JPH04148683A

JPH04148683A - 新規遺伝子、ベクター、それを用いた形質転換体およびその利用

Info

Publication number: JPH04148683A
Application number: JP2269416A
Authority: JP
Inventors: Yoji Hata; 洋二秦; Gakuzo Tamura; 田村　學造; Katsuhiko Kitamoto; 勝ひこ北本; Katsuya Gomi; 勝也五味; Chieko Kumagai; 熊谷　知栄子; Masamichi Hara; 原　昌道
Original assignee: JOZO SHIGEN KENKYUSHO KK; TAX ADM AGENCY; National Tax Administration Agency
Current assignee: JOZO SHIGEN KENKYUSHO KK; TAX ADM AGENCY; National Tax Administration Agency
Priority date: 1990-10-09
Filing date: 1990-10-09
Publication date: 1992-05-21
Anticipated expiration: 2010-06-21
Also published as: JPH0757194B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、アスペルギルス・オリゼーから得られた新規
グルコアミラーゼ遺伝子、これを含むベクター、そのベ
クターをアスペルギルス・オリゼーまたはサッカロミセ
ス・セレビシアエに移入した形質転換体及びその利用に
関するものである。

アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼは産業上
重要な酵素であり、本発明によって得られた形質転換体
は本酵素を著量に生産し、これら本酵素を用いる産業界
に大いに貢献するものである。

（従来技術およびその問題点）一般にグルコアミラーゼは、糖化型アミラーゼないしア
ミロ−１，４′−グルコシダーゼともいわれ、澱粉を非
還元末端からグルコース単位で分解する酵素であって、
酒類醸造や糖類製造等の産業において澱粉を糖化する工
程において広く利用されている（「化学大辞典１」共立
出版（昭４２−９−１０）ｐ、３０２）。

清酒醸造や味噌、醤油製造においては、アスペルギルス
・オリゼーを麹と呼ばれる固体培養を行って得られるグ
ルコアミラーゼを利用している。

特に清酒醸造においては本酵素の生産性は非常に重要で
、培養において本酵素の生産量が低い場合すなわち、本
酵素力価の低い麹は、その後の発酵工程に悪影響を及ぼ
す。従って、本酵素の高生産を計るため、培養方法の検
討や菌株の育種等の努力が重ねられてきた。

従来の菌株育種法は主に、紫外線や変異誘発剤によって
得られる変異株から選択する方法に限られている。しか
しながらこれらの育種方法は、安定な変異体を単離する
のが困難である、グルコアミラーゼのみが高生産になら
ず、褐変性やプロテアーゼカ価が高くなるなど好まざる
形質が伴う場合が多い、などの欠点を有している。その
結実現在までにグルコアミラーゼの生産性のみが上昇し
た実用菌株の育種は成功していない。

（問題点を解決するための手段）本発明は、上記問題点を解決するためになされたもので
あって、グルコアミラーゼのみを著量生産する微生物を
開発する目的でなされたものである。

そして上記目的達成のため各方面から検討した結果、目
的とする微生物を創製するには、古典的な変異法よりは
遺伝子を直接使用する遺伝子操作による方法が好適であ
るとの観点にたった。

この観点にたち、グルコアミラーゼ生産菌として多用さ
れているアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ
遺伝子に着目した。そして研究、検討を重ねた結果、同
菌由来の染色体ＤＮＡライブラリーを作成し、更にまた
同菌のｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを用いてｃＤＮＡ
ライブラリーを作成し、これら双方のライブラリーから
目的とするグルコアミラーゼをコードする遺伝子をそれ
ぞれクローニングするのに成功した。

そして更に、これらクローン化するのに成功したグルコ
アミラーゼをコードする遺伝子を有する染色体ＤＮＡ断
片及びｃＤＮＡについて、これらをアスペルギルス・オ
リゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）やサ
ツカロミセス０セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）といった宿主ベクター系に
移入することにも成功し、得られた形質転換体において
これらの遺伝子がいずれも発現することも確認した。

