JP2509163B2 - 発現ベクタ−及び該発現ベクタ−を含む酵母細胞 - Google Patents
発現ベクタ−及び該発現ベクタ−を含む酵母細胞Info
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Description
【発明の詳細な説明】 単細胞微生物中で異質すなわち外原性DNAの表現を得
ることができるようになつて関心のある長いポリペプチ
ド鎖を都合よく製造する機会が生じた。ほとんど直ち
に、小ホルモンソマトスタチン（somatostatin）および
インシユリン、インターフエロン、カプシド蛋白質を有
する種々のワクチンなどのようなもつと複雑なポリペプ
チドのような種々のポリペプチドが製造され、文献に報
告された。大体に於て、初期の研究は、科学者がその遺
伝的構造および性質を熟知している大腸菌（E.coli）で
行われた。従つて、初期の注意は、大腸菌（E.cole）中
に於ける異質蛋白質（foreign protein）の製造に向け
られた。一度大腸菌（E.coli）を宿主として使用するこ
とができるようになると、大腸菌（E.coli）を用いる限
界と不利益とが他の宿主の使用を刺激した。
ることができるようになつて関心のある長いポリペプチ
ド鎖を都合よく製造する機会が生じた。ほとんど直ち
に、小ホルモンソマトスタチン（somatostatin）および
インシユリン、インターフエロン、カプシド蛋白質を有
する種々のワクチンなどのようなもつと複雑なポリペプ
チドのような種々のポリペプチドが製造され、文献に報
告された。大体に於て、初期の研究は、科学者がその遺
伝的構造および性質を熟知している大腸菌（E.coli）で
行われた。従つて、初期の注意は、大腸菌（E.cole）中
に於ける異質蛋白質（foreign protein）の製造に向け
られた。一度大腸菌（E.coli）を宿主として使用するこ
とができるようになると、大腸菌（E.coli）を用いる限
界と不利益とが他の宿主の使用を刺激した。
大腸菌（E.coli）の多くの欠点をもたないために特に
魅力的なものとなつた１つの宿主は酵母である。しか
し、酵母は真核生物であり、より不純な遺伝系を有して
いる。さらに、酵母ゲノムについては大腸菌（E.coli）
ほど知られていない。酵母を酵母にとつて異質な蛋白質
の生産のための宿主として用いるためには、数多くの発
見が必要であり、かつ新規物質が入手可能にならねばな
らない。
魅力的なものとなつた１つの宿主は酵母である。しか
し、酵母は真核生物であり、より不純な遺伝系を有して
いる。さらに、酵母ゲノムについては大腸菌（E.coli）
ほど知られていない。酵母を酵母にとつて異質な蛋白質
の生産のための宿主として用いるためには、数多くの発
見が必要であり、かつ新規物質が入手可能にならねばな
らない。
初期には、発現ベクターとして、あるいは酵母染色体
中への組込みによつて酵母に安定性を賦与する複製系が
要求された。さらに、所望の蛋白質の表現を可能にする
ために転写および表現に関する調節機能を開発しなけれ
ばならなかつた。異質DNA配列順序が転写され翻訳され
るかどうか、また、表現されたならば、得られたペプチ
ドが酵母細胞中で生存するかどうかも不確かであつた。
有糸分裂、細胞形成、栄養増殖（vegetative growth）
に及ぼす組換型DNA（RDNA）の影響のような、酵母細胞
の生存能力に及ぼす異質（foreign）蛋白質の影響も決
定しなければならないものとして残された。
中への組込みによつて酵母に安定性を賦与する複製系が
要求された。さらに、所望の蛋白質の表現を可能にする
ために転写および表現に関する調節機能を開発しなけれ
ばならなかつた。異質DNA配列順序が転写され翻訳され
るかどうか、また、表現されたならば、得られたペプチ
ドが酵母細胞中で生存するかどうかも不確かであつた。
有糸分裂、細胞形成、栄養増殖（vegetative growth）
に及ぼす組換型DNA（RDNA）の影響のような、酵母細胞
の生存能力に及ぼす異質（foreign）蛋白質の影響も決
定しなければならないものとして残された。
従つて、関心ある蛋白質の調節された表現ならびにか
かる蛋白質の高度に有効な製造を可能にする、酵母中で
の新規RDNA系の開発にかなりの努力が向けられた。
かる蛋白質の高度に有効な製造を可能にする、酵母中で
の新規RDNA系の開発にかなりの努力が向けられた。
ヒツツエマン（Hitzeman）らはJ.Biol.Chem.,255:120
73-12080（1980）に、酵母３−ホスホグリセリン酸キナ
ーゼ（PGK）遺伝子を有しかつ酵母中で表現することが
できる調節信号を伴うプラスミドを記載している。関連
する他の文献には、クリフトン（Cliftom）らの報文ゲ
モテイツクス（Genetics）、88、1-11（1978）；クラー
クおよびカーボン（Clark and Carbon）の報文セル（Ce
ll）、9、91-99（1978）；トムソン（Tomson）の報文ジ
ーン（Gene）、1、347〜356（1977）；ホランドおよび
ホランド（Holland and Holland）の報文J.Biol.Chem.,
254、5466-5474（1979）；ホランドおよびホランド（Ho
lland and Holland）、の報文J.Biol.Chem.,254、9830-
9845（1979）；ナスミスおよびリード（Nasmyth and Re
ed）の報文Proc.Nat.Acad.Sci.,77、2119-2123（198
0）；ブローチ（Broach）らの報文ジーン（Gene）、8、
121〜133（1979）；ウイリアミソン（Williamson）らの
報文ネーチヤー（Nature）、283、214-216（1980）が含
まれる。
73-12080（1980）に、酵母３−ホスホグリセリン酸キナ
ーゼ（PGK）遺伝子を有しかつ酵母中で表現することが
できる調節信号を伴うプラスミドを記載している。関連
する他の文献には、クリフトン（Cliftom）らの報文ゲ
モテイツクス（Genetics）、88、1-11（1978）；クラー
クおよびカーボン（Clark and Carbon）の報文セル（Ce
ll）、9、91-99（1978）；トムソン（Tomson）の報文ジ
ーン（Gene）、1、347〜356（1977）；ホランドおよび
ホランド（Holland and Holland）の報文J.Biol.Chem.,
254、5466-5474（1979）；ホランドおよびホランド（Ho
lland and Holland）、の報文J.Biol.Chem.,254、9830-
9845（1979）；ナスミスおよびリード（Nasmyth and Re
ed）の報文Proc.Nat.Acad.Sci.,77、2119-2123（198
0）；ブローチ（Broach）らの報文ジーン（Gene）、8、
121〜133（1979）；ウイリアミソン（Williamson）らの
報文ネーチヤー（Nature）、283、214-216（1980）が含
まれる。
本願発明は、酵母プロモーターを使用し、酵母におい
て外来DNAの発現を調節することにより、異種タンパク
質の製造を効果的に行うことを可能にすることを目的と
し、この目的を達成するために、酵母内で複製可能な発
現ベクター、該発現ベクターにより形質転換した酵母、
及び該発現ベクターを使用する方法を提供するものであ
る。したがって、本発明は、酵母内で複製が可能であっ
て、三炭糖燐酸イソメラーゼ又はピルビン酸キナーゼの
転写を制御することができる酵母プロモーターを含み、
該酵母プロモーターによって正規に調節される蛋白質を
表現する遺伝子以外の遺伝子が該酵母プロモーターの下
流に続く発現ベクターを提供する。
て外来DNAの発現を調節することにより、異種タンパク
質の製造を効果的に行うことを可能にすることを目的と
し、この目的を達成するために、酵母内で複製可能な発
現ベクター、該発現ベクターにより形質転換した酵母、
及び該発現ベクターを使用する方法を提供するものであ
る。したがって、本発明は、酵母内で複製が可能であっ
て、三炭糖燐酸イソメラーゼ又はピルビン酸キナーゼの
転写を制御することができる酵母プロモーターを含み、
該酵母プロモーターによって正規に調節される蛋白質を
表現する遺伝子以外の遺伝子が該酵母プロモーターの下
流に続く発現ベクターを提供する。
本発明においては、解糖（glycolytic）経路中で遺伝
子の転写を制御し、かつ酵母にとって異質な（foreig
n）蛋白質の調節された生産に使用することができる酵
母プロモーターを使用する。このうち特に好ましいの
は、三炭糖燐酸イソメラーゼ及びピルビン酸キナーゼに
関連するプロモーターである。プロテアーゼ阻害剤、哺
乳類α−１−アンチトリプシンは、三炭糖燐酸イソメラ
ーゼのためのプロモーターを用いて表現される。なお、
外来又は異質DNAとは、野性型中に天然に存在しない、
特に異種からのDNAであり、通常、宿主と遺伝情報を交
換しないものをいう。解糖経路中に含まれかつ高いレベ
ルの蛋白質生産を与え、その結果、酵母細胞によつて生
産される全蛋白質の実質的な部分が関心ある蛋白質へ捧
げられる新規プロモーターを用いる。その上、解糖酵素
の生産の調節に付随する調節機能が得られるので、所望
の生成物の生産を調節することができる。さらに、表現
の効率および量を増強するため、生存能力のある細胞を
保持することができる。
子の転写を制御し、かつ酵母にとって異質な（foreig
n）蛋白質の調節された生産に使用することができる酵
母プロモーターを使用する。このうち特に好ましいの
は、三炭糖燐酸イソメラーゼ及びピルビン酸キナーゼに
関連するプロモーターである。プロテアーゼ阻害剤、哺
乳類α−１−アンチトリプシンは、三炭糖燐酸イソメラ
ーゼのためのプロモーターを用いて表現される。なお、
外来又は異質DNAとは、野性型中に天然に存在しない、
特に異種からのDNAであり、通常、宿主と遺伝情報を交
換しないものをいう。解糖経路中に含まれかつ高いレベ
ルの蛋白質生産を与え、その結果、酵母細胞によつて生
産される全蛋白質の実質的な部分が関心ある蛋白質へ捧
げられる新規プロモーターを用いる。その上、解糖酵素
の生産の調節に付随する調節機能が得られるので、所望
の生成物の生産を調節することができる。さらに、表現
の効率および量を増強するため、生存能力のある細胞を
保持することができる。
興味あるプロモーターは、特に、三炭糖燐酸イソメラ
ーゼ、及びピルビン酸キナーゼの表現に関連のあるプロ
モーターであり、解糖調節遺伝子GCR1によつて制御され
る。解糖経路の遺伝子には、ヘキソキナーゼ１および２
（HEX1、２）、ホスホグルコースイソメラーゼ（PG
I）、三炭糖燐酸イソメラーゼ（TPI）、ホスホグリセリ
ン酸キナーゼ（PGK）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（G
PM）、ピルビン酸キナーゼ（PYK）、ホスホフルクトキ
ナーゼ（PFK）、エノラーゼ（ENO）、フルクヘース1,6
−二燐酸アルドラーゼ（FDA）、グリセルアルデヒド３
−燐酸デヒドロゲナーゼ（PGK）、解糖調節蛋白質（GC
R）が含まれる。
ーゼ、及びピルビン酸キナーゼの表現に関連のあるプロ
モーターであり、解糖調節遺伝子GCR1によつて制御され
る。解糖経路の遺伝子には、ヘキソキナーゼ１および２
（HEX1、２）、ホスホグルコースイソメラーゼ（PG
I）、三炭糖燐酸イソメラーゼ（TPI）、ホスホグリセリ
ン酸キナーゼ（PGK）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（G
PM）、ピルビン酸キナーゼ（PYK）、ホスホフルクトキ
ナーゼ（PFK）、エノラーゼ（ENO）、フルクヘース1,6
−二燐酸アルドラーゼ（FDA）、グリセルアルデヒド３
−燐酸デヒドロゲナーゼ（PGK）、解糖調節蛋白質（GC
R）が含まれる。
プロモーターは、酵母DNAの大断片を有する遺伝子銀
行を用いることによつて得られる。適当なベクトル、特
に原核生物および酵母のためのレプリコンを有するシヤ
トルベクトル（shuttle vector）中へ断片を導入するこ
とにより、細菌中で酵母DNAを容易に増幅またはクロー
ニングし、かつそのあとで相補性のために突然変異株酵
母細胞中へこの酵母DNAを導入することができる。この
方法で、酵母宿主中で栄養素要求障害または突然変異を
補充する酵素断片を同定することができる。
行を用いることによつて得られる。適当なベクトル、特
に原核生物および酵母のためのレプリコンを有するシヤ
トルベクトル（shuttle vector）中へ断片を導入するこ
とにより、細菌中で酵母DNAを容易に増幅またはクロー
ニングし、かつそのあとで相補性のために突然変異株酵
母細胞中へこの酵母DNAを導入することができる。この
方法で、酵母宿主中で栄養素要求障害または突然変異を
補充する酵素断片を同定することができる。
特に興味のあるものは、宿主が関心のある解糖経路段
階と別個の生化学的経路との両方に於て栄養素要求的で
ある場合であり、ベクトル中のマーカーによつて補充さ
