JPS61502655A - 酵母クロ−ニングビヒクル - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
酵母クローニングビヒクル
vehicle )に関する。(本明細書において使用する”タン・ξり質″と
いう語はサイズが不特定のRプチド類を包含する。)酵母のような真核細胞を、
遺伝子または特定タン・ξり質の相補的DNA(cDNA)コーディング配列の
発現用宿主として使用することは次第に関心をもたれてきている。一般K、真核
細胞から放出されるタンパク質は、前駆体タンパク質(アミン末端”シグナル”
ペプチド領域を含む)の合成、小胞体膜を横切る輸送、その後の特異的シグナル
ペプチドの切断、炭水化物付加(グリコジル化)を含むプロセッシング、最後に
細胞からの成熟生産物の分泌をともなう分泌経路においてプロセッシングを受け
る。酵母サツカロミセス・セレビシェ(SaccharomycθeCereV
i81aQ )はこのような分泌経路を有することが知られてング・ハーバ−研
究所、1982年におけるシェフマン(Schek−man )およびノビツク
(Novick )の”分泌過程および酵母細胞表面アセンブリー(The 5
ecretory process and yeastcell −Il]u
rface assembly ) ”を参照されたい〕。さらに、いくつかの
原核生物種に存在する類似の分泌経路と異なって、酵母の分泌機構はタンパク質
をグリコジル化しうる成分を与える。
ヒツツ? 7 (Hitzsman )らのニエ王ヱ2219 : 620〜6
25(1983)は、インターフェロンシグナル配列を含むコーディング領域に
基づくヒトインターフェロンの酵母による発現および分泌を報告している。ヒラ
ラマンらが報告した分泌成熟タンツク質はシグナルRプチドの不正確な切断を示
した。
ヒネン(Hlnnen )らは国際微生物学会議(マサチューセッツ州ボストン
、 1982年)において、酵母サツカロミセス・車上。
ビシエのPH0s遺伝子からのDNA断片(プロモーターおよびPH05シグナ
ル配列の5′末端の80%を含む)の、成熟タン・ξり質配列をコート9するc
DNA断片およびヒトα−インターフェロンのシグナル配列の3′末端の一部へ
の融合を報告した。PH05はこの酵母の分泌酵素である酸性ホスファターゼ(
リン酸基により抑制される)をコードする。この構成物はPH05シグナルOフ
チドの最後の3個のアミノ酸のだめのDNAコーディング配列を欠き、その代わ
りに・・イブリッドシグナルの最後の3個のアミノ酸はヒトcDNA配列により
コードされるもの・・・すなわちプレーインターフェロンシグナル情報のアミノ
酸である。ヒネンらにより作製されたプラスミVはサツカロミセス・セレビシェ
の細胞を形質転換するのに用いられた。この形質転換細胞はリン酸基の制御下に
インターフェロン活性を発現すると報告された。インターフェロン活性の分布(
細胞内対細胞外)は論じられなかった。
発明の概要
第一の面において、本発明は一般にタンパク質の発現および分泌のために微生物
を形質転換する際に使用できるクローニングビヒクルは転写の順に、酵母転写調
節DNA配列、酵母シグナルはプチドをコードするDNA配列、および目的タン
パク質をコードする外来性DNA配列を含有する。
第二の面において、本発明は酵母PH05転写調節配列と実質的に同一のシグナ
ル配列;完全PH05シグナルにプチドと実質的に同一であり、且つPH05シ
グナルRプチト見同じ3個のカルボキシ末端アミノ酸を有するシグナルズプチド
をコードする配列;および該シグナル配列のカルボキシ末端に隣接する制限エン
ドヌクレアーゼ切断部位;を含むDNA断片を提供する。
第三の面において、本発明は自然界に存在するPH05転写調節配列およびシグ
ナル配列を準備し、そしてDNAシグナル配列によりコート藩れる3個のカルボ
キシ末端アミノ酸の同一性を変えることなくシグナル配列の3′末端に1つの制
限エンドヌクレアーゼ切断部位を作ることによりそれらを修飾することから成る
上記プラスミドの作製方法を提供する。
外来性DNA配列を含むクローニングビヒクルは酵母宿主を形質転換するのに使
用でき、形質転換宿主を培養して目的タンパク質を分泌させることができる。
7酵母転写調節DNA配列”という用語は、DNAの転写を開始するのに有効な
酵母内に自然界で存在するDNA配列を意味する。”酵母シグナルDNA配列°
という用語は、酵母内に自然界で存在するシグナルはプチド配列をコードするD
NA配列を意味する。”外来性DNA“は本発明ビヒクルの酵母転写調節DNA
配列および酵母シグナルDMA配列と関連して自然界では見出せないDNAを意
味する。
好適な実施態様において、転写調節DNA配列は自然界に存在する酵母遺伝子の
転写調節DNA配列と同一であシ、酵母シグナルDNA配列は該遺伝子により生
産されるシグナルベプチビと同一の×ゾチドをコードする。酵母遺伝子は大きな
抑制酵素(repressible enzyme )の酸性ホスファターゼを
コート9するPH05遺伝子である。PH05はサツカロミセス・セレビシェ内
の染色体2のゲノムDNAの8キロ塩基(Kb) EcoR工領域に含まれる。
この遺伝子の転写調節配列および隣接シグナルDNA配列は双方とも、この領域
のより小さな600塩基対(bp)のBamHI−Kpn工部分に含まれる。外
来性DNAは非分泌(または分泌)酵母タンパク質をコードする酵母DNAであ
りうるが、好ましくは非酵母タン・ξり質をコードするDNA配列に相当する。
上記のクローニングビヒクルは酵母内での外来性DNAの発現を可能にし、こう
してタンパク質産物が酵母から周囲の培地中に分泌される。さらに、タンパク質
はプロセッシング(すなわち酵母シグナル配列の除去)後にその成熟体で回収さ
れる。
後述するように、シグナル配列の配置および間隔を制御すると、目的の外来性タ
ンパク質が宿主生物により発現およびプロセッシングされ、それによりシグナル
配列の切断が正確な部位で起こって、成熟体のタンパク質が分泌されるであろう
。
成熟タン・々り質の正確なプロセッシングを行うために必要とされる情報は酵母
シグナルDNA配列に含まれ、外来性タンパク質をコードするDNA配列の性質
には無関係である。上記のクローニンブイフタ−は分泌および非分泌外来性タン
パク質をコート9するどのようなりNA配列の発現および分泌に対しても有用で
ある。
第1図はプラスミ)’ 99 NMlu−アルファを示す模式図である。
第2図はプラスミl−#99Nを示す模式図である。
第3図はプラスミド99 NMluを示す模式図である。
第4図はプラスミ)’99N−アルファを示す模式図である。
第5図は成熟アルファhCGの最初の30ヌクレオチドのためのコーディング配
列を含む、pBR322内でクローニングされたDNA断片の制限エンドヌクレ
アーゼによる切断地図の一部クローニングベクターまたはビヒクルの諸成分は第
1図のプラスミド’ggNM1u−アルファ、または第4図のp99N−アルフ
ァにより例示される。このプラスミドは機能的プロモーター領域および転写開始
部位から成る酵母転写調節配列を含む。
機能的酵母プロモーター領域は他のプラスミド成分から上流に転写を開始させる
のに十分な配列、例えば自然界に存在する完全な酵母プロモーターを含むべきで
ある(自然界に存在し且つ3′末端にある種の欠失を含む酵母転写調節DNA配
列もまた機能的プロモーターである。)。BamH工部位(−553)からAT
G )リプレツ) (+1 、+2.+3と定める)に先行するヌクレオチドゞ
までの5’−3’DNA配列は、転写を開始させるのに十分な上流配列を有する
機能的PH05プロモーター領域を表わす。PH05転写調転写域の3′末端に
ある種の欠失を含むものも機能的プロモーターである。
9998M1u−アルファはシグナルはブチP(PH05シグナルペプチドと同
一)をコードシ、このはゾチドは次のアミノ酸配夕II:Me t−Phe −
Lys −3er −Val−Mal−Tyr −3er−I le −Leu
−Ala−Ala−3er−Leu−Ala−Asn−Alaを有する。p99
NMlu−アルファに含まれるシグナルはプチドをコードするDNA配列は
ATGTTTAAATCTGTTGTITATTCAATrI’TAGCCAA
CGCGである。
上記の酵母DNA配列は目的とする外来性タンパク質をコードするDNA配列と
同調的に位置づけられる。”外来性タンパク質”とは、自然界に存在する系にお
いて、ビヒクルの酵母プロモーターの制御下に生産されず且つビヒクルの酵母シ
グナルにプチドと共に生産されないタンパク質を意味する。この用語は酵母タン
ノξり質を含むが、好ましくは外来性DNA配列は非酵母タンパク質の成熟体を
コードする。
成熟タンパク質をコードする配列に対するシグナル配列の融合を促進させるため
に、自然界に存在するシグナルDNA配列を変化させることができる。しかしな
がら、得られるシグナルにプチト9のアミノ酸配列に反映する変化は避けるべき
である。
シグナルDNA配列の3′末端は外来性DNA配列の5′末端に連結(1iga
tiOn )され、これらの配列間に外部からのヌクレオチドが全く存在しない
ようにする。この方法では形成期のタンパク質が目的とする成熟タンパク質に直
接に隣接したシグナルにプチドを含み、そして分泌されるタンパク質は外部アミ
ノ酸を含まないだろう。
好適なりローニングビヒクルの他の成分には、DNA複製開始点およびシラスミ
ド選択用の表現型塩基を与えるDNA断片が含まれる。9998M1u−アルフ
ァに存在する詳細な特徴は、その前駆体プラスミドp99 Nおよびp99Nか
らの9998M1u−アルファの作製方法に関する次の説明により例示される。
クローニングビヒクルの作製および前駆体上記のクローニングビヒクルは、多目
的のクローニング部位を与えるように修飾された、酵母転写調節配列および酵母
シグナル配列を含むベクターを遺伝子操作することにより作製される。プラスミ
)”99NM1u (第3図参照)はクローニング部位MxuIを含むこの種の
ベクターである。この制限酵素部位は酵母シグナルDNA配列の末端に、または
その近くに配置されるべきであシ、こうして制限エンドヌクレア、−ゼ消化また
は合成リンカ−の使用により遺伝子工学的に処理された、目的の分泌または非分
泌タンパク質をコードする外来性DNA配列がその後プラスミ)”99NM1u
のM1uI部位に挿入され、それにより目的タンパク質またはにプチドの発現お
よび分泌が達成される。
制限酵素部位がどこに配置され且つどんな配列が必要とされるかによって、使用
するリンカ−は自然界に存在する完全なシグナルDNA配列を保持するように遺
伝子操作されるが、遺伝暗号の不必要な部分は実施する遺伝子操作工程に関して
若干の柔軟性を与える。同様に、シグナル配列への同調融合を確かなものとする
ために、外来性DNA配列の5′末端忙おいて遺伝子操作およびヌクレオチド9
付加が必要となるかも知れない。この種のリンカ−の構造および作製の例は99
98M1u−アルファに関して後述する。
p99Nおよびその作製の詳細な説明は以下の通シであり、その後制限酵素部位
M1u工を挿入することによるp99Nからの9998M1uの作製を説明する
。この作製において使用する通常の組換えDNA法は、マニアラス(Mania
tis ) ラのモレキュラークローニンク:実験手引書、コールド・スプリン
グ・ハーバ−研究所、コールドトスプリング・ハーバ−(1982)に記載サブ
ラスミド99Nは次のDNAセグメントを含有する( Ec。
R工部位から時計と反対口りに):
1、酵母の染色体4からの1.45KbのEcoRIゲノムDNA断片に含まれ