すなわち、本発明者らはアスペルギルス・オリゼーのグ
ルコアミラーゼ遺伝子に着目し、アスペルギルス・オリ
ゼーのゲノムＤＮＡ制限酵素断片よりグルコアミラーゼ
をコードするＤＮＡ断片をクローン化し、これをアスペ
ルギルス・オリゼーの宿主ベクター系に移入することに
よりグルコアミラーゼを著量生産する形質転換体（Ａ）
を得ることに成功した。ここで得られた形質転換体（Ａ
）はＦＥＲＭＰ−１１７２８として微工研に寄託されて
いる。

さらに、アスペルギルス・オリゼーの全ｍＲＮＡをＷＲ
製し、これに基すいてｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライ
ブラリーを作製し、その中からアスペルギルス・オリゼ
ーのグルコアミラーゼをコードするクローンを分離する
ことができた。そして、このｃＤＮＡを発現ベクターに
連結した後サッカロミセス・セレビシアエに移入するこ
とにより、アスペルギルス・オリゼーと同等のグルコア
ミラーゼを生産する形質転換体（Ｂ）を得ることにも成
功した。ここで得られた形質転換体（Ｂ）はＦＥＲＭ　
Ｐ−１１７２９として微工研に寄託されている。

また、ここに得られた形質転換体（Ａ）を用いて、清酒
醸造を行なったところ、従来の菌株と比較して麹使用量
が減少し、粕歩合が低下し、原料コストを大きく減少さ
せることが可能となった。さらに、形質転換体ＣＢ）を
用いることにより澱粉原料から直接アルコール醗酵が可
能となることも確認した。

本発明は、これらの新知見に基づき、更に検討の結果完
成されたものであって、その態様を例挙すれば次のとお
りである。

（１）アスペルギルス・オリゼーから単離したプロモー
ターを含むグルコアミラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列。

（２）この（１）のグルコアミラーゼ遺伝子のＤＮＡ配
列を連結したアスペルギルス・オリゼーのベクタ（３）
　（２）のベクターをアスペルギルス・オリゼーに移入
することによって得られる高グルコアミラーゼ分泌能を
有する形質転換体。

（４）アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼの
ｅＤＮＡ配列。

（５）　（４）のｃＤＮＡを含むサッカロミセス・セレ
ビシアエのグルコアミラーゼを分泌させるベクター（６
）　（５）のベクターをサッカロミセス・セレビシアエ
に移入することによって得られるアスペルギルス・オリ
ゼーのグルコアミラーゼを分泌生産する形質転換体。

（７）　（３）あるいは（６）の形質転換体を用いるこ
とによって酒類、アルコール等を製造する方法。

（８）　（３）あるいは（６）の形質転換体を用いるこ
とによってグルコアミラーゼを効率的に著量製造する方
法。

以下、本発明について詳しく説明するが、本発明に用い
た染色体ＤＮＡ、　　ｍＲＮＡおよびグルコアミラーゼ
酵素の供与体はアスペルギルス・オリゼーであり、具体
的には例えばＲＩＢ　４０株である。

まず本発明においては、本菌株の精製グルコアミラーゼ
を得るため、例えば精白米と本菌株の分生胞子を用いて
固体麹を調製する。得られた固体麹からグルコアミラー
ゼを精製するには、例えばＡｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅｗ、、　Ｖｏｌ、５２．１７０７−１７１１　（
１９８９）に記載されたアスペルギルス・オリゼーのグ
ルコアミラーゼの精製に関する方法に準じて行なわれる
。

次に、得られた精製グルコアミラーゼをＪ、　Ｂｉｏｌ
。

９μｍ、並、　３０５−３１８（１９８５）に準じてリ
シルエンドペプチダーゼによって消化し、さらに逆相高
速液体クロマトグラフィーによりペプチド断片を分離回
収する。得られたペプチド断片をＪ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２５６．７９９０（１９８１）に準じてＡ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の自動ペプチ
ドシーケンサ−ＭＯＤＥＬ　４７０Ａにて、そのアミノ
酸配列を決定する。得られたアミノ酸配列に基すいてオ
リゴＤＮＡを合成し、これを後述のプラークハイブリダ
イゼーションのプローブとして使用する。

