JPH06209763A - 変異株 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 メタノール資化性で、かつブドウ糖資化性で
ある異種蛋白質産生可能な変異株、及び当該変異株を培
養することを特徴とする異種蛋白質の製造方法。 【効果】 本発明の変異株によれば、メタノールとブド
ウ糖とが共存する培地を用いることができ、菌株の増殖
と異種蛋白質の発現及び産生とを同時に行うことができ
る。従って、異種蛋白質を短時間にかつ大量に産生する
ことが可能である。
ある異種蛋白質産生可能な変異株、及び当該変異株を培
養することを特徴とする異種蛋白質の製造方法。 【効果】 本発明の変異株によれば、メタノールとブド
ウ糖とが共存する培地を用いることができ、菌株の増殖
と異種蛋白質の発現及び産生とを同時に行うことができ
る。従って、異種蛋白質を短時間にかつ大量に産生する
ことが可能である。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な変異株及びそれ
を培養することによる異種蛋白質の製造方法に関する。
を培養することによる異種蛋白質の製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】メタノール資化性菌株はメタノールを炭
素源、及びエネルギー源として増殖することができる。
これは該菌株が、メタノールの代謝機構における第一番
目の反応、即ちメタノールを酸化してホルムアルデヒド
とする反応を触媒する酵素であるアルコールオキシダー
ゼ(EC1.1.3.B、以下AOXともいう。)をコ
ードする遺伝子を有していることによる。
素源、及びエネルギー源として増殖することができる。
これは該菌株が、メタノールの代謝機構における第一番
目の反応、即ちメタノールを酸化してホルムアルデヒド
とする反応を触媒する酵素であるアルコールオキシダー
ゼ(EC1.1.3.B、以下AOXともいう。)をコ
ードする遺伝子を有していることによる。
【0003】すなわちメタノール資化性菌株は、メタノ
ールを単一の炭素源とする培地において、自ら産生した
AOXを用いてメタノールを代謝し、その代謝産物を炭
素源として増殖することができる。
ールを単一の炭素源とする培地において、自ら産生した
AOXを用いてメタノールを代謝し、その代謝産物を炭
素源として増殖することができる。
【0004】ピキア酵母(Pichia pastoris )はメタノ
ール資化性菌株の一つであるが、この酵母はその染色体
中にそれぞれプロモーター、構造遺伝子およびターミネ
ーターを含む2種類のAOX遺伝子(AOX1遺伝子、
AOX2遺伝子)を有している。これらの構造遺伝子は
互いに高い相同性を有しており、同等の比活性を示すA
OXをコードする。しかしプロモーターについては、そ
の転写活性に著しく差があり(AOX1プロモーター>
AOX2プロモーター)、実際に産生されるAOXはA
OX1遺伝子に由来するものであることが知られている
[Molecular and Cellular Biology, vol.9, 1316(198
9)]。
ール資化性菌株の一つであるが、この酵母はその染色体
中にそれぞれプロモーター、構造遺伝子およびターミネ
ーターを含む2種類のAOX遺伝子(AOX1遺伝子、
AOX2遺伝子)を有している。これらの構造遺伝子は
互いに高い相同性を有しており、同等の比活性を示すA
OXをコードする。しかしプロモーターについては、そ
の転写活性に著しく差があり(AOX1プロモーター>
AOX2プロモーター)、実際に産生されるAOXはA
OX1遺伝子に由来するものであることが知られている
[Molecular and Cellular Biology, vol.9, 1316(198
9)]。
【0005】最近、このピキア酵母のAOX遺伝子を用
いて異種蛋白質を産生する方法が研究されている〔Yeas
t 5, 167-177(1989)、特開平1-128790号、特開平2-1042
90号、EP公開公報347928号〕。プロモーター活性の高
いAOX1プロモーター下流域に所望の異種蛋白質遺伝
子を置換してなる菌株は、その転写効率は高いが、メタ
ノールを資化するAOXの産生を発現活性の低いAOX
2遺伝子にのみ任せているため、メタノールを炭素源と
する培地中での増殖は悪く、異種蛋白質の産生に長時間
の培養が必要であった。
いて異種蛋白質を産生する方法が研究されている〔Yeas
t 5, 167-177(1989)、特開平1-128790号、特開平2-1042
90号、EP公開公報347928号〕。プロモーター活性の高
いAOX1プロモーター下流域に所望の異種蛋白質遺伝
子を置換してなる菌株は、その転写効率は高いが、メタ
ノールを資化するAOXの産生を発現活性の低いAOX
2遺伝子にのみ任せているため、メタノールを炭素源と
する培地中での増殖は悪く、異種蛋白質の産生に長時間
の培養が必要であった。
【0006】この問題を解決すべく研究を重ねたとこ
ろ、この菌株のAOX2プロモーターを変異させること
により、プロモーター活性が増強されAOX2遺伝子に
よるAOXの産生を増加することができ、その結果菌株
はメタノール含有培地中で良好に増殖することが可能と
なった。
ろ、この菌株のAOX2プロモーターを変異させること
により、プロモーター活性が増強されAOX2遺伝子に
よるAOXの産生を増加することができ、その結果菌株
はメタノール含有培地中で良好に増殖することが可能と
なった。
【0007】しかし、この菌株のAOX系プロモーター
は培地中のブドウ糖によってカタボライトリプレッショ
