JP2730923B2 - Ｂａｒ１分泌シグナル - Google Patents

Ｂａｒ１分泌シグナル

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、一般に、蛋白質の発現に関し、さらに詳し
くは、酵母および哺乳動物細胞中の蛋白質の発現におけ
る特定の分泌シグナルの使用に関する。
〔従来の技術〕
最近において、遺伝子工学の技術における進歩は、よ
り高等生物体に由来し、そして特定の蛋白質をコードす
るDNA配列が酵母細胞中で発現できることを示した。組
み換えDNA技術は、また、特定の蛋白質を細胞壁を通し
て培地中に分泌せしめることを可能にする分泌シグナル
の発見および利用に導いた。
酵母中での真核生物（例えば、哺乳動物）の遺伝子生
成物の生産は、哺乳類動物またはバクテリアの細胞の培
養を用いる生産に卓越する利点を有する。異種蛋白質の
生産のための宿主としてバクテリアを使用することにお
ける主な欠点の１つは、生成物を製剤として使用できる
前に、エンドキシン生成物を完全に除去しなくてはなら
ないということである。バクテリア中で生産された異種
蛋白質は、低い溶解性をもち、この問題は、克服されな
ければ、製剤としてのそれらの使用をきぼしく制限す
る。さらに、商業的レベルで蛋白質生成物を発現するた
めの哺乳動物細胞の使用はひじょうに経費を必要とす
る。
対照的に、酵母の商業的規模の発酵は、よく確立され
ており、異種蛋白質生成物の大量の生産を可能とする。
酵母は、バクテリアよりも哺乳動物細胞との類似性を有
する真核生物体である。酵母生成蛋白質は、また、細胞
によって培地中に分泌されることができ、ここで量の汚
染蛋白質の量が減少していることは生成物の精製を促進
する。分泌は、また、ある種の蛋白質の適当なフォルデ
ィング（folding）および／または生物学的活性のため
に要求されうる、グリコシル化およびジサルファイド結
合の形成を可能としうる。酵母および哺乳動物細胞の分
泌系は類似する。両者の細胞のタイプは、分泌オルガネ
ラ、例えば、小胞体（endoplasmic reticulum）、ゴル
ジ装置、および細胞表面への小包移送（vesicle transi
t）系を有する。さらに、生産される蛋白質上に見いだ
される分泌シグナルのペプチドは２つの細胞タイプにお
いて非常に類似し（Watson,Nucleic Acids Reseach1
2:5154,1984）、重要な面は疎水性アミノ酸のコアであ
る。これらのシグナルペプチドは、新しく合成されたシ
グナル蛋白質を小包胞体膜へ供給しそしてそれらをそれ
らのルーメン中に挿入する１組の蛋白質によって認識さ
れる。分泌ペプチドは、酵母および哺乳動物細胞の両者
において、シグナルプロテアーゼによって分泌蛋白質か
ら実質的に除去される。真核生物分泌通路については、
Kelly,Science 230:1985参照。
酵母からの異種蛋白質の分泌は、自然酵母分泌ペプチ
ドの使用によって達成されて来た。酵母から分泌される
ことが知られているポリペプチドは、ペプチドを分泌経
路に入らせる疎水性アミノ末端部分を含有する。疎水性
領域は「シグナルペプチド」として知られている。シグ
ナルペプチドは、一般に、他の配列との組み合わせにお
いて、成熟ポリペプチドまたは蛋白質の分泌を制御す
る。これらの配列は、典型的には、分泌の間に成熟ポリ
ペプチドから切り放され、そして集合的に分泌ペプチド
を構成する。α−因子分泌ペプチド（pre-pro配列）（K
urjanおよびHerskowitz,Cell30:933-943,1982）は、種
々の研究者らによって、酵母から異種蛋白質を分泌する
ために使用されてきている（Brake,欧州特許116,201
号、1983;Biiter,欧州特許123,294号,1984;Singh,欧州
特許123,544号;Oshimら，欧州特許171,000,1985）。Bra
ke（欧州特許116,201号,1983）は、MFα１プロモーター
および分泌ペプチドを利用して、ヒト表皮成長因子を分
泌せしめた。Bitter（前掲）は、MFα１プロモーターお
よび分泌ペプチドを利用して、ヒト〔Leu5〕β−エンド
ルフィンを分泌せしめた。Singn（前掲）は、２つの遺
伝子MFα１およびMFα２をクローニングし、それらの蛋
白質はMATa細胞中におけるG1の阻止を誘発できる。Sing
hによってクローニングされたMFα１遺伝子は、Kurjan
およびHerskowitz（前掲）が記載するMFα１遺伝子に相
当することが示された。MFα２遺伝子は、MFα１遺伝子
に本来類似するが、同一でないことが示された。Singh
はMFα１プロモーターおよび分泌ペプチドを使用して、
種々の異種蛋白質を分泌せしめた。これらは、有意な量
で分泌される蛋白質、例えば、ヒトインターフェロン
Ｄ、ヒト血清アルブミン、ウシインターフェロンα１、
ウシインターフェロンα２、組織プラスミノゲンアクチ
ベーター（ｔ−PA）およびヒトインスリン様成長因子；
および微量で分泌されるタンパク質、例えば、レンニン
およびヒトインターフェロンγを包含する。Ohsimaら
（前掲）は、MFα１プロモーターおよび分泌ペプチドを
使用して、α−ネオエンドルフィンおよびインターロイ
キン２を分泌せしめることを報告した。それらは、他の
蛋白質およびペプチド、例えば、インスリン、ソマトス
タチン、成長ホルモン、成長ホルモン刺激因子、利尿ホ
ルモン、インターフェロン、腫瘍壊死因子およびリンフ
ォトキシンの分泌におけるMFα１の利用を示唆してい
る。
Lemonttら（W086/00638）は、PH05分泌ペプチドを使
用して、酵母から異種蛋白質を分泌せしめた。Brake
（欧州特許123,289、1984）は、α−因子分泌ペプチド
を使用して異種蛋白質を分泌せしめることを報告した。
S.セレビシアエ（S.cervisiae）（以後、S.セレビシ
エー）BAR1遺伝子は、メイティング（mating）タイプａ
細胞から分泌される「バリヤー」（Barrier）として知
られている蛋白質をコードする。このバリヤー蛋白質
は、細胞がα−因子の阻害作用を克服できるようにす
る。BAR1の分泌経路は、α−因子の分泌経路とは異る経
路を代表する。
米国特許第4,613,572号（Mackayら、1986）は、BAR1
遺伝子を使用して、異種蛋白質を分泌することができる
ことを開示しているが、これに関して有用であるであろ
う遺伝子の特定の領域を同定していない。
W087/02670（Mackay）は、BAR1シグナルペプチドコー
ド領域を使用して、形質転換された酵母細胞からの異種
遺伝子生成物の低いレベルの分泌を指令することを開示
している。Mackay（前掲）が記載するBAR1分泌系は、α
−因子分泌ペプチドより低い効率の分泌シグナルを提供
することがわかった。
酵母からの組織プラスミノゲンアクチベーターの分泌
の研究は、α−因子分泌ペプチドがｔ−PAまたはウロキ
ナーゼを培地中に効率よく移送しないことを示してい
る。これは、また、他の異種蛋白質について真実である
事を証明される。
〔発明が解決しようとする課題〕
結局、この分野において、異種蛋白質を酵母からより
効率よい方法で分泌させる他の分泌ペプチドを同定する
ことが要求されている。本発明は、この要求を満足し、
そして、さらに、他の関連する利点を提供する。
〔課題を解決するための手段〕
要約すれば、本発明は、DNA造成物を開示し、この造
成物は、シグナルペプチドをコードするDNA配列と、こ
れに続くリーティングフレーム内にBAR1遺伝子生成物の
部分であって少なくともＣ−末端ドメインの一部分を含
むもの及び異種蛋白質又はポリペプチドをコードする第
二のDNA配列に作用可能に連結された転写プロモーター
を含んで成る。好ましいシグナルペプチドはバリヤーシ
グナルペプチドである。１つの態様において、第二のDN
A配列は、異種蛋白質又はポリペプチドをコードするセ
グメント、及びその下流に続く、BAR1遺伝子生成物のＣ
−末端ドメインの少なくとも一部をコードするセグメン
トを含んで成ることができる。あるいは、第二のDNA配
列は、BAR1遺伝子生成物のＣ−末端ドメインの少なくと
も一部をコードするセグメント、および引き続く下流
に、異種蛋白質またはポリペプチドをエンコードするセ
グメントを含んで成ることができる。
本発明の１つの面において、前記Ｃ−末端ドメインの
部分は、番号391のセリンから始まりそして番号526のセ
リンで終わる第１図のアミノ酸配列を含んでる。本発明
の関連する面の範囲内で、前記Ｃ−末端ドメインの部分
は、番号423のアラニンから始まりそして番号526のセリ
ンで終わる第１図のアミノ酸配列を含んで成る。
他の面において、第二のDNA配列は、さらに、異種蛋
白質またはポリペプチドをコードするセグメントに隣接
して位置する切断部位をコードするセグメントを含んで
成る。好ましい態様に範囲内で、前記切断部位は２塩基
部位またはトロンビン切断部位である。
本発明のなお他の面において、第二のDNA配列は突然
変異誘発され、BAR1遺伝子生成物のアミノ酸468および5
03の一方または双方における炭水化物の付加を防止す
る。好ましくは、第二のDNA配列は位置468および／また
は位置503におけるグルタミンをコードする。
本発明は、種々の蛋白質、例えば、ウロキナーゼ、イ
ンスリン、血小板誘導因子およびその類似体を発現する
ために使用できる。好ましい態様の範囲内で、転写プロ
モーターはトリオースホスフェートイソメラーゼ（TP
I）酵素またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）酵素
をコードする遺伝子のそれである。このようなDNA造成
物で形質転換された酵母細胞および哺乳動物細胞もまた
開示される。
本発明の他の面において、問題の蛋白質を製造する方
法を開示する。この方法は、一般に、（ａ）シグナルペ
プチドをコードするDNA配列に作用可能に結合された転
写プロモーター並びに引き続いてリーディングフレーム
内に、異種蛋白質又はポリペプチドおよびBAR1遺伝子生
成物のＣ−末端ドメインの少なくとも部分をコードする
第二のDNA配列を含んで成る造成物を含有する宿主細胞
を、適当な培地中で増殖せしめ、そして（ｂ）該宿主細
胞から蛋白質またはポリペプチドを単離することを含ん
でなる。好ましい宿主細胞は、酵母細胞および哺乳動物
細胞を包含する。この方法は、また、分離工程後、蛋白
質生成物を精製することを包含できる。
本発明のこれらの目的および他の面は、以下の詳細な
説明および添付図面を参照とすることにより明らかにな
るであろう。
〔具体的な説明〕
前述のように、本発明は、宿主細胞中で生産される異
種蛋白質の分泌を指令するシグナルペプチドをコードす
る配列（シグナル配列）と関連して、S.セレビシエーBA
R1遺伝子生成物のＣ−末端領域［第３ドメイン（domai
n）］の一部をコードする配列を利用する。シグナル配
列およびバリヤーＣ−末端領域の一部をコードする配列
は、一緒になってハイブリッド分泌ペプチドをコードす
る。次いで、このハイブリッド分泌性ペプチドを使用し
て、宿主細胞からの異種蛋白質またはポリペプチドの分
泌を指令する。シグナルペプチドおよび第３ドメインは
隣接することができ、異種蛋白質またはポリペプチドは
ハイブリッド分泌性ペプチドにその下流（Ｃ−末端）に
おいて融合しているか、あるいは異種蛋白質またはポリ
ペプチドはハイブリッド分泌性ペプチドの部分の間に位
置することができる。いずれの配置においても、プロセ
シングシグナル（processing signal）、好ましくはア
ミノ酸Lys-Arg、Arg-Arg、Lys-LysまたはArg-Lysから成
る二塩基切断部位を使用して、分泌性ペプチドと異種蛋
白質の間の切断を実施する。好ましい二塩基切断部位は
KEX2切断部位Lys-Argである。あるいは、トロンビン部
位を、分泌ペプチドと異種蛋白質との間のプロセシング
部位として使用できる。
好ましい態様において、ハイブリッド分泌性ペプチド
は、シグナルペプチドおよびバリヤーのＣ−末端ドメイ
ンまたはＣ−末端ドメインの一部から本質的に成る。バ
リヤーの第１および第２ドメインに由来する配列は、実
質的に存在しないであろう。前述のように、蛋白質分解
プロセシングシグナルもまた、含めることができる。
また、前述のように、好ましいシグナル配列はBAR1シ
グナル配列であることができるが、S.セレビシエーPHO5
遺伝子のそれもまた使用できる。BAR1遺伝子によってコ
ードされるバリヤー蛋白質の前駆体は、そのアミノ末端
に推定上のシグナルペプチドを含有する。この推定上の
シグナルペプチドは、疎水性アミノ酸のコアによって特
徴つけられ、そしてアミノ酸１からアミノ酸24へ延びる
と思われる（第１図）。BAR1一次翻訳生成物のこの部分
は、分泌経路を通ってのバリヤーのプロセシングの間に
除去されると思われ、そしてこの明細書において「BAR1
シグナルペプチド」と呼ぶ。BAR1遺伝子の対応する部分
は、この明細書において「シグナル配列」と呼ぶ。
例示的発現単位は、少なくともBAR1シグナル配列およ
び第３ドメインコード配列を含み、そしてまた、他のBA
R1配列を含むことができる。例えば、１つの適当な発現
単位はTPI1プロモーター（Kawasaki、米国特許第4,599,
