PT79518B - 54). 5 ^ig do plasmídeo pBR 322 /PHO5 Bam Rsa 637 são digeridos com a endonuclease de restrição Xbal. Apos digestão completa o DNA ê extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. 0 DNA ê redissolvido em Tris.HCl 50mM pH8,0 numa concentração de 50 p-g/nd. e ê digerido com 11 unidades de fosfatase alcalina do intestino de vitela (Boehringer), durante 1 hora a 379C. - 97 fORHjf y| A enzima ê inativada a 65 9C durante 1 hora. 0 DNA ê purificado por cromatografia de troca iõnica em DE 52 ( Whatman) e precipitação com etanol como descrito no Exemplo 9Aa. Dois oligodeoxinucleotídeos sintéticos com a formula 5’-CTAGAAGGGGTATCTTTGGATAAGA - 3' 3’- TTCCCCATAGAAACCTATTCTCTAG -5' são fosforilados individualmente nas suas extremidades 5' como descrito no Exemplo 9Ab. Os oligodeoxinacleotídeos fosforilados são misturados em quantidades equimolares . A mistura ê aquecida durante 10 min. a 759C, depois deixada arrefecer lentamente atê à temperatura ambiente e guardada a -209C. Este adaptador ê designado por adaptador C. 1 ^ig (120 pmoles) do adaptador C emparelhado e fosforilado e 5 pg (1,5 pmoles) de pBR322/ /PH05 Bam-Rsa 637 desfosforilado e cortado com Xba I são ligados em 40^1 de Tris.HCl 60mM pH 7,5, MgCl2 lOmM, DTT 5mM, ATP lmM, 1600 unidades da ligase de DNA do T4 a 159C durante 20 horas. A ligase de DNA ê inactivada durante 10 min. a 859C e o excesso de adaptadores ê removido por precipitação com isopropanol. 0 DNA ê redissolvido em H20 numa concentração de 0,25 mg/ml. Os múltiplos de adaptadores são removidos por digestão com a endonuclease de restrição BglII. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido e depois digerido com Bam HI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris-borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento Bam HI-BglII de 662 pb (derivado de fragmento Bam HI-Rsa I de 637 pb) ê localizado e removido do gel. c) Isolamento de um fragmento de vector contendo a sequência codificadora do TPA maduro ( fig. 23) 5 yig do plasmídeo p31R/SS-TPA /\ 2, são digeridos com as endonucleases de restrição Bam HI e BglII. Após digestão completo de DNA e precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCl 50mM pH 8,0 numa concentração de 75 jxg /ml. Os fragmentos de DNA sao desforilados nas suas extremidades 5' por digestão com 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela ( Boehringer) em 60 de Tris.HCl 50mM pH 8,0 durante 1 hora a 379 C. A fosfatase ê inactivada por incubação a 659C durante 1,5 horas. 0 DNA é purificado por cromatografia de troca iónica em DE-52 (Whatman) como descrito no Exemplo 9Aa. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido em Tris-HCl lOmM, pH8,0 e aplicada num gel de 0,6 °'o de agarose de ponto de fusão baixo. 0 fragmento maior Bam HI -BglII de 5,2 kb ê removido do gel. d) Ligação dos fragmentos de DNA isolados e transformação de E.coli HB 101 (cf. figs 23 e 24 ). Dois blocos de gel de agarose de ponto de fusão baixo contendo 0,1 pmoles do fragmento Bam HIBglII de 5,2 kb de p31R/SS-TPA/\ 2 e 0,2 pmoles do fragmen to BamHI -BglII de 662 pb de pBR322/PHO5 Bam-Rsa 637, respectivamente, são misturados, liquefeitos a 659C e diluídos para baixar a concentração de agarose para 0,3¾. A ligação ê feita em 150^1 de Tris.HCl 60mM, pH 7,5; MgCl^ lOmM, 99 jr £ DTT 5mM, ATP ImM e 800 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) a 159C durante 16 horas. Amostras de 10 ^il e 30 yjl são misturadas com 100 p.1 de células E.coliHB 101 competentes para a transformação como descrito no Exemplo 4a. - R 6 colonias transformadas amp são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 ^g/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê analisado quanto ao tamanho e orientação da invenção por corte com a endonuclease de restrição Bam Hl. Um único clone com a orientação correcta da inserção é designado por p31/PHO5 637-TPA (cf. fig. 23). 0 plasmídeo pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 pode também ser substituído por pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 595, pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 811 e pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 1312 . Seguindo o processo descrito atras são isolados clones únicos com inserções do tamanho e orientação esperados e designados por p31/PHO5 595C-TPA, p51/PHO5 811C-TPA e p31/PHO5 1312 C-TPA. 0 adaptador C pode também ser substituído pelo adaptador B com a seguinte férmula 5' -CTAGATAAGAGATCTGC -3’ 3’ TATTCTCTAGACG -5' o qual codifica Lis -Arg na construção final (fig. 24). A fosforilação dos oligodeoxinucleotídeos sintéticos e emparelhamento são como descrito para o adaptador C. Para a adição do adaptador 5 de pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 cortado com Xba I são digeridos com 2 unidades de nuclease (Sigma) em 50 yjl de acetato de sédio 30mM pH 4,6, NaCI 200mM e ZnSO^ ImM durante 40 min. a 379C para criar extremidades cerses (ver fig.23). Apos extração com fenol clorofórmio o DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em H^O numa concentração de 0,25 mg/ml. 0,4 ^g (120 pmoles) de adaptador A fosforilado e emparelhado e 5 ^ig (1,5 pmoles) de pBR 322/PHO5 Bam -Rsa 637 cortado com Xba I /S^ são ligados através das extremidades cerses como descrito para o adaptador C exceptuando a utilização de ATP 3,5 mM. As outras construções são como descrito atras. Os clones resultantes são identificado pela letra A e referidos como p31/PHO5 595A-TPA, p31/PHO5 637A-TPA, p31/PHO5 811A-TPA e p31/PHO5 1312 A-TPA. Exemplo 16: Subclonagem de construção genética no vector de levedura de elevado numero de copias pJDB2O7 e transformação de S. cerevisiae GRF18 As construções descritas nos Exemplos 13-19 contêm o promotor de PH05 com ou sem extensões para a região codificadora do gene de PH05 . A região codificadora do TPA com ou sem prepo-sequência e os sinais de terminação da transcrição de PH05 num arranjo tendem, tudo inserido num vector derivado do pBR 322. Os fragmentos Bam HI-HIND III contendo todo o arranjo são ligados ao fragmento Bam Hl -Hind III de 6,4 kb do pJDB 207 como descrito para uma reacção analoga no Exemplo 10. Células E.coli HB101 competentes são transformadas e vãrias colonias amp^ de cada experiência são crescidas individualmente em meio LB com 100 ^ig/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídio é analisado por corte com as endonucleases de restrição Hind III, Bam Hl e Pst I. Partindo dos plasmídeos p31/PHO5-TPA 18, ρ31 /PHO5-TPA 42, p31R/SS-TPA /\ 2, p31R/SS-TPA/\ 3, Ρ31/ΡΗΟ5 595C-TPA, p31/PHO5 637C-TPA,’ p31/PHO5 811C-TPA, P31/PHO5 1312C-TPA, p31/PHO5 595B-TPA, p31/PHO5 637-TPA, P31/PHO5 811 B-TPA, p31/PHO5 1312 B-TPA, p31/PHO5 595 A-TPA P31/PHO5 637-TPA, p31/PHO5 811-A-TPA e p31/PHO5 1312A-TPA obtem-se os clones que se seguem com as inserções correctas PJDB2O7/PHO5-TPA18 PJDB2O7/PHO5-TPA42 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 2 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 3 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA PJDB2O7/PHO5 637C-TPA PJDB2O7/PHO5 811C-TPA PJDB2O7/PHO5 1312C-TPA PJDB2O7/PHO5 595B-TPA PJDB207/PH05 637B-TPA pJDB2O7/PHO5 811B-TPA PJDB2O7/PHO5 1312B-TPA pJDB2O7/PHO5 595A-TPA PJDB2O7/PHO5 637A-TPA PJDB2O7/PHO5 811A-TPA PJDB2O7/PHO5 1312A-TPA . Estes plasmídeos são introduzidos individualmente em Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 como descrito no Exemplo 11. Uma única colónia de levedura de cada uma das transformações de levedura ê picked. Os clones obtidos são designados por . Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2Ò7/PHO5-TPA18 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA42 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-SS-TPA/\ 2 Sacchãtúiuycea cerevisíae GRFi8/pJD32O7R/?HO5~SS-TPA /\ 3 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312B-TPA As células de levedura são crescidas colhidas e extraídas como descrito nos Exemplos 11 e 12. A actividade de TPA nos extractos celulares é testado como descrito no Exemplo 12. Os resultados estão apresen tados na tabela 3. Tabela 3: Actividade de TPA da estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformada com diferentes plasmídeos e testada em condições de desrepressão (Pi baixo) : plasmídeo Actividade de TPA(unidades/l de cultura de células de levedura/ OD^qq) PJDB2O7/PHO5-TPA18 750 PJDB2O7/PHO5-TPA42 700 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA_A 2 600 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA 3 650 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA 900 Exemplo 17: Substituição cromossómica do gene de PHO5 pelo gene do TPA (ver fig.25) A região codificadora da proteína TPA ê colocada no cromossoma II de levedura na posição da região codificadora da proteína PH05 . Experimentálmente isto ê con seguido por cotransformação. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 ê cotransformada com 25 ^ig do plasmídeo p31/PHO5 -TPA 18, linearizado com BnmHI e Hind III, e 3 ^xg do plasmídeo de levedura Yepl3 (51). De 24 colónias Leu obtidas, uma ê Pho5 e ao mesmo tempo produz aproximadamente 35 unidades de TPA/1 de cultura de células de levedura /0D600. Por crescimento deste transformante num meio contendo leucina (YPD, 10g/l de Bacto Yeast Extract, 20g/l de Bacto Peptone, 20 g/l de glucose) durante 10 gerações, segregantes Leu~são obtidos com uma frequência de 10-20¾ os quais provavelmente perderam o plasmideo Yep31. Por análise ou Southern do DNA total de levedura isolado dos segregantes Leu (52) verifica-se que no nível de DNA que as sequências codificadoras da proteína TPA substituem as sequências codificadores da proteína PH05 deixando inal. teradas as sequências ladeantes do cromossoma II. Seleccionou-se uma estirpe que se designou por Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (pho-5-ΤΡΑ)♦ Exemplo 18: Melhoramento de estirpe por mutação A estirpe Saccharomyces cerevisiae GRF18 /pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) é ainda desenvolvida para produção de TPA por mutação e selecção de baixa actividade de fosfatase ácida. Saccharomyces cerevisiae H2 4 3/pJDB 20 7/ /PH05 -TPA (IA) um mutante termo-sensível de Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5 TPA (IA) ê obtido por irra_2 diação com UV (0,08 yiWcm , 15 segundos, 99,2¾ de morte). As colónias são crescidas em meio YPD osmc ticamente estabilizado contendo sorbitol 1,2M (10 g/l de Bacto Yeast Extract, 20 g/l de Bacto Peptone, 20g/l de glucose, 20 g/l de agar Bacto) e transferidas para meio YPD sem sorbitol. Saccharomyces cerevisiae H243 ê isolada como colónia de crescimento lento. Cerca de 10$ células de Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA (IA) são semeadas em agar YNB (6,8 1 de yeast Nitrogen Base sem aminoãcidos ; 20 g/1 de glucose, 20 g/1 de agar Bacto, suplementado com 20 mg/1 de histidina) e são irradiadas directamente com UV (0,08 -2 uWcm durante 12 segundos). A morte e de 98¾. As colonias obtidas a partir das células sobreviventes são transferidas para meio de Pi baixo e dois dias depois coradas para a actividade de fosfatase acida por um teste de sobrecamada de agar mole (48). Os mutantes negativos para a fosfatase _4 acida são obtidos com uma frequência de mutaçao de 3,2x10 . A estirpe com o título de TPA mais elevado é seleccionado e referido como Saccharomyces cerevisiae H423/pJDB2O7/PHO5-TPA (IA). As actividades de TPA de tres estirpes diferentes de levedura transformadas com pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) estão apresentadas na Tabela 4. Tabela 4: Actividade de TPA de diferentes estirpes de Saccharomyces cerevisiae transformadas em condi ções de desrepressão (Pi baixo) Actividade de TPA (unidades/1 de cultura de células de levedura /OD^qq) GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) 625 H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 1560 H423/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 7200 • 1 Exemplo 19 : Produção de TPA por uma estirpe recombinante da levedura Saccharomyces cerevisiae numa escala de 30 1. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) possui um plasmídeo que inclui uma marca para leucina permitindo manutenção selectiva do plasmídeo no organismo hospedeiro, um gene estrutural para o TPA humano e o promotor da fosfatase acida PH05 que permite a expressão do gene do TPA em meios com quantidades limitativas de fosfato inorgânico (condições de desrepressão). A estirpe ê mantida em culturas de agar inclinado preparadas com um meio definido sem o aminoãcido leucina para assegurar a retenção do plasmídeo. Agar recentemente inoculado e incubado durante 24 horas a 30?C. A cultura â superfície de um dos agares inclinados ê ressuspensa em 3ml de meio de pre-cultura o qual ê então transferido para o primeiro balão de pre-cultura com agitação. 0 balão de 500 ml tem uma unica saída e contem 100 ml de meio I de pre-cultura tendo o seguinte composição ( valoreq em g/1). L-asparagina, 2,0; L-histidina, 0,02 glucose, 10 ; Kt^PO^, 1,0 ; MgSO4· 7H2O, 0,5 ; NaCl 0,1 ; CaCl2~2H2O, 0,1 ; solução de vitaminas 5 jil/1 e solução de micronutriantes 5 ml/1. 0 meio e ajustado a pH7,2 usando NaOH antes da esterilização . A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados à parte e adicionados ao meio. As soluções "stock” de vitaminas e micronutrientes têm as seguintes composições (em g/1): Vitaminas - biotina, 0,0002; D-pantotenato de cãlcio , 0,04 ; acido fõlico, 0,0002; acido micotínico, 0,04 ; acido p-aminobenzõico, 0,02 ; hidrocloreto de piridoxina, 0,04; riboflãvina, 0,02 ; hidrocloreto de tiamina, 0,04; e inositol 0,2 em 1 1 de agua desionizada ; micronutrientes - acido bórico 0,05 ; CuSO "^H 0, 0,004 ; Kl, 0,01; FeCl^.óH^O, 0,02 ; MnSO^, 0,04 ; NaMoO^. 2^0, 0,02 e ZnSO^.71^0, 0,04 em 1 1 de agua desionizada. 0 meio ê preparado usando agua desionizada. A primeira pré-cultura é incubada durante 24 horas a 309C num agitador orbitol com 5cm de excentricidade a uma velocidade de 250 rev/min. Os balões com a primeira pré-cultura constituem o inoculo para os balões da segunda pré-cultura. Estes balões recebem um inoculo de 1¾ (v/v). Eles contem 100 ml de meio II de pré-cultura tendo a seguinte composição (mg/1): Extracto de levedura (Difco), 10,0 ; L-asparagina, 6,6; Κ^ΡΟ^ 1.0 ; MgSO^.7H2O, 1,0 ; L-histidina, 0,02 e D-glucose (mono-hidrato) , 33,0. 0 meio que ê preparado usando agua desionizada tem um pH de aproximadamente 6,0. A glucose é esterilizada separadamente. As condições de incubação são idênticas âs da primeira pré-cultura. 0 caldo de cultura de 3 balões ê combinado para dar um inoculo a 1¾ v/v para o fermentador principal de produção. 0 fermentador de produção tem um volume total de aproximadamente 45 1, contem 4 saliências e um agitador de turbina de disco de seis lâminas com um diâmetro de 115 mm. A velocidade de agitação é de 600 rev/min, a sobrepressão de 0,3 bar e uma velocidade de arejamento de 0,5 vol/vol/min. * ,· Η Ο fermentador contem 30 1 de um meio com as composições seguintes: (valores em g/1): L-asparagina, 2,0 ; L-histidina, 0,02 ; Kí^PO^, 0,03; MgSO^. 71^0, 0,5; NaCl, 0,1, CaCl2.2H2O, 0,1 ; KC1, ip ; D-glucose (mono -hidrato) , 20,0 ; solução de vitaminas 5 ml/1 e solução micronutrientes, 5ml/l. 0 meio ê ajustado pH 7,2 usando NaOH antes da esterilização. A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados separadamente e adicionados ao meio. As soluções "stock" de vitaminas e micronutrientes têm composição idêntica às descritas para o meio I de prê-cultura. A temperatura de fermentação ê de 309C. 0 pH desce para 5,0 onde ê controlado usando NaOH. Apos fermentação durante cerca de 20 horas atinge-se a produção máxima de TPA. A densidade óptica que atinge 2-3 unidades e a actividade de fosfatase ácida dão indicações uteis àcer ca do progresso da fermentação. 0 calor de fermentação ê arrefecido para 109C antes da colheita das células de levedura. Exemplo 20: Recuperação e purificação do TPA e pro-TPA por cromatografia com anticorpos monoclonais anti-TPA a) Preparação de extractos celulares 0 líquido de cultura (pH4) dos 30 1 de fermentação (cf.Exemplo 19) é arrefecido atê 109C e centrifugado usando uma centrífuga Alfa-Laval BRPX-207. As células separadas são ressuspensas em 21 de tampão de lise A ( NaH2P04 20mM, f^HPO^ 80mM, NaCl 150 mM, 0,01¾ de Tween, Benzamidina lOmM e EDTA lOmM). • 1 ί »» A solução é arrefecida atê 59C e passa da através de um moinho Dyno (tipo KDL-Pilot) com uma velocidade de alimentação de 101/h. 0 moinho estã equipado com 500 ml de pérolas de vidro de 0,5 -0,75 m de diâmetro e ê ligado a 3000 rev/min. Antes da adição das pérolas de vidro às células em suspensão aquelas são lavadas com 300 ml de tampão de lise A contendo 30 mg de BSA. A suspensão de células ê centrifugada ( rotor Sorvall 653, 40 min. 9000 rpm) e o sedimento rejeitado. b) Digestão do DNA^e fraccionamento com sulfato de amonio Adiciona-se 5 mg de DNAse a 2 1 da suspensão clarificada e a mistura ê agitada durante 30 min. a 49C. Subsequentemente a solução é levada a 35¾ de saturação com (NH^^SO^ (p/v) e ê agitada durante 1 hora a 49C. A solução ê centrifugada como descrito atrãs e o sedimento contendo toda a actividade de TPA ê ressuspensa em 1 1 de tampão H contendo 1¾ de Tween e 0,1¾ de SDS. A suspensão ê agitada durante pelo menos 1 hora a 49C. c) Cromatografia de imunoafinidade I) Purificação do anticorpo anti-TPA 5 ml de soro de coelho, anti -TPA (oferecido pelo Dr. E. Reich, Friedrich -Miescher-Institut Basel) são passados por uma coluna de sefarose com lisina para renovar o plasminogenio de soro. A coluna ê lavada com 1-2 volumes de PB5 pH 7,4 contendo NaCl 100 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP04 8,lmM e KH2PO4 1,5 mM. $ rf* « « Ο líquido da coluna e de lavagens são juntos. 0 anti-soro sem plasminogênio é precipitado pela adição de (NH^)2SO^ sólido para uma concentração final de 50¾ (p/v). A solução ê mantida durante a noite a 4?C e em seguida centrifugada ( rotor Sorvall GSA,1200 rpm, 20 min.) . 0 precipitado e dissolvido num peque no volume de PB5 e dializado contra PBS contendo 0,1 ¾ de NaNj. A IgG desta solução dializada e purificada numa coluna de proteína A -sefarose (55). II) Preparação de uma coluna com anticorpo anti-TPA 13 mg de anticorpo anti-TPA purificado são dializados contra MOPS 0,1 M pH7,0. 0 anticorpo e ligado a 5 ml de Affigel 10 activado ( Biorad ) segundo as instruções do fabricante. A matrix do gel ó equilibrada com PBS contendo 1¾ de Tween 80, 0,1¾ de SDS, NaCl 0,2M, Benzamidin lOmM e 0,1¾ de NaN^. A matrix e aplicada numa coluna de 5 ml. III) Purificação de TPA por cromatografia de imunoafinidade. 0 sedimento redissolvido do fraccionamento com sulfato de amónio ê centrifugado para remover o material insolúvel ( rotor Sorvall GSA, 30 min. 12000rpm) e subsequentemente aplicado â coluna de afinidade a uma ve locidade de fluxo de cerca de lOml/hr a 49C. Depois de todo o volume ter passado através da coluna esta ê lavada com 10 volumes da coluna de PBS contendo 0,05¾. de Tween 80. A coluna ê eluída usando glicina-ΗΟΙΟ,ΙΜ pH2,5 contendo 0,1 ¾ de Tween. São colhidas fracções de 2 ml e testados para a actividade de TPA segundo o método de Rânby (49). Como substracto usa-se D-Val-Leu-Lis -pNA (Kabi -S-2251). As fracções com actividades mais elevadas são reunidas, neutralizadas usando Tris IM e concentradas por ultrafiltração usando uma membrana Amicon YM10. 0 TPA assim obtido apresenta cerca de 90¾ de pureza e estã predominantemente em forma de cadeia unica ( pro-TPA) como evidenciado por SDS-PAGE em condições de redução. 0 peso molecular aparente em condições não redutoras ê de cerca de 60 000 por SDS -PAGE (ver figura A). Figuras A e B : electroforese em gel de poliacrilamida-SDS do produto do gene TPA em levedura (Figura A) e a sua actividade enzimãtica num gel de actividade (placas com caseína) ( figura B). B:gel de actividade A:gel com SDS ad figura A (SDS-PAGE): Faixas 1 e 4 : proteínas padrão (marcadores de peso molecular) Faixas 2 e 5 : TPA de melanoma Faixas 3 e 6 : TPA de levedura Faixas 1 - 3 : em condições de redução Faixas 4 - 6 : em condições de não-redução As amostras correram num gel de 12,5¾ que se corou para proteínas usando azul Coomassie brilhante. ad. figura B (gel de actividade, cf. Exemplo 23): Faixa 1 : TPA de melanoma Faixa 2 : TPA de levedura Sobre-camada para plasminogénio de agar com caseira (referência 56) . Exemplo 21: Recuperação e purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia de afinidade com DE-3 a. Preparação de uma coluna de DE-3 Sepharosé 26 mg do inibidor DE-3 purificado a partir de Erythrina latíssima (16) são acoplados a 5 ml de Sepharose 4b ® activada com brometo de cianogênio (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante. A matrix ê equilibrada com tampão fosfato salino ("PBS") pH 7,4 contendo NaCl 0,4M, 0,1¾ de Triton X-100R e 0,02¾ de azida de sódio. A matrix ê então acamada numa coluna de 5 ml. b. Purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia em DE-3 R Sepharose 4b Os extractos celulares (cf. Exemplo 20a) são tornados 0,4 M relativamente a NaCl e 0,1¾ para Triton X-lOCr^ e filtrados através de uma membrana de 0,45 ^im (Millipore). A solução ê então aplicada à coluna de DE-3 Sepharose (ver atras) a uma velocidade de fluxo de 45ml/hr â temperatura ambiente e o efluente ê rejeitado. Depois do volume total do extracto ter passado através da coluna esta ê lavada com cerca de 50 ml de PB5 contendo NaCl 0,4 M e 0,1 ¾ de Triton X-lOO*' sendo colhidos fracções de 2 ml a 49C. 0 conteúdo protêico de cada fracção ê determinado por medição da absorvância de UV a 280nm. A proteína adsorvida verificou-se ser eluída como um pico bem definido. As fracções contendo os valores mais elevados de absorvância de UV e de activida125 de fibrinolítica determinada pelo teste da I fibrina (47) são reunidas dando 8 ml de solução que se guardou a -209 C. Isto representa aproximadamente 70-80¾ da actividade total aplicada à coluna. As fracções com as actividades »· mais baixas são reunidas separadamente. A recuperação total de actividade em ambos os conjuntos de fracções monta os 90-100¾. c). Purificação de pro-TPA por cromatografia em DE-3 Sepharose 4b® na presença de um inibidor de proteíases. A cromatografia dos extractos de células de levedura ê feita de modo semelhante ao descrito no Exemplo 21b exceptuando a inclusão neste caso do inibidor de tripsina pancreãtica bãsica (BPTI) a 0,1 KlU/ml usando o teste fluorimétrico como Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC como substracto (37) determinou-se o conteúdo em TPA e pro-TPA da solução purificada. 90¾ do TPA estã na forma de pro-enzima e 10¾ na forma activa. Assim, a conversão de pro-TPA em TPA durante o processo de purificação é inibido pelo BPTI. Exemplo 22: Separação de pro-TPA do TPA A solução de TPA e pro-TPA obtida como descrito no Exemplo 21c e ajustada a pH8,0 com Tris.HCl O,1M contendo 0,1¾ de Triton X-lOcP e tornado lmM relativamente ao diisopropilfluorofosfato. Apos incubação a 37?C durante 4 horas, a mistura ê passada através de uma coluna de 5 ml de DE-3 Sepharose® (cf. Exemplo 21a). 0 efluente contendo o TPA irreversivelmente inibido é rejeitado. A coluna e lavada com 6 volumes de coluna de PBS contendo NaCl 0,4 M e 0,1¾ de Triton X-IOC^ e subsequentemente eluída com PB5 contendo K SCN 1,6M, NaCl 0,4M e 0,1¾ de Triton X-10C^ como descrito no Exemplo 21b . As fracções apresentando as absorvân. 1 s· P0RWI « ? » ... Ή , - - - , __. «τ'. cias de UV mais elevadas são reunidas. 0 conjunto de fracções contem pro-TPA numa forma substancialmente pura uma vez que não se detecta actividade amidolítica no teste fluorimêtrico usando Cbz-Gli-Gli-Arg-AMC (37) como substrato. A actividade amidolítica assim como a fibrinolítica pode ser restabelecida por tratamento com plasmina a qual converte pro-TPA em enzima activa. Exemplo 23: Propriedades do produto do gene TPA em levedura a. Propriedades enzimãticas 0 produto do gene TPA em levedura obtido segundo o Exemplo 19 e purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 (cf. Exemplo 21b) ê enzimãticamente activo como se mostra por clivagem de plasminogênio zimogênio em plasmina na ausência e na presença de fibrina. A actividade enzimãtica pode ser verificada pelos testes colorimêtricos descritos por Ranby (49) (cf. Exemplo 12) e por Verheijen et al. (60) , em placas de caseína e de fibrina (56) e num teste de fase solida com 12 9 I - fibrinogenio ( 47). A actividade enzimãtica em placas de caseína ê mostrada na figura B ( cf. Exemplo 20 c III). A actividade enzimãtica do TPA obtido ê grandemente estimulada pela fibrina. 0 TPA parcialmente purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 ê testado num teste de velocidade parabólica (cf. Ranby (49)). Tomando a velocidade reacção Δ E versus Δ t^ entre e 5 minutos como uma medida da actividade enzimãtica a estimulação por concentração óptimas de fibrina ê de 10-20 vezes ( ca. 100 yig /ml) . 0 efeito pode ser observado com fragmentos de fibrina obtidos por digestão com CnBr - Google Patents

Description

Descrição detalhada do invento

1. -Vectores híbridos contendo uma sequência codificadora de TPA.