ンをうけることが分かった。すなわち、培地中にブドウ
糖が存在する条件ではAOX系プロモーターは転写活性
が抑制されて、該プロモーターに制御されているAOX
遺伝子及び異種蛋白質遺伝子は発現しない。このため、
この条件下では、菌株はブドウ糖を炭素源として構成蛋
白質を合成して増殖はするが、AOXを合成したり異種
蛋白質を産生することはない。これは、メタノールがブ
ドウ糖と共存している場合でも同様である。この場合、
ブドウ糖を消費し尽くした後にはじめてAOX系プロモ
ーターが作動し、菌株はAOX及び異種蛋白質を産生す
るようになる。このように、上記菌株は異種蛋白質の産
生に長時間を費やし、所望の異種蛋白質の製造には好ま
しくない。
は培地中のブドウ糖によってカタボライトリプレッショ
ンをうけることが分かった。すなわち、培地中にブドウ
糖が存在する条件ではAOX系プロモーターは転写活性
が抑制されて、該プロモーターに制御されているAOX
遺伝子及び異種蛋白質遺伝子は発現しない。このため、
この条件下では、菌株はブドウ糖を炭素源として構成蛋
白質を合成して増殖はするが、AOXを合成したり異種
蛋白質を産生することはない。これは、メタノールがブ
ドウ糖と共存している場合でも同様である。この場合、
ブドウ糖を消費し尽くした後にはじめてAOX系プロモ
ーターが作動し、菌株はAOX及び異種蛋白質を産生す
るようになる。このように、上記菌株は異種蛋白質の産
生に長時間を費やし、所望の異種蛋白質の製造には好ま
しくない。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
した従来法での問題を解消し、本来誘導的であったAO
X及び異種蛋白質を構成的に発現、産生せしめるように
して、物質生産時間の短縮、物質生産の増強を行い得る
菌株を提供することである。
した従来法での問題を解消し、本来誘導的であったAO
X及び異種蛋白質を構成的に発現、産生せしめるように
して、物質生産時間の短縮、物質生産の増強を行い得る
菌株を提供することである。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、所望の物
質を高い収率でかつ短時間で得る目的で鋭意研究を重ね
た結果、上記の菌株をエチルメタンスルホネート(以
下、EMSという。)等の変異原で処理することによ
り、メタノール資化性およびブドウ糖資化性を共に有す
る変異株を調製することができることを見出して本発明
を完成した。
質を高い収率でかつ短時間で得る目的で鋭意研究を重ね
た結果、上記の菌株をエチルメタンスルホネート(以
下、EMSという。)等の変異原で処理することによ
り、メタノール資化性およびブドウ糖資化性を共に有す
る変異株を調製することができることを見出して本発明
を完成した。
【0010】即ち本発明は、メタノール資化性でかつブ
ドウ糖資化性を有する異種蛋白質産生可能な変異株、及
びその製造法を提供するものである。また本発明は、こ
の変異株を培養することを特徴とする異種蛋白質の製造
方法に関する。
ドウ糖資化性を有する異種蛋白質産生可能な変異株、及
びその製造法を提供するものである。また本発明は、こ
の変異株を培養することを特徴とする異種蛋白質の製造
方法に関する。
【0011】本発明の変異株は、異種蛋白質の発現にお
いて本来誘導的であった菌株を構成的に変異せしめた菌
株である。ここで構成的(または構成性)であるとは、
培養条件に関係なく一定のレベルで産生される性質を意
味する。本発明の変異株において、具体的には菌株(細
胞構築タンパクなど)の増殖、菌株内に保有される遺伝
子の発現、タンパクの産生等がブドウ糖の存在によって
支配されない性質を意味する。
いて本来誘導的であった菌株を構成的に変異せしめた菌
株である。ここで構成的(または構成性)であるとは、
培養条件に関係なく一定のレベルで産生される性質を意
味する。本発明の変異株において、具体的には菌株(細
胞構築タンパクなど)の増殖、菌株内に保有される遺伝
子の発現、タンパクの産生等がブドウ糖の存在によって
支配されない性質を意味する。
【0012】それに対し、誘導的(または誘導性)であ
るとは、異化代謝産物または誘導因子などの影響を受け
て発現及び産生が制御される性質を意味する。これはプ
ロモーターの転写活性能が、異化代謝産物または誘導因
子などによって制御される転写調節遺伝子により支配さ
れていることによるものである。例えば、AOXプロモ
ーターは上記性質を有する誘導性プロモーターであり、
該プロモーターの転写活性はブドウ糖の存在により制御
を受ける。
るとは、異化代謝産物または誘導因子などの影響を受け
て発現及び産生が制御される性質を意味する。これはプ
ロモーターの転写活性能が、異化代謝産物または誘導因
子などによって制御される転写調節遺伝子により支配さ
れていることによるものである。例えば、AOXプロモ
ーターは上記性質を有する誘導性プロモーターであり、
該プロモーターの転写活性はブドウ糖の存在により制御
を受ける。
【0013】本発明の変異株は、メタノール資化性とブ
ドウ糖資化性とを共に持ち合わせてなるものであればい
かなる手段によって得られるものであってもよい。具体
的には、異種蛋白質産生可能なメタノール資化性菌株を
変異原処理することによって取得されるものが例示され
る。
ドウ糖資化性とを共に持ち合わせてなるものであればい
かなる手段によって得られるものであってもよい。具体
的には、異種蛋白質産生可能なメタノール資化性菌株を
変異原処理することによって取得されるものが例示され
る。
【0014】(1)異種蛋白質を産生可能なメタノール