311号、1986）、BAR1シグナル配列、アミノ酸391-526を
コードするBAR1C−末端ドメインのための配列の部分、
２塩基切断部位をコードする配列、および異種蛋白質の
ためのコード配列、例えば、インスリン前駆体MI−３を
コードするDNA配列〔Markussenら、欧州特許163,529号
に記載されているように「Ｂ（１−29）Ala Ala Lys A
（１−12）」としても知られる〕、を含んで成る。
他の例示的発現単位は、TPI1プロモーター、開始ATG
から＋1572bpにおけるEcoRI部位までのBAR1遺伝子、２
塩基切断部位をコードする配列、および異種蛋白質のた
めのコード配列、例えば、インスリン前駆体MI−３をコ
ードするDNA配列を含んで成る。
さらに他の発現単位は、TPI1プロモーター、酵母PHO5
〔抑性性（repressible）ホスファターゼ〕シグナル配
列、ブタ・ウロキナーゼcDNA、アミノ酸423-526をコー
ドするBAR1第３ドメイン配列の一部、およびTPI1ターミ
ネーターを含んで成る。
分泌性ペプチドと異種蛋白質との間のプロセシング部
位としてのトロンビン切断部位の別の使用は、他の例示
的発現単位を生ずる。１つのこのような発現単位は、TP
I1プロモーター、BAR1シグナル配列、BAR1C−末端ドメ
インのためのコード配列、トロンビン切断部位（アミノ
酸プロリンおよびアルギニン）をコードする配列、異種
蛋白質のためのコード配列、例えば、インスリン前駆体
MI−３をコードするDNA配列を含んで成る。
BAR1遺伝子配列の分析は、バリヤーおよびいくつかの
ペプシン様プロテアーゼの間の相同性を示した。さら
に、バリヤーは、これらのプロテアーゼとの相同性を示
さない、第３ドメインをそのＣ−末端に含有する。本発
明者らによるそれ以上の研究は、このドメイン内の配列
が細胞からのバリヤーの輸送に必要であることを示し
た。BAR1推定シグナル配列を第３（Ｃ−末端）ドメイン
の136アミノ酸のためのコード領域と組み合わせること
によって、本発明者らはMFα1pre-pro配列を含んで成る
類似造成物を使用して得られたものよりも高い異種蛋白
質についての分泌レベルを得た。
Ｃ−末端ドメインの136アミノ酸部分を使用すること
に加えて、このドメインのより小さいセグメントを使用
することができる。制限酵素による切断およびエキソヌ
クレアーゼによる消化を使用することによって、第３ド
メインのより小さい断片を発生させ、そして形質転換さ
れた細胞からの蛋白質の分泌を指令するそれらの能力に
ついて試験した。例えば、１系列の実験において、BAR1
遺伝子をいくつかの便利な制限部位において切断して、
Ｃ−末端の欠失を発生させた。次いで、遺伝子断片を物
質ＰのＣ−末端部分をコードする断片に融合せしめた
（MunroおよびPelham、EMBOJ. 3:3087-3093、1984）。
得られた融合蛋白質を、物質Ｐに体する抗体を使用し
て、検出しかつ定量した。これらの研究により、位置12
67（第１図）から位置1572におけるEcoRI部位までの領
域を適当なシグナルペプチドコード配列と組み合わせ
て、強力なハイブリッド分泌性ペプチドを得ることがで
きる。
また、BAR1第３ドメインの突然変異を含有する発現単
位を発生させ、こうしてアミノ酸468-470（グリコシル
化部位＃７）、またはアミノ酸503-505（グリコシル化
部位＃８）、または両部位におけるＮ−結合グリコシル
化部位を突然変異誘発させて、それぞれ、アミノ酸468
または503における炭水化物の付加を防止することも有
利であろう。Ｎ−結合グリコシル化はAsn-X-SerまたはA
sn-X-Thr（ここでＸは任意のアミノ酸であることができ
る）のアクセプター・トリペプチド配列において起こる
が、これらのトリペプチド配列のすべてはＮ−結合グリ
コシル化に対するホストではない。Ｎ−結合グリコシル
化アクセプター部位を、トルペプチドアクセプター配列
の部位のいずれかにおける他のアミノ酸コドンで置換す
ることによって炭水化物部分の付加を防止するために、
突然変異誘発することができる。例えば、アクセプター
配列Asn-X-SerまたはAsn-X-Thrのいずれかの第２位置に
おけるプロリン残基は酵母におけるグリコシル化を阻止
することができる（Marshall、Biochem. Soc.Symp．4
0:17-26、1974）。アクセプター・トリペプチド配列の
第３アミノ酸もまた変化させることができる。とくに好
ましい態様において、トリペプチドアクセプター配列の
第１位置におけるアスパラギンを他のアミノ酸と置き換
える。最も好ましくは、グルタミン残基（Gln）をAsn残
基の代りに用いる。しかしながら、他のアミノ酸の置換
もまたトリペプチドアクセプター配列の３つの位置にお
いて実施して炭水化物の付加を防止することができる。
部位＃７もしくは＃８、または両者の部位における炭
水化物のＮ−結合付加を阻止する突然変異は、好ましく
は部位特異的生体外突然変異誘発によって生成される。
特に好ましい突然変異は、トリペプチド・アクセプター
配列の第１位におけるAsn残基に対するGln置換を発生さ
せる。位置＃７もしくは＃８においてBAR1第３ドメイン
・グリコシル化部位の突然変異を発生させることによっ
て、野生型グリコシルを伴うBAR1第３ドメイン及びMFα
1pre-pro配列またはBAR1シグナルペプチドを含んで成る
類似の構成体を使用して得られるものよりも高い、異種
蛋白質について分泌レベルを本発明者らは得た。位置＃
７または＃８におけるグリコシル化部位の突然変異を含
有するBAR1造成物で形質転換した細胞と、完全にグリコ
シル化されるBAR1造成物で形質転換した細胞の間の増殖
曲線の比較において、完全にグリコシル化されるBAR1造
成物の形質転換体において明らかな増殖ラグは、突然変
異誘発した造成物の形質転換体において欠けている。
２塩基切断部位を含有する本発明の発現単位は、好ま
しくは適当なプロモーター、BAR1遺伝子の適当な部分、
２塩基切断部位をコードするアダプター、異質種伝子ま
たcDNA、および転写ターミネータ、例えば、TPI1ターミ
ネータを連結することによって生成される。トロンピン
切断部位を含有する本発明の発現単位は、好ましくは、
前述の発現単位中に含有される２塩基プロセス部位の生
体外突然変異誘発によって、例えば、Lys-ArgをPro-Arg
に変化させることによって、あるいはトロンビン切断部
位をコードするアダプターを有する発現単位を組み立て
ることによって生成される。
次いで、生ずる発現単位を適当なベクター中に連結す
る。適当な酵母ベクターは次のものを包含する:YRp7（S
truhlら、(Proc.Natol.Acad.Sci.USA、76:1035-1039、1
978）、YEp13（Broachら、Gene，8,8:121-133,1978）、
pJDB 248およびpJDB（Beggs,Nature，275:104-108,17
8）およびそれらの誘導体。このようなベクターは、一
般に、選択マーカー、例えば、栄養マーカー、LEU2（こ
れはleu2を有する宿主菌株における選択を可能とす
る）、またはシゾサッカロミセス・ポムベ（Schizosacc
haromycesprombe）からの解糖系遺伝子POT1（Kawasaki
およびBell,欧州特許171,142号）（これはtpil突然変異
を有する宿主菌株における選択を可能とする）を包含す
る。好ましいプロモーターは、酵母解糖系遺伝子からの
もの（Hitzemanら、J.Biol.Chem.255:12073-12080,198
0;AlberおよびKawasaki,J.Mol.Appl.Genet．1:419-43
4、1982）またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子か
らのもの（Youngら，Genetic Engineering of Microorg
anisms for Chemicals,Holaenderら編,p.355,Plenum.N.
Y.,1982;Ammerer,Meth.Enzymol．101:192-201,1983）で
ある。これに関して、とくに好ましいプロモーターはTP
I1プロモーター（Kawasaki,米国特許第4,599,311号、19
86）である。好ましい転写停止シグナルはTPI1ターミネ
ーターである。
酵母ベクター中の発現単位を含んで成る造成物を、酵
母、例えば、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharo
myces cervisiae）（以後、S.セレビシエー）の菌株中
に形質転換する。酵母を形質転換するための技術は、例
えば、Beggs（前掲）およびHinnenら（Proc.Natol.Aca
d.Sci.USA、75:1929-1933、1978）において知られてい
る。形質転換体を、炭素および窒素源、ならびに特定の
宿主菌株が要求する他の栄養物質を含有する適当な培地
中で培養する。POT1選択マーカーを含有するプラスミド
で形質転換した宿主細胞を、炭素源としてグルコースを
含有する複合培地中で培養することができる。
本発明における使用に適する酵母菌株は、プラスミド
が含有する選択マーカーによって補完され得る遺伝子欠
陥を有するであろう。選択マーカーは一般に、宿主細胞
における栄養要求変異を補完する遺伝子である。このよ
うな遺伝子欠陥を有する酵母菌株は、例えば、ATCC（米
国マリイランド州ロックビル）または酵母遺伝子原料セ
ンター（Yeast Genetic Stock Center）（米国カリフォ
ルニア州バークレイ）から商業的に入手可能であるか、
あるいは突然変異および選択の標準技術を使用して調製
できる。特定の宿主および選択マーカーの選択は、当業
者の技量の範囲内である。異種蛋白質の生産を最適化す
るために、宿主株菌は突然変異、例えば、タンパク質分
解活性を減少させるpep4突然変異（Jones,Gentics，85:
23,1977）を有することが好ましい。
哺乳動物細胞の発現ベクターもまた、この分野におい
てよく知られている。種々のプロモーター、例えば、ウ
イルス（例えば、SV40およびアデノウイルス）プロモー
ターおよび細胞性プロモーター（例えば、メタロチオネ
イン遺伝子;Karin,米国特許第4,601,978号；およびPalm
iterら、米国特許第4,579,821号）が入手可能である。
他の要素、例えば、転写停止シグナル、ポリアデニル化
シグナルおよび転写増強配列は、特定の宿主細胞系にお
けるそれらの機能のために選択される。哺乳動物細胞を
形質転換し、そしてクローニングしたDNA配列を発現す
る方法は、KaufmanおよびSharp（J.Mol.Bilo．159:601-
621,1982）、SouthernおよびBerg（J.Appl.Genet．1:32
7-341,1982）、Loyterら，（Proc.Natol.Aca.Sci.USA 7
9:422-426,1982）およびNeumannら，（EMBO J.、1:841-
845、1982）に記載されている。細胞を血清含有培地ま
たは適当な補充物質を含有する血清不含培地中で培養す
る。このような適当な培地は、商業的に入手可能である
か、あるいは公表された処方に従って調製できる（例え
ば、ATCCのカタログ）。特定の精製のプロトコルは、精
製すべき特定のタンパク質の性質によって決定されるで
あろう。このような決定は当業者の技量の範囲内であ
る。一般に、細胞培地を細胞から分離し、そして蛋白質
を培地から単離する。有用な精製の技術は、沈澱、免疫
吸着および種々のクロマトグラフィー法、例えば、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィーおよびゲルろ過による分画を包含する。
実施例 実施例1.S.セレビシエーからのBAR1遺伝子のクローニン
グ BAR1遺伝子をMackayら（米国特許第4,613,572号,198
6）に記載されているようにクローニングした。簡単に
述べると、S.セレビシエーに由来する酵母ゲノムDNA断
片のランダム混合物ベクターYEp13中にを含有するプラ
スミドのプールを、遺伝子型MATa、leu2 bar1をもつ酵
母菌株中に形質転換した。形質転換体を、ロイシンを欠
く合成培地上で増殖するそれらの能力について選択し
た。形質転換した細胞を、さらに、宿主細胞におけるba
r1欠陥を補完するそれらの能力についてスクリーニング
した。機能的BAR1遺伝子を欠く酵母菌株MATa細胞は、α
−因子による阻害に対して異常に感受性である。次い
で、α−因子の阻害に対して抵抗性であることがわかっ
た形質転換体を、バリアー活性を分泌する能力について
スクリーニングした。ベクターYEp13および9.2kbの酵母
ゲノムインサートを含んで成るプラスミドpBAR2（ATCC
＃36410）は、bar1欠陥を完全に補完することがわかっ
た。
BAR1遺伝子およびその関連するフランキング（flanki
ng）配列を、HindIII-XhoI断片として、ベクターpUC13
（VieiraおよびMessing,Gene，19:259,1982）中にサブ
クローニングした。プラスミドpBAR2をHinIIおよびXhoI
