotuloksia saadaan käyttäen fibriinimaljakoetta (ku-30 vattu kohdassa Q.3). Nämä tulokset on koottu taulukkoon I.

36 88 932

Taulukko I

Urokinaasiproteiinin fibriinimaljakoe Näyte Aktiivisuus Aktiivisuus uro- Inhibitio, % (Plough-yk- kinaasin vasta-5 sikköä/ml)^ aineen läsnäol lessa (Plough-1 yksikköä/ml)

Urokinaasi- standardi 112 2,5 98 10 11 0,45 96 1,1 0 100

Keksinnön mukaisesti tuotettu uroki- 480 1,12 99 15 naasi 224 0 100 ·]

Vertailukäyrä saatiin lisäämällä tunnettu määrä urokinaa-sistandardia maljoihin. E. coli -fraktioille ja vasta-ai-neinhibitiolle saadut arvot määritettiin ekstrapoloimalla tästä vertailukäyrästä.

20 Standardiurokinaasin aktiivisuus inhiboitui 96 % tai enemmän lisättäessä tämän urokinaasiproteiinin vasta-aineita. E. colista peräisin olevilla uutteilla oli merkittävä urokinaasiaktiivisuus. Tämä aktiivisuus inhiboitui melkein täydellisesti lisättäessä luonnon urokinaasin vas-25 ta-aineita.

Myös kolmannessa kokeessa (kromogeeninen substraatti -koe) havaittiin urokinaasin kaltaista aktiivisuutta E. coli -uutteissa. Koska tämä on epäherkin kokeista, ei vasta-aine-inhibitiokokeita voitu tehdä inhibition havaitsemiseen tar-30 vittavien suurien vasta-ainemäärien takia.

Yllä olevissa kolmessa kokeessa käytettiin standardina Calbiochemin urokinaasia. Saadut arvot (Plough-yksik-köä/ml) olivat kaikki samaa suuruusluokkaa: 500 fibriinimal j akokeessa ; 100 plasminogeenin aktivointikokeessa; ja 35 350 kromogeeninen substraatti-kokeessa (S2444). Ilmenevät vaihtelut aiheutuvat epäilemättä materiaalin suhteellisen epäpuhtaasta luonteesta tutkimushetkellä.

37 88932

Farmaseuttiset koostumukset Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan formuloida tunnetuin menetelmin farmaseuttisesti käyttökelpoisten koostumuksien valmistamiseksi, jolloin ihmisen urokinaasi-5 tuote yhdistetään farmaseuttisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen. Soveltuvia kantaja-aineita kuvataan esimerkiksi teoksessa E.W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, joka mainitaan tässä viitteenä. Tällaiset koostumukset sisältävät vaikuttavan määrän keksinnön mukaista proteiinia 10 yhdistettynä soveltuvaan määrään kantaja-ainetta tehokkaaseen antamiseen soveltuvien farmaseuttisesti hyväksyttävien koostumuksien valmistamiseksi.

A. Parenteraalinen antotapa

Keksinnön mukaista ihmisen urokinaasia voidaan an-15 taa parenteraalisesti potilaille, joilla on veritulppasai-rauksia tai -tiloja. Annostus ja antonopeus voi olla samanlainen kuin mitä yleensä käytetään kliinisesti muiden sydän- ja verisuonitukoksia hajottavien aineiden yhteydessä, esimerkiksi noin 4 400 ky/kg laskimon sisäisenä aloi-20 tusannoksena, jota seuraa jatkuva laskimon sisäinen infuusio nopeudella noin 4 400 ky/kg/h 12 tunnin ajan, potilaille, joilla on keukoveritulppa.

Yhtenä esimerkkinä soveltuvasta antomuodosta tässä yhteydessä käyttökelpoisessa muodossa olevalle suurinpiir-25 tein homogeeniselle ihmisen urokinaasille on pullo, joka sisältää 250 000 ky urokinaasiaktiiivisuutta, 25 mg man-nitolia ja 45 mg natriumkloridia ja johon voidaan lisätä 5 ml steriiliä vettä ruiskeen valmistamiseksi ja sekoittaa sopivaan tilavuuteen 0,9 % natriumkloridiliuosta injektio-30 varten tai 5-%:ista dekstroosiliuosta injektiota varten laskimon sisäisesti annettavaksi.

