JPH06209763A - 変異株 - Google Patents

変異株

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JPH06209763A
JPH06209763A JP5004289A JP428993A JPH06209763A JP H06209763 A JPH06209763 A JP H06209763A JP 5004289 A JP5004289 A JP 5004289A JP 428993 A JP428993 A JP 428993A JP H06209763 A JPH06209763 A JP H06209763A
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methanol
promoter
glucose
aox
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JP5004289A
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Ken Okabayashi
謙 岡林
Takao Omura
孝男 大村
Kazumasa Yokoyama
和正 横山
Haruhide Kawabe
晴英 川辺
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Original Assignee
Green Cross Corp Japan
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 メタノール資化性で、かつブドウ糖資化性で
ある異種蛋白質産生可能な変異株、及び当該変異株を培
養することを特徴とする異種蛋白質の製造方法。 【効果】 本発明の変異株によれば、メタノールとブド
ウ糖とが共存する培地を用いることができ、菌株の増殖
と異種蛋白質の発現及び産生とを同時に行うことができ
る。従って、異種蛋白質を短時間にかつ大量に産生する
ことが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な変異株及びそれ
を培養することによる異種蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】メタノール資化性菌株はメタノールを炭
素源、及びエネルギー源として増殖することができる。
これは該菌株が、メタノールの代謝機構における第一番
目の反応、即ちメタノールを酸化してホルムアルデヒド
とする反応を触媒する酵素であるアルコールオキシダー
ゼ（ＥＣ１．１．３．Ｂ、以下ＡＯＸともいう。）をコ
ードする遺伝子を有していることによる。
【０００３】すなわちメタノール資化性菌株は、メタノ
ールを単一の炭素源とする培地において、自ら産生した
ＡＯＸを用いてメタノールを代謝し、その代謝産物を炭
素源として増殖することができる。
【０００４】ピキア酵母（Pichia pastoris ）はメタノ
ール資化性菌株の一つであるが、この酵母はその染色体
中にそれぞれプロモーター、構造遺伝子およびターミネ
ーターを含む２種類のＡＯＸ遺伝子（ＡＯＸ１遺伝子、
ＡＯＸ２遺伝子）を有している。これらの構造遺伝子は
互いに高い相同性を有しており、同等の比活性を示すＡ
ＯＸをコードする。しかしプロモーターについては、そ
の転写活性に著しく差があり（ＡＯＸ１プロモーター＞
ＡＯＸ２プロモーター）、実際に産生されるＡＯＸはＡ
ＯＸ１遺伝子に由来するものであることが知られている
[Molecular and Cellular Biology, vol.9, 1316(198
9)]。
【０００５】最近、このピキア酵母のＡＯＸ遺伝子を用
いて異種蛋白質を産生する方法が研究されている〔Yeas
t 5, 167-177(1989)、特開平1-128790号、特開平2-1042
90号、ＥＰ公開公報347928号〕。プロモーター活性の高
いＡＯＸ１プロモーター下流域に所望の異種蛋白質遺伝
子を置換してなる菌株は、その転写効率は高いが、メタ
ノールを資化するＡＯＸの産生を発現活性の低いＡＯＸ
２遺伝子にのみ任せているため、メタノールを炭素源と
する培地中での増殖は悪く、異種蛋白質の産生に長時間