0 presente invento relaciona-se com vectores híbridos de levedura compreendendo-se um promotor de levedura e uma região codificadora de TPA a qual é controlada pelo referido promotor.

0 DNA de TPA que faz parte dos vectores híbridos de levedura de acordo com o presente invento é especialmente um de natureza humana e pode ser derivado de qualquer linha celular humana que seja capaz de produzir TPA. Tais células são ou não de origem cancerosa e de preferência derivadas de uma linha celular estabelecida.

São exemplos de células adequadas células de melanoma, como sejam as células de Bowes ou de Malme, células de fibrossarcoma, carcinoma da epiderme, car cinoma da bexiga, hipernefroma ou lipossarcoma, células HeLa, fibroblaastos, linfocitos, queratocitos ou células epiteliais da mama ou de rim embrionário.

Numa execução preferida do presente invento ê usado células HeLa. 0 DNA de TPA pode ser DNA cronossomico ou cDNA.

0 DNA cromossomico de TPA pode ser isolado a partir de uma biblioteca de genes contendo o gene do TPA e o cDNA de TPA pode ser preparado pela via do m RNA usando métodos conhecidos na especialidade.

Também é possível usar fragmentos da sequência codificadora do TPA ou variantes mutadas do gene as quais poderão possuir caracteristicas proteolíticas e/ou comportamento de activação idênticas ou alteradas durante a conversão de pro-TPA em TPA activo.

Alguns dos produtos destes genes podem apresentar novas propriedades desejáveis.

Os promotores de leveduras do presente invento são derivados do DNA genomico de levedura, especialmente de Saccharomyces cerevisiae.

De preferência usa-se para expressão do TPA um promotor de um gene de levedura altamente expresso.

Assim, poderão ser usados o promotor do gene TRP1 , do gene ADH1 ou ADHII, do gene da fosfatase ácida ( PHOg ou PHOg), do gene do isocitocromio C ou um promotor dos genes codificadores de enzimas glicoliticas, como sejam os promotores dos genes da enolase, desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato ( GAPDH), cinase do 3-fosfoglicerato ( PGK ), hexocinase, piruvatodescarboxilase, fosfosfrutocinase, isomerase da glucose-6-fosfato, mutase do

3-fosfoglicerato, cinase do piruvato, isomerase de triosefosfato, isomerase de fosfoglucose e glucocinase, ou um

promotor dos genes de feromoma da cpnjugação de leveduras

codificadoras do factor a ou oÇ .

Os vectores preferidos do presente invento contem promotores com controle da transcrição.

Os promotores deste tipo, e.g. os promotores dos genes PHO5 e GAPDH, podem ser accionados ou não por variação das condições de crescimento.

Por exemplo o promotor de PHO5 pode ser reprimido ou desreprimido conforme a vontade do investigador, apenas pelo aumento ou decréscimo da concentração de fosfato inorgânico do meio. Assim, o promotor pode ser reprimido durante a fase de crescimento exponencial da levedura e pode ser accionado (desreprimido) apenas durante a fase estacionaria precoce com um máximo de densidade celular deixando que a expressão do gene seja controlada pelo promotor de PHO5 .

Esta propriedade combinada com um nível elevado de transcrição faz com que o promotor de PHO5 seja o preferido no presente invento.

Nos vectores híbridos do presente invento, o promotor de levedura estã opcionalmente ligado à região codificadora do TPA de modo a assegurar a expressão eficaz do TPA.

Numa execução preferida do presente invento, o promotor de levedura ê ligado directamente à região codificadora do TPA maduro com um sinal de iniciação da tradução (ATG) inserido na junção.

Uma região preferida para a união do promotor de levedura â região codificadora do TPA é a situada entre a iniciação principal do mRNA e o ATG do gene

naturalmente ligado ao referido promotor.

Numa outra execução preferida do presente invento e incluída uma sequência sinal na construção.

São sequências sinal adequado as ligações feitas naturalmente ao promotor usado, especialmente a sequência sinal de PHO5 ou sequência sinal do TPA.

Poderão também ser usadas outras sequên cias sinal como sejam as dos genes invertase de levedura ou do factor .

Como alternativa podem ser construidas sequências sinal de fusão por ligação de parte da sequência sinal do gene naturalmente ligado ao promotor usado, com parte da sequência sinal do TPA.

São convenientes as combinações que permitam um corte preciso entre a sequência sinal e a sequên cia de aminoãcidos do TPA maduro. Sequências adicionais, tais como prossequencias ou sequeências de espaçamento as quais podem ou não possuir sinais de processamento específicos também podem ser incluídos nas construções para facilitar um processamento preciso da molécula percursora.

Como alternativa podem ser produzidos proteínas de fusão, contendo sinais internos de processamento os quais permitem maturação correcta in vivo ou in vitro .

De preferência, os sinais de processamento contêm um resíduo Lis - Arg o qual ê reconhecido por uma endopeptidase de levedura situada nas membranas do Golgi.

Quando da expressão do que do TPA, o produto do gene entra na via secreta e é transportado para

12

o espaço periplasmãtico.

Se se conseguir ainda excreção através da parede celular para o meio de cultura devera ser pos sível um aumento considerável nos rendimentos.

Também o processo de recuperação pode ser simplificado pois não hã necessidade de romper as células .

Ainda, o TPA pode ser recuperado sem uma metionina adicional na terminação N, porque não hã necessidade de um ATG como sinal de iniciação da tradução antes da sequência codificadora madura.

Uma vez que a glicosilação estã associada à via secretora ê de esperar que o TPA produzido seja glicosilado.

Hã vãrias características que tornam mais vantajoso o TPA glicosilado que o não-glicosilado:

TPA glicosilado ê mais semelhante ao TPA genuino das células de mamífero do que o ATP não glicosilado. Também a estrutura terciária das proteínas semelhantes ao TPA depende provãvelmente atê certo grau da presença de resíduos glicosilo.

E de esperar que os resíduos de açúcar presentes nas moléculas de TPA tenham uma influência favorável na estabiLidade química e na actividade farmacológica.

Além de um promotor de levedura e de uma região codificadora de TPA, os vectores híbridos de acordo com o invento contêm sequências adicionais de DNA que não são essenciais ou menos importantes para a função

do promotor, i.e. para a expressão de região codificadora do TPA, mas que podem desempenhar funções importantes, por exemplo, na propagação das células de levedura transformadas com os referidos vectores híbridos.

As sequências de DNA adicionais podem ser derivados de células procariotas e/ou eucariotas e podem incluir sequências de DNA cromossomio e/ou extracromossonio.

Por exemplo, as sequências de DNA podem derivar de ( ou consistir em) DNA de plasmídeo, como seja DNA de plasmídio bacteriano ou eucariótico, DNA virai e/ou DNA cromossomico, tal como DNA cromossomico bacteriano, de levedura ou de eucariotas superiores.

Os vectores híbridos preferidos contêm sequências de DNA adicionais derivados de plasmídeos bacterianos, especialmente do plasmídeo pBR 322 de E. coli ou plasmídios relacionado, bacteriófago 1, plasmídeo 2ju de levedura e/ou DNA cromossomico de levedura.

De preferência, as sequências adicionais de DNA possuem uma origem de replicação de levedura e uma marca genética de selecção para levedura.

Os vectores híbridos contendo uma origem de replicação de levedura, e.g. um segmento (s) cromossómico de replicação autónoma, são mantidos extracrossomicos dentro da célula de levedura após transformação e são replica dos autonomamente quando da mitose.

Os vectores híbridos contendo sequências homologas do DNA do plasmide 2 μ de levedura podem ser igualmente usados.

Estes vectores híbridos ficarão integrados por recombinação nos plasmideos de 2 μ ja presentes dentro de célula ou replicar-se-ão autonomamente. As sequências 2μ são especialmente adequados para plasmideos de elevada frequência de transformação e dão origem a um grande número de copias.

Em adição, os vectores híbridos de acordo com o invento podem incluir uma sequência de DNA como parte de um gene presente no cromossoma da levedura hospedeira (e.g. o gene PHO5 ou o seu promotor ligado â região codificadora do TPA).

Devido à sequência homologa, que deve ser um segmento de cerca de 20 a 100 deoxinucleotidos ; todo o vector ou fragmento lineares podem ser estávelmente incorporados no cromossoma do hospedeiro por recombinação.

Assim durante a propagação das células filhas reterão o material geométrico introduzido mesmo sem pressão selectiva. Por exemplo, o gene do TPA ladeado por sequência de ocorrência natural num gene cromossomico de levedura, como seja a região do promotor de um gene de cromossonico de levedura na extremidade 5' e a região ladeante 3’ (parte) do referido gene na extremidade 3', pode ser estávelmente integrado no local do referido gene cromossomico .

Numa execução preferida do presente in vento, um segmento de DNA linear contendo o promotor de PH05 a região codificadora do TPA e a região ladeante 3' de PH05 é usada para integrar o gene do TPA no respectivo cromossoma de levedura, vez, cromossoma II de levedura, no local de PH05.

Como marca selectiva para levedura pode ser usada qualquer gene " marca" que facilite a selecção

de transformantes devido à expressão fenotípica da marca.

São marcas adequadas para levedura particularmente as que expressem resistência a antibióticos, ou, no caso de mutantes auxotróficos de levedura, genes que complementem lesões no hospedeiro.

Os correspondentes genes conferem por exemplo, resistência ao antibiótico, ciclo-heximida ou conferem prototrofia a um mutante auxõtrofio, por exemplo os genes URA3, LEU2 , HIS3 ou TRP1 .

£ também possível empregar como marcas genes estruturas que estejam associadas a um segmento de replicação autónoma, desde que o hospedeiro a ser transformado seja auxõtrofico para o produto expresso pela marca.

Com vantagem, as sequências de DNA adicionais que estejam presentes nos vectores híbridos de acordo com o invento também incluem uma origem de replicação e uma marca genética, selectiva para um hospedeiro bacteriano especialmente E. coli.

Hã características úteis que estão associadas com a presença de uma origem de replicação de E. coli e e uma marca de E.coli num vector híbrido de levedura

Em primeiro lugar pode-se obter grandes quantidades de DNA do vector híbrido por crescimento e amplificação em E. coli e em segundo lugar a construção de vectores híbridos ê convenientemente feita em E.coli tirando partido de todos os dados da tecnologia de clonagem baseada em E. coli.

Os plasmídeos de E. coli , como sejam o pBR322 e similares, contem a origem de replicação de E. coli e marcas genéticas de E.coli conferindo resistência a antibióticos, por exemplo tetraciclina e amplicilina e são

com vantagem empregues como parte dos vectores híbridos de levedura.

De preferência, os vectores híbridos de acordo com o presente invento compreendem também a sequência ladeante 3' de um gene de levedura a qual contem os sinais adequados à terminação da transcrição e poliademilação.

Sequências ladeantes 3' adequadas são por exemplo as do gene de levedura naturalmente ligado ao promotor usado, especialmente sequências ladeantes do gene PHO5 .

A sequência de DNA adicional que contem, por exemplo a origem de replicação e marcas genéticas para levedura e para um hospedeiro bacteriano (ver acima) ê aqui referido com "DNA vector" o qual juntamente com o promotor de levedura e a região codificadora de TPA formam um vector híbrido de acordo com o invento.

Numa execução preferida, o presente invento relaciona-se com vectores híbridos capazes de replicação e selecção fenotípica numa estirpe de levedura hospedeira compreendendo um promotor de levedura e uma sequência de DNA codificadora do activador do plasminogêneo de tecido estando a referida sequência de DNA juntamente com os sinais de iniciação e de terminação da transcrição assim como os sinais de iniciação e paragem da tradução, situada no referido vector híbrido sob o controle do referido promotor de modo a que seja expressa numa estirpe de levedura transformada para produzir activador do plasminogênio de tecido.

Os vectores híbridos são preparados pelos métodos conhecidos na especialidade, por exemplo por introdução num DNA vector de um promotor de levedura e de uma

região codificadora de TPA a qual ê controlada pelo referido promotor.

Pode ser empregue DNA vector linear ou de preferência circular conveniente mapeado, por exemplo DNA de plasmídeo bacteriano ou similares (ver acima), tendo pelo menos um local de restrição, de preferência dois ou mais locais de restrição.

Com vantagem o DNA vector jã contem as origens de replicação e as marcas genéticas para levedura e/ou hospedeiro bacteriano.

O DNA vector ê cortado usando uma endonuclease de restrição adequada.

0 DNA cortado é ligado ao fragmento de DNA contendo o promotor de levedura e ao segmento de DNA codificador do TPA.

Antes ou depois da ligação do promotor e da região codificadora do TPA ( ou também em simultâneo) , ê igualmente possível introduzir origens de replicação e/ou marcas para levedura ou hospedeiro bacteriano.

Em todos os casos as condições de restrição e de ligação devem ser escolhidas de modo a não haver interferência com as funções basicas do DNA vector e do promotor.

0 vector híbrido pode ser construído sequenciadamente ou por ligação de dois segmentos de DNA compreendendo todas as sequências com interesse.

Vãrias técnicas podem ser usadas para ligar segmentos de DNA in vitro. Extremidades cerses (cadeiras duplas de DNA cornpletamente emparelhadas) produzidas por certas endonucleases de restrição podem ser directa

mente ligadas com DNA ligase de T4.

Mais frequentemente os segmentos de DNA são ligados através de extremidades coesivas e fechadas covalentemente por uma DNA ligase, e.g. DNA ligase de T4.

Tais terminações coesivas de cadeia simples podem ser formadas cortando o DNA com uma outra cias se de endonucleases que produzem extremidades protuberantes ( as duas cadeias do DNA são cortadas em pontas diferentes a uma distância de poucos nucleotídeos).

Também se podem formar cadeias simples por adição de nucleotídeos a extremidades cerses ou extremidades protuberantes usando transferase terminal (" colocação de caudas homopolimêricas ") ou simplesmente desfazendo uma porção de uma das cadeias de um segmento de DNA com extremidades cerses com uma exonuclease adequada, como seja a exonuclease / . Uma outra maneira de produzir extre midades protuberantes consiste na ligação a um segmento de DNA de extremos cerses de um DNA adaptador obtido por síntese química o qual contem um local de reconhecimento para uma endonuclease criadora de extremidades protuberantes e digestão do DNA resultante com a endonuclease respectiva

Para ser expresso eficientemente o gene do TPA deve estar correctamente situado em relação às sequências contendo funções de transcrição ( promotor de levedura ) e de tradução ( locais de ligação ao ribossona).

Em primeiro lugar a ligação do segmento de DNA compreendendo o promotor com a região codificadora do TPA deve ser conseguida com a orientação correcta sendo possível duas orientações a correcta ê determinada por analise de restrição convencional.

»ί ·

Os vectores híbridos contêm uma inserção do gene do TPA incorrectamente orientada são reorientados de novo por excisão do gene inserido com uma endonuclease de restrição adequada e nova ligação do gene ao fragmento de vetor híbrido.

De qualquer modo a orientação incorrecta ê evitada ligando dois segmentos de DNA cada um dos quais com diferentes locais de restrição nas suas extremidades.

Ainda, a construção do vector híbrido deve ser feita de modo a permitir uma iniciação e terminação da transcrição correctas.

Relativamente ao último ponto, o produto da transcrição deve de preferência terminar numa sequência de DNA derivada de DNA cromossomico de levedura ou do plasmídeo 2 y de levedura.

Com vantagem o produto da transcrição termina numa sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de um gene de levedura, e.g. de PHO5 ou de TRP1.

Em segundo lugar deve ser estabelecida uma fase de leitura correcta.

Geralmente, a sequência de nucleótidos da região do promotor e da região codificadora do TPA e conhecida antes da ligação ou pode ser facilmente determinada / e.g. (10)_7 de modo a não haver problemas no estabelecimento da fase de leitura correcta.

Caso se deseje expressão directa do TPA maduro, sequências sinal ou partes delas facultativamente a seguir à região do promotor e/ou facultativamente precedendo a região codificadora do TPA madurç· tem de ser eliminadas, por exemplo por digestão com uma exonuclease, e.g. com Bal 31.

Uma região preferida para ligar directamente um promotor de levedura à região codificadora do TPA entre o ponto principal de iniciação do mRNA e o ATG da região codificadora do gene naturalmente ligado ao promotor de levedura.

Para uma união nesta região a sequência codificadora do TPA deve ter o seu próprio ATG para inicia ção da tradução ou então tem de ser conseguido com um oligonucleotido sintético adicional.

0 promotor de levedura pode também ser ligado â sequência codificadora do TPA por meio de um oligo dexinucleotido sintético como molécula de ligação. Assim, a região poderá ser, se possível, cortada perto da sua extremidade 3' de modo a perder um numero predeterminado de pares de bases.

Analogamente a sequência codificadora do TPA pode ser cortada perto da sua extremidade 5’.

Pode-se então construir um oligodeoxinucleotídeo sintético de modo a que quando se liga o promotor de levedura e a sequência codificadora do TPA através do oligodeoxinucleotido sintético os pares de bases,faltam, sejam repostos incluindo um sinal de iniciação da tradução e que a sequência codificadora do TPA esteja na fase de lei tura correcta em relação ao promotor.

Os produtos intermediários, como sejam ainda sem um ou mais funções essenciais assim como os vecto· res híbridos finais de acordo com o invento são facultativa· mente usados para transformar um hospedeiro bacteriano, especialmente E.coli, pelas razões acima referidas (e.g. produção de grandes quantidades de produtos intermediários e plasmrteos híbridos respectivamente).

21

Os vectores bacterianos, tais como o pias mídeo pBR322 de E.coli e os seus fragmentos, que contem um origem de replicação bacteriana e marca(s) genética© são os vectores preferidos por aquela razão. Quando se usa tal vector bacteriano, os passos finais para a preparação dos vectores híbridos de levedura de preferência incluem também a introdução de uma marca genética e uma origem de replicação para levedura.

2. Transformação de leveduras com vectores híbridos contendo a sequência codificadora do TPA

Um outro aspecto do presente invento envolve um processo para a produção de células de levedura transformadas capazes de produzir um activador do plasminogênio de tecido, processo esse caracterizado pela transformação de células de levedura com qualquer dos vectores híbridos descritos no parágrafo 1 ou integração do gene do activador do plasminogenio de tecido num cromossoma de levedura .

As leveduras que podem ser utilizadas incluem espécies dos géneres Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulopsis e gêneros relacionados [_ cf. (11J.7 » especialmente estirpes de Saccharomyces cerevisiae.

A transformação de leveduras com os vectores híbridos pode ser conseguida por processos conhecidos na especialidade, e.g. segundo o método descrito por Hinnen et al (12) .

Este método pode ser dividido em três pas

(1) Remoção da parede celular da levedura.

(2) Tratamento das células de levedura

"nuas" (esferoplastos) com o DNA

transformante na presença de PEG 2 +

(polietilenoglicol) e ioes la

(3) Regeneração da parede celular e selecção das células transformadas numa camada solida de agar.

Métodos preferidos :

ad(l) ; A parede celular de levedura é removida enzimãticamente usando varias preparações de glucosidases, tais como sucos intestinais de caracol (e.g. Glusalase® ou Helicase ® ) ou misturas de enzimas

Cr

obtidas a partir de microorganismos (e.g. Zymolase^ em soluções osmoticamente catalizadas (e.g. sorbitol 1M ).

ad(2) : Os esferoplastos de levedura agregam na presença

de PEG sendo induzidas fusões locais das membranas citoplasmãticas. A criação de condições em que se dão fusões ê crucial e muitas células de levedura transformadas tornam-se diploides ou mesmo triplõides durante o processo de transformação.

Para se obter um enriquecimento em transformantes podem ser usados processos que permitam a selecção de esferoplastos fundidos, ie. células transformadas podem ser facilmente detectadas entre produtos de fusão prê-seleccionados.

»5 *

ad(3): Uma vez que as células de levedura sem parede celular não se dividem a parede celular tem de ser regenerada.

Esta regeneração é convenientemente efectuada por embebição dos esferoplastos em agar. Por exemplo, agar fundido ( a cerca de 50^?C) ê misturado com os esferoplastos.

Quando do arrefecimento da solução para temperaturas de crescimento de leveduras ( cerca de 30⁹ C), obtêm-se uma camada colida. Esta camada de agar ê para evitar a difusão rãpida e perda de macromolêculos essenciais pelos esferoplastos facilitando assim a regeneração da parede celular.

No entanto também se pode obter regeneração da parede celular ( se bem que com uma eficiência mais baixa) por sementeira dos esferoplastos na superfície de camadas de agar prê-formadas.

De preferência, o agar de regeneração ê preparado de modo a permitir simultâneamente regeneração e selecção da célula transformada. Uma vez que os genes de levedura codificadores de enzimas das vias de biosíntese de aminoãcidos são normalmente usados como marcas selectivas ( =cf. capítulo 1), a regeneração é feita de preferência em agar com meio núnimo para leveduras. Caso se deseje eficiências de regeneração elevados ê vantajoso seguir um processo com dois passos: (1) regeneração da parede celular num meio rico complexo e (2) selecção das células transformadas por trasferência da camada de células para placas de agar selectivo.

Se o vector híbrido não contiver qualquer marca genética as células transformadas poderão ser iden tificadas por meio de métodos alternativos.

Tais métodos incluem, por exemplo, lubridação in situ com um fragmento de DNA marcado homolo24

go de sequências do vector híbrido / e.g. segundo Hinnen et al. /" (12)_7_7, imunotestes in situ desde que se disponha do anticorpo contra o produto do gene introduzido ou outros métodos de detecção que permitam identificar os produtos genéticos codificados pelos plasmídeos transformantes.

Como alternativa a levedura pode ser transformada com um vector híbrido de acordo com o invento e com um segundo vector contendo uma marca genética para levedura.

Se os dois vectores diferentes possuirem sequências em comum ( estas poderão ser sequências bact£ rianas presentes nos vectores), poderá dar-se recombinação conduzindo a uma molécula híbrida de fusão seleccional.

A levedura também pode ser transformada com um segmento de DNA linear contendo o gene TPA ladeado por sequências homologas de sequências dum cromossoma de levedura e com um vector contendo uma marca selectiva para levedura.

A cotransformação permite um enriquecimento em células de levedura que tenham adquirido DNA que não possa ser directamente seleccionado. Uma vez que células interiorizam qualquer tipo de DNA uma percentagem elevada de células transformadas com um vector selectivo também adquirem qualquer DNA adicional ( como seja o segmento linear contendo o gene TPA com outras sequências ladeantes (SO).

Devido a sequências homologas suficientemente longas ( e.g. cerca de 20 a 100 deoxinucleotídos de comprimento) o gene do TPA serã estavelmente integrado no cromossoma do hospedeiro. Espeeialmente, o segmento de DNA linear contem o promotor de PH05 controlando o gene do TPA e as sequências de terminação do PH05.

Esta construção levara a uma integração estãvel do gene do

TPA no cromossoma no local do gene PHOS, viz. no cromossoma

II de levedura.

Um segmento de DNA linear compreendendo um promotor de levedura, o gene para o activador do plasminogénio de tecido o qual ê controlado pelo referido promotor e uma sequência de DNA contendo os sinais de terminação de um gene de levedura ê também objectivo do presente invento.

As estirpes de levedura obtidas contendo os plasmideos híbridos de acordo com o invento podem ser melhoradas no respeitante â produção de TPA por mutação e selecção usando métodos conhecidos na especialidade.

A mutação pode ser produzida, por exemplo, por irradiação com U.V. ou reagentes químicos adequados.

0 invento também esta relacionado com leveduras hospedeiras transformadas com vectores híbridos compreendendo um promotor de levedura e uma região codificadora do TPA o qual é controlada pelo referido promotor e com leveduras hospedeiras com um gene para o activador do plasminogênio de tecido estãvelmente integrado num cromossoma de levedura e respectivos mutantes.

3. Cultura de células de levedura transformadas e isolamento do DNA expresso

0 produto primário da expressão do gene do TPA em levedura de acordo com o presente invento ê a proteína precussora do TPA com uma única cadeia ("pro-TPA")

Se, no entanto, estiverem presentes proteãses na célula hospedeira de levedura, no espaço periplasmãtico ou no meio de cultura, o pro-TPA expresso como

produto primário pode pelo menos ser parcialmente convertido em TPA com duas cadeias. Na realidade, o produto isolado pode portanto consistir em TPA, pro-TPA e suas misturas.

Se a região codificadora do TPA for precedida de uma sequência sinal nos vectores híbridos de acordo com o presente invento, a secreção estã associada com glicosilação pelo menos parcial. 0 produto obtido pode assim incluir também proteínas glicosiladas e nao glicosiladas.