れる場合である。所望の遺伝子を有するDNA分節を一度
確立してしまうと、種々の技術によつて再クローニング
して、DNA分節を短くし、かつ転写および表現のための
その調節信号とともに主として関心のある遺伝子である
分節を与えることができる。
階と別個の生化学的経路との両方に於て栄養素要求的で
ある場合であり、ベクトル中のマーカーによつて補充さ
れる場合である。所望の遺伝子を有するDNA分節を一度
確立してしまうと、種々の技術によつて再クローニング
して、DNA分節を短くし、かつ転写および表現のための
その調節信号とともに主として関心のある遺伝子である
分節を与えることができる。
プロモーターを保持するためには、開始暗号メチオニ
ンを決定し、この暗号を、プロモーターから下流に外来
DNAを導入するための戦略を開発するために用いること
が不可欠である。解糖経路中でプロモーターの調節制御
下にあるように外来DNAを導入するための部位を与える
ために、種種の技術を用いることができる。
ンを決定し、この暗号を、プロモーターから下流に外来
DNAを導入するための戦略を開発するために用いること
が不可欠である。解糖経路中でプロモーターの調節制御
下にあるように外来DNAを導入するための部位を与える
ために、種種の技術を用いることができる。
制限部位が、都合よくイニシエーターメチオニンコー
ドンに隣接している場合には、解糖遺伝子（glycolytic
gene）をその部位で分裂させ、DNAをBal 31で種々の時
間かみもどして、イニシエーターメチオニンコードン中
へまたは過ぎて噛むようにしあるいは開始暗号メチオニ
ンを保持するようにすることができる。
ドンに隣接している場合には、解糖遺伝子（glycolytic
gene）をその部位で分裂させ、DNAをBal 31で種々の時
間かみもどして、イニシエーターメチオニンコードン中
へまたは過ぎて噛むようにしあるいは開始暗号メチオニ
ンを保持するようにすることができる。
都合のよい制限部位が無い場合には、プライマー修復
のような他の接合（splicing）技術を用いることができ
る。生体外の突然変異誘発を用いることによつても、所
望の蛋白質の最初のアミノ酸のための暗号となる制限部
位をイニシエーターメチオニンの隣りに導入することが
できる。おのおのの場合に、解糖生成物のためのインタ
クト（intact）プロモーターを有しかつインタクトレプ
リコン、１個以上のマーカーなどのような他のDNA配列
順序を通常含む線形化DNA分節が得られる。
のような他の接合（splicing）技術を用いることができ
る。生体外の突然変異誘発を用いることによつても、所
望の蛋白質の最初のアミノ酸のための暗号となる制限部
位をイニシエーターメチオニンの隣りに導入することが
できる。おのおのの場合に、解糖生成物のためのインタ
クト（intact）プロモーターを有しかつインタクトレプ
リコン、１個以上のマーカーなどのような他のDNA配列
順序を通常含む線形化DNA分節が得られる。
上記の方法の代表例は、TPI１遺伝子のためのプロモ
ーターを有するベクトルの開発である。pBR322および酵
母の２μ−プラスミドからのレプリコンまたは複製系を
有する代表的ベクトルCV13ならびにLEU２遺伝子が、TPI
１遺伝子を有することが示された酵母断片の挿入のため
に用いられた。これは、leu -、tpi -である突然変異体酵
母との二重選択を用いることによつて達成された。TPI
１遺伝子は独特のKpn I部位を有することがわかつた。
そのベクトルをKpn I部位で分裂させた後、二重ストラ
ンドエクソヌクレアーゼ（exonuclease）Bal 31で種々
の時間処理してそのDNAをf-metコードンにチユーバツク
（chew back）した。次に所望の制限部位を与えるリン
カーを挿入した。次に、開始のための適当な位置にf-me
tコードンを有する配列順序を与える外来DNAを挿入する
ことができた。別法では、異質DNAを、TPI１遺伝子のf-
metコードンを用いて表現することができる。
ーターを有するベクトルの開発である。pBR322および酵
母の２μ−プラスミドからのレプリコンまたは複製系を
有する代表的ベクトルCV13ならびにLEU２遺伝子が、TPI
１遺伝子を有することが示された酵母断片の挿入のため
に用いられた。これは、leu -、tpi -である突然変異体酵
母との二重選択を用いることによつて達成された。TPI
１遺伝子は独特のKpn I部位を有することがわかつた。
そのベクトルをKpn I部位で分裂させた後、二重ストラ
ンドエクソヌクレアーゼ（exonuclease）Bal 31で種々
の時間処理してそのDNAをf-metコードンにチユーバツク
（chew back）した。次に所望の制限部位を与えるリン
カーを挿入した。次に、開始のための適当な位置にf-me
tコードンを有する配列順序を与える外来DNAを挿入する
ことができた。別法では、異質DNAを、TPI１遺伝子のf-
metコードンを用いて表現することができる。
他の被験体解糖遺伝子については、これらの遺伝子に
関連するプロモーターを与えるために、同様な方法を行
うことができる。PYK配列順序は制限のための都合のよ
いXbal部位を有し、この場合には、所要ならば、Bal 31
を短時間用いて２、３の付加的塩基を除去して、メチオ
ニンコードンへまたはコードン中へチユー（chew）する
ことができる。特に関心のあることは、解糖経路中に含
まれる他の遺伝子の表現を制御するためにGCRプロモー
ターを使用することである。外来DNAの表現を調節する
他の解糖プロモーターと共にGCR遺伝子を用いることに
より、他のプロモーターをターンオンおよびターンオフ
して外来DNAの表現を調節することができる。かくし
て、所望の細胞密度に達するまで栄養増殖を進行させた
後に、所望のポリペプチドの生産を行うことができる。
関連するプロモーターを与えるために、同様な方法を行
うことができる。PYK配列順序は制限のための都合のよ
いXbal部位を有し、この場合には、所要ならば、Bal 31
を短時間用いて２、３の付加的塩基を除去して、メチオ
ニンコードンへまたはコードン中へチユー（chew）する
ことができる。特に関心のあることは、解糖経路中に含
まれる他の遺伝子の表現を制御するためにGCRプロモー
ターを使用することである。外来DNAの表現を調節する
他の解糖プロモーターと共にGCR遺伝子を用いることに
より、他のプロモーターをターンオンおよびターンオフ
して外来DNAの表現を調節することができる。かくし
て、所望の細胞密度に達するまで栄養増殖を進行させた
後に、所望のポリペプチドの生産を行うことができる。
適当な栄養素要求体を用いることにより、適当な栄養
培地を選んで関心のあるポリペプチドの表現をさらに調
節することができる。選ばれたプロモーターが代謝妨害
のため、特別な栄養素で抑制される場合、栄養素の性質
を変化させることによつて表現を誘起することができ
る。さらに、GCR遺伝子またはその他の調節的制御によ
つて表現を抑制または活性化することにより、解糖経路
中の多数のプロモーターの活性に影響を与えることがで
きる。また、GCR調節信号を用いてGCRの表現の調節剤と
して働くポリペプチドを滴定することもできる。コピー
番号を制御することができるベクトルをもつことによ
り、野性型GCR遺伝子の活性を変化させることができ
る。
培地を選んで関心のあるポリペプチドの表現をさらに調
節することができる。選ばれたプロモーターが代謝妨害
のため、特別な栄養素で抑制される場合、栄養素の性質
を変化させることによつて表現を誘起することができ
る。さらに、GCR遺伝子またはその他の調節的制御によ
つて表現を抑制または活性化することにより、解糖経路
中の多数のプロモーターの活性に影響を与えることがで
きる。また、GCR調節信号を用いてGCRの表現の調節剤と
して働くポリペプチドを滴定することもできる。コピー
番号を制御することができるベクトルをもつことによ
り、野性型GCR遺伝子の活性を変化させることができ
る。
表現を得るため、異なる機能を限定する多数の配列順
序を有する発現ベクター構造物が製造される。１つの機
能は複製系であり、ベクトルの部分を形成する。もう１
つの機能は、それ自体、あるいは外来DNAと共にプロモ
ーターである。その他の機能には、表現のイニシエータ
ーおよびターミネーターが含まれる。選択マーカーもあ
る。
序を有する発現ベクター構造物が製造される。１つの機
能は複製系であり、ベクトルの部分を形成する。もう１
つの機能は、それ自体、あるいは外来DNAと共にプロモ
ーターである。その他の機能には、表現のイニシエータ
ーおよびターミネーターが含まれる。選択マーカーもあ
る。
適当なベクトルの開発には、どうしても必要というわ
けではないが、ベクトルは通常、酵母のための複製系と
原核生物のための複製系〔シヤトルベクトル（shuttle
vector）〕の両方を有する。酵母のための複製系は、発
現ベクターの安定な保持を与える系であつてもよく、あ
るいは宿主中でのDNAの十分な寿命を与える系であつて
もよく、宿主中へのDNAの組込みの受容できる確率があ
る系である。宿主に相同の配列順序を与えて組換を与え
るようにすることにより、組込みが非常に助けられる。
一般に相同配列順序は、少なくとも約800bpであり、通
常約2000bp以下である。従つて、ARS１遺伝子の使用の
ような、組込みまたは自律複製系を用いて、酵母宿主中
に於ける外来DNAの保持を与えることができる。選ばれ
る複製系は、通常１より大きく、好ましくは５より大き
い合理的なコピー数を与えねばならない。pBR322、pACY
C184、pSC101、pMB9などのような多種の原核生物に対し
て多種の複製系が有効である。別法では、DNA構造物の
１つ以上のコピーを宿主染色体中へ組込むことができ
る。複製系は、条件的に調節することもでき、通常、温
度を変えることによつて複製をターンオンおよびターン
オフすることができるように感温的に調節することがで
きる。
けではないが、ベクトルは通常、酵母のための複製系と
原核生物のための複製系〔シヤトルベクトル（shuttle
vector）〕の両方を有する。酵母のための複製系は、発
現ベクターの安定な保持を与える系であつてもよく、あ
るいは宿主中でのDNAの十分な寿命を与える系であつて
もよく、宿主中へのDNAの組込みの受容できる確率があ
る系である。宿主に相同の配列順序を与えて組換を与え
るようにすることにより、組込みが非常に助けられる。
一般に相同配列順序は、少なくとも約800bpであり、通
常約2000bp以下である。従つて、ARS１遺伝子の使用の
ような、組込みまたは自律複製系を用いて、酵母宿主中
に於ける外来DNAの保持を与えることができる。選ばれ
る複製系は、通常１より大きく、好ましくは５より大き
い合理的なコピー数を与えねばならない。pBR322、pACY
C184、pSC101、pMB9などのような多種の原核生物に対し
て多種の複製系が有効である。別法では、DNA構造物の
１つ以上のコピーを宿主染色体中へ組込むことができ
る。複製系は、条件的に調節することもでき、通常、温
度を変えることによつて複製をターンオンおよびターン
オフすることができるように感温的に調節することがで
きる。
複製系に加えて、１個以上の選択可能をマーカーもあ
り、通常、マーカーとして働くことができる外来DNAに
加えて少なくとも１個のマーカーがある。通常のマーカ
ーには、抗生物質抵抗性を与える殺菌性マーカーと、毒
素および重金属に対して抵抗性を与えるマーカーとが含
まれる。栄養素要求宿主を用いかつ相補性による原栄養
を与えることも有用である。すぐ上で述べた通常の選択
系に加えて、本発明の解糖性遺伝子は、適当な突然変異
宿主株に於て、糖を選択的基質として用いる選択を与え
ることができるので特に望ましいマーカーである。
り、通常、マーカーとして働くことができる外来DNAに
加えて少なくとも１個のマーカーがある。通常のマーカ
ーには、抗生物質抵抗性を与える殺菌性マーカーと、毒
素および重金属に対して抵抗性を与えるマーカーとが含
まれる。栄養素要求宿主を用いかつ相補性による原栄養
を与えることも有用である。すぐ上で述べた通常の選択
系に加えて、本発明の解糖性遺伝子は、適当な突然変異
宿主株に於て、糖を選択的基質として用いる選択を与え
ることができるので特に望ましいマーカーである。
他の遺伝子も、種々の目的のために発現ベクター中へ
挿入することができる。宿主のゲノム中への組込みが望
ましい場合、宿主ゲノムの特別な領域の相同配列順序を
発現ベクター中に含むことができる。１つ以上の配列順
序の増幅が望ましい場合には、メトトレキセートストレ
ス（methotrexatestress）に感応するジヒドロ葉酸レダ
クターゼ遺伝子または重金属ストレスに感応するメタロ
チオネイン（metallothionein）遺伝子のようなかかる
増幅を与えることが知られている遺伝子を、反復される
べきDNA領域が片側にある発現ベクター中に含むことが
できる。動原体、自律複製分節などのような他の調節信
号をも含むことができる。
挿入することができる。宿主のゲノム中への組込みが望
ましい場合、宿主ゲノムの特別な領域の相同配列順序を