また澱粉を唯一炭素源とした培地で培養したアスペルギ
ルス・オリゼーの菌体よりＡｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ。

０μｍ、、　５４．１９０５（１９９０）に記載された
方法によりｍＲＮＡを抽出し、Ｇｅｎｅ、　Ｖｏｌ、　
２５．２６３−２６９（１９８３）の記載の方法にてｃ
ＤＮＡを合成し、５ｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ、　２２２゜
７７８−７８２（１９８３）　１７）方法テファージＤ
ＮＡ　λｇｔ　１−０　ニ挿入し、ｉｎν１ｔｒｏパッ
ケージを行なってｃＤＮＡのライブラリーを作製する。

上記で得られたオリゴＤＮＡをプローブとしてこのｃＤ
ＮＡライブラリーよりプラークハイブリダイゼーション
法によりグルコアミラーゼｃＤＮＡをクローニングする
。単離したグルコアミラーゼｃＤＮＡの中で、最も塩基
対の長さが長いものは第１図の塩基配列を有していた。

次に、得られたアスペルギルス・オリゼーのグルコアミ
ラーゼｃＤＮＡをサッカロミセス・セレビシアエの発現
ベクター、例えば酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（用
圓）プロモーターを持つ酵母発現ベクターｐＹｃＤＥ！
あるいはｐＡＡＨ５に挿入し、サッカロミセス・セレビ
シアエに移入することにより、それぞれ形質転換体（Ｂ
、Ｉ）あるいは（Ｂ２１）を作製する。形質転換法とし
ては公知の方法例えばＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　
Ｖｏｌ、　１５３．１６３−１６８（１９８３）に記載
されている方法あるいはそれに準じた方法がとられる。

この方法により形質転換体（Ｂ）を得る。

上記で得られた形質転換体がアスペルギルス・オリゼー
と同一のグルコアミラーゼを生産するがどうかを確認す
るには、次に記載の方法によって行なうことができる。

先に記述した精製グルコアミラーゼを抗原として、ウサ
ギ等を用いてポリクローナル抗体を作製する。この抗体
と形質転換体の培養液中の蛋白質との抗原−抗体反応を
公知の方法例えばウェスタンブロッティング法によって
判定する。

次にアスペルギルス・オリゼーＲＩＢ　４０株より染包
体ＤＮＡを、例えばＡ　ｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
Ｉｌ、、　Ｖｏｌ、　５１゜３２３−３２８（１９８７
）に記載された方法に準じて抽出し、Ａ　ｒｉｃ、　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、　５３．５９３（１
９８９）に準じて染色体シーンライブラリーを作製する
。この染色体シーンライブラリーより、先に単離したグ
ルコアミラーゼｃＤＮＡをプローブとしてグルコアミラ
ーゼ染色体遺伝子を単離する。得られたＤＮＡ断片は第
２図のＤＮＡ配列を有していた。

上記で得られたＤＮＡ断片をアスペルギルス・オリゼー
のベクターとして例えばａｒｇ　Ｂ遺伝子をマーカーに
持つｐＲＧＢｌ（Ａ　ｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ
、、　Ｖｏｌ。

５３、２５４９−２５５５（１９８７））　　に挿入し
、得られたＤＮＡを部欠損株のアスペルギルス・オリゼ
ーに移入し形質転換体を得る。ａｒｇＢ欠損株として具
体的にはＭ−２−３株（Ａ　ｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、５３．２５４９（１９８９））が
あげられる。形質転換方法としては、公知の方法例えば
Ａ　ｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、　Ｖｏｌ
、５１゜３２３−３２８（１９８７）に記載された方法
あるいはこれに準じた方法がとられる。この方法によっ
て形質転換体（＾）を得る。

次に、形質転換体（Ａ）を蒸米上で生育させ、分生胞子
を形成させ、得られた分生胞子を用いて公知の方法によ
って米麹を製造し、これに水、酵母および蒸米を加え１
発酵させることにより、酒類、エタノール等を製造する
。