0 invento também diz respeito a um método para produção de TPA, pro-TPA ou suas misturas em que o TPA e o pro-TPA estão presentes na forma glicosilada ou não glicosilado ou numa mistura destas formas, caracterizado pelos passos de cultura em condições nutritivas adequadas de uma estirpe de levedura transformada com um vector híbrido contendo um promotor de levedura e uma região codificadora do TPA a qual é controlada pelo referido promotor, ou de uma estirpe de levedura com um gene para o activador do plasminogénio de tecido estãvelmente integrado num cromossoma de levedura e estando sob o controle de um promotor cromossómico de levedura ou de um mutante de tais estirpes de levedura e isolamento e purificação das referidas proteínas e, caso se deseje, separação de uma mistura de TPA e pro-TPA obtida nos seus componentes individuais e, para a produção de TPA livre de pro-TPA, conversão do pro-TPA produzido em TPA, e, se se desejar, separação dos produtos glicosilados dos não glicosilados obtidos numa mistura e, para a produção de proteína não glicosilada sem proteína glicosilada, remoção dos resíduos glicosilo das proteínas obtidas .

a. Cultura de células de levedura transformadas

As estirpes de levedura transformadas de acordo com o presente invento são cultivadas num meio líquido contendo fontes de carbono assimiláveis azoto e sais

inorgânicos.

Podem-se usar variadas fontes de carbono. São exemplos de fontes de carbono preferidos hidratos de carbono assimiláveis, tais como glucose, maltose, manitol ou lactose ou um acetato, o qual pode ser usado sózinho ou em misturas adequadas.

Fontes de azoto apropriadas incluem, por exemplo, aminoãcidos, tais como casaminoãcidos, peptideos e proteínas e os seus produtos de degradação, como sejam triptona, peptona ou extractos de carne e ainda extracto de levedura, extracto de malte, melaço de milho, assim como sais de amónio, tais como cloreto, sulfato ou nitrato de amónio, os quais podem ser usados sozinhos ou em misturas adequadas. Os sais inorgânicos que podem ser usados incluem, por exemplo, sulfatos, cloretos, fosfatos e carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio.

Em adição os meios nutritivo pode também conter substâncias promotoras do crescimento. Substâncias que promovem o crescimento incluem, por exemplo, micronutrientes, tais como, ferro, zinco, manganesio e similares ou aminoácidos individuais.

Num grau variãvel, as células de levedura transformadas com plasmideos de replicação autónoma, por exemplo, plasmídeos contendo DNA do plasmideo 2 ju de levedura, tendem a perder o plasmideo híbrido introduzido /’cf.(13)_7.

Por esta razão, tais células de levedura têm de ser cultivadas em condições selectivas, i.e. condições que requáram a expressão de um gene codificado pelo plasmideo para crescimento. A maior parte das marcas selectivas normalmente usadas são genes codificadores de enzimas da biosíntese de aminoácidos ou purinas.

Isto faz com que seja necessário usar meios mínimos sintéticos deficientes no correspondente amino ácido ou base purina. No entanto podem também ser usados genes que conferem resistência a um biocido adequado /"e.g. genes que conferem resistência à ciclo-heximida, ao aminoglicosido G418(14), a um metal pesado, ou similares_7.

As células de levedura transformadas com vectores contendo genes de resistência a antibióticos são cultivadas em meios complexos contendo o correspondente antibiótico através dos quais se atingem taxas de crescimento e densidades celulares mais elevadas.

As células de leveduras transformadas com integração de DNA nos cromossomas não necessitam de condições de crescimento selectivas. Estas células transformadas são suficientemente estáveis para permitirem crescimento sem pressão selectiva. Pela razão atrás referida estas células são com vantagem cultivadas em meios complexos.

As células de levedura contendo plasmídeos híbridos com um promotor constitutivo (e.g. PHO5 ou

ADHI) expressam o gene do TPA ligado ao referido promotor sem indução. No entanto, se o gene do TPA estiver sob o controle de um promotor regulável (e.g. GAPDH, PGK ou PHO5 ) a composição do meio de crescimento tem de ser adaptada de modo a obter-se níveis máximos de transcrição de mRNA, i.e. quando se usa o promotor de PHQ5 o meio de crescimento deve conter uma concentração baixa de fosfato inorgânico, para despressão deste promotor.

A cultura é feita empregando convencionais técnicas. As condições de cultura, tais como temperatura, pH do meio e tempo de fermentação são seleccionadas de modo a produzirem-se níveis máximos de TPA. Uma estirpe de levedura escolhida ê de preferência crescida em condições aerõbicas em cultura submersa com agitação a uma temperatura

RVj'. '......

ΡΟκτυοήΓ

' > _;í,~ ./ ·4<

de cerca de 25^? a 35^ρ C, de preferência a cerca de 30⁹C, a um valor de pH entre 4 e 8, por exemplo a aproximadamente pH7 e durante cerca de 4 a 20 horas, de preferência serem atingidas rendimentos máximos de produção de proteínas.

b. Isolamento e purificação do TPA expresso

Apos crescimento das células de levedura transformadas até uma densidade celular satisfeita o primeiro passo para a recuperação da proteína expressa consis te na libertação da proteina do interior da célula. Na maior parte dos processos a parede celular ê primeiro removida por digestão enzimãtica com glucosidase (cf. secção 2). Subsequentemente, os esferoplastos resultantes são tratados com detergentes, por exemplo Triton.

Como alternativa, forças mecânicas, tais como forças tangenciais ( por exemplo prensa X, prensa Francesa) ou agitação com pérolas de vidro, são adequadas à destruição das células. A mistura proteína resultante é enriquecida em TPA por meios convencionais, como sejam remoção da maior parte do material não proteico por tratamento com polietileneimina, precipitação das proteínas por saturação da solução com sulfato de amónio ou acido tricloroacetico, electroforese em gel, diãlise, cromatografia, por exemplo, cromatografia de troca iónica, cromatografia de exclusão de tamanho, HPLC ou HPLC de fase reversa, separação pelo tamanho molecular numa coluna adequada de Sephadex , ou similares.

A purificação final do produto pre-purifiçado ê conseguido, por exemplo, por meio de cromatografia de afinidade, por exemplo por cromatografia de afinidade com anticorpos, especialmente cromatografia de afinidade com anticorpos monoclonais usando anticorpos monoclonais an-

ti-TPA fixados a uma matrix insolúvel por métodos conhecidos na especialidade e similares.

Outros métodos preferidos para isolamento de TPA a partir dos meios de cultura consiste na absor ção selectiva do TPA num suporte de afinidade específica de fragmentos de fibrina solúvel as quais são fixadas covalentemente numa matrix-insoluvel, e.g. dextran / e.g. (15)/, ou em particular, numa coluna de DE-3 Sepharose R.

DE-3 é um inibidor da tripsina existente nas sementes do legume Emythrina latissina (16).

Verificou-se agora que DE-3 também ê capaz de inibir a actividade TPA. Assim, o inibidor DE-3 purificadonode ser acoplado a uma matrix insolúvel, e.g. Sepharose^ activada com Brln, usando processos estandardizado. 0 TPA serã adsorvido â matrix com inibidor, e pode ser eluído com um tampão que contenha um agente caotropico.

Numa execução preferida do presente invento, o meio de cultura, facultativamente apos passagem por um ou mais dos passos de purificação acima referidos, é passado à temperatura ambiente por uma coluna consistindo em Sepharose^ activada com Brln â qual foi acoplado o inibidor DE-3. Após lavagem da coluna, o activador do plasminogênio de tecido adsorvido é eluido por tratamento da coluna com uma solução tampão, por exemplo salino tampossado com fosfatos, tendo um pH de aproximadamente 5,5-6,0 e contendo um agente caotropico, tal como KSCN, entre cerca de

1,4 e cerca de 2,0 molar, de preferência 1,6 molar.

Como alternativa podem ser escolhidos como agentes de eluição benzamidina ou arginina. Ha vantagem na adição de um detergente, especialmente um detergente não íonico , tal como Triton X-100 ou Tween 80 a

todas as soluções tampão usadas nos passos de purificação de modo a evitar a adsorção do activador do plasminogenio de tecido às paredes dos recipientes e para melhorar a estabilidade. 0 detergente pode ser adicionado para uma concentração final de 0,01 - 0,1 %.

No caso de o activador do plasminogenio de tecido ser secretado pela célula de levedura para o espaço periplãsmico pode-se usar um protocolo simplificado:

A proteína e recuperada sem lise celular por remoção enzimãtica da parede celular ou por tratamento com agentes químicos, e.g. reagentes tiol ou EDTA, os quais provocam danificação da parede celular permitindo a libertação do TPA produzido. No caso do TPA ser secretado para o caldo de cultura pode ser recuperado directamente a partir deste.

A cultura de células de levedura tendo um gene do TPA integrado num cromossoma e isolamente e purificação do TPA expresso ê efectuado como descrito atras.

Para a preparação de TPA substancialmente livre de qualquer pro-TPA, o pro-TPA e convertido enzimaticamente em TPA, por exemplo por acção da plasmina ou uma enzima tendo um efeito equivalente no pro-TPA.

Para a preparação de pro-TPA substancial mente liberto de TPA é vantajoso incluir_um inibidor de proteases, como seja aprotinina ( trasylol ) ou um inibidor da tripsina, básica pancreática, durante o processo de purificação de modo a inibir vestígios de proteases que possam estar presentes e que possam causar conversão (parcial) do pro-TPA em TPA.

A purificação final e então conseguida por cromatografia numa coluna contendo um reagente de afinidade selectiva, como seja DE-3, na presença de um inibidor que selectivamente se liga apenas ao TPA e não ao pro-TPA

como seja, por exemplo, diisopropilfluorofosfato (DEP) ou guanidinobenzoato de nitrofenilo.

Estes reagentes evitam a adsorção do TPA â coluna de afinidade. Consequentemente, o TPA passará através da coluna de DE-3 enquanto que o pro-TPA se adsor verá à coluna podendo ser eluido como descrito atrás.

Uma mistura de proteínas glicosiladas e não glicosiladas podem ser separadas^nor exemplo, por cromatografia numa coluna de Sepharose^> concanavalina A.

Os produtos não glicosilados passarão através da coluna enquanto que os produtos glicosilados se adsorverão selectivamente podendo ser eluido por métodos convencionais, e.g. * -metilmanosido em combinação com um agente caotrópico, como seja KSCN.

É também possível remover enzimáticamen te os resíduos glicosilo, e.g. por acção da endoglicosidase

H.

Este método permite a produção de produ· tos não glicosilados numa forma substancialmente pura.

Os TPAs e pro-TPAs obtidos de acordo com o presente invento apresentam propriedades farmacológicas importantes .

Assim, estas proteínas podem ser usadas em analogia com os activadores do plasminogenio conhecidos em seres humanos para prevenção ou tratamento de trombose ou outros estados em que se deseje produzir actividade fibrinolítica ou proteolítica localizada através do mecanismo de activação do plasminogênio, como sejam a arteriosclerose, enfarte do miocardio e cerebral, trombose venosa, tromboembolimsmo, trombose pós-cirurgica, tromboflebite e vasculopatias diabéticas.

0 invento também se relaciona com TPAs,

pro-TPAs e suas misturas tendo uma glicosilação específica

de levedura, mais especificamente tendo uma glicosilação

específica do gênero de leveduras Saccharomyces, especialmente Saccharomyces cerevisiae.

0 invento diz respeito ainda a TPAs, pro -TPAs assim como a suas misturas sempre que preparadas de acordo com os métodos do presente invento.

0 invento diz também respeito a TPAs, pro-TPAs e suas misturas obtidas de acordo com o processo do invento.

0 invento relaciona-se espeeialmente com vectores híbridos, estirpes de leveduras transformadas e processos para a sua preparação assim como o método para produção de TPAs, pro-TPAs ou suas misturas como descrito nos Exemplos.

Preparações farmacêuticas

As novas proteínas, espeeialmente TPA e pro-TPA, obtidas de acordo com o presente invento, apresentam propriedades farmacológicas importantes.

Assim, TPA e pro-TPA podem ser usados em analogia com activadores do plasminogênio conhecidos em seres humanos para prevenção ou tratamento de trombose ou outras condições em que se pretenda produzir actividade fibrinolítica ou proteolítica localizada através do mecanis mo dé activação do plasminogênio, como sejam a arteriosclerose, enfarte do miocãrdio ou cerebral, trombose venosa,

nflBTUGAI

' ‘Al

L·.

'Λ'**

tromboembolismo, trombose pós-cirurgica, tromboflebite e vasculopatias diabéticas.

0 invento também diz respeito a preparações farmacêuticas que contenham uma quantidade terapêuticamente eficaz do ingrediente activo ( especialmente TPA pro-TPA ou suas misturas ) juntamente com veículos orgânicos ou inorgânicos, solidos ou líquidos farmacêuticamente aceitáveis que sejam adequados à administração parenteral, i.e. intramuscular, subcutânea ou intraperitoneal e que não interactue de modo prejudicial com os ingredientes activos.

Existem soluções adequadas especialmente as de infusão, de preferência soluções ou suspensões aquosas, sendo possível preparã-las antes de usar, por exemplo a partir de preparações liofilizadas que contenham o ingrediente activo sozinho ou juntamente com um veículo, como seja manitol, lactose, glucose, albumina e similares.

A preparação farmacêutica pode ser esteri lizada e caso se deseje, misturada com aditivos, por exemplo preservativos, estabilizadores, emulsores, solubilizantes, tampões e/ou sais para regulação da pressão osniótica.

A esterilização pode ser conseguida por filtração em condições de assépcia através de filtros de poro pequeno (0,45 pm de diâmetro ou menor ) apos o que a preparação pode ser liofilizada, caso se deseje. Também se pode adicionar antibióticos no intuito de preservar a esterilidade .

As preparações farmacêuticas de acordo com o presente invento são divididas por formas de dosagem unitárias, por exemplo ampolas, contendo 1 a 2000 mg de um veículo farmacêuticamente aceitável por unidade de dosagem e cerca de 1 a 20 mg, de preferência cerca de 3 a 15 mg, do

I

ingrediente activo ( TPA, pro-TPA, pro-TPA ou suas misturas)

por unidade de dosagem.

Dependendo do tipo de doença, idade e estado do paciente, a dose diária a ser administrada para tratamento de um doente que para aproximadamente 70 kg estã dentro da gama de 3 a 15 mg, de prefer^encia entre 5 e lOmg por 24 horas.

0 invento também inclui um método para produção de uma preparação farmacêutica caracterizada por uma proteína biologicamente activa do presente invento ser misturada com um veículo farmacêuticamente aceitável.

A utilização das novas proteínas para tra tamento profilático e terapêutico do corpo humano é também um tema do presente invento.

Descrição breve dos desenhos

Na parte experimental que se segue várias execuções práticas do presente invento são descritas com referência aos desenhos juntos em que :

Figura 1 é um mapa parcial de locais de ataque por endonucleases de restrição dos plasmídeos pJDB 2o7 PH05, PH03 e pBR 322/ PH05 Bam-Sal usados como fontes do gene PH05 ou para sequenciação de DNA respectivamente.

Figura 2 mostra a localização dos genes da fosfatase ãcida PH05 e PH03 dentro do fragmento Bam Hl de 5,lkb isolato a partir de uma biblioteca de genes de levedura.

Figura 3a e 3b representam as sequências de DNA da região do promotor de PH05 e PHO3, respectivamente.

Figura 4 ê um diagrama esquemático mostrando a construção do plasmídeo híbrido p30.

Figura 5 e um diagrama esquemático da construção do plasmídeo p31 contendo um fragmento de terminação de PHO5.

Figura 6 mostra a sequência de nucleotidos do fragmento Sau 3A-Pst I de terminação da transcrição de PH05.

Figura 7 apresenta um diagrama esquemático do processo para a delecção da sequência sinal de PHO5 no plasmídeo de expressão p31 e mostra especificamente a construção do plasmídeo p31 / R.

í

I

Figura 8 mostra esquematicamente a colec- j ção de clones obtidos no processo representado na fig. 7.

Figuras 9 e 10 apresentam as sequências de nucleótidos dos fragmentos de restrição Bam HI - Eco RI contendo as regiões dos promotores PH05/R e PH05/ Y.

Figura 11 mostra as sequências do DNA e dos aminoãcidos correspondentes do clone de cDNA do TPA isolado a partir de células HeLa.

Figura 12 ê uma representação esquemática da construção do veículo de clonagem M13 mp 9 /PHO5-TPA.

Figura 13 descreve a construção do plasmídeo pJDB 207/ PH05-TPA (IA), incluindo a sequência sinal de PH05.

Figura 14 ilustra esquemáticamente a ccns trução do plasmídeo pJDB 2O7/PHO5 - TPA Δ contendo um fragmento encurtado da terminação da transcrição de PH05.

Figura 15 mostra a sequência do fragmento encurtado da terminação da transcrição de PH05.

Figura 16 mostra a construção do plasmideo híbrido p31 RL/TPA (12-2) , uma construção sem a sequência sinal. A sequência codificadora do TPA maduro estã ligada ao promotor de PH05.

Figura 17 ê um diagrama esquemático mos- ; trando a construção do plasmídeo pJDB 207 R/PH05-TPA (12-2). ·

ί

Figura 18 descmre a construção do pias- ί mídeo p31/PH05-TPA 18.

Figura 19 mostra a junção entre a sequência sinal de PH05 e a região codificadora do TPA maduro no plasmídeo p31/PH05 -TPA18.

Figura 20 ê uma descrição esquemática do isolamento dos fragmentos de DNA contendo partes da região codificadora de prepro-TPA.

Figura 21

mídeo p31 R/SS- TPA A 2.

descnve a construção do plasFigura 22 mostra a construção do plasmídeo intermediário pBR32/PH05 Bam-Rsa 637.

Figura 23 mostra a construção de plasmídeos com a sequência sinal de PHO5 estendendo-se atê ã região codificadora de PHQ5.

Figura 24 ê um diagrama esquemático mostrando a ligação do promotor PH05 e parte da sequência codificadora de PH05 ã sequência codificadora do TPA maduro através do adaptador A, B ou C.

Figura 25 ê um diagrama esquemático da substituição do gene de PH05 pelo gene do TPA no cromossoma.

Os Exemplos que se seguem servem para ilustrar o presente invento mas não devem ser encarados como uma sua limitação.

Parte Experimental

Nos exemplos são usadas as seguintes abreviaturas:

BSA : albumina do soro bovino

DTT: 1,4-ditiotreitol (1,4-dimercapto-2,3-batanodiol )

EDTA : acido etilenodiaminatetracêtico SDS: sulfato dodecilo do sodio

TNE: solução contendo NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) e EDTA lmM.

TRIS . HC1 : tris-(hidroximetil)-aminometano, pH ajustado com HC1

TE : solução contendo Tris . HC1 10 mM (pH 7,5) e EDTA 1 mM

MOPS : acido 3-morfolino-propano-l-sulfõnico.

Exemplo_l : Construção de uma biblioteca de genes de levedura

Trinta pg de DNA total de alto peso molecular de levedura (17) da estirpe S288 C de Saccharomyces cerevisiae tipo selvagem ê incubado durante 30 minutos a 37⁹ C com 2 unidades de metilase de Eco RI (New England Biolabs) em 250 pl de tampão de metilação de Eco RI conforme recomendado pelo fornecedor.

0 DNA ê precipitado com etanol, ressuspenso em 500 pl de tris. HC1 25 mM pH8,5, MgCl₉ 2mM (tam*

pão Eco RI ) (18) e digerido com Eco RI (Boehringer) ate a distribuição de tamanhos dos fragmentos de DNA ter um máximo na gama de 30-50 Kb (o produto da digestão do DNA de ^com Xh° I fornece os marcadores de 33 kb e 17kb adequados).

0 DNA de leveduras digerido nas condições de Eco RI ê fraccionado pelo tamanho num gradiente

de sacarose ( 5-20¾ de sacarose em Tris. HC1 10 mM, pH 7,5 EDTA lmM ) durante 6 hrs a 38.000 rpm num rotor SW 40.

Colhem-se trinta fracções de 0.4 ml cada a partir do cimo do gradiante. A fracção 16 contem os fragmentos de DNA com um tamanho de 30-40 kb.

0 DNA desta fracção ( 3 ^ig ) é precipitado com etanol e ligado durante 16 horas a 15⁹C num volume total de 15 pl a 1 pg do vector cosmídeo pYcl (19), linearizado com Eco RI. A ligação é feita com 300 U de ligase de DNA do T4 ( New England Biolabs) usando o sistema tampão descrito pelo fornecedor.

0 DNA ê encapsidado in vitro no bacte riofago λ(20) e os fagos formados são usados para transdacção de E. coli estirpe HB1O1 ( r^ , m^ , leu , pro , recA~ ).

A eficiência de transdacção ê de cerca de 5000 colónias resistentes â ampicilina por pg de vector pYcl. 3000 colónias amp^ são repicadas e cultivadas individualmente nos poços de placas de microtitulação em meio LB /" 10 g de Bacto-Tryptone ( Difco), Tg de Bacto Yeest Extract (Difco), 10 g de NaCl_7 contendo 100 yg/ml de ampicilina.

Exomplo_2 Isolamento do gene regulável PH05 da fosfactase ácida.

Replicas da biblioteca de genes são cultivadas em placas de agar LB ( meio LB mais 15g/l de agar) contendo 100 ug/ml de ampicilina.

0 material celular de 500 colónias e

removido das placas por lavagem e reunido.

0 DNA é isolado de conjuntos individuais usando o protocolo que se segue :

As células são recolhidas por centrifugação ( Sorvall, rotor GSA, 10 min. a 6000 rpm, 4⁹ C) , ressuspensos em 100 ml de TE ( Tris.HCl lOmM, EDTA ImM, pH 8,0) e centrifugados de novo nas condições acima.

0 rendimento celular é ressuspenso em 3 ml de Tsuc /” Tris. HC1 50 mM pH 7,5, 25¾ de sucrose ( p/v)_7 ^e transferido para tubos Sorvall de propileno SS-34. Todos os passos subsequentes são efectuados em gelo: 0,3 ml de solução de lisozima ( 10 mg/ml, adquirida â Worthington, 11'000 U/mg ) é adicionado, apos 5 min, adicio na-se 1,2 ml de EDTA (500mM, pH8,0) e apõs outros 5 min. junta-se 4,8 ml de detergente / 0,1¾ de Triton x-100

(Merck), EDTA 50mM, Tris . HC1 50mM, pH 8,0_7.

Apos 5 min. o lisado é centrifugado num rotor SS-34 prê-arrefecido durante 40 minutos a 4^? C.

0 sobrenadante é cuidadosamente removido e adicionado CsCl solido ( 8,3 g de CsCl para 8,7 ml de sobrenadante). Apos adição do brometo de etídio (Sigma ) (concentração final de Img/ml de sobrenadante) a solução é transferida para tubos de polialomero Quick Seal de 13,5 ml ( Beckman ) e centrifugada num rotor Beckman Ti 50 durante 40 hrs a 40000 rpm.

Podem ser visualizadas duas bandas com UV de grande comprimento de onda ( 366 nm). A banda inferior contem DNA de plasmídeo superenrolado o qual é colhido fazendo um furo no tubo lateralmente com uma seringa de 2 ml ( agulha de 18G ). 0 brometo de etídio é removido

por extracção 5 vezes com iguais volumes de isopropanol

13

( saturado com CsCl) e o produto õ transferido para tubos Corex de 30 ml. Adiciona-se 2,5 volumes de TE e o DNA é precipitado com etanol. A solução é então mantida durante 12 - 15 hrs a -20°C. 0 DNA precipitado ó colhido por centrifugação num rotor Sorvall HB-4 durante 30 min a 12000 rpm a 0^?C e redissolvido em 200 jul de TE. 50-100 /ug do DNA do plasmídeo híbrido são recuperados a partir de 100 ml de cultura.

0 DNA de plasmídeo destes conjuntos "pools" "e usado para transformar S. cerevisiae estirpe AH216 (a, his5, leu2, pho3, pho5) de acordo com o processo descrito por Hinnen et. al. (12). Os transformantes de levedura são replicados em meio nunimo com Pi baixo / como "meio nunimo para leveduras da Difco sem aminoãcidos " suplementado com 20 g/1 de glucose, mas preparado a partir dos componentes individuais de acordo com a receita da Difco (Difco Manual, Difco Laboratories, Detroit, USA) exceptuando a utilização de 0,03 g/1 de P0^ mais lg/1 de KC1 em vez de lg/1 de KH^PO^/ e corados relativamente à actividade de fosfatase acida cobrindo-os com agar de coloração /' 1 °ò de agar Difco em tampão acetato 100 mM pH 4,0, 2 mg/

/ ml de Sal de Azul Rápido B ( " Fast Blue B Salt)(Serva) e 0,2 mg/ml de tf, -naftilfosfato (Serva)_7 . As colónias com um gene PH05 funcional coram de vermelho quando das desrepressão do gene num meio de Pi baixo. Por "fraccionamento " repetido ( 21) da biblioteca do genes obtem-se 3 clonas independentes com actividade de fosfatase acida reprimível .

Um destes clones (pG7) e ulteriormente analisada. 0 plasmídeo híbrido tem um tamanho de 42 kb.

Os fragmentos Eco RI e Bam HI de pG 7 são subclonados em pBR 322 /HIS3 (13) e pJDB2O7 (22) respectivamente. As digestões por restrição são feitas como recomendado pelo fornecedor ( New England Biolabs ) e as ligações dão-se em 20 ul com 150 U de DNA ligase de T4.(New England Biolabs)

e 20 jag/ml dos plasmídeos individuais digeridos (condições como ê sugerido por New England Biolabs). Um fragmento Bam HI de 5,kb que ê parte de um fragmento Eco Ride 8kb ê subclonado no vector de levedura pJDB2O7 e quando da transformação da estirpe de leveduraAH216, este plasmídeo híbrido (pJDB2O7/PHO5, PH05, ver fig. 1) induz numa elevada actividade de fosfatase em condições de desrepressão (Pi baixo) (gene PH05 ) e níveis baixos de actividade num meio mínimo normal de levedura )( expressão do gene PH03 ).

Exemplo_3 : Localização dos genes PH05 e PH03 e anãlise das sequências de DNA.

a. 0 gene PH05

Para a localização do PH03 e PH05 no fragmento Bam HI tira-se partido do padrão dos locais de restrição Sau3A e da existência de um único local Pst I.