資化性菌株 本発明において変異原処理される出発菌株は、「異種蛋
白質を産生可能なメタノール資化性菌株」である。この
メタノール資化性菌株は、ブドウ糖の存在によりカタボ
ライトリプレッションを受ける。即ち、メタノールとブ
ドウ糖が共存する培養条件下では、まずブドウ糖を消費
して異種蛋白質を産生することなく菌株を増殖させ、そ
の後ブドウ糖を消費し尽くした後メタノールの消費を開
始して異種蛋白質を産出する性質を有する。当該菌株
は、異種蛋白質を産生しかつメタノール資化能を有する
ものであり、好ましくは、AOX系プロモーターの支配
下に異種蛋白質を発現、産生することのできるメタノー
ル資化性菌株である。かかる菌株は、AOX系プロモー
ターの支配下に異種蛋白質遺伝子が発現される遺伝子
(以下、ユニットともいう。)を有すればよく、より好
適には、当該ユニットとAOX系プロモーターの支配下
にAOXが発現される遺伝子(以下、AOX系遺伝子と
もいう。)とを一つの菌体内に保持しているものであ
る。このようなユニットおよびAOX系遺伝子の菌株内
での具体的な存在態様を図1、及び図2に例示する。
資化性菌株 本発明において変異原処理される出発菌株は、「異種蛋
白質を産生可能なメタノール資化性菌株」である。この
メタノール資化性菌株は、ブドウ糖の存在によりカタボ
ライトリプレッションを受ける。即ち、メタノールとブ
ドウ糖が共存する培養条件下では、まずブドウ糖を消費
して異種蛋白質を産生することなく菌株を増殖させ、そ
の後ブドウ糖を消費し尽くした後メタノールの消費を開
始して異種蛋白質を産出する性質を有する。当該菌株
は、異種蛋白質を産生しかつメタノール資化能を有する
ものであり、好ましくは、AOX系プロモーターの支配
下に異種蛋白質を発現、産生することのできるメタノー
ル資化性菌株である。かかる菌株は、AOX系プロモー
ターの支配下に異種蛋白質遺伝子が発現される遺伝子
(以下、ユニットともいう。)を有すればよく、より好
適には、当該ユニットとAOX系プロモーターの支配下
にAOXが発現される遺伝子(以下、AOX系遺伝子と
もいう。)とを一つの菌体内に保持しているものであ
る。このようなユニットおよびAOX系遺伝子の菌株内
での具体的な存在態様を図1、及び図2に例示する。
【0015】当該ユニットのメタノール資化性菌株細胞
中での存在様式は、染色体中に挿入あるいは置換されて
組み込まれていてもよいし、またはプラスミドやファー
ジ状態で存在していてもよい。
中での存在様式は、染色体中に挿入あるいは置換されて
組み込まれていてもよいし、またはプラスミドやファー
ジ状態で存在していてもよい。
【0016】このようなユニットを担持するメタノール
資化性菌株は、任意の手段によって調製されるものでよ
く、その調製方法は特に制限されない。例えば一種類の
AOX系遺伝子を担持するメタノール資化性菌株の場
合、AOX系プロモーターの制御のもとで異種蛋白質が
産生されるユニットを直接細胞内に導入することによっ
て調製することができる(図1)。また二種類のAOX
系遺伝子を担持するメタノール資化性菌株の場合は、同
様に該ユニットを直接細胞内に導入することによって、
図2aに示すように2つのAOX遺伝子と該ユニットを
有する態様のものを調製することができるし、また、異
種蛋白質をコードする遺伝子を菌株の染色体中の一方の
AOXプロモーターの下流に組み込むことによって当該
ユニットに相当するユニットを有する態様のものを調製
することができる(図2b)。または、当該ユニット及
びAOX系遺伝子を含むプラスミドベクターまたはファ
ージベクターを適当なメタノール資化性菌株に導入する
ことによっても調製することができる。このような調製
は、自体周知の操作で行うことができる。
資化性菌株は、任意の手段によって調製されるものでよ
く、その調製方法は特に制限されない。例えば一種類の
AOX系遺伝子を担持するメタノール資化性菌株の場
合、AOX系プロモーターの制御のもとで異種蛋白質が
産生されるユニットを直接細胞内に導入することによっ
て調製することができる(図1)。また二種類のAOX
系遺伝子を担持するメタノール資化性菌株の場合は、同
様に該ユニットを直接細胞内に導入することによって、
図2aに示すように2つのAOX遺伝子と該ユニットを
有する態様のものを調製することができるし、また、異
種蛋白質をコードする遺伝子を菌株の染色体中の一方の
AOXプロモーターの下流に組み込むことによって当該
ユニットに相当するユニットを有する態様のものを調製
することができる(図2b)。または、当該ユニット及
びAOX系遺伝子を含むプラスミドベクターまたはファ
ージベクターを適当なメタノール資化性菌株に導入する
ことによっても調製することができる。このような調製
は、自体周知の操作で行うことができる。
【0017】メタノール資化性菌株に導入されるユニッ
トのコピー数は1コピーでも複数であってもよい。かか
るユニットは、リポソーム結合部位、翻訳開始コドン、
シグナルペプチドをコードする遺伝子、翻訳開始コド
ン、ターミネーター、選択マーカー遺伝子または自律複
製遺伝子等を含有していてもよい。
トのコピー数は1コピーでも複数であってもよい。かか
るユニットは、リポソーム結合部位、翻訳開始コドン、
シグナルペプチドをコードする遺伝子、翻訳開始コド
ン、ターミネーター、選択マーカー遺伝子または自律複
製遺伝子等を含有していてもよい。
【0018】このメタノール資化性菌株中のAOX系プ
ロモーターは、プロモーター活性を有していれば野生型
であることを問わず、変異または修飾を施したものでも
よい。好ましくは、プロモーター活性の高い野生型AO