発現ベクター中に含むことができる。１つ以上の配列順
序の増幅が望ましい場合には、メトトレキセートストレ
ス（methotrexatestress）に感応するジヒドロ葉酸レダ
クターゼ遺伝子または重金属ストレスに感応するメタロ
チオネイン（metallothionein）遺伝子のようなかかる
増幅を与えることが知られている遺伝子を、反復される
べきDNA領域が片側にある発現ベクター中に含むことが
できる。動原体、自律複製分節などのような他の調節信
号をも含むことができる。
問題のプロモーターを単離するために、酵母ゲノムの
ランダム消化（random digestion）または機械的剪断に
より、酵母染色体DNAでクローンを作ることができる。
次に、所望の遺伝子の存在は、相補性のための栄養素要
求宿主中へ酵母断片の均一クローンを導入することによ
つて決定される。望ましくは、クローニング伝播体は、
選択のための付加的基礎を可能にして二重選択技術を使
用することができるようにするもう１つの遺伝子を有す
ることができる。突然変異株は、限定された栄養培地で
は実質的に増殖することができないので、培地の選択に
よつて所望の解糖性遺伝子の存在のために選択すること
ができる。所望の遺伝子を有する酵母断片を隔離した
後、その断片をサブクローニングして（subcloned）余
分なDNAフランキング（flanking）領域を除きかつより
容易に取扱われる断片を与えることができる。サイズが
約500塩基対より少ない、所望遺伝子を含むより小さい
断片を、次に、さらにクローニングし、制限地図作成し
かつ配列順序をきめて、有用な所望のプロモーター源お
よび外来DNAの挿入を与えるようにすることができる。
また、上記したように、プロモーター自体も、酵母宿主
中に於ける特別な酵素の生産を変えたい場合、リプレツ
サー（repressor）またはアクチベーター（activator）
のためのタイトレーター（titrator）として作用して、
有用であることができる。外来DNAは、天然産でも合成
でもよく、また原核生物でも真核生物のものでもよく、
どんなDNA源からのものでもよい。特に興味あるもの
は、ポリ（アミノ酸）すなわち生理活性を有するポリペ
プチドまたは蛋白質を表現する哺乳類遺伝子である。酵
母中で生成されたポリ（アミノ酸）は、種々の程度に、
グリコシル化（glycosylation）を修飾することがで
き、この場合、グリコシル化は起こらなくてもよく、ま
たは天然産哺乳類ポリペプチドから異なる部位で起こつ
てもよく、かつ（あるいは）種々の糖類で種々の度合に
起こることができる。従つて、大きな関心事は、グリコ
シル化の度合および方法によつて天然産ポリペプチドと
異なり、かつ多くの場合に、アミノ酸配列順序に関して
１つ以上の方法で異なる可能性があり、その場合、１種
以上のアミノ酸が欠けるかあるいは１種以上のアミノ酸
が置換されることができるポリペプチドの製造が可能だ
ということである。哺乳類遺伝子は、家畜（例えば牛、
豚、羊、馬）および霊長類、例えばヒトおよび猿のよう
な多種の哺乳類源からのものでよい。
ランダム消化（random digestion）または機械的剪断に
より、酵母染色体DNAでクローンを作ることができる。
次に、所望の遺伝子の存在は、相補性のための栄養素要
求宿主中へ酵母断片の均一クローンを導入することによ
つて決定される。望ましくは、クローニング伝播体は、
選択のための付加的基礎を可能にして二重選択技術を使
用することができるようにするもう１つの遺伝子を有す
ることができる。突然変異株は、限定された栄養培地で
は実質的に増殖することができないので、培地の選択に
よつて所望の解糖性遺伝子の存在のために選択すること
ができる。所望の遺伝子を有する酵母断片を隔離した
後、その断片をサブクローニングして（subcloned）余
分なDNAフランキング（flanking）領域を除きかつより
容易に取扱われる断片を与えることができる。サイズが
約500塩基対より少ない、所望遺伝子を含むより小さい
断片を、次に、さらにクローニングし、制限地図作成し
かつ配列順序をきめて、有用な所望のプロモーター源お
よび外来DNAの挿入を与えるようにすることができる。
また、上記したように、プロモーター自体も、酵母宿主
中に於ける特別な酵素の生産を変えたい場合、リプレツ
サー（repressor）またはアクチベーター（activator）
のためのタイトレーター（titrator）として作用して、
有用であることができる。外来DNAは、天然産でも合成
でもよく、また原核生物でも真核生物のものでもよく、
どんなDNA源からのものでもよい。特に興味あるもの
は、ポリ（アミノ酸）すなわち生理活性を有するポリペ
プチドまたは蛋白質を表現する哺乳類遺伝子である。酵
母中で生成されたポリ（アミノ酸）は、種々の程度に、
グリコシル化（glycosylation）を修飾することがで
き、この場合、グリコシル化は起こらなくてもよく、ま
たは天然産哺乳類ポリペプチドから異なる部位で起こつ
てもよく、かつ（あるいは）種々の糖類で種々の度合に
起こることができる。従つて、大きな関心事は、グリコ
シル化の度合および方法によつて天然産ポリペプチドと
異なり、かつ多くの場合に、アミノ酸配列順序に関して
１つ以上の方法で異なる可能性があり、その場合、１種
以上のアミノ酸が欠けるかあるいは１種以上のアミノ酸
が置換されることができるポリペプチドの製造が可能だ
ということである。哺乳類遺伝子は、家畜（例えば牛、
豚、羊、馬）および霊長類、例えばヒトおよび猿のよう
な多種の哺乳類源からのものでよい。
活性ポリペプチド組成物の製造に於ける主題プロモー
ターの使用の代表例として、ならびに種々の目的のため
に特に関心のあるものとして、プロテアーゼ−阻害剤を
記載しかつ製造する。このプロテアーゼ阻害剤は、ヒト
のα−１−アンチトリプシンと同じまたはほとんど同じ
アミノ酸配列順序を有しており、多数の蛋白質分解酵素
を阻害する能力がある。ヒトのα−１−アンチトリプシ
ン遺伝子は、ヒト遺伝子中の9.6kb Eco RI DNA断片中に
存在するようである。成熟したmRNAは約1400個のヌクレ
オチドを有するようである。１個のヒトα−１−アンチ
トリプシンcDNAは第1B図に示した配列順序を有する。ヒ
トα−１−アンチトリプシンの優勢形は第1A図に示して
ある。他の天然に存在する形（多形）も知られている。
ターの使用の代表例として、ならびに種々の目的のため
に特に関心のあるものとして、プロテアーゼ−阻害剤を
記載しかつ製造する。このプロテアーゼ阻害剤は、ヒト
のα−１−アンチトリプシンと同じまたはほとんど同じ
アミノ酸配列順序を有しており、多数の蛋白質分解酵素
を阻害する能力がある。ヒトのα−１−アンチトリプシ
ン遺伝子は、ヒト遺伝子中の9.6kb Eco RI DNA断片中に
存在するようである。成熟したmRNAは約1400個のヌクレ
オチドを有するようである。１個のヒトα−１−アンチ
トリプシンcDNAは第1B図に示した配列順序を有する。ヒ
トα−１−アンチトリプシンの優勢形は第1A図に示して
ある。他の天然に存在する形（多形）も知られている。
α−アンチトリプシンの染色体DNA暗号の配列順序は
クラチ（Kurachi）らによつてProc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.,78、6826-6830（1981）に、およびチヤンドラ（Chan
dra）らによつてBiochem.Biophys.Res.Comm.103、751-7
58（1981）に記載されており、これらの記載は参照文と
して本明細書に含まれるものとする。α−１−アンチト
リプシンのための霊長類遺伝子は上記チヤンドラ（Chan
dra）らの文献中に記載されているDNAクローニング方法
で得られる。DNA雑種形成プローブとしてひひの配列順
序を用いることによつてヒトcDNAライブラリーから隔離
された、ヒトα−１−アンチトリプシンの優勢形のため
の遺伝子暗号を第1A図に示す。
クラチ（Kurachi）らによつてProc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.,78、6826-6830（1981）に、およびチヤンドラ（Chan
dra）らによつてBiochem.Biophys.Res.Comm.103、751-7
58（1981）に記載されており、これらの記載は参照文と
して本明細書に含まれるものとする。α−１−アンチト
リプシンのための霊長類遺伝子は上記チヤンドラ（Chan
dra）らの文献中に記載されているDNAクローニング方法
で得られる。DNA雑種形成プローブとしてひひの配列順
序を用いることによつてヒトcDNAライブラリーから隔離
された、ヒトα−１−アンチトリプシンの優勢形のため
の遺伝子暗号を第1A図に示す。
ヒトα−１−アンチトリプシンは、成熟プロテインか
ら１個のグルタミン酸の情報を除去することによる遺伝
子の切断を可能にするBamHI制限部位を有する。解糖性
プロモーターの隣りに、このプロモーターの調節下にあ
るようにヒトα−１−アンチトリプシン遺伝子を導入す
るために種々のスキーム（shemes）を用いることができ
る。プロモーターがf-metコードンの近くに都合のよい
制限部位をもたない場合には、解糖性遺伝子をBal 31で
分裂させかつプロモーターにチユーバツク（chewed bac
k）することができる。次に、プロモーターから下流に
リンカーを導入して、ヒトα−１−アンチトリプシン遺
伝子へ接合するための便利な相補末端またはフラツシユ
末端を与えることができる。リンカーは、α−１−アン
チトリプシン遺伝子のＮ−末端に於けるアミノ酸のため
の１つ以上のコードンを与えることもでき、このアミノ
酸は天然産アミノ酸と同じであつても異つていてもよ
い。
ら１個のグルタミン酸の情報を除去することによる遺伝
子の切断を可能にするBamHI制限部位を有する。解糖性
プロモーターの隣りに、このプロモーターの調節下にあ
るようにヒトα−１−アンチトリプシン遺伝子を導入す
るために種々のスキーム（shemes）を用いることができ
る。プロモーターがf-metコードンの近くに都合のよい
制限部位をもたない場合には、解糖性遺伝子をBal 31で
分裂させかつプロモーターにチユーバツク（chewed bac
k）することができる。次に、プロモーターから下流に
リンカーを導入して、ヒトα−１−アンチトリプシン遺
伝子へ接合するための便利な相補末端またはフラツシユ
末端を与えることができる。リンカーは、α−１−アン
チトリプシン遺伝子のＮ−末端に於けるアミノ酸のため
の１つ以上のコードンを与えることもでき、このアミノ
酸は天然産アミノ酸と同じであつても異つていてもよ
い。
ヒトα−１−アンチトリプシンのための遺伝子を、次
に、f-metコードンがヒトα−１−アンチトリプシンの
表現の開始のために与えられる解糖性プロモーターから
下流の発現ベクター中へ導入することができる。
に、f-metコードンがヒトα−１−アンチトリプシンの
表現の開始のために与えられる解糖性プロモーターから
下流の発現ベクター中へ導入することができる。
例えば、シヤトルプラスミドプラスミドCV13のBamHI
に挿入された三炭糖燐酸イソメラーゼ（TPI）のための
酵母プロモーターを含むCTEA32（第２図）のような発現
ベクトル中へ、α−１−アンチトリプシン（以下“AT"
と称す）のためのcDNA暗号を挿入することができる。
〔J.R.ブローチ、J.N.ストラサーン、J.B.ヒツクス（Br
oach J.R.,Strathern J.N.,Hicks J.B.,ジーン（Gen
e）、8、121-133（1979）〕。TPI暗号領域内のKpnＩ制
限部位からBAL31消化によつてTPI構造配列順序を除いた
後、TPIプロモーター中へ合成DNAアダプターを結紮し
た。〔アルバー（Alber）ら、J.Molec.Applied Genet.,
1、419-434（1982）〕。このアダプターは、翻訳開始と
それに続く配列順序GAGGATCCのためのATGコードンを含
んでいた。GAGコードンは、天然産ヒトATの第１アミノ
酸であるグルタミン酸残基を指定する。アダプターのGG
ATCC部分は、Bam HIエンドヌクレアーゼのための切断部
位であり、ヒトAT DNA配列順序の残りのこのベクトル中
へ接合を可能にする。
に挿入された三炭糖燐酸イソメラーゼ（TPI）のための
酵母プロモーターを含むCTEA32（第２図）のような発現
ベクトル中へ、α−１−アンチトリプシン（以下“AT"
と称す）のためのcDNA暗号を挿入することができる。
〔J.R.ブローチ、J.N.ストラサーン、J.B.ヒツクス（Br
oach J.R.,Strathern J.N.,Hicks J.B.,ジーン（Gen
e）、8、121-133（1979）〕。TPI暗号領域内のKpnＩ制
限部位からBAL31消化によつてTPI構造配列順序を除いた
後、TPIプロモーター中へ合成DNAアダプターを結紮し
た。〔アルバー（Alber）ら、J.Molec.Applied Genet.,
1、419-434（1982）〕。このアダプターは、翻訳開始と