A digestão do fragmento Bam HI com a endonuclease de restrição Sau3A ( New England Biolabs) origina 6 fragmentos (A-F, fig.2 ). Subclonagem de um produto de digestão parcial com Sau 3A no local Bam HI do vector de levedura de auto-replicação pYDB2O7 produz plasmídeos com diferentes combinações de fragmentos Sau 3A. Estes plasmídeos são então usados para transformar o mutante PH03, PH05 da levedura S. cerevisiae AH216. Os transformantes são testados relativamente à actividade de fosfatase ãcida apõs crescimento em placas quer com meio núnimo normal quer com Pi-baixo. Os clones contendo pelo menos os fragmentos Sau3A A e B ( fig.2 , N⁹ 1-4) expressam fosfatase ãcida, com o mesmo nível ( cãlculos qualitativos apõs cobertura agar para coloração da fosfatase ãcida, como descrito no Exemplo 2) que o fragmento total Bam HI de 5,1 kb.

A expressão e regulada normalmente pela concentração de

,--4¾...,

fosfato inorgânico no meio. Os clones com o fragmento Sau 3A apenas ( fig.2, Ν^ρ 5,6 ) expressam níveis baixos de fosfatase acida, que não ê influenciada pela concentração de fosfato inorgânico no meio. Isto indica que a informação presente no fragmento Sau 3A A ê suficiente para expressão da foafatase acida constitutiva (PHQ3).

0 fragmento Sau 3A B ( fig. 2, N⁹7) por si só não conduz a qualquer expressão da fosfatase acida quer em condições de repressão quer de desrepressão.

No entanto, um subclone com a sequência completa entre locais Bam HI e Pst I ( fig.2, Ν^ρ10) apresenta síntese de fosfatase acida regulável mas não constitutiva. Este subclone deve portanto conter um gene PHQ5 de levedura ( 13).

il;

»

>

A localização exacta do gene PHO5 ê determinada por sequenciação de DNA usando o método de Maxam e Gilbert (10). Um fragmento de restrição Bam HI-SalI de 623 pb é clonado no plasmídeo pBR322 (Ver fig. 1), substituindo o fragmento Bam HI -Sal I que se estende da posição 375 a 650 ( nomenclatura do pBR322), usando as condições de digestão e ligação como descrito atras ( todas as enzimas são da New England Biolabs). Fragmentos de DNA da inserção de DNA Bam HI-SalI são marcados assimétricamente nas suas extremidades 5' nos seguintes locais : Bam HI (-541), Sau3A (-200) e Sall (+82), (para numeração ver fig. 3a). A sequência de nucleotideos da inserção de DNA BamHI Sall com 623pb estã descrita na fig.3a. Como se pode ver a inserção contem a região do promotor de PH05 e parte da região codificadora da proteína fosfatase acida PH05.

b. 0 gene PH03

A localização exacta do gene PH03 é

determinada por análise da sequência do DNA segundo o manual "M13 cloning and DNA sequencing system " publicado por New England Biolabs. Um fragmento de 415 pb (5') Pst I- Rsa I (3’) ê subclonado nos vectores M13 mp8 e M13 mp9 (23), usando locais únicos Pst I e Smal. A sequência de nucleotídeos da inserção de DNA PstI-Ssa I com 416 pb ê apresentada na fig. 3b. Ela mostra que a inserção contem a região promotora de PH03 e parte da sequência codificadora da proteína fosfatase ácida PHO3.

Exemplo_4 : Construção do plasmideo p30 (Ver fig. 4).

a) Eliminação do local de restrição Bali no plasmideo pBR

322

3 pg de pBR 322 ê digerido completamente com as endonucleases de restrição Bali (BRL) e PvuII ( Biolabs) segundo as recomendações dos fornecedores . A dupla digestão com BalI/PvuII do pBR322 resulta em dois fragmentos de restrição de 3738 pb e 622 pb de tamanho. Os dois fragmentos são separados numa gel de 1¾ de agarose de ponto de fusão baixo ( Sigma) em tampão TBE ( Tris.HCl 90 mH pH 8,3, EDTA 2,5mM , ácida bórico 90mM). As bandas de DNA são coradas com brometo de etídio e visualizadas sob luz UV de grande comprimento de onda a 366 nm. 0 pedaço de agarose contendo o fragmento de 3738 pb ê retirado do gel, liquefeito a 65^?C ajustado a NaCl 500mM e incubado a 65⁹C durante 20min.

Adiciona-se um volume de fenol (equilibrado com Tris.HCl lOmM pH 7,5, EDTA lmM, NaCl 500 mM).

A fase aquosa ê reextraída duas vezes com fenol e uma vez com clorofórmio. 0 DNA e precipitado com 2,5 volumes de etanol absoluto frio e colhido por centrifugação. 0 sedimento de DNA ê lavado com etanol a 80¾ frio e depois seco

sob vacuo. 0 DNA ê ressuspenso em TE a uma concentração de 0,15 mg/ml.

0 fragmento de DNA de 3738 pb isolado tem duas extremidades cerses resultante da dupla digestão com Bali e Pvu II. 0 DNA é circularizado por ligação das extremidades cerses. 0,6 ug de DNA ê incubado durante a noite â temperatura ambiente em 30 ul de Tris. HCI 60 mM pH 7,5, MgCI₂ lOmM,, DTT lOmM, ATP 4mM e 900 U de ligase de DNA do T4 (Biolabs).

Amostras de 5 yul da mistura de ligação são adicionadas a 50 P¹ de células E.coli HB101 tratadas com cálcio e competentes para a transformação, preparadas pelo método de Mandei et al. (24). A mistura é mantida em gelo durante 5 min. depois incubado durante 2 min a 37⁹C e deixada 10 min â temperatura ambiente antes de semear em placas de agar LB contando 100 /ug/ml de ampicilina. Seis colónias amp^P são repicadas e cultivadas individualmente em 100 ml de meio LB ( como acima mas sem agar ) contendo 100 ug/ml de ampicilina. 0 DNA do plasmídeo é preparado a partir das células usando o processo descrito no Exemplo 2. Digestões com as enzimas de restrição Hae III (adquirida ã Biolabs, as condições de digestão são as sugeridas pelo fornecedor), PvuII e Bali dos plasmídeos são analisados num gel de 1,5¾ de agarose em tampão TBE. 0 padrão de restrição e o tamanho previsto do novo fragmento de junção formado indica os plasmídeos que são idênticos e contêm todas as sequências do pBR322 com excepção do fragmento Ball-Pvu II. Estes plasmídeos não têm o local de restrição Bali e são referidos por pBR32 Δ Bali.

b) Clonagem de um fragmento de restrição BamHI de levedura

com 5,1 kb contendo PH03 e PH03 em pBR322 Δ Bali.

»·, J

H9SBBr «β—

pJDB2O7/PHQ5, ΡΗ03 (ver fig. 1) contem uma inserção BamHI 5,1 de levedura com os genes da fosfatase acida regulável e constitutiva de levedura (PH05 e PHO3). pJDB2O7/PHO5, PH03, assim como o plasmídeo pBR 322 Δ Bali são digeridos com a endonuclease de restrição Bam Hl. Apos digestão completa a enzima ê inactivada durante 2 min. a 65⁹ C. Ambos os DNAs são precipitadas por etanol e ressuspensos em Tris.HCI lOmM pH8,0 a uma concentração de 0,2 mg/ml de cada. 0,5 ug de cada um dos dois DNAs digeridos com BamHI são combinados e ligados em 20 jul de tampão de ligação ( como sugerido por New England Biolabs, contendo 300 U de ligase de DNA do T4, durante 20hrs a 15^?C. Amostras de 5 yul da mistura de ligação são adicionadas a células E.coli tratadas com cálcio e feito a transformação como descrito no Exemplo 4a. As células de E.coli trans formadas são testadas quanto â sua resistência relativamente à ampicilina e tetraciclina. Oito colonias amp , tet são isoladas e cultivadas em 100 ml de meio LB contendo 100 yug/ /ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo é isolado a partir das células (ver Exemplo 2). Digestão por restrição com Bam Hl mostra que 4 plasmídeos contêm uma inserção de 5,lkb além do fragmento vector de 3,7 kb (pBR322 À Bali).

Digestão por restrição com Sall (New England Biolabs) determina a orientação do fragmento de 5,lkb inserido : dois plasmídeos têm a inserção orientada como mostra a figura 4.

Um deles é referido como p30. A direcção da transcrição dos genes PH05 e PH03 na inserção de 5,1 kb ê ao contrário do sentido dos ponteiros do relogio como indicado na figura

4.

Ex emp1o _ 5 j Construção de um plasmídeo de expressão contendo o promotor PH05 e os sinais de terminação da

transcrição de PH05 (ver fig. 5).

a) Eliminação do local de restrição Eco RI no plasmídeo p30:

Cinco pg de DNA de p30 (cf Exemplo 4) são digeridos completamente com a endonuclease de restrição Eco RI (Boehringer).

Para preencher as extremidades coesivas resultantes ,l^ug de p30 digerido com Eco RI em 50 ^ul de NaCl 50mM, Tris. CHI lOmM pH 7,5, MgCI₂ lOmM, DTT lmM, dATP 0,25 mM e dTTP 0,25 mM ê incubado durante 30 minutos a 37 ⁹C com 1 unidade de polimerase de DNA fragmentos maior Klanow, BRL). 0 DNA recuperado da precipitação com

etanol ê ligado como habitual e usado para transformação de células E.coli HB101 competentes como descrito no Exemplo 4. Os clones qne são resistentes à digestão com Eco RI são referidos por p30 ( Eco RI ).

b) Isolamento de um fragmento Sau3A-PstI com O,37kb

de terminação da transcrição de PH05:

0 produto da transcrição de PH05 foi mapeado por mapeamento com nuclease SI (25). Os sinais de terminação da transcrição verifica-se estarem localizados num fragmento Sau3A-PstI de 0,37 kb de gene de PH05 .

A sequência de nucleotídeos de fragmento Sau3A-PstI é dada na fig. 6.

Cinco pg do DNA de pJDB2O7/PHO5 ,

PH03 (cf Exemplo 2) são digeridas completamente com as endonuleases de restrição Sau3A e PstI.

Os fragmentos de restrição resultantes são separados num gel de 1,5¾ de agarose de ponto de fusão

[ί!

baixo em tampão TBE. 0 fragmento Sau3A-PstI de 0,37 kb é localizado por coloração com brometo de etídio e removido um bloco de gel tão pequeno quanto possível contendo este fragmento de DNA.

c) Clonagem do fragmento Sau3A-PstI de PH05 em M13mp9:

0 DNA do fago M13mp 9 ê um vector de clonagem útil com uma série de locais de restrição únicos (23). Cinco yug de DNA de M13mp9 são digeridos com as endonucleases de restrição BamHI e PstI. 0 fragmento de DNA maior com 7,1 kb é separado de um fragmento muito pequeno (8 pb) num gel de 8¾ de agarose de ponto de fusão baixo. 0 bloco de gel contendo o fragmento de DNA maior é removido do gel. Blocos de gel com o fragmento Sau3A-PstI de 0,37 kb do pJDB2O7/PHO5, PH03 (cf.Exemplo 5b) e o fragmento BamHI-PstI de 7,2 kb do M13mj>9· são liquefeitos a 65^ÇC, misturados em quantidades aproximadamente equimolares e diluídos com H^O para baixar a concentração da agarose para 0,3¾. A ligação é feita em 200/ul de solução contendo Tris.HCI 60mM pH7,,5, MgCI₂ lomM, DTT lOmM, ATP lmM e 600 unidades de DNA ligase de T4 (Biolabs). A transdução de células competentes da estirpe E.coli JM101 (Ca⁺⁺) é feita segundo o manual " M13 cloning and DNA sequencyng system" publicado por New England Biolabs. Os fagos de uma série de placas brancas são replicados e analisados relativamente ao tamanho da sua inserção de DNA por corte com as endonucleases de restrição EcoRI e PstI.

Um clone derivado de M13mp9 contendo o fragmento Sau3A-PstI de terminação da transcrição de PH05 ê isolado e referido como M13mp9/PHO5 ( Sau3A-PstI).

d) Clonagem do fragmento de terminação da transcrição de

PH05 em p30 ( EcoRI^r)

0 fragmento original de terminação da transcrição de PHO5 clonado no fago M13mp9 ( M13mp9/PHO5 (Sau3A-PstI) ê reclonado na forma de um fragmento HaelII-HindlII no plasmídeo p30 (Eco RI^) cortado com Bali e HindIII : DNA de M13mp9 /PHO5 (Sau3A-PstI) é cortado com pletamente com as endonucleases de restrição HaelII e Hind

III. Os dois fragmentos de DNA resultantes são separados num gel vertical de 1,5 % de agarose de ponto de fusão baixo em tampão TBE. 0 fragmento de 0,39 kb ê isolado num bloco de gel removido do gel. 0 DNA de p30 (Eco RI& ) é digerido com Bali e HindIII. 0 fragmento maior de 3,98 kb é separado num gel de 0,8¾ de agarose de baixo ponto de fusão em tampão TBE e isolado por excisão de um bloco de gel contendo o fragmento de DNA.

Os blocos de gel com o fragmento Hae III - Hind III com 0,39 kb de terminação da transcrição de PH05 e o fragmento BalI-HindIII de 3,98 kb do p30 (Eco RI ) são fundidos a 65^?C e misturados em quantidades aproximadamente equimolares. Ligação e transformação de células de E.coli HB101 competentes são como descrito no Exemplo 4. 0 DNA das células transformadas ê analisado e referido como p31 ( ver figura 5).

0 plasmídeo de expressão p31 contem a região do promotor de PH05 com parte da sequência sinal de PH05 e adjacente a ela um fragmento de DNA com os sinais de terminação da transcrição. Sequências codificadoras estranhas a serem expressas neste vector podem convenientemente ser inseridas entre as sequências do promotor e da terminação da transcrição.

4 '»

Exemplo_6 : Deleção da sequência sinal de PH05 no plasmídeo de expressão p31 (ver figura 7)

0 plasmideo de expressão p31 contem a sequência do promotor de PHO5 incluindo os sinais de inicia ção do mRNA, o codão de iniciação da tradução ATG da fosfatase acida e 40 nucleotídeos adicionais codificando parte da sequência sinal da fosfatase acida. Nesta construção os nucleotídeos da sequência sinal e o ATG são eliminados por digestão com Bal 31. Introduzem-se adaptadores EcoRI para permitir a união do promotor de PH05 â sequ^encia codificadora do TPA maduro.

a) Digestão com Bal31 do plasmideo p30 cortado com Bali

20 /ag de DNA de p30 (ver Exemplo 4b) são digeridos com a endonuclease de restrição Bali, resultando em 2 fragmentos de 3,7 e 5,1 kb.

Após extracção com fenol/clorofórmio o DNA e precipitado com etanol. 0 DNA e ressuspenso em Tris lOmM pH 8,0 a uma concentração de 0,5 ^g/ml. 9 ytig de DNA de p30 cortado com Bali são digeridos com 2 U da exonuclease Bal 31 (BRL) em 100 yul de Tris. 20mM pH 8,0 ,

NaCl 199 mM, MgCI₂ 12mM, CaCI₂ 12mM e EDTA lmM. Amostras de DNA são MgCI₂ 12mM, CaCI₂ 12 mM e EDTA lmM.

Amostras de 2 pg de DNA são retiradas após 15 seg., 30 seg. 45 seg. e 60 seg. de incubação a 30⁹C e misturadas imediatamente com 50 yul de fenol e 60 pl de TNE. Após extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol, o DNA e ressuspenso em Tris lOmM pH8,0 a uma concentração de 100 pg ml. Para analisar a extensão do corte com Bal 31 digeriu-se com a endonulease BamHI 0,5 pg de DNA de cada ponto e analisou-se num gel de 1,5¾ de agarose em tampão tris.borato pH 8,3. Em media são removidos 70 pb de cada extremidade do fragmento após 45 seg. de digestão com Bal 31. Para ex- 52 -

Ιβί^ϊ.

periências posteriores usou-se DNA do ponto 45 segundos

b) Adição de adaptadores EcoRI ao DNA tratado com Bal31

Duas unidades de &26O adaptadores EcoRI (5'-GGAATTCC-3', BRL) são ressuspensos em 250 ^il de Tris lOmM pH8, EDTA lmM. Duas %ig de adaptadores Eco RI são sujeitos à acção de cinase em 75 ^il de Tris 6omM pH7,5 MgCI^ lOmM, DTT 15mM, ATP lOmM e 33 U de polinucleotídeocinase de T4 (Bochringer). Apos 1 h a 37⁹C a mistura ê deixada arrefecer até â temperatura ambiente e depois guardada a -20⁹C.

Os adaptadores EcoRI de cadeia dupla são ligados com as suas extremidades cerses aos fragmentos de DNA tratados com Bal 31. Metade de um micrograma de DNA tratado com Bal 31 ( ver Exemplo 6a) ê incubado durante 16 horas à temperatura ambiente com um excesso de 50 vezes de adaptadores EcoRI tratados com cinase em 20^11 de tris 60mM pH 7,5, MgCI₂ lOmM, DTT lOmM, ATP 4mM e 600 U de ligase de DNA do T4 ( Biolabs). Após inactivação da ligase do DNA do T4 (10 min. a 65⁹C ) o excesso de adapatadores EcoRI e cortado com 50 U de EcoRI (Bochringer) num volume de 50 yil . 0 DNA e extraído com

fenol / clorofórmio, precipitado com etanol e ressuspenso em Tris lOmM, EDTA lmM.

A endonuclease de restrição EcoRI, não só corta os adaptadores EcoRI nas extremidades de ambos os fragmentos Bali (3,7 kb e 5,1 kb) como também o local EcoRI interno no fragmento de 5,1 kb dando origem a um fragmento de 3,9 kb e a outro de 1,2 kb. Os fragmentos de 3,7 kb e 3,9 kb são separados do fragmento de 1,2 kb num

gel de 0,8¾ de agarose de ponto de fusão baixo (Sigma) em

Tris-HCI 90mM pH8,3, acido borico 9 0mM e EDTA 2,5mM. As bandas de DNA são coradas com brometo de etídio e visualizadas sob luz UV de grande comprimento de onda a 365 nm Os dois fragmentos de DNA maiores de 3,7Kb e 3,9 kb não são separados. São removidos do gel num único bloco de gel e extraídos como descrito no Exemplo 4a.

Os fragmentos lineares terminando em extremidades coesivas EcoRI são circularizadas por ligação. Cerca de 0,25 ^ig de fragmentos são ligados em 100 ^il de tris 60mM pH 7,5, MgCIz lOmM, DTT 10 mM, ATP lmM e 600 U de ligase de DNA do T4 durante 4 horas a 15^ÇC.

Amostras de 10 p.1 da mistura de ligação são adicionadas a 100 ^il de células E.coli HB101 tratadas com cálcio e competentes para a transformação (ver Exemplo 4a), 35 colonias transformadoras amp são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 / ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo é preparado de acordo com o método de Holmes et al. (26) e ê analisado por dupla digestão com EcoRI/BamHI.

c) Análise da sequência de nucleotídeos para determinar a

posição do adaptador EcoRI adicionado

A maior parte dos 35 clones diferirão uns dos outros na posição do adaptador EcoRI adicionado na região do promotor de PH05 dependendo do grau de diges- [ tão com Bal31 das moléculas de DNA individuais. Para a anãlise da sequência de nucleotídeos o DNA de plasmídeo é digerido com EcoRI. Apos extracção com fenol/cloroformio o DNA cortado por restrição é precipitado com etanol.

0 DNA é desfosforilado e marcado nas extremidades 5'.

Os fragmentos de DNA marcado são cortados com uma segunda endonuclease de restrição, BamHI.

Os produtos são separados num gel de 8¾ de agarose de baixo ponto de fusão. 0 fragmento EcoRI-BamHI marcado em 5’ e com 0,5-0,6 kb é isoladoa partir de agarose de ponto de fusão baixo como descrito no Exemplo 4a. Para a determinação da sequência de nucleotídeos adjacente ao adaptador EcoRI os diferentes fragmentos de DNA são degradados quimicamente e os produtos separados por electroforese em gel de poliacrilamida como descrito por Maxam e Gilbert ( =L0) .

Os diferentes clones e a posição do correspondente ultimo nucleotídeo da sequência de PH05 (depois seguido de um adaptador EcoRI) são registados na Tabela 1 ( ver também figura 8).

TABELA 1

CLONE	posição do ultimo nucleotídeo
quência de	PH05
pE			+ 25
pG			+16
pe			+15
pd			+12
pY			-4
pR			-10
pP			-16
PV			-18
pL			-21
pN			-22
pC			-24
pH			-27

TABELA 1 (Continuação)

CLONE posição do último nucleotido da sequência de PH05

pS

pk

pi

pM

pO

pF

pm

pK

Pi

ph

-28

-29

-38

-50

-53

-59'

-67

-73

-81

-137

d)

Isolamento de um fragmento BamHI-EcoRI de 0,53 kb contendo o promotor PHO5R

0 plasmídeo pR contem o promotor PH05R num fragmento BamHI-EcoRI de 534 pb. Segundo a numeração na fig. 3a, o fragmento cobre as sequências de pro motor de PHO5 desde o nucleotídeo-541 (local Bam HI) atê ao nucleotideo -10. Um adaptador EcoRI ligado ao nucleotídeo -10 (ver Exemplo 6b) contribui com dois resíduos G quando do corte com EcoRI.

0 plasmídeo pR ê digerido com as endonucleases de restrição BamHI e EcoRI. 0 fragmento BamHI -EcoRI de 0,53 kb ê separado num gel de 0,8¾ de agarose de baixo ponto de fusão e isolado como descrito no Exemplo 4a. A sequência de nucleotideos ê dada na fig. 9.

De modo análogo o plasmídeo py ê digerido e um fragmento BamHI-EcoRI de 0,53 kb ê isolado contendo o promotor PH05 y. A sequência de nucleotídeos ê dada na fig. 10.

e) Substituição do fragmento SalI-EcoRI no plasmídeo p31

por um fragmento SalI-EcoRI das novas construções.

Cinco ^ig do plasmídeo p31 (cf .Exemplo 5d) são digeridos com a endonuclease de restrição Sall.

0 DNA cortado por restrição é precipitada com etanol e ressuspenso em 50^1 de tris lOOmM pH7,5 NaCl 50mM, MgCI^ 5mM. 0 DNA é digerido completamente com EcoRI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,8¾ de agarose de baixo ponto de fusão em tampão tris-borato -EDTA pH8,3. Um fragmento de DNA de 3,5 kb ê isolado num pequeno bloco de gel contendo a banda de DNA.

Cinco ^ig de cada um dos clones pR e py (cf. tabela 1 e fig. 8) são digeridos com Sall e EcoRI do mesmo modo que o descrito atras. Os fragmentos de DNA com 0,8 kb são isolados em pequenos blocos de gel de agarose de baixo ponto de fusão.

0,67 ^.g de fragmento Sall-EcoRI de 3,5kb do vector p31 ê ligado a 0,34 ^ig do fragmento SalI-EcoRI de 0,8 kb do plasmídeo pR ou py, respectivamente. Os blocos de gel apropriados, contendo os fragmentos de DNA são misturados e fundidos a 65⁹C. 0 gel liquefeito é diluído três vezes. A ligação é efectuada num volume total de 240 ^il de tris 60mM pH7,5, MgCI₂ lomM, DTT lOmM, ATP ImM com 750 U de DNA ligase de T4 (Biolabs) durante a noite a 15⁹C. Uma amostra de 2 p.1 de cada uma das ligações ê adicionada a 100 ^il de células E.coli H13101 tratadas com cálcio e competentes para o transformação (ver Exemplo 4a).

9

8 colónias transformadas amp cada uma é crescida individualmente em meio LB contendo 100 ^ig/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo é analisado por anãlie de restrição. Os clones de cada grupo são idênticos Um clone de cada ê ainda usado e referido por p31R e p31Y, respectivamente (fig. 7).

Exemplo__7 : Preparação do gene do TPA

a. Preparação do mRNA

2

Frascos Falcon (175 cm ) para cultura de células são semeados com um inoculo inicial de 10x10^ células HeLa e mantidas em 25 ml de meio de Eagle modificação de Dulbecco (DME) suplementado com 5¾ de soro fetal de bovino. 0 meio ê mudado de três em três dias até se atingir a confluência.

Culturas com monocamadas confluentes são lavadas duas vezes com PBS (salino tamponado com fosfato : 80g NaCI, 2g KCI, 14,4g Na₂PHO₄ e 2g KH₂PO₄ por 1 de solução ) e subsequentemente mantidas durante 16 horas em DME suplementado com 100 ng/ ml de TPA. 0 RNA total ê extraído como descrito (27), aplicando tampão de lise directamente sobre as monocamadas celulares. Sequências ricas em poli (A) são isoladas a partir do RNA Total de acordo com o método de Nagamine et al. (28).

A centrifugação em gradientes de sacarose é feita numa ultracentrífuga Beckman equipada com um rotor SW-41. 100 ^.g de RNA poli (A) em 200 ^il de H₂0

são centrifugados através de um gradiante de 15-30¾ de sacarose em tris. HCI 0,02M , pH 7,4, 0,1¾ de SDS, EDTA 0,01M, NaCI 0,04M a 30000 rpm durante 12 horas a 18^?C.

- 58 | I

;'>'·''q

-Γ0 gradiente ê fraccionado a partir do fundo em 36 fracções e o RNA precipitado pela adição de NaCl atê 0,2M e

2,5 volumes de EtOH. Apos uma incubação durante a noite a -20⁹C, o RNA é recuperado por centrifugação e dissolvido em 20 ^tl de H₂0.

0 õcitos na fase seis são seleccionados por observação a olho nu, mantidos em meio de Barth modificado e injectados com RNA das fracções do gradiente de sacarose basicamente como descrito (29). A secrecção do activador do plasminogénio pelos oõcitos injectados é demostrada.por caseinólise radical com o descrito por Nagamine et al ( 28). A secrecção máxima de TPA ê observada em oõcitos injectados com as fracções 21-23S.

b. Síntese de cDNA e clonagem molecular

RNA poli (A) de HeLa enriquecido em mRNA de TPA é copiado para cDNA. Dito ^ig de tris.HCI 50mM, pH8,3, KCI 75 mM, MgCI₂ 8mM, 1¾ v/v de etanol, EDTA 0,2 mM, 25 pg/ml de oligo úT^₂_^g ; 0,5 mM de cada dNTP e

12 ^íli de Çbí ³²P_/ dCTP ( New England Nuclear) .

