DE3382760T2

DE3382760T2 - Herstellung von funktionellen menschlichen Urokinasepolypeptiden.

Info

Publication number: DE3382760T2
Application number: DE3382760T
Authority: DE
Inventors: Herbert Louis Heyneker; William Evans Holmes; Gordon Alan Vehar
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Gruenenthal GmbH
Priority date: 1982-04-15
Filing date: 1983-04-14
Publication date: 1995-03-02
Anticipated expiration: 2003-04-15
Also published as: AU573523B2; DK163683D0; EP0620279A1; DK163683A; FI88932B; IE64536B1; PH24783A; JPH0824579B2; EP0092182B1; PT76546B; EP0092182A2; ES8506087A1; ES533924A0; HK38297A; EP0620279B1; YU45128B; BR8301918A; GR78180B; DK173910B1; FI831228L

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Humanurokinase-Polypeptid, neue Formen und Zusammensetzungen davon und insbesondere Mittel und Methoden für die in vitro-Herstellung funktioneller Polypeptidarten von Humanurokinase.
Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung der DNA-Sequenz und der abgeleiteten Aminosäuresequenz von nativer Urokinase sowie assoziierten Bereichen des Urokinasemoleküls, die als funktionelle bioaktive Einheiten gefunden wurden. Diese Entdeckung ermöglichte die Herstellung von Urokinase-Polypeptid in verschiedenen Formen über die Anwendung der DNA-Rekombinationstechnik, die wiederum die Herstellung einer ausreichenden Qualität und Quantität an Materialien ermöglichte, mit denen die erforderlichen biologischen Untersuchungen durchgeführt wurden, um die biologisch funktionellen und daher nützlichen Einheiten des Moleküls zu identifizieren. Nachdem diese bestimmt worden waren, war es möglich, durch genetische Manipulation und in vitro-Verarbeitung funktionelle Arten von Urokinase-Polypeptid maßzuschneidern, wodurch man effizient zu bisher nichterhältlichen kommerziell effektiven Mengen von aktiven Polypeptidprodukten gelangte. Diese Erfindung betrifft diese assoziierten Ausführungsformen in jeder Hinsicht. Auf die Publikationen und andere Materialien hiervon, die zur Erläuterung des Hintergrunds der Erfindung und in bestimmten Fällen, um zusätzliche, die Praxis betreffende Details anzugeben, wird hiermit Bezug genommen und der Bequemlichkeit halber wird auf sie im folgenden Text mit Zahlen Bezug genommen, und sie werden entsprechend in der angefügten Bibliographie gruppiert.

Hintergrund der Erfindung

A. Humanurokinase

Das fibrinolytische System befindet sich in einem dynamischen Gleichgewicht mit dem Gerinnungssystem, wodurch ein intaktes durchgängiges Gefäßbett aufrechterhalten wird. Das Gerinnungssystem scheidet Fibrin als Matrix ab, um einen hämostatischen Zustand wiederherzustellen. Das fibrinolytische System entfernt das Fibrinnetzwerk, nachdem der hämostatische Zustand erreicht ist. Der fibrinolytische Prozeß wird durch das proteolytische Enzym Plasmin, das aus dem Plasmaprotein Plasminogen als Vorläufer gebildet wird. Plasminogen wird durch Aktivierung durch einen Aktivator in Plasmin umgewandelt.
Ein solcher Aktivator ist Urokinase. Dieser und ein anderer Aktivator, Streptokinase, sind gegenwärtig im Handel erhältlich. Beide sind für die Behandlung akuter Gefäßerkrankungen, wie Myocardinfarkt, Schlaganfall, Lungenembolie, Thrombose tiefer Venen, Verschluß peripherer Arterien und andere Venenthrombosen. Zusammen verursachen diese Krankheiten erhebliche Gesundheitsgefährdungen und -risiken.
Die zugrundeliegende äthiologische Basis dieser Krankheiten weist auf einen entweder teilweise oder in schweren Fällen totalen Verschluß eines Blutgefäßes durch einen Blutpropf - Thrombus oder Thromboembolus - hin. Die herkömmliche Therapie mit gerinnungshemmenden Mitteln, wie mit Heparin und Cumarin, trägt nicht dazu bei, die Auflösung der Thromben oder Thromboembolie direkt zu steigern. Streptokinase und Urokinase wurden bereitwillig in der Praxis und wirksam als thrombolytische Mittel eingesetzt. Bis heute wiesen jedoch beide erhebliche Einschränkungen auf. Keines zeigt eine hohe Affinität für Fibrin. Als Folge aktivieren beide zirkulierendes und fibringebundenes Plasminogen ohne wesentlichen Unterschied. Das in zirkulierendem Blut gebildete Plasmin wird relativ schnell neutralisiert und ist für die nützliche Thrombolyse verloren. Verbleibendes Plasmin baut verschiedene Gerinnungsfaktor-Proteine ab, beispielsweise Fibrinogen, Faktor V und Faktor VIII, wodurch ein Blutungspotential verursacht wird. Zusätzlich hat Streptokinase eine starke antigene Wirkung und Patienten mit hohen Antikörpertitern reagieren ineffizient auf die Behandlung und können nicht in fortdauernder Behandlung bleiben. Aufgrund der komplizierten Isolierung aus menschlichem Urin oder Gewebskulturen ist die Therapie mit Urokinase teuer und sie wird daher in der klinischen Praxis nicht allgemein akzeptiert. Urokinase war der Gegenstand zahlreicher Untersuchungen - vergleiche z. B. Literaturhinweise 1-9. Die gegenwärtig erhältliche Urokinase wird definitionsgemäß aus menschlichem Urin oder Gewebskulturen, z. B. Nierenzellen (9A, 9B) isoliert.
Das Urokinasemolekül existiert in mehreren biologisch aktiven Formen - mit hohem Molekulargewicht (ca. 54.000 Dalton) und mit niedrigem Molekulargewicht (ca. 33.000 Dalton), jeweils bestehend aus einer einkettigen oder zweikettigen Substanz. Die Form mit niedrigem Molekulargewicht leitet sich durch enzymatische Spaltung von der Form mit hohem Molekulargewicht ab. Biologisch aktives Material enthält den sogenannten Serinproteasebereich, der in der aktiven Form über eine Disulfidbrücke mit einer zweiten Kette verbunden ist. Man nimmt an, daß jegliche Aktivität, die dem Material mit hohem Molekulargewicht zugeschrieben wird, auf die gleichzeitige Anwesenheit dieser zwei verbundenen Ketten zurückzuführen ist, wobei die strategische Disulfidbindung und die Unterbrechung in der Sequenz zweifellos in dem Serinproteasebereich des Gesamtmoleküls lokalisiert sind (vergleiche Figur A). Jedenfalls war bis zu der vorliegenden Erfindung die Identität und somit Funktion des ca. 21.000 Dalton-Rests unbekannt, und es war nicht ohne Kontroverse möglich, die Aktivität der einen oder anderen der bekannten Urokinaseeinheiten zuzuschreiben.
Kürzlich wurde von einer weiteren Form eines Urokinasepeptids berichtet, das eine niedrige aber spezifische Aktivität aufwies (10, 10A). Es wurde spekuliert, daß dieses Material der nativen Urokinase entspricht, einer Vorform der früher isolierten oben beschriebenen aktiven Art, die höchstwahrscheinlich aus einer einzelnen Kette besteht.
Bisherige Versuche, das erforderliche Gen für Urokinase zu clonieren, begleitet von Hoffnungen, die Expression in einem Wirtsmikroorganismus zu erreichen, wurden nicht als erfolgreich angesehen (11, 11A). Vergleiche auch (6).
Man erkannte, daß die Anwendung der DNA-Rekombinationstechnik und verwandter Techniken letztendlich einen höchst effektiven Weg darstellen würden, die erforderlichen Mengen an qualitativ hochwertigem bioaktivem Humanurokinase-Polypeptid, im wesentlichen frei von anderen menschlichen Proteinen, und von dessen Derivaten, die die funktionelle Bioaktivität beibehalten, zur Verfügung zu stellen, wodurch somit die Verwendung solcher Materialien bei der klinischen Behandlung unterschiedlicher Gefäßzustände und -erkrankungen zulässig wird.

