JPH02268685A

JPH02268685A - 新規遺伝子、ベクター、それを用いた形質転換体及びその利用

Info

Publication number: JPH02268685A
Application number: JP1086787A
Authority: JP
Inventors: Kojiro Takahashi; 康次郎高橋; Minoru Iimura; 飯村　穣; Katsuya Gomi; 勝也五味; Masamichi Hara; 原　昌道; Kiyoshi Yoshizawa; 吉沢　淑; Setsuzo Tada; 節三多田; Gakuzo Tamura; 田村　學造
Original assignee: JOZO SHIGEN KENKYUSHO KK; TAX ADM AGENCY; National Tax Administration Agency
Current assignee: JOZO SHIGEN KENKYUSHO KK; TAX ADM AGENCY; National Tax Administration Agency
Priority date: 1989-04-07
Filing date: 1989-04-07
Publication date: 1990-11-02

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）から得られ
た新規タカアミラーゼＡ遺伝子、これを含むベクター、
そのベクターをアスペルギルス・オリゼーに移入した形
質転換体及びその利用に関するものである。

本発明はタカアミラーゼＡ遺伝子のＤ　Ｎ　Ａ　Ｂｅ　
列を解明したものであり、この遺伝子を含むベクターを
移入したアスペルギルス・オリゼーは著量のタカアミラ
ーゼＡを生産することができるので、アスペルギルス・
オリゼーを利用する産業において重用されるものである
。

（従来技術及びその問題点）一般に、タカアミラーゼＡは、アスペルギルス・オリゼ
ーの生産するα−アミラーゼであり、デンプンのα−１
、４結合をエンド型に加水分解することができる。この
性質により、酒類醸造をはじめ．水飴製造、製パン、製
紙業あるいは製菓業等の工程で広く利用されている。

従来からタカアミラーゼＡはよく研究され、このタンパ
ク質については４７８のアミノ酸からなる糖タンパク質
であることが明らかにされ、そのアミノ酸の一次配列は
戸田らが明らかにしている（Ｐｒｏ、　Ｊａｐａｒ４　
Ａｃ１ｄ、、　ｖｏｌ、５８．２０８−２１２）。

しかしながら、アミノ酸配列を一義的に決定するところ
の遺伝子は得られておらず、従ってそのＤＮＡ配列も明
らかでない。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、アスペルギルス・オリゼーのゲノムＤＮ
Ａの制限酵素による切断断片から、タカアミラーゼＡを
コードするＤＮＡ断片をクローン化し、その塩基配列を
決定した。このＤＮＡ断片を組込んだアスペルギルス・
オリゼーの宿主−ベクター系を利用してアスペルギルス
・オリゼーに移入することにより、タカアミラーゼＡ活
性が６倍に上昇した形質転換体を得ることができ、本発
明を完成するに到った。

本発明は（１）アスペルギルス・オリゼーから単離したタカアミ
ラーゼＡ遺伝子のプロモーター、ターミネータ−及び蛋
白質コード領域のＤＮＡ配列及び介在配列を含むＤＮＡ
配列。

（２）この（１）のタカアミラーゼＡ遺伝子のＤＮＡ配
列を連結したアスペルギルス・オリゼーのベクター（３）　（２）のベクターをアスペルギルス・オリゼー
に移入することによって得られる。タカアミラーゼＡ生
産能の上昇した形質転換体。

（４）　（３）の形質転換体を用いることを特徴とする
タカアミラーゼＡの製造法。

（５）　（３）の形質転換体を用いることを特徴とする
酒類、アルコール等の製造法。

である。

（詳細な説明）本発明に用いたゲノムＤＮＡの供与体はアスペルギルス
・オリゼーであり、具体的には、例えばＲＩＢ４０株で
ある。

本菌体からゲノムＤＮＡを抽出するには、例えば１蚤Ｂ
ｉｏ１．　Ｃｈｅｗ、、　Ｖｏｌ、５１．３２３−３２
８（１９８７）に記載された。アスペルギルス・オリゼ
ーの染色体ＤＮＡの抽出に関する方法に準じて行なわれ
る。

次に、得られたゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で処理し
１部分分解を行い、　１０Ｋｂｐ〜２０Ｋｂｐの断片を
得る。同じ接着末端を生じさせる制限酵素で処理したフ
ァージに上記で得られたＤＮＡ断片を挿入して染色体シ
ーンライブラリーを作製する。当該ファージとしてはＥ
ＭＢＬ３　（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　Ｖｏｌ。

１７０、８２７−８４２（１９８３））が用いられる。

また、サブクローンには、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙ＋ｓｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、１５３゜３〜１１（１
９８７）に記載のｐＵｃ１１８を用いた。

