JP2685125B2 - 新規遺伝子、それを用いた形質転換体及びその利用 - Google Patents
新規遺伝子、それを用いた形質転換体及びその利用Info
- Publication number
- JP2685125B2 JP2685125B2 JP7039434A JP3943495A JP2685125B2 JP 2685125 B2 JP2685125 B2 JP 2685125B2 JP 7039434 A JP7039434 A JP 7039434A JP 3943495 A JP3943495 A JP 3943495A JP 2685125 B2 JP2685125 B2 JP 2685125B2
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- JP
- Japan
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- nuclease
- aspergillus oryzae
- transformant
- dna
- gene
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アスペルギルス・オリ
ゼーから得られた新規ヌクレアーゼＳ１遺伝子、これを
含むベクター、そのベクターをアスペルギルス・オリゼ
ーに導入した形質転換体及びその利用に関するものであ
る。
ゼーから得られた新規ヌクレアーゼＳ１遺伝子、これを
含むベクター、そのベクターをアスペルギルス・オリゼ
ーに導入した形質転換体及びその利用に関するものであ
る。
【０００２】アスペルギルス・オリゼーのヌクレアーゼ
Ｓ１は、産業上重要な酵素であり、本発明によって得ら
れた形質転換体は本酵素を著量に生産し、これら本酵素
を用いる産業界に本発明は多大の貢献をなすものであ
る。
Ｓ１は、産業上重要な酵素であり、本発明によって得ら
れた形質転換体は本酵素を著量に生産し、これら本酵素
を用いる産業界に本発明は多大の貢献をなすものであ
る。
【０００３】
【従来の技術及び問題点】ヌクレアーゼＳ１は、１本鎖
のＤＮＡ又はＲＮＡを基質として分解し２本鎖ＤＮＡや
ＲＮＡは分解しない。この性質を利用して、ＤＮＡやＲ
ＮＡの構造解析にアスペルギルス・オリゼーのヌクレア
ーゼＳ１が利用されている。例えば、Ｓ１マッピングと
呼ばれる転写開始点の決定に本酵素が使用されるほか
（MolecularCloning, A Laboratory Manual 2nd ed., 1
989)、複雑な転写産物を解析するＳ１二次元分析法、二
本鎖ＤＮＡの末端の平滑化等にも利用され、本酵素は、
遺伝子工学において非常に重要である。
のＤＮＡ又はＲＮＡを基質として分解し２本鎖ＤＮＡや
ＲＮＡは分解しない。この性質を利用して、ＤＮＡやＲ
ＮＡの構造解析にアスペルギルス・オリゼーのヌクレア
ーゼＳ１が利用されている。例えば、Ｓ１マッピングと
呼ばれる転写開始点の決定に本酵素が使用されるほか
（MolecularCloning, A Laboratory Manual 2nd ed., 1
989)、複雑な転写産物を解析するＳ１二次元分析法、二
本鎖ＤＮＡの末端の平滑化等にも利用され、本酵素は、
遺伝子工学において非常に重要である。
【０００４】このアスペルギルス・オリゼーのヌクレア
ーゼＳ１は、市販されてはいるが、その生産量はα−ア
ミラーゼやグルコアミラーゼなどの酵素と比べて非常に
微量であり、精製酵素は１ｍｇが約２４万円と非常に高
価である（Takara遺伝子工学カタログ）。
ーゼＳ１は、市販されてはいるが、その生産量はα−ア
ミラーゼやグルコアミラーゼなどの酵素と比べて非常に
微量であり、精製酵素は１ｍｇが約２４万円と非常に高
価である（Takara遺伝子工学カタログ）。
【０００５】
【問題点を解決するための手段】本発明は上記問題点を
解決するためになされたものであって、ヌクレアーゼＳ
１を著量に生産するアスペルギルス・オリゼーを開発す
る目的でなされたものである。そして上記目的達成のた
め各方面から検討した結果、目的とする遺伝子をクロー
ニングし、この遺伝子を用いて遺伝子操作による方法が