で消化して、BAR1遺伝子を含有するほぼ3kbの断片を単
離した。プラスミドpUC13を、HinIIIおよびSalIで消化
によって線状化した。線状化したベクターをpBAR2から
の3kbと連結した。生ずるプラスミドをpZV9と表示した
（E.Coli菌株RRI中の形質転換体として寄託された;ATCC
＃53283）。
クローニングしたBAR1遺伝子の配列および一次翻訳生
成物の配列を第１図に示す。
実施例2.TPI1プロモーターおよびターミネータのサブク
ローニング 第２図を参照すると、プラスミドpM220（またはpM210
として知られている）を、TPI1プロモーターおよびター
ミネータの両者の人手源として使用した（AlberおよびK
awasaki,J.Appl.Genet.1:419-434,1982）。pM220で形質
転換したE.コリRRIは、ATCCに受託番号39853で寄託され
た。TPI1プロモーターおよびターミネーターを含んで成
るプラスミドpD1107を造成するため、まず、pM220の900
bpのBg1II-EcoRI TPI1プロモーター断片をpIC7（Marsh
ら，Gene，32,481-485,1984）中にサブクローニングし
て、プラスミドpD1101を発生させた。次いで、プラスミ
ドpD1101をHinIIIおよびSphIで消化して、700pbの部分
的TPI1プロモーター断片を単離した。pUC18中にサブク
ローニングされたpM220の800bpのXbaI-BamHT TPI1プロ
モーター断片を含んで成るプラスミドpDR1100を、HinII
IおよびSphIで切断した。700bpの部分的TPI1プロモータ
ーを線状化したpDR1100中に連結してpD1107を生成し
た。プロモーター配列の３′末端にXbaI部位を挿入する
ために修飾されたpM220からのTPI1プロモーターを使用
して、pD1107中に存在するTPI1プロモーターを置換し
た。プラスミドpM220をEcoRIで消化し、そしてTPI1プロ
モーターを含んで成る0.9断片をアガロースゲルの電水
泳動によって分離し、そして末端をDNAポリメラーゼＩ
（クレノー断片）で平滑末端とした。キナーゼXbaIリン
カーをこの断片に付加し、次いでBg1IIおよびXbaIで消
化した。次いで、この修飾されたTPI1プロモーター断片
をpD1107の3.4kbのBg1II-XbaIベクター断片中に連結し
てpZV118を生成せしめた。
次いで、pZV118中のTPI1プロモーターの３′末端にお
いて再生したEcoRI部位を破壊した。このプラスミドをH
indIIIおよびEcoRIで消化し、そして0.9kbの断片を分離
し、そしてオリゴヌクレオチドZC708（５′‐AATTGCTCG
AGT-3′）およびZC709（３′−CGAGCTCAGATC-5′）をア
ニーリングすることによって構成した合成リンカーに連
結した。［オリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシ
ステムス（Applied Biosystems）380A型合成装置で合成
し、そしてポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって
精製した］。ZC708およびZC709をマニアチス（Maniati
s）ら（Molecular Cloning,A Laboratory Method,p.12
2,Cold Spring Harber Laboratory,Cold Spring Harbe
r,N.Y.,1982］に記載されている方法に従ってキナーゼ
処理し、そしてアニールした。アダプターの付加は、TP
I1プロモーター断片の３′末端におけるEcoRIVを排除
し、そしてXhoIおよびXbaI部位を付加する。次いで、こ
の断片をHinIII-XbaI切断pUC13に連結した。生ずるプラ
スミドをpZV134と表示する（第２図）。
実施例3:プラスミドpGLY2,3の造成 プラスミドpMT610（Markussenら，欧州特許163,529
号；第３図参照）に由来する、MFα１リーダーおよびイ
ンスリン前駆体MI−３〔また、Ｂ（１−29）−Ala-Ala-
Lys（１−21）としても知られている〕をコードする酵
母コドン最適化配列からなる0.5kbの断片を突然変異誘
発して、MFα１リーダー中に存在する２つの潜在的グリ
コシル化部位を除去した。MFα１リーダーのアミノ酸57
（グルコシル化部位＃２）およびアミノ酸67（グリコシ
ル化部位＃３）で開始する部位を、各場合において、As
nコドンをGlnコドンに変化させることによって除去し
た。突然変異誘発のため、pMT610に由来する0.5kbのEco
RI-XbaI MFα１断片をM13mp11（これはXbaIおよびEcoRI
を使用する消化によって線状化されている）中に連結し
た。生ずる組み換えファージをmCα68と表示した。オリ
ゴヌクレオチドZC457（５′‐TGT TCC AAA CTA CTA TTG
CC-3′）およびZC458（５′‐GCC ATT TCC CCA ATC CA
C CAA T−３′）をアプライド・バイオシステムス380A
型DNA合成装置で合成し、そしてポリアクリルアミドゲ
ルの電気泳動によって精製した。次いで、MFα１リーダ
ーグリコシル化部位＃３のAsnコドンを、生体外突然変
異誘発（ZollerおよびSmith,DNA 3:479-488,1984;およ
びZollerおよびSmith,Meth.Enzymology 100,1983）によ
って、オリゴヌクレオチドZC457およびmCα68鋳型を使
用して変更した。陽性のクローンの配列を決定し、そし
て正しいクローンをmCα68と表示した。MFα１グリコシ
ル化部位＃２を変更したオリゴヌクレオチドZC457を使
用して、ZollerおよびSmith（前掲）に記載される突然
変異誘発法に従い、mCα75鋳型を突然変異誘発した。陽
性のクローンの配列を決定し、そして正しいクローンを
mCα88と表示した。突然変異誘発したMFα１リーダーお
よびMI−３をコードする遺伝子を含んで成る0.515kbのE
coRI-XbaI断片をMCα88から取り、そしてpUC19（EcoRI
およびXbaIで消化することによって線状化したもの）中
にサブクローニングした。得られたプラスミドをpGLY2,
3と表示した（第３図）。
実施例4:ベクターpSW167の造成 発現ベクターpSW167は、酵母ベクターYEp13中MI−３
コード配列に融合したバリヤーの最初の526アミノ酸を
コードする配列を含んで成る。TPI1プロモーターおよび
1578bpのBAR1断片とMI−３のためのコード配列との間の
融合を使用して、２塩基切断部位をコードするアダプタ
ーを用いて、フレーム内に該２つの配列を連結して、発
現単位を構成した。融合を構成するとき、BAR1コード配
列はpSW8およびその誘導体pSW81から生成し、それらは
次のようにして造成した。
完全なBAR1コード領域およびそれに連なるフランキン
グ領域を含んで成るプラスミドpZV9をSalIおよびBamH1
で切断して、1.3kbのBAR1断片を単離した。この断片をp
UC13（これはSalIおよびBamH1で切断した）中にサブク
ローニングして、pZV17と表示するプラスミドを発生さ
せた（第４図）。プラスミドpZV17をEcoRIで消化して、
BAR1コード領域の最も３′側の0.5kbを除去した。ベク
ター−BAR1断片を再連結してpJH66と表示するプラスミ
ドを発生させた。プラスミドpJH66をEcoRIで線状化し、
そしてDNAポリメラーゼＩ（クレノー断片）で平滑末端
とした。キナーゼ処理したBamH1リンカー（５′−CCGGA
TCCGG-3′）を付加し、そして再連結の前に過剰のリン
カーをBamH1で消化して除去した。得られたプラスミド
をpSW8と表示した（第８図）。
TPI1プロモーター、物質Ｐ（MunroおよびPelham,前
掲）のＣ−末端部分のコード領域に融合したBAR1コード
領域およびTPI1ターミネーターを含んで成るpSW81を、
第４図および第５図に示すようにして、pSW8から誘導し
た。プラスミドpSW8をSalIおよびBamHIで切断して、バ
リヤーのアミノ酸252-526をコードする824bpの断片を単
離した。M13mp8中に物質ＰのＣ−末端部分を２量体の形
態でコードする合成オリゴヌクレオチド配列を含有する
プラスミドpPM2を、MunroおよびPelhamから得た。プラ
スミドpPM2をBamH1およびSalIによる消化によって線状
化し、そしてpSW8からの824bpのBAR1断片と連結した。
得られるプラスミドpSW14をSalIおよびSmaIで消化し
て、871bpのBAR1−物質Ｐ断片を単離した。アミノ酸１
−250をコードするBAR1の断片を含んで成るプラスミドp
ZV16をXbaIおよびSalIで切断して、767bpのBAR1断片を
得た。この断片を、XbaIおよびSmaIで切断したpUC18と
の３部分の連結において、871bpのBAR1−物質Ｐ断片と
連結した。得られるプラスミド（pSW15を表示する）をX
baIおよびSmaIで消化して、1.64kbのBAR1−物質Ｐ断片
を単離した。ADH1プロモーターをpRL029から得た。pRL0
29はpUC18中のADH1プロモーターおよび116bpのBAR1の
５′コード領域を含んで成る（Mackay,W087/02670）。
プラスミドpRL029をSphIおよびXbaIで消化して、0.42kb
のADH1プロモーター断片を単離した。TPI1ターミネータ
ー（AlberおよびKawasaki,前掲）を、pUC18（EcoRI-Sph
I）に連結された0.7kbのTPI1ターミネータ（平滑末端Xb
aI-EcoRI）を含んで成る平滑末端のXbaI-SphI断片とし
て準備した。この断片を0.42kbのADH1−プロモーター断
片および1.64kbのBAR1物質Ｐ断片と、３部分連結におい
て連結してプラスミドpSW22を生成した（第４図）。
pSW22中に存在するADH1プロモーターをTPI1プロモー
ターと置換して、プラスミドpSW81を造成した（第５
図）。TPI1プロモーターを900bpのHindIII-XbaI断片と
して準備した。BAR1−物質Ｐ融合およびTPI1ターミネー
ターを含有する2.3kbの断片を、XbaI-SatI断片としてプ
ラスミドpSW22から単離した。TPI1プロモーター断片お
よびBAR1−物質Ｐ−TPI1ターミネーター断片を、３部分
連結合で、HindIIIおよびSstIで線状化されたpUC18と連
結した。得られるプラスミドをpSW81と表示した。
Lys-Arg切断部位をコードする合成オリゴヌクレオチ
ドアダプターを使用して、BAR1およびMI−３の間の融合
を実施した。オリゴヌクレオチドZC794（５′‐CAT CCT
TGG ATA AAA G-3′）およびZC795（５′‐AAT CTT TTA
TCC AAG-3′）をキナーゼ処理し、そしてアニーリング
して、BamH1およびHinfI粘着末端およびLys-Arg切断部
位をコードする配列を含んで成るアダプターを生成し
た。プラスミドpGLY2,3（実施例３）をEcoRIおよびXbaI
で切断して、修飾されたMFα1pre-proおよびMI−３配列
を含有する0.515kbの断片を生成した。次いで、この断
片をHinfIで消化して、180bpのMI−３断片を遊離せしめ
た。前述のプラスミドpSW22をEcoRIおよびBa1IIで切断
して240bpのBAR1断片を分離した。この断片を、EcoRIお
よびXbaIで線状化したpUC18との４部分連結において、1
80bpのMI−３断片およびZC794/ZC795アダプターと連結
した。得られるプラスミド（pSW123と表示する）（第５
図）、をEcoRIおよびXbaIで切断して、3.2kbのBAR1-MI
−３断片を単離した。プラスミドpSW81をHindIIIおよび
EcoRIで切断して、1.1kbのTPI1プロモーター−BAR1断片
を単離した。TPI1ターミネーターを0.76kbのXbaI-BamH1
断片として準備した。1.1kbのTPI1-BAR1断片、3.2kbのB
AR1-MI-3断片およびTPI1ターミネーターを、HindIIIお
よびBamH1で線状化したpUC18との４部分連結において連
結した。得られるプラスミド（pSW127と表示する）はTP
I1プロモーター、アミノ酸１−115をコードするBAR1配
列、Lys-Arg切断部位をコードする配列、MI−３コード
配列およびTPI1ターミネーターを含有する。
pSW127中に存在するBAR1コード領域を、BAR1遺伝子か
らのアミノ酸251-526のためのコード領域と置換するこ
とによって、プラスミドpSW151を造成した。プラスミド
pSW127をXhoIIおよびEcoRIで消化して、TPI1ターミネー
ターと連結されたMI−３に融合したZC794/ZC795合成ア
ダプターを含んで成る965bpの断片を単離した。pSW81を
SalIおよびBamH1で消化して、BAR1のＣ−末端275アミノ
酸をコードする821bp断片を単離した。SmaIおよびEcoRI
で線状化したプラスミドpIC18H（Marshら、前掲）を、9