上記で得られた染色体シーンライブラリーからの当該遺
伝子の単離にあたっては、タカアミラーゼＡ酵素のアミ
ノ酸−次配列に基づいて合成オリゴマーＤＮＡを作成し
、それをプローブに用いてプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行い、タカアミラーゼＡ遺伝子のＤＮＡをクロー
ニングする。

得られたＤＮＡ断片は第１図のＤＮＡ配列を有していた
。

上記で得られたＤＮＡ断片をアスペルギルス・オリゼー
のベクターとして例えばＡＲＧＢ遺伝子をマーカーに持
つｐｓａ１２３　（７，８ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　Ｖ
ｏｌ。

５３、２５４９〜２５５５（１９８７））に挿入し、得
られたＤＮＡを出港欠損株のアスペルギルス・オリゼー
に移入し形質転換体を得る。吐１欠損株として、具体的
にはト２−３株（ハＬ匡、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、
　Ｖｏｌ、５３．２５４９〜２５５５（１９８７））が
挙げられる。形質転換方法としては公知の方法、例えば
７．　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　Ｖｏｌ。

５１、３２３〜３２８（１９８７）に記載された方法あ
るいはこれに準じた方法がとられる。

後述の実施例で製造された形質転換体（ＴＦ７０１）は
ＦＥＲＭ　Ｐ−１０５４８として微工研に寄託されてい
る。

次に上記で得られた形質転換体が、タカアミラーゼＡ生
産能が上昇することの確認方法を記載する。

即ち、形質転換体をデンプンを唯一の炭素源とする培地
で培養し、得られた培養液中に含ま九る酵素の可溶性デ
ンプン分解力を測定する。酵素活性の測定は公知の方法
例えば国税庁所定分析法注解に記載の方法による。

こうして、形質転換体（ＴＦ７０１）を培養することに
より、タカアミラーゼＡを効率よく製造できる。

また、形質転換体（ＴＦ７０１）を蒸米水で生育させ、
分生胞子を形成させ、得られた分生胞子を用いて公知の
方法により、米麹を製造し、これに水、酵母及び蒸米を
加え、糖化、発酵させることにより、酒類、エタノール
類等を製造することができる。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１染色体ＤＮＡのシーンライブラリーの作成アスペルギル
ス・オリゼーＲＩＢ４０の菌糸をデキストリン・ペプト
ン培地（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０，５
％にｕ、ｐｏ、、　ｏ、ｉ、％ＮａＮＯ３，０，０５％
Ｍｇ５Ｏ４）　２００ｍＱに接種し、３０℃、５０時間
回転振盪培養後、得られた菌体を３Ｇ１ガラスフイルタ
ーで集めた。次にこの菌体をプロトプラスト調製用溶液
（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）、　５．０％Ｍ
ａｉｌ）に懸濁し、３５℃、２時間振盪して、細＃Ａ壁
を溶解することによりプロトプラスト化した。得られた
プロトプラストを３００Ｏｒｐｍ、１０分間の遠心分離
で集め、５％ＮａＣ１溶液で洗浄後、５％ＳＤＳを含む
５０ｍＭＴｒｉｓｉ（Ｃ１緩衝液（ｐＨａ、ｏ）に懸濁
し、溶菌した。得られた溶菌液を１５００Ｏｒｐｍ、１
０分間冷却遠心分離後、上清を取得した。その上清を等
量のフェノール・クロロホルム混合液で続けて２回処理
して、夾雑するタンパク質を除去後、２倍容の冷エタノ
ールを加え核酸分を沈澱させた。この沈澱を凍結乾燥後
、ＴＥ温溶液溶解し、ＤＮＡ溶液とした。得られたＤＮ
Ａを制限酵素５ａｕ３Ａ１で部分分解し、約１０〜２０
　Ｋｂｐの断片を得た。この断片をファージλＥＭＢＬ
３−Ｂａｍｔ（Ｉアーム（東洋紡（株））に丁４リガー
ゼを用いて連結し、得られたファージＤＮＡをｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏパッケージングキット（東洋紡（株）販売）を
用いてパッケージング後、　Ｅ、　ｅｏｌｉ　０３５９
株に感染させ、染色体ＤＮＡのシーンライブラリーを作
製した６実施例２染色体ＤＮＡのシーンライブラリーからのタカアミラー
ゼＡ（以下、ＴＡＡともいう）遺伝子のクローニング実施例１に記載のシーンライブラリーに保存されたファ
ージプラークから、プラークハイブリダイゼーションに
よりＴＡＡ遺伝子を含むクローンの選択を行なった。こ
の一連の操作は常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｉｇ、　ｐｐ６３−６７、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌ
（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２））
によった、プラークハイブリダイゼーションに用いたプ
ローブは次の配列を持つ合成オリゴマーＤＮＡを３ｚＰ
で放射能標識したものである。

５’ＧＧＩＡＴＧＧＧＩＴＴＩＡＣＩＧＣＩＡＴＩＴＧ
ＧＡＴ　３’５’　ＧＡＩＧＧＩＡＡＩＧ丁ＩＣＣＩＧ
ＴＩＣＣＩＡＴＧＧＣ３’なお、Ａはデオキシアデノシ
ン３′−リン酸、Ｃはデオキシシトシン３′−リン酸、
Ｇはデオキシグアノシン３′−リン酸、Ｔはデオキシチ
ミン３′−リン酸、Ｉはデオキシイノシン３′−リン酸
である。

約２００００個のプラークから、上記２種類のプローブ
共にハイブリダイゼーションするクローンが２個選択で
きた。これらのクローンの中に挿入されているアスペル
ギルス・オリゼー由来のＤＮＡ断片を各種制限酵素で消
化し、上記のプローブを用いてサザンハイプリダイゼー
シコンを行なったところ、ＥｅｏＲＩで消化して得られ
た断片の中に上記のプローブ全てにハイブリダイゼーシ
ョンの見られる３、７ＫｂｐのＤＮＡ断片を得た。この
ＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＵｃ１１８に連結し
、サブクローンｐＵｃ１１８−２６７を得て、第２図に
示す如く、当該挿入断片の制限酵素切断地図を作製した
。

実施例３染色体ＤＮＡから単離したアスペルギルス・オリゼーの
タカアミラーゼＡ（ＴＡＡ）遺伝子のＤＮＡ配列実施例２で得られたｐＵｃ２２８−２６７に挿入されて
いるアスペルギルス・オリゼー由来の３．７ＫｂｐＥｃ
ｏＲＩ断片中のＴＡＡ遺伝子領域のＤＮＡ配列を次の方
法により決定した。

先ずＧｅｎｅ、　Ｖｏｌ、２８．３５１−３５９（１９
８４）及びＧｅｎｅ。

Ｖｏｌ、３３．１０３−１１９（１９８５）の方法に従
ってｐＵｃ　１１８−２６７中の３，７Ｋｂｐ挿入断片
をエキソヌクレアーゼＩＩＩ及び、マングビーンヌクレ
アーゼで処理して短鎖化し、熱該挿入断片の一部が脱落
し、異なる鎖長を持った種々のクローンを作製した。こ
の過程ではキロシーフェンス用デレージョンキット（宝
酒造■）を使用した。得られた種々のクローンの挿入断
片にライてジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１４．１
２０５−１２１０（１９８１）によりα−’　”　Ｐｄ
ＣＴＰを用いてＤＮＡ配列を決定した。なお、この決定
にはＭ１３シークエンスキット（宝酒！ｆ４１３）を用
いた。その結果、アスペルギルス・オリゼーのＴＡＡ遺
伝子の蛋白質コード領域及び介在配列の全部並びにコー
ド領域に隣接する上流及び下流領域の一部のＤＮＡ配列
について第１図に示す配列が見いだされた。

実施例４活性アスペルギルス・オリゼータ力アミラーゼＡ（ＴＡ
Ａ）を分泌生産するためのアスペルギルス・オリゼーで
機能するベクターの構築。

実施例２で述べたＰＵＣｌ　１８−２６７のアスペルギ
ルス・オリゼー由来の３．７ＫｂｐＥｅｏＲＩ断片（ア
スペルギルス・オリゼーのＴＡＡ遺伝子を含むと思われ
、以下配列Ａともいう）をアスペルギルス・オリゼーで
複製可能なベクターｐｓａ１２３　（ハニｉｅ、　Ｂｉ
虹、ハ憇、。

Ｖｏｌ、５１．３２３〜３２８　（１９８７）　）に次
の方法で連結した。

ｐＬｌｃ１１８−２６７ＤＮＡ　１　μｇをＥｅｏＲＩ
制限＃素で消化した後、１％アガロースゲル電気泳動に
がけ、３．７ＫｂＰＤＮＡを分離精製し、ＴＥ溶液（１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１ｓＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ
７，５）に溶解した。一方、ｐｓａ１２３ＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩ制限酵素で消化した後、細菌アルカリホスファタ
ーゼ（ＢＡＰ）で処理し、５′末端のリン酸を除去して
ｐＳａ　１２３の自己連結を防ぎながら上記の３．７Ｋ
ｂｐ　ＤＮＡ断片とＴ４リガーゼを用いて連結し。

第３図に示すベクターＰＩ’１ＡＡ１、及び挿入方向の
逆転しているｐ、ＲＡＡ２を作製した。このベクターは
ｌｌ：、ｃｏｌｉ用ベクターｐＢＲ３２７由来ＤＮＡを
含み、Ｅ、ｃｏｌｉに移入することにより抗生物質アン
ピシリンに耐性な形質転換体を作製し、これを用いてベ
クターＤＮＡを大量に取得することができる。