好適であるとの観点にたった。
解決するためになされたものであって、ヌクレアーゼＳ
１を著量に生産するアスペルギルス・オリゼーを開発す
る目的でなされたものである。そして上記目的達成のた
め各方面から検討した結果、目的とする遺伝子をクロー
ニングし、この遺伝子を用いて遺伝子操作による方法が
好適であるとの観点にたった。
【０００６】この観点にたち、アスペルギルス・オリゼ
ーのヌクレアーゼＳ１遺伝子を、アスペルギルス・オリ
ゼー染色体ＤＮＡライブラリーからクローニングするこ
とに成功し、また、ヌクレアーゼＳ１遺伝子の塩基配列
の決定にも成功した。
ーのヌクレアーゼＳ１遺伝子を、アスペルギルス・オリ
ゼー染色体ＤＮＡライブラリーからクローニングするこ
とに成功し、また、ヌクレアーゼＳ１遺伝子の塩基配列
の決定にも成功した。
【０００７】そして更に、これらクローン化するのに成
功したヌクレアーゼＳ１をコードする遺伝子を有する染
色体ＤＮＡ断片をアスペルギルス・オリゼー（Aspergil
lusoryzae）の宿主ベクター系に移入することにも成功
し、得られた形質転換体においてこれらの遺伝子が発現
する事も確認し、ヌクレアーゼＳ１を著量に生産する形
質転換体を具体的に得るのに成功した。そしてここで得
られた形質転換体の内、形質転換体（Ａ）及び（Ｂ）
は、それぞれ、Aspergillus oryzae NS及び同NGSと命名
し、FERM P-14572及びFERM P-14571として、工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託した。
功したヌクレアーゼＳ１をコードする遺伝子を有する染
色体ＤＮＡ断片をアスペルギルス・オリゼー（Aspergil
lusoryzae）の宿主ベクター系に移入することにも成功
し、得られた形質転換体においてこれらの遺伝子が発現
する事も確認し、ヌクレアーゼＳ１を著量に生産する形
質転換体を具体的に得るのに成功した。そしてここで得
られた形質転換体の内、形質転換体（Ａ）及び（Ｂ）
は、それぞれ、Aspergillus oryzae NS及び同NGSと命名
し、FERM P-14572及びFERM P-14571として、工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託した。
【０００８】また、ここで得られた形質転換体は、いず
れも、すぐれたヌクレアーゼＳ１生産能が高く、例え
ば、形質転換体（Ｂ）を用いてヌクレアーゼＳ１生産能
を調べたところ、対照の親株に比して約１００倍以上の
高い生産性であることも確認した。
れも、すぐれたヌクレアーゼＳ１生産能が高く、例え
ば、形質転換体（Ｂ）を用いてヌクレアーゼＳ１生産能
を調べたところ、対照の親株に比して約１００倍以上の
高い生産性であることも確認した。
【０００９】本発明は、これらの新知見に基づき、更に
検討の結果、遂に完成されたものであって、本発明は、
配列表の配列番号１で示されるＤＮＡを基本的技術思想
のひとつとするものであり、更に次のような態様を包含
するものである。
検討の結果、遂に完成されたものであって、本発明は、
配列表の配列番号１で示されるＤＮＡを基本的技術思想
のひとつとするものであり、更に次のような態様を包含
するものである。
【００１０】（１）アスペルギルス・オリゼーから単離
したプロモーターを含むヌクレアーゼＳ１遺伝子のＤＮ
Ａ配列。 （２）この（１）のヌクレアーゼＳ１遺伝子のプロモー
ター及びタンパク質コード領域を含むＤＮＡ配列を連結
したアスペルギルス・オリゼーのベクター。 （３）この（１）のヌクレアーゼＳ１遺伝子のタンパク
質コード領域の上流にアスペルギルス・オリゼー由来の
強力なプロモーターをもつＤＮＡ配列を連結したアスペ
ルギルス・オリゼーのベクター。 （４）（２）のベクターをアスペルギルス・オリゼーに
移入することによって得られる高ヌクレアーゼＳ１分泌
能を有する形質転換体。 （５）（３）のベクターをアスペルギルス・オリゼーに
移入することによって得られる高ヌクレアーゼＳ１分泌
能を有する形質転換体。 （６）（４）または（５）の形質転換体を用いることに