の培養が必要であった。
【０００６】この問題を解決すべく研究を重ねたとこ
ろ、この菌株のＡＯＸ２プロモーターを変異させること
により、プロモーター活性が増強されＡＯＸ２遺伝子に
よるＡＯＸの産生を増加することができ、その結果菌株
はメタノール含有培地中で良好に増殖することが可能と
なった。
【０００７】しかし、この菌株のＡＯＸ系プロモーター
は培地中のブドウ糖によってカタボライトリプレッショ
ンをうけることが分かった。すなわち、培地中にブドウ
糖が存在する条件ではＡＯＸ系プロモーターは転写活性
が抑制されて、該プロモーターに制御されているＡＯＸ
遺伝子及び異種蛋白質遺伝子は発現しない。このため、
この条件下では、菌株はブドウ糖を炭素源として構成蛋
白質を合成して増殖はするが、ＡＯＸを合成したり異種
蛋白質を産生することはない。これは、メタノールがブ
ドウ糖と共存している場合でも同様である。この場合、
ブドウ糖を消費し尽くした後にはじめてＡＯＸ系プロモ
ーターが作動し、菌株はＡＯＸ及び異種蛋白質を産生す
るようになる。このように、上記菌株は異種蛋白質の産
生に長時間を費やし、所望の異種蛋白質の製造には好ま
しくない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
した従来法での問題を解消し、本来誘導的であったＡＯ
Ｘ及び異種蛋白質を構成的に発現、産生せしめるように
して、物質生産時間の短縮、物質生産の増強を行い得る
菌株を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、所望の物
質を高い収率でかつ短時間で得る目的で鋭意研究を重ね
た結果、上記の菌株をエチルメタンスルホネート（以
下、ＥＭＳという。）等の変異原で処理することによ
り、メタノール資化性およびブドウ糖資化性を共に有す
る変異株を調製することができることを見出して本発明
を完成した。
【００１０】即ち本発明は、メタノール資化性でかつブ
ドウ糖資化性を有する異種蛋白質産生可能な変異株、及
びその製造法を提供するものである。また本発明は、こ
の変異株を培養することを特徴とする異種蛋白質の製造
方法に関する。
【００１１】本発明の変異株は、異種蛋白質の発現にお
いて本来誘導的であった菌株を構成的に変異せしめた菌
株である。ここで構成的（または構成性）であるとは、
培養条件に関係なく一定のレベルで産生される性質を意
味する。本発明の変異株において、具体的には菌株（細
胞構築タンパクなど）の増殖、菌株内に保有される遺伝
子の発現、タンパクの産生等がブドウ糖の存在によって
支配されない性質を意味する。
【００１２】それに対し、誘導的（または誘導性）であ
るとは、異化代謝産物または誘導因子などの影響を受け
て発現及び産生が制御される性質を意味する。これはプ
ロモーターの転写活性能が、異化代謝産物または誘導因
子などによって制御される転写調節遺伝子により支配さ
れていることによるものである。例えば、ＡＯＸプロモ
ーターは上記性質を有する誘導性プロモーターであり、
該プロモーターの転写活性はブドウ糖の存在により制御
を受ける。
【００１３】本発明の変異株は、メタノール資化性とブ
ドウ糖資化性とを共に持ち合わせてなるものであればい
かなる手段によって得られるものであってもよい。具体
的には、異種蛋白質産生可能なメタノール資化性菌株を
変異原処理することによって取得されるものが例示され
る。
【００１４】（１）異種蛋白質を産生可能なメタノール
資化性菌株 本発明において変異原処理される出発菌株は、「異種蛋
白質を産生可能なメタノール資化性菌株」である。この
メタノール資化性菌株は、ブドウ糖の存在によりカタボ
ライトリプレッションを受ける。即ち、メタノールとブ
ドウ糖が共存する培養条件下では、まずブドウ糖を消費
して異種蛋白質を産生することなく菌株を増殖させ、そ
の後ブドウ糖を消費し尽くした後メタノールの消費を開
始して異種蛋白質を産出する性質を有する。当該菌株
は、異種蛋白質を産生しかつメタノール資化能を有する
ものであり、好ましくは、ＡＯＸ系プロモーターの支配
下に異種蛋白質を発現、産生することのできるメタノー
ル資化性菌株である。かかる菌株は、ＡＯＸ系プロモー
ターの支配下に異種蛋白質遺伝子が発現される遺伝子
（以下、ユニットともいう。）を有すればよく、より好
適には、当該ユニットとＡＯＸ系プロモーターの支配下
にＡＯＸが発現される遺伝子（以下、ＡＯＸ系遺伝子と
もいう。）とを一つの菌体内に保持しているものであ
る。このようなユニットおよびＡＯＸ系遺伝子の菌株内
での具体的な存在態様を図１、及び図２に例示する。
【００１５】当該ユニットのメタノール資化性菌株細胞
中での存在様式は、染色体中に挿入あるいは置換されて
組み込まれていてもよいし、またはプラスミドやファー
ジ状態で存在していてもよい。
【００１６】このようなユニットを担持するメタノール
資化性菌株は、任意の手段によって調製されるものでよ
く、その調製方法は特に制限されない。例えば一種類の
ＡＯＸ系遺伝子を担持するメタノール資化性菌株の場
合、ＡＯＸ系プロモーターの制御のもとで異種蛋白質が
産生されるユニットを直接細胞内に導入することによっ
て調製することができる（図１）。また二種類のＡＯＸ
系遺伝子を担持するメタノール資化性菌株の場合は、同
様に該ユニットを直接細胞内に導入することによって、
図２ａに示すように２つのＡＯＸ遺伝子と該ユニットを
有する態様のものを調製することができるし、また、異
種蛋白質をコードする遺伝子を菌株の染色体中の一方の
ＡＯＸプロモーターの下流に組み込むことによって当該
ユニットに相当するユニットを有する態様のものを調製
することができる（図２ｂ）。または、当該ユニット及
びＡＯＸ系遺伝子を含むプラスミドベクターまたはファ
ージベクターを適当なメタノール資化性菌株に導入する
ことによっても調製することができる。このような調製
は、自体周知の操作で行うことができる。
【００１７】メタノール資化性菌株に導入されるユニッ
トのコピー数は１コピーでも複数であってもよい。かか
るユニットは、リポソーム結合部位、翻訳開始コドン、
シグナルペプチドをコードする遺伝子、翻訳開始コド
ン、ターミネーター、選択マーカー遺伝子または自律複
製遺伝子等を含有していてもよい。
【００１８】このメタノール資化性菌株中のＡＯＸ系プ
ロモーターは、プロモーター活性を有していれば野生型
であることを問わず、変異または修飾を施したものでも
よい。好ましくは、プロモーター活性の高い野生型ＡＯ
Ｘプロモーターまたは修飾または変異させることによっ
てプロモーター活性が強化されたＡＯＸプロモーターで
ある。
【００１９】具体的には、ピキア酵母の場合を例にとる
と、プロモーター活性の高い野生型ＡＯＸ１プロモータ
ー、及びプロモーター活性の低いＡＯＸ２プロモーター
を適当な処理によって変異または修飾せしめることによ
って活性を増強させた変異型ＡＯＸ２プロモーターなど
が挙げられる。
【００２０】上記の変異型ＡＯＸ２プロモーターは、例
えばピキア酵母に由来する、ＡＯＸ１遺伝子によりＡＯ
Ｘが産生されずその染色体上において野生型ＡＯＸ２プ
ロモーターを担持してなる菌株をメタノールを単一の炭
素源とする培地で継代培養することにより変異させ、そ
の結果メタノール資化能が上昇した菌株から得ることが
できる。また、これによって得られた変異型ＡＯＸ２プ
ロモーターの塩基配列を参考にして化学的に合成した
り、野生型ＡＯＸ２プロモーターを公知の遺伝子工学的
手法（例えば、部位指定削除法〔Site-directed deleti
on, Nucl. AcidsRes., 11, 1645(1983)〕、部位特異的
変異法〔Site-directed Mutagenesis 〕、制限酵素処理
など）によって処理することによっても調製することが
できる。
【００２１】メタノール資化性菌株としては、具体的に
はピキア酵母（Pichia pastoris)、Hansenula 属菌、Ca
ndida 属菌、Rhodotorula 属菌、Sporobolomyces属菌等
の酵母、Methylomonas methanica、Methylophilus meth
ylotrophus、Methylococcus属、Methylosinus属、Pseud
omonas 属、Methylobacterium属等の細菌が挙げられ
る。
【００２２】異種蛋白質としては、ヒト血清アルブミ
ン、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、プロウロキナーゼ、組織プ
ラスミノーゲン・アクチベーター、各種インターフェロ
ン、免疫グロブリン、コロニー形成刺激因子などが例示
される。用いられる異種蛋白質の遺伝子（構造遺伝子）
としては、このような所望の異種蛋白質をコードする遺
伝子であれば特に制限はなく、またいかなる方法で得ら
れるものであってもよい。この構造遺伝子は公知の遺伝
子工学的手法を用いて、好ましくはＡＯＸ系プロモータ
ーの下流域に組み込まれ、メタノール資化性菌株に導入
することができる。例えば形質転換法、即ち染色体へ組
み込む方法、または直接メタノール資化性菌株細胞内に
導入する方法などが用いられる。
【００２３】前述の態様を有する菌株の具体例として
は、ＧＣＰ１０１株、ＳＨＧ４１０５株、ＵＨＧ４２−
３株（特願平３−６３５９８号、同３−６３５９９号）
等が例示される。
【００２４】（２）変異原処理による突然変異 本発明の変異株は、（１）に記載した菌株を、その細胞
１０6 〜１０10個／ｍｌ当たりＥＭＳ等の変異原が０．
１〜１０％程度存在する環境において、５〜３７℃で１
０分〜３時間程度処理することにより得ることができ
る。次いで、得られた変異株を０．０１〜０．１％程度
の２−デオキシグルコースを加えた適当なメタノール含
有培地〔例えば、ＹＰＭ培地（１％酵母抽出物、２％バ
クトペプトン、１％メタノール）等〕を用いて培養する
ことにより、本発明の変異株を選択することができる。
【００２５】変異原としては、ＥＭＳの他、例えば２−
アミノプリン、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、アクリジンなどが
挙げられる。これらは単独に用いてもよいし、また組み
合わせて用いてもよい。
【００２６】（３）得られた変異株の性状 本発明の変異株は、ブドウ糖の存在によるカタボライト
リプレッションを受けない。従って、当該変異株はメタ
ノールを単一の炭素源とする培地は勿論、メタノールと
ブドウ糖とが共存する培地中で培養されて、増殖と共に
異種蛋白質を産生することができる
【００２７】（４）変異株を培養することによる異種蛋
白質の製造方法。 かくして得られた変異株は適切な公知培地中で培養する
ことによって、所望の異種蛋白質を産生させることがで
きる。培地には該形質転換体の生育に必須な炭素源、窒
素源、無機物、ビタミン、薬剤などが含有される。詳細
には、メタノールを単一の炭素源とする培地、並びにメ
タノールとブドウ糖とが共存する培地を用いることがで
きる。
【００２８】具体的には、例えば変異株が酵母の場合、
ＹＰＤＭ培地（１％ Bacto Yeast Extract, ２％ Bacto
Peptone, ２％ Glucose，０．５％ Methanol)、ＹＰＤ
培地（１％ Bacto Yeast Extract, ２％ Bacto Pepton
e, ２％ Glucose）、ＹＰＧ培地（１％ Bacto Yeast Ex
tract, ２％ Bacto Peptone, ２％ Glycerol ）、ＹＰ
Ｍ培地（１％ Bacto Yeast Extract, ２％ Bacto Pepto
ne, ２％ Methanol)、０．１〜５％メタノールを含有し
たＹＮＢ液体培地〔０．７％ Yeast Nitrogen Base(Dif
co社）〕、及び０．０１〜５％メタノールを含有したＹ
Ｐ培地〔１％ Bacto Yeast Extract(Difco社) , ２％ P
oly Peptone(大五栄養社）〕、及びＳＭＭ培地 (２％ M
ethanol,０．５％ CH 3 COONH 4 -synthetic medium)な
どが挙げられる。
【００２９】培養は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは
約３０℃〜４０℃で１〜２００時間程度おこなわれる。
必要に応じて通気、攪拌を加えることもできる。培地の
ｐＨは５〜８の範囲が好ましい。
【００３０】培養後、培養上清中または形質転換体中に
蓄積された目的の異種蛋白質は公知の方法で抽出、精製
される。例えば、塩析法、溶媒沈澱法、透析法、限外濾
過法、ゲル電気泳動法、あるいはゲル濾過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の手
法を組み合わせて分離精製することができる。
【００３１】なお、本発明において使用する多くの技
法、反応及び分析方法は当業者らに自体周知のものであ
る。また、酵素、プラスミド等は商業的に入手できるも
のを用いることができる。
【００３２】本発明をより詳細に説明するために、以下
に実施例及び参考例を挙げるが、本発明はこれらにより
何ら限定されるものではない。
【００３３】以下の実施例及び参考例で使用した全ての
酵素は、特に断らない限り商業的供給源、例えば宝酒造
株式会社等から入手したものである。また、酵素反応の
ための緩衝液及び反応条件は特に断らない限り各酵素の
製造元の推奨に従って使用した。
【００３４】ピキアパストリス(Pichia pastoris) ＧＴ
Ｓ１１５株、ＧＣＰ１Ｏ４株、及びプラスミドｐＰＧＰ
１はフィリップス・ペトリウム社から入手した。
【００３５】実施例１で得られたＥＣＣＲ７２株は、
（財）発酵研究所に寄託されている〔寄託番号ＩＦＯ
No. １０６１２（１９９２年１２月２８日）〕。
【００３６】
【参考例・実施例】
参考例１ Ｍｕｔ＋菌株であるＧＣＰ１０１株の取得
（図３参照） 特開平２−１０４２９０号公報記載の方法により、ピキ
アパストリス(Pichiapastoris) ＧＴＳ１１５のＡＯＸ
１遺伝子領域に、ＡＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡ
が発現する転写ユニットを持つプラスミドｐＰＧＰ１を
制限酵素ＮｏｔＩで切断して得られる断片を置換挿入し
てＧＣＰ１０４株（ＡＯＸ１欠失株）を得た。この株は
ＡＯＸ１遺伝子を欠失しており、メタノールを資化する
ＡＯＸの産生を発現効率の低いＡＯＸ２遺伝子に任せて
いるため、メタノールを単一の炭素源とする培養基の中
での増殖能が低下している（Ｍｕｔ−株）。
【００３７】ＧＣＰ１０４株をＹＰＤ培地（1%バクト酵
母抽出物、2%バクトペプトン、2%グルコース）３ｍｌに
植菌し、２４時間後に初期ＯＤ540 ＝１となるようにＹ
ＰＤ培地５０ｍｌに植菌した。３日間３０℃で培養後に
初期ＯＤ540 ＝１となるようにＹＰＭ培地（1%バクト酵
母抽出物、2%バクトペプトン、2%メタノール）５０ｍｌ
に植菌した。さらにＹＰＭ培地を用いて、３日毎に同様
の継代を繰り返した。継代毎に菌体を１０7 cell/plate
になるように滅菌水で希釈して２％ Methanol-YNB w/o
a.a.プレート(0.7% Yeast Nitogen Base without Amin
o acid 、2%メタノール、1.5%ゼラチン）に塗布し、３
０℃５日間培養してコロニーの有無を判断した。その結
果、１２日間継代後に塗布した２％ Methanol-YNB w/o
a.a.プレートから２０個のコロニーが生じた。
【００３８】このプレートにおいてはメタノールが唯一
の炭素源であるため、メタノール資化性の低いＭｕｔ−
株は殆ど生育できない。ゆえにこのプレートに生じたこ
のコロニーは、即ちメタノールの資化性の上昇した変異
株Ｍｕｔ＋のものである。この資化性の上昇は、ＡＯＸ
２プロモーターが変異し、プロモーター活性が増強する
ことによりＡＯＸ２構造遺伝子に由来するＡＯＸが産生
されるようになったことに基づく。これらコロニーの内
の１つを適当に滅菌水で希釈して２％ Methanol-YNB w/
o a.a. プレートに拡げ、シングルコロニーに単離し
た。その内１つをＧＣＰ１０１と名付けた。
【００３９】実施例１ 変異原による突然変異、及び得
られた変異株を培養することによる異種蛋白質の製造 突然変異 参考例１で得られたＧＣＰ１０１株をＹＰＤ培地で培養
して、その２×１０8個／ｍｌ当たり、ＥＭＳを２．９
％となるように添加し、３０℃１時間処理した。その
後、０．０２％の２−デオキシグルコースを含むＹＰＭ
培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、１％メタ
ノール）を用い、突然変異株である２−デオキシグルコ
ース耐性株を分離した。ＥＭＳによる２−デオキシグル
コース耐性株の出現頻度は１．４×１０-4〜３．３×１
０-4であり、ＥＭＳ未処理の場合の出現頻度２×１０-7
〜２×１０-6と比べて約１００倍に上昇した。
【００４０】継代培養 上記において得られた突然変異株を０．０２％の２−デ