それに続く配列順序GAGGATCCのためのATGコードンを含
んでいた。GAGコードンは、天然産ヒトATの第１アミノ
酸であるグルタミン酸残基を指定する。アダプターのGG
ATCC部分は、Bam HIエンドヌクレアーゼのための切断部
位であり、ヒトAT DNA配列順序の残りのこのベクトル中
へ接合を可能にする。
CTEA32のBam HI部位は、AT構造異分子の残りと“イン
フレーム（in frame）”であるように構成されており、
それによつて、クローニングされたcDNAからのBam HI断
片を適当にCTEA32中へ挿入するときポリペプチドの表現
を可能にした。CTEA32＋AT遺伝子からなるプラスミツド
をCAT1と呼ぶ（第２図）。
フレーム（in frame）”であるように構成されており、
それによつて、クローニングされたcDNAからのBam HI断
片を適当にCTEA32中へ挿入するときポリペプチドの表現
を可能にした。CTEA32＋AT遺伝子からなるプラスミツド
をCAT1と呼ぶ（第２図）。
酵母三炭糖燐酸イソメラーゼ（TPI）プロモーター断
片に対して下流に位置するヒトATのための遺伝子を含む
このDNA構造物は酵母株N501-BおよびGK100に形質転換さ
れた。酵母への形質転換は、ベツグズ（Beggs）によつ
てネーチヤー（Nature）、275、104-109（1978）に記載
されている。免疫学的試験（α−１−アンチトリプシン
に対する抗体を用いる競合試験およびELISA試験）によ
る形質転換酵母株のスクリーニングにより、プラスミツ
ドCAT1から作つた酵母中に多量のヒトATが存在すること
を確認した。“野性型”酵母株N501-1B〔カワサキ（Kaw
asaki）らによつてBiochem.Biophys.Res.Comm.,108,110
7-1112（1982）に記載されている〕は、CAT1で形質転換
されるとき、６％グルコースを有する合成最小培地〔改
良ウイツカーハム（Wickerham′ｓ）培地〕で30℃に於
て増殖させるとき、可溶性蛋白質1g当たり1.8mgのα−
１−アンチトリプシン（すなわち0.18％のα−１−アン
チトリプシン）を生成した。突然変異酵母株GK100は、C
AT1で形質転換されるとき、同一増殖条件下で、可溶性
蛋白質1g当たり10〜15mgのα−１−アンチトリプシン
（すなわち１〜1.5％α−１−アンチトリプシン）を生
成した。株N501-1BおよびGK100のおのおのは、おのおの
が機能性LEU２遺伝子を含むCV13およびCV13誘導プラス
ミツド（CAT1のような）の最小および無ロイシン培地で
の選択的維持を可能にする欠損LEU２をもつている。対
照としてCV13のみを有する最小培地で増殖させるとき、
N501-1BとGK100とは検知できるATを生成しない。かくし
て、ATは、CAT1プラスミツドによつて特異的に生成され
る。
片に対して下流に位置するヒトATのための遺伝子を含む
このDNA構造物は酵母株N501-BおよびGK100に形質転換さ
れた。酵母への形質転換は、ベツグズ（Beggs）によつ
てネーチヤー（Nature）、275、104-109（1978）に記載
されている。免疫学的試験（α−１−アンチトリプシン
に対する抗体を用いる競合試験およびELISA試験）によ
る形質転換酵母株のスクリーニングにより、プラスミツ
ドCAT1から作つた酵母中に多量のヒトATが存在すること
を確認した。“野性型”酵母株N501-1B〔カワサキ（Kaw
asaki）らによつてBiochem.Biophys.Res.Comm.,108,110
7-1112（1982）に記載されている〕は、CAT1で形質転換
されるとき、６％グルコースを有する合成最小培地〔改
良ウイツカーハム（Wickerham′ｓ）培地〕で30℃に於
て増殖させるとき、可溶性蛋白質1g当たり1.8mgのα−
１−アンチトリプシン（すなわち0.18％のα−１−アン
チトリプシン）を生成した。突然変異酵母株GK100は、C
AT1で形質転換されるとき、同一増殖条件下で、可溶性
蛋白質1g当たり10〜15mgのα−１−アンチトリプシン
（すなわち１〜1.5％α−１−アンチトリプシン）を生
成した。株N501-1BおよびGK100のおのおのは、おのおの
が機能性LEU２遺伝子を含むCV13およびCV13誘導プラス
ミツド（CAT1のような）の最小および無ロイシン培地で
の選択的維持を可能にする欠損LEU２をもつている。対
照としてCV13のみを有する最小培地で増殖させるとき、
N501-1BとGK100とは検知できるATを生成しない。かくし
て、ATは、CAT1プラスミツドによつて特異的に生成され
る。
GK100は、N501-1Bより顕著に多量にATを生成するので
好ましい。しかし、本発明は、GK100によるAT生成に限
定されるものではない。ATの高生成に導くGK100に於け
る突然変異の利用が望ましい。
好ましい。しかし、本発明は、GK100によるAT生成に限
定されるものではない。ATの高生成に導くGK100に於け
る突然変異の利用が望ましい。
CNBr活性化セフアロースにヒトATに対する親和性精製
羊抗体を共有結合させることによつてJ.Biol.Chem.,24
5,3059（1970）に記載のP.クアトレカサス（Cuatrecasa
s,P.）方法に従つて作つた免疫吸着カラムを調製した。
破壊したGK100酵母細胞を、0.5M NaClを含むpH7.2の燐
酸塩緩衝食塩水３容で抽出し、抽出液をカラムにかけ
た。酵母が生産したヒトAT（0.5〜1.0mg）を、3M NaSCN
でカラムから溶出した。溶出物を透析して塩を除去した
後、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でポリアクリルア
ミドゲルで電気泳動によつて分析した。結果は第３図に
示してある。ゲル中の蛋白質の相対的移動に基づいて、
酵母中で生成したヒトα−１−アンチトリプシンのおよ
その分子量は42,000〜43,000ダルトンである。天然産の
ヒトATは、約54,000ダルトンの分子量を有し、ホツジス
（Hodges）らによつてJ.Biol.Chem.,254,8208〜8212（1
979）に示されたように、約16％の炭水化物組成物を有
する。従つて、酵母が生産したATは、グリコシル化され
ていないかあるいは実質的にグリコシル化されておらず
かつ天然産蛋白質中に存在する炭水化物部分が欠けてい
るものと思われる。
羊抗体を共有結合させることによつてJ.Biol.Chem.,24
5,3059（1970）に記載のP.クアトレカサス（Cuatrecasa
s,P.）方法に従つて作つた免疫吸着カラムを調製した。
破壊したGK100酵母細胞を、0.5M NaClを含むpH7.2の燐
酸塩緩衝食塩水３容で抽出し、抽出液をカラムにかけ
た。酵母が生産したヒトAT（0.5〜1.0mg）を、3M NaSCN
でカラムから溶出した。溶出物を透析して塩を除去した
後、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でポリアクリルア
ミドゲルで電気泳動によつて分析した。結果は第３図に
示してある。ゲル中の蛋白質の相対的移動に基づいて、
酵母中で生成したヒトα−１−アンチトリプシンのおよ
その分子量は42,000〜43,000ダルトンである。天然産の
ヒトATは、約54,000ダルトンの分子量を有し、ホツジス
（Hodges）らによつてJ.Biol.Chem.,254,8208〜8212（1
979）に示されたように、約16％の炭水化物組成物を有
する。従つて、酵母が生産したATは、グリコシル化され
ていないかあるいは実質的にグリコシル化されておらず
かつ天然産蛋白質中に存在する炭水化物部分が欠けてい
るものと思われる。
別法では、α−１−アンチトリプシンのための暗号づ
けをする分節を含む他の表現ベクトルを作ることができ
る。かかる表現ベクトルは、入手できるDNA構造物を用
いて、当業者に公知の方法で作ることができる。好まし
いベクトルはプラスミツドC1/1であり、このものは、CA
T1のように、CV13およびCV13誘導ベクトルよりも安定で
ある。C1/1は、プラスミツドpJDB248〔J.ベツグズ（J.B
eggs）、ネーチヤー（Nature）275,104-109（1978）〕
から作られた。Eco RIによる部分的浄化によつてpJDB24
8からpMB9配列順序を除去し、Eco RIで切断したpBR322
DNAで置換した。C1/1の制限地図は第４図に示してあ
る。C1/1プラスミツドは、酵母〔S.セルビシアエ（S.ce
rvisiae）〕からの全２μDNAを含み、Eco RI部位にpBR3
22が挿入されている。このプラスミツドはLEU２をも含
む。かくして、アダプターをもつ酵母TPIプロモーター
を、C1/1のTcR遺伝子中の単一Bam HI部位中に挿入する
ことができる。次に、酵母TPI遺伝子からの転写終了暗
号断片に結合したAT配列を、TPIプロモーターから下流
のBam HI側中へ挿入することができる。得られたプラス
ミツドHAT4を、次に、上記の方法で、N501-1BおよびGK1
00に形質転換することができる。
けをする分節を含む他の表現ベクトルを作ることができ
る。かかる表現ベクトルは、入手できるDNA構造物を用
いて、当業者に公知の方法で作ることができる。好まし
いベクトルはプラスミツドC1/1であり、このものは、CA
T1のように、CV13およびCV13誘導ベクトルよりも安定で
ある。C1/1は、プラスミツドpJDB248〔J.ベツグズ（J.B
eggs）、ネーチヤー（Nature）275,104-109（1978）〕
から作られた。Eco RIによる部分的浄化によつてpJDB24
8からpMB9配列順序を除去し、Eco RIで切断したpBR322
DNAで置換した。C1/1の制限地図は第４図に示してあ
る。C1/1プラスミツドは、酵母〔S.セルビシアエ（S.ce
rvisiae）〕からの全２μDNAを含み、Eco RI部位にpBR3
22が挿入されている。このプラスミツドはLEU２をも含
む。かくして、アダプターをもつ酵母TPIプロモーター
を、C1/1のTcR遺伝子中の単一Bam HI部位中に挿入する
ことができる。次に、酵母TPI遺伝子からの転写終了暗
号断片に結合したAT配列を、TPIプロモーターから下流
のBam HI側中へ挿入することができる。得られたプラス
ミツドHAT4を、次に、上記の方法で、N501-1BおよびGK1
00に形質転換することができる。
酵母生産AT中の最初の10個のアミノ酸の配列順序は、
アミノ酸配列順序分析により、天然産ヒトATの最初の10
個のアミノ酸と同一であることを確認することができ
る。
アミノ酸配列順序分析により、天然産ヒトATの最初の10
個のアミノ酸と同一であることを確認することができ
る。
この酵母生産ATはATG開始コードンで指定された開始
メチオニンを含まない。それ故、この酵母細胞はメチオ
ニンをプロセスから除外して天然産ヒトATのアミノ酸配
列順序を生成する。
メチオニンを含まない。それ故、この酵母細胞はメチオ
ニンをプロセスから除外して天然産ヒトATのアミノ酸配
列順序を生成する。
本発明によつて製造されたAT活性を有するポリペプチ
ドは、遺伝的AT欠失および不十分なATレベルに関連する
他の疾病状態の治療に有用である。かくして、気腫、お
よび慢性閉塞性肺疾患や成人呼吸困難症候群のような、
肺嚢の進行性消化に関連する他の肺障害を治療すること
ができる。嚢胞線維症や関節炎のような、必ずしも肺に
制限されない症状も治療することができる。AT欠失の総
説については、J.E.ガデツクおよびR.クリスタル（Gade
k,J.E.and R.Crystal），″α−１−アンチトリプシン
欠失（Alpha−１−Antitrypsin Deficiency）″，ザ・
メタボリツク・ベイシス・オブ・インヘリテツド・デイ
ジーズ（The Metabolic Basis of Inherited Diseas
e）,J.B.スタンドバリー、J.B.ワインガーデン、D.S.フ
レドリクソン（J.B.Standbury,J.B.Wyngaarden,D.S.Fre
drickson）、マグロー・ヒル（Mc Graw-Hill）、N.Y.pp
-1450-67（1982）を参照されたい。
ドは、遺伝的AT欠失および不十分なATレベルに関連する
他の疾病状態の治療に有用である。かくして、気腫、お
よび慢性閉塞性肺疾患や成人呼吸困難症候群のような、
肺嚢の進行性消化に関連する他の肺障害を治療すること
ができる。嚢胞線維症や関節炎のような、必ずしも肺に
制限されない症状も治療することができる。AT欠失の総
説については、J.E.ガデツクおよびR.クリスタル（Gade
k,J.E.and R.Crystal），″α−１−アンチトリプシン
欠失（Alpha−１−Antitrypsin Deficiency）″，ザ・
メタボリツク・ベイシス・オブ・インヘリテツド・デイ
ジーズ（The Metabolic Basis of Inherited Diseas
e）,J.B.スタンドバリー、J.B.ワインガーデン、D.S.フ