Keksinnön mukainen ihmisen urokinaasiproteiini on määritelty määritetyn DNA-geenijakson ja siitä johdetun aminohappo jakson avulla. On selvää, että on olemassa luonnol-35 lisiä alleelisia vaihteluita eri yksilöiden välillä. Tällaisia vaihteluita voivat olla aminohappoero(t) koko jaksossa, aminohapon/-happojen poisjäämiset, substituoitumiset, 38 88932 lisäykset, inversiot ja siirrot ketjussa. Lisäksi yhdistelmä -DNA- tekniikan käyttö tarjoaa mahdollisuuden valmistaa erilaisia ihmisen urokinaasijohdannaisia, joita muuttavat vaihtelevasti yhden tai useamman aminohapon substituutiot, 5 poisjäämiset, lisäykset tai siirrot, jne., käyttäen kooditta van DNA:n muuntamista. Kaikki tällaiset muunnokset ja alleelliset vaihtelut, jotka johtavat ihmisen urokinaasin johdannaisiin, kuuluvat keksinnön piiriin niin kauan kuin olennainen, karakteristinen ihmisen urokinaasiaktiivisuus 10 säilyy luonteeltaan muuttumattomana.

Vaikka tässä on viitattu erityisiin edullisiin ilmenemismuotoihin, on ymmärrettävä, että keksintö ei rajoitu niihin, vaan sitä rajoittavat liitteenä olevat patenttivaatimukset.

39 88 952

Kirjallisuus 1. US-patenttijulkaisu nro 3 355 361.

2. US-patenttijulkaisu nro 3 926 727.

3. US-patenttijulkaisu nro 4 029 767.

5 4. US-patenttijulkaisu nro 4 258 030.

5. US-patenttijulkaisu nro 4 271 150.

6. EP-hakemusjulkaisu nro 0037687.

7. US-patenttijulkaisu nro 3 555 000.

8. Wallen, P., Proc. Serono Symp. 9, 91 (1977).

10 9. Thorsen, S., et ai., Thrombos. Diathes. haemorrh. 28, 65 (1972).

9A. Barnett ja Baron, Proc. Soc. Exptl. Biol. 102, 308 (1959). 9B. Banlow ja Lazer, Thrombosis Res. 1, 201 (1972).

10. Husain, S.S., et ai., Thrombasis ai Hemostasis 46, 11 15 (1981).

10A.Wun et ai., J. Biol. Chem. 257, 3276 (1982).

11. Ratzkin et ai., Proc. Natl. Acid. Sei. (USA) 78, 3313 (1981 ) .

11A.Bollen, A. et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 103, 20 391 (1981).

12. GB-hakemusjulkaisu nro 2 007 676 A.

13. Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980).

14. Microbiology, 2d Ed., Harper and Row Publications, Inc., Hagerstown, Maryland (1973), erityisesti s. 1122 et seq.

25 15. Scientific American 245, 66 et seq. (1981.

16. GB-hakemusjulkaisu nro 2 055 382 A.

17. DE-hakemusjulkaisu 2 644 432.

18. Chang et ai., Nature 275, 617 (1978).

19. Itakura et ai., Science 198, 1056 (1977).

30 20. Goeddel et ai., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980).

21. EP-hakemusjulkaisu nro 0036776.

22. Siebenslist et ai., Cell 20, 269 (1980).

23. Stinchcomb et ai., Nature 282, 39 (1979).

24. Kingsnian eL ai., liene 7, 14 1 (1979).

35 25. Tschumper et ai., Gene 10, 157 (1980).

26. Mortimer et ai., Microbiological Reviews 44, 519 (198 ).

27. Miozzari et ai., Journal of Bacteriology 134, 48 (1978).

40 88932 28. Jones, Genetics 85, 23 (1977).