65bpおよび821bpの断片と３部分連結において連結し
た。
酵母ベクターYEp13中MI−３配列に融合したBAR1のコ
ドン１−526を含んで成るプラスミドpSW167を次のよう
にして造成した。プラスミドpSW81は、pSW151中に存在
するBAR1配列に結合したときにBAR1のためのコード配列
を完成するために必要なTPI1プロモーターおよびBAR1配
列を提供した。pSW81をHindIIIおよびSalIで消化して、
1.67kbのTPI1プロモーター−BAR1断片を単離した。pSW1
51をSmaIおよびBalIIで切断して、BAR1-MI−３融合物お
よびTPI1ターミネーターを含んで成る1.6kbの断片を単
離した。この断片を、1.67kbのTPI1プロモーターおよび
YEp13（Broachら，Gene 8:121-133,1979）（これはHinI
IIおよびBamH1で線状化されている）と連結した。得ら
れるプラスミドをpSW167と表示する（第６図）。プラス
ミドpSW167はATCCにE.コリHB101の形質転換体として受
託番号67523号として寄託されている。
実施例5:発現ベクターpSW200の造成 BAR1シグナル配列、BAR1第三ドメイン配列及びMI−３
コード配列を含有する造成物を、まずベクターpIC19H
〔マーシュ（Marsh）等、前掲〕中に組み立て、その
後、酵母ベクターYEp13（第６図）中にクローニングし
た。プラスミドpSW81（実施例４）をEcoRIで線状化し
た。EcoRI粘着末端をDNAポリメラーゼＩ（クレノー断
片）で処理してフィルインした。次に、得られた平滑末
端断片をBglIIで切断して、TPI1プロモーター及びBAR1
シグナル配列を含有する1.1kb断片を単離した。プラス
ミドpSW151（実施例３）をEcoRV及びCla1で切断して、4
03bpBAR1の第三ドメイン配列、MI−３コード配列及びTP
I1ターミネーターを含有する1.37kb断片を単離した。こ
の断片を、BalIIおよびCIaで消化して線状化したpIC19H
との３部分連結においてpSW81由来の1.1kb断片に連結し
た。得られたプラスミド（pSW195と命名）をBglII及びS
maIで消化して2.4kbの発現単位を単離後、BamHI及びPvu
IIで消化して線状化したYEp13に連結した。得られたプ
ラスミドをpSW200と命名した。このプラスミドpSW200
を、アメリカンタイプ カルチャー コレクション（Am
erican Type Culture Collection）に大腸菌HB101形質
転換株（寄託第67524号）として寄託した。
実施例6:ベクターpSW207の造成 pSW167に含有される発現単位も、選択マーカーとして
S.ポンベ（S.pombe）POT1遺伝子を用いるベクターに挿
入し、宿主細胞におけるtpil欠損を補足した。POT1遺伝
子は酵母宿主細胞株におけるtpil欠損の補償レベルが低
い。この低レベル補償により、発現ベクターのコピー数
の増加を補償する。このベクターは、ベクターpCPOT
〔アメリカン タイプ カルチャー コレクションに大
腸菌株HB101形質転換体（寄託第39685号）として寄
託）〕由来のものであった。第７図に示したように、ベ
クターpCPOTを、２ミクロン及びpBR322配列を含有する7
50bp SphI-BamHI断片をpBR322テトラサイクリン耐性遺
伝子由来の186bp SphI-BamHI断片で置換することにより
変異させてプラスミドpDPOTを造成した。プラスミドpDP
OTを変性してSphI部位を破壊し、NotI部位への５′にBa
mHI部位を配置した。オリゴヌクレオチドZC994（５′‐
GAT CCG CGG CCG CAC ATG-3′）及びZC995（５′‐TGC
GGC CGC G-3′）をキナーゼ処理及びアニーリングして
５′SphIコンパチブル末端、NotI部位及び３′BamHI粘
着末端を有するアダプターを形成した。プラスミドpDPO
Tを、SphI及びBamHIで消化することにより線状化した。
線状化したpDPOTを、ZC994/ZC995アダプターに連結して
プラスミドpSW197（第７図）を形成した。
TPI1プロモーターをプラスミドpSW197に挿入してpSW2
07を造成した。プラスミドpZV134（実施例２）をBglII
及びEcoRIで消化して0.9kbプロモーター断片を単離し
た。TPI1プロモーター断片及び上記したZC994/ZC995ア
ダプターを、SphI及びEcoRIで消化して線状化したpUC18
に３部分連結により連結した。得られたプラスミドpSW1
98をNotI及びBamHIで消化して0.9kbTPI1プロモーター断
片を単離した。この断片を、NotI及びBamHIで消化して
線状化したpSW197に連結した。得られたプラスミドをプ
ラスミドpSW207（第７図）と命名した。
実施例7:発現ベクターpSW210の造成 MI−３コード配列に融合したバリア（Barrier）の最
初の526個のアミノ酸をコードしている配列を含有して
いる発現ベクターを第８図及び第９図に示すようにして
造成した。
操作を容易にするために、ZC794/ZC795アダプター、M
I−３コード配列及びTPI1ターミネーターを含有してい
る断片をPIC19H中でサブクローニングした。プラスミド
pSW127（実施例４）をEcoRIで消化して、BAR1の３′部
分、ZC794/ZC795アダプター、MI−３コード配列及びTPI
1ターミネーターを含有している1.2kb断片を単離した。
この1.2kb断片をxhoIIで消化して、ZC794/ZC795アダプ
ター、MI−３コード配列及びTPI1ターミネーターを含有
している0.96kb断片を単離した。この断片を、BamHI及
びEcoRIで消化して線状化したPIC19Hに連結した。得ら
れたプラスミドをpSW150（第９図に図示）と命名した。
TPI1プロモーター断片をプラスミドpSW84から得た。
プラスミドpSW84はTPI1プロモーター、物質Ｐの配列に
融合した突然変異させたBAR1遺伝子及びTPI1ターミネー
ターを含有おり、このプラスミドpSW84を第８図に示す
ようにして造成した。ADH1プロモーター及びプラスミド
pSW22（実施例４）由来のBAR1の最初の119bpを含有して
いる0.54kb SphI-EcoRI断片を、SphI及びEcoRIで消化し
て線状化したM13mp18に連結した。得られたファージ（p
SW54と命名）を、突然変異誘発用のオルゴヌクレオチド
ZC634（５′‐ATT ACT GCT CCT ACA AAC GAT-3′）を用
いて試験管内突然変異誘発（ゾラー及びスミス、前掲）
させた。この突然変異により、位置25のロイシンのコド
ンをプロリンのコドンに変更して、シグナルペプチド開
裂部位突然変異体を生成した。陽性クローンの配列決定
を行い突然変異を確認し、そのうちの一つの陽性クロー
ンをmZC634−７と命名した。mZC634−７の複製型DNAをS
phI及びEcoRIで消化して0.54kb断片を単離した。この断
片を、SphI及びEcoRIで消化して線状化したpUC18に連結
した。得られたプラスミドpSW66をHindIII及びxbalで消
化して、ADH1プロモーター断片を除去した。突然変異さ
せたBAR1断片を含有している2.8kb断片及びpUC18を、TP
I1プロモーターを含有しているプラスミドpZV134（実施
例２）からのHindIII-xbal断片に連結した。得られたプ
ラスミドをpSW82と命名した。プラスミドpSW82をHindII
I及びEcoRIで消化して、TPI1プロモーター及び突然変異
させたBAR1断片を含有している1.02kb断片を単離した。
プラスミドpSW22をEcoRIで部分消化し、そしてSstIで完
全に消化して、物質Ｐの配列に融合したBAR1遺伝子のＣ
−末端部分及びTPI1ターミネーターを含有している2.16
kb断片を単離した。これらの２つの断片を、HindIII及
びSstIで消化して線状化したpUC18に３部分連結で連結
した。得られたプラスミドpSW84は、TPI1プロモータ
ー、突然変異させたBAR1遺伝子及びTPI1ターミネーター
を含有している。
操作を容易にするために、pSW84からのTPI1プロモー
ター−BAR1断片を、ベクターpIC19R（マーシュ等、前
掲）中でpSW150のMI−３−TPI1ターミネータ断片に連結
した。第９図に示すように、プロモーターpSW150を、Ac
cIで消化して線状化し、粘着末端をDNAポリメラーゼＩ
（クレノー断片）で平滑化した。平滑化した断片を、次
に、BalIIで切断して、ZC994/ZC995アダプター、MI−３
コード配列及びTPI1ターミネーターを含有している0.97
kb断片を単離し、プラスミドpSW84をEcoRIで消化し、粘
着末端をDNAポリメラーゼＩ（クレノー断片）で平滑化
した。次に、平滑化した断片をHindIIIで切断して、1.0
2kbTPI1プロモーター−BAR1断片を単離した。pSW150か
らの0.97kb断片及びpSW84からの1.02kb断片を、HindIII
及びBglIIで消化して線状化したpIC19Hに、３部分連結
で連結した。得られたプラスミドをpSW204と命名した。
pSW204中の発現単位をpSW207（実施例６）に挿入して
プラスミドpSW212を調製した。プラスミドpSW204をSphI
及びBalIIで切断して、1.3kb発現単位を単離した。プラ
スミドpSW207をSphI及びBamHIで切断して、部分的TPI1
プロモーター・ベクター断片を単離した。これらの２つ
の断片をいっしょに連結して、プラスミドpSW212（第９
図）を調製した。
pSW212中に存在するBAR1断片をpSW167（実施例４）か
らのBAR1断片で置換して、全長BAR1-MI−３融合物を造
成した。プラスミドpSW212をSphI及びBamHIで消化し
て、部分的TPI1プロモーター、ZC794/ZC795アダプタ
ー、MI−３コード配列及びTPI1ターミネーターを含有し
ているベクター断片を単離した。プラスミドpSW167をSp
hI及びBamHIで消化して、1.81kbの部分的TPI1プロモー
ター及びBARI配列を単離した。この断片をpSW212に連結
して、発現ベクターpSW210（第９図）を生成した。
実施例8:発現ベクターpSW219の造成 pSW200（実施例５）中に存在している発現単位及びPO
T1選択マーカーを含有しているプラスミドpSW219を以下
のようにして造成した（第10図）。プラスミドpSW195
（実施例５）をBalII及びClaで消化して、TPI1プロモー
ター、BAR1シグナル配列、BAR1第三ドメインコード配列
及びTPI1ターミネーターを含有している2.4kb断片を単
離した。この断片を、BamHI-ClaIで線状化したpIC19Hに
連結した。得られたプラスミドpSW217は、TPI1ターミネ
ーターの３′端にBamHI部位を有するpSW195からの発現
単位を含有していた。プラスミドpSW217をSphI及びBglI
Iで消化して、部分的TPI1プロモーター、BAR1シグナル
及び第三ドメイン配列、MI−３コード配列並びにTPI1タ
ーミネーターを含有している1.7kb断片を端離した。プ
ラスミドpSW207（実施例６）をSphI及びBamHIで消化し
て、部分TPI1プロモーター・ベクター断片を単離した。
この断片をpSW217からの1.7kb断片に連結して、発現ベ
クターpSW219を調製した。
実施例9:発現ベクターpZV187の造成 二塩基性開裂部位に代るプロセッシング部位はトロン
ビン開裂部位である。代替発現単位を造成するために、
プラスミドpSW195を、試験管内突然変異誘発により変異
してLys-Arg開裂部位をトロンビン開裂部位で置換し
た。この変形により、二塩基性プロセッシング部位に関
連したコドンの代わりに、アミノ酸プロリン及びアルギ
ニンをコードしているコドンが生じた。BAR1シグナル配
列及び第三ドメインコード配列を含有している得られた
MI−３発現ベクターを、pZV187と命名した。
第11図に、pZV187の造成を示す。プラスミドpSW195を
SphI及びSalIで消化して、BAR1−MI−３融合物及びTPI1
ターミネーターを含有している1.7kb断片を単離した。
この断片を、予めSphI及びSalIで完全に消化したM13mp1
8に連結した。得られたファージクローンをmp18-ZV172
と命名した。オリゴヌクレオチドZC1083（５′‐TCC TT
G GAT CCA AGA TTC GTT-3′）を用いて、ウラシル法
〔クンケル（Kunkel）、プロク ナトル アカドサイ
（Proc.Natl.Acad.Sci.）、米国、第82巻、488〜492（1
985）〕により、mp18-ZV172を突然変異誘発させた。得
られた突然変異体の配列決定を行い突然変異誘発を確認
し、陽性クローンをZV172/1083と命名した。便宜上、ZV
172/1083に存在する挿入物をpUC18中でサブクローニン
グした。ZV172/1083からの1.7kbSphI-SalI挿入物を単離
し、予めSphI及びSalIで完全に消化したpUC18に連結し
た。得られたプラスミドpZV180をSalIで完全に消化し