オキシグルコースを含むＹＰＭ（１％酵母抽出物、２％
バクトペプトン、１％メタノール）培地においてさらに
継代培養し、２−デオキシグルコース耐性株であるＥＣ
ＣＲ７２株を選択、単離した。
【００４１】本培養 ＹＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２
％ブドウ糖）で一晩培養した上記ＥＣＣＲ７２株の菌体
懸濁液を５０ｍｌのＹＰＤＭ培地（１％酵母抽出物、２
％バクトペプトン、２％ブドウ糖、０．５％メタノー
ル）に１％の割合になるように植菌して、３００ｍｌ容
のバッフル付三角フラスコを用いて３０℃で振盪培養を
行った。対象菌株として、出発菌株ＧＣＰ１０１を同様
に培養して、経時的にそれぞれの菌体濃度（波長５４０
ｎｍにおける吸光度）、ブドウ糖濃度、及びメタノール
濃度、及び産生されるＨＳＡ濃度を測定、比較した。
【００４２】結果 ＧＣＰ１０１株では、ブドウ糖が消費し尽くされた後に
メタノールの消費が始まる（図４）、グルコースカタボ
ライトリプレッション現象が見られ、実験時間内におい
て、ＨＳＡの産生は見られなかった。一方、ＥＣＣＲ７
２株は、ブドウ糖とメタノールとを同時に消費した。ま
た、メタノール消費に伴って、培地中にはＨＳＡが分泌
されていることが確認できた（図５）。
【００４３】
【発明の効果】本発明の変異株によれば、メタノールと
ブドウ糖とが共存する培地を用いることができ、菌株の
増殖と異種蛋白質の発現及び産生とを同時に行うことが
できる。従って、異種蛋白質を短時間にかつ大量に産生
することが可能である。
【図面の詳細な説明】
【図１】菌株内におけるユニット（ＡＯＸ系プロモータ
ーの支配下に異種蛋白質が発現されるユニット）の存在
態様において、出発菌株が一種類のＡＯＸ系プロモータ
ーを担持するものである場合を示す。
【図２】菌株内におけるユニット（ＡＯＸ系プロモータ
ーの支配下に異種蛋白質が発現されるユニット）の存在
態様において、出発菌株が二種類のＡＯＸ系プロモータ
ーを担持するものである場合を示す。
【図３】ＧＴＳ１１５株、ＧＣＰ１０４株のＡＯＸ１、
ＡＯＸ２遺伝子領域、及びＧＣＰ１０１株の取得方法を
示す図である。図中、Ｐｒｏｍ．はプロモーターを、
ｔ．はターミネーターを、ＰｏｌｙはポリＡ領域を示
す。
【図４】ＧＣＰ１０１株をＹＰＤＭ培地で培養した際の
菌体密度（吸光度）、培地中のブドウ糖濃度及びメタノ
ール濃度、産生されたＨＳＡ濃度の経時的消長を示す図
である。
【図５】ＥＣＣＲ７２株をＹＰＤＭ培地で培養した際の
菌体密度（吸光度）、培地中のブドウ糖濃度及びメタノ
ール濃度、産生されたＨＳＡ濃度の経時的消長を示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 川辺 晴英 大阪府大阪市中央区今橋一丁目３番３号 株式会社ミドリ十字内

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 メタノール資化性で、かつブドウ糖資化
    性である異種蛋白質産生可能な変異株。
  2. 【請求項２】 異種蛋白質を産生可能なメタノール資化
    性菌株を変異原処理することによって得られる、請求項
    １記載の変異株。
  3. 【請求項３】 請求項１または請求項２記載の変異株を
    培養することを特徴とする、異種蛋白質の製造方法。
JP5004289A 1993-01-13 1993-01-13 変異株 Pending JPH06209763A (ja)

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EP94100460A EP0606917A3 (en) 1993-01-13 1994-01-13 A methylotropic and glucotropic mutant strain for producing a heterologous protein.

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EP0606917A2 (en) 1994-07-20
EP0606917A3 (en) 1995-07-19
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