B. DNA-Rekombinations-/Proteinbiochemie-Technik

Die DNA-Rekombinationstechnik hat die Phase einer gewissen Ausgereiftheit erreicht. Molekularbiologen sind in der Lage, unterschiedliche DNA-Sequenzen mit einer gewissen Leichtigkeit zu rekombinieren, wodurch neue DNA-Einheiten gebildet werden, die in der Lage sind, reichliche Mengen an exogenem Proteinprodukt in transformierten Mikroorganismen und Zellkulturen zu produzieren. Die generellen Mittel und Methoden für die in vitro-Ligierung von verschiedenen DNA-Fragmenten mit glatten Enden oder "klebrigen" Enden sind verfügbar für die Herstellung potenter Expressionsvehikel, die für die Transformation bestimmter Organismen einsetzbar sind, wodurch deren effiziente Synthese erwünschter exogener Produkte gelenkt wird. Im Hinblick auf das individuelle Produkt bleibt der Weg jedoch in gewisser Weise umständlich und die Wissenschaft hat sich noch nicht zu dem Stadium entwickelt, auf dem regelmäßig der Erfolg vorhergesagt werden kann. Tatsächlich tun diejenigen, die erfolgreiche Ergebnisse ohne die zugrundeliegende experimentelle Basis ankündigen, dieses mit einem erheblichem Risiko der Undurchführbarkeit.
Die DNA-Rekombination der wesentlichen Elemente, d. h. eines Replikations-Startpunktes, eines oder mehrerer phänotypischer Selektionsmerkmale, eine heterologe Geninsertion und des restlichen Vektors wird im allgemeinen außerhalb der Wirtszelle durchgeführt. Das resultierende rekombinante replizierbare Expressionvehikel oder das Plasmid wird durch Transformation in Zellen eingeführt und große Mengen des rekombinanten Vehikels werden durch Züchten des Transformanten erhalten. Sofern das Gen hinsichtlich der Bereiche, die die Transkription und Translation der codierten DNA-Botschaft steuern, richtig insertiert ist, ist das so erhaltene Expressionvehikel nützlich, um tatsächlich die Polypeptidsequenz zu produzieren, für die das insertierte Gen codiert, ein Prozeß, der als Expression bezeichnet wird. Das resultierende Produkt, kann, falls notwendig, durch Lyse der Wirtszelle in mikrobiellen Systemen und Gewinnen des Produkts durch geeignete Reinigung von anderen Proteinen erhalten werden.
In der Praxis können durch Verwendung der DNA-Rekombinationstechnik vollkommen heterologe Polypeptide exprimiert werden - sogenannte direkte Expression - oder alternativ kann ein heterologes Polypeptid, das mit einem Teil einer Aminosäuresequenz eines homologen Polypeptids fusioniert ist, exprimiert werden. In den letzteren Fällen wird das angestrebte bioaktive Produkt manchmal in dem fusionierten homologen/heterologen Polypeptid bioinaktiviert, bis es in der extrazellulären Umgebung gespalten wird. Vergleiche Literaturstellen (12) und (13).
In ähnlicher Weise ist die Technik der Zell- und Gewebekulturen für Studien in der Genetik und Zellphysiologie gut etabliert. Mittel und Methoden zum Aufrechterhalten permanenter Zellinien sind verfügbar, die durch aufeinanderfolgenden mehrfachen Transfer von isolierten normalen Zellen hergestellt werden. Für die Verwendung in der Forschung werden solche Zellinien auf einem festen Träger in einem flüssigen Medium gehalten oder durch Wachstum in Suspension, die die unterstützenden Nährstoffe enthält. Das Scale-up für große Ansätze scheint nur mechanische Probleme zu stellen. Für weitere Hintergrundsinformationen wird auf die Literaturstellen (14) und (15) verwiesen.
In gleicher Weise ist die Proteinbiochemie ein nützlicher tatsächlich notwendiger Zusatzbereich der Biotechnologie. Zellen, die das angestrebte Protein produzieren, produzieren auch Hunderte von anderen Proteinen, die endogenen Produkte des Zellmetabolismus. Diese verunreinigenden Proteine sowie andere Verbindungen würden sich, sofern sie nicht von dem angestrebten Protein entfernt werden, als toxisch erweisen, wenn sie einem Tier oder Menschen im Verlauf einer therapeutischen Behandlung mit dem angestrebten Protein verabreicht würden. Daher kommen die Techniken der Proteinbiochemie zum Tragen, die den Entwurf von Trennverfahren erlauben, die für das bestimmte betrachtete System geeignet sind und die ein homogenes Produkt, das für die angestrebte Verwendung sicher ist, ergeben. Die Proteinbiochemie bestätigt auch die Identität des angestrebten Produkts, indem sie es charakterisiert und sicherstellt, daß die Zellen es wahrheitsgetreu produziert haben, ohne Veränderungen oder Mutationen. Dieser Zweig der Wissenschaft ist auch am Entwurf von Bioassays, Stabilitätsuntersuchungen und anderen Verfahren, deren Anwendung notwendig ist, bevor erfolgreiche klinische Studien und Vermarktung stattfinden können, beteiligt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß die DNA- Rekombinations-/Proteinbiochemietechnik verwendet werden kann, um erfolgreich Humanurokinase in Form biologisch funktioneller maßgeschneiderter Arten herzustellen. Diese Erfindung stellt aktives Urokinaseprotein für die Verwendung bei der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von verschiedenen Gefäßzuständen und -erkrankungen bei Menschen bereit. Jede ihrer Formen beinhaltet die bioaktive Einheit, die der enzymatische Bereich des nativen Materials ist, von dem man annimmt, daß er sich in dem Serinproteasebereich befindet. Gemäß dieser Erfindung kann eine Reihe von Produkten mit Urokinaseaktivität hergestellt werden in einer für in vitro-Verarbeitung verfügbaren Form, um zu einem bioaktiven Produkt zu führen. Diese Erfindung stellt auch die Mittel und Methoden für die Herstellung von nativen Urokinase-Polypeptidmolekülen der vollen Längen in bioaktivierbarer Form bereit, die den potentiellen zusätzlichen Vorteil der spezifischen Affinität für Fibrin haben, der bisher für kein aus natürlichen Quellen isoliertes Urokinaseprodukt gezeigt wurde. Somit wird ein Humanurokinase-Polypeptidprodukt bereitgestellt, das die potentielle neue Eigenschaft der spezifischen Aktivität gegenüber materiellen bestehenden Thromben hat. Da die Produkte durch eine Wirtszelle, die die für die entsprechende Produkteinheit codierende rekombinante DNA enthält, produziert werden, stehen nun die Möglichkeiten zur Verfügung, Humanurokinase-Polypeptid in Formen, die gesteigerte biologisch signifikante Eigenschaften aufweisen, herzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein nicht-glykosyliertes Polypeptid bereit mit einer intakten Lysin-Isoleucin-Bindung an der Position, die den Aminosäuren 158-159 im nativen Prourokinase-Molekül entspricht, und das genügend von der in den Fig. 4A und 4B dargestellten Aminosäuresequenz aufweist, so daß, bei Aktivierung, das aktivierte Polypeptid die enzymatische Aktivität von Humanurokinase zeigt. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann beispielsweise ein nicht-glykosyliertes Prourokinaseprotein oder Met-Prourokinaseprotein sein. Es ist bevorzugt, daß das Polypeptid die Sequenz Lys- Ile-Ile-Gly-Gly an den Positionen, die den Aminosäuren 158-162 im nativen Prourokinasemolekül entsprechen, aufweist und im einzelnen, daß es die Aminosäuresequenz oder im wesentlichen die Aminosäuresequenz, wie in den Figuren 4A und 4B dargestellt, hat.
Die vorliegende Erfindung schließt eine isolierte DNA-Sequenz ein, die das erfindungsgemäße Polypeptid codiert, wobei diese Sequenz normalerweise mit einer zweiten DNA-Sequenz verknüpft ist, die in der Lage ist, die Expression der ersten zu bewirken und betrifft weiter replizierbare DNA-Expressionsvehikel, die Gensequenzen beherbergen, die das erfindungsgemäße Polypeptid in exprimierbarer Form codieren. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus, z. B. E. coli, der mit den oben beschriebenen Expressionvehikeln transformiert ist sowie mikrobielle Kulturen davon, die in der Lage sind, die Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids durchzuführen.
Gemäß weiteren Aspekten schließt die Erfindung ein Präparat ein, das eine therapeutisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen Polypeptids zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt. Weiterhin schließt sie das erfindungsgemäße Polypeptid zur Verwendung bei einem Behandlungsverfahren des menschlichen oder tierischen Körpers für die Behandlung von Gefäßerkrankungen ein. Ferner stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids durch Expression einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz, um das nicht-glykosylierte Polypeptid zu erhalten, das bei Aktivierung, z. B. durch proteolytische Spaltung, zu einem Polypeptid umgewandelt wird, das die enzymatische Aktivität von Humanurokinase zeigt.
Hierin bezeichnet der Ausdruck "Humanurokinase-Polypeptid" ein Polypeptid in der bioaktiven Form, hergestellt durch Mikrobenkultur oder gegebenenfalls in vitro-Verarbeitung, das den enzymatischen Bereich umfaßt, der dem nativen Material entspricht. Humanurokinase-Polypeptid gemäß der Erfindung wird somit bereitgestellt: 1) in voller Länge im Unterschied zum Material, das bislang aus natürlichen Quellen isoliert wurde oder 2) in anderen bioaktiven Formen, die die Orte des enzymatischen Bereichs tragen, der im wesentlichen für die Plasminogen-Aktivierung gefunden wird oder 3) mit einem Methionin als erster Aminosäure oder einem Signalpolypeptid oder einem von dem Signalpolypeptid verschiedenen konjugierten Polypeptid, das mit dem N- Terminus des enzymatischen Bereichs verknüpft ist, wobei das Methionin, Signal- oder konjugierte Polypeptid in einer intra- oder extrazellulären Umgebung spezifisch abspaltbar ist (vergleiche Literaturstelle 12). in jedem Falle werden die so hergestellten Humanurokinase-Polypeptide gewonnen und bis zu dem Grad gereinigt, daß sie für die Verwendung in der Behandlung verschiedener cardiovaskulärer Zustände oder Erkrankungen geeignet sind.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

A. Kulturen von Mikroorganismen

1. Bakterienstämme/Promotoren

Die hierin beschriebene Arbeit wurde durchgeführt unter Verwendung des E. coli-Stammes K-12 GM 48 (thr&supmin;, leu&supmin;, B&sub1;&supmin;, lacYl, gal Kl2, gal T22, ara 14, ton A31, tsx 78, Sup E44, dam 3, dcm 6), hinterlegt bei der American Type Culture Collection am 9. April 1982 (ATTC Nr. 39099) und des E. coli-Stammes K-12 294 (end A, thi&supmin;, hsr&supmin;, khsm&spplus;) beschrieben in der Literaturstelle (16) und hinterlegt bei der American Type Culture Collection am 28. Oktober 1978, ATCC Hinterlegungs-Nr. 31446 als Mikroorganismen. Jedoch sind auch andere Mikrobenstämme nützlich einschließlich der bekannten E. coli-Stämme, wie E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC Nr. 31537, hinterlegt am 3. Juli 1979) und E. coli W 3110 (F&supmin;, λ&supmin;, protroph) (ATCC Nr. 27325, hinterlegt am 10. Februar 1972) oder andere Mikrobenstämme, von denen viele hinterlegt und (potentiell) von anerkannten Institutionen zur Hinterlegung von Mikroorganismen erhältlich sind, wie von der American Type Culture Collection (ATCC) - vergleiche die Auflistung im ATCC-Katalog. Siehe (17). Diese anderen Mikroorganismen schließen beispielsweise Bacilli, wie Bacillus subtilis, und andere Enterobacteriaceae ein, von denen als Beispiele Salmonella typhimurium, Serratia marcesans und Pseudomonas erwähnt werden können. Es werden Plasmide verwendet, die replizieren und heterologe Gensequenzen darin exprimieren können.
Beispielsweise wurden die beta-Lactamase- und Lactose-Promotersysteme mit Vorteil verwendet, um die mikrobielle Produktion heterologer Polypeptide zu initiieren und aufrechtzuerhalten. Details, die die Aufmachung und Konstruktion dieses Promotorsystems betreffen, können aus den Literaturstellen (18) und (19) entnommen werden. Kürzlich wurde ein System, das auf dem Tryptophan-Stoffwechselweg basiert, das sogenannte trp-Promotorsystem, entwickelt. Details, die die Aufmachung und Konstruktion dieses Systems betreffen, können aus den Literaturstellen (20) und (21) entnommen werden. Zahlreiche andere mikrobielle Promotoren sind entdeckt und verwendet worden und Details bezüglich ihrer Nucleotidsequenzen, die den Fachmann in die Lage versetzen, sie funktionell in Plasmidvektoren zu ligieren, sind veröffentlicht worden. Siehe (22).

B. Vektorsysteme

1. Expression in Bakteriensystemen

Expressionsplasmide zur Verwendung mit Bakterien, z. B. E. coli, werden gemeinhin abgeleitet, indem man BR322 (37) als Vektor verwendet und die heterologe Gensequenz in geeigneter Weise zusammen mit Start- und Stopsignalen für die Translation in funktionellem Leseraster mit einem funktionellen Promoter unter Ausnutzung üblicher oder synthetisch gebildeter Restriktions-Spaltstellen. Der Vektor trägt ein oder mehrere charakteristische Gene für die phänotypische Selektion sowie einen Replikationsstartpunkt, um die Amplifikation im Wirt sicherzustellen. Der heterologe insertierte Bereich kann wiederum so eingefügt werden, daß er zusammen mit einer daran fusionierten Vorsequenz exprimiert wird, die sich beispielsweise aus den Genen des trp-Systems ableiten läßt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur A ist eine schematische Darstellung der Urokinase-Polypeptide. Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht beginnt bei der Aminosäure 136 und endet bei der Aminosäure 411. Urokinase mit hohem Molekulargewicht beginnt bei der Aminosäure 1 und endet bei der Aminosäure 411. Die Umwandlung der einkettigen Form von sowohl Urokinase mit hohem Molekulargewicht wie Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht zu der bioaktiven zweikettigen Form findet durch proteolytische Spaltung zwischen den Aminosäuren 158 und 159 statt. Präurokinase beginnt bei der Aminosäure 20. Die dargestellte konformative Positionierung der Disulfidbindungen basiert auf der Analogie mit anderen Serinproteasen.
Die Fig. 1A bis 1C stellen die Nucleotidsequenz und die Restriktionsendonucleasenkarte des cDNA-Inserts für das bioaktive 33.000 Dalton- Urokinase-Polypeptid mit niedrigem Molekulargewicht des Plasmids pD2 dar. Der Nucleotidbereich der synthetischen Desoxyoligonucleotid-CB6B-Sonde ist unterstrichen.
Die Fig. 2A, B stellen die aus der cDNA-Sequenz von Fig. 1 abgeleitete Aminosäuresequenz dar, wobei die Aminosäuren des cDNA-Insertbereichs mit 1-279 numeriert sind.
Die Fig. 3A bis 3C stellen die Nucleotidsequenz und Restriktionsendonucleasenkarte der cDNA für das Humanurokinase-Polypeptid mit voller Länge dar. Die CB6B-Sonde ist in gleicher Weise unterstrichen.
Die Fig. 4A, B stellen die aus der cDNA-Sequenz von Fig. 3 abgeleitete Aminosäuresequenz für Urokinase-Polypeptid in voller Länge dar.
Die Fig. 5 erläutert die Konstruktion des Plasmids pUK33trpLEL für die Expression des 33.000 Dalton-Proteins mit langer Fusion dar.
Die Fig. 6 erläutert die Konstruktion des Plasmids pUK33trpLES für die Expression des 33.000 Dalton-Proteins mit kurzer Fusion.
Die Fig. 7 zeigt die Konstruktion des Plasmids für die direkte Expression des 33.000 Dalton-Polypeptids.
Die Fig. 8 erläutert eine andere Konstruktion eines Plasmids für die direkte Expression des 33 kD-Polypeptids.
Die Fig. 9 und 10 erläutern die Konstruktion von Plasmiden für die direkte Expression des 54 kD-Urokinase-Polypeptids und einer Vorläuferform des 54 kD-Urokinase-Polypeptids.
Die Fig. 11 erläutert die zeitabhängige Aktivierung von Plasminogen durch Urokinase-Polypeptid, das wie hier beschrieben hergestellt wurde, in einem Plasminassay sowie dessen Notwendigkeit.
Die Fig. 12 stellt die Plasminogen-aktivierende Aktivität der Urokinase-Polypeptid-Extrakte hiervon und die Inhibierung dieser Aktivität durch Antikörper, die gegen natürliche Urokinase gebildet wurden, dar.

Detaillierte Beschreibung

A. Quelle für Urokinase-mRNA

Detroit 562 (menschliche Kehlkopf-Carcinom)-Zellen (38) (ATCC Nr. CCL 138) wurden bis zur Konfluenz im essentiellen Eagle-Minimalmedium (39) kultiviert, das auf einen Gehalt von 3% Natriumbicarbonat (pH 7,5), 1% L- Glutamin (Irvine), 10% fötales Rinderserum, 1% Natriumpyruvat (Irvine), 1% nichtessentielle Aminosäuren (Irvine), 2,4% HEPES (pH 7,5), 50 ug/ml Garamycin ergänzt und bei 37ºC in einer Atmosphäre mit 5% CO&sub2; inkubiert wurde. Nach der 15minütigen Behandlung mit 0,25% Trypsin bei 37ºC wurden konfluente Zellen durch Zentrifugation geerntet.

B. Isolierung der Messenger-RNA

Aus Detroit 562-Zellen wurde die gesamte RNA, im wesentlichen wie von Lynch et al. (40) beschrieben, extrahiert. Die Zellen wurden zu einem Pellet zentrifugiert und ungefähr 1 g Zellen wurde dann in 10 ml 10 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 7,4), 1,5 mM MgCl&sub2; resuspendiert. Durch Zugabe des nichtionischen Detergens NP-40 bis zu einer Endkonzentration von 1% wurden die Zellen lysiert. Die Kerne wurden durch Zentrifugation entfernt, und die RNA wurde durch zwei aufeinanderfolgende Phenol (redestilliert)/Chloroform: Isoamylalkohol-Extraktionen bei 4ºC weiter gereinigt. Die wäßrige Phase wurde bezüglich NaCl auf 0,2 M gebracht, und die gesamte RNA wurde durch Zugabe von 2 Volumen 100%igem Ethanol und Lagerung über Nacht bei -20ºC ausgefällt. Nach der Zentrifugation wurde polyA-mRNA aus der Gesamt-RNA durch oligo-dT- Cellulosechromatographie (41) gereinigt. Typische Ausbeuten aus 1 g Zellen waren 10-15 mg Gesamt-RNA und bis etwa 2% davon waren polyA-mRNA.

C. Fraktionierung der polyA-mRNA nach der Größe

Die Fraktionierung von 200 ug polyA-mRNA nach der Größe wurde durch Elektrophorese durch ein Säure-Harnstoff-Gel, hergestellt aus 1,75% Agarose, 25 mM Natriumcitrat (pH 3,8) und 6 M Harnstoff (40,42) erreicht. Die Elektrophorese wurde 7 Stunden lang bei 25 mA und 4ºC durchgeführt. Das Gel wurde dann manuell mit einer Rasierklinge fraktioniert. Einzelne Scheiben des Gels wurden bei 70ºC geschmolzen und in 12 ml 10 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 7,4), 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,1% SDS verdünnt und zweimal mit wassergesättigtem, redestilliertem Phenol sowie einmal mit Chloroform extrahiert. Die Fraktionen wurden dann mit Ethanol ausgefällt und anschließend in vitro translatiert (43), um die betreffende Größenfraktionierung und die Vollständigkeit bzw. Einheitlichkeit der polyA-mRNA zu bestimmen.

D. Herstellung einer Koloniebank auf der Basis von oligo-dT-Primern, enthaltend Urokinase-DNA-Sequenzen

Poly A-mRNA wurde auf saure Harnstoffgele nach der Größe fraktioniert. mRNA-Fraktionen größer als 12S wurden gesammelt und als Templat für die oligo-dT-Primer unterstützte Herstellung von doppelsträngiger cDNA nach Standardverfahren verwendet (44,45). Die cDNA wurde durch Elektrophorese auf 6%igem Polyacrylamidgel nach der Größe fraktioniert und 132 ng von ds-cDNA mit einer größeren Länge als 350 Basenpaaren wurde durch Elektroelution erhalten. Ein Anteil von 30 ng der ds-cDNA wurde mit Desoxy-C-Resten unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase (46) verlängert und wurde mit 200 ng des Plasmids pBR322 (37), das auf ähnliche Weise an der PstI-Spaltstelle (46) mit einem Schwanz von Deoxy G-Resten versehen worden war, reassoziieren gelassen. Jedes reassoziierte Gemisch wurde dann in E. coli-Stamm K12 294 (ATCC Nr. 31446) transformiert. Etwa 10.000 gegenüber Ampicillin empfindliche tetracyclinresistente Transformanten wurden erhalten.

E. Herstellung synthetischer DNA-Oligomere zur Verwendung als Screening-Sonden für Urokinase

Acht synthetische 14 Basen lange DNA-Oligomere wurden komplementär zu mRNA entworfen, die auf der Met-Tyr-Asn-Asp-Pro-Aminosäuresequenz eines Bromcyan-Polypeptidfragments von Urokinase mit der Bezeichnung CB6 basierten. Diese acht Desoxyoligonucleotide wurden nach der Phosphortriestermethode (47) in den folgenden Pools von zwei Deoxyoligonucleotiden synthetisiert: (CB6A) 5' GGGTCGTTA/GTACAT 3', (CB6B) 5' GGATCGTTA/GTACAT 3', (CB6C) 5' GGGTCATTA/GTACAT 3', (CB6D) 5' GGATCATTA/GTACAT 3'. Jeder Pool von zwei Oligomeren wurden dann wie folgt radioaktiv phosphoryliert: 250 ng Desoxyoligonucleotid wurden mit 25 ul 60 mM Tris HCl (pH 8), 10 mM MgCl&sub2;, 15 mM beta-Mercaptoethanol und 100 uCi (γ-³²P)-ATP (Amersham, 5000 Ci/mmol) gemischt. 5 Einheiten T4-Polynucleotidkinase wurden zugegeben und man ließ bei 37 C 30 Minuten lang reagieren und beendete die Reaktion durch Zugabe von EDTA auf 20 mM.

F. Absuchen der Koloniebank auf der Basis von oligo-dT-Primern nach Urokinasesequenzen

Etwa 10.000 Kolonien wurden einzeln in Vertiefungen von Mikrotiterplatten inokuliert, die LB-Medium (48) + 5 ug/ml Tetracyclin enthielten, und wurden nach Zugabe von DMSO bis auf 7% bei -20ºC gelagert. Einzelne Kolonien dieser Bank wurden auf Schleicher und Schuell BA85/20-Nitrocellulosefilter übertragen und auf LB + 5 ug/ml Tetracyclin-enthaltenden Agarplatten gezüchtet. Nach etwa 10stündigem Wachstum bei 37ºC wurden die Koloniefilter auf Agarplatten übertragen, die LB + 5 ug/ml Tetracyclin und 12,5 ug/ml Chloramphenicol enthielten, und wurden wiederum über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die DNA aus jeder Kolonie wurde dann denaturiert und nach einem modifizierten Grunstein-Hogness-Verfahren (49) an dem Filter fixiert. Man ließ jeden Filter 3 Minuten lang auf 0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl schwimmen, um die Kolonien zu lysieren und die DNA zu denaturieren, dann wurde durch 15minütiges Schwimmen auf 3 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5) neutralisiert. Die Filter ließ man dann weitere 15 Minuten auf 2·SSC schwimmen und sie wurden anschließend 2 Stunden lang in einem Vakuumofen bei 80ºC erhitzt. Die Filter wurden ca. 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in 0,9 M NaCl, 1·Denhardt-Medium, 100 mM Tris HCl (pH 7,5), 5 mM Na-EDTA, I mM ATP, 1 M Natriumphosphat (dibasisch), 1 mM Natriumpyrophosphat, 0,5% NP-40 und 200 ug/ml E. coli t- RNA prähybridisiert und in derselben Lösung über Nacht hybridisiert, im wesentlichen wie von Wallace et al. (50) beschrieben, wobei ca. 40·10&sup6; cpm jedes kinasebehandelten Pools von 2 CB6-Deoxyoligonucleotiden verwendet wurde. Nach ausgiebigem Waschen bei 37ºC in 6·SSC, 0,1% SDS, wurden die Filter 16 bis 24 Stunden bei -80ºC einem Kodak XR-5-Röntgenfilm mit DuPont Lightning-Plus-Verstärkungsschirmen ausgesetzt. Bei zwei Kolonien zeigte sich Hybridisierung mit dem Gemisch der acht Sonden: UK513dT69D2 (pD2) und UK513dT73D12 (pD12).

G. Charakterisierung der Plasmid-DNA von pD2 und pD12

Die Plasmid-DNA wurde aus den E. coli-Kolonien UK513dT69D2 und UK513dT73D12 nach einem schnellen Miniscreenverfahren (51) isoliert und der Analyse mit der Restriktionsendonuclease PstI unterworfen. Diese Analyse ließ stark vermuten, daß pD2 und pD12 identisch sind. Jede Plasmid-DNA hat 3 PstI-Restriktionsfragmente, die bei Elektrophorese durch ein 6% Polyacrylamidgel zusammen wandern. Die vollständige Nucleotidsequenz des cDNA- Inserts von Plasmid pD2 wurde nach der Didesoxynucleotid-Kettenabbruchmethode (52) bestimmt, nachdem die PstI-Restriktionsfragmente in den M13-Vektor mp7 (53) subcloniert worden waren. Fig. 1 stellt die Nucleotidsequenz dar und Fig. 2 stellt die translatierte Nucleotidsequenz des cDNA-Insertfragments von pD2 dar. Der gesamte codierende Bereich von Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht (33 kD) wurde auf diesem einen großen Fragment von pD2 isoliert. Die Nucleotidsequenz des CB6B (5' GGATCGTTA/GTACAT) Desoxyoligonucleotids schließt nach dieser Karte die Nucleotide 466 bis 479 ein. Ein für Serinproteasen typisches Reaktionszentrum (Gly Asp Ser Gly Gly Pro) liegt zwischen den Aminosäuren 222 und 227. Der codierende Bereich besteht aus 838 Basenpaaren oder 279 Aminosäuren des carboxyterminalen Teils von Urokinase mit hohem Molekulargewicht (54 kD). Das Stopcodon UGA bei der Aminosäureposition 280 beginnt bei ca. 935 Nucleotiden der nicht-translatierten 3'-Sequenz bis zu der poly A-Sequenz. Da nur 31.413 Dalton der Urokinase mit voller Länge von dem cDNA-Insert von pD2 codiert wurden, war es notwendig, zusätzliche Koloniebanken, die Urokinasesequenzen enthalten, zu konstruieren, um das Urokinase-Polypeptid mit hohem Molekulargewicht zu identifizieren.

H. Konstruktion zweier verschiedener Koloniebanken mit spezifischem Primer zur Verlängerung der existierenden Urokinaseclone am Aminoterminus

Bei der ersten cDNA-Bank mit spezifischem Primer wurde ein 45 Basenpaare-Restriktionsendonucleasefragment von Urokinase-DNA, das mit HaeII an der Position 225 beginnt und mit AccI an der Position 270 endet (Fig. 1) anstelle von oligo-dT&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als Primer verwendet. Dieses Fragment wurde in Gegenwart von 20 ug nicht-fraktionierter Detroit 562-poly A-mRNA in der Wärme denaturiert und cDNA wurde gemäß den Verfahren, auf die in Abschnitt D hingewiesen wurde, hergestellt. 11,5 ng doppelsträngiger DNA mit mehr als 200 bp wurden aus einem 6% Polyacrylamidgel elektroeluiert und zur Bildung von ca. 6000 Clonen in E. coli 294 verwendet.
Eine zweite cDNA-Bank mit spezifischem Primer mit etwa 4000 Kolonien, die als UK89CB6 bezeichnet wurde, wurde unter Verwendung eines Pools von 4 ug poly A-mRNA der Fraktion 8 des Säureharnstoff-Agarosegels sowie 4 ug poly A-mRNA aus Fraktion 9 (Abschnitt C) konstruiert. 250 ng jedes CB6- Deoxyoligonucleotidpools (Abschnitt E) wurden anstelle von oligo-dT&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als Primer verwendet.

I. Absuchen der Koloniebank mit voller Länge

cDNA der vollen Länge enthaltende Kolonien wurden direkt auf Nitrocellulosefilter übertragen und dann bei 37ºC gezüchtet. Die Kolonien wurden lysiert und die DNA wurde denaturiert und an den Filtern fixiert, wie in Abschnitt F beschrieben (49). Aus einem Restriktionsendonucleasefragment mit 143 Basenpaaren von HinfI bis HaeII des cDNA-Inserts von pD2 wurde eine ³²P- markierte DNA-Sonde hergestellt (54) und mit der auf dem Filter fixierten cDNA der vollen Länge hybridisiert (55). 8·10&sup6; cpm der Sonde wurden 16 Stunden lang hybridisiert, dann wie beschrieben gewaschen (55) und dem Röntgenfilm ausgesetzt. 2 Kolonien wiesen starke Hybridisierung auf: A3 und E9.

J. Charakterisierung der cDNA's pA3 und pE9 für Urokinase der vollen Länge

Die Restriktionsanalyse mit PstI der DNA des A3-Plasmids zeigte cDNA-Insertfragmente von ca. 360 bp und ca. 50 bp und von DNA des E9-Plasmids ein Fragment von ca. 340 bp. Doppelte Restriktion von jeder Plasmid-DNA mit PstI und EcoRI ergab ein gemeinsames cDNA-Insertfragment von ca. 190 bp, wie vorhergesagt, worin jede Plasmid-DNA die Information der Urokinasesequenz 5' zum HaeII-AccI-Primerfragment codiert. Plasmid pA3 hat ein zusätzliches PstI-EcoRI-cDNA-Insertfragment von 185 bp und E9 ein zusätzliches Fragment von 160 bp. Das größere ca. 360 bp PstI-cDNA-Insertfragment von pA3 wurde in den M13-Vektor mp7 (53) subcloniert und nach der Didesoxynucleotidkettenabbruchmethode (52) sequenziert. Die Urokinase-codierende Sequenz von pA3 erstreckt sich von etwa Position 405 bis Position 785 in der cDNA-Sequenz des Urokinaseproteins der vollen Länge in Fig. 3.

K. Absuchen der Urokinase-Koloniebank UK89CB6

DNA von Kolonien die das ca. 1900 UK89CB6 cDNA-Insert enthalten, wurde denaturiert und an Nitrocellulosefilter, wie vorher in Abschnitt F beschrieben, fixiert. Eine ³²P-markierte DNA-Sonde wurde aus dem 146 bp Psti- HinfI-Fragment des cDNA-Insertfragments von pA3 hergestellt (54). 40·10&sup6; cmp dieser Sonde wurden dann 16 Stunden lang mit der filtergebundenen DNA der UK89CB6-Kolonien hybridisiert, anschließend wie beschrieben gewaschen (55) und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Zwei Kolonien wiesen positive Hybridisierung auf, und zwar UK89CB6F1 (pF1) und UK89CB6H10 (pH10).

L. Charakterisierung von pF1- und pH10-Urokinase-cDNA.

PstI-Restriktion von pF1 führt zu cDNA-Insertfragmenten mit ca. 450 bp und ca. 125 bp. pH10 weist ein PstI-cDNA-Insertfragment von ca. 500 bp auf. Bei doppelter Restriktion von pF1 mit PstI-EcoRI zeigt sich keine EcoRI-Restriktionspaltstelle und weist cDNA-Insertfragmente auf, die mit denen der ausschließlichen PstI-Restriktion identisch sind. pH10 zeigt eine EcoRI-Restriktionsspaltstelle, wodurch sich cDNA-Insertfragmente von ca. 375 bp und ca. 110 bp ergeben. Diese EcoRI-Spaltstelle von pH10 ist wahrscheinlich dieselbe EcoRI-Spaltstelle, die bei Position 627 festgestellt wurde (Fig. 3). Das pF1-cDNA-Insert enthält diese EcoRI-Restriktionsspaltstelle nicht.
pF1, das ein längeres cDNA-Insertfragment als das von pH10 aufweist, wurde für die Sequenzierung ausgewählt. Beide PstI-Restriktionsfragmente des pF1-cDNA-Inserts wurden durch M13-Subclonierung und Didesoxysequenzierung sequenziert. Die zusammengesetzte Nucleotidsequenz der UK- cDNA-Inserts von pF1, pA3 und pD2, die für die gesamte Aminosäuresequenz der Urokinase mit hohem Molekulargewicht in voller Länge codiert, ist in Fig. 3 gezeigt. Die Urokinase-codierende Sequenz von pF1 ist von Position 1 bis etwa Position 570 dargestellt. Die Urokinase-codierende Sequenz von pD2 erstreckt sich von Position 532 bis Position 2304 in Fig. 3.
In den Figuren A und 4 ist das aminoterminale Serin an der Aminosäureposition 1 gezeigt, wie es bei der Analyse der Aminosäuresequenz bestimmt wurde. Die davor befindlichen 20 Aminosäuren am Aminoterminus, die mit Met beginnen und mit Gly enden, dienen wahrscheinlich als Signalsequenz für die Sekretion der restlichen 411 Aminosäuren der Urokinase mit hohem Molekulargewicht. Diese mutmaßliche Signalsequenz hat mit anderen charakterisierten Signalsequenzen Eigenschaften gemeinsam, wie Größe und Hydrophobizität (56, 57).
Die Trypsin-Spaltungsstellen, durch die sich die zweikettige 33kD-Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht aus der Urokinase mit hohem Molekulargewicht ergibt, sind wie folgt: Lys an der Position 136 ist die aminoterminale Aminosäure der kurzen Kette und Ile an der Position 159 ist der Aminoterminus der langen Kette (Figuren A, 4).