た。線状化しpZV180をDNAポリメラーゼＩ（クレノー断
片）を用いて平滑化し、キナーゼ処理したBglIIリンカ
ーに連結した。過剰のリンカーを、BalIIで消化するこ
とにより除去した。次に、リンカーを付加したDNAをSal
Iで完全に切断して、1.7kb挿入物を単離した。部分TPI1
プロモーター、BAR1-MI−３融合物及びTPI1ターミネー
ターを含有する1.7kb挿入物をプラスミドpSW207のSphI-
Bam-HI部分TPI1プロモーター−ベクター断片に連結し
て、pZV187を造成した。
実施例10:宿主細胞及び形質転換及びインシュリン類似
体MI−３の発現 ベクターYEp13中に発現単位を含有する発現ベクターp
SW167及びpSW200、並びにベクターpSW197中に発現単位
を含有する発現ベクターpSW210、pSW219及びpZV187によ
り、標準法に準じて適当な酵母を形質転換した。サッカ
ロミセス・セレビシエー（S.cerevisiae）宿主株は、プ
ラスミド上に存在する選択マーカーにより補完された突
然変異を含有していた。
YEp13中でMI−３のコード配列に融合したBAR1のコー
ド領域の最初の526個のアミノ酸をコードしている配列
を含有しているプラスミドpSW167、並びにYEp13中でBAR
1シグナルペプチド及びMI−３のコード配列に融合したB
AR1第三ドメインをコードしている配列を包含している
プラスミドpSW200により、S.セレビシエー（S.cerev
i）、siae株ZA521（MATaleu2−3 leu2−112 ura3 pep
4::URA3 bar1 gal2）を形質転換した。ロイシンを含ま
ない合成増殖培地で増殖できる形質転換体を選択した。
形質転換体を、5mlの−LeuD〔ウィッカーハム（Wicke
rham）、エル ジェイ、ジェイ バクト（J.Bact.）、
第52巻、293〜301（1946）；窒素源としてディフコ イ
ースト ナイトロジェンベース（Dfco Yeast Nitrogen
Base）を含有〕中で一晩30℃で増殖させた。形質転換
を、20又は50mlのLeuDで1:100に希釈して、24又は48時
間、30℃で増殖させた。細胞をペレット化して洗浄後、
−70℃で凍結した。スペント培地を２回回転させ、細胞
物から傾斜して除去後、−70℃で凍結した。放射線免疫
検定法（RIA;実施例14参照）により測定したMI−３レベ
ルにより、54時間で、pSW167形質転換体が38pg/mlのMI
−３免疫反応性物質を生成し、pSW200形質転換体が113p
g/mlのMI−３免疫反応性物質を生成したことが分かっ
た。
pSW197中でMI−３のコード配列に融合したBAR1の最初
の526個のアミノ酸をコードしている配列を含有してい
るプラスミドpSW210、並びにpSW197中でBAR1シグナルペ
プチド及びMI−３のコード配列に融合したBAR1第三ドメ
インをコードしている配列を含有しているプラスミドpS
W219により、S.セレビシエー（S.cerevisiae）株GA18-1
C（MATa leu2−3 leu2−112 ura3 tpil::LEU2）及びZM1
14（MATa leu2−3,112 ura3−52 ade2−1 pep4::TPI-CA
T tpi::URA3 vpt3）を形質転換した。グルコースの存在
下での増殖能力について形質転換を選択した。
プラスミドpSW210及びpSW219で形質転換したGA18-1C
株からのMI−３発現及び分泌は、まず形質転換体を一晩
30℃で、5mlのMED1〔バクトイースト エクストラクト
（Bacto Yeast Extract）２％、硫酸アンモニウム0.5
％、グルコース６％〕中で増殖させることにより行われ
た。形質転換体を20ml又は50mlのMED1で1:100に希釈し
て、24時間又は48時間、30℃で増殖させた。細胞をペレ
ット化して洗浄後、−70℃で凍結した。スペント培地を
２回回転させ、細胞材料から傾斜して除去後、−70℃で
凍結した。RIAにより測定したMI−３レベルにより、24
時間で、pSW210形質転換体が0.3μg/mlのMI−３免疫反
応性物質を生成し、pSW219形質転換体が0.15μg/mlのMI
−３免疫反応性物質を生成したことが分かった。
ZM114株のpSW219形質転換体からのMI−３の発現及び
分泌レベルも、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）ア
ッセイにより測定した。形質転換体を、一晩30℃で5ml
の補足YEPD〔YEPD＋40mg/l Ade＋80mg/l Leu＋10mMCaCl
2（グルコース濃度を６％に調整）〕中で増殖させた。
一晩培養した培養物を、補足YEPD50mlで1:100に希釈
し、30℃で成長させた。試料4mlを２つづつ、30時間、4
8時間及び75時間に採取した。試料を遠心分離して上澄
みを保存した。上澄みの0.5mlのアリコットを、醗酵液
（552gの96％EtoH＋349gのＨ2Ｏ＋5mlの濃Ｈ2SO4）0.5m
lと混合し、室温で30分間インキュベートした。次に、
混合物を0.2μｍアクロディスクス（Acrodiscs）（ミシ
ガン州アン アーバーにあるゲルマンサイエンス社）を
通して濾過後、−20℃で凍結した。HPLCアッセイ（実施
例14B）で測定してMI−３レベルにより、pSW219形質転
換体が75時間で14μg/mlのMI−３を生成したことが分か
った。
BAR1第三ドメインとMI−３コード配列の間にトロンビ
ン開裂部位を含有するプラスミドpZV187で、S.セレビシ
エー株GA18-1C及びZM114を形質転換した。グルコースの
存在下の増殖能力について形質転換体を選択した。形質
転換体を一晩5mlのYEP＋６％グルコース（１％バクト
イースト エクストラクト、２％バクト イースト ペ
プトン、及びオートクレービング後に６％デキストロー
ス添加）中で成長させた。一晩培養した培養物を、YEP
＋６％グルコース10mlで1:100に希釈し、30℃で増殖さ
せた。試料を、26時間及び48時間に採取した。試料を遠
心分離して細胞をペレット化し、上澄み液を傾しゃ後−
70℃で凍結した。MI−３レベルを放射線免疫検定法によ
り測定した。その結果、48時間で、GA18-1C形質転換体
が0.9ng/mlのMI−３免疫反応物質を生成し、一方、ZM11
4形質転換体が、0.52ng/mlのMI−３免疫反応性物質を生
成したことが分かった。
実施例11:発現ベクターpSW290及びpSW281の造成 TPI1プロモーター、BAR1シグナル配列、位置＃７にグ
リコシル化部位突然変異を有するBAR1第三ドメイン配
列、MI−３コード配列、TPI1ターミネータ及びpDPOTベ
クター配列を含有する造成物をpZC891から次のようにし
て造成した。TPI1プロモーターの一部分、BAR1シグナル
配列及びBAR1第三ドメインを含有するpSW195（実施例
５）のSphI-BamHI断片を、SphI及びBamHIで消化して線
状化したM13mp18中でクローニングした。得られた造成
物から製造した一本鎖鋳型DNAを、ゾラー及びスミス
（前掲、1983年）により記載されている方法と実質的に
同様にして、ZC891（５′‐AGT CGA TGC TCT ACG-3′）
を用いて、試験管内突然変異誘発させた。ZC891を用い
た突然変異誘発により、BAR1第三ドメインの位置＃７に
Asn→Gln突然変異を生成した。プラークハイブリダイゼ
ーションで同定し、ジデオキシシ−クエンシングにより
確認した陽性クローンを、pZC891と命名した。
複製型pZC891DNAを調製し、SphI及びBamHIで消化し
て、TPI1プロモーターの一部分、BAR1シグナル配列、及
びグリコシル化部位＃７にZC891突然変異を含有するBAR
1第三ドメインを含んで成る0.73kb断片を単離した。プ
ラスミドpSW210（実施例７）をSphI及びBamHIで消化し
て、TPI1プロモーターの５′側0.7kb、MI−３コード配
列、TPI1ターミネーター及びpDPOTベクター配列を含有
する12.3kb断片を単離した。pSW210断片を、リガーゼ処
理によりpZC891に連結してプラスミドpSW290を生成し
た。
TPI1プロモーター、BAR1シグナル配列、位置＃８にグ
リコシル化部位突然変異を有するBAR1第三ドメイン配
列、MI−３コード配列、TPI1ターミネーター及びpDPOT
ベクター配列を含有する造成物を、pSW290の造成に類似
の方法により造成した。ZC1330（５′‐AAA CCT CTC AA
G AAA CCA A−３′）及びゾラー及びスミス（前掲、198
3年）により記載された方法を用いて、pSW253の一本鎖
鋳型DNAについての位置特異的試験管内突然変異誘発に
より、グリコシル化部位＃８にAsn→Gln置換を生じる突
然変異を生じさせた。陽性クローンを同定し、SphI及び
BamHIで消化して、ZC1330突然変異を含有する0.73kb断
片を単離した。次に、0.73kb断片を、プラスミドpSW210
の12.3kb SphI-BamHI断片に連結した。得られたプラス
ミドをpSW281と命名した。
実施例12:宿主細胞の形質転換及びプラスミドpSW290か
らのインシュリン前駆体MI−３の発現 プラスミドpSW290からのインシュリン前駆体MI−３の
発現を、TPI1プロモーター、MFα１シグナル配列、MI−
３コード配列、TPI1ターミネーター及びpDPOTベクター
配列を含んで成るベクターpDPOT及び類似の造成物pIN4
A、並びにTPI1プロモーター、BAR1シグナル配列、野性
型BAR1第三ドメイン配列、MI−３コード配列、TPI1ター
ミネーター配列及びpDPOTベクター配列を含んで成るpSW
219（実施例８）と比較した。発現を増殖曲線実験にお
いて解析した。プラスミドpSW290、pDPOT、pIN4A及びpS
W219により、S.セレビシエー株ZM114（実施例10）を標
準法に準じて形質転換した。YEPD＋ade＋leu（１％イー
スト エクストラクト、２％ペプトン、２％グルコー
ス、40mg/lアデニン、80ml/lロイシン）5ml中の一晩培
養した前培養物を、各形質転換体について増殖させた。
前培養物をYEPD＋ade＋leuでOD6000.1に希釈し、通気し
ながら30℃で増殖させた。試料を、接種後22時間、34.5
時間、36.5時間及び57.2時間に採取した。
各時間に、OD600を測定し、各培養物から5mlの試料を
採取した。ZM114〔SW290〕培養物は、BAR1第三ドメイン
において野性型グリコシル化をコードしている類似造成
物pSW219で見出されたような増殖ラグを示さなかった
（第１表）。細胞を４℃で遠心分離により除去し、上澄
み液を保存した。各上澄み液の0.5mlアリコット２つを
２個のミクロフュージ管に分配した。0.5mlの醗酵液で
希釈後室温で30分間インキュベートし、エッペンドルフ
ミクロフュージ〔ニューヨーク、ウエストバリーにある
ブリンクマン社（Brinkmann）〕で５分間４℃で遠心分
離し、0.45μｍフィルターを通して濾過して別のミクロ
フュージ管に入れて、HPLC用0.5mlアリコットを調製し
た。アッセイの前に試料を−70℃で保存した。実施例16
Bに記載したようにして、培養物の上澄み液の高圧液体
クロマトグラフィーを行った。アッセイの結果（第２
表）、ZM114〔pSW290〕が、ZM114を形質転換した類似造
成物pIN4Aより多くのMI−３の分泌を示すことが判明し
た。
実施例13:PHO5シグナルペプチド及びBAR1第三ドメイン
配列を含んで成るハイブリッド分泌ペプチド PHO5シグナルペプチド、BAR1第三ドメイン配列及びブ
タウロキナーゼ（uPA）cDNAを含んで成る発現単位を造
成し、ベクターYEp13に挿入した。uPA cDNAは、ベクタ
ーpBR322中の2.3kb挿入物としてuPA cDNAを含有するプ
ラスミドpYN15〔ナガミネ等、ヌク アシッズ レス（N
uc.Acids Res．）、第12巻、9525〜9541（1984）〕に由
来するものであった（第12図）。cDNA配列をまず変異し
て、uPAストップコドンの３′側にxbaI部位を配置し
た。プラスミドpYN15をxbaIで切断して、uPAコード配列
を含有する1.9kb断片を単離した。この断片を、xbaIで
完全に消化したpUC13に連結した。連結混合物で大腸菌
株JM83を形質転換した。形質転換体からプラスミドDNA
を調製し、正しく配向した挿入物を有するプラスミドを
pDR2010と命名した。プラスミドpDR2010をApaIで消化し
て線状化し、粘着末端をＴ4DNAポリメラーゼで平滑化し
た。平滑化した断片をSmaIで切断して585bpの３′非コ
ード領域を除去し後、再連結してプラスミドpDR2011を
得た。
次に、プラスミドpDR2011に存在するcDNAを変異させ
て、uPAの第一アミノ酸コドンの５′側にBglII部位を配
置した。その後、プラスミドpDR2011をxbaI及びEcoRIで
切断して、1.35kbuPA断片を単離し、次に、xbaI及びEco
RIで完全に消化したM13mp19に連結した。得られたファ
ージクローンをM13mp19-2011と命名した。オリゴヌクレ