レドリクソン（J.B.Standbury,J.B.Wyngaarden,D.S.Fre
drickson）、マグロー・ヒル（Mc Graw-Hill）、N.Y.pp
-1450-67（1982）を参照されたい。
α−１−アンチトリプシンは、α−１−アンチトリプ
シンの欠失を有する宿主中への導入のため、あるいは哺
乳類宿主中の蛋白分解活性を変えるために、ヒトα−１
−アンチトリプシンに対するポリクローンおよびモノク
ローン抗体の生産のための抗原として用いることができ
る。特に、α−１−アンチトリプシンは、タバコおよび
他の喫煙によつて不活性化（酸化）されたα−１−アン
チトリプシンを置換するためにヒトに投与することがで
きる。
シンの欠失を有する宿主中への導入のため、あるいは哺
乳類宿主中の蛋白分解活性を変えるために、ヒトα−１
−アンチトリプシンに対するポリクローンおよびモノク
ローン抗体の生産のための抗原として用いることができ
る。特に、α−１−アンチトリプシンは、タバコおよび
他の喫煙によつて不活性化（酸化）されたα−１−アン
チトリプシンを置換するためにヒトに投与することがで
きる。
本発明のポリペプチドは、通常の薬学的坦体と混合す
ることができる。好ましくは、本発明のポリペプチド
は、静脈内または吸入により投与すべきである。有効投
与量は、症状の重篤度、患者の体重によつて異なるが、
多くの場合、0.5〜10.0g/週の範囲のポリペクチドを静
脈内に注射するが有効である。投与方法が吸入の場合に
は、これよりも少量で有効である。ATを、消化管中での
早期消化からカプセルまたはコーテイング坦体で保護す
るならば、経口投与も有効である。
ることができる。好ましくは、本発明のポリペプチド
は、静脈内または吸入により投与すべきである。有効投
与量は、症状の重篤度、患者の体重によつて異なるが、
多くの場合、0.5〜10.0g/週の範囲のポリペクチドを静
脈内に注射するが有効である。投与方法が吸入の場合に
は、これよりも少量で有効である。ATを、消化管中での
早期消化からカプセルまたはコーテイング坦体で保護す
るならば、経口投与も有効である。
以下に本発明の特別な実施態様を実施例で示すが、本
発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ 菌株:S.セレビシアエ〔S.cerevisiae（s．c．）〕×218
0-1A〔MA Ta SUC2 CUP1 gal２、バークレー・イースト
・ストツク・センター（Berkeley Yeast Stock Cente
r）より〕のメタンスルホン酸エチル（EMS）突然変異誘
発によつて得られたPGI１、PGK１、GPM１、PYK１、GCR
１中に突然変異を有する同質遺伝子菌株。YEP−３％グ
リセリン−２％エタノール上で35,000の独立コロニーを
増殖させ、YEP−４％デキストロース上で増殖不能であ
ることによつてレプリカ平板でスクリーニングした（第
１表）。
0-1A〔MA Ta SUC2 CUP1 gal２、バークレー・イースト
・ストツク・センター（Berkeley Yeast Stock Cente
r）より〕のメタンスルホン酸エチル（EMS）突然変異誘
発によつて得られたPGI１、PGK１、GPM１、PYK１、GCR
１中に突然変異を有する同質遺伝子菌株。YEP−３％グ
リセリン−２％エタノール上で35,000の独立コロニーを
増殖させ、YEP−４％デキストロース上で増殖不能であ
ることによつてレプリカ平板でスクリーニングした（第
１表）。
特別な損傷の同定は、公知の解糖突然変異株による相
補性試験〔シリアシーおよびブライテンバツハ（Ciriac
y and Bveitenbach）、J.Bacteriol.,139、152-60（197
9）〕によつて行つたが、突然変異株の相互かけ合わせ
によつて、少なくとも15種の付加的な相補性基を見いだ
した。酵素試験〔クリフトン（Clifton）から、ゲネテ
イツクス（Genetix）88、1-11（1980）〕により、pgi
１、pgk１、gpm１、pyk１、gcr１突然変異株中に解糖性
欠損が確認された。
補性試験〔シリアシーおよびブライテンバツハ（Ciriac
y and Bveitenbach）、J.Bacteriol.,139、152-60（197
9）〕によつて行つたが、突然変異株の相互かけ合わせ
によつて、少なくとも15種の付加的な相補性基を見いだ
した。酵素試験〔クリフトン（Clifton）から、ゲネテ
イツクス（Genetix）88、1-11（1980）〕により、pgi
１、pgk１、gpm１、pyk１、gcr１突然変異株中に解糖性
欠損が確認された。
S.セレジシアエ（S．cerevisiae）X2180-1Aから、EMS
処理によつてLEU２突然変異株をも誘導し、X2180-1B
（同質遺伝子MATａ株）とかけ合わせてN501-1B（MATa l
eu2 SUC2 CUP1 gal２）を生産した。次に、シクロヘキ
シミド（cyh２）およびカナバニン（can１）抵抗性を、
N501-1B中の偶発突然変異として選択した。解糖突然変
異株をN501-1Bにかけ合わせて、おのおのが単一解糖機
能またはGCR１に欠けている一連の同質遺伝子leu２株を
生産した。
処理によつてLEU２突然変異株をも誘導し、X2180-1B
（同質遺伝子MATａ株）とかけ合わせてN501-1B（MATa l
eu2 SUC2 CUP1 gal２）を生産した。次に、シクロヘキ
シミド（cyh２）およびカナバニン（can１）抵抗性を、
N501-1B中の偶発突然変異として選択した。解糖突然変
異株をN501-1Bにかけ合わせて、おのおのが単一解糖機
能またはGCR１に欠けている一連の同質遺伝子leu２株を
生産した。
tpi１突然変異株、S．セレビシアエ（S.serevisiae）
GLU77をN551-1A（MATa leu2 SUC2 CUP1 gal２）にかけ
合わせ、このかけ合わせから誘導された菌株をN501-1B
と２回かけ合わせてtpi 1 leu２株、N587-2Dを生産し
た。この株は遺伝的背景が他の解糖突然変異株と類似し
ていた。
GLU77をN551-1A（MATa leu2 SUC2 CUP1 gal２）にかけ
合わせ、このかけ合わせから誘導された菌株をN501-1B
と２回かけ合わせてtpi 1 leu２株、N587-2Dを生産し
た。この株は遺伝的背景が他の解糖突然変異株と類似し
ていた。
３種のグルコース燐酸化酵素に於ける突然変異は、唯
一の炭素源としてのデキストロースで増殖することがで
きずかつ２−デオキシグルコースおよびグルコサミンに
よるカタボライトリプレツシヨンに対して抵抗性である
株を生産する。hxk1 hxk2 glk１株、D308.3から、グル
コサミン抵抗性胞子コロニーについてスクリーニングす
ることによつて、N517-6C（hxk1 hxk2 glk1 leu2 can1-
100cyh2 ade２−１）を誘導した。試験によつて、グル
コースキナーシング活性の欠損が確認された。
一の炭素源としてのデキストロースで増殖することがで
きずかつ２−デオキシグルコースおよびグルコサミンに
よるカタボライトリプレツシヨンに対して抵抗性である
株を生産する。hxk1 hxk2 glk１株、D308.3から、グル
コサミン抵抗性胞子コロニーについてスクリーニングす
ることによつて、N517-6C（hxk1 hxk2 glk1 leu2 can1-
100cyh2 ade２−１）を誘導した。試験によつて、グル
コースキナーシング活性の欠損が確認された。
ホモタリツク二倍体株、S.c.AB 320は、酵母DNAプー
ルの根源であり〔ナフミスおよびリード（Nasmyth and
Reed）,Proc.Nat.Acad.Sci.,71,2119-2123（1980）〕、
これを幾つかの実験で対照として使用した。
ルの根源であり〔ナフミスおよびリード（Nasmyth and
Reed）,Proc.Nat.Acad.Sci.,71,2119-2123（1980）〕、
これを幾つかの実験で対照として使用した。
三炭糖燐酸イソメラーゼ遺伝子（調節信号を有する上
流配列順序を含む）は第1C図に示す通りである。
流配列順序を含む）は第1C図に示す通りである。
調節信号を有するピルビン酸カナーゼ遺伝子上流配列
順序は第1D図に示す通りである。
順序は第1D図に示す通りである。
クローンバンクのスクリーニング leu２解糖突然変異株を、選択可能なLEU２野性型遺伝
子を有する高コピープラスミツドDYE 13中へ挿入された
酵母DNAプールで形質転換させた〔ブローチ（Broach）
ら、ジーン（Gene）、8、121-133（1979）〕。解糖性遺
伝子は、グルコースおよびロイシン原栄養性での増殖の
ための同時選択を含む、相補性によつて得られた。酵母
窒素塩基と４％のグルコースと、１当たり下記の補充
成分：アデニン40mg、アルギニン20mg、アスパラギン酸
塩50mg、ヒスチジン10mg、イソロイシン60mg、リジン40
mg、メチオニン10mg、フエニルアラニン60mg、スレオニ
ン50mg、トリプトフアン40mg、チロシン50mg、ウラシル
20mg、バリン60mgとを含む合成培地を用いた。
子を有する高コピープラスミツドDYE 13中へ挿入された
酵母DNAプールで形質転換させた〔ブローチ（Broach）
ら、ジーン（Gene）、8、121-133（1979）〕。解糖性遺
伝子は、グルコースおよびロイシン原栄養性での増殖の
ための同時選択を含む、相補性によつて得られた。酵母
窒素塩基と４％のグルコースと、１当たり下記の補充
成分：アデニン40mg、アルギニン20mg、アスパラギン酸
塩50mg、ヒスチジン10mg、イソロイシン60mg、リジン40
mg、メチオニン10mg、フエニルアラニン60mg、スレオニ
ン50mg、トリプトフアン40mg、チロシン50mg、ウラシル
20mg、バリン60mgとを含む合成培地を用いた。
形質転換体（transformants）を無ロイシン培地で精
製した後、非選択性培地（YEPGE）で増殖させてプラス
ミツドの有糸分裂分離を可能にした。leu２選択性培地
でレプリカ平板によつて決定される解糖突然変異株表現
型とを共分離（cosegregated）した株の解糖性酵素活性
の試験をした。酵母DNAプレプス（preps）を作り、大腸
菌（E．Coli）株RR1を、アンピシリン抵抗性で選択し
て、形質転換し、これらの酵母解糖性形質転換体中にプ
ラスミツドDNASの存在を立証した。
製した後、非選択性培地（YEPGE）で増殖させてプラス
ミツドの有糸分裂分離を可能にした。leu２選択性培地
でレプリカ平板によつて決定される解糖突然変異株表現
型とを共分離（cosegregated）した株の解糖性酵素活性
の試験をした。酵母DNAプレプス（preps）を作り、大腸
菌（E．Coli）株RR1を、アンピシリン抵抗性で選択し
て、形質転換し、これらの酵母解糖性形質転換体中にプ
ラスミツドDNASの存在を立証した。
酵母試験 形質転換した酵母株を、グルコース８％を含む最小培
地（アデニンを最終濃度50mg/lになるように添加した）
で選択的に増殖させた。野生型対照N501-IBは、同じ培
地にロイシン（100mg/l）を加えたもので増殖させた。
解糖突然変異株は、YEP−グリセリン５％−乳酸塩１％
で増殖させた。１晩中、培養菌に新しい培地を供給し、
30°で４時間好気増殖させたのち、収穫した。細胞を２
回水洗し、K2HPO4 50mM、EDTA 2mM、２−メルカプトエ
タノール3mM（HClでpH7.4に調節）中に再懸濁させた。
細胞を、等容量のガラスビード（直径0.45mm）と共に、
高速で２分間ボーテクシング（Vortexing）することに
よつて抽出物を得た。４°で、15分間ミクロ遠心分離器
中で遠心分離することによつて細胞破片を除し、酵素
を、上記クリフトンおよびプライテンバツハ（Clifton
and Breitenbach）の文献に記載されたようにして試験
した。蛋白質濃度は、ビウレツト−TCA法で測定した。
地（アデニンを最終濃度50mg/lになるように添加した）
で選択的に増殖させた。野生型対照N501-IBは、同じ培
地にロイシン（100mg/l）を加えたもので増殖させた。
解糖突然変異株は、YEP−グリセリン５％−乳酸塩１％
で増殖させた。１晩中、培養菌に新しい培地を供給し、
30°で４時間好気増殖させたのち、収穫した。細胞を２
回水洗し、K2HPO4 50mM、EDTA 2mM、２−メルカプトエ
タノール3mM（HClでpH7.4に調節）中に再懸濁させた。
細胞を、等容量のガラスビード（直径0.45mm）と共に、
高速で２分間ボーテクシング（Vortexing）することに
よつて抽出物を得た。４°で、15分間ミクロ遠心分離器
中で遠心分離することによつて細胞破片を除し、酵素
を、上記クリフトンおよびプライテンバツハ（Clifton
and Breitenbach）の文献に記載されたようにして試験
した。蛋白質濃度は、ビウレツト−TCA法で測定した。
実施例２ 形質転換媒体中の種々の解糖性遺伝子の活性を決定す
るため、種々の酸素を試験し、形質転換体についての結
果を、突然変異体および野生型株と比較した。gcr１突