形質転換体（Ａ）は、　そのグルコアミラーゼ力価が非
常に高く、糖化力のすぐれた麹が得られるので、酒類、
エタノール等を短期間に効率よく製造することができる
。

また、形質転換体（Ｂ）を用いることにより、グルコア
ミラーゼ等の糖化酵素を加える事なく、サッカロミセス
・セレビシアエによる澱粉から直接アルコール醗酵を行
なうことが可能である。したがって、形質転換体（Ｂ）
を例えばカラム壁部に固定したり、ビーズにこれを固定
化した後カラムに充填したりしておき、カラムの一方か
ら澱粉等の基質を流入せしめれば他方からエタノール等
を得ることができ、エタノール製造用バイオリアクタと
しても利用することができる。スケールアップも可能で
あるので、本発明はアルコールの工業的製造にも利用す
ることができ、飲用のみならず燃料等エネルギーの面で
の貢献も大いに期待することができる。

当然のことながら、形質転換体（Ａ、　Ｂ）は、常法に
したがってこれを培養することによって、グルコアミラ
ーゼを多量分泌生産するので、培養物から酵素を分離採
取すれば、酵素を効率よく製造することができ、発酵工
業のみならず、食品工業、医薬品工業その他各種の工業
において様々な用途に利用することができる。本発明に
よれば酵素は菌体外に分泌されることが多いので、酵素
の分離採取が容易となり、この点においてもすぐれてい
る。

次に１本発明の実施例を示す。

実施例１アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ　４０株の分生胞子約
１ｅ個を蒸米１ｋｇに接種し、３７℃で４４時間培養し
た。培養を終了した米麹に対して、２Ｑの抽出バッファ
ー（１％ＮａＣｌ１．１０ｍＭ　Ａｃｅｔａｔｅ　ｂｕ
ｆｆｅｒ（ｐＨ５，０））を加え、　４℃にて１６時間
放置した後、トーヨー濾紙Ｎｃｉ５Ａにてろ過した。得
られたろ液をトーソー製ＤＥＡＥ−トヨバール６５０Ｓ
にロードし、Ｏ−０，５ＭＮａＣＱの直線的グラジェン
トにて溶出し、グルコアミラーゼ活性を有する両分を集
めた。

このグルコアミラーゼ画分を限外ろ過装置にて濃縮し、
グルコアミラーゼインヒビターであるアカボースを固定
化したアフィニティーカラムにロードした。グルコアミ
ラーゼをこのカラムに吸着させた後、カラムを１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７，０）によ
って十分洗浄後、溶出バッファー（０，５Ｍ　Ｍａｌｔ
ｏｓｅ、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱｂｕｆｆｅｒ　
（ｐＨ７，０））にて吸着したグルコアミラーゼをカラ
ムから溶出した。溶出液を凍結乾燥することにより、最
終的に精製グルコアミラーゼを２００ｍｇ得た。

得られた精製グルコアミラーゼ２Ｂをｌｌｌ１ｆｌの８
Ｍｕｒｅａ、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＱ（ｐＨ７
，０）に溶解し、３７℃にて１０分間保温し、グルコア
ミラーゼ蛋白を変性させる。変性した蛋白溶液に５μｇ
のりシルエンドペブチダーゼを−含む１ｍＱの１００ｍ
Ｍ　Ｃ１ｔｒａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４）を加え、
３７℃にて６−８時間保温し、グルコアミラーゼ蛋白を
ペプチド断片に分解した。これを１００℃、１０分間加
熱した後、逆相高速液体クロマトグラフによって各ペプ
チド断片を分離回収した。このペプチド画分を濃縮し、
気相式自動ペプチドシーケンサ−（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　ＭＯＤＥＬ３７０Ａ）によって
、そのＮ末端付近のアミノ酸配列を決定した。