よってヌクレアーゼＳ１を効率的に著量製造する方法。
したプロモーターを含むヌクレアーゼＳ１遺伝子のＤＮ
Ａ配列。 （２）この（１）のヌクレアーゼＳ１遺伝子のプロモー
ター及びタンパク質コード領域を含むＤＮＡ配列を連結
したアスペルギルス・オリゼーのベクター。 （３）この（１）のヌクレアーゼＳ１遺伝子のタンパク
質コード領域の上流にアスペルギルス・オリゼー由来の
強力なプロモーターをもつＤＮＡ配列を連結したアスペ
ルギルス・オリゼーのベクター。 （４）（２）のベクターをアスペルギルス・オリゼーに
移入することによって得られる高ヌクレアーゼＳ１分泌
能を有する形質転換体。 （５）（３）のベクターをアスペルギルス・オリゼーに
移入することによって得られる高ヌクレアーゼＳ１分泌
能を有する形質転換体。 （６）（４）または（５）の形質転換体を用いることに
よってヌクレアーゼＳ１を効率的に著量製造する方法。
【００１１】また、本発明に係るヌクレアーゼＳ１遺伝
子のＤＮＡは、ヌクレアーゼＳ１酵素のアミノ酸配列が
変化しないようにその塩基配列の塩基を置換することも
可能であるし、その塩基配列の一部について、塩基の置
換、削除、挿入、及び／又は転移を行ってもよい。
子のＤＮＡは、ヌクレアーゼＳ１酵素のアミノ酸配列が
変化しないようにその塩基配列の塩基を置換することも
可能であるし、その塩基配列の一部について、塩基の置
換、削除、挿入、及び／又は転移を行ってもよい。
【００１２】以下、本発明についてくわしく説明する
が、本発明に用いた染色体ＤＮＡおよびヌクレアーゼＳ
１の供与体はアスペルギルス・オリゼーであり、具体的
には例えばＲＩＢ４０株である。
が、本発明に用いた染色体ＤＮＡおよびヌクレアーゼＳ
１の供与体はアスペルギルス・オリゼーであり、具体的
には例えばＲＩＢ４０株である。
【００１３】クローニングのために、まず、すでに決定
されているヌクレアーゼＳ１のアミノ酸配列（A. Iwama
tsu et al., J. Biochem., 110, 151-158(1991))に基づ
いてオリゴＤＮＡを合成し、後述のプラークハイブリダ
イゼーションのプローブを作製する。
されているヌクレアーゼＳ１のアミノ酸配列（A. Iwama
tsu et al., J. Biochem., 110, 151-158(1991))に基づ
いてオリゴＤＮＡを合成し、後述のプラークハイブリダ
イゼーションのプローブを作製する。
【００１４】また、ＹＰＤ培地（イーストエキス１％、
ペプトン２％、グルコース２％）で培養したアスペルギ
ルス・オリゼーＲＩＢ４０株より染色体ＤＮＡを、例え
ばAgric. Biol. Chem., Vol. 51, 323-328(1987)に記載
された方法に準じて抽出し、Agric. Biol. Chem., Vol.
53, 593(1989)に準じた染色体ジーンライブラリーを作
製する。この染色体ジーンライブラリーより、先に作製
したプローブを使用しヌクレアーゼＳ１遺伝子を単離す
る。得られたＤＮＡ断片は、図２、図３に示すＤＮＡ配
列を有している。
ペプトン２％、グルコース２％）で培養したアスペルギ
ルス・オリゼーＲＩＢ４０株より染色体ＤＮＡを、例え
ばAgric. Biol. Chem., Vol. 51, 323-328(1987)に記載
された方法に準じて抽出し、Agric. Biol. Chem., Vol.
53, 593(1989)に準じた染色体ジーンライブラリーを作
製する。この染色体ジーンライブラリーより、先に作製
したプローブを使用しヌクレアーゼＳ１遺伝子を単離す
る。得られたＤＮＡ断片は、図２、図３に示すＤＮＡ配
列を有している。
【００１５】上記で得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐ
ＵＣ１１８にサブクローニングしたｐＮＵＣＳにアスペ
ルギルス・オリゼーのマーカー遺伝子ｎｉａＤを挿入
し、得られたＤＮＡをｎｉａＤ欠損株のアスペルギルス
・オリゼーに移入し形質転換体を得る。ｎｉａＤ欠損株
として具体的にはｎｉａＤ３００株が挙げられる。形質
転換法としては、公知の方法例えばAgric. Biol. Chem.