Xプロモーターまたは修飾または変異させることによっ
てプロモーター活性が強化されたAOXプロモーターで
ある。
ロモーターは、プロモーター活性を有していれば野生型
であることを問わず、変異または修飾を施したものでも
よい。好ましくは、プロモーター活性の高い野生型AO
Xプロモーターまたは修飾または変異させることによっ
てプロモーター活性が強化されたAOXプロモーターで
ある。
【0019】具体的には、ピキア酵母の場合を例にとる
と、プロモーター活性の高い野生型AOX1プロモータ
ー、及びプロモーター活性の低いAOX2プロモーター
を適当な処理によって変異または修飾せしめることによ
って活性を増強させた変異型AOX2プロモーターなど
が挙げられる。
と、プロモーター活性の高い野生型AOX1プロモータ
ー、及びプロモーター活性の低いAOX2プロモーター
を適当な処理によって変異または修飾せしめることによ
って活性を増強させた変異型AOX2プロモーターなど
が挙げられる。
【0020】上記の変異型AOX2プロモーターは、例
えばピキア酵母に由来する、AOX1遺伝子によりAO
Xが産生されずその染色体上において野生型AOX2プ
ロモーターを担持してなる菌株をメタノールを単一の炭
素源とする培地で継代培養することにより変異させ、そ
の結果メタノール資化能が上昇した菌株から得ることが
できる。また、これによって得られた変異型AOX2プ
ロモーターの塩基配列を参考にして化学的に合成した
り、野生型AOX2プロモーターを公知の遺伝子工学的
手法(例えば、部位指定削除法〔Site-directed deleti
on, Nucl. AcidsRes., 11, 1645(1983)〕、部位特異的
変異法〔Site-directed Mutagenesis 〕、制限酵素処理
など)によって処理することによっても調製することが
できる。
えばピキア酵母に由来する、AOX1遺伝子によりAO
Xが産生されずその染色体上において野生型AOX2プ
ロモーターを担持してなる菌株をメタノールを単一の炭
素源とする培地で継代培養することにより変異させ、そ
の結果メタノール資化能が上昇した菌株から得ることが
できる。また、これによって得られた変異型AOX2プ
ロモーターの塩基配列を参考にして化学的に合成した
り、野生型AOX2プロモーターを公知の遺伝子工学的
手法(例えば、部位指定削除法〔Site-directed deleti
on, Nucl. AcidsRes., 11, 1645(1983)〕、部位特異的
変異法〔Site-directed Mutagenesis 〕、制限酵素処理
など)によって処理することによっても調製することが
できる。
【0021】メタノール資化性菌株としては、具体的に
はピキア酵母(Pichia pastoris)、Hansenula 属菌、Ca
ndida 属菌、Rhodotorula 属菌、Sporobolomyces属菌等
の酵母、Methylomonas methanica、Methylophilus meth
ylotrophus、Methylococcus属、Methylosinus属、Pseud
omonas 属、Methylobacterium属等の細菌が挙げられ
る。
はピキア酵母(Pichia pastoris)、Hansenula 属菌、Ca
ndida 属菌、Rhodotorula 属菌、Sporobolomyces属菌等
の酵母、Methylomonas methanica、Methylophilus meth
ylotrophus、Methylococcus属、Methylosinus属、Pseud
omonas 属、Methylobacterium属等の細菌が挙げられ
る。
【0022】異種蛋白質としては、ヒト血清アルブミ
ン、B型肝炎ウイルス抗原、プロウロキナーゼ、組織プ
ラスミノーゲン・アクチベーター、各種インターフェロ
ン、免疫グロブリン、コロニー形成刺激因子などが例示
される。用いられる異種蛋白質の遺伝子(構造遺伝子)
としては、このような所望の異種蛋白質をコードする遺
伝子であれば特に制限はなく、またいかなる方法で得ら
れるものであってもよい。この構造遺伝子は公知の遺伝
子工学的手法を用いて、好ましくはAOX系プロモータ
ーの下流域に組み込まれ、メタノール資化性菌株に導入
することができる。例えば形質転換法、即ち染色体へ組
み込む方法、または直接メタノール資化性菌株細胞内に
導入する方法などが用いられる。
ン、B型肝炎ウイルス抗原、プロウロキナーゼ、組織プ
ラスミノーゲン・アクチベーター、各種インターフェロ
ン、免疫グロブリン、コロニー形成刺激因子などが例示
される。用いられる異種蛋白質の遺伝子(構造遺伝子)
としては、このような所望の異種蛋白質をコードする遺
伝子であれば特に制限はなく、またいかなる方法で得ら
れるものであってもよい。この構造遺伝子は公知の遺伝
子工学的手法を用いて、好ましくはAOX系プロモータ
ーの下流域に組み込まれ、メタノール資化性菌株に導入
することができる。例えば形質転換法、即ち染色体へ組
み込む方法、または直接メタノール資化性菌株細胞内に
導入する方法などが用いられる。
【0023】前述の態様を有する菌株の具体例として
は、GCP101株、SHG4105株、UHG42−
3株(特願平3−63598号、同3−63599号)
等が例示される。
は、GCP101株、SHG4105株、UHG42−
3株(特願平3−63598号、同3−63599号)
等が例示される。
【0024】(2)変異原処理による突然変異 本発明の変異株は、(1)に記載した菌株を、その細胞
106 〜1010個/ml当たりEMS等の変異原が0.