A solução ê arrefecida atê 0⁹C e adicionado pirofosfato de sodio 3mM, DTT lmM e 144 unidades de transcriptase reversa ( Life Sciences Ltd ).

Apos 60 mh a 39⁹C, adiciona-se mais 32 unidades de transcriptase reversa. Apos 100 min. de incubação a reacção ê parada pela adição de SDS para 0,2¾

- 32 e EDTA para 15mM. A incorporação de / <X P_/ dCTP em cDNA ê medida por precipitação com ácido tricloroacético de amostras da mistura de reacção. 1,15 ^ig de cDNA é sintetizado a partir de 8 ug de RNA (14,4¾ de copia).

Depois de duas extrações em clorofõrmio-ãlcool isoamílico (24:1 v/v) , à fase aquosa ê retirado o sal numa coluna de 4 ml ( 5 x 0,5 cm ) de Sephadex G 50 fina por centrifugação em tris.HCI 20mM, pH9, NaCl 100 mM, EDTA lmM.

As fracções do void volume são reunidas e adicionado NaOH para 0,3N. Apos 12 horas a 20^?C, adiciona-se HCI para 0,3N e os ácidos nucleicos são precipitados pela adição de 3 volumes de etanol. A síntese da segunda cadeia e feita em 200 yl de uma solução contendo ácido N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-etano-2-sulfónico (Hepes), pH 6,9 , KCI 30 mM, DTT lOmM, MgCI2 lOmM, dATP, dCTP, dTTP 0,5 mM de cada e 25 unidades do fragmento Klenow por yig de cDNA. Apos 2 horas de incubação a 25^?C a reacção e parada por adição de SDS para 0,1¾ e â solução ê-lhe removido o sal numa coluna de 4 ml de Sephadex G 50 fine por centrifugação em acetato de sódio 30mM, pH 4,5, NaCl 0,2M, Zn CI2 3mM, 0,01¾ de SDS. Âs fracções do void volume adiciona-se

2,5 unidades /ml de nuclease Sl e a solução e incubada a 37⁹C durante 30 min. A solução e extraída com fenolclorofómio -álcool isoamílico (24 : 24 : 1, v/v ) e o ácido nucleico na fase aquosa precipitado com NaCl 0,3M e 3 vol. de etanol, 76¾ do / P_7 dCTP incorporado na primeira cadeia permanece precipitãvel pelo ácido trifluoroacêtico após digestão com Sl e a análise num gel de agarose alcalina (30) mostra cDNA de cadeia dupla com um tamanho entre 500 e 3000 pb. 0 cDNA e fraccionado pelo tamanho num gradiente de 5-20¾ de sacarose em tris.HCI lOmM, pH 7,4, NaCl lOOmM, EDTA lmM, 0,1¾ de SDS.

Após 10 horas de centrifugação a 12^?C num rotor SW 41 a 39^: K as fracções contendo o cDNA de maior tamanho (43¾ das amostras totais ) são reunidas e precipitadas por adição de NaCl para 0,3M, 5 yig/ml de

BSA e 3 volumes de etanol, 25 ng de cDNA fraccionado pelo tamanho são providos de caudas dC como descrito anteriormente (31) numa reacção de 85 yal contendo 450 unidades / ml de transferase terminal, cocodilato de potás

sio Ο,ΙΜ , ph 7,5 , COCI₂ 2 mM, EDTA lmM, DTT O,lmM e /“<A ³²P_7 dCTP 5 pM (20 ^iCi). Após 3 min. a 30⁹C a reacção é parada pela adição de EDTA para lOmM, SDS para 0,2¾ p/v e tRNA para 100 ^ig/ml . A solução ê extraída duas vezes com cloroíormio-ãlcool isoamílico e removido o sal numa coluna de 5ml de Sephadex G50 fine em tris.HCI 20 mM, pH9, NaCl lOOmM, EDTA lmM. As fracções do void volume foram reunidas e o acido nucleico precipitado por adição de NaCl para 0,3M, 25 ^ig/ml de tRNA e 3 volumes de EtOH. 20 ng de cDNA ds com caudas ê ligado a 60ng de pBR322 com caudas dG no local PstI (32) em 20 pl de NaCl 0,4M, tris. HCI lOmM, pH7,5. EDTA lmM durante 10 min a65⁹C, 2 horas a 45^?C, 2 horas a 22⁹C e depois arrefecido lentamente para 4⁹C durante a noite. 0 cDNA ligado é misturado a 0⁹C com 100 pl de suspensão de E.coli HB101 /LM 1035 competente (33).

Após 15 min de incubação a 0⁹C e 5 min. a 37⁹C, adiciona-se 1,9 ml de LB à suspensão bacteriana continuando-se a incubação a 37⁹C durante 2 horas.

As células são semeadas em placas de agar LB contendo 10 /ig/ml de tetraciclina. Obtem-se 100 transformantes /ng de vector com uma frequência de fundo de vector realizado de 13¾. 5400 transformantes são de

colónias isoladas para placas de microtitulação de 96 poços contendo 200 pl de LB e 10 ^ig /ml de tetraciclina, crescidas durante a noite a 37⁹C, depois guardadas congeladas a -80⁹C apos adição de glicerol para 5¾ v/v.

c. Rastreio de sequências de DNA do TPA

Dois oligonucleotídeos tendo as sequências

d5'-GGCAAAGATGGCAGCCTGCAAG-3’ e

d5'-GCTGTACTGTCTCAGGCCGCAG-3'

do cDNA do activador do plasminogenio de tecido humano (34) são sintetizados pelo método tri-êster modificado (35), purificados por HPLC de fase reversa e electroforese preparativa em poliacrilamida. Os oligonucleotídeos são marcados com /”Y P_7 ATP ( New England Nuclear ) na extremidade 5' usando a cinase de T4 com uma actividade específica de 1x10^ cpm ( Cherenkov)/pmole (10).

As placas de microtitulação são descongeladas e as culturas transformantes transferidas segundo um arranjo tipo grelha de 6 por 8 para filtros de nitrocelulose HATF Millipore de 82 mm, crescidos durante 18 horas em placas de agar LB contendo 10 jig/ml de tetracidina e os plasmídeos amplificadoq durante 12 horas em pia cas de agar LB contendo 10 jig de tetracidina, 10 ^íg/ml de cloranfenicol.

0 DNA é fixado aos filtros por transferência ( "blotting ") de cada filtro para papel WÊatman 3M saturado com 10¾ de SDS durante 3 min ; NaOA 0,5N, NaCl 1,5M durante 5 min; Tris. HC1 0,5M, pH8, NaCl 1,5M durante 5 min; e SSPE 2x (SSPE : NaCl 0,15M, NaH₂PO₄ lOmM, pH7,4 EDTA lmM) durante 5 min. ( 42).

Os filtros são secos ao ar, depois colocados a 80⁹C sob vacuo durante 2 horas.

Os filtros assim tratados são lavados durante 2 horas a 37⁹C em Tris . HC1 50mM, pH 7,5, EDTA lOmM, NaCl 1M, 1¾ de SDS para remover detritos bactérianos aderentes.

A hibridação e lavagem ê feita como

descrito por Wallace et al. ( 1981) usando as relações empí

ricas entre comprimento do nucleotideo, conteúdo G+C e

Tm determinados por Suggs et al. ( 45) e Smith ( 46 ).

Os filtros são prê-hibridados ( 2 horas ) e hibridados ( 12 horas ) a 60⁹ C. num filtro de

1,6 ml de NaC190OmM, Na H₂ P0₄ 60mM, pH 7,4, EDTA 7,2mM (SSP 6x ), BSA, polivinilpirrolidona, Ficoll 400 0,1¾ p/v de cada ( solução de Denhardt), 200 jAg de TRNA e 0,1¾ p/v de SDS.

Uma mistura de ambos os oligonucleotídeos marcados com P e 0,3 pmol/ml ê adicionada â solução de pre-hibridaçao.

Apos hibridação, os filtros são lavados em SSC 6x ( SSC: NaCl, 0,15M, citrato tri-sódio 15mM) durante 3x10 min a 4⁹ C e 3x10 min. a 60⁹C.

Os filtros são expostos a filme Kodak XB5 de raios X com um écran de intensificação Dupont durante 36 horas a -70⁹C.

As placas de microtitulação que produzem sinais de hibridação positivos são identificados e colõnas isoladas destas culturas são testadas de novo como descrito, hibridando filtros em duplicado com cada sonda em separado e usando 63⁹ C para a hibridação e lavagem dos filtros.

As colõnias que apresentam sinais positivos com ambas as sondas são repicadas do filtro principal e crescida durante a noite a 37⁹ C em LB contendo 10 ug/ml de tetracidina. Uma destas colõnias ê referida

obtidas useguido de

por pW 349 F. As preparações de plasmideos são

sando o método da lise alcalina modificado (36)

centrifugação de equilíbrio em CsCl.

0 DNA do plasmídeo pW 349 F ê analisado por digestão com as endonucleases de restrição Pst I e Bgl II. Os fragmentos de restrição têm os tamanhos esperados. Pode-se pois concluir que o plasmídeo pW349 F (7,lkb) contem o gene estrutural completo do activador do plasminogênio de tecido.

d. Sequência do DNA de clone de cDNA do TPA (cf. fig. 11).

Usando uma combinação dos métodos, de Maxam e Gilbert (10) e Sanger (53) ê sequenciado o clone de cDNA do TPA. Os resultados estão apresentados na fig. 11. Comparando os resultados da sequenciação com os publicados por Pennica et al. (7) apenas se pode observar uma alteração a qual se situa no nucleotídeo da posição 113 dando origem a uma alteração na posição "silenciosa " de um aminoãcido da prê-sequencia do TPA ( CTG- CTA).

Exemplo_8£ Construção dos plasmideos pJDB 207 /PH05-TPA/ (IA) e pJDB 207/ PH05 - TPA (figs. 12-15)

0 promotor de PH05 e a sequência sinal de PH05 são unidas em fase â sequência codificadora do TPA maduro. Na construção é também incluído um sinal de terminação da transcrição de PH05

a) Construção de M13mp9 / PH05-Bam-Sal (ver fig. 12)

Um fragmento Bam Hl-Sall de 623 pb contendo o promotor de PH05 (Exemplo 3a, fig.3a) obtem-se cortando 2 ^ig de pBR 322/PHO5 Bam-Sal (ver fig. 1) com as endonucleases de restrição Bam Hl e Sall (ambas da Biolabs) nas condições indicadas pelo fornecedor . 2 da forma replicativa (RF) do vector fãgico de cadeia simples M13mp9 (23) ê digerido com as mesmas enzimas. Ambas as preparações de DNA são aplicadas a um gel de 0,6¾ de agarose como descrito no Exemplo 5. Um fragmento de 623 pb derivado do plasmídeo pBR322/PHO5 Bam-Sal e uma banda de

7,2 kb derivado de M13 mp9 são extraídas como descrito no Exemplo 5c. 150 ng de fragmentos de 623 pb e 150 ng do

fragmento de 7,2 kb do DNA de M13mp9 são ligados com 200 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) durante 4 horas a 15⁹C em Tris.HCl 60mM, pH 7,5, MgCl₂ lOmM, DTT lOmM e ATP ImM.

A estirpe E.coli JM 101 ê transformada como descrito por Messing (23) e 12 placas brancas são repicadas e analisadas por analise de restrição do plasmídeo RF (38).

Todos os clones analisados continham o fragmento de 623 pb inserido no local Bam-Sal do M 13mp9 Seleccionou-se um único isolado e designou-se por M13mp9/ /PH05 Bam-Sal I (ver fig. 12).

b) União da sequência codificadora da proteína TPA à sequência sinal de PH05 (ver fig. 12)

2 jig do plasmídeo pW 349 F (cf. Exemplo 7) ê digerido com acudonuclease Bgl II (New England Biolabs) nas condições sugeridas pelo fornecedor.

0 DNA ê precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCl 6mM, pH 7,5, NaCl 50mM, MgCl₂ 6mM.

As extremidades 3' recessed do DNA são preenchidas usando o fragmento Klenow da polimerese de DNA de E.coli . A reacção tem lugar num volume total de 50 ^1 com 2 unidades de enzima na presença de dATP, dGTP dCTP e dTTP 80p M cada durante 30 min. a 37⁹C.

A incubação ê parada por extraap, com fenol e o DNA precipitado com etanol.

2 pg do plasmideo M13mp9 / PH05 Bam-Sal na forma RF ê digerido com o endonuclease de restrição Κρη I ( Biolabs ) como indicado pelo fornecedor. 0 DNA ê precipitado com etanol e ressuspenso em 10 ^ul de NaCl 200 mM, ZnSO^ lmM e Na-acetato 60mM pH 4,6. Adiciona-se uma unidade da exonuclease SI e a mistura é incubada durante 60 min a 37⁹C. A reacção é parada por extracção com fenol, o DNA ê precipitado com etanol e ressuspenso em 50 yUl de Tris.HCl 50mM, pH 7,5, MgCl₂ lmM. Adiciona-se 10 unidades de fosfatase alcalino de intestino de vitela ( Bochringer) e a mistura é incubada durante 60 min. a 65⁹C.

0 DNA é purificado por cromatografia de troca iónica em DE52 ( Whatman) (ver Exemplo 9 Aa ) e em seguida precipitado com etanol.

1,5 pg do plasmideo pW349 F digerido com BglII tratado com polimerase de DNA Klenow (ver acima) ê ligado a 0,5 jig de M13mp9/PHO5 - Sal cortado com Kpnl, digerido com S^ e tratado com fosfatase num volume de 10 jxl usando 900 unidades de ligase de DNA do T4 num tampão como descrito atras, excepto usar-se ATP 4mM e a incubação ter lugar durante 18 horas â temperatura ambiente. Células E.coli JM 101 são transformadas, 6 placas são seleccionadas e o molde fãgico de cadeia simples é preparado como des crito (38) . A sequênciação da união entre o fragmento BglII de 2,0 kb e o vector M13mp9 é feita usando o método dideoxi de terminação de cadeias (39). Usou-se como iniciador o oligodeoxinucleotídeo seguinte :

5’ AGTATGGCTTCATCTCTC 3’

0 oligodeoxinucleotídeo ê sintetizado pelo método fosfotriester (40,41). Hibridiza com o promotor de PH05 e permite alongamento com o fragmento Klenow da DNA polimerase de E.coli ao longo do desejado ponto de junção do DNA.

Obtem-se um isolado correcto que tem o seguinte arranjo de sequência do DNA ( começando a partir do ATG da sequência codificadora da proteína de PH05 ) :

ATG TTT AAA TCT GTT GTT TAT TCA ATT TTA GCC GCT TCT TTG GCC

AAT GCA GGA TCT_TAC_CAA_GTG

_ sequência codificadora da proteína PH05

------- sequência codificadora da proteína TPA

Esta construção ê designada por M13mp9 PH05 - TPA (ver figura 12 ).

c) Construção de um fragmento encurtado de terminação da transcrição de PH05 (ver fig. 13)

10 yUg do DNA do plasmídeo p31R fig. 7) ê digerido com a enzima de restrição Sma I,

(ver o DNA

ê ressuspenso em Tris-HCl lOmM pH 8,0 a uma concentração de 0,5 ml. 10 pg do DNA cortado com Sma I são digeridos com 2U da endonuclease Bal 31 ( BRL) em 100 yul de Tris 20mM pH 8,0, NaCl lOOmM, MgCl₂ 12mM, CaCl₂ 12mM e EDTA lmM.

Amostras de 3 yUg de DNA cada são retira das após 90, 120 e 150 segundos de incubação a 30⁹C e imediatamente misturadas com 50 yil de fenol e 60^1 de TNE.

Após extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol o DNA e ressuspenso em Tris.HCl lOmM pH8,0 a uma concentração de 100^ig/ml. Para analisar a digestão com a exonuclease Bal31, amostras de 0,7 ^ag de DNA de cada ponto no tempo são digeridas com HindIII e analisadas por electroforese em gel de agarose. Para anãlise ulterior e analisado o DNA do ponto 90 segundos 2,2 ^ug do DNA de plasmídeo são incubadas durante 1 hora a 37⁹ C com 2,8 U da DNA polimerase Klenow ( fragmento maior da polimerase I, BRL ) em 35 jxl de Tris.HCl 60mM pH7,5, MgCl₂ com lOmM e dNTPs 0,lmM.

Três yig do adaptador Xhol (5'-CCTCG AGG-3', Collaborative Research) são tratados com cinase em 50 ^1 de Tris.HCl 6mM pH7,5 MgCl₂ lOmM, DTT 4mM, ATP 0,5mM e 35 U da cinase de polinucleotídeos do T4 ( Bochringer) durante 30 min. a 37⁹ C.

0,67 yug de adaptadores Xhol tratados com cinase e 0,4 ^ug de DNA do plasmídeo p31R de extremidades cerses tratado com Bal 31 são ligados durante a noite â temperatura ambiente em 25 yil de Tris 60mM pH7,5 MgCl₂ lOmM,

DTT 5mM, ATP 3,5mM e 450 U de DNA ligase de T4. 0 DNA ligado ê separado do excesso de adaptadores por precipitação com isopropanol na presença de EDTA lOmM, acetato de sódio 0,3M pH6,0 e 0,54 volumes de isopropanol. Após 35 min. de incubação â temperatura ambiente o DNA ó sedimentado por centrifugação .

6

Ο sedimento ê seco ao ar e ressuspenso em 17 yUl de Tris. 6mM pH 7,9, NaCl 150 mM, MgCl₂ 6mM e mercaptoetanol 6mM. Os adaptadores Xho I ligados ao DNA são cortados com Xho I, o DNA ê precipitado com isopropanol como jã descrito e circularizado por ligação.

Após 6 horas de ligação a 15⁹C em 50 yal de Tris.HCl 60mM ph 7,5, MgCl₂ lomM, DTT lOmM, ATP lmM e 600 U de DNA ligase de T4, 10 yiil de cada mistura de ligação são adicionados a 100 yiil de células E .coli HB101 tratadas com cálcio e competentes para a transformação (ver Exem pio 4a ).

24 colónias amp^R são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 mg/1 de ampicilina.

0 DNA de plasmídeo/^Ç p31R(Xho I)_7 ê isolado e analisado por digestão com Hae III. São escolhidos dois plasmídeos e a sequência de nucleotídeos adjacente ao local Xho I no fragmento de terminação e determinado pela técnica de Maxam e Gilbert (10). A sequência estã apresentada na Fig. 15.

d) Transferência do gene híbrido PH05 -TPA para o vector de levedura pJDB 207 (ver figura 13.)

Uma preparação de plasmídeo RF de M13mp9 PH05 -TPA e efectuada como descrito atras. 2 Mg deste DNA ê digerido com a endonuclease de restrição Bam Hl (Biolabs) e Sal I (Biolabs) e o fragmento de 2,6 kb e isolado por electroforese num gel de agarose de baixo ponto de fusão (ver Exemplo 5c). De modo idêntico prepara-se 100 ng do fragmento Hind III - Xho I de 134 pb do plasmídeo p31R (Xho I) contendo a terminação de PH05. Em adição, 1 ^ig do plasmídeo pJDB2O7 (22) e digerido com Bam Hl e Hind III

e o fragmento de 6,5 kb e isolado por electroforese num gel de agarose de baixo ponto de fusão.

0,5 yig de cada um dos três fragmentos são ligados em 20 yul de Tris. HC1 60mM, pH 7,5, MgC^lOmM, DTT lOmM, ATP lmM com 200 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) durante a noite a 15⁹C.

A transformação de E.coli HB 101 ê feita como descrito no Exemplo 4a com selecção de colónias resistentes à ampicilina.

Quatro colónias são repicadas, o DNA de plasmídeo e preparado ( usando o mótodo descrito no Exemplo 2) e o DNA e analisado usando como marcas os seguintes locais de restrição : Bam HI, Hind III, Bst E II.

Todos os isolados verifica-se estarem correctos. Um dos plasmídeos e referido como pJDB 207/ /PH05-TPA (IA).

e) Construção de pJDB 2O7/PHO5 -TPA Λ (ver fig. 14).

10 jig de DNA de cadeia dupla de Ml3mp9 PH05 -TPA e digerido com Sal I. Após extracção com fenol e precipitação com etanol o DNA e ressuspenso em Tris. .HC1 lOmM pH8,0 a uma concentração de 0,5 mg/d. As digestões com Bal 31 são feitas especialmente como descrito no Exemplo 8c ) e adicionados os adaptadores Xho I.

Após transformação da estirpe JM 101 de E.coli o DNA RF e isolado e determinada a posição do adaptador Xho I pelo mótodo de sequência dideoxi (39) usando o oligodeoxinucleotídeo iniciador

M15mp9/PHO5-TPA (Xhol-l)

M13mp9/PHO5-TPA (Xho1-2)

M13mp9/PHO5-TPA (XhoI-3)

M13mp9/PHO5-TPA (XhoI-4)

As posições 1-4 dos adaptadores Xho I são mostradas abaixo:

CGACCG TGA

CCAGGAACACCCGACTCCTCAAAAGCAAATGAGAGTCC

CGCCT

CTTCTTCTTCA

gaagacactg[caaaggícgcagtg Icttctct

TGA

codão de paragem da tradução para o TPA

1, 2, 3, 4 posições do adaptador Xho I(5'CCTCGAGG-3')

2 yig de DNA RF de cada um dos quatro derivados M13 atras referidos / M13 mp9/PHO5-TPA (Xho I-1 a 4 )_7 são digeridos com Bam HI e Xho I e os fragmentos de 2,5 kb são isolados por electroforese em gel de agarose de baixo ponto de fusão (ver Exemplo 5c).

De modo idêntico, 2 yig de p31R (Xho I) são digeridos com Xho 1 e Hind III e o isolador , o fragmen to de 134 pb. 2 yig do plasmideo de levedura pJDB 207 ê digerido com Bam HI e Hind III e o fragmento de DNA de

71

6,5 kb é isolado como descrito atras. Os três fragmentos são ligados a 15⁹C durante 15 horas e E.coli HB101 ê trans formado para resistência â ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê isolado de séries de 12 colónias e as construções são verificadas por analise de restrição com as endonucleases de restrição HindIII, Xho I e Bam III .

Isolados de quatro experiências de clonagem são colhidos e designados por ;

pJDB2O7/PHO5 -	- TPA Z_\ 1,
PJDB2O7/PHO5	TPA Λ 2.
pJDB2O7/PHO5	TPA Δ 3,
PJDB2O7/PHO5	TPA A 4,

Exemplo_9: Construção do plasmídeo p31 RL/TPA (12-2) (fig.16)

A união do promotor de PHO5 e a sequência codificadora do TPA maduro ê feita através de um oligodeoxinucleotídeo sintético. Um plasmídeo contendo este adaptador oligodeoxinucleotídeo na extremidade 3’ do promotor de PHO5 é usado com DNA receptor para clonagem da sequência codificadora do TPA maduro.

A. Preparação do plasmídeo receptor p31BL (fig.16) :

a) Digestão do plasmídeo p31R com Eco RI e fosfatase alcalina

3 yg de DNA do plasmídeo p31R (ver Exemplo 6e ) são digeridos com 6 unidades da endonuclease de restrição Eco _Rj durante 60 min. a 37⁹ C ^nas condições recomendadas pelo fornecedor ( Boehringer). Após digestão completa a amostra e aquecida durante 10 minutos a 65⁹C para inactivar a enzima. Adiciona-se então 0,05 volumes de Tris.HCl 1M pH 8,0 e 2 U de fosfatase alcalina de intestino de vitela ( Boerhinger). A mistura e incubada durante 60 minutos a 37^?C e depois durante 1 hora a 65⁹C para inactivar a fosfatase pelo calor. 0 DNA e purificado por cromatografia de troca ionica em DE 52 ( Whatman). 0 DNA

adsorviio a DE52 ( 100 yul deito uma camada numa pipeta de Pasteur siliconada) em tampão de baixa concentração salina (NaCl 150mM, Tris.HCl lOmM pH8,0, EDTA ImM) e eluido com uma solução tampão com alto teor de sal ( NaCl 1,5M, Tris. HC1 lOmM, EDTA ImM). 0 DNA eluido é precipitado com etanol e ressuspenso em Tris,HCl lOmM pH8,0 a uma concentração de 0.15 mg/ml.

b) Ligação de um adaptador de DNA obtido por síntese quími· ca ao p31R digerido com Eco RI e fosfatase alcalina :

Um oligodeoxinucleotídeo com a fórmula

5' -GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3’

é sintetizado pelo método fosfotriêster ( Itakura et al.

(40) de Rooij et al. (41). A sequência do oligodeoxinucleo tídeo é auto-complementar.

0 emparelhamento conduz a um adaptador de DNA de cadeia dupla com 24 pares de bases. 5 jxg do oligodeoxinucleotídeo sintético são fosforilados nas extremidades 5' com 7,5 ^Ci de / f ³²-P_7 -ATP (5000 Ci.mmol' Amersham) em 50 yul de Tris.HCl 60mM pH 7,5 MgCl₂ lOmM, DTT 4mM, ATP 0,5mM e 35 unidades de polinucleotídeo cinase de

Τ4 (Boehringer) durante 30 min. a 37⁹C.

A mistura ê ainda incubada durante 5 min. a 75⁹C e então deixada arrefecer atê â temperatura ambiente e guardada a -20⁹C.

2,5 yug do DNA adaptador emparelhado e radioactivamente fosforilado são antolizados em 50 pl de Tris.HCl 60mM pH 7,5, ATP 3,5mM, DTT 5mM e 2000 unidades de DNA ligase de T4 (Biolabs) a 6⁹C durante a noite.

A DNA ligase de T4 ê inactivada a 65⁹C durante 10 min. Os multímeros resultantes de DNA adaptador são digeridos com a endonuclease de restrição Eco RI em 60 yul de Tris.HCl 100 mM pH 7,5 , MgCl₂ lOmM, NaCl 50mM e 55 unidades de Eco RI (Boehringer) durante 60 min. a 37⁹C.