Vol. 51, 323-328(1987)に記載された方法あるいはこ
れに準じた方法がとられる。この方法によって形質転換
体（Ａ）を得る。
ＵＣ１１８にサブクローニングしたｐＮＵＣＳにアスペ
ルギルス・オリゼーのマーカー遺伝子ｎｉａＤを挿入
し、得られたＤＮＡをｎｉａＤ欠損株のアスペルギルス
・オリゼーに移入し形質転換体を得る。ｎｉａＤ欠損株
として具体的にはｎｉａＤ３００株が挙げられる。形質
転換法としては、公知の方法例えばAgric. Biol. Chem.
Vol. 51, 323-328(1987)に記載された方法あるいはこ
れに準じた方法がとられる。この方法によって形質転換
体（Ａ）を得る。
【００１６】次に、上記で得られたＤＮＡ断片の内ヌク
レアーゼＳ１酵素タンパク質をコードする領域の上流を
切断したＤＮＡをアスペルギルス・オリゼーの高発現ベ
クターとして例えばグルコアミラーゼ遺伝子プロモータ
ーとｎｉａＤ遺伝子をマーカーに持つｐＵＮＧ１に挿入
し、得られたＤＮＡをｎｉａＤ欠損株のアスペルギルス
・オリゼーに移入し形質転換体を得る。この方法によっ
て形質転換体（Ｂ）を得る。形質転換体（Ａ）、（Ｂ）
ともにヌクレアーゼＳ１を高生産したが、特に、（Ｂ）
は対照の親株ｎｉａＤ３００株に比べて約１００倍以上
の生産性を示した。
レアーゼＳ１酵素タンパク質をコードする領域の上流を
切断したＤＮＡをアスペルギルス・オリゼーの高発現ベ
クターとして例えばグルコアミラーゼ遺伝子プロモータ
ーとｎｉａＤ遺伝子をマーカーに持つｐＵＮＧ１に挿入
し、得られたＤＮＡをｎｉａＤ欠損株のアスペルギルス
・オリゼーに移入し形質転換体を得る。この方法によっ
て形質転換体（Ｂ）を得る。形質転換体（Ａ）、（Ｂ）
ともにヌクレアーゼＳ１を高生産したが、特に、（Ｂ）
は対照の親株ｎｉａＤ３００株に比べて約１００倍以上
の生産性を示した。
【００１７】形質転換体（Ａ）、（Ｂ）は、ヌクレアー
ゼＳ１を多量分泌生産するので、培養物から酵素を分離
採取すれば、酵素を効率よく製造することができ、各種
の工業において様々な用途に利用することができる。
ゼＳ１を多量分泌生産するので、培養物から酵素を分離
採取すれば、酵素を効率よく製造することができ、各種
の工業において様々な用途に利用することができる。
【００１８】次に、本発明の実施例を示す。
【００１９】
【実施例１】 染色体ジーンライブラリーからのアスペルギルス・オリ
ゼーのヌクレアーゼＳ１遺伝子のクローニング
ゼーのヌクレアーゼＳ１遺伝子のクローニング
【００２０】Agric. Biol. Chem., Vol. 53, 593-599に
記載の方法に準じて作成したλＤＡＳＨファージ（TOYO
BO）を用いたアスペルギルス・オリゼーの染色体ジーン
ライブラリーより、プラークハイブリダイゼーション法
によりヌクレアーゼＳ１遺伝子をクローニングした。プ
ローブとしては、下記に示す２種類のオリゴＤＮＡを用
いて染色体ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅したＤＮＡを用
いた。
記載の方法に準じて作成したλＤＡＳＨファージ（TOYO
BO）を用いたアスペルギルス・オリゼーの染色体ジーン
ライブラリーより、プラークハイブリダイゼーション法
によりヌクレアーゼＳ１遺伝子をクローニングした。プ
ローブとしては、下記に示す２種類のオリゴＤＮＡを用
いて染色体ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅したＤＮＡを用
いた。
【００２１】 オリゴＤＮＡ＃１ ５’−ＧＧＩＣＡＣＧＡＡＡＣＩＧＴＩＧＣＩＴＡＣＡＴＡＧＣ−３’ Ｔ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ
【００２２】 オリゴＤＮＡ＃２ ５’−ＡＡＩＡＣＩＧＧＣＴＧＩＧＡＣＴＴＡＴＣＡＴＡＡＴＡＣＴＣ−３’ Ｔ Ｔ Ｇ Ｇ Ｇ Ｔ
【００２３】この方法により約２００００個のファージ
クローンの中から、上記のプローブとハイブリダイズす
るクローンを単離した。
クローンの中から、上記のプローブとハイブリダイズす
るクローンを単離した。
【００２４】これのクローンの中に挿入されているアス
ペルギルス・オリゼー由来のＤＮＡ断片を各種制限酵素
剤にて消化し、サザンブロット解析によりXbaI 5 kbp断
片中にヌクレアーゼＳ１遺伝子の全長が含まれているこ