M. Expression der Derivate mit niedrigem Molekulargewicht von Urokinase-Polypeptid in E. coli

1. Lange trp-LE-Fusion (Fig. 5)

Ein Plasmid (pNCV, 58) mit den folgenden Eigenschaften wurde konstruiert: 1) das Plasmid leitet sich von pBR322 ab und liegt in der Zelle in etwa 20 Kopien vor. 2) Durch das Plasmid wird der E. coli-Wirt resistent gegen Tetracyclin. 3) Das Plasmid enthält einen induzierbaren Tryptophan-Promotor, der die Synthese eines Proteins steuert, das aus einer Fusion des trp-Leaderpeptids mit dem trp-E-Strukturgen (LE-Fusionsgen) besteht. 4) Dem trp-Gen wurde eine einzelne PstI-Restriktionsspaltstelle konstruiert, die verwendet werden kann, um PstI-DNA-Fragmente zu clonieren, indem man die EcoRI-Spaltstelle am distalen Ende des LE-Gens in Plasmid pSOM7Δ1Δ4 unter Verwendung einer synthetischen Sequenz in eine PstI-Spaltstelle, die von zwei EcoRI-Spaltstellen flankiert ist, umwandelt:
AATTCTGCAG
GACGTCTTAA.
Das DNA-Fragment, das den trp-Promotor und das LE-Gen enthielt, wurde dann in das Plasmid pBR322 eingeführt, um das pNCV (47A) zu ergeben.
Das PstI-Urokinasefragment vom Nucleotid an Position 5 (die PstI- 5'-Spaltstelle) bis zum Nucleotid an Position 1130 (Fig. 1) wurde auf die Weise in die PstI-Spaltstelle von pNCV cloniert, daß ein Fusionsprotein bei Induktion des trp-Promotors hergestellt wird. Der N-terminale Teil ist trp- LE und der C-terminale Teil ist Urokinase-Polypeptid mit niedrigem Molekulargewicht.
5 ug des Plasmids pUK513dT69D2 (pD2) wurden mit 20 Einheiten PstI gespalten und das 1125 bp cDNA-Insertfragment, das Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht codiert, wurde durch 6% Polyacrylamid-Gelelektrophorese isoliert, vergleiche Fig. 5. Ca. 1 ug dieses Inserts wurde aus dem Gel elektroeluiert, Phenol/Chloroform-extrahiert und mit Ethanol gefällt. 1 ug des Vektorsplasmids pNCV (58) wurde mit 10 Einheiten PstI gespalten und nach der Phenol/Chloroform-Extraktion mit Ethanol gefällt. Ca. 100 ng dieses 1125 bp-Fragments wurden mit ca. 100 ng mit PstI gespaltenem pNCV in 20 ul 20 mM Tris HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 2,5 mM ATP und 30 Einheiten von T4-DNA-Ligase gemischt. Nach der Ligierung über Nacht bei 14ºC wurde eine Hälfte des Gemisches in den E. coli-Stamm K12 294 transformiert. Bei der BamHI-Spaltung der DNA von 12 Transformanten zeigten 3 die richtige Orientierung. Die Expression dieses Plasmids (pUK33trpLEL) (Fig. 5) in E. coli ergab ein langes trp-LE-Fusionsprotein, das das 33.000 Urokinase-Polypeptid einschloß. Das 33.000 Urokinase-Polypeptid wird durch Spaltung mit einem trypsinartigen aktiven Enzym zwischen den Positionen 3 und 4 und den Positionen 26 und 27 aktiviert (vergleiche Fig. 2).

2. Kurze trp-LE-Fusion (Fig. 6)

Plasmid pINCV wurde konstruiert. Es ist in jeder Hinsicht pNCV ähnlich (vergleiche oben), außer daß der größte Teil des trp-E-Gens deletiert ist. In diesem Plasmid wurde die BglII-Spaltstelle in eine PstI-Spaltstelle umgewandelt und der Bereich zwischen dieser neuen PstI-Spaltstelle und der ursprünglichen PstI-Spaltstelle wurde deletiert. Ca. 100 ng pINCV wurden mit PstI und HindIII gespalten, dann Phenol/CHCl&sub3;-extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Ca. 3 ug von pUK33trpLEL (Fig. 6) wurden vollständig mit HindIII gespalten und teilweise mit PstI gespalten, wodurch sich ein PstI- HindIII-DNA-Fragment von 1150 bp ergab, das durch Elektrophorese auf einem 6% Polyacrylamidgel und anschließende Elektroelution gereinigt wurde. Die PstI-Spaltstelle in dem UK-Strukturgen wurde von der Spaltung ausgenommen. Das gesamte mit PstI und HindIII gespaltene pINCV wurde mit ca. 50 ng des 1150 bp-Fragments der HindIII-, teilweisen PstI-Spaltung von pUK33trpLEL gemischt und über Nacht bei 14ºC ligiert. Das Gemisch wurde dann in den E. coli-Stamm K12 294 transformiert. Durch BamHI-Spaltung wurde die korrekte Konstruktion dieses Plasmids (pUK33trpLES) bestätigt (Fig. 6). Die Expression dieses Plasmids in E. coli ergab ein Fusionsprotein, aus dem das 33.000 Urokinase-Polypeptid, wie oben beschrieben, aktiviert wird.

3. Direkte Expression von 33kD Urokinase-Polypeptid (Fig. 7 und 9)

Ein mit dem Nucleotid 16 (Fig. 1) beginnendes Urokinase-DNA-Fragment wurde in ein pBR322-Derivat cloniert, was zu einer Konstruktion führte, in der der trp-Promotor direkt vor diesem Urokinasefragment, das das Urokinase-Polypeptid mit niedrigem Molekulargewicht codiert, angeordnet ist. Das Plasmid pLelfAtrp103 (Fig. 7) ist ein Derivat des Plasmids pLeIFA25 (58), in dem die distal zu dem LeIFA-Gen gelegene EcoRI-Spaltstelle entfernt wurde (59). 10 ug pLeIfAtrp103 (Fig. 7) wurden mit 20 Einheiten EcoRI gespalten, Phenol/CHCl&sub3;-extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die cohäsiven EcoRI-Enden der Plasmid-DNA-Moleküle wurden zu glatten Enden verlängert, wobei 12 Einheiten DNA-Polymerase I in einem 50 ul-Reaktionsansatz der 60 mM NaCl, 7 mM MgCl&sub2;, 7 mM Tris HCl (pH 7,4) und 1 mM von jedem Ribonucleotidtriphosphat enthielt, verwendet wurden. Die Reaktion wurde bei 37ºC 1 Stunde lang inkubiert, mit Phenol/CHCl&sub3; extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die DNA wurde dann in 50 ul 10 mM Tris HCl (pH 8), 1 mM EDTA resuspendiert und mit 500 Einheiten bakterieller alkalischer Phosphatase 30 Minuten lang bei 65ºC behandelt, zweimal extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Nach der Spaltung mit PstI wurde das Gemisch der Elektrophorese auf einem 6% Polyacrylamidgel unterworfen und das ca. 3900 bp-Vektorfragment wurde elektroeluiert.
Das Plasmid pUK33trpLEL wurde in den E. coli-Stamm K12 GM48 (Desoxyadenosinmethylase&supmin;) transformiert, damit die aus diesem E. coli-Stamm gereinigte DNA mit der Restriktionsendonuclease BclI (60) gespalten werden konnte. 4 ug dieser DNA wurden 1 Stunde lang bei 50ºC mit 6 Einheiten BclI behandelt (in 75 mM KCl, 6 mM Tris HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT), dann wurde 50 mM NaCl eingestellt und mit 10 Einheiten PstI gespalten. 6% Gelelektrophorese wurde durchgeführt und das 914 bp-Fragment wurde elektroeluiert.
Ein DNA-Primer mit 14 Nucleotiden, der die Aminosäuresequenz Met Lys Lys Pro codiert, wurde nach der Phosphortriestermethode (47) synthetisiert und hat die folgende Sequenz:
MetLysLysPro
5' CTATGAAAAAGCCC 3'.
500 ng dieses Primers wurden mit 10 Einheiten T4-DNA-Kinase in einem 20 gl-Reaktionsansatz, der 0,5 mM ATP enthielt, phosphoryliert. Das 264 bp PstI-AccI-Fragment des cDNA-Inserts von pUK33trpLEL (gezüchtet in E. coli GM48) wurde isoliert. Ca. 500 ng dieses Fragments wurden in 10 ul entionisiertem Wasser resuspendiert, mit 20 ul des phosphorylierten Primers gemischt, 3 Minuten auf 95 C erhitzt und in einem Trockeneis-Ethanol-Bad schnell gefroren. Die Lösung der denaturierten DNA wurde auf 60 mM NaCl, 7 mM MgCl&sub2;, 7 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM bezüglich jedes Desoxyribonucleotidtriphosphats eingestellt und 12 Einheiten des langen Fragments der DNA- Polymerase I wurden zugegeben. Nach 2stündiger Inkubation bei 37ºC wurde diese Reparaturreaktion für den Primer mit Phenol/CHCl&sub3; extrahiert und mit Alkohol gefällt und vollständig mit BclI bei 50ºC gespalten. Das Reaktionsgemisch ließ man dann auf einem 6% Polyacrylamidgel laufen und ca. 50 ng des aminoterminalen 200 bp-Fragments mit glattem BclI-Ende wurden elektroeluiert. Anschließend wurden ca. 50 ng des glatten BclI-Primer-Reparaturfragments, ca. 100 ng des carboxyterminalen BclI-PstI-Fragments und ca. 100 ng des ca. 3900 bp Vektorfragments über Nacht bei 14ºC ligiert und in E. coli 294 transformiert. Die EcoRI-Spaltung einer Anzahl von Transformanten zeigte die korrekte Konstruktion und durch DNA-Sequenzanalyse wurde die angestrebte Sequenz über das Initiationscodon des neuen Plasmids pUK33trp103 (Fig. 7) hinaus bewiesen. In dieser Konstruktion folgt auf das N-terminale Methionin zweimal Lysin, wiederum gefolgt von der Aminosäuresequenz 5 bis 279, wie in Fig. 2A dargestellt. Die Expression dieses Plasmids in E. coli führte zu der Synthese von Urokinase-Polypeptid mit niedrigem Molekulargewicht. Dieses Polypeptid wurde durch ein trypsinartiges aktives Enzym aktiviert, wie oben beschrieben, das dazu dient, das N-terminale Lysinpaar abzuspalten und das zwischen Lysin an Position 26 und Isoleucin an Position 27 spaltet (Fig. 2A).
Wir fanden es erstrebenswert, ein von pUK33trp103 abgeleitetes Plasmid zu konstruieren, das Resistenz gegen Tetracyclin auf seine Wirtszelle übertragen würde. Fig. 8 stellt die folgende Konstruktion von pUK33trp103ApR&supmin; TcR. 5 ug von pHGH207-1 (siehe unten) wurden mit HpaI und PvuII gespalten. Das Vektorfragment wurde isoliert und gereinigt. 5 ug pUK33trp103 wurden mit HpaI und BamHI gespalten, der Elektrophorese auf 6% Polyacrylamid unterzogen und das 836 bp-DNA-Fragment wurde gereinigt. Ein zweiter 5 ug-Aliquot von pUK33trp103 wurde mit BamHI und PvuII gespalten, um das 119 bp-DNA-Fragment zu isolieren und zu reinigen. Gleiche molare Mengen jedes dieser drei DNA- Fragmente wurden über Nacht bei 14ºC ligiert und eingesetzt, um E. coli 294 zu transformieren. Die Analyse der Plasmid-DNA aus einigen Ampicillin-resistenten Transformanten mit Restriktionsendonucleasen bestätigte die korrekte Konstruktion von pUK33trp103ApR und die Umkehr der Orientierung der trp-Promotor/UK33-codierenden DNA.
Ca. 5 ug pBR322-DNA wurden mit EcoRI gespalten und die cohäsiven Enden wurden mit Klenow PolI aufgefüllt. Nach Spaltung mit PstI wurde das große Vektorfragment isoliert und gereinigt, das die Tetracyclin-Resistenz, den Replikationsstartpunkt und einen Teil des Ampicillin-Resistenzgens codiert. Ca. 5 ug pUK33trp103ApR wurden mit BamHI und PstI gespalten. Das DNA-Fragment, das den verbleibenden Teil des Ampicillin-Resistenzgens, den trp-Promotor und den größten Teil der Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht codiert, wurde gereinigt. Etwa gleiche molare Mengen dieser zwei DNA-Fragmente und das 119 bp BamHI-PvuII-DNA-Fragment aus pUK33trp103ApR wurden über Nacht bei 14ºC ligiert, um die Konstruktion von pUK33trp103ApRTcR zu vervollständigen. Dieses Plasmid wurde zur Konstruktion eines Plasmids verwendet, das zur Expression von Urokinase-Polypeptid mit hohem Molekulargewicht entworfen worden war (siehe Abschnitt N und Fig. 9).

N. Expression von Urokinase-Polypeptidderivaten mit hohem Molekulargewicht

1. Direkte Expression von 54kD-Urokinase-Polypeptid

Fig. 10 verdeutlicht ein Konstrukt für Urokinase-Polypeptid mit voller Länge. Plasmid pHGH207-1 mit einem einzelnen trp-Promotor wurde durch Entfernen des doppelten lac-Promotors aus pHGH 207, das einen doppelten lac- Promotor, gefolgt von einem einzelnen trp-Promotor aufweist, erhalten. Dies wurde wie folgt durchgeführt: das 310bp-DNA-Fragment mit trp-Promotor wurde aus pFIF trp 69 (20) durch Spalten mit EcoRI erhalten. Dieses Fragment wurde in pHGH 107 (44) insertiert, das mit EcoRI geöffnet worden war. Auf diese Weise wurde ein Plasmid erhalten (pHGH 207), das einen doppelten lac-Promotor, gefolgt von dem trp-Promotor, flankiert von EcoRI-Spaltstellen aufweist. Das so erhaltene pHGH 207 wurde mit BamHI gespalten; dies wurde teilweise mit EcoRI gespalten und das größte Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment war daher der vollständige trp-Promotor. Aus pBR322 wurde das größte EcoRI-BamHI-Fragment isoliert. Beide Fragmente wurden ligiert und das Gemisch wurde verwendet, um E. coli 294 zu transformieren. Tetr-, Ampr-Kolonien wurden isoliert und die meisten von ihnen enthielten das Plasmid mit der Struktur, wie sie für pHGH207-1 gezeigt wurde. Plasmid pHGH207-1 ist somit ein Derivat des Plasmids pHGH107 (44) und hat die folgenden Eigenschaften: 1) das Gen des menschlichen Wachstumshormons ist vom Tryptophan-Promotor anstelle des lac-Promotors, wie bei pHGH107 flankiert, 2) das Plasmid überträgt die Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz, wenn es in E. coli exprimiert wird. (Siehe auch 47A).
20 ug pHGH207-1 wurden mit EcoRI teilweise gespalten und mit BglII vollständig gespalten. Die Reinigung des großen Vektorfragments wurde durch Elektrophorese auf 5% Polyacrylamidgel, Elektroelution, Extraktion mit Phenol/CHCl&sub3; und Ausfällen mit Ethanol erreicht. 14 ug pF1 wurden mit BglII und TaqI gespalten und das 236 bp-DNA-Fragment wurde isoliert und über 6% Polyacrylamidgel gereinigt. Die folgenden komplementären DNA-Fragmente wurden nach der Phosphortriestermethode (47) synthetisiert:
MetSerAsnGluLeuHi sGlnValPro
5' AATTATGAGCAATGAATTACATCAAGTTCCAT
TACTCGTTACTTAATGTAGTTCAAGGTAGC 5'
Wie angegeben, codiert die Aminosäuresequenz Met Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro das Startcodon ATG und die acht aminoterminalen Aminosäuren der Urokinase mit hohem Molekulargewicht. 50 ng von jedem synthetischen DNA- Fragment wurden phosphoryliert und die Fragmente wurden gemischt, 1 Minuten lang auf 65 C erwärmt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen gelassen. 10 ng der phosphorylierten und gemischten synthetischen DNA-Fragmente wurden mit ca. 200 ng des pHGH207-1-Vektorfragments der teilweisen EcoRI-, BglII-Spaltung und ca. 50 ng des 236 bp BglII-TaqI-DNA-Fragments zusammengegeben, über Nacht bei 14ºC ligiert und in E. coli 294 transformiert. Die einzelnen Plasmid-DNAs aus 24 ampicillinrestistenten Kolonien wurden mit EcoRI und BglII gespalten und 1 Plasmid (pInt1), das die korrekte Konstruktion aufwies, wurde für die DNA-Sequenzanalyse ausgewählt. Diese Analyse bestätigte die korrekte DNA-Sequenz nach dem ATG-Startcodon und des aminoterminalen Bereichs der Urokinase mit hohem Molekulargewicht.
4 ug pNCV (Abschnitt M) wurden mit BglII und Clal gespalten und das große Vektorfragment wurde isoliert und über ein 5% Polyacrylamidgel gereinigt. 30 Ug pF1 wurden mit PstI und BglII gespalten und der Elektrophorese durch ein 6% Polyacrylamidgel unterworfen. Das 44 bp-DNA-Fragment wurde elektroeluiert, mit Phenol/CHCl&sub3; extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. 4 ug pA3-DNA wurden mit PstI und TaqI gespalten und das 192 bp DNA-Fragment wurde über ein 6% Polyacrylamidgel gereinigt. Ca. 100 ng des BglII-ClaI-Vektor- DNA-Fragments, ca. 50 ng des 192 bp-Fragments und ca. 50 ng des 44 bp-Fragments wurden zusammengegeben und über Nacht bei 14ºC ligiert und anschließend in E. coli 294 transformiert. Doppelspaltung mit BglII und ClaI der Plasmid-DNA von einigen tetracyclinresistenten Transformanten bewies die korrekte Konstruktion dieses neuen Plasmids mit der Bezeichnung pInt2.
5 ug des in E. coli GM48 (ATCC Nr. 39099, 9. April 1982) gezüchteten pUK33trp103ApRTcR wurden mit BclI und SalI gespalten, um das 1366 bp-DNA- Fragment zu isolieren und zu reinigen. Das 108 bp EcoRI-BclI-DNA-Fragment wurde aus demselben Plasmid isoliert. Ungefähr gleiche molare Mengen des EcoRI-SalI-DNA-Fragments aus pUK33trp103ApRTcR und des EcoRI-BclI-DNA-Fragments auch aus pUK33trp103ApRTcR wurden über Nacht bei 14ºC ligiert, um pInt3 zu ergeben.
5 ug pInt3-DNA wurden mit BglII und SalI gespalten, der Elektrophorese durch 6% Polyacrylamid unterworfen und das 1701 bp-Fragment, das den carboxyterminalen Bereich der Urokinase mit voller Länge und den aminoterminalen Bereich des Tetracyclin-Resistenzgens enthielt, wurde gereinigt. Ca. 5 ug der p-"Intermediate"-1-DNA wurden mit BglII und SalI gespalten, der Elektrophorese durch 6% Polyacrylamid unterworfen und das große Vektorfragment, das den carboxyterminalen Bereich des Tetracyclin-Resistenzgens, den Replikations-Startpunkt, das Ampicillin-Resistenzgen, den trp-Promotor, das Startcodon ATG und den aminoterminalen Bereich der Urokinase voller Länge enthielt, wurde gereinigt. Ca. 100 ng des Vektorfragments und ca. 100 ng des 1701 bp-Fragments wurden zusammengegeben, über Nacht bei 14ºC ligiert und in E. coli 294 transformiert. Ein Plasmid aus einer tetracyclinresistenten und ampicillinresistenten Kolonie, das das für die Restriktionsendonuclease PvuII korrekte Muster aufwies, wurde identifiziert, und die Konstruktion wurde hinsichtlich der Urokinase mit voller Länge stromabwärts vom trp-Promotor bestätigt. Dies ist Plasmid pUK54trp207-1. Durch Expression dieses Plasmids in E. coli 294 wird Urokinase-Polypeptid in voller Länge produziert.

2. Direkte Expression von 54 kD Pre-UK in E. coli (Fig. 10)

Das folgende Schema wurde zur Konstruktion eines Plasmids für die direkte Expression von preUK54 verwendet. Zwei komplementäre DNA-Fragmente wurden nach der Phosphortriestermethode (47) synthetisiert, die das Startcodon der Aminosäuresequenz, gefolgt von den ersten drei N-terminalen Aminosäuren der Urokinase-Präsequenz Arg Ala Leu codieren, wie unten gezeigt
EcoRI MetArgAlaLeu BglI
5' AATTATGCGTGCCCTGC
TACGCACGGG5'
Spaltstellen der Restriktionsendonucleasen EcoRI und BglI flankieren diesen Bereich der Präsequenz. 50 ng jedes synthetischen DNA-Fragments wurden phosphoryliert. Die phosphorylierten Fragmente wurden gemischt, 1 Minute auf 65ºC erwärmt und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. 5 ug der pF1-DNA wurden mit BglI und BglII gespalten und das 310 bp-UK-DNA-Fragment wurde isoliert und gereinigt. Ca. 50 ng des 310 bp-UK-DNA-Fragments, ca. 150 ng des Vektor-DNA-Fragments der teilweisen EcoRI-, BglII-Spaltung aus pHGH207-1 (siehe Abschnitt N) und 10 ng der phosphorylierten und gemischten synthetischen DNA-Fragmente wurden über Nacht bei 14ºC ligiert und in E. coli 294 transformiert. Einzelne aus mehreren ampicillinrestistenten Transformanten isolierte Plasmid-DNAs wurden analysiert, um die korrekte Konstruktion und die Nucleotidsequenz der Präsequenz der Urokinase mit hohem Molekulargewicht zu bestätigen.
Ein korrektes Plasmid wurde mit pInt4 bezeichnet. 5 ug von pInt4-DNA wurde mit BglII und EcoRV gespalten, um das Vektor-DNA-Fragment zu isolieren und zu reinigen, das die N-terminalen Nucleotide von pre-UK54, den trp-Promotor, die Ampicillin-Resistenzgene, den Replikations-Startpunkt und einen Teil der die Tetracyclinresistenz codierenden DNA enthält. 5 ug pUK54trp207- 1-DNA wurden mit BglII und EcoRV gespalten. Das BglII-EcoRV-DNA-Fragment, das den Rest von UK54 und die Tetracyclinrestistenz codierende DNA codierte, wurde isoliert, gereinigt und mit dem BGlII-EcoRV-Vektor-DNA-Fragment ligiert, um die Konstruktion des Plasmids p-preUK54trp207-1 zu vervollständigen.

P. Isolierung und Charakterisierung

Aus E. coli wurde ein Urokinasepolypeptid-haltiger Rückstand isoliert. Der Rückstand wurde in 5M Guanidin-HCl, das 50 mM Tris, pH 8,0, enthielt, aufgelöst. Die Lösung wurde auf 1M Guanidin-HCl, 50 mM Tris HCl, pH 9, verdünnt, bei einer Proteinkonzentration von 1 ng/ml. Die Lösung wurde dann auf 2 mM reduziertes Glutathion (GSH), 0,2 mM oxidiertes Glutathion (GSSG) eingestellt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die resultierende Lösung, die wiedergefaltetes Polypeptid enthielt, wurde dann gegen wäßriges Medium dialysiert. Die resultierende Lösung enthielt Urokinase-Polypeptid, das eine Aktivität von 100 PU/mg aufwies.
Nach der Reinigung mit herkömmlichen Techniken wurde das Polypeptid charakterisiert, wobei es die erwartete N-terminale Sequenz für beide Ketten des bioaktiven Materials mit niedrigem Molekulargewicht zeigte. Die C-terminale Analyse zeigte ebenfalls die korrekte Sequenz für beide Ketten. Das Protein wandert bei einem Molekulargewicht von ca. 30.000 Dalton. Es hat eine spezifische Aktivität von ca. 170.000 PU/mg 9.225.000 IU/mg) unter der Annahme, daß 1 mg/ml eine OD&sub2;&sub8;&sub0; von 1,3 hat.

Q. Assays zur Detektion der Expression von Urokinase-Polypeptid

1. Chromogenes Substrat

a. Theorie

Der Assay basiert auf der proteolytischen Abspaltung eines Tripeptids von einer chromophoren Gruppe. Die Geschwindigkeit der Spaltung kann in direkte Beziehung mit der Spezifität und der Konzentration der untersuchten Protease gesetzt werden. Urokinase spaltet das chromogene Substrat S2444 (gekauft von Kabi Group Inc., Greenwich, CT). Indem man die Bildung des Chromophors verfolgt, kann man die in der Probe vorhandene Menge an funktionellem Urokinase-Polypeptid bestimmen. Urokinase wird in Form einer inaktiven Vorläufer-Form synthetisiert und die Aktivierung findet durch Spaltung zwischen dem Rest 26 (Lysin) und 27 (Isoleucin) statt (die Numerierung basiert auf dem Proteaseclon, Fig. 2A). Bei einigen Urokinase-Polypeptidpräparaten wurde gefunden, daß sie sich autoaktiviert hatten und/oder von E. coli-Proteasen aktiviert worden waren. Um die Aktivierung des Urokinase-Polypeptids, das die Detektion nach dieser chromogenen Methode erlaubt, sicherzustellen, ist die Behandlung der Probe mit geringen Mengen an Trypsin erforderlich. Trypsin ist eine Protease, die die Lysin-Isoleucin-Bindung spalten kann, die für die Aktivierung von Urokinase nötig ist. Trypsin kann jedoch auch das chromogene Substrat spalten und muß daher vor dem Assay eliminiert werden. Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (STI) ist ein Protein, das Trypsin inaktiviert, während es keine Wirkung auf Urokinase hat. Demzufolge besteht der Assay aus der Trypsinaktivierung des Urokinase-Polypeptids, der STI-Inhibierung des Trypsins und schließlich der Zugabe des chromogenen Substrats, um das vorhandene funktionelle Urokinase-Polypeptid zu messen.

b. Verfahren

Der Assay wird wie folgt durchgeführt: 0,2 ml 0,1M Tris, pH 8,0, 50 ul der Probe für den Assay und 5 ul Trypsin (0,1 mg/ml in 0,1M Tris, pH 8,0 plus 0,25M CaCl&sub2;) wurden in ein Reagensglas gegeben und die Probe wurde 10 Minuten bei 37ºC inkubiert. Trypsin wurde durch Zugabe von 2 ul 10 mg/ml STI (in 0,1M Tris, pH 8,0) inaktiviert. Die Urokinaseaktivität wurde durch Zugabe von 50 ul einer 1 mM-Lösung von S2444 (in Wasser) und 10minütiges Inkubieren des Reaktionsansatzes bei 37ºC bestimmt. Essigsäure (50 ul) wurde zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Lösung wurde zentrifugiert, um einen Niederschlag zu entfernen, und die Absorption bei 405 nm wurde bestimmt. Die tatsächliche Menge an Urokinase-Polypeptid kann berechnet werden, indem man eine Probe mit dem abgelesenen Wert vergleicht, den man beim Durchführen des Assays mit Verdünnungen einer Standardlösung einer bekannten Urokinasemenge (erhalten von Calbiochem, San Diego, CA) vergleicht.

2. Direkter Assay der Plasminbildung

a. Theorie

Ein wesentlich empfindlicherer Assay für Urokinase kann erhalten werden, indem man die von Urokinase katalysierte Umwandlung von Plasminogen in Plasmin verfolgt. Plasmin ist ein Enzym, für das es Assays mit chromogenen Substraten gibt, die auf denselben Prinzipien basieren wie oben in 1. beschrieben. Die Grundlage des Assays ist die Bestimmung der Plasminmenge, die im Anschluß an die Inkubation der urokinasehaltigen Lösung mit einer Plasminogenlösung gebildet wird. Je größer die Menge an Urokinase, desto größer ist die Menge an gebildetem Plasmin.

b. Verfahren

Ein Aliquot der Probe wird mit 0,10 ml 0,7 mg/ml Plasminogen (in 0,5M Tris-HCl, pH 7,4, das 0,012M NaCl enthält) gemischt und das Volumen wird auf 0,15 ml eingestellt. Das Gemisch wird für unterschiedliche Zeiträume (wie angegeben) bei 37ºC inkubiert, 0,35 ml S2251 (1,0 mM Lösung im obigen Puffer) werden zugegeben und die Reaktion wird 5 Minuten bei 37ºC fortgesetzt. Essigsäure (25 ul) wird zugegeben, um die Reaktion zu beenden und die Absorption bei 405 nm wird gemessen. Eine Quantifizierung des Aktivitätswerts erhält man durch Vergleich mit Verdünnungen einer Urokinase- Standardlösung.

3. Indirekter Assay der Plasminbildung

a. Theorie

Ein empfindlicher Test auf Urokinaseaktivität ist entwickelt worden (61). Der Assay beruht auf der Bestimmung der Plasminbildung, indem man das Ausmaß der Zersetzung von Fibrin durch Plasmin in einer Agarplatte, die Fibrin und Plasminogen enthält, mißt. Plasmin erzeugt eine klare Lysezone in der Fibrinplatte. Die Fläche dieser Lysezone läßt sich mit der Menge an Urokinase in der Probe korrelieren.

b. Verfahren

Gemäß dem Verfahren von Granelli-Piperno und Reich (61) wurden die Platten 1 bis 3 Stunden bei 37ºC inkubiert und die Lysezonen wurden gemessen. Die Quantifizierung wurde erreicht, indem man den Assay mit Verdünnungen einer Urokinase-Standardlösung durchführte.

R. Detektion der Urokinaseaktivität

1. Züchtung der Bakterien und Herstellung einer Urokinase-Polypeptidprobe

Ein E. coli-Stamm (W3110) wurde unter Verwendung eines Plasmids (pUK33trpLEs), das ein Urokinase-Fusionsprotein enthielt, transformiert. Dieses Expressionsvehikel (kurze trpLE-Fusion) wurde oben beschrieben. Die Zellen wurden auf Minimalmedien über Nacht bis zu einer O.D. von 1,2 bei 550 nm gezüchtet. Weitere 200 ml der Medien wurden zugegeben. Indolacrylsäure, eine Verbindung die die Expression der Tryptophanoperon-kontrollierten Gene zu verstärken scheint, wurde bis zur Konzentration 10 ug/ml zugegeben. Die Zellen wurden 2 Stunden inkubiert und geerntet. Die aus 400 ml an Medien erhaltenen Zellen wurden in Wasser suspendiert und Guanidin wurde bis zu einer Konzentration von 7M zugegeben (Endvolumen 40 ml). Die Lösung wurde 90 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugieren entfernt. Der Überstand wurde gegen 0,01M Tris-HCl, pH 7,5, das 0,1M NaCl enthielt, 4 Stunden lang dialysiert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugieren entfernt und die Probe wurde 2,5 Stunden lang gegen 0,01M Tris-HCl, pH 7,5, dialysiert.
Die Probe wurde auf eine 3,9·9 cm DE-52-Säule aufgegeben, die mit 0,01M Tris-HCl, pH 7,5, equilibriert worden war, und die Säule wurde mit demselben Puffer gewaschen und mit 0,01M Tris-HCl, pH 7,5, das 0,15M NaCl enthielt, eluiert. Der Aktivitätsspitzenwert (peak) wurde gesammelt und für alle weiteren Studien verwendet.

2. Detektion der Aktivität

Fig. 11 zeigt die Ergebnisse der direkten Aktivierung von Plasminogen durch fraktionierte E. coli-Extrakte, wenn diese unter ähnlichen Bedingungen, wie die oben und in Abschnitt Q.2. beschriebenen, einem Assay unterworfen werden. Es entsteht eine Aktivität, die von der Anwesenheit von Plasminogen abhängt. Darum ist die aufgezeichnete Aktivität eine Plasminoden-abhängige Aktivität. Die gemessene Aktivität steigt auch im Laufe der seit an, ein Hinweis auf eine zeitabhängige katalytische Bildung von Plasmin. Diese Eigenschaften sind mit denen von Urokinase konsistent, d. h. eine katalytische Aktivierung von Plasminogen. Wenn gleiche Extraktionsbedingungen auf L. coli angewendet werden, die kein Urokinase-Plasmid enthalten, wird unter diesen Bedingungen Plasminogen nicht aktiviert.
Die Extrakte wurden auch in den Assays, wie oben beschrieben, getestet, um die Urokinaseaktivität zu detektieren und zu quantifizieren. Fig. 12 zeigt die Wirkung verschiedener Mengen an Fraktionen aus Bakterien in dem in Abschnitt Q.2. beschriebenen Assay mit einer 10minütigen Aktivierung. Die erhaltenen Werte werden mit denen verglichen, die bei Verwendung einer Urokinase-Standardlösung erhalten wurden (Plough Unitage-Bestimmung). Das Ausmaß der Plasminogenaktivierung ist direkt proportional zur Menge an zugegebener clonierter Urokinase. Von Antikörpern, die gegen gereinigte natürliche Urokinase gebildet wurden, ist bekannt, daß sie die Aktivität der natürlichen Urokinase senken. Die Wirkung dieser Antikörper bei Zugabe zu diesem Assay zum Zeitpunkt Null ist in Fig. 12 ebenfalls gezeigt. Eine deutliche Inhibierung des aus E. coli erhaltenen Materials wird beobachtet. Dies belegt, daß die bei dem aus L. coli erhaltenen Material beobachtete Aktivität dieselben antigenen Bereiche aufweist wie natürliche Urokinase und daß es darum tatsächlich mikrobiell synthetisiertes Urokinase-Polypeptid ist.
Ähnliche Resultate bei der Detektion der Aktivität und bei der Inhibierung durch Antikörper werden bei Verwendung des Fibrinplattenassays (beschrieben in Abschnitt Q.3.) beobachtet. Diese Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt. Tabelle I FIBRINPLATTENASSAY FOR UROKINASE Probe Aktivität (Plough-Einheiten/ml)¹ Aktivität in Gegenwart von Urokinase- Antikörpern (Plough-Einheiten/ml)¹ Prozent Inhibierung Urokinase-Standard Erfindungsgemäß hergestelltes Urokinase-Polypeptid ¹ Durch Zugabe einer bekannten Menge an Urokinase-Standard in die Vertiefungen erhaltene Standardkurve. Werte erhalten für die E. coli-Fraktionen und die Inhibierung durch Antikörper wurden durch Extrapolierung von dieser Standardkurverhalten.
Die Aktivität der Standard-Urokinase wurde um 96% oder mehr durch die Zugabe von Urokinase-Antikörpern, die gegen dieses Protein gebildet worden waren, inhibiert. Der Assay der Extrakte aus E. coli wies eine signifikante Urokinaseaktivität auf. Diese Aktivität wurde fast vollständig inhibiert, wenn Antikörper gegen natürliche Urokinase zu dem Assay gegeben wurden.
Mit dem dritten Assay (Assay mit einem chromogenen Substrat) wurde ebenfalls eine urokinaseartige Aktivität in den E. coli-Extrakten detekviert. Da er der am wenigsten empfindliche von den Assays ist, konnten aufkund der großen Mengen an Antikörper, die erforderlich sind, um eine Inhibierung zu sehen, keine Antikörper-Inhibierungsuntersuchungen durchgeführt werden.
Die obigen drei Assays wurden durch Verwendung der Standard-Urokinase, erworben von Calbiochem, quantifiziert. Die erhaltenen Werte (Plough Units pro ml) waren alle von derselben Größenordnung: 500 bei der Fibrinplatte; 100 bei der Plasminogenaktivierung und 350 bei dem chromogenen Substrat (S2444). Auftretende Variationen gehen zweifellos auf den relativ verunreinigten Zustand des Materials zum Zeitpunkt der Tests zurück.

Pharmazeutische Präparate

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach bekannten Methoden formuliert werden, um pharmazeutisch nützliche Präparate herzustellen, wobei das erfindungsgemäße Humanurokinase-Polypeptidprodukt unter Zumischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägervehikel kombiniert wird. Geeignete Vehikel und ihre Formulierung sind beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences von E.W. Martin beschrieben. Solche Präparate enthalten eine wirksame Menge des erfindungsgemäßen Polypeptids zusammen mit einer geeigneten Menge an Vehikel bzw. Träger, um pharmazeutisch annehmbare Präparate herzustellen, die geeignet sind, sie dem Wirt wirksam zu verabreichen.

A. Parenterale Verabreichung

Das erfindungsgemäße Humanurokinase-Polypeptid kann Personen, die an thromboembolischen Krankheiten oder Zuständen leiden, parenteral verabreicht werden. Die Dosierung und die Dosisrate können denen entsprechen, die gegenwärtig bei klinischen Anwendungen anderer cardiovaskulärer thrombolytischer Mittel verwendet werden, z. B. etwa 4400 IU/kg Körpergewicht als intravenöse Anfangsdosis, gefolgt von einer kontinuierlichen intravenösen Infusion mit etwa 4400 IU/kg/h während 12 Stunden bei Patienten, die an einer Lungenembolie leiden.
Als ein Beispiel einer geeigneten Dosierungsform für im wesentlichen homogenes Humanurokinase-Polypeptid in parenteraler Form, die hier anwendbar ist, kann eine Ampulle, die 250.000 IU Urokinaseaktivität, 25 mg Mannit und 45 mg Natriumchlorid, enthält, mit 5 ml sterilem Wasser zur Injektion rekonstituiert werden und mit einem geeigneten Volumen an 0,9%iger Natriumchlorid-Injektionslösung oder 5%iger Dextrose-Injektionslösung für die intravenöse Verabreichung gemischt werden.
Das erfindungsgemäße Humanurokinase-Polypeptid wurde durch bestimmte DNA-Gene und Sequenzierung der davon abgeleiteten Aminosäuresequenz definiert. Selbstverständlich existieren natürliche allele Variationen und treten von Individuum zu Individuum auf. Diese Variationen können sich als ein oder mehrere Aminosäureunterschied(e) in der Gesamtsequenz oder durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen von einer oder mehreren Aminosäure(n) in dieser Sequenz zeigen. Zusätzlich beinhaltet die Verwendung der DNA-Rekombinationstechnik das Potential zur Herstellung verschiedener Humanurokinase-Polypeptidderivate, die durch resultierende Einzel- oder Mehrfach-Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen, -Additionen oder -Ersatz, beispielsweise mit Hilfe der ortsgerichteten Mutagenese der zugrundeliegenden DNA. Alle diese Modifikationen und allelen Variationen, die zu Derivaten des Humanurokinase-Polypeptids führen, sind in den Bereich dieser Erfindung eingeschlossen, solange die wesentliche charakteristische Humanurokinaseaktivität in ihrer Art unberührt bleibt.
Trotzdem auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen Bezug genommen wurde, ist es weiterhin selbstverständlich, daß die vorliegende Erfindung nicht als auf diese beschränkt sondern gemäß dem gesetzlichen Geltungsbereich der beigefügten Ansprüche ausgelegt werden darf.
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61. Granelli-Piperino und Reich, J. Ex . Med. 148, 223.

Claims

1. Unglykosyliertes Polypeptid mit einer intakten Lysin- Isoleucin-Bindung an der Position, die den Aminosäuren 158- 159 im nativen Prourokinase-Molekül entspricht, und das genügend von der in den Fig. 4A und 4B dargestellten Amino- Säuresequenz aufweist, so daß, bei Aktivierung, das aktivierte Polypeptid die enzymatische Aktivität von Humanurokinase zeigt.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es unglykosyliertes Met-Prourokinase- Protein ist.

3. Polypeptid nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, daß es unglykosyliertes Prourokinase-Protein ist.

4. Polypeptid nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die Sequenz Lys- Ile-Ile-Gly-Gly an den Positionen, die den Aminosäuren 158-162 im nativen Prourokinase-Molekül entsprechen, aufweist.

5. Polypeptid nach einem der vorstehenden Ansprüche mit der Aminosäuresequenz oder im wesentlichen der Aminosäurese- Iuenz, wie in den Fig. 4A und 4B dargestellt.

6. Isolierte DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid nach einem der vorstehenden Ansprüche codiert.

7. DNA-Sequenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer DNA-Sequenz, die in der Lage ist, deren Expression zu bewirken, funktionsfähig verknüpft ist.

8. Replizierbares Expressionsvehikel, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Lage ist, in einem transformanten Mikroorganismus eine DNA-Sequenz nach Anspruch 6 oder 7 zu exprimieren.

9. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er mit einem Vehikel nach Anspruch 8 transformiert ist.

10. Mikroorganismus nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß er ein transformierter Stamm von E. coli ist.

11. Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

12. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung bei einem Behandlungsverfahren des menschlichen oder tierischen Körpers für die Behandlung von Gefäßerkrankungen.

13. Verfahren zur Herstellung eines in einem der Ansprüche 1 bis 5 definierten Polypeptids, gekennzeichnet durch die Expression einer DNA-Sequenz nach Anspruch 6 oder 7, um das unglykosylierte Polypeptid zu erhalten, das, bei Aktivierung, die enzymatische Aktivität von Humanurokinase zeigt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das resultierende aktivierbare Polypeptid durch proteolytische Spaltung in ein enzymatisch aktives Polypeptid umgewandelt wird.