実施例５タカアミラーゼＡを高度に分泌生産するアスペルギルス
・オリゼー形質転換体の作製実施例４で述べたベクターｐＲＡＡ１及びＰＲＡＡ３に
挿入されている３、７にｂｐのアスペルギルス・オリゼ
ー由来ＤＮＡ断片には、タカアミラーゼＡを発現、分泌
生産するのに必要な情報が含まれていると予想される。

そこで次のようにこれらのベクターのアスペルギルス・
オリゼーへの移入を行なった。

アスペルギルス・オリゼーのアルギニン要求性株（肛１
）をデキストリン・ペプトン培地（デキストリン２％、
ポリペプトン１％、ＫＨ，ＰＯ４０，５％。

ＮａＮ０．　ｏ、ｉ％、及びＭｇ５０４０．０５％をふ
くむ）で３０℃。

４８時間振盪培養した後、得られた菌糸を無菌水で洗浄
した。この菌糸を細胞壁溶解液（ｐＨ６，０，５０−Ｎ
リン酸緩衝液、５，０％ＮａＣ１，０，５Ｂ／ｌＱニス
コピア酵素を含む）に懸濁し、３０℃、２時間振盪する
ことによりプロトプラスト化を図った。得られたプロト
プラストをガラスフィルターで濾過することにより残存
する菌糸を除去した０次にこのプロトプラスト１．０Ｘ
１０”個を５．０％Ｎａ１ｌ及び１０ｍＭ　ＣａＣ１ｚ
を含む５０％Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）　１
００μｇに懸濁し。

これにｐＲＡＡｌあるいはｐＲＡＡ２のＤＮＡｌ０μＱ
を加え水中に２０分放置した後、等量のＰＥＧ溶液（７
０％ポリエチレングリコール４０００．５０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、　１０ｍＭ　ＣａＣｌ２
を含む）を添加し室温に２０分放置した。得られたプロ
トプラストを５％ＮａＣ］−で洗浄後５．０％ＮａＣ１
を含むツアペック・ドックス培地（ＮａＮ０．０．２％
、　Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、　Ｍｇ５０４−７Ｈ２００
−０５％、　ＫＣＩ　Ｏ，０５％、　Ｆｅ５０４０．０
０１％、グルコース２％、ｐ、Ｈ５，５）　ノ平板上に
塗布し、その上に５．０％ＮａＣ１及び０．５％寒天を
含むツアペック・ドックス培地を重！し、３０℃で培養
した。ｐＲＡＡｌ及びｐＲＡＡ２はアルギニン要求性を
相補する遺伝子を含んでおり、形質転換体は最小培地（
ツアペック・ドックス培地）で生育することができた。

得られた形質転換体を、炭素源をグルコースの代わりに
２％殿粉を用いたツアペック・ドックス培地で、３０’
Ｃで７２時間振盪培養して得られた培養液中のタカアミ
ラーゼＡ活性を測定した。結果を第１表に示した。

Ｍ−２−３Ｍ−２−３５ａ１２３ＰＲＡＡＩｐＲＡＡ２２．３　　　　　　　　　８２００１．０　　　　　　　　１７０００１．９　　　　　　　　４９０００２．５　　　　　　　　１３２００２．５　　　　　　　　１．７４００２．１　　　　　　　　１４７００２．３　　　　　　　　２９８００１．９　　　　　　　　３２１００３．６　　　　　　　　２１４００

【図面の簡単な説明】

第１図はタカアミラーゼＡ遺伝子の塩基配列を示し、第
２図は実施ｆｓ２　’ｔ’得りｐＬｌｃ１１８−２６７
ノ制限酵素切断地図を示し、第３図は実施例４で得たＰ
ＲＡＡＩ（Ａ）及びｐＲＡＡ（Ｂ）の制限酵素切断地図
を示す。代理人　弁理士　戸　１）親　男第２図第１図

Claims

【特許請求の範囲】１）アスペルギルス・オリゼーから単離したタカアミラ
ーゼＡ遺伝子のプロモーター、ターミネーター及びタン
パク質コード領域のＤＮＡ配列。２）特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含んだア
スペルギルス・オリゼーのベクター。３）特許請求の範囲第２項記載のベクターをアスペルギ
ルス・オリゼーに移入することによって得られたタカア
ミラーゼＡ酵素生産能の上昇した形質転換株。４）特許請求の範囲第３項記載の形質転換株を用いるこ
とを特徴とするタカアミラーゼＡ酵素の製造法。５）特許請求の範囲第３項記載の形質転換株を用いるこ
とを特徴とする酒類、アルコール等の製造法。