る機能的TRP1遺伝子〔キンゲスマン(Kingaman)らの遺伝子(Ge
ne )二、 141〜152(1979)およびジャンパー(Tschump
er )およびカーボン(Carbon )の遺伝子 10.157〜166(
1980)を参照〕。この断片は103bpの機能的TRP 1プロモーター領
域、672bpのコーディング配列、および転写終結配列としてばかりでな(a
rsl配列と呼ばれる弱いDNA複製開始点(またはレプリコン)として機能す
る678’bp3’非翻訳領域を含む;プラスミ)’ Y Rp 7はジャンパ
ーおよヒカーボンの上記文献(1980)に記載されておシ、TRPIおよびア
ンピシリン耐性遺伝子が同じ方向で転写されるような向きでpBR322のEc
oRI部位に挿入されたこの1.45 KbのEcoRI断片アンピシリン耐性
遺伝子および大腸菌内で機能するDNA複製開始点を含有する;
3、大部分のサツカロミセス・セレビシェ菌株に内在する2ミクロンの自然界に
存在する環状プラスミドの3体からの1.45KbのHinc [断片〔ブロー
チ(Broach )のサツカロミセス属酵母の分子生物学: %f’8mbl
U’ @ (Life Cycle ana Inhe−ritanCe )
+ コールド・スプリング・ハーバ−研究所、コールド・スプリング・ハーバ−
、1981年を参照〕。Hlnc ■ 断片は”強い″DNA複製開始点を含み
(すなわち、それは酵母内でより高いプラスミドコピー数を与えるのでars
lよりも゛強力“である)、且つ有光細胞分裂あたシに相当低いプラスミド損失
率を与える。これはまた大部分の酵母菌株に保有される内生02ミクロンプラス
ミドの存在が原因している。プラスミド99Nにおけるベクター断片の向きはこ
の機能にとって重要ではない;
4、pBR322のNruI−BamHIからノ597bp配列;s、sKbの
EcoRニーPH05断片からの0.6KbのBamHI−KpnIセグメント
。この断片は完全なPH○5プロモーターおよび17個のアミノ酸から成るシグ
ナルはプチド(初めのメチオニンを含む)をコードするのに必要な全てのDNA
配列を合む;および
6. KpnI−EcoR工断片がスば一す−(5pacer )領域として使
用される。この断片の起源および長さはプラスミド99N またはその誘導体で
の使用にとって重要ではない。プラスミド99Nにおけるスに一す−領域はPH
05構造配列から成る。
プラスミド#99Nは次のようにして作製される。プラスミドYRp7をEco
RIで部分消化して、2つあるEcoRI部位のうち1つだけを切断する。大部
分の消化産物は5.BKbの線状化されたYRp7分子から成る。これらの線状
分子のうち約半分は一方のBcoRI部位で切断され、残りの半分は他方のEc
oRI部位で切断される。この線状分子混合物をマニアチスらの上記文献(19
82)に記載されるようなゲル電気泳動、その後のゲルからの溶離により、非切
断環状分子および短い線状分子(両方のEcoRI部位が切断されることにより
まれに生じる)から分離する。その後5′突出EcoRI末端はDNAポリメラ
ーゼ(フレノウ酵素)を使ってaNTPで修復する。(これとは別に、5′Ec
oR工突出末端は最初に1本鎖特異的5′→ごエキソヌクレアーゼを使って除去
することができる。)このようにして生じた平滑末端分子はDNAIJガーゼを
使って再連結(環状化)させ、これにより1つのEcoRI認識配列が欠失され
る。TRPIプロモーターに隣接したEcoR工部位全部位する当該プラスミド
YRp7’は制限酵素マツピングにより同定する。次に酵母2ミク07プラスミ
ト9由来ノ1.45KbのH1ncll断片をYRp7’のNruI部位に連結
させる。得られたプラスミドYRp7’Nは1i:coRIおよびBamHIの
両方で消化する。ゲルから単離される6、87Kbの大きな断片がベクター断片
である。
サツカロミセス・セレビ/工のPH05遺伝子はp60と呼ばれるにプチドに相
当する大きな、リン酸基により抑制される酸性ホスファターゼ酵素(APase
)をコードシ、且つ染色体2からのBKbのEcoRIゲノムDNA断片内に含
まれる〔ポスチアン(Boetian )らの旦NAS nJ4504〜450
8 (1980)およびクラ? −(K ramer )およびアンデルセy
(Andersen )のPNAS77、 6541〜6545 (1980)
を参照されたい〕。PH05断片はBKbのEcoR,I PH05領域を保有
するプラスミド〔例えばpAP20.アンダーツ7 (Anderson )
、チ#(’rhi11)およびクラマーのモL/り・セル・バイオo (Mo1
ec、 CerIBiol、 )3 : 562〜569.1983を参照〕を
BamHIおよびKpnIで消化し、0,6KbのBamHI−Kpn工断片を
ゲルから単離することにより作られる。BamHI部位(−553)からATG
)リプレットに先行するヌクレオチドまでの5′→3’ D N A配列は、
転写を開始させるのに十分な上流配列を有する機能的PH05プロモーター領域
を表わす。
KpnI−EcoRIス×−サー断片の組成は任意である。プラスミ)’99N
の場合のスば一す−断片は、Kpn工部位(+q4bp)から始まってPst
工部位(+1500bp) (EcoRIリンカ−配列が付加される)で終るP
H05構造配列から成る。この断片はPH0s断片およびベクター断片と組み合
わせ、DNAIJガーゼを使って環状プラスミドとする。この生成物を使って大
腸菌をアンピシリン耐性へと形質転換する。形質転換細胞のこのプールから、プ
ラスミ)”99Nを同定し且つプラスミドDNAを作る。
プラスミド99NはNRRLに寄託番号15790 として寄託された。
プラスミド99Nは”プラスミド99N−アルファ”のところで述べる技術を使
って、最初の塩基対がGから始まる外来性DNA配列のだめのクローニングビヒ
クル(例えばp99N−アルファ)を作製する際に使用できる。また、p99N
にM1uI部位を挿入すると、最初の塩基対の同一性に係りなく外来性DNAの
発現が可能になるであろう。
プラスミ)”99HM1u
99HのPH05シグナル配列の3′末端内にM1u工部位を挿入するためには
、次の遺伝子操作工程を必要とする。最初に、PH05プロモーターおよびシグ
ナル配列を含む99Nの1.95KbのBamHI−EcoRI断片をpBR3
22内に挿入してプラスミドpBRPhoを作る。次いで、pBRPhoのpB
R部分にあるBalI部位を排除(Ava I−Pvu ]l断片を除去)して
pAPPを作製する。今や、pAPPはPH05シグナルをコードするDNA配
列の3′末端に接近して位置するBalI部位を1つだけ有する。
次の工程はBaII部位の隣りに位置するKpn工部位をM1uI部位で置換す
ることを包含する。この置換を達成するために、pAPPをKpnIで消化し、
3′突出部分をT4DNAポリメラーゼを使って除く。合成M1uニリンカー(
ACGCGT)を連結し、続いてMluIで消化後連結してこのベクターを閉じ
る。細菌の形質転換細胞をMluI部位の有無について調べて、シラスミドpA
PPMを単離する。
pAPPMはMluIで消化し、BalI部位およびM1uI突出部分を含む合
成7一体(5’TGGCCAA 3’)および11一体(5’CGCGTTGG
CCA3’)を連結させる。これらのリンカ−のいくつかを2つのM1u工突小
突出の中間に連結させることができ、これは次の構造:(PHOsシグナル−E
ax・・・Mxu−Bax・・・・・・Ba1−Mlu)へと導く。これらの構
造体をBaIIで消化し、連結させてベクターを閉じる。これは全ての不必要な
リンカ−を除き、M1uI部位をPH05シグナル内のBaII部位の隣りに移
動させ、それにより意図する配置を得る。この配置はDNA塩基配列決定により
証明される( pPhoM)。
プラスミド99Nおよびp Pho Mからの99HM1uの作製は次のように
行われる。pPhoMの1,95KbのBamHI−EcoRI断片を単離し、
次にBamHIとEcoRIの両方で切断し且つ細菌の酸性ホスファターゼで処
理した99NK連結させる。細菌の形質転換細胞をM1uI部位含有プラスミド
についてスクリーニングする。第3図に示すこのプラスミド99NM1uを単離
し、そして託された。
こうして、99HMjuをMluIで消化する場合4−塩基突出部分が作られ、
これはシグナル配列のカルボキシ末端をコードする部位で正確に終っている。こ
のM1u工突小突出は、DNA 4リメラーゼI(フレノウ酵素)の大型断片を
使ってaNTPで修復する(平滑末端の完全なPH05シグナル配列を生ずる)
か、あるいはこの突出部分をヌクレアーゼS1で消化する(最後の4つのヌクレ
オチドが消失した平滑末端のPH05シグナル配列へと導く)かのいずれかの方
法で修飾することができる。99N Mluのこの領域はさらにF’nuD■(
認識配列CGCG )で切断でき、これは最後の2つのヌクレオチドが消失した
平滑末端のPH05シグナル配列をもたらす。
これらの修飾は、制限酵素による消化丑たは合成リンカ−の使用により遺伝子工
学的に処理されたコーディング領域への枠内でのPH05シグナル配列の融合を
可能にする。
次の実施例はPH05のプロモーター、翻訳開始部位およびシグナル配列によっ
て支配されたプツ力ロミセス・セレビシェにオケるヒト絨毛性性腺刺激ホルモン
のアルファサブユニット(アルファhCG)の合成および分泌を開示している。
アルファhCG および酵母酸性ホスファターゼはともにそれらのアミン末端に
シグナルペプチドを含むプレータンパク質から誘導されル分泌タンパク質である
。
成熟アルファhCG のコーディング配列の最初の50ヌクレオチドは、既知制
限酵素の認識配列を全く含まない。従って、シグナル配列へのアルファhCG
の成熟部分の融合は非常に長い合成リンカ−の広範な使用を必要とする。このこ
とは制限酵素認識部位の全部のヌクレオチドではなく1つまたは2つのヌクレオ
チド9を含む位置で、成熟コーディング配列の出発点から下流に1つの制限酵素
部位を作ることにより避けることができる。
その後、この新しく作った制限酵素部位とc+c+NMxuのM1uI部位との
間に比較的短い安価な合成りNA断片を挿入する。
好適な方法において、アルファhCGの成熟体をコードするDNA断片は、プラ
スミド99 NM 1uのPH05シグナルへの正確な同調融合を達成するため
に遺伝子工学的に処理される。
完全なプレーアルファhCG分子をコードするアルファhCQクローンは、pB
R322のBamH工とEC0RI(7)間でクローニングした。この挿入物の
制限酵素切断地図の一部および成熟アルファhCGのコーディング配列の最初の
307クレオチドの配列を第5図に示す。成熟アルファhCGの最初のアミノ酸
のコドンは矢印で示した羽塩基から出発する。94位置のGをCで置換すると、
Pst工部位(CTGCAG )が作られるだろう。その後この部位は合成りN
AIJンカニを挿入するために使用される。
エキソヌクレアーゼBa131を使って、約90bpが消化されるような条件下
でBam HI部位からこの断片を切除することができる。これらの消化断片に
EcoRニリンカー(それらの3′末端にCを含む)を連結させる。切除がs’
TGCAG 3’の配列で正確に終った分子のみが、Cの付加後に、94位置に
Pst 工部位を含むだろう。こうして、上記の連結混合物をPst工で切断し
、長さが約250 bpの断片(各末端にPstI部位を含む)をpBR322
のP日tI部位でクローニングすることにより選択することができる。この断片
を含むプラスミドはPst工で消化して、合成1〇一体(5’CATCAGGA
GC3’)および18一体(5’CGCGGCTCCTGATGTGCA3’)
を連結させる。これらのリンカ−はM1u■突出部分およびPst I突出部分
で終る消失したアルファhCGコーディング配列を含む。その後、これらの連結
混合物をMluIで消化し、その断片をpPhoMのMluI部位においてクロ
ーニングする。アルファhCGコーディング領域の3′断片はXbaI−Eco
RI断片としてこのシラスミド内に挿入できる。成熟アルファhCG コーディ
ング領域へ融合したPH05シグナルおよびPH05プロモーターを含む全部の
BamHI7KcoR工断片はp99NMlu内に挿入し、それによ!llp9
9NM1u−アルファを作製する。このプラスミドはその後酵母を形質転換する
ために使用する。
プラスミド99N−アルフア
別の方法において、プラスミド99N をハイブリッド遺伝子(PHOsシグナ
ル配列がアルファhCG の成熟体をコードするDNA配列と融合したもの)を
作製するためのイクターとして使用して、プラスミド’99N−アルファ(第4
図に示す)を作った。ハイブリッド遺伝子の特異的作製は、PH05シグナル配
列が全17アミノ酸シグナルRプチビをコードする最初の51ヌクレオチドと追
加のダアニン(G)残基のみを含むように処理されたので可能であった。これは
初めにPH05DNAをKpnI酵素で消化して3′突出鎖を生成することによ
シ達成された。次に、T4DNAポリメラーゼの3′→5′エキソヌクレアーゼ
活性によシ平滑末端分子を得た。成熟アルファhCGのコーディング領域は、p
99NM1u−アルファの上記作製方法と同じ方法で処理された。
成熟コーディング領域へGAを付加すると、認識配列GAGCTCを有する新し
い制限酵素部位Sac Iが作られる。これはBa131を使ってBamH工部
位から切除したアルファhCG 断片を、修復5aII部位を含む断片(それ故
それらの末端にGAを含む)に連結させることによシ達成された。新しく作られ
た5acI部位はその中にA1u工部位(AGCT )を含む。AluIで切断
すると、成熟アルファhCGの最初のアミノ酸の最初のGを消失した断片が生成
する。これらの断片を99N 内の修飾シグナルペプチドへ融合させると、成熟
アルファhCGをコードする配列に同調融合された完全なPH05シグナル配列
、翻訳開始部位および完全なプロモーターを含むプラスミド99N−アルフアが
作製される。
プラスミド99N−アルフアは寄託番号B 15791としてNRRLに寄託さ
れた。
タンノξり質の合成
ベッグス(Beggs ) ’のネイチャー(Nature ) 275 :
104〜109 (197B)に記載されるような標準技術を使って、宿主酵母
をクロー二/グビヒクルで形質転換する。
よび遺伝子発現、607〜636頁、コールド・スプリング・ノ・−バー研究所
、コールドゞ・スプリング・ノ1−バー、ニューヨーク州、1982年における
ボッツタイン(Botetθin)およびデービス(Davis)の゛酵母によ
る組換えDNA研究の原理および実施″゛に要約されるような標準技術を使って
、標準培地で培養する。分泌された成熟ポIJ dプチドは周囲の培地から回収
する。
プラスミ)’99N−アルファを用いて、突然変異trp 1遺伝子(トリプト
ファン要求性を引き起こす)を保有するサツカロミケス・セレビシェの菌株をT
rp+表現型(トリプトファン原栄養株)へ形質転換した。プラスミ)”99N
−アルファは形質転換酵母をトリプトファンの不存在下で増殖させる発現可能な
酵母trpl遺伝子を保有する。プラスミ)’DNAによる酵母の適当な形質転
換方法は例えばばッグスの上記文献(1978年)K記載されている。1つ以上
のTrp+形質転換酵母をトリプトファン不含合成増殖培地上での単集落分離に
より分離した。この培地は5C−TRPと呼ばれ、その組成を表1に示す。
表 1
デキストロース 20 g20 9
硫酸アンモニウム 5 g 5 g
硫酸マグネシウム 0.5,9 0.5g塩化ナトリウム 0.1g0.11!
塩化カルシウム 0.1.9 0.1Fビオチン、葉酸 各々 2μg 各々2
μIホウ酸 500μm 500μg
硫酸銅 40μg 40μI
ヨウ化カリウム 100μ、9 100μlイノシトール 2 rR92■
トレオニン 150 m9 150 ■ロイシン、リシン 各々60rng各々
60 ηKH2PO41,5g 30m9
KCI O1,5g
形質転換菌株はトリシトファンを含まず且つKH2PO430rn9/lおよび
Kcll、5g/lを含む低リン酸塩含量の合成液状増殖培地中でインキュ(−
トシた。この培地はLP3o(SC−TRP)有する細胞はこの培地で増殖し、
そして無機リン酸の細胞内濃度が減少し始めるときアルファhCG の合成を開
始する。30℃で2日間インキュベートした後、抗原的に活性なアルファhCG
の実質上全部(90チ以上)が培地中に見出された。代表的濃度はラジオイムノ
アッセイで測定して0.2 m9/l またはそれ以上であった。
アルファhCGの大部分または全部が培地中に分泌されたので、最初に遠心分離
、濾過などのいくつかの有利な手段のいずれかを使って収穫した細胞懸濁液から
酵母細胞を取り除いた。その後、細胞不含の発酵培地は、純粋なアルファhCG
を単離するように設計された適当なタンパク質精製法で処理した。
先に述べたように、シラスミド’99NMlu外来性遺伝子またはcDNAにP
H05シグナル配列を結合させる際に使用され、そしテサツ力ロミ七ス・セレビ
シェのいずれの菌株にも導入することができる。その後、p99N−アルファで
形質転換した酵母を使用するアルファhCGの生産について上述したような技術
を使って目的の外来性タンパク質を生産させるだめに、この形質転換酵母を使用
することができる。この系は細胞外液体中に分泌され且つ収量の増大した外来性
タンパク質を与える。
本明細書において述べたプラスミド寄託物は各々(ai 本特許出願の未決の間
、培養物に対する利用は37 CF’R1,14および35 U、 S、 C,
122のもとて権利があると米国特許/商標局の長官によって決定された者に限
り認める;および(b)寄託培養物の一般人への利用可能性の制限は全て最終的
に本特許の認可の際に解くことを保証する;という条件のもとで作られた。
その他の実施態様
その他の実施態様は次の請求の範囲内のものである。発現されたポリペプチド中
のシグナル切断部位の十分な認識を達成するために、3個の末端アミノ酸は自然
界に存在する酵母シグナル配列のアミノ酸と同一であるべきである。完全な未修
飾シグナル切断部位を生産することが望ましいが、当業者なら若干の変更を施し
つつ請求された本発明を利用することが可能であるだろう。同様に、目的ポリペ
プチドのN末端において数個の外部アミノ酸を加えることができ、またシグナル
DNA配列の末端に関して制限酵素部位のわずかな(3〜6塩基対)移動を許容
することができる。
FIG 1
FIG 2
FIG 3
FIG 4
国際調査報告
+m″″″+1aaal A@g&tabhn Hap、、〒、、S日、、、o
1306
Claims (23)
- (1)互いに同調した状態で且つ転写の順に、酵母転写調節配列; 酵母シグナルペプチドをコードする酵母シグナル配列;および 目的タンパク質をコードするDNA配列から成る外来性DNA配列; を含み、酵母宿主内で外来性DNA配列を発現し得るクローニングビヒクル。
- (2)酵母シグナル配列および外来性DNA配列が、目的タンパク質に隣接した 完全な酵母シグナルペプチドから成り且つこれらの間に外部からのアミノ酸が全 く存在しないタンパク質をコードする、請求の範囲第1項記載のクローニングビ ヒクル。
- (3)酵母転写調節配列がリン酸により抑制される酵母酸性ホスフアターゼ遺伝 子の自然界に存在する転写調節配列と実質的に同一である、請求の範囲第1項記 載のクローニングビヒクル。
- (4)酵母転写調節DNA配列が酵母PHO5遺伝子の転写調節配列と実質的に 同一である、請求の範囲第3項記載のクローニングビヒクル。
- (5)酵母転写調節配列がサッカロミセス・セレビシエの染色体2からの8Kb のEcoRI PHO5ゲノムDNA断片の0.6KbのBamHI−KpnI 断片内に含まれる断片と実質的に同一である、請求の範囲第4項記載のクローニ ングビヒクル。
- (6)酵母シグナル配列が自然界に存在するリン酸−抑制性酵母酸性ホスフアタ ーゼ遺伝子により発現されるシグナルペプチドと実質的に同一のペプチドをコー ドする、請求の範囲第1項記載のクローニングビヒクル。
- (7)酵母シグナルDNA配列がPHO5ゲノム断片により発現される完全なシ グナルペプチドと同一のシグナルペプチドをコードする、請求の範囲第6項記載 のクローニングビヒクル。
- (8)シグナルペプチドのカルボキシ末端における3個のアミノ酸がAla−A sn−Alaである、請求の範囲第1項記載のクローニングビヒクル。
- (9)酵母シグナル配列が次のシグナルペプチド:【配列があります】 をコードする、請求の範囲第8項記載のクローニングビヒクル。
- (10)酵母シグナル配列(ATG翻訳開始コドンを含む)が:【配列がありま す】 のいずれかである、請求の範囲第9項記載のクローニングビヒクル。
- (11)外来性DNA配列が非分泌タンパク質または非分泌ペプチドをコードす る、請求の範囲第1項記載のクローニングビヒクル。
- (12)外来性DNA配列が分泌タンパク質または分泌ペプチドをコードする、 請求の範囲第1項記載のクローニングビヒクル。
- (13)外来性DNA配列が哺乳動物のタンパク質またはペプチドをコードする 、請求の範囲第1項記載のクローニングビヒクル。
- (14)自然界に存在する酵母PHO5転写調節配列と実質的に同一の転写調節 配列; 自然界に存在する酵母PHO5ゲノムDNAにより発現される酵母シグナルペプ チドと実質的に同一のシグナルペプチドをコードするシグナル配列、この際前記 シグナル配列によりコードされる前記シグナルペプチドの3個のカルボキシ末端 アミノ酸は、自然界に存在する前記のPHO5ゲノムDNAにより発現される3 個のカルボキシ末端アミノ酸と同一である;および前記シグナル配列の3′末端 の制限エンドヌクレアーゼ切断部位、この際前記3′末端と前記切断部位の間に は外部からの塩基対が存在しない; を含み、それにより目的タンパク質をコードする外来性DNAがその外来性DN Aの適切なリーデイング・フレームを保ちつつしかも前記シグナル配列の3′末 端と前記外来性DNAの5′末端の間に外部からの塩基対を導入することなしに 、前記シグナル配列ヘスプライシングされ得るDNA断片。
- (15)酵母シグナルDNA配列が次のペプチド:【配列があります】 をコードする、請求の範囲第14項記載のDNA断片。
- (16)酵母シグナルDNA配列が 【配列があります】 からなる請求の範囲第14項記載のDNA断片。
- (17)制限エンドヌクレアーゼ部位がMluIである請求の範囲第14項記載 のDNA断片。
- (18)DNA断片がクローニングベクターP99NMlu(NRRL番号B1 5792)またはp99N(NRRL番号15790)の中に組み込まれる、請 求の範囲第14項記載のDNA断片。
- (19)自然界に存在する酵母PHO5転写調節配列と実質的に同一の転写調節 配列; 次のシグナルペプチド: 【配列があります】 をコードするシグナル配列; 前記シグナル配列の3′末端に隣接するGヌクレオチド;を含み、それにより目 的タンパク質をコードする外来性DNAが、その5′末端にG塩基を結合する場 合、その外来性DNAの適切なリーデイング・フレームを保ちつつDNA断片の 前記3′末端ヘスプライシングされて、目的タンパク質に隣接した前記シグナル ペプチドから成り且つこれらの間に外部からのアミノ酸が存在しないペプチドを コードするDNAを作製し得るDNA断片。
- (20)シグナル配列(追加のGヌクレオチドを含む)が【配列があります】 である請求の範囲第19項記載の断片。
- (21)転写調節配列および自然界に存在するシグナル配列と同一のシグナル配 列を含むプラスミドを準備し;前記の自然界に存在する酵母シグナル配列をその 3′末端で修飾して制限エンドヌクレアーゼ切断部位を作り、この場合修飾され たシグナル配列が自然界に存在する酵母シグナル配列によりコードされる3個の カルボキシ末端アミノ酸と同一の3個のカルボキシ末端アミノ酸をコードする9 個の塩基対をその3′末端に含む; ことから成る請求の範囲第14項記載のクローニングビヒクルの作製方法。
- (22)目的ペプチドおよびペプチドシグナル配列から成るペプチドを酵母宿主 内で合成し、前記目的ペプチドを酵母宿主の膜を通して分泌させる方法であって 、 転写の順に、酵母転写調節DNA配列;シグナルペプチドをコードする酵母シグ ナルDNA配列(前記シグナルペプチドの3個のカルボキシ末端アミノ酸は自然 界に存在する酵母シグナルペプチドの3個のカルボキシ末端アミノ酸と同一であ る);および目的タンパク質をコードするDNA配列からなる外来性DNA配列 ;を含み、これらの配列が互いに同調的に位置づけられ、酵母宿主内で前記外来 性DNA配列を発現し得るクローニングビヒクルを準備し; 酵母宿主を前記クローニングビヒクルで形質転換し;その後形質転換された酵母 宿主を培養して所定のタンパク質またはペプチドを分泌させる; ことから成る方法。
- (23)所定のタンパク質がグリコシル化される請求の範囲第22項記載の方法 。
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A mistura ê aquecida durante 10 min. a 759C, depois deixada arrefecer lentamente atê à temperatura ambiente e guardada a -209C. Este adaptador ê designado por adaptador C. 1 ^ig (120 pmoles) do adaptador C emparelhado e fosforilado e 5 pg (1,5 pmoles) de pBR322/ /PH05 Bam-Rsa 637 desfosforilado e cortado com Xba I são ligados em 40^1 de Tris.HCl 60mM pH 7,5, MgCl2 lOmM, DTT 5mM, ATP lmM, 1600 unidades da ligase de DNA do T4 a 159C durante 20 horas. A ligase de DNA ê inactivada durante 10 min. a 859C e o excesso de adaptadores ê removido por precipitação com isopropanol. 0 DNA ê redissolvido em H20 numa concentração de 0,25 mg/ml. Os múltiplos de adaptadores são removidos por digestão com a endonuclease de restrição BglII. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido e depois digerido com Bam HI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris-borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento Bam HI-BglII de 662 pb (derivado de fragmento Bam HI-Rsa I de 637 pb) ê localizado e removido do gel. c) Isolamento de um fragmento de vector contendo a sequência codificadora do TPA maduro ( fig. 23) 5 yig do plasmídeo p31R/SS-TPA /\ 2, são digeridos com as endonucleases de restrição Bam HI e BglII. Após digestão completo de DNA e precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCl 50mM pH 8,0 numa concentração de 75 jxg /ml. Os fragmentos de DNA sao desforilados nas suas extremidades 5' por digestão com 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela ( Boehringer) em 60 de Tris.HCl 50mM pH 8,0 durante 1 hora a 379 C. A fosfatase ê inactivada por incubação a 659C durante 1,5 horas. 0 DNA é purificado por cromatografia de troca iónica em DE-52 (Whatman) como descrito no Exemplo 9Aa. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido em Tris-HCl lOmM, pH8,0 e aplicada num gel de 0,6 °'o de agarose de ponto de fusão baixo. 0 fragmento maior Bam HI -BglII de 5,2 kb ê removido do gel. d) Ligação dos fragmentos de DNA isolados e transformação de E.coli HB 101 (cf. figs 23 e 24 ). Dois blocos de gel de agarose de ponto de fusão baixo contendo 0,1 pmoles do fragmento Bam HIBglII de 5,2 kb de p31R/SS-TPA/\ 2 e 0,2 pmoles do fragmen to BamHI -BglII de 662 pb de pBR322/PHO5 Bam-Rsa 637, respectivamente, são misturados, liquefeitos a 659C e diluídos para baixar a concentração de agarose para 0,3¾. A ligação ê feita em 150^1 de Tris.HCl 60mM, pH 7,5; MgCl^ lOmM, 99 jr £ DTT 5mM, ATP ImM e 800 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) a 159C durante 16 horas. Amostras de 10 ^il e 30 yjl são misturadas com 100 p.1 de células E.coliHB 101 competentes para a transformação como descrito no Exemplo 4a. - R 6 colonias transformadas amp são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 ^g/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê analisado quanto ao tamanho e orientação da invenção por corte com a endonuclease de restrição Bam Hl. Um único clone com a orientação correcta da inserção é designado por p31/PHO5 637-TPA (cf. fig. 23). 0 plasmídeo pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 pode também ser substituído por pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 595, pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 811 e pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 1312 . Seguindo o processo descrito atras são isolados clones únicos com inserções do tamanho e orientação esperados e designados por p31/PHO5 595C-TPA, p51/PHO5 811C-TPA e p31/PHO5 1312 C-TPA. 0 adaptador C pode também ser substituído pelo adaptador B com a seguinte férmula 5' -CTAGATAAGAGATCTGC -3’ 3’ TATTCTCTAGACG -5' o qual codifica Lis -Arg na construção final (fig. 24). A fosforilação dos oligodeoxinucleotídeos sintéticos e emparelhamento são como descrito para o adaptador C. Para a adição do adaptador 5 de pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 cortado com Xba I são digeridos com 2 unidades de nuclease (Sigma) em 50 yjl de acetato de sédio 30mM pH 4,6, NaCI 200mM e ZnSO^ ImM durante 40 min. a 379C para criar extremidades cerses (ver fig.23). Apos extração com fenol clorofórmio o DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em H^O numa concentração de 0,25 mg/ml. 0,4 ^g (120 pmoles) de adaptador A fosforilado e emparelhado e 5 ^ig (1,5 pmoles) de pBR 322/PHO5 Bam -Rsa 637 cortado com Xba I /S^ são ligados através das extremidades cerses como descrito para o adaptador C exceptuando a utilização de ATP 3,5 mM. As outras construções são como descrito atras. Os clones resultantes são identificado pela letra A e referidos como p31/PHO5 595A-TPA, p31/PHO5 637A-TPA, p31/PHO5 811A-TPA e p31/PHO5 1312 A-TPA. Exemplo 16: Subclonagem de construção genética no vector de levedura de elevado numero de copias pJDB2O7 e transformação de S. cerevisiae GRF18 As construções descritas nos Exemplos 13-19 contêm o promotor de PH05 com ou sem extensões para a região codificadora do gene de PH05 . A região codificadora do TPA com ou sem prepo-sequência e os sinais de terminação da transcrição de PH05 num arranjo tendem, tudo inserido num vector derivado do pBR 322. Os fragmentos Bam HI-HIND III contendo todo o arranjo são ligados ao fragmento Bam Hl -Hind III de 6,4 kb do pJDB 207 como descrito para uma reacção analoga no Exemplo 10. Células E.coli HB101 competentes são transformadas e vãrias colonias amp^ de cada experiência são crescidas individualmente em meio LB com 100 ^ig/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídio é analisado por corte com as endonucleases de restrição Hind III, Bam Hl e Pst I. Partindo dos plasmídeos p31/PHO5-TPA 18, ρ31 /PHO5-TPA 42, p31R/SS-TPA /\ 2, p31R/SS-TPA/\ 3, Ρ31/ΡΗΟ5 595C-TPA, p31/PHO5 637C-TPA,’ p31/PHO5 811C-TPA, P31/PHO5 1312C-TPA, p31/PHO5 595B-TPA, p31/PHO5 637-TPA, P31/PHO5 811 B-TPA, p31/PHO5 1312 B-TPA, p31/PHO5 595 A-TPA P31/PHO5 637-TPA, p31/PHO5 811-A-TPA e p31/PHO5 1312A-TPA obtem-se os clones que se seguem com as inserções correctas PJDB2O7/PHO5-TPA18 PJDB2O7/PHO5-TPA42 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 2 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 3 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA PJDB2O7/PHO5 637C-TPA PJDB2O7/PHO5 811C-TPA PJDB2O7/PHO5 1312C-TPA PJDB2O7/PHO5 595B-TPA PJDB207/PH05 637B-TPA pJDB2O7/PHO5 811B-TPA PJDB2O7/PHO5 1312B-TPA pJDB2O7/PHO5 595A-TPA PJDB2O7/PHO5 637A-TPA PJDB2O7/PHO5 811A-TPA PJDB2O7/PHO5 1312A-TPA . Estes plasmídeos são introduzidos individualmente em Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 como descrito no Exemplo 11. Uma única colónia de levedura de cada uma das transformações de levedura ê picked. Os clones obtidos são designados por . Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2Ò7/PHO5-TPA18 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA42 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-SS-TPA/\ 2 Sacchãtúiuycea cerevisíae GRFi8/pJD32O7R/?HO5~SS-TPA /\ 3 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312B-TPA As células de levedura são crescidas colhidas e extraídas como descrito nos Exemplos 11 e 12. A actividade de TPA nos extractos celulares é testado como descrito no Exemplo 12. Os resultados estão apresen tados na tabela 3. Tabela 3: Actividade de TPA da estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformada com diferentes plasmídeos e testada em condições de desrepressão (Pi baixo) : plasmídeo Actividade de TPA(unidades/l de cultura de células de levedura/ OD^qq) PJDB2O7/PHO5-TPA18 750 PJDB2O7/PHO5-TPA42 700 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA_A 2 600 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA 3 650 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA 900 Exemplo 17: Substituição cromossómica do gene de PHO5 pelo gene do TPA (ver fig.25) A região codificadora da proteína TPA ê colocada no cromossoma II de levedura na posição da região codificadora da proteína PH05 . Experimentálmente isto ê con seguido por cotransformação. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 ê cotransformada com 25 ^ig do plasmídeo p31/PHO5 -TPA 18, linearizado com BnmHI e Hind III, e 3 ^xg do plasmídeo de levedura Yepl3 (51). De 24 colónias Leu obtidas, uma ê Pho5 e ao mesmo tempo produz aproximadamente 35 unidades de TPA/1 de cultura de células de levedura /0D600. Por crescimento deste transformante num meio contendo leucina (YPD, 10g/l de Bacto Yeast Extract, 20g/l de Bacto Peptone, 20 g/l de glucose) durante 10 gerações, segregantes Leu~são obtidos com uma frequência de 10-20¾ os quais provavelmente perderam o plasmideo Yep31. Por análise ou Southern do DNA total de levedura isolado dos segregantes Leu (52) verifica-se que no nível de DNA que as sequências codificadoras da proteína TPA substituem as sequências codificadores da proteína PH05 deixando inal. teradas as sequências ladeantes do cromossoma II. Seleccionou-se uma estirpe que se designou por Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (pho-5-ΤΡΑ)♦ Exemplo 18: Melhoramento de estirpe por mutação A estirpe Saccharomyces cerevisiae GRF18 /pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) é ainda desenvolvida para produção de TPA por mutação e selecção de baixa actividade de fosfatase ácida. Saccharomyces cerevisiae H2 4 3/pJDB 20 7/ /PH05 -TPA (IA) um mutante termo-sensível de Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5 TPA (IA) ê obtido