得られたペプチド断片のアミノ酸配列と、・それから類
推して合成したオリゴＤＮＡプローブの塩基配列を、以
下に示す。

Ｐｒｏｂｅ　　＃　ＩＨｉｓＡ　５ｐＰｒｏＡｓｐＴｙｒＰｈｅＴｙｒ　Ｔｈ
ｒＴｒｐＴｈｒＡｒｇＡ　ｓｐＡ　１ａＧ　１ｙＬｅｕ
ＧＡＣＴＡＣＴＴＣＴＡＣＡＣＧＴＧＧＡＣＴＴＴＴＰｒｏｂｅ　　＃　２ −−　ＧｌｙＡｒｇＰｒｏＧｌｎＡｒｇＡｓｐＧｌｙＰ
ｒｏＡｌａＧＧＧＡＧＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＧＡＴＧＧ
ＧＣＣＧＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ実施例２ｃＤＮＡライブラ！−からグルコアミラーゼｅＤＮＡの
クローニング実施例１に記載のオリゴＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチド
・キナーゼにより３３Ｐ放射能ラベルしたものをプロー
ブとして、アスペルギルス・オリゼーのλｇｔ　１０を
用いたファージライブラリーよりプラークハイブリダイ
ゼーション法によりグルコアミラーゼｅＤＮＡの選択を
行なった。一連の操作はＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ、　ｐｐ６３−６７、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　１（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）
に記載の常法によった。約１００００個のファージクロ
ーンより２種類のプローブ両方にハイブリダイズするク
ローン３個を選択した。

その中で最もインサートＤＮＡサイズの長いクローンよ
りインサートｃＤＮＡ（２，１ｋｂｐ）を切り出し、こ
れをプラスミドベクターｐＵｃ１１８に連結しｐＵｃ−
ｃＧＡを得た。

実施例３アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼｃＤＮＡ
のコーディング　　のＤＮＡ塩基　　の実施例２に記載
のｐＵｃ−ｃＧＡに挿入されている２、１ｋｂｐのアス
ペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼｃＤＮＡのＤ
ＮＡ塩基配列を次の方法にて決定した。

まずＧｅｎｅ、　Ｖｏｌ、　２８．３５１−３５９（１
９８４）の方法に従ってｐＵｃ−ｃＧＡ上の２．１ｋｂ
ｐ挿入部分をエキソヌクレアーゼ■及び、マングビーン
ヌクレアーゼで処理して短鎖化し、当該挿入部分の一部
が脱落し、異なる鎖長を持った種々のクローンを作製し
た。この過程ではキロシーフェンス用デレージョンキッ
ト（全酒造（株））を使用した。得られた種々のクロー
ンの挿入断片について、ジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ
。

２１４、１２９５−１３１０（１９８１））によりＤＮ
Ａ塩基配列を決定した。その結果、第１図に示すグルコ
アミラーゼｃＤＮＡのコーディング領域のＤＮＡ配列を
得た。この全塩基配列は１８３６ｂｐであり、Ｎｅｔで
始まる６１２個のアミノ酸からなるペプチドをコードす
る。

実施例４讃」１第１図に示したアスペルギルス・オリゼーのグルコアミ
ラーゼｃＤＮＡをサッカロミセス・セレビシアエの発現
ベクターに連結し、酵母に移入し発現させることにより
、アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼの分泌
生産が可能となる。

ｐＵｃ−ｃＧＡより制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出したグ
ルコアミラーゼｃＤＮＡ（２，１ｋｂｐ）　を０．８％
アガロースゲル電気泳動により分取後、第３図に示すよ
うに発現ベクターに連結した。使用した発現ベクターは
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１０
１．　ｐｐ、１９２−２０１（１９８３）に記載のｐＹ
ｃＤＥｌである０本ベクターは酵母で複製可能な２ミク
ロンＤＮＡ、　Ｅ、　ｅｏｌｉのｐＢＲ３２２，標識遺
伝子として酵母ＴＲＰＩ及び酵母のアルコール脱水酵素
遺伝子（＾ＤＨＩ）のプロモーターとチトクロームＣ遺
伝子（ＣＹＣＩ　’）のターミネータで構成されている
。