29. Hitzeman, et ai., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980).

30. Holland et ai., Biochemistry 17, 4900 (1978).

31. Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson eds, 5 (1973).

32. Gluzman, Cell 23, 175 (1981).

33. Lusky et ai., Nature 293, 79 (1981).

34. Gluzman et ai., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.

44, 293 (1980).

10 35. Fiers et ai., Nature 273, 113 (1978).

36. Reddy et ai., Science 200, 494 (1978).

37. Bolivar et ai., Gene 2, 95 (1977).

38. Vetterlein et ai., J. Biol. Chem. 255, 3665 (1980).

39. Eagle, H., Science 130, 432 (1959).

15 40. Lynch et ai., Virology 98, 251 (1979).

41. Aviv et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 1408 (1972).

42. Lehrach et ai., Biochemistry 16, 4743 (1977).

43. Jackson et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 74, 5598 (1977) .

20 44. Goeddel et ai., Nature 281, 544 (1979).

45. Wickens et ai., J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978).

46. Chang et ai., Nature 275, 617 (1978).

47. Crea et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 75, 5765 (1978) .

25 47A.EP-hakemusjulkaisu nro 0036776.

48. Miller, Experiments in Molecular Genetics, s. 431-3, Cold Pring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1972) .

49. Grunstein et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72, 3961 30 (1975).

50. Wallace et ai., Nucleic Acids Research 9, 879 (1981).

51. Birnboim et ai., Nucleic Acids Research 7, 1513 (1979).

52. Smith, Methods Enzymol. 65, 560 (1980).

53. Messing et ai., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981).

35 54. Taylor et ai., Biochem. Biophys. Acta 442, 324 (1976).

55. Fritsch et ai., Cell 19, 959 (1980).

56. Goeddel et ai., Nature 290, 20 (1981).

41 88932 57. Blobel et ai., Biomembranes, Voi. 2, ed. Manson, s. 193, Plenum.

58. Goeddel et ai., Nature 287, 411 (1980).

59. Itakura et ai., Science 198, 1956 (1977).

5 60. Bingham et ai., Nucleic Acids Research 5, 3457 (1978).

61. Granelli-Piperino and Reich, J. Exp. Med. 148, 223.

62. Crowley et ai., Mol. and Cellular Biol. 3, 44 (1983).

Claims (9)