オチドZC558（５′‐AGT TCA TGA GAT CTT TTG GAGT-
3′）を、uPAの最初のアミノ酸にBglII部位を生じるよ
うに設計した。プラスミドM13mp19-2011を、ゾラー及び
スミス（1984年、前掲）の２−プライマー法により、第
一プライマーとしてZC558を用い、第二プライマーとし
てZC87（５′−TCC CAG TCA CGA CGT-3′）を用いて試
験管内突然変異誘発させた。キナーゼ処理したZC558へ
のハイブリダイゼーションにより同定した陽性クローン
をBglII及びEcoRIで切断して、BglII部位の導入を確認
した。得られたファージmp19-2011-558をxbaI及びSstI
で消化して、突然変異誘発したuPA配列を含有する1.35k
b断片を単離した。この断片をxbaI及びSstIで消化して
線状化したpUC18に連結した。得られたプラスミドをpDR
2012（第12図）と命名した。
プラスミドpDR2012に存在するuPA cDNAを変異して、
ストップコドンにの３′側にXbaIを付加した。プラスミ
ドpDR2012をEcoRIで消化して線状化し、粘着末端をDNA
ポリメラーゼＩ（クレノー断片）で処理して平滑化し
た。末端を平滑化した断片を、キナーゼ処理したXbaIリ
ンカー（CTCTAGAG）に連結し、EcoRI株JM83を形質転換
した。形質転換体から単離したプラスミドDNAを、BglII
及びXabIで消化して解析した。陽性クローンをpZV112
（第13図）と命名した。
部分的TPI1プロモーター、MFα１プレプロ配列及びtP
A cDNA（第13図）を含有するプラスミドpDR1298中の組
織プラスミノーゲン活性因子（tPA）cDNA配列を、プラ
スミドpZV112に存在するuPA cDNAで置換した。プラスミ
ドpDR1298をBglII及びxbaIで消化して、TPI1プロモータ
ー、MFα１シグナル配列及びpUC18ベクターを含有する
3.25kb断片を単離した。プラスミドpZV112をBalII及びx
baIで消化して、uPAcDNAを単離した。この断片を3.25kb
pDR1298断片と連結した。得られたプラスミドpZV117を
SphI及びxbaIで消化して、部分的TPI1プロモーター、MF
α１シグナル配列及びuPA cDNAを単離した。プラスミド
pDR1107（実施例２）をSphI及びxbaIで消化して、部分
的TPI1プロモーター、TPI1ターミネーター及びpUC13ベ
クターを含有している3.6kb断片を単離した。次に、こ
の断片を3.25kb pZV117断片に連結して、プラスミドpZV
120を得た。プラスミドpZV120をHindIII及びSmaIで消化
して、発現単位を単離した。プラスミドYEp13を、BamHI
で消化後、DNAポリメラーゼＩ（クレノー断片）で末端
を平滑化した。次に、末端平滑化断片をHindIIIで切断
して、ベクター部分を単離し、その後、pZV120の発現単
位に連結してプラスミドpZV125を得た。
プラスミドpZV125におけるuPA cDNAを合成アダプター
を用いて変異させ、uPAcDNAストップコドンの３′側にS
alI部位を配置した。プラスミドpZV125をHindIII及びBa
mHIで消化して、TPI1プロモーター、MFα１プレプロ配
列及び部分的uPAcDNAを含有している2.5kb断片を単離し
た。オルゴヌクレオチドZC830（５′‐TCG ACG TGA GCT
AGC CCG TTT TCA CCA CCA ACG TGA GTG TG-3′）及びZ
C831（５′‐GAT CCA CAC TCA CGT TGG TGG TGA AAA CG
G GCT AGC TCA CG-3′）をキナーゼ処理後、アリーリン
グして、BamHI及びSalI粘着末端を有するuPAの末端の13
個のアミノ酸をコードしている酵母コドン最適化アダプ
ターを生成した。ZC830/ZC831アダプターとpZV125から
の2.5kb断片とを、HindIII及びSalIで消化して線状化し
たpUC13に、３部分連結で連結した。pZV157と命名した
得られたプラスミドは、uPAの第一コドンの５′側にBgl
II部位を有し、そしてuPAストップコドンの３′側にSal
I部位を有するuPA cDNAを含有している。
pZV157からのuPA cDNAをTPI1プロモーター及びPHO5シ
グナルペプチド配列に連結してpSW148を造成した。プラ
スミドpZV157をBglII及びSalIで消化して、1.3kb uPA c
DNAを単離した。プラスミドpDR1394〔酵母PHO5（アリマ
等、ヌクアシッズ レス（Nuc.Acids Res.）、第11巻、
1657〜1672、1983年）シグナルペプチドをコードしてい
る合成配列に連結されたTPI1プロモーターを含有してい
るpUC18系プラスミド〕由来のTPI1プロモーター−PHO5
シグナルペプチド配列を含有する0.96kbBglII断片及びu
PAcDNA断片を、BglII-SalI切断pIC19Hに、３部分連結に
より連結した。得られたプラスミドをpSW148と命名し
た。
物質Ｐの配列に融合したBAR1第三ドメイン配列及びTP
I1ターミネーターを含有するプラスミドpSW152を、下記
のようにして造成した。プラスミドpSW22（実施例４）
をPvuIIで消化して、1.16kb BAR1−物質Ｐ断片を単離し
た。キナーゼ処理しそしてアニーリングしたSalIリンカ
ー（５′‐CGT CGA CG-3′）を1.16kb断片に連結した。
過剰のリンカーを、SalI及びSstIで消化して除去した。
1.0kb断片を単離後、SalI及びSstIで線状化したpIC19R
に連結した。得られたプラスミドをpSW152と命名した。
プラスミドpSW148をHindIII及びSalIで消化して、TPI
1プロモーター、PHO5シグナル配列及びuPA cDNAを含有
する2.2kb断片を単離した。プラスミドpSW152をSalI及
びBalIIで消化して、BAR1第三ドメイン−物質Ｐ融合物
及びTPI1ターミネーターを含有する1.1kb断片を単離し
た。この2.2kb pSW148断片を、HindIII-BamHI切断YEp13
に、３部分連結で連結した。得られたプラスミドをpSW1
63と命名した（第15図）。
実施例14:宿主細胞の形質転換及びウロキナーゼの発現 酵母ベクターYEp13中にTPI1プロモーター、PHO5シグ
ナル配列、uPA cDNA、BAR1第三ドメイン及びTPI1ターミ
ネーターを含有しているプラスミドpSW163により、酵母
株ZY100（MATa ade2-101 leu2-3,112 ura3-52 suc2-Δ9
ga12 pep4:CAT）及びZY200（MATa ade2-101 leu2-3,11
2 ura3-52 suc2-Δ9 ga12 pep4:CAT vpt3）を形質転換
した。ロイシン不存在の合成増殖培地で増殖することの
できる能力について形質転換体を選択した。
pSW163形質転換体からのブタウロキナーゼの発現及び
分泌を、まず形質転換体を30℃で一晩−−Leu6％Ｄ＋0.
1MスクシネートpH5.5〔６％グルコースを含有する−Leu
及び0.1Mスクシネート（オートクレービング前にNaOHで
pH5.5に調整）〕5ml中で増殖させることにより行った。
一晩培養した培養物を、5mlの−Leu6％Ｄ＋0.1Mスクシ
ネートpH5.5で1:1000に希釈し、30℃で37時間増殖させ
た。細胞をペレット化し、上澄み液を傾しゃして保存し
た。uPA活性を、フィブリン溶解アッセイ（実施例16C）
により測定した。この方法を用いて測定したuPAのレベ
ルは、細胞抽出物中で7.2μg/l及びZY200のpSW163形質
転換体からの上澄み液中で38μg/lであった。
実施例15:BAR1分泌シグナルを用いたPDGF BBの発現及び
分泌 A.PDGF配列のクローニング PDGFのＢ鎖をコードしている配列の造成については、
ムレイ（Murray）等により開示されている〔米国特許第
4,766,073号及び第4,769,328号；これらの開示内容は本
発明に用いることができる〕。ムレイ等（米国特許第4,
766,073号）により記載されているように、発現ベクタ
ーpB12（第15図）は、S.セレビシエーTPI1プロモーター
に作用可能に結合させたヒトPDGF B鎖をコードしている
DNA配列、MFα１プレプロ配列及びTPI1ターミネーター
を含有している。又、米国特許第4,766,073号に記載さ
れているように、ベクターpSB1（第15図）は、TPI1プロ
モーター、MFα１プレプロ配列、ｖ−sisコード配列及
びTPI1ターミネーターからなる発現単位を含有してい
る。
pSB1ベクター中のMFα1/v−sis配列をMFα1/B鎖配列
に代って用いた。pSB1発現単位を、EcoRI部位を欠く変
異pBR322プラスミドに挿入した。pKP10（第10図）と命
名した得られたベクターをEcoRI及びXbaIで消化して、M
Fα1/v−sis断片を除去した。次に、pB12 MFα1/B鎖断
片をpKP10発現単位に挿入して、pKP26（第15図）を造成
した。
その後、コドン最適化α因子配列をこの発現単位に導
入した。α因子プレプロ配列及びインシュリン配列（実
施例３）を含有しているEcoRI-xbaI断片を、EcoRI及びx
baIで消化したpUC18〔ヴエイラ及びメッシング（Vieila
and Messing）、メス・エンザイモロジー（Meth.Enzym
ology）、第153巻、３〜11（1987）〕中でクローニング
後、一本鎖鋳型DNAを調製した。次に、この鋳型を２−
プライマー法〔ゾラー及びスミス、DNA、第３巻、479〜
488（1984）〕に準じて、突然変異誘発性オリゴヌクレ
オチドZC862（５′‐CGA ATC TTT TGA GCT CAG AAA CAC
C-3′）を用いて、突然変異誘発した。この突然変異誘
発により、α因子リーダーの３′末端にSatI部位が生成
した。正しく変異したプラスミドを選択し、pKP23と命
名した。リーダー配列を、EcoRI及びSatIで消化してpKP
23から除去し、このリーダー断片をEcoRI＋SacI切断pIC
19H〔マーシュ（Marsh）等、ジーン（Gene）、第32巻、
481〜486（1984）〕中でサブクローニングした。得られ
たプラスミドをpKP24（第15図）と命名した。プラスミ
ドpKP26をEcoRI及びSstIで切断して、α因子配列を除去
した。次に、コドン最適化α因子配列を、EcoRI-SstI断
片としてpKP24から取り出し、線状化したpKP26に接合し
た。得られたベクターをpKP28（第16図）と命名した。
ベクターの造成を容易にするために、次にα因子リー
ダーに導入したSstI部位を除去して野性型コード配列を
回復した。プラスミドpKP28EcoRI及びxbaIで消化し、α
因子−Ｂ鎖融合配列を回収した。この断片をpUC18中で
クローニングし、一本鎖DNAを単離した。鋳型を、２−
プライマー法に準じて、突然変異誘発性オリゴヌクレオ
チドZC1019（５′‐ACC CAA GGA TCT CTT GTC CAA AGA
AAC ACC TTC TTC-3′）を用いて突然変異誘発した。正
しく突然変異誘発したプラスミドをpKP32と命名した。
次に、発現単位全体を第16図に示すようにして再造成
した。プラスミドpKP32をEcoRI及びxbaIで消化し、α因
子−Ｂ−断片を回収した。この断片を、EcoRI及びXbaI
で切断したpKP10に挿入してpKP34を造成した。プラスミ
ドpKP34をClaI及びBamHIで消化し、発現単位を回収し
た。この断片を、ClaI及びBamHIで消化したpMPOT2（酵
母及び細菌複製起点、アンピシリン耐性遺伝子並びにPO
T1選択マーカーを含有する、酵母２ミクロンをベースに
したプラスミド）に挿入してpKP36を造成した。
プラスミドpA7（ムレイ等、米国特許第4,766,073号）
からのコドン最適化PDGF A鎖配列を、Ｂ鎖（第２図）に
関して上述した一連の造成工程に対応する工程により、
コドン最適化α因子リーダーと連結した。pA7A鎖配列を
SstI-xbaI断片として単離し、SstI及びXbaIで切断したp
KP28に挿入してpKP27を造成した。プラスミドpKP27をEc
oRI及びXbaIで消化し、α因子−Ａ鎖断片をpUC118中で
クローニングした。
上記と同様にして、オリゴヌクレオチドZC1018（５′
‐TTC GAT AGA TCT CTT GTC CAA AGA AAC ACC TTC TTC-
3′）を用いて突然変異誘発を行い、SstI部位を除去し
て野性型α因子配列を回復した。正しく突然変異誘発し
たプラスミドをpKP31を命名した。
次に、コドン最適化発現ベクターを造成した。プラス
ミドpKP31をEcoRI及びXbaIで消化し、α因子−Ａ鎖断片
をEcoRI及びXbaIで切断したpKP10に連結した。pKP33
（第17図）と命名した得られたベクターは発現単位全体
を含有していた。プラスミドpKP33をClaI及びBamHIで消
化し、発現単位断片を回収した。この断片をClaI及びBa
mHIで切断したpMPOT2に挿入して、発現ベクターpKP35を