A reacção ê parada por congelação da amostra em azoto líquido.

j

i

0,5 pg de DNA adptador fosforilado i

e cortado com Eco-RI são ligados a p31R digerido com Eco '

RI e fosfatase alcalina em 10 ^ul de Tris.HCl 60mM pH 7,5 MgC^j

lOmM, ATP lmM, DTT 5mM e 300 unidades de DNA ligase de T4

(Biolabs) a 15⁹C durante 3 horas. Amostras de 4 yil da mis- i

tura de ligação são adicionadas a 100 ^ul de células E.coli |

MB101 tratadas com cãlcio e competentes para a transforma- | - R i

ção (ver Exemplo 4a) . Quatro colonias transformadas amp são cultivadas individualmente em meio LB contendo 100 pg/

/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê preparado de acordo com o método de Holmes et. al (26) e analisado por digestão com Kpnl e SamI/Bam HI. j

Um clone, que ê cortado pela endonuclease de restrição Kpnl e que apresenta os fragmentos de restrição esperados após dupla digestão com Sma I/Bam HI, ê

Μ

escolhido para posteriores construções e designado por p31 RL.

0 plasmídeo p31R pode ser substituído pelo plasmídeo p31 Y ou qualquer um dos plasmídeos que se seguem e mencionados no Exemplo 6c : p31P, p31V, p31L, p31N p31 C, p31 H, p31S, p31K, p311. 0 DNA de p31Y cortado

com EcoRI e desfosforilado é ligado ao DNA adptador cortado com EcoRI e fosforilado.

A transformação e analise de colónias

R _

amp são feitas como descrito atras e escolhido um clone com os fragmentos de restrição esperados e designado por p31YL.

B. Inserção de DNA do TPA no plasmídeo p31RL (fig.16);

a) Digestão do plasmídeo p31 RL com Nco I:

5 de DNA do p3lRL são digeridos com

a endonuclease de restrição Nco I nas condições recomendadas pelo fornecedor ( Biolabs). Apõs digestão completa a solução e desproteinizada por extracção com fenol /clorofórmio e o DNA é concentrado por precipitação com etanol. 0 DNA ê redissolvido em Tris.HCI lOmM pH5 numa concentração de 0,25 mg/ml.

b) Reacção da polimerase de DNA Klenow com o DNA do p31

cortado com Nco 1 :

5 jig do DNA do p31 RL cortado com Nco I

ê incubado em 100 ul de Tris.HCI 60mM pH7,5, MgCl, lOmM,

/ λ? dATP 0,4 yuM, 30 yUCi de /tf - P_/-dATP , dTTP 0,lmM ,dCTP 0,1 mM, dGTP 0,lmM e 8 unidades de polimerase de DNA(fragmento maior ; BRL ). Após 15 min. ã temperatura ambiente

a concentração da dATP não marcado e aumentada para 0,lmM. A incubação continua durante mais 45 min. â temperatura ambiente. A reacção ê parada por extração com fenol/clorofórmio. 0 DNA ê concentrado por precipitação com etanol e redissolvido em Tris.HCl lOmM pH8 a uma temperatura, a uma concentração de 0,25 mg/ml.

Como alternativa âs reacções a) e b) o DNA do p31 RL pode também ser tratado com a endonuclease de restrição Κρη I e polimerase de DNA do T4 como descrito na reacção c) e d):

c) Digestão do plasmídeo p31RL com Κρη I :

10 yUg de DNA do p31 RL são digeridos completamente como recomendado pelo fornecedor (Biolabs).

A mistura é extraída com fenol/clorofórmio. 0 DNA é precipitado com etanol e redissolvido em Tris.HCl lOmM pH8, EDTA 0,1 mM a uma concentração de 0.4 mg/ml.

d) Reacção da polimerase de DNA do T4 com o DNA de p31RL cortado com Kpnl:

9 yxg de DNA do p31RL cortado com Κρη I é incubado a 37⁹C durante 2,5 min. com 10 unidades de polimerase de DNA do T4 (42) em 100 yul de Tris.acetato 33mM pH 7,9, acetato de potássio 66mM, acetato de magnésio lOmM e DTT 0,5mM ( passo de compsição. A síntese da nova cadeia de DNA composta ê feita num volume de 200 yxl na presença de Tris-acetato 33mM pH7,9, acetato de potássio 66mM, acetato de magnésio lOmM, DTT 0,5 mM, dATP 0,4 ^iM , 30 ^íCi de /'·( - ³²P_7 -dATP, dTTP 0,lmM, dCTP 0,lmM e dGTP 0,lmM.

Apos 18 minutos a 37⁹C a concentração de dATP não marcado é aumentada para 0,lmM e a incubação continua durante mais 35 min. a 37⁹C. A reacção ê parada por extracção com fenol

clorofórmio . 0 DNA e precipitado com etanol e redissolvente em Tris.HCl lOmM pH8 a uma concentração de 0.4 mg/ml.

e) Digestão com Smal do DNA linear do plasmídeo p31RL tratado com DNA polimerase :

4,5 pg de DNA do p31RL do tratado com Nco I e DNA polimerase de Klenow ( Exemplo 9 Bb) ou 4 yug de DNA do p31RL incubado com Kpnl e DNA polimerase de T4 (Exemplo 9Bb) são digeridos cornpletamente com a endonuclease de restrição Sma I. As reacções são paradas por extracção com fenol/clorofõrmio. 0 DNA ê precipitado com etanol e ressuspenso em 100 ^ul de Tris.HCl 50mM pH8,0.

f) Desfosforilação e isolamento dos fragmentos de DNA maiores de 4,3 kb ;

A cada amostra de DNA são adicionados

1,4 unidades de fosfatase alcalina de intestino de vitela (Boehringer). Elas são incubadas durante 1 hora a 37⁹C e em seguida durante 1 hora a 65⁹C para inactivar o enzima.

A concentração salina das misturas é ajustada para NaCl 150 mM e o DNA é purificado por cromatografia de troca iõnica em DE 52 como descrito no Exemplo 9Aa. 0 DNA é precipitado com etanol e redissolvido em 45 pl de Tris.HCl lOmM pH8.

Os fragmentos de DNA maiores com 4,3 kb são isolados num gel preparativo de 0,8¾ de agarose em Tris -borato EDTA pH 8,3 removendo pequenos blocos de gel que contem o DNA. 0 DNA de cada bloco de gel e electroeluído separadamente numa manga de diãlise contendo 1,5 ml de tampão Tris-borato-EDTA pH8,3 diluído 5 vezes. A manga fe-

chada é submersa em tampão tris-borato-EDTA pH8,3. Após 30 min. a 100 mA o polanidade da corrente ê invertida durante 45 seg. para repelir o DNA da membrana de diãlise.

0 tampão que rodeia o bloco de gel no tubo de diãlise e recuperado, ajustado para NaCl 150mM e passado através de uma coluna de troca iónica DE52 ( Whatman ).

0 DNA e eluído com um tampão de concentração salina elevada ( NaCl 1,5M , Tris.HCl lOmM pH8,0 e EDTA lMm) , precipitado com etanol e redissolvido em Tris lOmM pH8,0 numa concentração de 0,2 mg/ml. Os fragmentos de DNA são designados por p31 RL /\ .

As reacções a) a f) podem ser feitas de modo análogo com DNA de p31YL em vez de DNA de p31 RL para dar fragmentos de DNA p31Y Δg) Digestão do plasmídeo pw349F com Bal I :

0 plasmídeo pW349F contem o gene estrutural do activador do plasminogênio humano específico de J tecido clonado no local PstI do pBR322 (ver Exemplo 7c).

Para preparar DNA de plasmídeo usa-se uma única colónia de E.coli HB101 transformada com j

pW349F para inocular 100 ml de meio LB contendo 10mg/l de j

tetraciclina. A cultura e agitada durante a noite a 37^?C j

a 200 rpm. A preparação do plasmídeo ê feita como descrito í

no Exemplo 2.

10 yug de DNA do plasmídeo pW349F são digeridos como 10 unidades da endonoclease de restrição Bal I (BRL) em 200 yUl de Tris.HCl 6mM pH7,5 NaCl 6mM, MgCl₂ 6mM, 2-mercaptoetanol 6mM e 0.1 mg/ml de albumina de soro bovino durante 2 horas a 37⁹C. Após digestão completa a solução e desproteinizada por extracção com fenol/clorofõrmio.

1

0 DNA ê precipitado com etanol e ressus penso em Tris.HCI lOmM pH8,0 numa concentração de 0,2 mg/ml.

A ligação dos adaptadores Xho I às extremidades cerses do DNA cortado com Bal I e um passo facultativo que permite obter um bom local de clonagem para outras construções.

h) Digestão com BglII do DNA de pW349F cortado com Bali:

4 ^g de DNA do pW349F cortado com Bali é digerido com a endonuclease de restrição BglII conforme recomendado pelo fornecedor (Biolabs). Apos digestão completa as proteínas são extraídas com fenol/clorofõrmio. 0 DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em H₂0 numa concentração de 0,2 mg/ml.

i) Reacção limitada da polimerase de DNA Klenow e nuclease SI no local de restrição Bgl II :

4 ^ig de DNA do pW349F cortado com Bali e Bgl II são incubados em 100 pl de Tris.HCI 60mM pH7,5, MgCl₂ lOmM dATP 0,1 mM, dGTP 0,1 mM com 8 unidades de polimerase de DNA Klenow durante 30 min. à temperatura ambiente . A reacção ê parada por adição de EDTA para uma concentração final de lOmM. A proteína é extraída com fenol/ /clorofórmio. 0 DNA e precipitado com etanol e ressuspenso em H₂0 numa concentração de 0.2 mg/ml.

Para corte posterior com nuclease SI o DNA é incubado em 50 yul de acetato de sódio 30mM pH4,6,

NaCl 200mM, ZnS0₄lmM e 1,5 unidades de nuclease S.^ (Sigma) durante 30 min. a 37^ÇC. Após extração com fenol/cloroformio o DNA ê precipitado com etanol e ê redissolvido em

79

45μ1 de Tris.HCl lOmM pH8,O.

k) Isolamento de um fragmento de restrição BglII-BalI de

1,86 kb

O fragmento de DNA Bgl II-Bal I de

1,86 kb, com o local de restrição Bgl II convertido numa extremidade cerse pela polimerase de DNA Klenow e nuclease Sl como descrito atras, ê isolado num gel preparativo de 0,8% de agarose em Tris.-borato - EDTA pH 8,3. 0 DNA ê

recuperado dos blocos de gel por electro-eluição como descrito no Exemplo 9Bf.

1) Clonagem do fragmento de DNA de 1,86 kb num DNA receptor adequado :

0,3 yUg do fragmento de DNA de extremidades cerses com 1,86 kb (ver Exemplo 9 kb) é ligado a 0,6 yug de p31RL Δ (ver Exemplo 9Bf).

A reacção passa-se em 10 ^ul de Tris.

HC1 60mM pH 7,5, MgCl₂ lOmM, DTT 5mM, ATP 3,5 mM com 400 unidades de ligase do DNA de T4 (Biolabs) durante 20 horas a 15⁹C.

Amostras de 3 p.1 ou de 6 jxl das misturas de ligação são adicionadas a 100 yul de células E.coli HB101 tratadas com cãlcio e competentes para a transformação (ver Exemplo 4a).

48 colonias transformadas amp são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 jig /ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo é preparado de acordo com o método de Holmes et al . (26) e analisado por digestão com Eco RI. 12 clones têm o fragmento de DNA com l,86kb clonado na orientação correcta.

Estes clones são ainda analisados por sequenciação do DNA no ponto de união entre o promotor de PHO5 e o gene estrutural do TPA . Usa-se com oligodeoxinucleotídeo sintético que híbrida perto do ponto de iniciação do mRNA do promotor de PHO5 e permite sequenciação da região de união a jusante.

Condições de reversão do iniciador de M3. (43) são usadas para desnaturação do DNA de plasmídeo de cadeia dupla e hibridação do oligodeoxinucleotídeo sintético. A sequenciação do DNA ê feito como jã descrito (39).

Dois dos clones têm a seguinte sequência de união correcta:

> m RNA de PHO5

GAATA AGAACAACAACAAATAGAGCAAGCAAATTCGGAATTCC ATG TCT TAC CAA

Met Ser Tir Gin.

Iniciação do mRNA. de PHO5

DNA de PHD5

........ DNA adaptador

-------- DNA. do TPA

Es tes clones são idênticos e designados por p31RL/ TPA (12-2).

Exemplo 10 : Subclonagem das construções genéticas no vector de levedura de elevado número de copias pJDB 207 (cf. fig. 17)

A construção descrita no Exemplo 9 contem o promotor de PH05 sem a sua sequência sinal, a região codificadora do TPA e os sinais de terminação da trans crição de PH05 em arranjo tendem, inseridos num vector derivado do pBR322. Para expressão em levedura toda a inserção ê subclonada no vector de levedura pJDB2O7(22) permitindo a selecção de colõnias prototrõficas para leucina.

2 pg de DNA de p31RL/TPA (12-2)são digeridos com as endonucleases de restrição Sal I e HindIII

Os fragmentos de restrição são separados num gel preparativo de 0.8¾ de agarose de baixo ponto de fusão e o pequeno fragmento de 2,8 kb é removido do gel.

5 pg do DNA do pJDB2O7 são digeridos com as endonucleases de restrição Sal I e Hind III.

0 fragmento grande de 6,2 kb ê isolado a partir de um gel preparativo de 0,8¾ de agarose de baixo ponto de fusão. Os blocos de gel contendo os fragmentos de DNA são liquefeitos a 65⁹C e diluídos com agua para baixar a concentração de agarose atê cerca de 0,3¾.

0 fragmento SalI-HindIII de 2,8 kb do plasmideo p31RL/TPA (12-2) ê misturado com uma quantidade equimolar do fragmento HindIII-Sal I de 6,2 kb pJDB2O7 .

As ligações são feitas em 100 pl duran· te 4 horas a 15^?C. 10 pl de cada mistura de ligação são

usados para transformação de células E.coli HB101 competentes com o descrito no Exemplo 49. Varias colõnias amp de

cada experiencia são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 yig ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo e analisado relativamente ao tamanho da inserção por corte com as endonucleases de restrição Hind III e Sal I. Um único clone obtido com a inserção correcta ê designado por pJDB2O7 R/PH05-TPA (12-2).

Exemplo_ll : Transformação de Saccharomyces cerevisiae GRF’8

Os plasmídeos pJDB2O7/PHO5-TPA (IA), pJDB2O7/PHO5-TPA Δ 1. pJDB2O7/PHO5-TPA /\z. pJDB 2O7/PHO5 Δ³’ pJDB 2O7/PHO5 TPA A 4, e pJDB 2O7R/PHO5-TPA (12-2) são cada um introduzidos em Saccharomyces cerevisiae estir pe GRF 18 his3-ll, his3-15, leu2-3, leu2-112, can^)

usando o protocolo de transformação descrito por Hinnen et al, (12).

Um yjg de cada DNA de plasmídeo, ê adicio nado a 100 yjl de uma suspensão de esferoplastos e a mistura ê tratada com polietilenoglicol.

Os esferoplastos são misturados com 10 ml de agar de regeneração e semeados em placas com meio núnimo para leveduras sem leucina.

Após incubação durante 3 dias a 30⁹ C obtem-se cerca de 200 células transformadas. Ê escolhida uma única colónia de levedura de cada uma das transformações de leveduras . As diferentes colónias são designadas por :

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA Δι, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA Δ2,

I

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2Q7R/PHO5-TPA (12-2). Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5 -TPA Δ4

As células de levedura são crescidas a 30⁹C em lOml de meio núnimo para leveduras num Erlenmeyer de 100 ml com agitação durante 24 horas atê se atingir uma densidade de 2-3x10 células /ml. As células são lavadas uma vez com 20 ml de meio núnimo com um teor baixo de Pi. Três ml de células ressuspensas são usadas para inocular 300 ml de meio núnimo com um teor baixo de Pi e 300 ml de meio núnimo normal respectivamente em frascos Erlenmeyer de 1000 ml.

A incibação ê a 30⁹C a 160 rpm. A indu ção do promotor de PH05 é seguida medindo o aparecimento da actividade de fosfatase acida em células totais como descrito por Toh-e et. al (44). As células são crescidas ate cerca de 1-2x10 celulas/ml (26-30 horas de incubaçao).

Exemplo_12 : Preparação de extractos de células de levedu - I ra e determinação da actividade do TPA j

Células de 35 ml de meio de cultura j com um teor baixo de Pi (48) numa densidade celular de l

l-2xl0^/ml são colhidas por centrifugação num rotor Sorvall | SS34 durante 10 min. a 3000 rpm. As células são lavadas num tampão contendo os componentes salinos do meio de cultura (i.e. sem aminoãcidos, glucose, vitaminas, micronutri entes).

As células são centrifugadas à temperatura ambiente durante 5 min. a 3000 rpm. As células sedimentadas são ressuspensos num volume total de 4 ml de

» 1

tampão fosfato de sódio 66mM frio pH7.4 e 0,1¾ (v/v) de Triton X-100.

A suspensão celular é transferida para um tubo Corex de 30 ml, adiciona-se 8g de pérolas de vidro (0,4 mm de diâmetro) e agita-se a suspensão num Vortex Mixer (Scientific Instrument Inc. USA) a toda a velocidade durante 4 min. e arrefece-se depois num banho de gelo.

Mais de 90¾ das células são rebentadas por este processo. Os detidos celulares e pérolas de vidro são sedimentadas por centrifugação durante 10 min. a 8000 rpm a 4⁹C num rotor Sorvall HB-4. 0 sobrenadante é transferido para tubos Eppendorf, congelado em azoto líquido e guardado a -60⁹C.

A actividade de TPA é determinada Segundo o método de R§nby (49) com ligeiras modificações.

Como substrato usa-se D-Val-Leu-Lis-pNA (Kabi S-2251).

A absorção a 4O5nm é corrigida para corte inespecífico e tendo como padrão urocinase normalizada. Os resultados estão apresentados na Tabela 2.

Tabela 2 : Actividade de TPA em S.Cerevisiae estirpe GRF18 transformada com diferentes plasmídeos recombinan tes:

Plasmídeo	Actividade de TPA(unidades/l de culturas celulares/OD^)
reprimido (Pi elevado)	desreprimido (Pi baixo )
pJDB2O7R/PHO5 -TPA (12-2)	-	60
pJDB2O7/PHO5-TPA(lA)	20	625
pJDB2O7/PHO5-TPA /\ 1	-	600
pJDB2O7/PHO5-TPA Λ 2	-	700
pJDB2O7/PHO5-TPA	-	650
pJDB2O7/PHO5-TPA /\4	-	625

Exemglo_13 : Construção de um plasmídeo com uma determinada sequência entre a sequência sinal de PH05 e a região codificadora do TPA maduro (fig.18).

Esta construção estabelece uma união correcta entre a sequência sinal de PHO5 e a sequência codificadora do TPA maduro usando um oligodeoxinucleotídeo sintético. Por conveniência a região importante do plasmídeo pJDB2O7/PHO5-TPa/\ 2 (ver Exemplo 8e) é subclonada no plasmídeo p31 (ver Exemplo 5).

a) Isolamento do plasmídeo p31/PHO5-TPA / \2;

t ♦

- W'"*

2 yrg de cada um dos plasmídeos pJDB2O7/ /PH05-TPA Δ 2 e p31(ver Exemplos 8 e 5) são digeridos com as endonucleases de restrição HindIII e Sall. Após digestão completa os fragmentos de DNA são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris-borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento HindIII-SalI de 2,6 kb do pJDB2O7/

/PHO5-TPa/\2 , e o fragmento HindIII-SalI de 3,1 kb do p31 são removidos do gel. Os blocos de gel são liquefeitos a 65⁹C e diluídos com ^0 para uma concentração de agarose de 0,3¾.

Quantidades equimolares de ambos os fragmentos são misturadas e ligadas em 100^1 durante 4 horas a 15⁹C. Usa-se 10 yal da mistura de ligação para transformar células E.coli HB101 competentes. São analisadas vãrias colonias amp^ . Um único clone obtido com a sequência correcta ê designado por p31/PHO5 -TPA Δ 2·

0 mesmo tipo de construção é feita com os plasmídeos pJDB 207/PH05 TPA /\l, pJDB2O7/PHO5 -TPA /\ 3 e pJDB2O7/PHO5 -TPA 4 (ver exemplo 8 e) .

Os plasmídeos resultantes são designaos por p31/PHO5-TPA /\ 1, p31 /PH05-TPA/y, p31/PHO5/TPA Δ ³ e p31/PHO5-TPA Λ 4.

b) Construção do plasmídeo p51/PHO5-TPA 18 (fig. 18).

30 ^ig de plasmídeo p51/PHO5 -TPa/\2 são digeridos com a endonuclease de restrição Xho I.

0 DNA linearizado é extraído com fenol/cloroformio, precipitado com etanol e redissolvido em Tris.HCl lOmM pH8 numa concentração de 0,5 mg/ml (p31/PHO5 -TPA Λ2.Xho I).

ainda digerido ê extraído uma 2,5 volumes de

5 yig do DNA cortado com Xho I ê com Bal I. Apos digestão completa o DNA vez com fenol/clorofõrmio, precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCI lOmM pH8.

Os fragmentos de restrição são separados num gel de 1,2¾ de agarose em tampão Tris.borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento maior Xho I-Bal I de 3,9 kb ê removido

do gel num pequeno bloco de gel. 0 DNA (fragmento A, cf. fig. 18) ê recuperado a partir do bloco de gel por electroeluição e cromatografia de troca iónica em DE 52 como descrito no Exemplo 9Bf. 0 DNA ê concentrado por precipitação com etanol e redissolvido em Tris.HCI lOmM pH8 a uma concentração de 0,2 mg/ml.

20 pg de p51/PHO5-TPA/\2.Xho I (ver atras) são parcialmente digeridos com a endonuclease de res triçao Pst I ( 0,75 unidades) pg de DNA) em 200 pl de Tris .HCI lOmM pH7,5, MgCl₂ 6mM, NaCl 50mM, mercaptoetanol 6mM e brometo de etídio 0,01 mg/ml durante 45 min. a 37⁹C.

A reacção ê parada por extracção com fenol/clorofórmio.

0 DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em Tris.HCI lOmM pH8. Os fragmentos de restri çao são separados num gel de 1,2¾ de agarose em Tris-borato -EDTA pH8,3, Um fragmento Xho Ι-Pst I de 1,6 kb (fragmento B, cf. fig. 18 ) contendo a maior parte da região codificadora do TPA maduro é recuperado de um bloco de gel por electroeluição como descrito atras.

0 DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em Tris.HCI lOmM pH8 numa concentração de 40 yig /ml.

A união correcta entre a sequência sinal de PH05 e a sequência codificadora do TPA maduro ê proporcionado por um adaptador sintético com a fórmula

Γ Ç.J 5 ’ -CCAATGCATCTTACCAAGTGATCTGCA-3 ’

ΛD_7 3'-GGTTACGTAGAATGGTTCACTAG -5’

Os oito nucleotídeos da extremidade 5' do adaptador (5’-CCAATGCA...) representam parte da sequência sinal do PH05 desde o local Bal I atê ao fim e os outros 19 nucleotídeos complementam a sequência do TPA maduro desde a extremidade 5’ da região codificadora atê ao primeiro local PstI (ver figura 19). Os oligodeoxinucleotídeos C e D são sintetizados pelo método fosfotriêster. Eles são individualmente fosforilados nas suas extremidades 5', mistu rados em partes iguais e emparelhados como descrito no Exem pio 9Ab.

60 ng (4 pmoles) de DNA adaptador fo£ forilado e emparelhado são ligados a 0,4 (0,4 pmoles)

do fragmento Xho I - Pst I de 1,6 kb (fragmento B, ver atras) em 15 ^1 de Tris.HCl 60mM pH 7,5, MgCl₂ lOmM, ATP lmM, DTT 5mM e 600 unidades de ligase do DNA de T4 a 15⁹C durante 16 horas. A ligase ê inactivada durante 10 min. a 85⁹C. 0 excesso adaptadores ê removido por precipitação

do DNA na presença de EDTA lOmM, acetato de sodio 300mM pH6,0 e 0,54 volumes de isopropanol . Os múltiplos de DNA adaptador e o fragmento de DNA são resolvidos por digestão com Bal I e Xho I.

Devido ã adição do adaptador no local PstI o fragmento Xho Ι-PstI de 1,6 kb ê convertido num fragmento Xho I -Bali.

0,4 pg deste fragmento de DNA Xhol Bali de 1,6 kb e 1 jxg do fragmento Xho I-Ball de 3,9 kb (fragmento A, ver atras ) são ligados em 10 jxl de Tris.

HC1 60mM pH7,5, MgCl₂ lOmM, ATP 3,5mM, DTT 5mM e 400 uni«

"(|ΗΤ (ΛΙ

-,·

·· - tl Μί

• ’^{α ;} .$Ά ·

dades de ligase do DNA do T4 â temperatura ambiente durante 16 horas. Amostras de 3 γΛ. e 7 γΛ. da mistura de ligação são adicionados a 100 jxl de células E.coli HB 101

tratadas com cálcio e competentes para a transformação (ver R —

Exemplo 4a). 10 colõnias transformadas amp são crescidas

individualmente em meio LB contendo 100 yag /ml de ampicilina.

0 DNA de plasmídeo ê preparado de acordo com Holmes at al, (26).

Os clones são analisados por sequênciação ao longo da região do adaptador.

Um clone que se verificou ter a união na fase correcta entre a sequência sinal de PH05 e a região codificadora do TPA maduro (ver fig.19) ê designado por P31/PHO5 TPA 18.

0 plasmídeo p31/PHO5-TPA /\ΐ pode ser substituído por p31/PHO5- TP Ρ31/ΡΗΟ5 -TPA

A/\l, p31/PHO5 -TPA/\ 5, ou

As construções são feitas como descrito atras. Em particular, um clone derivado do plasmídeo p31 PH05-TPA /\ 3 ê designado por p51/PHO5 -TPA 42.