42 88932

1. Eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa polypeptidiä, jolla on seuraava ami-5 nohapposekvenssi -20 -10 met arg ala leu leu ala arg leu leu leu cys vai leu vai vai ser asp ser lys gly ser asn glu leu his gin vai pro 10 10 20 ser asn cys asp cys leu asn gly gly thr cys vai ser asn 30 lys tyr phe ser asn ile his trp cys asn cys pro lys lys 40 50 15 phe gly gly gin his cys glu ile asp lys ser lys thr cys 60 tyr glu gly asn gly his phe tyr arg gly lys ala ser thr 70 asp thr met gly arg pro cys leu pro trp asn ser ala thr 20 80 90 vai leu gin gin thr tyr his ala his arg ser asp ala leu 100 gin leu gly leu gly lys his asn tyr cys arg asn pro asp 110 120 25 asn arg arg arg pro trp cys tyr vai gin vai gly leu lys 130 pro leu vai gin glu cys met vai his asp cys ala asp gly 140 lys lys pro ser ser pro pro glu glu leu lys phe gin cys 30 150 160 gly gin lys thr leu arg pro arg phe lys ile ile gly gly 170 glu phe thr thr ile glu asn gin pro trp phe ala ala ile 43 88932 180 190 tyr arg arg his arg gly gly ser vai thr tyr val cys gly 200 gly ser leu ile ser pro cys trp vai ile ser ala thr his 5 210 cys phe ile asp tyr pro lys lys glu asp tyr ile val tyr 220 230 leu gly arg ser arg leu asn ser asn thr gin gly glu met 240 10 lys phe glu val glu leu ile leu his lys asp tyr ser ala 250 260 asp thr leu ala his his asn asp ile ala leu leu lys ile 270 arg ser lys glu gly arg cys ala gin pro ser arg thr ile 15 280 gin thr ile cys leu pro ser met tyr asn asp pro gin phe 290 300 gly thr ser cys glu ile thr gly phe gly lys glu asn ser 310 20 thr asp tyr leu tyr pro glu gin leu lys met thr val val 320 330 lys leu ile ser his arg glu cys gin gin pro his tyr tyr 340 gly ser glu val thr thr lys met leu cys ala ala asp pro 25 350 gin trp lys thr asp ser cys gin gly asp ser gly gly pro 360 370 leu val cys ser leu gin gly arg met thr leu thr gly ile 380 30 vai ser trp gly arg gly cys ala leu lys asp lys pro gly 390 400 val tyr thr arg val ser his phe leu pro trp ile arg ser 410 411 his thr lys glu glu asn gly leu ala leu 44 88932 tai sen osaa, jolla on ihmisen urokinaasin entsymaattista aktiivisuutta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että koodatulla poly-5 peptidillä on seuraava aminohapposekvenssi 1 10 ser asn glu leu his gin vai pro ser asn cys asp cys leu 20 asn gly gly thr cys vai ser asn lys tyr phe ser asn ile 30 40 his trp cys asn cys pro lys lys phe gly gly gin his cys 50 glu ile asp lys ser lys thr cys tyr glu gly asn gly his 15 60 70 phe tyr arg gly lys ala ser thr asp thr met gly arg pro 80 cys leu pro trp asn ser ala thr vai leu gin gin thr tyr 90 2Q his ala his arg ser asp ala leu gin leu gly leu gly lys 100 110 his asn tyr cys arg asn pro asp asn arg arg arg pro trp 120 cys tyr vai gin vai gly leu lys pro leu vai gin glu cys 25 130 140 met vai his asp cys ala asp gly lys lys pro ser ser pro 150 pro glu glu leu lys phe gin cys gly gin lys thr leu arg 160 30 pro arg phe lys ile ile gly gly glu phe thr thr ile glu 170 180 asn gin pro trp phe ala ala ile tyr arg arg his arg gly 190 gly ser vai thr tyr vai cys gly gly ser leu ile ser pro 200 210 cys trp vai ile ser ala thr his cys phe ile asp tyr pro 45 88932 220 lys lys glu asp tyr ile val tyr leu gly arg ser arg leu 5 230 asn ser asn thr gin gly glu met lys phe glu val glu asn 240 250 leu ile leu his lys asp tyr ser ala asp thr leu ala his 260 10 his asn asp ile ala leu leu lys ile arg ser lys glu gly 270 280 arg cys ala gin pro ser arg thr ile gin thr ile cys leu 290 pro ser met tyr asn asp pro gin phe gly thr ser cys glu 15 300 ile thr gly phe gly lys glu asn ser thr asp tyr leu tyr 310 320 pro glu gin leu lys met thr val val lys leu ile ser his 330 20 arg glu cys gin gin pro his tyr tyr gly ser glu val thr 340 350 thr lys met leu cys ala ala asp pro gin trp lys thr asp 360 ser cys gin gly asp ser gly gly pro leu val cys ser leu 25 370 gin gly arg met thr leu thr gly ile val ser trp gly arg 380 390 gly cys ala leu lys asp lys pro gly val tyr thr arg val 400 30 ser his phe leu pro trp ile arg ser his thr lys glu glu 410 411 asn gly leu ala leu. 46 88932

3. Ekspressioplasmidi pUK33trpLEL, tunnet-t u siitä, että se on plasmidin pBR322 johdannainen, joka sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaista DNA:ta vastaavan, pienen molekyylipainon omaavaa urokinaasia koo- 5 daavan cDNA-insertin, trp-promoottorin ja tetrasykliini-resistenssin antavan geenin ja joka E. colissa pystyy ilmentämään pitkän trp-LE-fuusioproteiinin, joka käsittää 33000 D urokinaasin.