然変異株は、ほとんどの解糖性活性の（PGI、アルドラ
ーゼ、エノラーゼで代表される）野生型レベルの５−10
％を有し、グルコース培地で増殖が極めて不良である。
対照的に、GCR１形質転換体は、ほとんど野生型レベル
の酵素を有し、グルコース培地での増殖は野生型とほと
んど同じであつた。他の解糖突然変異株は、それぞれの
酵素活性の通常レベルの５％未満の活性を有していた。
しかし、相補性高コピープラスミツドで形質転換させる
とき、特異的酵素活性は、ほぼ野生型レベルを越えて実
質的に上昇した（典型的には５〜10倍高く）。下記第２
表はこれらの結果を示す。
るため、種々の酸素を試験し、形質転換体についての結
果を、突然変異体および野生型株と比較した。gcr１突
然変異株は、ほとんどの解糖性活性の（PGI、アルドラ
ーゼ、エノラーゼで代表される）野生型レベルの５−10
％を有し、グルコース培地で増殖が極めて不良である。
対照的に、GCR１形質転換体は、ほとんど野生型レベル
の酵素を有し、グルコース培地での増殖は野生型とほと
んど同じであつた。他の解糖突然変異株は、それぞれの
酵素活性の通常レベルの５％未満の活性を有していた。
しかし、相補性高コピープラスミツドで形質転換させる
とき、特異的酵素活性は、ほぼ野生型レベルを越えて実
質的に上昇した（典型的には５〜10倍高く）。下記第２
表はこれらの結果を示す。
実施例３ 解糖性酵素の高生産が特別なプラスミツドによつて相
補される突然変異欠損に特異的であることを示すため
に、10種の異なる解糖性蛋白質の試験を、種々の形質転
換株について行つた。下記第３表は、詳細に試験した６
種の異なる解糖遺伝子のおのおのに対する１つの形質転
換株についての結果を示す。
補される突然変異欠損に特異的であることを示すため
に、10種の異なる解糖性蛋白質の試験を、種々の形質転
換株について行つた。下記第３表は、詳細に試験した６
種の異なる解糖遺伝子のおのおのに対する１つの形質転
換株についての結果を示す。
GCR-8形質転換株は全10種の酵素のほぼ野生型レベル
を示したが、PGI-19、TPI-10、PGK-2、GPM-2、PYK-1の
形質転換株はそれぞれの解糖性蛋白質を過剰生産した
が、他の酵素は過剰生産しなかつた。
を示したが、PGI-19、TPI-10、PGK-2、GPM-2、PYK-1の
形質転換株はそれぞれの解糖性蛋白質を過剰生産した
が、他の酵素は過剰生産しなかつた。
プラスミツドは、ロイシン原栄養性の選択的圧力下で
も十分に増殖した培養菌で容易に分離（典型的には５〜
50％分離）することが認められた。そこで、試験した培
養菌は、おそらく、ある範囲の数のプラスミツドを有す
る細胞を含む。大腸菌（E．coli）に於ける相補性およ
び（または）配列順序づけにより、TPI１およびPYK１
は、共に構造遺伝子であることを示した。
も十分に増殖した培養菌で容易に分離（典型的には５〜
50％分離）することが認められた。そこで、試験した培
養菌は、おそらく、ある範囲の数のプラスミツドを有す
る細胞を含む。大腸菌（E．coli）に於ける相補性およ
び（または）配列順序づけにより、TPI１およびPYK１
は、共に構造遺伝子であることを示した。
実施例３ ヒトα−１−アンチトリプシンの生産のためのTPI１
のプロモーターの利用は次のように示された。プラスミ
ツドCV13を用いた。CV13は、細胞１個当たり平均約10コ
ピーで酵素の選択によつて保持され得る。CV13は、２μ
−プラスミツドのためのレプリコンpBR322と酵母LEU２
遺伝子とを含む。TPI１プロモーター断片は、TPI１遺伝
子を独特のKpnI部位（塩基511〜518）の所で切断するこ
とによつて得られ、得られた線状化DNAを次にBal13で４
〜５分間処理してTPI１構造配列を除去した。次に、Eco
RIまたはHindIIIまたはBamHIのいずれかのリンカーを挿
入した。次に、このリンカーを適当な制限酵素で分裂さ
せて、ヒトα−１−アンチトリプシン遺伝子の挿入のた
めの相補末端を与えた。ヒトα−１−アンチトリプシン
遺伝子をBamHIで消化し、BamHIは暗号ストランドの５′
末端の所で分裂させて成熟蛋白質から単一グルタミン酸
コードンのための情報を除去する。下記第４表に示すよ
うに、４種の異なる構造物が製造された。第４表から、
グルタミン酸コードンは、イニシエーターメチオニンを
有する構造物の３種中のアラニンおよびプロリンのため
のコードンで置換されることがわかる。
のプロモーターの利用は次のように示された。プラスミ
ツドCV13を用いた。CV13は、細胞１個当たり平均約10コ
ピーで酵素の選択によつて保持され得る。CV13は、２μ
−プラスミツドのためのレプリコンpBR322と酵母LEU２
遺伝子とを含む。TPI１プロモーター断片は、TPI１遺伝
子を独特のKpnI部位（塩基511〜518）の所で切断するこ
とによつて得られ、得られた線状化DNAを次にBal13で４
〜５分間処理してTPI１構造配列を除去した。次に、Eco
RIまたはHindIIIまたはBamHIのいずれかのリンカーを挿
入した。次に、このリンカーを適当な制限酵素で分裂さ
せて、ヒトα−１−アンチトリプシン遺伝子の挿入のた
めの相補末端を与えた。ヒトα−１−アンチトリプシン
遺伝子をBamHIで消化し、BamHIは暗号ストランドの５′
末端の所で分裂させて成熟蛋白質から単一グルタミン酸
コードンのための情報を除去する。下記第４表に示すよ
うに、４種の異なる構造物が製造された。第４表から、
グルタミン酸コードンは、イニシエーターメチオニンを
有する構造物の３種中のアラニンおよびプロリンのため
のコードンで置換されることがわかる。
CV13プラスミツド中へのヒトα−１−アンチトリプシ
ン構造物の結紮後、得られたプラスミツドをs．c,No.50
1-1Bへ形質転換した。得られた酵母細胞を、次に最小合
成培地で増殖させた。
ン構造物の結紮後、得られたプラスミツドをs．c,No.50
1-1Bへ形質転換した。得られた酵母細胞を、次に最小合
成培地で増殖させた。
ヒトα−１−アンチトリプシン遺伝子を含む酵母細胞
を、ガラスビード（0.45mm）と共に、高速度で２〜３分
間ボーテツクシング（vortexing）することによつて、
破壊、開鎖した。抽出緩衝液は50mMK2HPO4、2mM EDTA、
2mM 2−メルカプトエタノール、1mM PMSF（pH7.4）を含
み、細胞破片を遠心分離で除去し、抽出液は、ロータリ
ー分析（Lowry assays）で測定して３〜4mg/1mlの蛋白
質を含む。
を、ガラスビード（0.45mm）と共に、高速度で２〜３分
間ボーテツクシング（vortexing）することによつて、
破壊、開鎖した。抽出緩衝液は50mMK2HPO4、2mM EDTA、
2mM 2−メルカプトエタノール、1mM PMSF（pH7.4）を含
み、細胞破片を遠心分離で除去し、抽出液は、ロータリ
ー分析（Lowry assays）で測定して３〜4mg/1mlの蛋白
質を含む。
ヒトα−１−アンチトリプシンの存在は、RIAを用
い、トリチウム標識ヒトα−１−アンチトリプシンと該
蛋白質に対して指向けられた抗体とを用いて決定され
た。結果は下記の第５表に示してある。
い、トリチウム標識ヒトα−１−アンチトリプシンと該
蛋白質に対して指向けられた抗体とを用いて決定され
た。結果は下記の第５表に示してある。
上の結果から、天然蛋白質に対する抗体に対して天然
産ヒトα−１−アンチトリプシンと競合することができ
る、免疫学的に活性な生成物が得られることが明らかで
ある。
産ヒトα−１−アンチトリプシンと競合することができ
る、免疫学的に活性な生成物が得られることが明らかで
ある。
さらに、α−１−アンチトリプシン遺伝子の表現がTP
Ｉプロモーターによつて調節される。すなわち表からわ
かるように、TPＩプロモーターの一部分が除かれる場合
にはα−１−アンチトリプシンは生成されない。その
上、哺乳類蛋白質ヒトα−１−アンチトリプシンの生産
は上記研究では最適になつていないので、この結果は生
成物の最低の生産を示し、さらに増強される可能性があ
る。かくして、PTＩは、外来DNAの表現生成物の高収率
を能率よく生産するための有効なプロモーターであるこ
とがわかつた。
Ｉプロモーターによつて調節される。すなわち表からわ
かるように、TPＩプロモーターの一部分が除かれる場合
にはα−１−アンチトリプシンは生成されない。その
上、哺乳類蛋白質ヒトα−１−アンチトリプシンの生産
は上記研究では最適になつていないので、この結果は生
成物の最低の生産を示し、さらに増強される可能性があ
る。かくして、PTＩは、外来DNAの表現生成物の高収率
を能率よく生産するための有効なプロモーターであるこ
とがわかつた。
実施例５ 酵母GK100酵母抽出物からのα−１−アンチトリプシ
ンの精製 クアトレカサス（Cuatrecasas）,J.Biol.chem.,245、
3059（1970）の方法に従つて、ヒトα−１−アンチトリ
プシンに対する親和力−精製した抗体をCNBr−活性化セ
フアロースに共有結合させることによつて免疫吸着カラ
ムを調製した。破壊したGK100細胞を、0.5MNaClを含むp
H7.2の燐酸塩緩衝食塩水の３容で抽出し、カラムにかけ
た。カラムを3MNaSCNで溶出し、回収物を、ドデシル硫
酸ナトリウムの存在下でポリアクリルアミドゲルでの電
気泳動によつて分析した。電気泳動の結果は第３図に示
す。トラツク１は分子量標準の混合物を含む：（ａ）ホ
スホリラーゼB,97,000ダルトン；（ｂ）牛血精アルブミ
ン（BSA）、65,000ダルトン：（ｃ）オバルブミン、43,
500ダルトン；（ｄ）炭酸脱水酵素、30,000ダルトン；
（ｅ）大豆トリプシン抑制剤、20,000ダルトン；（ｆ）
α−ラクトアルブミン14,000ダルトン。トラツク３は免
疫吸着によつて精製した、分子量約42,000の酵母生産AT
を含む。トラツク７はシグマ・ケミカルカンパニー（si
gma Chemical Company）から購入した天然産ATの試料
で、血液蛋白でひどく汚染されている。トラツク７の主
成分は分子量54,000ダルトンのヒトα−１−アンチトリ
プシンである。
ンの精製 クアトレカサス（Cuatrecasas）,J.Biol.chem.,245、
3059（1970）の方法に従つて、ヒトα−１−アンチトリ
プシンに対する親和力−精製した抗体をCNBr−活性化セ
フアロースに共有結合させることによつて免疫吸着カラ
ムを調製した。破壊したGK100細胞を、0.5MNaClを含むp
H7.2の燐酸塩緩衝食塩水の３容で抽出し、カラムにかけ
た。カラムを3MNaSCNで溶出し、回収物を、ドデシル硫
酸ナトリウムの存在下でポリアクリルアミドゲルでの電
気泳動によつて分析した。電気泳動の結果は第３図に示
す。トラツク１は分子量標準の混合物を含む：（ａ）ホ
スホリラーゼB,97,000ダルトン；（ｂ）牛血精アルブミ
ン（BSA）、65,000ダルトン：（ｃ）オバルブミン、43,
500ダルトン；（ｄ）炭酸脱水酵素、30,000ダルトン；
（ｅ）大豆トリプシン抑制剤、20,000ダルトン；（ｆ）
α−ラクトアルブミン14,000ダルトン。トラツク３は免
疫吸着によつて精製した、分子量約42,000の酵母生産AT
を含む。トラツク７はシグマ・ケミカルカンパニー（si
gma Chemical Company）から購入した天然産ATの試料
で、血液蛋白でひどく汚染されている。トラツク７の主
成分は分子量54,000ダルトンのヒトα−１−アンチトリ
プシンである。
実施例６ 血精プロテアーゼトリプシンに対する酵母生産α−１
−アンチトリプシンの活性 対照として、100μg/mlトリプシンと100μｇ（100μ
ｌ）の牛血清アルブミンとの溶液10μｌ（１μｇ）と、
1mMベンゾイル−アルギニオイル−ｐ−ニトロアニリド
を含む0.05モルTRIS,pH8.0緩衝液100μｌとを混合し、
分光光度計で経時による405nmの吸光度の増加を測定し
た。この溶液の吸光度値を100％トリプシン活性の標準
として用いた。３つの追加試料の反復試験を行い、毎回
１μｌトリプシンを含み、それぞれ25μlAT溶液＋175μ
ｌ緩衝液、100μｌα−１−アンチトリプシン＋100μｌ
緩衝液200μｌα−１−アンチトリプシンを含んでい
た。結果は、25μｌのATを用いると、トリプシン活性の
73％が残り、100μｌのATではトリプシン活性の41％が
残存し、200μｌのα−１−アンチトリプシンでは26％
のトリプシン活性が残存していた。このことは、酵母生
産ATの量を増すことによつてトリプシン抑制活性も増加
することを示している。
−アンチトリプシンの活性 対照として、100μg/mlトリプシンと100μｇ（100μ
ｌ）の牛血清アルブミンとの溶液10μｌ（１μｇ）と、
1mMベンゾイル−アルギニオイル−ｐ−ニトロアニリド
を含む0.05モルTRIS,pH8.0緩衝液100μｌとを混合し、
分光光度計で経時による405nmの吸光度の増加を測定し
た。この溶液の吸光度値を100％トリプシン活性の標準
として用いた。３つの追加試料の反復試験を行い、毎回
１μｌトリプシンを含み、それぞれ25μlAT溶液＋175μ