異種ＤＮＡ挿入部位はＥｃｏＲＩである。

このベクターをＥｃｏＲＩで処理後、細菌のアルカリフ
ォスファターゼを用いて５′末端のリン酸を除去し、こ
れにグルコアミラーゼｃＤＮ＾のＥｃｏＲＩ断片を加え
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにて連結し、第３図に示すｐＹＧ
Ａ−１を得る。

次に、このｐＹＧＡ−１をＩｔｏ等のＪ、　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ。

Ｖｏｌ、　１５３．１６３−１６８（１９８３）記載の
方法に従って、酵母宿主（ＹＰＨ−２５０旦、肛１．閃
１．匣、江鮭ｔｈｉｓ３，１ａｕ２）に移入し、トリプ
トファン要求性が相補されたことにより、トリプトファ
ンを含まない培地によっても生育可能な形質転換体（Ｂ
）を得る。

この形質転換体を次に示す組成の合成培地１００ｍＱに
接種し、３０℃、４８時間、振どう培養した。

合成培地：２％グルコース、２％ポリペプトン、１％イ
ーストエキストラクト、５０ｍｇ／Ｒアデニン培養終了後、３０００ｒｐｍ、　　１０分の遠心分離に
より酵母菌体を除去し、上清のグルコアミラーゼ活性を
、岩野等の醸造協会誌、７１巻、３８３頁（１９７６）
に記載の方法に従って測定した。その上清中のグルコア
ミラーゼ活性を第１表に示した。

上記の様にプラスミドｐＹＧＡ−１でサッカロミセス・
セレビシアエを形質転換し、得られた形質転換体（Ｂ）
は微工研にＦＥＲＭ　Ｐ−１１７２９として寄託した。

次に酵母の形質転換体（Ｂ）によって分泌生産されたグ
ルコアミラーゼがアスペルギルス・オリゼー由来のもの
であることの確認は、アスペルギルス・オリゼーのグル
コアミラーゼに対するポリクローナル抗体を用いたウェ
スタンブロッティング法によった。

培養終了後の培養ろ液１０μＱに対して等量のＬｏａｄ
ｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ　（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｑ（ｐＨ６，８）、　２００ｍＭｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅ
ｉｔｏｌ、　４％ＳＤＳ、　０，２％ｂｒｏｍｏｐｈｅ
ｎｏｌｂｌｕｅ、　２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加え沸
とう水中で１０分間放置する・その後、　　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　５ｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉ
ｏｎ、　ｐｐ１８．６０−１８．７４．　Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９
８９）の記載に準じて５Ｏ５−ポリアクリ、ルアミドゲ
ル電気泳動を行い、ＰＶＤＦ　（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉ
ｄｅｎｄｉｆ　１ｕｏｒｉｄｅ）膜に蛋白をセミドライ
法にて転写する。転写したＰＶＤＦ膜にアスペルギルス
・オリゼーのグルコアミラーゼのポリクローナル抗体を
反応させ、次にペルオキシダーゼにて標識した２次抗体
を反応させて目的タンパク質を検出した。

その結果ベクターのみによる形質転換体ではグルコアミ
ラーゼ抗体と反応するバンドは全く見られなかったが、
　ｐＹＧＡ−１による形質転換体（Ｂ）には分子量７Ｏ
ｋｄ付近にグルコアミラーゼ抗体と反応する蛋白が検出
された。

以上のことから、形質転換体（Ｂ）はアスペルギルス・
オリゼーと同等のグルコアミラーゼを生産していること
が確認できた。

実施例５ニックＡ　ｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　５３．５９
３−５９９に記載のＥＭＢＬ３ファージを用いたアスペ
ルギルス・オリゼーの染色体シーンライブラリーより、
プラークハイブリダイゼーション法によりグルコアミラ
ーゼ染色体遺伝子をクローニングした。プローブとして
は実施例２に記載のｐＵｃ−ｃＧＡよりグルコアミラー
ゼｃＤＮＡを含む２．１ｋｂｐのＥｃｏＲＴ断片を、ニ
ックトランスレーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ、　ｐｐ１０９−１１２゜Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９
８２））にて３２ｐ放射能標識したものを用いた。約２
００００個のファージクローンよりグルコアミラーゼｃ
ＤＮＡとハイブリダイズするクローン４株を単離した。