1〜10%程度存在する環境において、5〜37℃で1
0分〜3時間程度処理することにより得ることができ
る。次いで、得られた変異株を0.01〜0.1%程度
の2−デオキシグルコースを加えた適当なメタノール含
有培地〔例えば、YPM培地(1%酵母抽出物、2%バ
クトペプトン、1%メタノール)等〕を用いて培養する
ことにより、本発明の変異株を選択することができる。
106 〜1010個/ml当たりEMS等の変異原が0.
1〜10%程度存在する環境において、5〜37℃で1
0分〜3時間程度処理することにより得ることができ
る。次いで、得られた変異株を0.01〜0.1%程度
の2−デオキシグルコースを加えた適当なメタノール含
有培地〔例えば、YPM培地(1%酵母抽出物、2%バ
クトペプトン、1%メタノール)等〕を用いて培養する
ことにより、本発明の変異株を選択することができる。
【0025】変異原としては、EMSの他、例えば2−
アミノプリン、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N’
−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、アクリジンなどが
挙げられる。これらは単独に用いてもよいし、また組み
合わせて用いてもよい。
アミノプリン、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N’
−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、アクリジンなどが
挙げられる。これらは単独に用いてもよいし、また組み
合わせて用いてもよい。
【0026】(3)得られた変異株の性状 本発明の変異株は、ブドウ糖の存在によるカタボライト
リプレッションを受けない。従って、当該変異株はメタ
ノールを単一の炭素源とする培地は勿論、メタノールと
ブドウ糖とが共存する培地中で培養されて、増殖と共に
異種蛋白質を産生することができる
リプレッションを受けない。従って、当該変異株はメタ
ノールを単一の炭素源とする培地は勿論、メタノールと
ブドウ糖とが共存する培地中で培養されて、増殖と共に
異種蛋白質を産生することができる
【0027】(4)変異株を培養することによる異種蛋
白質の製造方法。 かくして得られた変異株は適切な公知培地中で培養する
ことによって、所望の異種蛋白質を産生させることがで
きる。培地には該形質転換体の生育に必須な炭素源、窒
素源、無機物、ビタミン、薬剤などが含有される。詳細
には、メタノールを単一の炭素源とする培地、並びにメ
タノールとブドウ糖とが共存する培地を用いることがで
きる。
白質の製造方法。 かくして得られた変異株は適切な公知培地中で培養する
ことによって、所望の異種蛋白質を産生させることがで
きる。培地には該形質転換体の生育に必須な炭素源、窒
素源、無機物、ビタミン、薬剤などが含有される。詳細
には、メタノールを単一の炭素源とする培地、並びにメ
タノールとブドウ糖とが共存する培地を用いることがで
きる。
【0028】具体的には、例えば変異株が酵母の場合、
YPDM培地(1% Bacto Yeast Extract, 2% Bacto
Peptone, 2% Glucose,0.5% Methanol)、YPD
培地(1% Bacto Yeast Extract, 2% Bacto Pepton
e, 2% Glucose)、YPG培地(1% Bacto Yeast Ex
tract, 2% Bacto Peptone, 2% Glycerol )、YP
M培地(1% Bacto Yeast Extract, 2% Bacto Pepto
ne, 2% Methanol)、0.1〜5%メタノールを含有し
たYNB液体培地〔0.7% Yeast Nitrogen Base(Dif
co社)〕、及び0.01〜5%メタノールを含有したY
P培地〔1% Bacto Yeast Extract(Difco社) , 2% P
oly Peptone(大五栄養社)〕、及びSMM培地 (2% M
ethanol,0.5% CH 3 COONH 4 -synthetic medium)な
どが挙げられる。
YPDM培地(1% Bacto Yeast Extract, 2% Bacto
Peptone, 2% Glucose,0.5% Methanol)、YPD
培地(1% Bacto Yeast Extract, 2% Bacto Pepton
e, 2% Glucose)、YPG培地(1% Bacto Yeast Ex
tract, 2% Bacto Peptone, 2% Glycerol )、YP
M培地(1% Bacto Yeast Extract, 2% Bacto Pepto
ne, 2% Methanol)、0.1〜5%メタノールを含有し
たYNB液体培地〔0.7% Yeast Nitrogen Base(Dif
co社)〕、及び0.01〜5%メタノールを含有したY
P培地〔1% Bacto Yeast Extract(Difco社) , 2% P
oly Peptone(大五栄養社)〕、及びSMM培地 (2% M
ethanol,0.5% CH 3 COONH 4 -synthetic medium)な
どが挙げられる。
【0029】培養は、通常15℃〜45℃、好ましくは
約30℃〜40℃で1〜200時間程度おこなわれる。
必要に応じて通気、攪拌を加えることもできる。培地の
pHは5〜8の範囲が好ましい。
約30℃〜40℃で1〜200時間程度おこなわれる。
必要に応じて通気、攪拌を加えることもできる。培地の
pHは5〜8の範囲が好ましい。
【0030】培養後、培養上清中または形質転換体中に
蓄積された目的の異種蛋白質は公知の方法で抽出、精製
される。例えば、塩析法、溶媒沈澱法、透析法、限外濾
過法、ゲル電気泳動法、あるいはゲル濾過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の手
法を組み合わせて分離精製することができる。
蓄積された目的の異種蛋白質は公知の方法で抽出、精製
される。例えば、塩析法、溶媒沈澱法、透析法、限外濾
過法、ゲル電気泳動法、あるいはゲル濾過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の手
法を組み合わせて分離精製することができる。
【0031】なお、本発明において使用する多くの技
法、反応及び分析方法は当業者らに自体周知のものであ
る。また、酵素、プラスミド等は商業的に入手できるも
のを用いることができる。
法、反応及び分析方法は当業者らに自体周知のものであ
る。また、酵素、プラスミド等は商業的に入手できるも
のを用いることができる。
【0032】本発明をより詳細に説明するために、以下
に実施例及び参考例を挙げるが、本発明はこれらにより
何ら限定されるものではない。
に実施例及び参考例を挙げるが、本発明はこれらにより
何ら限定されるものではない。
【0033】以下の実施例及び参考例で使用した全ての
酵素は、特に断らない限り商業的供給源、例えば宝酒造
株式会社等から入手したものである。また、酵素反応の
ための緩衝液及び反応条件は特に断らない限り各酵素の
製造元の推奨に従って使用した。
酵素は、特に断らない限り商業的供給源、例えば宝酒造
株式会社等から入手したものである。また、酵素反応の
ための緩衝液及び反応条件は特に断らない限り各酵素の
製造元の推奨に従って使用した。
【0034】ピキアパストリス(Pichia pastoris) GT
S115株、GCP1O4株、及びプラスミドpPGP
1はフィリップス・ペトリウム社から入手した。
S115株、GCP1O4株、及びプラスミドpPGP
1はフィリップス・ペトリウム社から入手した。
【0035】実施例1で得られたECCR72株は、
(財)発酵研究所に寄託されている〔寄託番号IFO
No. 10612(1992年12月28日)〕。
(財)発酵研究所に寄託されている〔寄託番号IFO
No. 10612(1992年12月28日)〕。
【0036】
参考例1 Mut+菌株であるGCP101株の取得
(図3参照) 特開平2−104290号公報記載の方法により、ピキ
アパストリス(Pichiapastoris) GTS115のAOX
1遺伝子領域に、AOX1プロモーター支配下にHSA
が発現する転写ユニットを持つプラスミドpPGP1を
制限酵素NotIで切断して得られる断片を置換挿入し
てGCP104株(AOX1欠失株)を得た。この株は
AOX1遺伝子を欠失しており、メタノールを資化する
AOXの産生を発現効率の低いAOX2遺伝子に任せて
いるため、メタノールを単一の炭素源とする培養基の中
での増殖能が低下している(Mut−株)。
(図3参照) 特開平2−104290号公報記載の方法により、ピキ
アパストリス(Pichiapastoris) GTS115のAOX
1遺伝子領域に、AOX1プロモーター支配下にHSA
が発現する転写ユニットを持つプラスミドpPGP1を
制限酵素NotIで切断して得られる断片を置換挿入し
てGCP104株(AOX1欠失株)を得た。この株は
AOX1遺伝子を欠失しており、メタノールを資化する
AOXの産生を発現効率の低いAOX2遺伝子に任せて
いるため、メタノールを単一の炭素源とする培養基の中
での増殖能が低下している(Mut−株)。
【0037】GCP104株をYPD培地(1%バクト酵
母抽出物、2%バクトペプトン、2%グルコース)3mlに
植菌し、24時間後に初期OD540 =1となるようにY
PD培地50mlに植菌した。3日間30℃で培養後に
初期OD540 =1となるようにYPM培地(1%バクト酵
母抽出物、2%バクトペプトン、2%メタノール)50ml
に植菌した。さらにYPM培地を用いて、3日毎に同様
の継代を繰り返した。継代毎に菌体を107 cell/plate
になるように滅菌水で希釈して2% Methanol-YNB w/o
a.a.プレート(0.7% Yeast Nitogen Base without Amin
o acid 、2%メタノール、1.5%ゼラチン)に塗布し、3
0℃5日間培養してコロニーの有無を判断した。その結
果、12日間継代後に塗布した2% Methanol-YNB w/o
a.a.プレートから20個のコロニーが生じた。
母抽出物、2%バクトペプトン、2%グルコース)3mlに
植菌し、24時間後に初期OD540 =1となるようにY
PD培地50mlに植菌した。3日間30℃で培養後に
初期OD540 =1となるようにYPM培地(1%バクト酵
母抽出物、2%バクトペプトン、2%メタノール)50ml
に植菌した。さらにYPM培地を用いて、3日毎に同様
の継代を繰り返した。継代毎に菌体を107 cell/plate
になるように滅菌水で希釈して2% Methanol-YNB w/o
a.a.プレート(0.7% Yeast Nitogen Base without Amin
o acid 、2%メタノール、1.5%ゼラチン)に塗布し、3
0℃5日間培養してコロニーの有無を判断した。その結
果、12日間継代後に塗布した2% Methanol-YNB w/o
a.a.プレートから20個のコロニーが生じた。
【0038】このプレートにおいてはメタノールが唯一
の炭素源であるため、メタノール資化性の低いMut−
株は殆ど生育できない。ゆえにこのプレートに生じたこ
のコロニーは、即ちメタノールの資化性の上昇した変異
株Mut+のものである。この資化性の上昇は、AOX
2プロモーターが変異し、プロモーター活性が増強する
ことによりAOX2構造遺伝子に由来するAOXが産生
されるようになったことに基づく。これらコロニーの内
の1つを適当に滅菌水で希釈して2% Methanol-YNB w/
o a.a. プレートに拡げ、シングルコロニーに単離し
た。その内1つをGCP101と名付けた。
の炭素源であるため、メタノール資化性の低いMut−
株は殆ど生育できない。ゆえにこのプレートに生じたこ
のコロニーは、即ちメタノールの資化性の上昇した変異
株Mut+のものである。この資化性の上昇は、AOX
2プロモーターが変異し、プロモーター活性が増強する
ことによりAOX2構造遺伝子に由来するAOXが産生
されるようになったことに基づく。これらコロニーの内
の1つを適当に滅菌水で希釈して2% Methanol-YNB w/
o a.a. プレートに拡げ、シングルコロニーに単離し
た。その内1つをGCP101と名付けた。
【0039】実施例1 変異原による突然変異、及び得
られた変異株を培養することによる異種蛋白質の製造 突然変異 参考例1で得られたGCP101株をYPD培地で培養
して、その2×108個/ml当たり、EMSを2.9
%となるように添加し、30℃1時間処理した。その
後、0.02%の2−デオキシグルコースを含むYPM
培地(1%酵母抽出物、2%バクトペプトン、1%メタ
ノール)を用い、突然変異株である2−デオキシグルコ
ース耐性株を分離した。EMSによる2−デオキシグル
コース耐性株の出現頻度は1.4×10-4〜3.3×1
0-4であり、EMS未処理の場合の出現頻度2×10-7
〜2×10-6と比べて約100倍に上昇した。
られた変異株を培養することによる異種蛋白質の製造 突然変異 参考例1で得られたGCP101株をYPD培地で培養
して、その2×108個/ml当たり、EMSを2.9
%となるように添加し、30℃1時間処理した。その
後、0.02%の2−デオキシグルコースを含むYPM
培地(1%酵母抽出物、2%バクトペプトン、1%メタ
ノール)を用い、突然変異株である2−デオキシグルコ