Exemplo 14: Construção de plasmídeos com DNA codificador de prepo-TPA (figs.20,21)

0 promotor de PH05 ê ligado às sequências de DNA codificadores da prepo-TPA . A sequência de nucleotideos dos 35 aminoãcidos da região prepo ê seguida da sequência codificadora do TPA maduro.

a) Isolamento departe da região codificadora do TPA incluindo a sequência sinal do TPA (cf. fig.20).

30 pg do plasmídeo pW349F são cortados com a endonuclease de restrição Bgll . Apos extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol o DNA ê ainda digerido com Eco RI e Bam HI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,1¾ de agarose em Tris. -borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento BglI-Eco RI de 0,9 kb ê

localizado no gel e removido.

0 DNA ê recuperado por electro-eluição como descrito no Exemplo 9Bf.

3,5 pg do fragmento BglI-Eco RI de 0,9 kb são digeridos completamente com Hgal resultando em 3 fragmentos. A mistura ê extraída com fenol/clorofórmio e os fragmentos de DNA são precipitados com etanol. As extremidades coesivas dos fragmentos criados por digestão com Hga I são preenchidos numa reacção com a polimerase de DNA Klenow ( 1 unidade /pg de DNA ) contendo Tris.HCI 60mM pH7,5, MgCl₂ lOmM, TTP 0,lmM, dCTP 0,1 mM e dGTP 0,lmM.

Após 60 min. a 2O⁹C a reacção ê parada por precipitação com etanol. Os fragmentos de DNA com extremidades cerses são misturados com um excesso molar de 40 vezes de adaptador Eco RI fosforilado e emparelhado (Biolabs), a ligação ê feita em 50 pl de Tris.HCI 60mM pH7,5, MgCl₂ lOmM, DTT 5mM, ATP 3,5mM e 2000 unidades de ligase do DNA do T4 durante 16 horas a 15⁹C. As moléculas de adaptador em excesso são removidos por precipitação do DNA na presença de EDTA lOmM pH7,5, acetato de sódio 300mM pH6,0 e 0,54 volumes de isopropanol. A mistura de fragmentos de DNA ê digerida com Eco RI para remover os múltiplos de adaptadores e com Narl.

Após digestão completa os fragmentos

de restrição são separados num gel de 1¾ de agarose em Tris-borato -EDTA pH8,3. 0 fragmento Eco RI/ / Hga I_7-Narl de 446 pb ê removido do gel e o DNA ê recuperado por electro-eluição (ver Exemplo 9Bf).

c) Isolamento de um fragmento de DNA contendo sequências do vector e o promotor de PHO5 (cf. fig. 21).

5 ^ig do plasmídeo p3lR são digeridos com as endonucleases de restrição HindIII e EcoRI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 1¾ de agarose em Tris.-borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento de DNA HindIII

Eco RI de 3,9 kb ê isolado e recuperado do bloco de gel de agarose por electro-eluição.

d) Ligação dos fragmentos (cf. fig.21)

0,3 pmoles do fragmento HindiII-Eco RI de 3,9 kb, 0,3 pmoles do fragmento Nar I-Hind III e 0,6 pmoles do fragmento Eco RI-Nar I de 446 pb são ligados em 12 pl de Tris.HCI 60mM pH7,5 , MgCl₂ lOmM, ATP lmM, DTT 5M e 480 unidades de ligase de DNA do T4 a 15⁹C durante 6,5 horas.

Amostras de 5 pl e 7 pl da mistura de ligação são adicionadas a 100 ^il de células E.coli HB 101 tratadas com cálcio e competentes para a transformação (ver Exemplo 4a).

23 colonias transformadas amp^ são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 pg /ml de ampicilina.

0 DNA de plasmídeo dos diferentes

clones e analisado por restrição com Pst I. Um dos clones com o padrão de fragmentos de restrição esperado ê designado por p31R/SS-TPA Δ*'

0 plasmídeo p31/PHO5 -TPA /\ 2, pode ser substituído por p31/PHO5-TPA, ou um dos outros clones mencionados no Exemplo 13a. As construções são feitas como descrito atras. Um clone derivado do plasmídeo p31/PHO5-TPA Δ 3, ê designado por p31R/SS-TPA Δ*·

Exemplo 15: Construções de plesmídeos com a sequência sinal de PH05 estendendo-se para a região codifi cadora de PH05 (cf. figs. 22-24)

Sempre que DNA estranho seja ligado â sequência sinal de PHO5 a sequência de aminoãcidos resultante na vizinhança do ponto de corte do peptídeo sinal ê diferente da proteína PH05 genuína. As alterações na sequência de aminoãcidos pode influenciar a eficãcia do processamento da proteína pela peptidase sinal. Portanto, as construções de DNA que se seguem usam a sequência sinal de PHO5 com extensões para a região codificadora da fosfatase acida madura. Apenas a distâncias variáveis da sequência sinal a região codificadora do TPA maduro ê ligada em fase através de adaptadores oligodoxinucleotídicos sintéticos os quais contêm locais de processamento para uma endopeptídase de levedura. 0. corte destes locais evita a formação de proteínas fundidas.

a) Subclonagem das sequências de PH05 estendendo-se para a região codificadora da fosfatase ãcida madura (fig. 22) .

Isolam-se fragmentos de DNA que contêm

f

f

o promotor de PHO5, a sequência sinal de PHO5 e tamanhos variáveis da sequência codificadora da fosfatase ácida madura.

Os locais de restrição Rsa I estão situados nas posições 595, 637, 811 e 1312 a montante do local de restrição Bam Hl ¢48). Uma vez que a sequência sinal de PHO5 se estende atê â posição 592, os diferentes locais Rsa I estão situados nas bases das posições 3,45, 219 ou 720, respectivamente na sequência codificadora da fosfatase ácida madura. Os fragmentos BamHI-Rsa I, são subclonadas através de um oligodeoxinucleotídeo sintético transformando o local Rst I num local Xba I.

0 DNA do plasmídeo pJDB2O7/PHO5, PH05 (cf. Exemplo 2) ê cortado com Bam Hl e Hpa I e o fragmento resultante de 3,9 kb contendo os genes de PH05 e PH03 ê isolado por electroforese preparativa em gel. 0 fragmento Bam HI-Hpa I de 3,9 kb é subclonado no vector pBR322, o qual foi cortado com Bam Hl e Pvu II. 0 plasmídeo resultante com os genes de PH05 e PH03 inseridos é designado por p29.

30 yig do plasmídeo p29 são digeridos com as endonucleases de restrição BamHI e Eco RI. Após digestão completa o DNA ê extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol.

0 DNA ê redissolvido em Tris.HCI lOmM pH8,0 numa concentração de 0,5 mg/ml.

15 yig de p29 cortado com Bam Hl e Eco RI é parcialmente digerido com Rsa I (0,9 unidades/ ^ig de DNA ) em 300 ^1 de Tris.HCI lOmM, pH8,0, MgCl₂ 6mM, NaCl 50mM, mercaptoetanol 6mM e 5yig/ml de brometo de etídio durante 45 min. a 37⁹C. A digestão ê parada por extracção com fenol . 0 DNA ê precipitado com etanol e redissolvi-

do em H^O numa concentração de 1 mg/ml.

Um oligodeoxinucleotídeo com a fórmula

5' -CTAGATCTAG -3'

ê fosforilado na sua extremidade 5' e ê auto-emparelhado como descrito no Exemplo 9Ab. 4 pg (1400 pmoles) de DNA adaptador emparelhado e fosforilado são ligados a 14 pg (140 pmoles) de DNA do p29 cortado com enzimas de restrição (ver atras) em 80 pl de Tris.HCl 60mM pH7,5, MgCl₂ lOmM, ATP 3,5mM, DTT 5mM e 3200 unidades de ligase de DNA do T4 a 20⁹C durante 16 horas.

A ligase de DNA do T4 ê inactivada durante 10 min a 65⁹C.

0 excesso de adaptadores ê removido por precipitação na presença de EDTA lOmM, acetato de sódio 300mM pH 6,0 e 0,54 volumes de isopropanol. A digestão do DNA com Bam HI e Xho I (4 unidades/ pg de DNA) origina múltiplas estruturas e produz extremidades coesivas Xho I.

Devido à adição de adaptadores nos locais Rsa I de extremidades cerses e corte subsequente com Xho I do adaptador todos os fragmentos de restrição BamI Rsa I do p29 são convertidos em fragmentos BamHI-Xba I.

Eles são separados num gel de 1¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris.borato-EDTA pH8,3, os blocos de gel contendo os fragmentos Bam ΗΙ-Xba I com 595 pb, 637 pb, 811 pb ou 1312 pb de tamanho são removidos do gel .

0 plasmídeo pBR322 /PH05 Eco-Bam deriva do plasmídeo pG7 (Exemplo 2). pG7 e cortado com as endonucleases de restrição Eco RI e Bam HI.

- 95 PORTUGA)

u.

Os fragmentos de DNA resultantes são separados por electroforese preparativa em gel.

£ isolado um fragmento Eco RI Bam HI de

2,1 kb que representa as sequências fronteiriças a montante do local Bam HI de PHO5. 0 fragmento de 2,1 kb ê ligado ao fragmento Eco RI-Bam HI de 4 kb do vector pBR 322.

0 plasmideo resultante ê designado por pBR 322 /PHO5 Eco-Bam.

0 plasmideo pBR 322/PHO5 Eco-Bam contêm um fragmento Eco-BamHI de 2,1 kb o qual representa sequências ladeantes a montante do local Bam HI de PHO5.

15 yig de DNA do plasmideo são digeridos com Bam HI e Xba I. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris.-Borato -EDTA pH8,3. 0 fragmento BamHI-Xba I

de 4,25 kb ê removido do gel.

Os blocos de gel contendo os fragmentos de DNA são liquefeitos a 65^?C e diluídos com ^0 para baixar a concentração de agarose para 0,3¾. Quantidades equimolares do fragmento Bam ΗΙ-Xba I de 637 pb e do fragmefito vector BamHI-Xba I de 4,25 kb são misturados e ligados em 125 pl de Tris.HCI 60mM pH7,5, MgCl₂ lOmM, DTT 5mM, ATP lmM e 600 unidades de ligase de DNA do T4 a 15^ÇC durante 16 horas.

10 pl da mistura de ligação são adicionados a 100 yil células de E.coli HB101 competentes para a transformação como descrito no Exemplo 4a.

5 colónias amp^ são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 u^ml de ampicilina.

ra

0 DNA de plasmídeo ê analisado relativamente ao tamanho da inserção por corte com as endonucleases de restrição Eco RI e BamHI.

Um clone único com a inserção correcta ê designada por pBR 322 /PHO5 Bam-Rsa 637.

0 fragmento Bam ΗΙ-Xba I de 637 pb pode ser substituído pelos fragmentos Bam ΗΙ-Xba I de 595 pb, 811 pb ou 1312 pb de tamanho.

Clones únicos com uma inserção de tamanho esperado sao designados por pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 595, pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 811 e pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 1312.

b) Adição de olidodeoxinucleotídeos sintéticos

0 fragmento Bam Hl -Xba I de 637 pb con tem o promotor de PHO5 e a sequência sinal de PHO5 com uma extensão para a sequência codificadora da fosfatase acida madura atê ao local Rsa I na posição 637.

0 fragmento de DNA ê ligado em fase â sequência codificadora do TPA maduro através de um adaptador oligodeoxinucleotídeo sintético o qual codifica a sequência de aminoãcidos Leu - Glu - Gly-Val-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg. Esta sequência também se encontra a montante da sequência codificadora do factor pc de levedura (54).

5 ^ig do plasmídeo pBR 322 /PHO5 Bam Rsa 637 são digeridos com a endonuclease de restrição Xbal. Apos digestão completa o DNA ê extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. 0 DNA ê redissolvido em Tris.HCl 50mM pH8,0 numa concentração de 50 p-g/nd. e ê digerido com 11 unidades de fosfatase alcalina do intestino de vitela (Boehringer), durante 1 hora a 37⁹C.

- 97 fORHjf y|

A enzima ê inativada a 65 ⁹C durante 1 hora. 0 DNA ê purificado por cromatografia de troca iõnica em DE 52 ( Whatman) e precipitação com etanol como descrito no Exemplo 9Aa.

Dois oligodeoxinucleotídeos sintéticos com a formula

5’-CTAGAAGGGGTATCTTTGGATAAGA - 3'

3’- TTCCCCATAGAAACCTATTCTCTAG -5'

são fosforilados individualmente nas suas extremidades 5' como descrito no Exemplo 9Ab. Os oligodeoxinacleotídeos fosforilados são misturados em quantidades equimolares .

A mistura ê aquecida durante 10 min. a 75⁹C, depois deixada arrefecer lentamente atê à temperatura ambiente e guardada a -20⁹C. Este adaptador ê designado por adaptador C.

1 ^ig (120 pmoles) do adaptador C emparelhado e fosforilado e 5 pg (1,5 pmoles) de pBR322/ /PH05 Bam-Rsa 637 desfosforilado e cortado com Xba I são ligados em 40^1 de Tris.HCl 60mM pH 7,5, MgCl₂ lOmM, DTT 5mM, ATP lmM, 1600 unidades da ligase de DNA do T4 a 15⁹C durante 20 horas. A ligase de DNA ê inactivada durante 10 min. a 85⁹C e o excesso de adaptadores ê removido por precipitação com isopropanol. 0 DNA ê redissolvido em H₂0 numa concentração de 0,25 mg/ml. Os múltiplos de adaptadores são removidos por digestão com a endonuclease de restrição BglII. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido e depois digerido com Bam HI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris-borato-EDTA pH8,3.

0 fragmento Bam HI-BglII de 662 pb (derivado de fragmento Bam HI-Rsa I de 637 pb) ê localizado e removido do gel.

c) Isolamento de um fragmento de vector contendo a sequência codificadora do TPA maduro ( fig. 23)

5 yig do plasmídeo p31R/SS-TPA /\ 2, são digeridos com as endonucleases de restrição Bam HI e BglII. Após digestão completo de DNA e precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCl 50mM pH 8,0 numa concentração de 75 jxg /ml. Os fragmentos de DNA sao desforilados nas suas extremidades 5' por digestão com 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela ( Boehringer) em 60 de Tris.HCl 50mM pH 8,0 durante 1 hora a 37⁹ C.

A fosfatase ê inactivada por incubação a 65⁹C durante 1,5 horas. 0 DNA é purificado por cromatografia de troca iónica em DE-52 (Whatman) como descrito no Exemplo 9Aa.

0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido em Tris-HCl lOmM, pH8,0 e aplicada num gel de 0,6 °'o de agarose de ponto de fusão baixo. 0 fragmento maior Bam HI -BglII de 5,2 kb ê removido do gel.

d) Ligação dos fragmentos de DNA isolados e transformação de E.coli HB 101 (cf. figs 23 e 24 ).

Dois blocos de gel de agarose de ponto de fusão baixo contendo 0,1 pmoles do fragmento Bam HIBglII de 5,2 kb de p31R/SS-TPA/\ 2 e 0,2 pmoles do fragmen to BamHI -BglII de 662 pb de pBR322/PHO5 Bam-Rsa 637, respectivamente, são misturados, liquefeitos a 65⁹C e diluídos para baixar a concentração de agarose para 0,3¾. A ligação ê feita em 150^1 de Tris.HCl 60mM, pH 7,5; MgCl^ lOmM,

99

jr

£

DTT 5mM, ATP ImM e 800 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) a 15⁹C durante 16 horas. Amostras de 10 ^il e 30 yjl são misturadas com 100 p.1 de células E.coliHB 101 competentes para a transformação como descrito no Exemplo 4a.

- R

6 colonias transformadas amp são

crescidas individualmente em meio LB contendo 100 ^g/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê analisado quanto ao tamanho e orientação da invenção por corte com a endonuclease de restrição Bam Hl. Um único clone com a orientação correcta da inserção é designado por p31/PHO5 637-TPA (cf. fig. 23).

0 plasmídeo pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 pode também ser substituído por pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 595, pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 811 e pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 1312 . Seguindo o processo descrito atras são isolados clones únicos com inserções do tamanho e orientação esperados e designados por p31/PHO5 595C-TPA, p51/PHO5 811C-TPA e p31/PHO5 1312 C-TPA.

0 adaptador C pode também ser substituído pelo adaptador B com a seguinte férmula

5' -CTAGATAAGAGATCTGC -3’

3’ TATTCTCTAGACG -5'

o qual codifica Lis -Arg na construção final (fig. 24).

A fosforilação dos oligodeoxinucleotídeos sintéticos e emparelhamento são como descrito para o adaptador C.

Para a adição do adaptador 5 de pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 cortado com Xba I são digeridos com 2 unidades de nuclease (Sigma) em 50 yjl de acetato de sédio 30mM pH 4,6, NaCI 200mM e ZnSO^ ImM durante 40 min. a 37⁹C para criar extremidades cerses (ver fig.23).

Apos extração com fenol clorofórmio o DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em H^O numa concentração de 0,25 mg/ml. 0,4 ^g (120 pmoles) de adaptador A fosforilado e emparelhado e 5 ^ig (1,5 pmoles) de pBR 322/PHO5 Bam -Rsa 637 cortado com Xba I /S^ são ligados através das extremidades cerses como descrito para o adaptador C exceptuando a utilização de ATP 3,5 mM.

As outras construções são como descrito atras.

Os clones resultantes são identificado pela letra A e referidos como p31/PHO5 595A-TPA, p31/PHO5 637A-TPA, p31/PHO5 811A-TPA e p31/PHO5 1312 A-TPA.

Exemplo 16: Subclonagem de construção genética no vector de levedura de elevado numero de copias pJDB2O7 e transformação de S. cerevisiae GRF18

As construções descritas nos Exemplos 13-19 contêm o promotor de PH05 com ou sem extensões para a região codificadora do gene de PH05 . A região codificadora do TPA com ou sem prepo-sequência e os sinais de terminação da transcrição de PH05 num arranjo tendem, tudo inserido num vector derivado do pBR 322. Os fragmentos Bam HI-HIND III contendo todo o arranjo são ligados ao fragmento Bam Hl -Hind III de 6,4 kb do pJDB 207 como descrito para uma reacção analoga no Exemplo 10.

Células E.coli HB101 competentes são transformadas e vãrias colonias amp^ de cada experiência são crescidas individualmente em meio LB com 100 ^ig/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídio é analisado por corte com as endonucleases de restrição Hind III, Bam Hl e Pst I.

Partindo dos plasmídeos p31/PHO5-TPA 18, ρ31 /PHO5-TPA 42, p31R/SS-TPA /\ 2, p31R/SS-TPA/\ 3, Ρ31/ΡΗΟ5 595C-TPA, p31/PHO5 637C-TPA,’ p31/PHO5 811C-TPA, P31/PHO5 1312C-TPA, p31/PHO5 595B-TPA, p31/PHO5 637-TPA, P31/PHO5 811 B-TPA, p31/PHO5 1312 B-TPA, p31/PHO5 595 A-TPA P31/PHO5 637-TPA, p31/PHO5 811-A-TPA e p31/PHO5 1312A-TPA obtem-se os clones que se seguem com as inserções correctas

PJDB2O7/PHO5-TPA18 PJDB2O7/PHO5-TPA42 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 2 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 3 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA PJDB2O7/PHO5 637C-TPA PJDB2O7/PHO5 811C-TPA PJDB2O7/PHO5 1312C-TPA PJDB2O7/PHO5 595B-TPA PJDB207/PH05 637B-TPA pJDB2O7/PHO5 811B-TPA PJDB2O7/PHO5 1312B-TPA pJDB2O7/PHO5 595A-TPA PJDB2O7/PHO5 637A-TPA PJDB2O7/PHO5 811A-TPA PJDB2O7/PHO5 1312A-TPA .

Estes plasmídeos são introduzidos individualmente em Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 como descrito no Exemplo 11.

Uma única colónia de levedura de cada uma das transformações de levedura ê picked. Os clones obtidos são designados por .

Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2Ò7/PHO5-TPA18 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA42 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-SS-TPA/\ 2 Sacchãtúiuycea cerevisíae GRFi8/pJD32O7R/?HO5~SS-TPA /\ 3 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595B-TPA

Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312B-TPA

As células de levedura são crescidas colhidas e extraídas como descrito nos Exemplos 11 e 12.

A actividade de TPA nos extractos celulares é testado como descrito no Exemplo 12. Os resultados estão apresen tados na tabela 3.

Tabela 3: Actividade de TPA da estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformada com diferentes plasmídeos e testada em condições de desrepressão (Pi baixo) :

plasmídeo	Actividade de TPA(unidades/l de cultura de células de levedura/ OD^qq)
PJDB2O7/PHO5-TPA18	750
PJDB2O7/PHO5-TPA42	700
PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA_A 2	600
PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA 3	650
PJDB2O7/PHO5 595C-TPA	900

Exemplo 17: Substituição cromossómica do gene de PHO5 pelo gene do TPA (ver fig.25)

A região codificadora da proteína TPA ê colocada no cromossoma II de levedura na posição da região codificadora da proteína PH05 . Experimentálmente isto ê con seguido por cotransformação.

Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 ê cotransformada com 25 ^ig do plasmídeo p31/PHO5 -TPA 18, linearizado com BnmHI e Hind III, e 3 ^xg do plasmídeo de levedura Yepl3 (51).

De 24 colónias Leu obtidas, uma ê Pho5 e ao mesmo tempo produz aproximadamente 35 unidades de TPA/1 de cultura de células de levedura /0D₆₀₀.

Por crescimento deste transformante num

meio contendo leucina (YPD, 10g/l de Bacto Yeast Extract,

20g/l de Bacto Peptone, 20 g/l de glucose) durante 10 gerações, segregantes Leu~são obtidos com uma frequência de

10-20¾ os quais provavelmente perderam o plasmideo Yep31.

Por análise ou Southern do DNA total de levedura isolado dos segregantes Leu (52) verifica-se que no nível de DNA que as sequências codificadoras da proteína TPA substituem as sequências codificadores da proteína PH05 deixando inal. teradas as sequências ladeantes do cromossoma II.

Seleccionou-se uma estirpe que se designou por Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (pho-5-ΤΡΑ)♦

Exemplo 18: Melhoramento de estirpe por mutação

A estirpe Saccharomyces cerevisiae GRF18 /pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) é ainda desenvolvida para produção de TPA por mutação e selecção de baixa actividade de fosfatase ácida.

Saccharomyces cerevisiae H2 4 3/pJDB 20 7/ /PH05 -TPA (IA) um mutante termo-sensível de Saccharomyces

cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5 TPA (IA) ê obtido por irra_2

diação com UV (0,08 yiWcm , 15 segundos, 99,2¾ de morte).

As colónias são crescidas em meio YPD osmc ticamente estabilizado contendo sorbitol 1,2M (10 g/l de Bacto Yeast Extract, 20 g/l de Bacto Peptone, 20g/l de glucose, 20 g/l de agar Bacto) e transferidas para meio YPD sem sorbitol.

Saccharomyces cerevisiae H243 ê isolada

como colónia de crescimento lento.

Cerca de 10$ células de Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA (IA) são semeadas em agar YNB (6,8 1 de yeast Nitrogen Base sem aminoãcidos ; 20 g/1 de glucose, 20 g/1 de agar Bacto, suplementado com 20 mg/1

de histidina) e são irradiadas directamente com UV (0,08

-2 uWcm durante 12 segundos). A morte e de 98¾.

As colonias obtidas a partir das células sobreviventes são transferidas para meio de Pi baixo e dois dias depois coradas para a actividade de fosfatase acida por um teste de sobrecamada de agar mole (48).

Os mutantes negativos para a fosfatase _4

acida são obtidos com uma frequência de mutaçao de 3,2x10 .

A estirpe com o título de TPA mais elevado é seleccionado e referido como Saccharomyces cerevisiae H423/pJDB2O7/PHO5-TPA (IA).

As actividades de TPA de tres estirpes diferentes de levedura transformadas com pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) estão apresentadas na Tabela 4.

Tabela 4: Actividade de TPA de diferentes estirpes de

Saccharomyces cerevisiae transformadas em condi ções de desrepressão (Pi baixo)

	Actividade de TPA (unidades/1 de cultura de células de levedura /OD^qq)
GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA)	625
H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA)	1560
H423/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA)	7200

• 1

Exemplo 19 : Produção de TPA por uma estirpe recombinante da levedura Saccharomyces cerevisiae numa escala de 30 1.

Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) possui um plasmídeo que inclui uma marca para leucina permitindo manutenção selectiva do plasmídeo no organismo hospedeiro, um gene estrutural para o TPA humano e o promotor da fosfatase acida PH05 que permite a expressão do gene do TPA em meios com quantidades limitativas de fosfato inorgânico (condições de desrepressão).

A estirpe ê mantida em culturas de agar inclinado preparadas com um meio definido sem o aminoãcido leucina para assegurar a retenção do plasmídeo. Agar recentemente inoculado e incubado durante 24 horas a 30^?C.

A cultura â superfície de um dos agares inclinados ê ressuspensa em 3ml de meio de pre-cultura o qual ê então transferido para o primeiro balão de pre-cultura com agitação. 0 balão de 500 ml tem uma unica saída e contem 100 ml de meio I de pre-cultura tendo o seguinte composição ( valoreq em g/1). L-asparagina, 2,0; L-histidina, 0,02 glucose, 10 ; Kt^PO^, 1,0 ; MgSO₄· 7H₂O, 0,5 ; NaCl 0,1 ; CaCl₂~2H₂O, 0,1 ; solução de vitaminas 5 jil/1 e solução de micronutriantes 5 ml/1.

0 meio e ajustado a pH7,2 usando NaOH antes da esterilização . A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados à parte e adicionados ao meio.

As soluções "stock” de vitaminas e micronutrientes têm as seguintes composições (em g/1): Vitaminas - biotina, 0,0002; D-pantotenato de cãlcio , 0,04 ; acido fõlico, 0,0002; acido micotínico, 0,04 ; acido p-aminobenzõico, 0,02 ; hidrocloreto de piridoxina, 0,04; riboflãvina, 0,02 ; hidrocloreto de tiamina, 0,04; e inositol

0,2 em 1 1 de agua desionizada ; micronutrientes - acido bórico 0,05 ; CuSO "^H 0, 0,004 ; Kl, 0,01; FeCl^.óH^O,

0,02 ; MnSO^, 0,04 ; NaMoO^. 2^0, 0,02 e ZnSO^.71^0, 0,04 em 1 1 de agua desionizada. 0 meio ê preparado usando agua desionizada.

A primeira pré-cultura é incubada durante 24 horas a 30⁹C num agitador orbitol com 5cm de excentricidade a uma velocidade de 250 rev/min.

Os balões com a primeira pré-cultura constituem o inoculo para os balões da segunda pré-cultura. Estes balões recebem um inoculo de 1¾ (v/v).

Eles contem 100 ml de meio II de pré-cultura tendo a seguinte composição (mg/1): Extracto de levedura (Difco), 10,0 ; L-asparagina, 6,6; Κ^ΡΟ^ 1.0 ; MgSO^.7H₂O, 1,0 ; L-histidina, 0,02 e D-glucose (mono-hidrato) , 33,0.

0 meio que ê preparado usando agua desionizada tem um pH de aproximadamente 6,0.

A glucose é esterilizada separadamente. As condições de incubação são idênticas âs da primeira pré-cultura. 0 caldo de cultura de 3 balões ê combinado para dar um inoculo a 1¾ v/v para o fermentador principal de produção.

0 fermentador de produção tem um volume total de aproximadamente 45 1, contem 4 saliências e um agitador de turbina de disco de seis lâminas com um diâmetro de 115 mm. A velocidade de agitação é de 600 rev/min, a sobrepressão de 0,3 bar e uma velocidade de arejamento de 0,5 vol/vol/min.

*

,·

Η

Ο fermentador contem 30 1 de um meio com as composições seguintes: (valores em g/1): L-asparagina, 2,0 ; L-histidina, 0,02 ; Kí^PO^, 0,03; MgSO^. 71^0, 0,5; NaCl, 0,1, CaCl₂.2H₂O, 0,1 ; KC1, ip ; D-glucose (mono -hidrato) , 20,0 ; solução de vitaminas 5 ml/1 e solução micronutrientes, 5ml/l. 0 meio ê ajustado pH 7,2 usando NaOH antes da esterilização. A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados separadamente e adicionados ao meio. As soluções "stock" de vitaminas e micronutrientes têm composição idêntica às descritas para o meio I de prê-cultura.

A temperatura de fermentação ê de 30⁹C. 0 pH desce para 5,0 onde ê controlado usando NaOH. Apos fermentação durante cerca de 20 horas atinge-se a produção máxima de TPA. A densidade óptica que atinge 2-3 unidades e a actividade de fosfatase ácida dão indicações uteis àcer ca do progresso da fermentação. 0 calor de fermentação ê arrefecido para 10⁹C antes da colheita das células de levedura.

Exemplo 20: Recuperação e purificação do TPA e pro-TPA

por cromatografia com anticorpos monoclonais anti-TPA

a) Preparação de extractos celulares

0 líquido de cultura (pH4) dos 30 1 de fermentação (cf.Exemplo 19) é arrefecido atê 10⁹C e centrifugado usando uma centrífuga Alfa-Laval BRPX-207.

As células separadas são ressuspensas em 21 de tampão de lise A ( NaH₂P0₄ 20mM, f^HPO^ 80mM, NaCl 150 mM, 0,01¾ de Tween, Benzamidina lOmM e EDTA lOmM).

• 1

ί

»»

A solução é arrefecida atê 5⁹C e passa da através de um moinho Dyno (tipo KDL-Pilot) com uma velocidade de alimentação de 101/h. 0 moinho estã equipado com

500 ml de pérolas de vidro de 0,5 -0,75 m de diâmetro e ê ligado a 3000 rev/min. Antes da adição das pérolas de vidro às células em suspensão aquelas são lavadas com 300 ml de tampão de lise A contendo 30 mg de BSA. A suspensão de células ê centrifugada ( rotor Sorvall 653, 40 min. 9000 rpm) e o sedimento rejeitado.

b) Digestão do DNA^e fraccionamento com sulfato de amonio

Adiciona-se 5 mg de DNAse a 2 1 da suspensão clarificada e a mistura ê agitada durante 30 min. a 4⁹C. Subsequentemente a solução é levada a 35¾ de saturação com (NH^^SO^ (p/v) e ê agitada durante 1 hora a 4⁹C. A solução ê centrifugada como descrito atrãs e o sedimento contendo toda a actividade de TPA ê ressuspensa em 1 1 de tampão H contendo 1¾ de Tween e 0,1¾ de SDS.

A suspensão ê agitada durante pelo

menos 1 hora a 4⁹C.

c) Cromatografia de imunoafinidade

I) Purificação do anticorpo anti-TPA

5 ml de soro de coelho, anti -TPA (oferecido pelo Dr. E. Reich, Friedrich -Miescher-Institut Basel) são passados por uma coluna de sefarose com lisina para renovar o plasminogenio de soro.

A coluna ê lavada com 1-2 volumes de PB5 pH 7,4 contendo NaCl 100 mM, KCI 2,7 mM, Na₂HP0₄ 8,lmM e KH₂PO₄ 1,5 mM.

$

rf*

«

«

Ο líquido da coluna e de lavagens são juntos. 0 anti-soro sem plasminogênio é precipitado pela adição de (NH^)₂SO^ sólido para uma concentração final de 50¾ (p/v).

A solução ê mantida durante a noite a 4^?C e em seguida centrifugada ( rotor Sorvall GSA,1200 rpm, 20 min.) .

0 precipitado e dissolvido num peque no volume de PB5 e dializado contra PBS contendo 0,1 ¾ de NaNj. A IgG desta solução dializada e purificada numa coluna de proteína A -sefarose (55).

II) Preparação de uma coluna com anticorpo anti-TPA

13 mg de anticorpo anti-TPA purificado são dializados contra MOPS 0,1 M pH7,0.

0 anticorpo e ligado a 5 ml de Affigel 10 activado ( Biorad ) segundo as instruções do fabricante.

A matrix do gel ó equilibrada com PBS contendo 1¾ de Tween 80, 0,1¾ de SDS, NaCl 0,2M, Benzamidin lOmM e 0,1¾ de NaN^. A matrix e aplicada numa coluna de 5 ml.

III) Purificação de TPA por cromatografia de imunoafinidade.

0 sedimento redissolvido do fraccionamento com sulfato de amónio ê centrifugado para remover o material insolúvel ( rotor Sorvall GSA, 30 min. 12000rpm) e subsequentemente aplicado â coluna de afinidade a uma ve locidade de fluxo de cerca de lOml/hr a 4⁹C.

Depois de todo o volume ter passado através da coluna esta ê lavada com 10 volumes da coluna de PBS contendo 0,05¾. de Tween 80.

A coluna ê eluída usando glicina-ΗΟΙΟ,ΙΜ pH2,5 contendo 0,1 ¾ de Tween. São colhidas fracções de 2 ml e testados para a actividade de TPA segundo o método de Rânby (49). Como substracto usa-se D-Val-Leu-Lis -pNA (Kabi -S-2251).

As fracções com actividades mais elevadas são reunidas, neutralizadas usando Tris IM e concentradas por ultrafiltração usando uma membrana Amicon YM10.

0 TPA assim obtido apresenta cerca de 90¾ de pureza e estã predominantemente em forma de cadeia unica ( pro-TPA) como evidenciado por SDS-PAGE em condições de redução. 0 peso molecular aparente em condições não redutoras ê de cerca de 60 000 por SDS -PAGE (ver figura A).

Figuras A e B : electroforese em gel de poliacrilamida-SDS do produto do gene TPA em levedura (Figura A) e a sua actividade enzimãtica num gel de actividade (placas com caseína) ( figura B).

B:gel de actividade

A:gel com SDS

ad figura A (SDS-PAGE):

Faixas 1 e 4 : proteínas padrão (marcadores de peso molecular)

Faixas 2 e 5 : TPA de melanoma

Faixas 3 e 6 : TPA de levedura

Faixas 1 - 3 : em condições de redução

Faixas 4 - 6 : em condições de não-redução

As amostras correram num gel de 12,5¾ que se corou para proteínas usando azul Coomassie brilhante.

ad. figura B (gel de actividade, cf. Exemplo 23):

Faixa 1 : TPA de melanoma

Faixa 2 : TPA de levedura

Sobre-camada para plasminogénio de agar com caseira (referência 56) .

Exemplo 21: Recuperação e purificação de TPA e pro-TPA

por cromatografia de afinidade com DE-3

a. Preparação de uma coluna de DE-3 Sepharosé

26 mg do inibidor DE-3 purificado a partir de Erythrina latíssima (16) são acoplados a 5 ml de Sepharose 4b ® activada com brometo de cianogênio (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante. A matrix ê equilibrada com tampão fosfato salino ("PBS") pH 7,4 contendo NaCl 0,4M, 0,1¾ de Triton X-100^R e 0,02¾ de azida de sódio. A matrix ê então acamada numa coluna de 5 ml.

b. Purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia em DE-3

R

Sepharose 4b

Os extractos celulares (cf. Exemplo 20a) são tornados 0,4 M relativamente a NaCl e 0,1¾ para Triton X-lOCr^ e filtrados através de uma membrana de 0,45 ^im (Millipore). A solução ê então aplicada à coluna de DE-3 Sepharose (ver atras) a uma velocidade de fluxo de 45ml/hr â temperatura ambiente e o efluente ê rejeitado. Depois do volume total do extracto ter passado através da coluna esta ê lavada com cerca de 50 ml de PB5 contendo NaCl 0,4 M e 0,1 ¾ de Triton X-lOO*' sendo colhidos fracções de 2 ml a 4⁹C. 0 conteúdo protêico de cada fracção ê determinado por

medição da absorvância de UV a 280nm.

A proteína adsorvida verificou-se ser

eluída como um pico bem definido. As fracções contendo os

valores mais elevados de absorvância de UV e de activida125

de fibrinolítica determinada pelo teste da I fibrina (47) são reunidas dando 8 ml de solução que se guardou a -20⁹ C. Isto representa aproximadamente 70-80¾ da actividade total aplicada à coluna. As fracções com as actividades

»·

mais baixas são reunidas separadamente. A recuperação total de actividade em ambos os conjuntos de fracções monta os 90-100¾.

c). Purificação de pro-TPA por cromatografia em DE-3 Sepharose 4b® na presença de um inibidor de proteíases.

A cromatografia dos extractos de células de levedura ê feita de modo semelhante ao descrito no Exemplo 21b exceptuando a inclusão neste caso do inibidor de tripsina pancreãtica bãsica (BPTI) a 0,1 KlU/ml usando o teste fluorimétrico como Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC como substracto (37) determinou-se o conteúdo em TPA e pro-TPA da solução purificada. 90¾ do TPA estã na forma de pro-enzima e 10¾ na forma activa. Assim, a conversão de pro-TPA em TPA durante o processo de purificação é inibido pelo BPTI.

Exemplo 22: Separação de pro-TPA do TPA

A solução de TPA e pro-TPA obtida como descrito no Exemplo 21c e ajustada a pH8,0 com Tris.HCl O,1M contendo 0,1¾ de Triton X-lOcP e tornado lmM relativamente ao diisopropilfluorofosfato. Apos incubação a 37^?C durante 4 horas, a mistura ê passada através de uma coluna de 5 ml de DE-3 Sepharose® (cf. Exemplo 21a). 0 efluente contendo o TPA irreversivelmente inibido é rejeitado.

A coluna e lavada com 6 volumes de coluna de PBS contendo NaCl 0,4 M e 0,1¾ de Triton X-IOC^ e subsequentemente eluída com PB5 contendo K SCN 1,6M, NaCl 0,4M e 0,1¾ de Triton X-10C^ como descrito no Exemplo 21b .

As fracções apresentando as absorvân. 1

s·

P0RWI

« ? » ... Ή

, - - - ,

__. «τ'.

cias de UV mais elevadas são reunidas. 0 conjunto de fracções contem pro-TPA numa forma substancialmente pura uma vez que não se detecta actividade amidolítica no teste fluorimêtrico usando Cbz-Gli-Gli-Arg-AMC (37) como substrato. A actividade amidolítica assim como a fibrinolítica pode ser restabelecida por tratamento com plasmina a qual converte pro-TPA em enzima activa.

Exemplo 23: Propriedades do produto do gene TPA em levedura

a. Propriedades enzimãticas

0 produto do gene TPA em levedura obtido segundo o Exemplo 19 e purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 (cf. Exemplo 21b) ê enzimãticamente activo como se mostra por clivagem de plasminogênio zimogênio em plasmina na ausência e na presença de fibrina.

A actividade enzimãtica pode ser verificada pelos testes colorimêtricos descritos por Ranby (49) (cf. Exemplo 12) e por Verheijen et al. (60) , em placas

de caseína e de fibrina (56) e num teste de fase solida com 12 9

I - fibrinogenio ( 47).

A actividade enzimãtica em placas de caseína ê mostrada na figura B ( cf. Exemplo 20 c III).

A actividade enzimãtica do TPA obtido ê grandemente estimulada pela fibrina. 0 TPA parcialmente purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 ê testado num teste de velocidade parabólica (cf. Ranby (49)). Tomando a velocidade reacção Δ E versus Δ t^ entre e 5 minutos como uma medida da actividade enzimãtica a estimulação por concentração óptimas de fibrina ê de 10-20

vezes ( ca. 100 yig /ml) . 0 efeito pode ser observado com

fragmentos de fibrina obtidos por digestão com CnBr (57) ou com fibrinogênio tratado com batroxolina (58). Quando se testa urocinase nas mesmas condições não se observa qualquer estimulação da sua actividade pela fibrina.

b. Ligação do TPA das placas de fibrina

Através da aplicação do teste de ligação à fibrina descrito por Rijken et al.(2) verificou-se que o TPA obtido purificado por cromatografia de afinidade em DE-3 se liga em grande parte aos coágulos de fibrina.

Ao contrário a urocinase não se liga significantemente à fibrina. Assim uma diferença bem marcada entre o produto do gene TPA em levedura obtido e a urocinase ê que o primeiro se adsorve à fibrina resultando num aumento pronunciado da actividade do plasminogênio ( 59) .

Exemplo 24 : Estado de glicosilação do produto do gene TPA em levedura

Para se ver se o TPA produzido em levedura ê ou não glicosilado analisa-se o seu comportamento

£

numa coluna de concanavalina-A Sepharose (2).

Usa-se uma fracção de TPA parcialmente purificada por cromatografia de afinidade na coluna de DE-3 Sepharose (ver Exemplo 21b) . Esta fracçao tem uma actividade de 11,5 FU/ml o que corresponde a 2,1 pg /ml de proteína TPA.

A fracção activa (3 ml) e aplicada a

R

uma coluna (0,5 ml de leite) de concanavalina -A Sepharose equilibrada com Tris.HCl O,1M, pH7,5, contendo NaCl 1M e 0,01 °i (v/v) de Tween 80 ^R.

As proteínas não adsorvidas são colhidas apenas numa fracção ( - 3ml). Após lavagem da coluna com 6 ml de tampão de equilíbrio, a eluição das proteínas ligadas à matrix e feita em quatro passos com << -metil mano sido e KSCN adicionados ao tampão de equilíbrio.

Os quatro passos são feitos em sucessão cada um com 0,5 ml de uma das soluções.

1. X -metil manosideo 50mM + KSCN O,25M em tampão de equilíbrio

2. oi -metil manosido 100mM + KSCN 0,50M em tampão de equilíbrio

3. -metil manosido 200mM + KSCN 1M em tampão de equilíbrio

4. c<-metil manosido 300mM + KSCN 2M em tampão de equilíbrio

Uma actividade significante de TPA e recuperada nos passos 2 e 3, não se libertando actividade com baixas concentrações de sal e açúcar (passo 1).

Também se encontrou alguma actividade de TPA na fracção de proteína não adsorvida (ver atrãs).

Estes resultados mostram que o TPA e glicosilado em levedura. No entanto, também se encontra actividade na fracção de proteína não adsorvida o que indica que nem todo, o TPA sintetizado em levedura ê completamente glicosilado o que poderã ser devido à situação de super-produção em meio com Pi-baixo.

Exemplo 25: Preparação farmacêutica para administração parenteral

Uma solução contendo TPA e/ou pro-TPA

obtida como descrito nos Exemplos 20 a 22, é dializada conR

tra cloreto de sodio 0,3 molar contendo 0,01¾ de Tween 80 e guardada a -80⁹C.

Antes da administração a concentração é ajustada a 75 pg /ml de TPA total (i.e. TPA ou pro-TPA ou TPA mais pro-TPA) e NaCl 0,3 Μ. A solução é esterilizada por filtração, através de filtro membranar de 0,22 ^im

Este processo é adequado à preparação de soluções de TPA, pro-TPA ou TPA mais pro-TPA para administração parenteral, como seja intravenosa.

119Referenci a$

1. S. Thorsen et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 28, 65(1972)

2. D.C. Rijken and D. Collen, J. Biol. Chem. 256, 7035 (1981)

3. D.C. Rijken et al., J. Biol. Chem. 257, 2920 (1982)

4. P. Wallén et al., Progr. Fibrin. _5, 16 (1982)

5. E.L. Wilson et al., Câncer Res. 40, 933 (1980)

6. E.L. Wilson et al., Blood 61, 568 (1983)

7. D. Pennica et al., Nature 301, 214 (1983)

8. T. Edlund et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 349 .(1983)

9. Perlman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 781 (1982)

10. A.M. Maxam.et al., in "Methods in Enzymology", vol. 65, p. 499, New York 1980

11. J. Lodder, ”The Yeasts", Amsterdam 1971

12. A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)

13. A. Hinnen et al., Curr. Top. Microbiol. Irnraun. 96, 101 (1982)

14. A. Jimenez et al., Nature 287, 869 (1980)

15. European Patent Application No. 23860

16. F.J, Joubert et al,, Hoppe-Seyler's Zeitschr. Physiol. Chem. 302, 531 (1981)

17. M.V. Olson et al., J. Mol. Biol. 132, 387 (1979)

18. H. Meyer, FEBS Lett. _90, 341 (1978)

19. B. Hohn et al. in "Genetic Engineering, vól. 2, p. 169,

New York 1980

20. B. Hohn in "Methods in Enzymology", vol. 68, p. 299,

New York 1979

21. A. Hinnen et al. in "Eukaryotic Gene Regulation", vol. 14, p. 43, New York 1979

22. J.D. Beggs in "Genetic Engineering, vol. p. 175,

New York 1981

23. J. Messing, In the 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA (ed. A. Walton), Elsevier, Amsterdam 1981,

p. 143

24. M. Mandei et al., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)

25. A.J. Berk et al., Cell LZ, 721 (1977)

ra

-120-

26. D.S. Holmes et al., Anal. Biochem. 144, 193 (1981)

27. P.M. Lizardi et al., Anal. Biochem. 96, 116 (1979)

28. Y. Nagamine et al., Cell 32, 1181 (1983)

29. J.B. Gurdon et al., J. Embryol. Exp. Morphol. 36, 523 (1976)

30. M.W. McDonnel et al., J. Mol. Biol. 110, 119 (1977)

31. G. Deng et al., Nucl. Acids Res. _9_, 4173 (1981)

32. L. Villa-Komaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75,

3727 (1978)

33. D.A. Morrison in "Hethods in Enzymology", vol. 68, 326 (1979)

34. T. Edlund et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 349 (1983)

35. H. Ito et al., Nucl. Acids Res. 10, 1755 (1982)

36. H.C. Birnboim et al., Nucl. Acids Res. _7j 1513 (1979)

37. M. Zimmerman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 750 (1978)

38. J. Messing in "M13 cloning/Dideoxy Sequencing" (EMBO-course manual), 1981

39. in manual "M13 cloning and DNA sequencing systera", New England Biolabs

40. K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975)

41. J.F.M. de Rooij et al., Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 98, 537 (1979)

42. Molecular cloning. A laboratory Manual (eds. T. Maniatis,

E.F. Fritsch, J. Sambrook), Cold Spring Harbor Lab. 1982, p. 177

43. G.F. Hong, Bioscience Reports _1, 243 (1981)

44. A. Toh-e et al., J. Bacteriol. 113, 727 (1973)

45. S.V. Suggs et al., in "Developmental biology using purified genes", ICN-UCLA symposium on molecular and cellular biology, vol. 23 (ed. D.D. Brown and D.F, Fox), p. 683 (1981)

46. M Smith, in "Methods of RNA and DNA sequencing" (ed. S.M. Weissmann), Praeger Scientific, New York 1983

47. E.L. Wilson et al., Int. J. Câncer 22, 390 (1978)

48. B. Meyhack et al., EMBO Journal _1, 675 (1982)

49. M. Rânby, Biochim. Biophys. Acta 704, 461 (1982)

50. Hicks et al.,' Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, Vol, XLIII, p. 1305 (1979)

51. Broach et al., Gene _8, 121 (1979)

52. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76, 1035 (1979)

53. F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463 (1977)

54. J. Kurjan et al., Cell 30, 933 (1982)

55. P.L. Ey et al., Immunochem. 15, 429 (1978)

56. J. Jespersen et al., Haemostasis 18, 301 (1983)

57. C. Zamarrron et al., J. Biol, Chem. 259, 2080 (1984)

58. J. Chmielewska et al., Thrombosis Research 31, 427 (1983)

59. P.'Wallén, Progr. Chem. Fibrinolysis Thrombolysis, _3, 167 (1978)

60. J.H. Verheijen et al., Thromb. Haemost. 48, 266 (1982)

Nas figuras dos desenhos juntos,os símbolos usados tem os seguintes significados:

sequência do

pBR 322

eliminação de um loc de restrição

τιn.m- DNA cromossómico de levedura derivado da região pHQ3,PH05

222222222 DNA 2/j de plasmídeo de levedura

gene do TPA

delecção no pBR 322

DNA cromossómico de levedura derivado da região LEU2

local de

ampR gene de resistência â ampici1ina

tetR gene de resistência â Tetraciclina

rj região do promotor

I região de terminação da

transcrição

direcção

restrição

da transcrição

segmento

dor

de DNA adapta-

Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES

   la.- Método para produção de APT (activador de pl asinino génio de tecido), pro-ΑΡΤ ou respectivas misturas em que o APT e pro-ΑΡΤ estão presentes numa forma glicosilada ou não glicosilada ou numa mistura destas formas caracterizado por compreender os passos de cultura em condições nutritivas adequadas de uma estirpe de levedura transformada com um vector híbrido contendo um promotor de levedura e uma região codificadora de APT a qual é controlada pelo referido promotor, ou de uma estirpe de levedura com um gene do activador do plasminogénio de tecido estãvelmente integrado num cromossoma da levedura e estando sob o controle de um promotor de levedura cromossómico ou um mutante de tal estirpe de levedura e isolamento e purificação das referidas proteínas e, caso se deseje, separação de uma mistura de APT e pro-APT obtida nos seus componentes individuais e, para a produção de APT liberte de pro-APT, conversão do pro-APT produzido em APT e, caso se deseje, separação de produtos glicosilados e não glicosilados obtidos numa mistura e, para a produção de proteína não glicosilada livre de proteína glicosilado, remoção dos resíduos glicosilo nas proteínas obtidas.
2. 2a.- Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vector híbrido de levedura compreender uma região codificadora de APT derivada do grupo constituído por célula de melanoma humano, célula de fibrossarcoma, célula de carcinoma epidermal, célula de carcinoma da bexiga, célula de hipernefroma, célula de lipossarcoma, célula HoLa, um fibroblasto, um queratócito, uma célula epitelial da mama e uma célula de rim embriónico.
3. 3a.- Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vector híbrido de levedura compreender uma região codificadora de APT derivado de células HeLa.
4. 4a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vector híbrido de levedura compreender um promotor de levedura que pode ser controlado exogenamente.
5. 5a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vector híbrido de levedura compreender o promotor PHO5 de levedura.
6. 6a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vector híbrido de levedura compreender um promotor de levedura o qual estã directamente ligado à região codificadora de APT maduro com um sinal de iniciação da tradução ATG inserido no ponto de união.
7. 7a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vector híbrido de levedura com preender uma região codificadora de APT que ê precedida por uma sequência sinal.
8. 8a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vector híbrido de levedura conter uma região codificadora de APT precedida pela sequência sinal PHO5.
9. 9a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vector híbrido de levedura compreender uma região codificadora de APT precedida pela prêpo-sequência de APT.
10. 10a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vector híbrido de levedura compreender um promotor de levedura que se estende atê à regiÍITiT»

    ão codificadora do gene naturalmente controlado pelo referido promotor e ligado â região codificadora de APT através de um adaptador sintético contendo locais de processamento para uma endopeptidase de levedura,
11. 11a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vector híbrido de levedura compreender um promotor de levedura e uma sequência sinal prolongada que são derivados do gene PHO5 .
12. 12a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por os produtos de transcrição de APT terminarem numa sequência de ADN contendo sinais de terminação de transcrição de um gene de levedura.
13. 13a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a levedura ser Saccharomyces cerevisial .
14. 14a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a estirpe de levedura ser cultivada em meio líquido contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos.
15. 15a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o APT e pro-ΑΡΤ e respectivas misturas serem isolados a partir dos líquidos de cultura por adsorção selectiva numa coluna de DE-3 Sepharose.
16. 16a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o APT e pro-ΑΡΤ e respectivas misturas são isoladas a partir dos líquidos de cultura por cromatografia de afinidade usando anticorpos monoclonais.
17. 17a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o pro-ΑΡΤ obtido ser convertido enzimãticamente em APT.

    125
18. 18a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por um inibidor de proteases ser incluído durante o processo de purificação e cromatografia numa coluna de DE-3 Sepharose ser efectuada na presença de um inibidor que selectivamente se liga apenas ao APT de modo a conseguir-se pro-ΑΡΤ substancialmente liberto de APT.
19. 19a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por os produtos glicosilados e não glicosilados obtidos serem separados por cromatografia numa coluna de concanavalina -A Sepharose.
20. 20a.- Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se produzir um activador do plasminogênio de tecido, um pro-activador do plasminogênio de tecido e respectivas misturas tendo uma glicosilação específica de levedura.