4. Ekspressioplasmidi pUK33trpLEs, tunnettu 10 siitä, että se on plasmidin pBR322 johdannainen, joka sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaista DNA:ta vastaavan, pienen molekyylipainon omaavaa urokinaasia koodaavan cDNA-insertin, trp-promoottorin ja tetrasykliiniresis-tenssin antavan geenin ja joka E. colissa pystyy ilmentä- 15 mään lyhyen trp-LE-fuusioproteiinin, joka käsittää 33000 D urokinaasin.

5. Ekspressioplasmidi pUK33trpl03, tunnettu siitä, että se käsittää plasmidista pUK33trpLEL saadun cDNA-insertin, joka vastaa patenttivaatimuksen 1 mukaista

20 DNA:ta koodaen pienen molekyylipainon omaavaa urokinaasia, trp-promoottorin, joka sijaitsee välittömästi ennen mainittua cDNA-inserttiä, sekä tetrasykliiniresistenssin antavan geenin.

6. Ekspressioplasmidi pUK54trp207-l, tunnet- 25. u siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaista DNA:ta vastaavan, täysipituista urokinaasia koodaavan cDNA-insertin, trp-promoottorin ja tetrasykliiniresistenssin ja ampisilliiniresistenssin antavat geenit, jolloin mainittu cDNA-insertti sijaitsee ennen trp-pro- 30 moottoria.

7. Ekspressioplasmidi p-prelIK54trp207-l, tunnettu siitä, että se on plasmidin pUK54trp207-l johdannainen, joka käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaista DNA:ta vastaavan, (pre)urokinaasia koodaavan cDNA-inser- 35 tin, trp-promoottorin ja tetrasykliiniresistenssin ja am- 47 88932 pisilliiniresistenssin antavat geenit, jolloin mainittu cDNA-insertti sijaitsee ennen trp-promoottoria.

8. Menetelmä polypeptidin valmistamiseksi, jolla polypeptidillä on seuraava aminohapposekvenssi 5 -20 -10 met arg ala leu leu ala arg leu leu leu cys vai leu vai vai ser asp ser lys gly ser asn glu leu his gin vai pro 10 10 20 ser asn cys asp cys leu asn gly gly thr cys vai ser asn 30 lys tyr phe ser asn ile his trp cys asn cys pro lys lys 40 50 phe gly gly gin his cys glu ile asp lys ser lys thr cys 60 tyr glu gly asn gly his phe tyr arg gly lys ala ser thr 70 asp thr met gly arg pro cys leu pro trp asn ser ala thr 20 80 90 vai leu gin gin thr tyr his ala his arg ser asp ala leu 100 gin leu gly leu gly lys his asn tyr cys arg asn pro asp HO 120 25 asn arg arg arg pro trp cys tyr vai gin vai gly leu lys 130 pro leu vai gin glu cys met vai his asp cys ala asp gly 140 lys lys pro ser ser pro pro glu glu leu lys phe gin cys 30 150 160 gly gin lys thr leu arg pro arg phe lys ile ile gly gly 170 glu phe thr thr ile glu asn gin pro trp phe ala ala ile 180 190 35 tyr arg arg his arg gly gly ser vai thr tyr vai cys gly 48 88902 200 gly ser leu ile ser pro cys trp vai ile ser ala thr his 210 cys phe ile asp tyr pro lys lys glu asp tyr ile val tyr 5 220 230 leu gly arg ser arg leu asn ser asn thr gin gly glu met 240 lys phe glu val glu leu ile leu his lys asp tyr ser ala 250 260 10 asp thr leu ala his his asn asp ile ala leu leu lys ile 270 arg ser lys glu gly arg cys ala gin pro ser arg thr ile 280 gin thr ile cys leu pro ser met tyr asn asp pro gin phe 15 290 300 gly thr ser cys glu ile thr gly phe gly lys glu asn ser 310 thr asp tyr leu tyr pro glu gin leu lys met thr val val 320 330 20 lys leu ile ser his arg glu cys gin gin pro his tyr tyr 340 gly ser glu val thr thr lys met leu cys ala ala asp pro 350 gin trp lys thr asp ser cys gin gly asp ser gly gly pro 25 360 370 leu val cys ser leu gin gly arg met thr leu thr gly ile 380 vai ser trp gly arg gly cys ala leu lys asp lys pro gly 390 400 30 val tyr thr arg val ser his phe leu pro trp ile arg ser 410 411 his thr lys glu glu asn gly leu ala leu 49 88 932 tai sen osaa, jolla on ihmisen urokinaasin entsymaattista aktiivisuutta, tunnettu siitä, että bakteeri-tai nisäkässolu transformoidaan patenttivaatimuksen 1 mukaisella DNA:11a ja DNA ilmennetään bakteeri- tai nisä-5 kässoluviljelmässä.