ース耐性株を分離した。EMSによる2−デオキシグル
コース耐性株の出現頻度は1.4×10-4〜3.3×1
0-4であり、EMS未処理の場合の出現頻度2×10-7
〜2×10-6と比べて約100倍に上昇した。
【0040】継代培養 上記において得られた突然変異株を0.02%の2−デ
オキシグルコースを含むYPM(1%酵母抽出物、2%
バクトペプトン、1%メタノール)培地においてさらに
継代培養し、2−デオキシグルコース耐性株であるEC
CR72株を選択、単離した。
オキシグルコースを含むYPM(1%酵母抽出物、2%
バクトペプトン、1%メタノール)培地においてさらに
継代培養し、2−デオキシグルコース耐性株であるEC
CR72株を選択、単離した。
【0041】本培養 YPD培地(1%酵母抽出物、2%バクトペプトン、2
%ブドウ糖)で一晩培養した上記ECCR72株の菌体
懸濁液を50mlのYPDM培地(1%酵母抽出物、2
%バクトペプトン、2%ブドウ糖、0.5%メタノー
ル)に1%の割合になるように植菌して、300ml容
のバッフル付三角フラスコを用いて30℃で振盪培養を
行った。対象菌株として、出発菌株GCP101を同様
に培養して、経時的にそれぞれの菌体濃度(波長540
nmにおける吸光度)、ブドウ糖濃度、及びメタノール
濃度、及び産生されるHSA濃度を測定、比較した。
%ブドウ糖)で一晩培養した上記ECCR72株の菌体
懸濁液を50mlのYPDM培地(1%酵母抽出物、2
%バクトペプトン、2%ブドウ糖、0.5%メタノー
ル)に1%の割合になるように植菌して、300ml容
のバッフル付三角フラスコを用いて30℃で振盪培養を
行った。対象菌株として、出発菌株GCP101を同様
に培養して、経時的にそれぞれの菌体濃度(波長540
nmにおける吸光度)、ブドウ糖濃度、及びメタノール
濃度、及び産生されるHSA濃度を測定、比較した。
【0042】結果 GCP101株では、ブドウ糖が消費し尽くされた後に
メタノールの消費が始まる(図4)、グルコースカタボ
ライトリプレッション現象が見られ、実験時間内におい
て、HSAの産生は見られなかった。一方、ECCR7
2株は、ブドウ糖とメタノールとを同時に消費した。ま
た、メタノール消費に伴って、培地中にはHSAが分泌
されていることが確認できた(図5)。
メタノールの消費が始まる(図4)、グルコースカタボ
ライトリプレッション現象が見られ、実験時間内におい
て、HSAの産生は見られなかった。一方、ECCR7
2株は、ブドウ糖とメタノールとを同時に消費した。ま
た、メタノール消費に伴って、培地中にはHSAが分泌
されていることが確認できた(図5)。
【0043】
【発明の効果】本発明の変異株によれば、メタノールと
ブドウ糖とが共存する培地を用いることができ、菌株の
増殖と異種蛋白質の発現及び産生とを同時に行うことが
できる。従って、異種蛋白質を短時間にかつ大量に産生
することが可能である。
ブドウ糖とが共存する培地を用いることができ、菌株の
増殖と異種蛋白質の発現及び産生とを同時に行うことが
できる。従って、異種蛋白質を短時間にかつ大量に産生
することが可能である。
【図1】菌株内におけるユニット(AOX系プロモータ
ーの支配下に異種蛋白質が発現されるユニット)の存在
態様において、出発菌株が一種類のAOX系プロモータ
ーを担持するものである場合を示す。
ーの支配下に異種蛋白質が発現されるユニット)の存在
態様において、出発菌株が一種類のAOX系プロモータ
ーを担持するものである場合を示す。
【図2】菌株内におけるユニット(AOX系プロモータ
ーの支配下に異種蛋白質が発現されるユニット)の存在
態様において、出発菌株が二種類のAOX系プロモータ
ーを担持するものである場合を示す。
ーの支配下に異種蛋白質が発現されるユニット)の存在
態様において、出発菌株が二種類のAOX系プロモータ
ーを担持するものである場合を示す。
【図3】GTS115株、GCP104株のAOX1、
AOX2遺伝子領域、及びGCP101株の取得方法を
示す図である。図中、Prom.はプロモーターを、
t.はターミネーターを、PolyはポリA領域を示
す。
AOX2遺伝子領域、及びGCP101株の取得方法を
示す図である。図中、Prom.はプロモーターを、
t.はターミネーターを、PolyはポリA領域を示
す。
【図4】GCP101株をYPDM培地で培養した際の
菌体密度(吸光度)、培地中のブドウ糖濃度及びメタノ
ール濃度、産生されたHSA濃度の経時的消長を示す図
である。
菌体密度(吸光度)、培地中のブドウ糖濃度及びメタノ
ール濃度、産生されたHSA濃度の経時的消長を示す図
である。
【図5】ECCR72株をYPDM培地で培養した際の
菌体密度(吸光度)、培地中のブドウ糖濃度及びメタノ
ール濃度、産生されたHSA濃度の経時的消長を示す図
である。
菌体密度(吸光度)、培地中のブドウ糖濃度及びメタノ
ール濃度、産生されたHSA濃度の経時的消長を示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:84) (C12P 21/00 C12R 1:84) (72)発明者 川辺 晴英 大阪府大阪市中央区今橋一丁目3番3号 株式会社ミドリ十字内
Claims (3)
- 【請求項1】 メタノール資化性で、かつブドウ糖資化
性である異種蛋白質産生可能な変異株。 - 【請求項2】 異種蛋白質を産生可能なメタノール資化
性菌株を変異原処理することによって得られる、請求項
1記載の変異株。 - 【請求項3】 請求項1または請求項2記載の変異株を
培養することを特徴とする、異種蛋白質の製造方法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5004289A JPH06209763A (ja) | 1993-01-13 | 1993-01-13 | 変異株 |
US08/181,242 US5643792A (en) | 1993-01-13 | 1994-01-13 | Mutant strain of Pichia pastoris which utilizes methanol in the presence of glucose |
EP94100460A EP0606917A3 (en) | 1993-01-13 | 1994-01-13 | A methylotropic and glucotropic mutant strain for producing a heterologous protein. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5004289A JPH06209763A (ja) | 1993-01-13 | 1993-01-13 | 変異株 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06209763A true JPH06209763A (ja) | 1994-08-02 |