とが明かとなった。このXbaI5 kbp断片をプラスミドベ
クターpUC118に連結し、pS1B2を得て、図１に示す如
く、当該挿入断片の制限酵素切断地図を作製した。
ペルギルス・オリゼー由来のＤＮＡ断片を各種制限酵素
剤にて消化し、サザンブロット解析によりXbaI 5 kbp断
片中にヌクレアーゼＳ１遺伝子の全長が含まれているこ
とが明かとなった。このXbaI5 kbp断片をプラスミドベ
クターpUC118に連結し、pS1B2を得て、図１に示す如
く、当該挿入断片の制限酵素切断地図を作製した。
【００２５】
【実施例２】 染色体ＤＮＡから単離したアスペルギルス・オリゼーの
ヌクレアーゼＳ１遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定
ヌクレアーゼＳ１遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定
【００２６】実施例１で得られたサブクローンpS1B2に
挿入されているヌクレアーゼＳ１遺伝子周辺の２．６ｋ
ｂｐのＤＮＡ塩基配列をジデオキシ法（Science, 214,
1295-1310(1981))により決定し、下記表１、表２、表３
で示される配列表の配列番号１に示されるＤＮＡ配列を
得た。このＤＮＡ配列は、アスペルギルス・オリゼーの
ヌクレアーゼＳ１遺伝子のコーディング領域およびその
介在配列の全部並びにコーディング領域に隣接する上流
および下流領域の一部のＤＮＡ配列を包含するものであ
る。
挿入されているヌクレアーゼＳ１遺伝子周辺の２．６ｋ
ｂｐのＤＮＡ塩基配列をジデオキシ法（Science, 214,
1295-1310(1981))により決定し、下記表１、表２、表３
で示される配列表の配列番号１に示されるＤＮＡ配列を
得た。このＤＮＡ配列は、アスペルギルス・オリゼーの
ヌクレアーゼＳ１遺伝子のコーディング領域およびその
介在配列の全部並びにコーディング領域に隣接する上流
および下流領域の一部のＤＮＡ配列を包含するものであ
る。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【表２】
【００２９】
【表３】
【００３０】
【実施例３】 アスペルギルス・オリゼーのヌクレアーゼＳ１を多量に
分泌生産するアスペルギルス・オリゼー形質転換体の作
製（１）
分泌生産するアスペルギルス・オリゼー形質転換体の作
製（１）
【００３１】実施例２に記載のヌクレアーゼＳ１ＤＮＡ
を含む３．２kbp NcoI, XbaI断片を、pUC118のHincIIサ
イトに連結したpNUCSにアスペルギルス・オリゼーのマ
ーカー遺伝子niaDを含む５．５kbpのHindIII断片を挿入
したアスペルギルス・オリゼーで複製可能なｐＮＳ（図
４）を作製した。挿入したNcoI, XbaI断片はヌクレアー
ゼＳ１のコーディング領域０．９６kbpとその上流部分
１．２kbpと下流部分１kbpを含んでおり、ヌクレアーゼ
Ｓ１の発現、転写に必要な領域はすべてこの断片中に存
在すると考えられたことにより、この断片を含むpNSを
アスペルギルス・オリゼーに移入することにより、ヌク
レアーゼＳ１を多量に分泌生産する形質転換体が得られ
ると予想される。そこで次のようにpNSのアスペルギル
ス・オリゼーへの移入を行った。
を含む３．２kbp NcoI, XbaI断片を、pUC118のHincIIサ
イトに連結したpNUCSにアスペルギルス・オリゼーのマ
ーカー遺伝子niaDを含む５．５kbpのHindIII断片を挿入
したアスペルギルス・オリゼーで複製可能なｐＮＳ（図
４）を作製した。挿入したNcoI, XbaI断片はヌクレアー
ゼＳ１のコーディング領域０．９６kbpとその上流部分
１．２kbpと下流部分１kbpを含んでおり、ヌクレアーゼ
Ｓ１の発現、転写に必要な領域はすべてこの断片中に存
在すると考えられたことにより、この断片を含むpNSを
アスペルギルス・オリゼーに移入することにより、ヌク
レアーゼＳ１を多量に分泌生産する形質転換体が得られ
ると予想される。そこで次のようにpNSのアスペルギル
ス・オリゼーへの移入を行った。
【００３２】アスペルギルス・オリゼーのｎｉａＤ３０
０株をＹＰＤ培地で３０℃、２０時間振とう培養した
後、得られた菌体を殺菌水で洗浄した。この菌体を細胞
壁溶解酵素液（０．２７Ｍ ＣａＣｌ2，０．６Ｍ Ｎ