por irra_2 diação com UV (0,08 yiWcm , 15 segundos, 99,2¾ de morte). As colónias são crescidas em meio YPD osmc ticamente estabilizado contendo sorbitol 1,2M (10 g/l de Bacto Yeast Extract, 20 g/l de Bacto Peptone, 20g/l de glucose, 20 g/l de agar Bacto) e transferidas para meio YPD sem sorbitol. Saccharomyces cerevisiae H243 ê isolada como colónia de crescimento lento. Cerca de 10$ células de Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA (IA) são semeadas em agar YNB (6,8 1 de yeast Nitrogen Base sem aminoãcidos ; 20 g/1 de glucose, 20 g/1 de agar Bacto, suplementado com 20 mg/1 de histidina) e são irradiadas directamente com UV (0,08 -2 uWcm durante 12 segundos). A morte e de 98¾. As colonias obtidas a partir das células sobreviventes são transferidas para meio de Pi baixo e dois dias depois coradas para a actividade de fosfatase acida por um teste de sobrecamada de agar mole (48). Os mutantes negativos para a fosfatase _4 acida são obtidos com uma frequência de mutaçao de 3,2x10 . A estirpe com o título de TPA mais elevado é seleccionado e referido como Saccharomyces cerevisiae H423/pJDB2O7/PHO5-TPA (IA). As actividades de TPA de tres estirpes diferentes de levedura transformadas com pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) estão apresentadas na Tabela 4. Tabela 4: Actividade de TPA de diferentes estirpes de Saccharomyces cerevisiae transformadas em condi ções de desrepressão (Pi baixo) Actividade de TPA (unidades/1 de cultura de células de levedura /OD^qq) GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) 625 H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 1560 H423/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 7200 • 1 Exemplo 19 : Produção de TPA por uma estirpe recombinante da levedura Saccharomyces cerevisiae numa escala de 30 1. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) possui um plasmídeo que inclui uma marca para leucina permitindo manutenção selectiva do plasmídeo no organismo hospedeiro, um gene estrutural para o TPA humano e o promotor da fosfatase acida PH05 que permite a expressão do gene do TPA em meios com quantidades limitativas de fosfato inorgânico (condições de desrepressão). A estirpe ê mantida em culturas de agar inclinado preparadas com um meio definido sem o aminoãcido leucina para assegurar a retenção do plasmídeo. Agar recentemente inoculado e incubado durante 24 horas a 30?C. A cultura â superfície de um dos agares inclinados ê ressuspensa em 3ml de meio de pre-cultura o qual ê então transferido para o primeiro balão de pre-cultura com agitação. 0 balão de 500 ml tem uma unica saída e contem 100 ml de meio I de pre-cultura tendo o seguinte composição ( valoreq em g/1). L-asparagina, 2,0; L-histidina, 0,02 glucose, 10 ; Kt^PO^, 1,0 ; MgSO4· 7H2O, 0,5 ; NaCl 0,1 ; CaCl2~2H2O, 0,1 ; solução de vitaminas 5 jil/1 e solução de micronutriantes 5 ml/1. 0 meio e ajustado a pH7,2 usando NaOH antes da esterilização . A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados à parte e adicionados ao meio. As soluções "stock” de vitaminas e micronutrientes têm as seguintes composições (em g/1): Vitaminas - biotina, 0,0002; D-pantotenato de cãlcio , 0,04 ; acido fõlico, 0,0002; acido micotínico, 0,04 ; acido p-aminobenzõico, 0,02 ; hidrocloreto de piridoxina, 0,04; riboflãvina, 0,02 ; hidrocloreto de tiamina, 0,04; e inositol 0,2 em 1 1 de agua desionizada ; micronutrientes - acido bórico 0,05 ; CuSO "^H 0, 0,004 ; Kl, 0,01; FeCl^.óH^O, 0,02 ; MnSO^, 0,04 ; NaMoO^. 2^0, 0,02 e ZnSO^.71^0, 0,04 em 1 1 de agua desionizada. 0 meio ê preparado usando agua desionizada. A primeira pré-cultura é incubada durante 24 horas a 309C num agitador orbitol com 5cm de excentricidade a uma velocidade de 250 rev/min. Os balões com a primeira pré-cultura constituem o inoculo para os balões da segunda pré-cultura. Estes balões recebem um inoculo de 1¾ (v/v). Eles contem 100 ml de meio II de pré-cultura tendo a seguinte composição (mg/1): Extracto de levedura (Difco), 10,0 ; L-asparagina, 6,6; Κ^ΡΟ^ 1.0 ; MgSO^.7H2O, 1,0 ; L-histidina, 0,02 e D-glucose (mono-hidrato) , 33,0. 0 meio que ê preparado usando agua desionizada tem um pH de aproximadamente 6,0. A glucose é esterilizada separadamente. As condições de incubação são idênticas âs da primeira pré-cultura. 0 caldo de cultura de 3 balões ê combinado para dar um inoculo a 1¾ v/v para o fermentador principal de produção. 0 fermentador de produção tem um volume total de aproximadamente 45 1, contem 4 saliências e um agitador de turbina de disco de seis lâminas com um diâmetro de 115 mm. A velocidade de agitação é de 600 rev/min, a sobrepressão de 0,3 bar e uma velocidade de arejamento de 0,5 vol/vol/min. * ,· Η Ο fermentador contem 30 1 de um meio com as composições seguintes: (valores em g/1): L-asparagina, 2,0 ; L-histidina, 0,02 ; Kí^PO^, 0,03; MgSO^. 71^0, 0,5; NaCl, 0,1, CaCl2.2H2O, 0,1 ; KC1, ip ; D-glucose (mono -hidrato) , 20,0 ; solução de vitaminas 5 ml/1 e solução micronutrientes, 5ml/l. 0 meio ê ajustado pH 7,2 usando NaOH antes da esterilização. A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados separadamente e adicionados ao meio. As soluções "stock" de vitaminas e micronutrientes têm composição idêntica às descritas para o meio I de prê-cultura. A temperatura de fermentação ê de 309C. 0 pH desce para 5,0 onde ê controlado usando NaOH. Apos fermentação durante cerca de 20 horas atinge-se a produção máxima de TPA. A densidade óptica que atinge 2-3 unidades e a actividade de fosfatase ácida dão indicações uteis àcer ca do progresso da fermentação. 0 calor de fermentação ê arrefecido para 109C antes da colheita das células de levedura. Exemplo 20: Recuperação e purificação do TPA e pro-TPA por cromatografia com anticorpos monoclonais anti-TPA a) Preparação de extractos celulares 0 líquido de cultura (pH4) dos 30 1 de fermentação (cf.Exemplo 19) é arrefecido atê 109C e centrifugado usando uma centrífuga Alfa-Laval BRPX-207. As células separadas são ressuspensas em 21 de tampão de lise A ( NaH2P04 20mM, f^HPO^ 80mM, NaCl 150 mM, 0,01¾ de Tween, Benzamidina lOmM e EDTA lOmM). • 1 ί »» A solução é arrefecida atê 59C e passa da através de um moinho Dyno (tipo KDL-Pilot) com uma velocidade de alimentação de 101/h. 0 moinho estã equipado com 500 ml de pérolas de vidro de 0,5 -0,75 m de diâmetro e ê ligado a 3000 rev/min. Antes da adição das pérolas de vidro às células em suspensão aquelas são lavadas com 300 ml de tampão de lise A contendo 30 mg de BSA. A suspensão de células ê centrifugada ( rotor Sorvall 653, 40 min. 9000 rpm) e o sedimento rejeitado. b) Digestão do DNA^e fraccionamento com sulfato de amonio Adiciona-se 5 mg de DNAse a 2 1 da suspensão clarificada e a mistura ê agitada durante 30 min. a 49C. Subsequentemente a solução é levada a 35¾ de saturação com (NH^^SO^ (p/v) e ê agitada durante 1 hora a 49C. A solução ê centrifugada como descrito atrãs e o sedimento contendo toda a actividade de TPA ê ressuspensa em 1 1 de tampão H contendo 1¾ de Tween e 0,1¾ de SDS. A suspensão ê agitada durante pelo menos 1 hora a 49C. c) Cromatografia de imunoafinidade I) Purificação do anticorpo anti-TPA 5 ml de soro de coelho, anti -TPA (oferecido pelo Dr. E. Reich, Friedrich -Miescher-Institut Basel) são passados por uma coluna de sefarose com lisina para renovar o plasminogenio de soro. A coluna ê lavada com 1-2 volumes de PB5 pH 7,4 contendo NaCl 100 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP04 8,lmM e KH2PO4 1,5 mM. $ rf* « « Ο líquido da coluna e de lavagens são juntos. 0 anti-soro sem plasminogênio é precipitado pela adição de (NH^)2SO^ sólido para uma concentração final de 50¾ (p/v). A solução ê mantida durante a noite a 4?C e em seguida centrifugada ( rotor Sorvall GSA,1200 rpm, 20 min.) . 0 precipitado e dissolvido num peque no volume de PB5 e dializado contra PBS contendo 0,1 ¾ de NaNj. A IgG desta solução dializada e purificada numa coluna de proteína A -sefarose (55). II) Preparação de uma coluna com anticorpo anti-TPA 13 mg de anticorpo anti-TPA purificado são dializados contra MOPS 0,1 M pH7,0. 0 anticorpo e ligado a 5 ml de Affigel 10 activado ( Biorad ) segundo as instruções do fabricante. A matrix do gel ó equilibrada com PBS contendo 1¾ de Tween 80, 0,1¾ de SDS, NaCl 0,2M, Benzamidin lOmM e 0,1¾ de NaN^. A matrix e aplicada numa coluna de 5 ml. III) Purificação de TPA por cromatografia de imunoafinidade. 0 sedimento redissolvido do fraccionamento com sulfato de amónio ê centrifugado para remover o material insolúvel ( rotor Sorvall GSA, 30 min. 12000rpm) e subsequentemente aplicado â coluna de afinidade a uma ve locidade de fluxo de cerca de lOml/hr a 49C. Depois de todo o volume ter passado através da coluna esta ê lavada com 10 volumes da coluna de PBS contendo 0,05¾. de Tween 80. A coluna ê eluída usando glicina-ΗΟΙΟ,ΙΜ pH2,5 contendo 0,1 ¾ de Tween. São colhidas fracções de 2 ml e testados para a actividade de TPA segundo o método de Rânby (49). Como substracto usa-se D-Val-Leu-Lis -pNA (Kabi -S-2251). As fracções com actividades mais elevadas são reunidas, neutralizadas usando Tris IM e concentradas por ultrafiltração usando uma membrana Amicon YM10. 0 TPA assim obtido apresenta cerca de 90¾ de pureza e estã predominantemente em forma de cadeia unica ( pro-TPA) como evidenciado por SDS-PAGE em condições de redução. 0 peso molecular aparente em condições não redutoras ê de cerca de 60 000 por SDS -PAGE (ver figura A). Figuras A e B : electroforese em gel de poliacrilamida-SDS do produto do gene TPA em levedura (Figura A) e a sua actividade enzimãtica num gel de actividade (placas com caseína) ( figura B). B:gel de actividade A:gel com SDS ad figura A (SDS-PAGE): Faixas 1 e 4 : proteínas padrão (marcadores de peso molecular) Faixas 2 e 5 : TPA de melanoma Faixas 3 e 6 : TPA de levedura Faixas 1 - 3 : em condições de redução Faixas 4 - 6 : em condições de não-redução As amostras correram num gel de 12,5¾ que se corou para proteínas usando azul Coomassie brilhante. ad. figura B (gel de actividade, cf. Exemplo 23): Faixa 1 : TPA de melanoma Faixa 2 : TPA de levedura Sobre-camada para plasminogénio de agar com caseira (referência 56) . Exemplo 21: Recuperação e purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia de afinidade com DE-3 a. Preparação de uma coluna de DE-3 Sepharosé 26 mg do inibidor DE-3 purificado a partir de Erythrina latíssima (16) são acoplados a 5 ml de Sepharose 4b ® activada com brometo de cianogênio (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante. A matrix ê equilibrada com tampão fosfato salino ("PBS") pH 7,4 contendo NaCl 0,4M, 0,1¾ de Triton X-100R e 0,02¾ de azida de sódio. A matrix ê então acamada numa coluna de 5 ml. b. Purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia em DE-3 R Sepharose 4b Os extractos celulares (cf. Exemplo 20a) são tornados 0,4 M relativamente a NaCl e 0,1¾ para Triton X-lOCr^ e filtrados através de uma membrana de 0,45 ^im (Millipore). A solução ê então aplicada à coluna de DE-3 Sepharose (ver atras) a uma velocidade de fluxo de 45ml/hr â temperatura ambiente e o efluente ê rejeitado. Depois do volume total do extracto ter passado através da coluna esta ê lavada com cerca de 50 ml de PB5 contendo NaCl 0,4 M e 0,1 ¾ de Triton X-lOO*' sendo colhidos fracções de 2 ml a 49C. 0 conteúdo protêico de cada fracção ê determinado por medição da absorvância de UV a 280nm. A proteína adsorvida verificou-se ser eluída como um pico bem definido. As fracções contendo os valores mais elevados de absorvância de UV e de activida125 de fibrinolítica determinada pelo teste da I fibrina (47) são reunidas dando 8 ml de solução que se guardou a -209 C. Isto representa aproximadamente 70-80¾ da actividade total aplicada à coluna. As fracções com as actividades »· mais baixas são reunidas separadamente. A recuperação total de actividade em ambos os conjuntos de fracções monta os 90-100¾. c). Purificação de pro-TPA por cromatografia em DE-3 Sepharose 4b® na presença de um inibidor de proteíases. A cromatografia dos extractos de células de levedura ê feita de modo semelhante ao descrito no Exemplo 21b exceptuando a inclusão neste caso do inibidor de tripsina pancreãtica bãsica (BPTI) a 0,1 KlU/ml usando o teste fluorimétrico como Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC como substracto (37) determinou-se o conteúdo em TPA e pro-TPA da solução purificada. 90¾ do TPA estã na forma de pro-enzima e 10¾ na forma activa. Assim, a conversão de pro-TPA em TPA durante o processo de purificação é inibido pelo BPTI. Exemplo 22: Separação de pro-TPA do TPA A solução de TPA e pro-TPA obtida como descrito no Exemplo 21c e ajustada a pH8,0 com Tris.HCl O,1M contendo 0,1¾ de Triton X-lOcP e tornado lmM relativamente ao diisopropilfluorofosfato. Apos incubação a 37?C durante 4 horas, a mistura ê passada através de uma coluna de 5 ml de DE-3 Sepharose® (cf. Exemplo 21a). 0 efluente contendo o TPA irreversivelmente inibido é rejeitado. A coluna e lavada com 6 volumes de coluna de PBS contendo NaCl 0,4 M e 0,1¾ de Triton X-IOC^ e subsequentemente eluída com PB5 contendo K SCN 1,6M, NaCl 0,4M e 0,1¾ de Triton X-10C^ como descrito no Exemplo 21b . As fracções apresentando as absorvân. 1 s· P0RWI « ? » ... Ή , - - - , __. «τ'. cias de UV mais elevadas são reunidas. 0 conjunto de fracções contem pro-TPA numa forma substancialmente pura uma vez que não se detecta actividade amidolítica no teste fluorimêtrico usando Cbz-Gli-Gli-Arg-AMC (37) como substrato. A actividade amidolítica assim como a fibrinolítica pode ser restabelecida por tratamento com plasmina a qual converte pro-TPA em enzima activa. Exemplo 23: Propriedades do produto do gene TPA em levedura a. Propriedades enzimãticas 0 produto do gene TPA em levedura obtido segundo o Exemplo 19 e purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 (cf. Exemplo 21b) ê enzimãticamente activo como se mostra por clivagem de plasminogênio zimogênio em plasmina na ausência e na presença de fibrina. A actividade enzimãtica pode ser verificada pelos testes colorimêtricos descritos por Ranby (49) (cf. Exemplo 12) e por Verheijen et al. (60) , em placas de caseína e de fibrina (56) e num teste de fase solida com 12 9 I - fibrinogenio ( 47). A actividade enzimãtica em placas de caseína ê mostrada na figura B ( cf. Exemplo 20 c III). A actividade enzimãtica do TPA obtido ê grandemente estimulada pela fibrina. 0 TPA parcialmente purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 ê testado num teste de velocidade parabólica (cf. Ranby (49)). Tomando a velocidade reacção Δ E versus Δ t^ entre e 5 minutos como uma medida da actividade enzimãtica a estimulação por concentração óptimas de fibrina ê de 10-20 vezes ( ca. 100 yig /ml) . 0 efeito pode ser observado com fragmentos de fibrina obtidos por digestão com CnBr |
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1985
- 1985-07-09 JP JP50324385A patent/JPS61502655A/ja active Pending
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1986
- 1986-03-07 DK DK103886A patent/DK103886A/da not_active Application Discontinuation
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Publication number | Publication date |
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DK103886A (da) | 1986-05-07 |
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