Family
ID=11580365
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5004289A Pending JPH06209763A (ja) | 1993-01-13 | 1993-01-13 | 変異株 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5643792A (ja) |
EP (1) | EP0606917A3 (ja) |
JP (1) | JPH06209763A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003526365A (ja) * | 2000-03-16 | 2003-09-09 | シャンタ バイオテクニックス (ピー) リミテッド | 遺伝子工学的に改変された酵母からのヒトインターフェロンアルファの生産工程 |
JP2008531000A (ja) * | 2005-02-23 | 2008-08-14 | テッヒニシェ・ウニフェルジテート・グラーツ | 突然変異体aox1プロモーター |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102757976B (zh) * | 2012-07-12 | 2014-10-08 | 华东理工大学 | 消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性的方法 |
JP2018501814A (ja) | 2014-11-11 | 2018-01-25 | クララ フーズ カンパニー | 卵白タンパク質産生のための方法および組成物 |
AU2020309602A1 (en) | 2019-07-11 | 2022-02-24 | Clara Foods Co. | Protein compositions and consumable products thereof |
US12096784B2 (en) | 2019-07-11 | 2024-09-24 | Clara Foods Co. | Protein compositions and consumable products thereof |
US10927360B1 (en) | 2019-08-07 | 2021-02-23 | Clara Foods Co. | Compositions comprising digestive enzymes |
US11739166B2 (en) | 2020-07-02 | 2023-08-29 | Davol Inc. | Reactive polysaccharide-based hemostatic agent |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
IL81817A0 (en) * | 1986-03-14 | 1987-10-20 | Phillips Petroleum Co | Methanol and glucose responsive yeast regulatory regions |
IL89992A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts |
DE3851535T2 (de) * | 1988-12-20 | 1995-02-02 | Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh | Mutanter Stamm von einem methylotrophen Organismus und Verfahren zur Herstellung eines Proteins in methylotrophen Organismus. |
EP0547171A1 (en) * | 1990-09-05 | 1993-06-23 | The Salk Institute Biotechnology Industrial Associates, Inc. | Production of human lysozyme in methylotrophic yeast cells and efficient secretion therefrom |
CA2063890C (en) * | 1991-03-27 | 2007-03-13 | Masami Miura | Mutant aox2 promoter, microorganism carrying same, method of preparation thereof and production of heterologous protein using such microorganism |
-
1993
- 1993-01-13 JP JP5004289A patent/JPH06209763A/ja active Pending
-
1994
- 1994-01-13 US US08/181,242 patent/US5643792A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-01-13 EP EP94100460A patent/EP0606917A3/xx not_active Withdrawn
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003526365A (ja) * | 2000-03-16 | 2003-09-09 | シャンタ バイオテクニックス (ピー) リミテッド | 遺伝子工学的に改変された酵母からのヒトインターフェロンアルファの生産工程 |
JP2008531000A (ja) * | 2005-02-23 | 2008-08-14 | テッヒニシェ・ウニフェルジテート・グラーツ | 突然変異体aox1プロモーター |
JP2012080886A (ja) * | 2005-02-23 | 2012-04-26 | Technische Univ Graz | 突然変異体aox1プロモーター |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0606917A2 (en) | 1994-07-20 |
EP0606917A3 (en) | 1995-07-19 |
US5643792A (en) | 1997-07-01 |
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