9· Menetelmä ekspressiovektorin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että konstruoidaan ensimmäinen DNA-sekvenssi, joka koodaa polypeptidiä, jolla on seuraa-va aminohapposekvenssi 10 -20 -10 met arg ala leu leu ala arg leu leu leu cys vai leu vai vai ser asp ser lys gly ser asn glu leu his gin vai pro 15 10 20 ser asn cys asp cys leu asn gly gly thr cys vai ser asn 30 lys tyr phe ser asn ile his trp cys asn cys pro lys lys 40 50 phe gly gly gin his cys glu ile asp lys ser lys thr cys 20 60 tyr glu gly asn gly his phe tyr arg gly lys ala ser thr 70 asp thr met gly arg pro cys leu pro trp asn ser ala thr 25 80 90 vai leu gin gin thr tyr his ala his arg ser asp ala leu 100 gin leu gly leu gly lys his asn tyr cys arg asn pro asp 110 120 asn arg arg arg pro trp cys tyr vai gin vai gly leu lys 30 130 pro leu vai gin glu cys met vai his asp cys ala asp gly 140 lys lys pro ser ser pro pro glu glu leu lys phe gin cys 35 150 160 gly gin lys thr leu arg pro arg phe lys ile ile gly gly so 88 932 170 glu phe thr thr ile glu asn gin pro trp phe ala ala lie 180 190 tyr arg arg his arg gly gly ser vai thr tyr val cys gly 5 200 gly ser leu ile ser pro cys trp vai ile ser ala thr his 210 cys phe ile asp tyr pro lys lys glu asp tyr ile val tyr 220 230 leu gly arg ser arg leu asn ser asn thr gin gly glu met 240 lys phe glu val glu leu ile leu his lys asp tyr ser ala 250 260 asp thr leu ala his his asn asp ile ala leu leu lys ile 15 270 arg ser lys glu gly arg cys ala gin pro ser arg thr ile 280 gin thr ile cys leu pro ser met tyr asn asp pro gin phe 290 300 gly thr ser cys glu ile thr gly phe gly lys glu asn ser 310 thr asp tyr leu tyr pro glu gin leu lys met thr val val 320 330 lys leu ile ser his arg glu cys gin gin pro his tyr tyr 25 340 gly ser glu val thr thr lys met leu cys ala ala asp pro 350 gin trp lys thr asp ser cys gin gly asp ser gly gly pro 360 370 leu val cys ser leu gin gly arg met thr leu thr gly ile 3 0 380 vai ser trp gly arg gly cys ala leu lys asp lys pro gly 390 400 val tyr thr arg val ser his phe leu pro trp ile arg ser 35 410 411 his thr lys glu glu asn gly leu ala leu si 88932 tai sen osaa, jolla on ihmisen urokinaasin entsymaattista aktiivisuutta, ja liitetään mainittu ensimmäinen DNA-sek-venssi toiminnallisesti toiseen DNA-sekvenssiin, joka pystyy aikaansaamaan mainitun ensimmäisen DNA-sekvenssin 5 ilmentymisen. 52 88 9 52