ａＣｌ， ０．５％ Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）に懸濁し、３
０℃、２時間振とうすることによりプロトプラスト化を
図った。
０株をＹＰＤ培地で３０℃、２０時間振とう培養した
後、得られた菌体を殺菌水で洗浄した。この菌体を細胞
壁溶解酵素液（０．２７Ｍ ＣａＣｌ2，０．６Ｍ Ｎ
ａＣｌ， ０．５％ Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）に懸濁し、３
０℃、２時間振とうすることによりプロトプラスト化を
図った。
【００３３】得られたプロトプラストをガラスフィルタ
ーでろ過することにより残存する菌体を除去した。次に
このプロトプラスト４．０×１０7個を１．２Ｍソルビ
トール、５０ｍＭ ＣａＣｌ2、３５ｍＭ ＮａＣｌを
含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２００
μｌに懸濁し、これにｐＮＳを加え室温に２０分間放置
した後、２５０、２５０、８５０μｌのＰＥＧ溶液（６
０％ポリエチレングリコール４０００、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＣａＣｌ2を
含む）を徐々に添加し室温にて２０分間放置した。次に
プロトプラストを１．２Ｍソルビトールを含むツァペッ
ク・ドックス培地（０．３％ＮａＮＯ3、０．１％ＫＨ2
ＰＯ4、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２％ＫＣ
ｌ、０．００２％ＦｅＳＯ4、２％グルコース、２％寒
天、ｐＨ５．５）の平板上に塗布し、その上に１．２Ｍ
ソルビトールを含む０．７％寒天を重層し、３０℃で培
養した。
ーでろ過することにより残存する菌体を除去した。次に
このプロトプラスト４．０×１０7個を１．２Ｍソルビ
トール、５０ｍＭ ＣａＣｌ2、３５ｍＭ ＮａＣｌを
含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２００
μｌに懸濁し、これにｐＮＳを加え室温に２０分間放置
した後、２５０、２５０、８５０μｌのＰＥＧ溶液（６
０％ポリエチレングリコール４０００、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＣａＣｌ2を
含む）を徐々に添加し室温にて２０分間放置した。次に
プロトプラストを１．２Ｍソルビトールを含むツァペッ
ク・ドックス培地（０．３％ＮａＮＯ3、０．１％ＫＨ2
ＰＯ4、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２％ＫＣ
ｌ、０．００２％ＦｅＳＯ4、２％グルコース、２％寒
天、ｐＨ５．５）の平板上に塗布し、その上に１．２Ｍ
ソルビトールを含む０．７％寒天を重層し、３０℃で培
養した。
【００３４】ｐＮＳは硝酸を利用できない性質を相補す
る遺伝子を含んでおり、形質転換体は最小培地（ツアペ
ック・ドックス培地）で生育することができた。得られ
た形質転換体は小麦ふすま培地において３０℃で４日間
培養して得られた抽出液のヌクレアーゼＳ１活性を測定
した。その結果を第１表に示した。
る遺伝子を含んでおり、形質転換体は最小培地（ツアペ
ック・ドックス培地）で生育することができた。得られ
た形質転換体は小麦ふすま培地において３０℃で４日間
培養して得られた抽出液のヌクレアーゼＳ１活性を測定
した。その結果を第１表に示した。
【００３５】 第１表 形質転換体（Ａ）における菌体外ヌクレアーゼＳ１活性 ────────────────────────────────── ヌクレアーゼＳ１活性 活 性 比 （Ｕ／ｍｌ） （ＮＳ／ｎｉａＤ３００） ────────────────────────────────── 形質転換株（ＮＳ） ９００ ３．１ 親株（ｎｉａＤ３００） ２９０ １ ──────────────────────────────────
【００３６】上記のようにプラスミドｐＮＳでアスペル
ギルス・オリゼーを形質転換し、得られた形質転換体
（Ａ）は、Aspergillus oryzae NSと命名し、これを生
命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４５７２とし
て寄託した。
ギルス・オリゼーを形質転換し、得られた形質転換体
（Ａ）は、Aspergillus oryzae NSと命名し、これを生