これらのクローンの中に挿入されてい孔アスペルギルス
・オリゼー由来のＤＮＡ断片を各種制限酵素にて消化し
、グルコアミラーゼｃＤＮＡをプローブとしてサザンハ
イプリダイゼーションを行なった結果、Ｐｓｔ　Ｉ　　
５．０ｋｂｐ断片中にグルコアミラーゼ遺伝子の全長が
含まれていることが明らかとなった。この５．０ｋｂｐ
　Ｐｓｔ　Ｉ断片をプラスミドベクターｐＵｃ１１８に
連結し、ｐＵｃ−ｇｅｎＧＡを得て、第３図に示す如く
、当該挿入断片の制限酵素切断地図を作製した。

実施例６ ■ 実施例５で得られたサブクローンｐｌｃ−ｇｅｎＧＡに
挿入されている５、０ｋｂｐ　Ｐｓｔ　Ｉ断片のＤＮＡ
塩基配列を実施例３に記載と同様の方法で決定した。そ
の結果、アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ
遺伝子のコーディング領域およびその介在配列の全部並
びにコーディング領域に隣接する上流及び下流領域の一
部のＤＮＡ配列について、第２図に示す配列が見いださ
れた。

実施例７実施例５に記載のグルコアミラーゼ染色体ＤＮＡを含む
５．０ｋｂｐ　Ｐｓｔ　Ｉ断片を、アスペルギルス・オ
リゼーで複製可能なベクターｐＲＧＢ１（Ａｇｒｉｃ、
　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　Ｖｏｌ、　５１．３２３−３２８）のＰ
ｓｔ　Ｉサイトに連結し、第４図に示すｐＧＧＡ−１を
作製した。挿入したＰｓｔ　Ｉ断はグルコアミラーゼの
コーディング領域２．２ｋｂｐとその上流部分１．８ｋ
ｂｐと下流部分１．０ｋｂｐを含んでおり、グルコアミ
ラーゼの発現、転写に必要な領域はすべてこの断片中に
存在すると考えられたことにより、この断片を含むｐＧ
ＧＡ−１７スペルギルス・オリゼーに移入することによ
り、グルコアミラーゼを多量に分泌生産する形質転換体
が得られると予想される。そこで次のようにＰＧＧＡ−
１のアスペルギルス・オリゼーの移入を行なった。

アスペルギルス・オリゼーのアルギニン要求性株（畦ｄ
）をデキストリン・ペプトン培地（２％デキストリン、
１％ポリペプトン、０．５％ＫＨ，ＰＯい０．１％Ｎａ
ＮＯ３及び０．０５％Ｍｇ５Ｏ４）で３０℃、４８時間
振どう培養した後、得られた菌糸を無菌水で洗浄した。

この菌糸を細胞壁溶解酵素液（５０鱈リン酸緩衝液Ｐ）
１６．０．５．０％ＮａＣｆ１．０．５ｍｇ／−エルス
コビア酵素を含む）に懸濁し、３０℃、２時間振とうす
ることによりプロトプラスト化を図った。

得られたプロトプラストをガラスフィルターでろ過する
ことにより残存する菌糸を除去した。次にこのプロトプ
ラスト１．ＯＸ　１０’個を５．０％ＮａＣＱ及び１０
ｍＭ　ＣａＣｕ５を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２
（ｐＨ７，５）　１００／ＪＱに懸濁し、これにｐＧＧ
Ａ−１を加え室温に５分間放置した後、等量のＰＥＧ溶
液（７０％ポリエチレングリコール４０００．５０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−）１ｃＱ（ｐＨ７，５）、１０ＩＩＭＣａ
ＣＱ２を含む）を添加し室温にて１０分間放置した。得
られたプロトプラストを５％Ｎａ（、Ｑを含むツアペッ
ク・ドックス培地（０，２％ＮａＮＯ２，０，１％に２
）ＩＰＯ，、０，０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，０，０
５％ＫＣＱ、０．００１％Ｆｅ５０．、２％グルコース
、　ｐＨ５，５）の平板上に塗布し、その上に５．０％
Ｎａ（ｊｌを含む０．５％寒天を重層し、３０℃で培養
した。

ｐＧＧＡ−１はアルギニン要求性を相補する遺伝子を含
んでおり、形質転換体は最小培地（ツアペック・ドック
ス培地）が生育することができた。得られた形質転換体
でデキストリン・ペプトンにおいて３０℃で４８時間振
どう培養して得られた培養ろ液のグルコアミラーゼ活性
を測定した。その結果を第２表に示した。

上記のようにプラスミドｐＧＧ＾−１でアスペルギルス
・オリゼーを形質転換し、得られた形質転換体（Ａ）は
、微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ　Ｐ−１１７２８と
して寄託した。

（発明の効果）本発明によってはじめてアスペルギルス・オリゼー由来
のグルコアミラーゼ遺伝子のクローン化に成功し、その
ヌクレオチド配列も解明された。

また本発明においては、クローニングされた上記遺伝子
をベクターに挿入して宿主の形質転換を行うことにも成
功したものである。したがって。

得られた形質転換体を培養することによってグルコアミ
ラーゼを著量製造することができる。

これら形質転換体の内、例えばアスペルギルスオリゼー
を宿主とするものについては、これを用いて製麹するこ
とによってすぐれた麹が製造できるので、酒類の製造や
アルコール発酵その他麹利用工業製品の効率的製造に有
利に利用することができる。

また例えばサッカロミセス・セレビシアエを宿主とする
ものについては、澱粉糖化工程を別途経ることなく直接
アルコール発酵することができるので、澱粉から直接ア
ルコールを製造することができるという著効が奏される
。したがって本発明によれば澱粉から直接アルコール飲
料を製造できるだけでなく、例えば形質転換体を固定し
たカラムの一方から澱粉を供給し他方からアルコールを
取り出すことができ、アルコールの工業的製造も可能で
あるので、エネルギー業界においてもその効果は卓越し
ている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、グルコアミラーゼｃＤＮＡのコーディング領
域の１）ＮＡ配列を図示したものであり、第２図はグル
コアミラーゼ染色体遺伝子のＤＮＡ配列を図示したもの
である。第３図及び第４図は、プラスミドρＹＧＡ−１及びｐＧ
Ｇ＾−１の制限酵素地図をそれぞれ図示したものである
。代理人　弁理士　戸　１）親　男第図（ぶり＃省や、イｊヒ、ンＥ　：　ＥＣＯＲＩ第図ＳＥＢＳＳＢＥｐＨＬｐ巳１

Claims

【特許請求の範囲】

（１）第２図に示す塩基配列を含む、アスペルギルス・
オリゼーから単離したグルコアミラーゼ遺伝子のプロモ
ータ及び／又は蛋白質コード領域を含むＤＮＡ配列。
（２）第１図に含まれる、アスペルギルス・オリゼーの
グルコアミラーゼｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ配列。
（３）請求項第１項記載のＤＮＡ配列を含んだアスペル
ギルス・オリゼーのベクター。
（４）請求項第２項記載のｃＤＮＡ配列を含んだサッカ
ロミセス・セレビシアエのベクター。
（５）請求項第３項記載のベクターをアスペルギルス・
オリゼーに移入することによって得られたグルコアミラ
ーゼ酵素生産能の上昇した形質転換体。
（６）請求項第４項記載のベクターをサッカロミセス・
セレビシアエに移入することによって得られるグルコア
ミラーゼを生産する形質転換体。
（７）請求項第５項又は第６項に記載の形質転換体を使
用することを特徴とするアルコール、酒類の製造方法。
（８）請求項第５項又は第６項に記載の形質転換体を培
養し、培養物からグルコアミラーゼを採取することを特
徴とするグルコアミラーゼの製造方法。