ｌ緩衝液、100μｌα−１−アンチトリプシン＋100μｌ
緩衝液200μｌα−１−アンチトリプシンを含んでい
た。結果は、25μｌのATを用いると、トリプシン活性の
73％が残り、100μｌのATではトリプシン活性の41％が
残存し、200μｌのα−１−アンチトリプシンでは26％
のトリプシン活性が残存していた。このことは、酵母生
産ATの量を増すことによつてトリプシン抑制活性も増加
することを示している。
実施例７ 酵母プラスミツドからの増加した遺伝的安定性を有す
るα−１−アンチトリプシンの製造 CV13よりも遺伝的に安定なフラスミツドであるC1/1を
用いることにより、増加した量のATを得ることができ
る。C1/1プラスミツドはS．セレビシアエ（S．cerevisi
ae）からの全２−μDNAを含むので、遺伝的マーカーの
ための選択の不在下に於て酵母中でのそれ自体の複製お
よび保持を促進することができる。また、C1/1プラスミ
ツドはTcR遺伝子中にある単一のBamHI部位をも有する。
C1/1を有する形質転換株は、大腸菌（E.cali）中で、ア
ンピシリン−またはテトラサイクリン−抵抗性で選択す
ることができ、酵母中ではロイシ原栄養性で選択するこ
とができる。C1/1は２μDNAのEcoRI中へ挿入されたpBR3
22を含み、J.ベツグズ（J.Beggs）、ネーチヤー（Natur
e）、275、104-109（1978）が記載しているLEU2遺伝子
を担持する。
るα−１−アンチトリプシンの製造 CV13よりも遺伝的に安定なフラスミツドであるC1/1を
用いることにより、増加した量のATを得ることができ
る。C1/1プラスミツドはS．セレビシアエ（S．cerevisi
ae）からの全２−μDNAを含むので、遺伝的マーカーの
ための選択の不在下に於て酵母中でのそれ自体の複製お
よび保持を促進することができる。また、C1/1プラスミ
ツドはTcR遺伝子中にある単一のBamHI部位をも有する。
C1/1を有する形質転換株は、大腸菌（E.cali）中で、ア
ンピシリン−またはテトラサイクリン−抵抗性で選択す
ることができ、酵母中ではロイシ原栄養性で選択するこ
とができる。C1/1は２μDNAのEcoRI中へ挿入されたpBR3
22を含み、J.ベツグズ（J.Beggs）、ネーチヤー（Natur
e）、275、104-109（1978）が記載しているLEU2遺伝子
を担持する。
酵母TPIプロモーター（CTEA32からの）を、合成DNAア
ダプター（上述）と共に、C1/1の単一BamHI部位中へ、B
alII-BamHI断片（約900塩基対）として挿入した。この
挿入によつて、その中にヒトAT遺伝子を酵母中の表現の
ために接合することができる単一BamHI部位が生じた。C
AT1プラスミツドの場合のように、AT遺伝子（第１図）
を挿入するとき、得られたプラスミツドはATC開始暗号
とそれに続くGAG（グルタミン酸コードン）とを有する
ことになり、酵母中で成熟したヒトAT蛋白質配列の生産
が可能になる。
ダプター（上述）と共に、C1/1の単一BamHI部位中へ、B
alII-BamHI断片（約900塩基対）として挿入した。この
挿入によつて、その中にヒトAT遺伝子を酵母中の表現の
ために接合することができる単一BamHI部位が生じた。C
AT1プラスミツドの場合のように、AT遺伝子（第１図）
を挿入するとき、得られたプラスミツドはATC開始暗号
とそれに続くGAG（グルタミン酸コードン）とを有する
ことになり、酵母中で成熟したヒトAT蛋白質配列の生産
が可能になる。
酵母TPI遺伝子の３′フランキング（flanking）領域
の約700の塩基対をヒトATの後に付加して転写終了を助
ける。“終了”断片は、プラスミツドTPIC10中のXbaIか
らEcoRIまでの部位の配列順序である〔T.アルバーおよ
びG.カワサキ（T.Alber and G.Kawasaki）、J.Molec Ap
plied Genet.,1、419-434（1982）〕。
の約700の塩基対をヒトATの後に付加して転写終了を助
ける。“終了”断片は、プラスミツドTPIC10中のXbaIか
らEcoRIまでの部位の配列順序である〔T.アルバーおよ
びG.カワサキ（T.Alber and G.Kawasaki）、J.Molec Ap
plied Genet.,1、419-434（1982）〕。
酵母終了配列を、終了暗号およびATDNA′ｓを別個に
その中に挿入することができる多重クローニング部位を
有するベクトルpUC13を用いて、ヒトATに結合させた。p
UC13プラスミツドは、J.ビエイラおよびJ.メツシング
（Vieira、J.and Messing、J.）、ジーン（Gene）、1
9、259-268（1982）がベクトルpU8およびpUC9について
記載したようにして作られた。pUC13プラスミツドは、
第５図に示すように、lacＺ遺伝子の開始に於ける多重
制限部位を含んでいた。ヒトAT遺伝子をTPI転写終了暗
号に結合させるために、ATcDNAクローン（第１図）を単
一PstI部位に於て、pUC13中へPstI断片として挿入し
た。AT遺伝子の後には、多重クローニング配列中のXbaI
部位およびEcoRI部位が続いた。pUC13のこれらXba部位
とEcoRI部位との間に、酵母終了暗号を、pTPIC10からの
700塩基対XbaI−EcoRI断片として挿入した。得られたプ
ラスミツドpUCα１＋EG1は、酵母転写終了暗号と共にヒ
トAT遺伝子を含んでいた。（第６図参照）。次に、この
プラスミツドのEcoRI部位へEcoRI-BamHI合成DNAアダプ
ターを付加させ、酵母終了暗号の５′末端にBamHIを生
成させた。このアダプターを用いることにより、ヒトAT
−酵母終了暗号配列を、BamHIで切断することによつて
除去し、約2100塩基対の断片を遊離させることができ
る。このBamHI断片をBamHIアダプターと共に、TPIプロ
モーターを含むC1/1プラスミツド中へ挿入した。得られ
たプラスミツドHAT4は、TPIプロモーターとATG GAGGATC
CアダプターとヒトAT遺伝子（BamHI部位からの）とC1/1
中へ挿入されたTPI終了暗号とを有する。HAT4のメポロ
ジーは第７図に示してある。
その中に挿入することができる多重クローニング部位を
有するベクトルpUC13を用いて、ヒトATに結合させた。p
UC13プラスミツドは、J.ビエイラおよびJ.メツシング
（Vieira、J.and Messing、J.）、ジーン（Gene）、1
9、259-268（1982）がベクトルpU8およびpUC9について
記載したようにして作られた。pUC13プラスミツドは、
第５図に示すように、lacＺ遺伝子の開始に於ける多重
制限部位を含んでいた。ヒトAT遺伝子をTPI転写終了暗
号に結合させるために、ATcDNAクローン（第１図）を単
一PstI部位に於て、pUC13中へPstI断片として挿入し
た。AT遺伝子の後には、多重クローニング配列中のXbaI
部位およびEcoRI部位が続いた。pUC13のこれらXba部位
とEcoRI部位との間に、酵母終了暗号を、pTPIC10からの
700塩基対XbaI−EcoRI断片として挿入した。得られたプ
ラスミツドpUCα１＋EG1は、酵母転写終了暗号と共にヒ
トAT遺伝子を含んでいた。（第６図参照）。次に、この
プラスミツドのEcoRI部位へEcoRI-BamHI合成DNAアダプ
ターを付加させ、酵母終了暗号の５′末端にBamHIを生
成させた。このアダプターを用いることにより、ヒトAT
−酵母終了暗号配列を、BamHIで切断することによつて
除去し、約2100塩基対の断片を遊離させることができ
る。このBamHI断片をBamHIアダプターと共に、TPIプロ
モーターを含むC1/1プラスミツド中へ挿入した。得られ
たプラスミツドHAT4は、TPIプロモーターとATG GAGGATC
CアダプターとヒトAT遺伝子（BamHI部位からの）とC1/1
中へ挿入されたTPI終了暗号とを有する。HAT4のメポロ
ジーは第７図に示してある。
HAT4をN501-1BおよびGK100に形質転換させた。６％の
グルコース、２−３％の酵母を有する最小培地で、可溶
性蛋白質はα−１−アンチトリプシンであり、細胞密度
は約3g/l（湿潤重量）であつた。HAT4はC1/1を含んでい
るので、このプラスミツドは種々の富んだ培地中で保持
可能であり、YEPD（１％の酵母抽出物、２％のペプト
ン、２％のグルコース）を含んでいた。富培地では、２
−３％のATが依然として生産されるが、細胞密度は10-2
0g/l（湿潤重量）と高かつた。このHAT4プラスミツド
は、富培地上で30回以上の分裂に対してN501-1B中で選
択なしに保持され、70％より多くの細胞がプラスミツド
を含んでいた。GK100では、細胞の95％以上が、富培地
上での30回の分裂後にHAT4を有していた。CAT1よりもHA
T4を用いることの利益は、１）プラスミツド安定性がよ
り大きく、２）全蛋白質の百分率としてのAT量がより高
く、３）富培地を用いる結果として１当たりの細胞収
量がずつと大きく、４）合成（無ロイシン）培地に比べ
て富培地のコストが安いことであつた。突然変異酵母株
GK100は、米国メリーランド州ロツクビル市のアメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（American Typ
e Culture Collection）にATCCNo.20669として寄託され
ている。
グルコース、２−３％の酵母を有する最小培地で、可溶
性蛋白質はα−１−アンチトリプシンであり、細胞密度
は約3g/l（湿潤重量）であつた。HAT4はC1/1を含んでい
るので、このプラスミツドは種々の富んだ培地中で保持
可能であり、YEPD（１％の酵母抽出物、２％のペプト
ン、２％のグルコース）を含んでいた。富培地では、２
−３％のATが依然として生産されるが、細胞密度は10-2
0g/l（湿潤重量）と高かつた。このHAT4プラスミツド
は、富培地上で30回以上の分裂に対してN501-1B中で選
択なしに保持され、70％より多くの細胞がプラスミツド
を含んでいた。GK100では、細胞の95％以上が、富培地
上での30回の分裂後にHAT4を有していた。CAT1よりもHA
T4を用いることの利益は、１）プラスミツド安定性がよ
り大きく、２）全蛋白質の百分率としてのAT量がより高
く、３）富培地を用いる結果として１当たりの細胞収
量がずつと大きく、４）合成（無ロイシン）培地に比べ
て富培地のコストが安いことであつた。突然変異酵母株
GK100は、米国メリーランド州ロツクビル市のアメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（American Typ
e Culture Collection）にATCCNo.20669として寄託され
ている。
上記の結果から、酵母中で外来DNAの表現を調節する
ことによる異質蛋白質の製造に酵母プロモータを有効に
使用できることは明らかである。これらのプロモーター
は強力なプロモーターであるので、高度の表現を与える
ことがわかつた。さらに、このメツセンジヤーは十分に
安定なので所望の表現生成物中へのかなりの明瞭な翻訳
の程度を与えることができるように思われる。その上、
解糖性プロモーターと適当な栄養培地とを用いることに
より、外来DNAの表現を変えることができる。この方法
で、外来DNAの生産をターンオンおよびターンオフする
ことができる。かくして、本発明は、異質蛋白質の製造
に於て、製造を変えることができる有効な宿主として酵
母を用いる方法を提供するものである。さらに、解糖性
調節遺伝子を用いることにより、複数の解糖性プロモー
ターをターンオンおよびターンオフすることが可能であ
る。
ことによる異質蛋白質の製造に酵母プロモータを有効に
使用できることは明らかである。これらのプロモーター
は強力なプロモーターであるので、高度の表現を与える
ことがわかつた。さらに、このメツセンジヤーは十分に
安定なので所望の表現生成物中へのかなりの明瞭な翻訳
の程度を与えることができるように思われる。その上、
解糖性プロモーターと適当な栄養培地とを用いることに
より、外来DNAの表現を変えることができる。この方法
で、外来DNAの生産をターンオンおよびターンオフする
ことができる。かくして、本発明は、異質蛋白質の製造
に於て、製造を変えることができる有効な宿主として酵
母を用いる方法を提供するものである。さらに、解糖性
調節遺伝子を用いることにより、複数の解糖性プロモー
ターをターンオンおよびターンオフすることが可能であ
る。
以上、本発明を明瞭に理解して頂くための説明と実施
例とによつてある程度詳細に説明したが、本発明の特許
請求の範囲内で変化や変形を行うことができることは明
らかであろう。
例とによつてある程度詳細に説明したが、本発明の特許
請求の範囲内で変化や変形を行うことができることは明
らかであろう。
【図面の簡単な説明】 第1A図および第1B図は、ヒトα−１−アンチトリプシン
を暗号づけする２つの形の遺伝子のcDNA配列順序であ
り、 第1C図は調節信号を有する三炭糖燐酸イソメラーゼ遺伝
子の上流配列順序であり、 第1D図は調節信号を有するピルビン酸キナーゼ遺伝子上
流配列順序であり、 第２図は、プラスミツドCTEA32およびCAT1の制限地図を
示し、 第３図は、本発明に従つて製造された精製α−１−アン
チトリプシンを示す電気泳動クロマトグラムの図であ
り、 第４図は、プラスミツドC1/1の制限地図を示し、 第５図は、pUC13の多重制限部位のDNA配列順序を示し、 第６図は、第１図からのDNA配列順序を含むプラスミツ
ドpUCα１の制限地図を示し、 第７図は、プラスミツドHAT4の制限地図である。
を暗号づけする２つの形の遺伝子のcDNA配列順序であ
り、 第1C図は調節信号を有する三炭糖燐酸イソメラーゼ遺伝
子の上流配列順序であり、 第1D図は調節信号を有するピルビン酸キナーゼ遺伝子上
流配列順序であり、 第２図は、プラスミツドCTEA32およびCAT1の制限地図を
示し、 第３図は、本発明に従つて製造された精製α−１−アン
チトリプシンを示す電気泳動クロマトグラムの図であ
り、 第４図は、プラスミツドC1/1の制限地図を示し、 第５図は、pUC13の多重制限部位のDNA配列順序を示し、 第６図は、第１図からのDNA配列順序を含むプラスミツ
ドpUCα１の制限地図を示し、 第７図は、プラスミツドHAT4の制限地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リチヤ−ド・ウツドベリ− アメリカ合衆国ワシントン州98155シア トル・ノ−ス・イ−スト・テンス・アベ ニユ−15464 (56)参考文献 Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔｉ ｃｓ，１（1982）ｐ．419〜434 Ｎａｔｕｒｅ，298（Ｊｕｌ．1982) ｐ．347−350 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，103（２) （1981）ｐ．751−758 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，21 （1982）ｐ．1935−1942 Ｎａｔｕｒｅ，297（Ｊｕｎ．1982) ｐ．655−659 Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．，78（11）（1981）ｐ. 6826−6830 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，130（２) （1981）ｐ．297−300
Claims (6)
- 【請求項１】酵母内で複製が可能であって、三炭糖燐酸
イソメラーゼ又はピルビン酸キナーゼの転写を制御する
ことができる酵母プロモーターを含み、該酵母プロモー
ターによって正規に調節される蛋白質を表現する遺伝子
以外の遺伝子が該酵母プロモーターの下流に続く発現ベ
クター。 - 【請求項２】酵母宿主中に於ける選択のためのマーカー
を有する、特許請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 - 【請求項３】プロモーターから下流にかつ該プロモータ
ーの調節下で異質蛋白質を表現する遺伝子を有する、特
許請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 - 【請求項４】α−１−アンチトリプシンと実質的に同じ
構造を有するプロテアーゼ阻害剤を表現する遺伝子がプ
ロモーターのあとに続く、特許請求の範囲第１項記載の
発現ベクター。 - 【請求項５】プロモーターの調節下で、異質蛋白質を表
現する遺伝子があとに続く三炭糖燐酸イソメラーゼプロ
モーターを含む特許請求の範囲第１項記載の発現ベクタ
ー。 - 【請求項６】酵母内で複製が可能であり、三炭糖燐酸イ
ソメラーゼ又はピルビン酸キナーゼの転写を制御するこ
とができる酵母プロモーターを含み、かつ該酵母プロモ
ーターによって正規に調節される蛋白質を表現する遺伝
子以外の遺伝子が該酵母プロモーターの下流に続く発現
ベクターが、ゲノム中に組み込まれた酵母細胞。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/408,099 US4599311A (en) | 1982-08-13 | 1982-08-13 | Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor |
| US408099 | 1982-08-13 | ||
| US48940683A | 1983-04-28 | 1983-04-28 | |
| US489406 | 1983-04-28 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8004339A Division JP2694134B2 (ja) | 1982-08-13 | 1996-01-12 | 形質転換酵母を用いる蛋白質の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5991886A JPS5991886A (ja) | 1984-05-26 |
| JP2509163B2 true JP2509163B2 (ja) | 1996-06-19 |
Family
ID=27020145
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58147907A Expired - Lifetime JP2509163B2 (ja) | 1982-08-13 | 1983-08-12 | 発現ベクタ−及び該発現ベクタ−を含む酵母細胞 |
| JP8004339A Expired - Lifetime JP2694134B2 (ja) | 1982-08-13 | 1996-01-12 | 形質転換酵母を用いる蛋白質の製造方法 |
| JP9095684A Expired - Lifetime JP2991670B2 (ja) | 1982-08-13 | 1997-04-14 | 形質転換酵母を用いて製造した蛋白質 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8004339A Expired - Lifetime JP2694134B2 (ja) | 1982-08-13 | 1996-01-12 | 形質転換酵母を用いる蛋白質の製造方法 |
| JP9095684A Expired - Lifetime JP2991670B2 (ja) | 1982-08-13 | 1997-04-14 | 形質転換酵母を用いて製造した蛋白質 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0103409B1 (ja) |
| JP (3) | JP2509163B2 (ja) |
| AU (3) | AU577259B2 (ja) |
| DE (2) | DE3382821T2 (ja) |
| IL (1) | IL69465A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE895961A (fr) * | 1983-02-21 | 1983-06-16 | Wallone Region | Procede de preparation d'un clone bacterien produisant de 1'alpha 1-antitrypsine humaine |
| CA1341116C (en) * | 1983-02-22 | 2000-10-17 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis or foreign protein |
| ZA8410063B (en) * | 1984-01-30 | 1985-10-30 | Smith Kline Rit | Expression of human alpha-1-antitrypsin in yeast |
| EP0164556B1 (en) * | 1984-05-11 | 1994-03-02 | Chiron Corporation | Enhanced yeast transcription employing hybrid promoter region constructs |
| US5422267A (en) * | 1984-05-22 | 1995-06-06 | Robert R. Yocum | Industrial yeast comprising an integrated glucoamylase gene |
| JP2599585B2 (ja) * | 1984-06-19 | 1997-04-09 | トランスジ−ン ソシエテ アノニム | ヒトα▲下１▼−アンチトリプシン誘導体及びその製造法 |
| FR2582001B2 (fr) * | 1985-05-15 | 1988-04-29 | Transgene Sa | Nouveaux derives de l'a1-antitrypsine humaine, composition et reactif biologique les contenant |
| FR2565983B1 (fr) * | 1984-06-19 | 1988-01-15 | Transgene Sa | Derives de l'a1-antitrypsine humaine et procede pour leur preparation |
| US5498600A (en) * | 1984-10-12 | 1996-03-12 | Zymogenetics, Inc. | Biologically active mosaic proteins |
| US5187263A (en) * | 1984-10-12 | 1993-02-16 | Zymogenetics, Inc. | Expression of biologically active PDGE analogs in eucaryotic cells |
| EP0487116B1 (en) * | 1984-10-12 | 1999-12-29 | ZymoGenetics, Inc. | Biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells |
| US6291662B1 (en) | 1984-12-05 | 2001-09-18 | Amgen Inc. | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences |
| HU204563B (en) * | 1984-12-06 | 1992-01-28 | Synergen Biolog Inc | Process for producing recombinant serine-protease inhibitors and dns sequencyes for them |
| WO1986003497A1 (en) * | 1984-12-06 | 1986-06-19 | Synergen Biologicals, Inc. | Serine protease inhibitors and methods for isolation of same |
| DK4286A (da) * | 1985-01-07 | 1986-07-08 | Celltech Ltd | Fremgangsmaade til fremstilling af en metalloproteinaseinhibitor |
| DE3666826D1 (en) * | 1985-01-18 | 1989-12-14 | Searle & Co | Human natural inhibitor of collagenases |
| AU5549386A (en) * | 1985-02-05 | 1986-08-26 | Synergen Biologicals Inc. | Metalloproteinase inhibitor sequence recombinant vector system for using same and recombinant dna for the manufactureof same |
| US5045633A (en) * | 1985-02-25 | 1991-09-03 | Zymogenetics, Inc. | Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells |
| US4683294A (en) * | 1985-04-03 | 1987-07-28 | Smith Kline Rit, S.A. | Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them |
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