命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４５７２とし
て寄託した。
【００３７】
【実施例４】 アスペルギルス・オリゼーのヌクレアーゼＳ１を多量に
分泌生産するアスペルギルス・オリゼー形質転換体の作
製（２）
分泌生産するアスペルギルス・オリゼー形質転換体の作
製（２）
【００３８】実施例２に記載のヌクレアーゼＳ１ＤＮＡ
を含む２ｋｂｐ XbaI,ClaI断片を、アスペルギルス・オ
リゼーで複製可能なベクターｐＵＮＧ１のＳｍａＩサイ
トに連結し、図５に示すｐＮＧＳを作製した。ｐＮＧＳ
はグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター領域１．１ｋ
ｂｐとヌクレアーゼＳ１のコーディング領域０．９６ｋ
ｂｐと下流部分１ｋｂｐを含んでおり、ヌクレアーゼＳ
１の発現、転写は強力でマルトースや澱粉により誘導す
ることができるグルコアミラーゼ遺伝子プロモーターの
支配のもとにヌクレアーゼＳ１が発現すると考えられた
ことにより、この断片を含むｐＮＧＳをアスペルギルス
・オリゼーに移入することにより、ヌクレアーゼＳ１を
多量に分泌生産する形質転換体が得られると、予想され
た。そこで実施例３と同様にしてｐＮＧＳのアスペルギ
ルス・オリゼーへの移入を行った。
を含む２ｋｂｐ XbaI,ClaI断片を、アスペルギルス・オ
リゼーで複製可能なベクターｐＵＮＧ１のＳｍａＩサイ
トに連結し、図５に示すｐＮＧＳを作製した。ｐＮＧＳ
はグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター領域１．１ｋ
ｂｐとヌクレアーゼＳ１のコーディング領域０．９６ｋ
ｂｐと下流部分１ｋｂｐを含んでおり、ヌクレアーゼＳ
１の発現、転写は強力でマルトースや澱粉により誘導す
ることができるグルコアミラーゼ遺伝子プロモーターの
支配のもとにヌクレアーゼＳ１が発現すると考えられた
ことにより、この断片を含むｐＮＧＳをアスペルギルス
・オリゼーに移入することにより、ヌクレアーゼＳ１を
多量に分泌生産する形質転換体が得られると、予想され
た。そこで実施例３と同様にしてｐＮＧＳのアスペルギ
ルス・オリゼーへの移入を行った。
【００３９】得られた形質転換体でＤＰＹ培地（２％デ
キストリン、１％ポリペプトン、０．５％イーストエキ
ス、０．５％ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ（ｐＨ５．５））において３０℃で６０時間振とう培
養して得られた培養ろ液のヌクレアーゼＳ１活性を測定
した。その結果を第２表に示した。
キストリン、１％ポリペプトン、０．５％イーストエキ
ス、０．５％ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ（ｐＨ５．５））において３０℃で６０時間振とう培
養して得られた培養ろ液のヌクレアーゼＳ１活性を測定
した。その結果を第２表に示した。
【００４０】 第２表 形質転換体（Ｂ）における菌体外ヌクレアーゼＳ１活性 ────────────────────────────────── ヌクレアーゼＳ１活性 活 性 比 （Ｕ／ｍｌ） （ＮＧＳ／ｎｉａＤ３００） ────────────────────────────────── 形質転換株（ＮＧＳ） １３５００ １０４ 親株（ｎｉａＤ３００） １３０ １ ──────────────────────────────────
【００４１】上記のようにプラスミドｐＮＧＳでアスペ
ルギルス・オリゼーを形質転換し、得られた形質転換体
（Ｂ）は、Aspergillus oryzae NGSと命名し、これを生
命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４５７１とし
て寄託した。
ルギルス・オリゼーを形質転換し、得られた形質転換体
（Ｂ）は、Aspergillus oryzae NGSと命名し、これを生
命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４５７１とし
て寄託した。
【００４２】
【発明の効果】本発明によってはじめてアスペルギルス
・オリゼー由来のヌクレアーゼＳ１遺伝子のクローン化
に成功し、そのヌクレオチド配列も解明された。
・オリゼー由来のヌクレアーゼＳ１遺伝子のクローン化