造成した。
PDGF B鎖をコードする配列は、第17図に示すように造
成したプラスミドpKP51に由来するものであった。プラ
スミドpKP32により、E.コリMV1193を形質転換した。一
本鎖鋳型DNAを調製し、鋳型を突然変異誘発性オルゴヌ
クレオチドZC1078（表３）を用いて突然変異誘発した。
ZC1078による鋳型の突然変異誘発により、PDGF B鎖コー
ド配列の５′末端にBamHI制限部位の挿入が生じた。陽
性クローンをプラークハイブリダイゼーション、制限解
析及びジデオキシシークエンシングにより同定した。陽
性クローンをpKP47と命名した。
pKP47に存在するMFα１シグナル配列を合成シグナル
配列で置換した。プラスミドpKP47をEcoRI及びBamHIで
消化して、ヒトＢ鎖配列及びpUC118を含有する断片を単
離した。オリゴヌクレオチドZC1157、ZC1158、ZC1076及
びZC1077（３表）を、アリーリングしたとき、合成シグ
ナル配列をコードするEcoRI-BamHIアダプターをコード
するように設計した。オリゴヌクレオチドZC1158及びZC
1076をキナーゼ処理した。オリゴヌクレオチドZC1158及
びZC1157をアリーリングし、そしてZC1076及びZC1077を
それとは別個に反応させてアニーリングした。pKP47か
らのEcoRI−BamHI断片を、３部分連結で、ZC1158/ZC115
7及びZC1076/ZC1077に連結した。pKP49と命名した得ら
れたプラスミドは、合成シグナル配列、PDGFB鎖配列及
びpUC118ベクター配列を含有していた。
TPI1プロモーター、合成シグナル配列、PDGF B鎖配列
及びTPI1ターミネーターをプラスミドpKP49から造成
後、酵母配列ベクターでサブクローニングした。プラス
ミドpKP34をClaI及びBamHIで消化して、TPI1プロモータ
ー、MFα１シグナル配列、PDGF B鎖配列及びTPI1ターミ
ネーター発現単位を含有する2.3kb断片を単離した。プ
ラスミドpUC12をHindIII及びEcoRIで消化して線状化し
た。オリゴヌクレオチドZC1016及びZC1017（表３）をキ
ナーゼ処理後アリーリングして、ClaI、HindIII、xho
I、AccI、xbaI及びBamHI制限部位を含有するポリリンカ
ーアダプターを生成した。線状ベクターを、リガーゼ処
理により、キナーゼ処理及びアニーリングしたZC1016/Z
C1017アダプターに連結して、pUC12 HindIII及びEcoRI
部位を喪失せしめた。得られたベクターpUC12＊をAccI
及びBamHIにより線状化した。2.3kb発現単位断片を、pU
C12＊にリガーゼ処理により連結した。得られたプラス
ミドをpKP38と命名した。プラスミドpKP38をEcoRI及びx
baIで消化して、TPI1プロモーター、TPI1ターミネータ
ー及びpUC12＊ベクター配列を含有する4.3kb断片を単離
した。プラスミドpKP49をEcoRI及びxbaIで消化して、合
成シグナル配列及びPDGF B鎖配列を含有する0.8kb断片
を単離した。この0.8kb断片をpKP37からの4.3kb断片に
リガーゼにより連結した。得られたプラスミドをpKP51
と命名した。
B.発現ベクターの造成 PDGF B鎖発現を、次に、リーダー及びS.セレビシエー
BAR1遺伝子の第三ドメインコード配列を含有している
分泌シグナルに連結した。その後、BAR1分泌シグナルを
Ｂ鎖コード配列と連結して、発現ベクターpSW304及びpZ
Y76を造成した。
TPI1プロモーター及びBAR1分泌シグナルを含有するプ
ラスミドpSW255をまず造成した。プラスミドpSW195（実
施例５）に存在するBAR1の第三ドメインコード配列を、
α因子のアミノ酸81-85、Lys-Arg開裂部位、５′EcoRI
粘着末端、３′BalII粘着末端及びPDGF B鎖の最初のア
ミノ酸をコードする合成アダプターに融合した。オリゴ
ヌクレオチドZC1135及びZC1136（表３）を、マニアチス
（Maniatis）等（前掲）により記載されているのと実質
的に同様にして、キナーゼ処理及びアニーリングした。
プラスミドpSW195をHindIII及びEcoRIで消化して、TPI1
プロモーター及びBAR1コード配列を含有する1.4kb断片
を単離した。この1.4kb断片を、３部分連結により、ZC1
135/ZC1136アダプター並びにHindIII及びBglIIで消化し
て線状化したpIC19Rに接合した。得られたプラスミドを
pSW255（第18図）と命名した。
プラスミドpKP51に存在するPDGF B鎖配列をTPI1プロ
モーター、BAR1シグナル配列、BAR1第三ドメイン及びZC
1135/ZC1136アダプター（Lys-Arg開裂部位をコードして
いる）に連結して、pSW262（第18図）を造成した。プラ
スミドpKP51をBamHIで消化して、PDGF B鎖コード配列及
びTPI1ターミネーターを含有する1.09kb断片を単離し
た。プラスミドpSW255をSphI及びBglIIで消化して、部
分的TPI1プロモーター、BAR1シグナル配列、BAR1第三ド
メイン及びZC1135/ZC1136アダプターを含有する0.75kb
断片を単離した。これらの２つの断片を、SphI及びBamH
Iで消化して線状化したpUC18に、３部分連結により連結
した。正しい配向で成分断片を含有するプラスミドを同
定し、pSW262と命名した。
次に、ベクターpMPOT2中にTPI1プロモーター、BAR1シ
グナル配列、BAR1第三ドメイン、PDGF B鎖及びTPI1ター
ミネーターを含有する酵母発現ベクターpSW304を、第18
図に示すようにして造成した。プラスミドpKP36をClaI
及びSphIで消化して、TPI1プロモーターの0.76kb5′部
分を単離した。プラスミドpKP36（第16図）もClaI及びB
glIIで消化して、PDGF B鎖配列、TPI1ターミネーター及
びpMPOT2ベクター配列を含有する11kbベクター含有断片
を単離した。プラスミドpSW262をSphI及びBglIIで消化
して、0.75kb部分的TPI1プロモーター、BAR1シグナル配
列、BAR1第三ドメイン及びZC1135/ZC1136を単離した。
３つの断片を、３部分連結により連結し、得られたプラ
スミドをpSW304と命名した。
Ｂ鎖発現単位をベクターpRPOTに挿入することにより
発現ベクターpZY76（第19図）を造成した。pRPOTベクタ
ーは、まずpCPOTの750bp SphI-BamHI断片をpBR322の186
bp SphI-BamHI断片で置換することにより得られるpCPOT
（ATCC 39685）に由来するものである。得られたプラス
ミドpDPOTを、SphI及びBamHIで消化して、10.8kb断片を
単離した。オリゴヌクレオチドZC1551及びZC1552（表
１）をキナーゼ処理及びアニーリングして、SmaI、SstI
及びxhoI制限部位の側面に位置するBamHI粘着末端及びS
phI粘着末端を有するアダプターを形成した。10.8kb pD
POT断片をZC1551/ZC1552アダプターに、連結により再環
状化した。得られたプラスミドをpRPOTと命名した。
TPI1ターミネーターを次のようにしてサブクローニン
グした。プラスミドpSW195（第11図）をBglII及びSmaI
で消化して、TPI1プロモーター、BAR1アミノ末端及び第
三ドメイン、MI−３コード配列及びTPI1ターミネーター
を含有している2.38kb断片を単離した。この2.38kb断片
を、SmaI及びBglIIで消化して線状化したプラスミドpRP
OTに連結した。pSW313と命名した得られたプラスミドを
xbaI及びSphIで消化して、0.76kbTPI1ターミネーター断
片を単離した。この0.76kb断片を、SphI及びxbaIで消化
して線状化したpUC18に連結した。得られたプラスミドp
ZY75と命名した。
次に、プラスミドpZY76を造成した。プラスミドpSW19
5をBglII及びEcoRIで消化して、TPI1プロモーター並び
にBAR1アミノ末端及び第三ドメインを含有する1.4kb断
片を単離した。プラスミドpSW262（第18図）をEcoRI及
びxbaIで消化して、ZC1135/ZC1136アダプター及びPDGF
B鎖コード配列を包含する0.35kb断片を単離した。プラ
スミドpZY75をXbaI及びSphIで消化して、TPI1ターミネ
ーターを含有する0.75kb断片を単離した。これらの３つ
の断片を、BamHI及びSphIで消化して線状化したpRPOT
に、３部分連結により連結した。TPI1プラスミド、BAR1
アミノ末端及び第三ドメイン、PDGFコード配列、TPI1タ
ーミネーター並びにpRPOTベクター配列を含有する得ら
れたプラスミドをpZY76と命名した。
C.BBモホダイマーの発現 pSW304及びpZY76で形質転換した酵母株からのPDGF BB
の発現を、対照プラスミドpB170m（ムレイ等、米国特許
出願第896,485号）及びpKP57（pRPOT中にpKP34発現単位
を含有する）からのPDGFの発現と比較した。プラスミド
pSW304、pZY76、pB170m及びpKP57により、酵母株E18＃
９（MATa leu2-3,112 his4-580 pep4-3 tpi1::LEU2/MAT
α leu2-3,112 pep4-3 tpi1::LEu2）、XB13-4B（MATα
leu2-3,112 ura3 bar1 ga12 tpi1::LEU2）、及びZM114
（MATa ade2-101 leu2-3,112 ura3-52 tpi1::URA3 vpt3
suc2−9 ga12 pep4::tpi::CAT）を、ベッグス（Bagg
s）（ネーチャー、第275巻、104〜108（1978）に記載の
方法と実質的に同様にして形質転換した。
単一コロニーからの形質転換体を醗酵培地（表４）に
接種し、30℃で24時間増殖させた。24時間後、グルコー
スを最終濃度２％となるように培養物に添加し、培養物
を30℃で24時間増殖させた。
表４ 醗酵培地： NZ アミンタイプＡ 20g KH2PO4 7g NH4SO4 6g MgSO4 2g 固体を水に溶解し容積を１リットルとする。25分間オ
ートクレーブ滅菌する。オートクレーブ滅菌後、2ml/l
の微量元素液（下記の処方による）、ビタミン液（下記
の処方による）3ml、2Mコハク酸ナトリウム（pH5.5;最
終モル濃度0.1Mまで）及び50％グルコース（最終濃度２
％まで）を添加する。
微量元素液： ZnSO4 9.45mg Fe2（SO4）3 284.8mg CuSO4・5H2Ｏ 48mg 固体を希釈水に溶解し、最終容積100mlとする。次に
濾過滅菌する。
ビタミン液： リボフラビン 420mg パントテン酸 5.4g ナイアシン 6.1g ピロドキシン 1.4g ビオチン 60mg 葉酸 40mg イノシトール 6.6g チアミン 1.3g 蒸留水に溶解し、最終容積100mlとする。次に濾過滅
菌する。
細胞を遠心分離により培地から除去した。次に、上澄
み液を0.45μｍの濾過器を通して濾過し、細胞又は細胞
片を除去した。ライネス及びロス（Raines and Ross）
〔メス・エンザイモロジー（Meth Enzymology）、第109
巻、749〜773（1985）〕により記載されたようにして、
濾過した培養上澄み液について有系分裂誘発アッセイを
行った。結果（培地1ml当たりのPDGF活性をngで表した
もの）を表５に示す。
形質転換した酵母細胞によって産生されるPDGF類似体
は、一連のクロマトグラフィおよび濃縮工程によって濃
縮された培地上澄液から精製される。培地上澄液はミリ
ポア・ペリカン・カセッツ（Milipore Pellican Casset
tes）（ミリポア（Milipore）、ヘッドフォード、マサ
チューセッツ）を用いて濃縮され、濃縮液はベックマン
（Bekcman）J-6B遠心分離装置（ベックマン・インスツ
ルメンツ・インコーポレーテド（Beckman Instruments,
Inc.）、ブレア、カルフォルニア）で4200rpmで30分間
遠心分離することによってペレット化して濁りを除去す
る。最終濃縮物に10mMになるようにEDTAを加えて、混合
物のpHを5M水酸化ナトリウムで5.5に調整する。次い
で、濃縮液を水で希釈して、導電率を約10ミリモーとす
る。
生成する濃縮液をＳ−セファロース・ファスト・フロ
ー（Sepharose Fast Flow）（ファルマシア（Pharmaci
a）、ピスカタウェイ、ニュー・ジャージー）カラム上
でクトマトグラフィにかける。カラムを20mMリン酸ナト
リウム、0.1M塩化ナトリウム（pH7.3）で洗浄する。次
に、カラムを20mMリン酸ナトリウム、1M塩化ナトリウム
（（pH7.3）で溶出する。溶出液の280nmでの吸収を測定
して、ピーク分画をまとめて保存する。
溶出液を−20℃で凍結した後、融解する。溶出液から
粒状物質を遠心分離によって取り除く。上澄液を集め
て、0.87M酢酸を用いてpHを3.0に調整する。次に、溶出
液をアミコン（Amicon）YM10フィルター（アミコン（Am
icon）、デンバース、マサチューセッツ）を用いて濃縮
する。濃縮溶出液を1M酢酸５倍容を用いて希釈し、塩化
ナトリウム濃度を約0.2Mに低下させる。
次に、溶出液を第二のＳ−セファロース・カラム上で
クロマトグラフィにかける。カラムを1M酢酸で洗浄し、
溶出液の280nmでの吸収を測定して、この吸収がベース
ラインに戻るまで洗浄を続ける。カラムを1M酢酸、1.5M
塩化アンモニウム（pH4.8〜5.0）で溶出する。溶出液の
280nmでの吸収を測定し、PDGFを最後の280nmにおける吸
収ピークとして集める。このピーク分画をプールして、
アミコンYM10フィルターを用いて濃縮する。
次いで、濃縮した溶出液をカラム容積の約１％の試料
容積を用いてセファデックスＧ−50スーパーファイン
（Sephadex G−50 Superfine）（ファルマシア（Pharma
cia）、ピスカタウェイ、ニュー・ジャージー）カラム
にかける。カラムにＭ酢酸アンモニウム（pH9.0）を5cm
/時の流速で流す。SDS−ゲル電気泳動で測定して、最も
純粋な分画をプールして、pHを酢酸で4.0に調整する。
実施例16:分析法の説明 A.MI−３免疫反応物質についてのラジオイノムアッセ
イ。
（実施例９に記載した方法で調製した）培養液上澄液
についてラジオイノムアッセイを行った。試料（50μl/
ウェル）を96ウェルのＶ型底マイクロタイタープレート
（フロー・ラブス（Flow Labs）、マクレーン、バージ
ニア）に加えた。NaFAM〔0.04Mリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.4）100mlに0.6g塩化ナトリウムおよび5.9gウシ血
清アルブミンを溶解し、0.1％ウシ血清アルブミンを含
有せしめ、最終pHを水酸化ナトリウムで7.3に調整した
もの〕中ブタ−インシュリンの希釈液からなる標準試料
をそれぞれのプレートに加えた。それぞれのウェルに50
μｌのモルモットの抗インシュリン抗血清を加えた。ウ
ェル当たり2.5×105cpm/50μｌの125IFab′マウス抗イ
ンシュリンを加えた。この混合物を室温で２時間インキ
ュベーションした。Staph A細胞〔パンソルビン（Panso
rbin）、シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemic
al Co.）、セントルイス、ミズーリー〕をNaFAMで1:10
に希釈し、50μｌをそれぞれのウェルに加え、室温で45
分間インキュベーションした。プレートをベックマンTJ
−６遠心機で４℃で3,000rpmで５分間遠心分離した。上
澄液を捨てて、ウェルをTNEN（50mMトリス塩基、10mMNa
cl、1mMEDTA、0.5％NP40、pH0.8に調整）中１％ウシ血
清アルブミン（BSA）150μｌで２回洗浄した。細胞をTN
EN中１％BSAに再懸濁して、ガンマーカウンターで計数
した。
B.MI−３の高圧液体クロマトグラフィ（HPLC）分析法 表−６ HPLC緩衝液処方 緩衝液A: 56.8g Na2SO4 1800ml HPLC級Ｈ2Ｏ（オムニソルブ（Omnisolv）、
イー・エム・サイエンス（EM Science）、チェリー・ヒ
ルズ、ニュー・ジャージー） 5.4ml Ｈ3PO4（最低85％） エタノールアミンでpHを2.3に調整。4N水酸化ナトリ
ウムでpHを3.6に調整。HPLC級アセトニトリル（アメリ
カン・ブルディック・アンド・ジャックソン・ラボラト
リー（Am.Burdick ＆ Jackson Laboratory）、ムスケゴ
ンミシガン）156gを加える。HPLC級Ｈ2Ｏで容積を２リ
ットル調整。0.45フィルターで濾過。
緩衝液B: 780g HPLC級アセトニトリル 1044g HPLC級Ｈ2Ｏ HPLC分析はビスタ（VISTA）5500HPLC〔バリアン（Var
ian）〕を用いて培地上澄液に就いて行った。（実施例1
0に記載の方法で調製した）上澄液試料を融解し、ミク
ロ遠心機中で室温で１分間遠心分離して、試料から沈澱
物を除去した。MI−３標準試料〔ノボ・インダストリー
・エイ／エス（Novo Industri A/S）、バグスベルト（B
agsvaerd）、デンマークから入手〕2.0、1.0および0.5
μｇを0.025Mギ酸に加えた。それぞれの試料及び標準試
料100μｌを、C18逆相カラム〔リクロプレプ（LiChropr
ep）RP-10（５μｍ）、イー・メルク（E.Merck）、ダル
ムシュタット、西ドイツ〕上に置いた。
カラムに60％緩衝液Ａと40％緩衝液Ｂ（表−４に示し
た処方）からなる等グラディエント（isocratic gradie
nt）を50℃で1ml/分の流速で流し、214nmの検出水準0.0
5AUFS（Absorbance Units Full Scale）を用いた。それ
ぞれの試料を30分間流したところ、MI−３ピークは18分
後に現れた。MI−３物質の定量は試料物質と既知のMI−
３標準試料との比較に基づく。
C.uPA活性についての定量的フィブリン溶解測定 前記実施例に記載されたのと同様に適当に増殖した培
養物を遠心分離して細胞をペレット化した。上澄液を傾
瀉して取り除いた。細胞ペレットを水で１回洗浄し、リ
ン酸緩衝化食塩水（PBS、シグマ・ケミカル・カンパニ
ー）と5mM EDTAとの混合物に再懸濁した。ガラスビーズ
（450〜500μｍ）を総容積の半分になるように加えた。
混合物の全速力での１分間撹拌を３回行い、撹拌の間に
試料を氷冷した。液体をパスツールピペットで試験管か
ら取り出してミクロ遠心機に移した。次いで、溶解産物
をエッペンドルフ・ミクロ遠心機（ブリンクマン（Brin
kman）、ウェストバリー、ニューヨーク）中で最高速度
で15分間４℃で遠心分離した。上澄液を注意深く採取し
て分析した。
フィブリンリ溶解測定はバインダー（Binder）らの方
法（J.Biol.Chem．254,1998,1979）に基づいている。ア
ガロースＢ（ファルマシア）150mgを15mlのフィブリン
プレート緩衝液（１リットル中4.36gトリス−塩基、8.4
8g塩化ナトリウム、15mgCaCl2、200mgNaN3、pH8.4に調
整）に加えた。アガロース混合物を55℃で融解して保持
した。この溶液に、ウシ−トロンビン（500U/ml）を加
えた。フィブリノーゲン（シグマ・ケミカル・カンパニ
ー）をフィブリンプレート緩衝液に溶解し、濾過除菌し
て、次にフィブリンプレート緩衝液で希釈してOD280を
５にした。フィブリノーゲン溶液5mlをアガロース−ト
ロンビン溶液に加えた。混合物をゲルボンド・アガロー
ス・サポート・シート〔エフ・エム・シー・コーポレー
ション（FMC Corp.）、ロックランド、メイン〕に注入
して、放冷した。ウェルをアガロース中で切断し、これ
らのウェルに処理される試料10μｌまたは20μｌを加え
た。結果をヒトウロキナーゼ標準曲線と比較し、ブタウ
ロキナーゼの換算比活性に調整した。ウェルの周りの透
明なハローの出現は生物学的に活性なブタウロキナーゼ
の存在を示す。上記の説明から、本発明の特定の態様を
例示の目的で記載してきたが、各種の改変が本発明の精
神および範囲から離反することなく可能であることが理
解されるであろう。したがって、本発明は特許請求の範
囲による以外は制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
第１−１図〜１−３図は、BARI遺伝子のヌクレオチド配
列および一次翻訳生成物の誘導されたアミノ酸配列を示
す。線より上の数字はヌクレオチド配列に関し；マイナ
スの数字は５′非コード配列を示す。線よりしたの数字
は、アミノ酸配列に関する。推定のシグナルペプチドの
切断部位を矢印で示す。星印は潜在的なグリコシル化部
位を意味する。 第２図は、プラスミドpZV135の造成を示す。 第３図は、プラスミドpGLY2,3の造成を示す。 第４図は、プラスミドpSW22の造成を示す。 第５図は、プラスミドpSW151の造成を示す。 第６図は、発現ベクターpSW152およびpSW200の造成を示
す。 第７図は、プラスミドpSW207の造成を示す。 第８図は、プラスミドpSW84の造成を示す。 第９図は、発現ベクターpSW210の造成を示す。 第10図は、発現ベクターpSW219の造成を示す。 第11図は、発現ベクターpZV187の造成を示す。 第12図は、プラスミドpDR2012の造成を示す。 第13図は、プラスミドpZV125の造成を示す。 第14図は、プラスミドpSW163の造成を示す。 第15図は、プラスミドpKP24およびpKP26の造成を示す。 第16図は、プラスミドpKP36の造成を示す。 第17図は、プラスミドpKP51の造成を示す。 第18図は、発現ベクターpSW304の造成を示す。 第19図は、発現ベクターpZY76の造成を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/72 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (56)参考文献 特開 昭59−51300（ＪＰ，Ａ)

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】シグナルペプチドをコードするDNA配列
    と、これに続くリーディングフレーム内にBAR 1遺伝子
    生成物の部分であって少なくともＣ−末端ドメインの部
    分を含みシグナルペプチドと組合わせて使用された場合
    に異種性蛋白質又はポリペプチドの分泌を指令すること
    ができるもの、及び異種蛋白質又はポリペプチドをコー
    ドする第二のDNA配列に作用可能に連結された転写プロ
    モーターを含んで成るDNA造成物。
  2. 【請求項２】前記Ｃ−末端ドメインの部分が、次のアミ
    ノ酸配列： を有する、請求項１記載のDNA造成物。
  3. 【請求項３】前記Ｃ−末端ドメインの部分が、次のアミ
    ノ酸配列： を有する、請求項１記載のDNA造成物。
  4. 【請求項４】前記異種性蛋白質またはポリペプチドがウ
    ロキナーゼ、インシュリン、血小板由来の成長因子およ
    びそれらの類似体からなる群から選択される蛋白質であ
    る、請求項１記載のDNA造成物。
  5. 【請求項５】前記転写プロモーターがTPI酵素またはADH
    酵素をコードする遺伝子の転写プロモーターである、請
    求項１のDNA造成物。
  6. 【請求項６】前記シグナルペプチドがバリヤーシグナル
    ペプチドまたは酵母抑制酸性ホスファターゼシグナルペ
    プチドである、請求項１記載のDNA造成物。
  7. 【請求項７】前記第二のDNA配列がBAR 1遺伝子生成物の
    Ｃ−末端ドメインの少なくとも一部をコードするセグメ
    ント及びその下流にある異種性蛋白質またはポリペプチ
    ドをコードするセグメントとを含んで成る、請求項１記
    載のDNA造成物。
  8. 【請求項８】前記第二のDNA配列が異種性蛋白質または
    ポリペプチドをコードするセグメント及びその下流にあ
    るBAR 1遺伝子生成物のＣ−末端ドメインの少なくとも
    一部をコードするセグメントを含んで成る、請求項１記
    載のDNA造成物。
  9. 【請求項９】前記第二のDNA配列が異種性蛋白質または
    ポリペプチドをコードするセグメントに隣接して配置さ
    れた開裂部位をコードするセグメントを含んで成る、請
    求項７または８記載のDNA造成物。
  10. 【請求項１０】前記開裂部位が二塩基性開裂部位または
    トロンビン開裂部位である、請求項９記載のDNA造成
    物。
  11. 【請求項１１】前記第二のDNA配列がBAR 1遺伝子生成物
    のアミノ酸468および503の一方若しくは両方において炭
    水化物の付加を妨げるために変異誘発されている請求項
    １記載のDNA造成物。
  12. 【請求項１２】前記第二のDNA配列がアミノ酸468におい
    てグルタミン残基をコードする、請求項11記載のDNA造
    成物。
  13. 【請求項１３】前記第二のDNA配列がアミノ酸503におい
    てグルタミン残基をコードする、請求項11記載のDNA造
    成物。
  14. 【請求項１４】請求項１〜13のいずれか１項記載のDNA
    造成物で形質転換された酵母細胞。
  15. 【請求項１５】請求項１〜13のいずれか１項記載のDNA
    造成物で形質転換された哺乳類細胞。
  16. 【請求項１６】適当な媒質中で請求項１〜13のいずれか
    １項記載のDNA造成物を含有する宿主細胞を増殖させ、 該宿主細胞から蛋白質またはポリペプチド生成物を単離
    することを含んで成る、蛋白質の産生方法。
  17. 【請求項１７】単離工程の後、前記蛋白質生成物を精製
    する、請求項16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】上記宿主細胞が酵母細胞または哺乳類細
    胞である、請求項16に記載の方法。
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