に成功し、そのヌクレオチド配列も解明された。
【００４３】また本発明においては、クローニングされ
た上記遺伝子をベクターに挿入して宿主の形質転換を行
うことにも成功したものである。従って、得られた形質
転換体を培養することによってヌクレアーゼＳ１を著量
製造することができる。これらの形質転換体を用いて、
培養することにより、これまで非常に少量の生産量のた
めに、非常に高価であったヌクレアーゼＳ１を、簡単な
培養により多量に生産することが可能であり、ＤＮＡや
ＲＮＡの構造解析のための利用のみならずその他の新規
の工業的利用の道が開かれ、その効果は卓越している。
た上記遺伝子をベクターに挿入して宿主の形質転換を行
うことにも成功したものである。従って、得られた形質
転換体を培養することによってヌクレアーゼＳ１を著量
製造することができる。これらの形質転換体を用いて、
培養することにより、これまで非常に少量の生産量のた
めに、非常に高価であったヌクレアーゼＳ１を、簡単な
培養により多量に生産することが可能であり、ＤＮＡや
ＲＮＡの構造解析のための利用のみならずその他の新規
の工業的利用の道が開かれ、その効果は卓越している。
【図１】プラスミドｐＳ１Ｂ２の制限酵素地図を示す。
【図２】本発明に係るヌクレアーゼＳ１遺伝子のＤＮＡ
配列を示す。
配列を示す。
【図３】同上続きを示す。
【図４】プラスミドｐＮＳの構造を示す。
【図５】プラスミドｐＮＧＳの構造を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:69）
Claims (5)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１に示すＤＮＡ。
- 【請求項２】 請求項１に記載したＤＮＡを含んでなる
こと、を特徴とするアスペルギルス・オリゼー形質転換
用ベクター。 - 【請求項３】 請求項２に記載したベクターをアスペル
ギルス・オリゼーに移入してなる、ヌクレアーゼＳ１酵
素生産能の上昇した形質転換体。 - 【請求項４】 該形質転換体が、アスペルギルス・オリ
ゼーＮＧＳ又はアスペルギルス・オリゼーＮＳであるこ
と、を特徴とする請求項３に記載の形質転換体。 - 【請求項５】 請求項３又は請求項４に記載の形質転換
体を培養し、培養物からヌクレアーゼＳ１を採取するこ
と、を特徴とするヌクレアーゼＳ１の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7039434A JP2685125B2 (ja) | 1995-02-06 | 1995-02-06 | 新規遺伝子、それを用いた形質転換体及びその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7039434A JP2685125B2 (ja) | 1995-02-06 | 1995-02-06 | 新規遺伝子、それを用いた形質転換体及びその利用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08205872A JPH08205872A (ja) | 1996-08-13 |
| JP2685125B2 true JP2685125B2 (ja) | 1997-12-03 |
Family
ID=12552901
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7039434A Expired - Lifetime JP2685125B2 (ja) | 1995-02-06 | 1995-02-06 | 新規遺伝子、それを用いた形質転換体及びその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2685125B2 (ja) |
-
1995
- 1995-02-06 JP JP7039434A patent/JP2685125B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J BIOCHEM 110=1991 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08205872A (ja) | 1996-08-13 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |