JP2003526365A - 遺伝子工学的に改変された酵母からのヒトインターフェロンアルファの生産工程 - Google Patents
遺伝子工学的に改変された酵母からのヒトインターフェロンアルファの生産工程Info
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- JP2003526365A JP2003526365A JP2001567311A JP2001567311A JP2003526365A JP 2003526365 A JP2003526365 A JP 2003526365A JP 2001567311 A JP2001567311 A JP 2001567311A JP 2001567311 A JP2001567311 A JP 2001567311A JP 2003526365 A JP2003526365 A JP 2003526365A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
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Abstract
(57)【要約】
遺伝子工学的に改変された酵母であるＰ．パストリスから生理学的に活性なヒトインターフェロンアルファを生産する工程は、プロモーターを有し、機能上融合領域がない状態でヒトインターフェロンアルファ遺伝子にリンクされるプラスミドにおいて、線形化されたプラスミドを生産するために酵素での切断と；Ｐ．パストリスクローンを形成するために相同性組換え体によって線形化されたプラスミドへのＰ．パストリス細胞の形質転換と；インターフェロンの収率が高いＰ．パストリスクローンを探索するために高い発現のインターフェロンアルファにおけるＰ．パストリスクローンのスクリーニングと；インターフェロンの収率が高いＰ．パストリスクローンの成長と；及びインターフェロンの収率が高いＰ．パストリスクローンからの生理学的に活性なヒトインターフェロンアルファタンパク質の精製とを含有する。
Description
【０００１】
優先権の主張
この出願は、１９９９年３月１９日に出願されたインド国特許出願番号８２６
／ＭＡＳ／９８に優先権を主張する。
／ＭＡＳ／９８に優先権を主張する。
【０００２】
引用への照合
引用された参照文献に対する完全な引用文は書目で見ることができる。
【０００３】
発明の分野
本発明は遺伝子工学的に改変された酵母からヒトのインターフェロンアルファ
の生産工程に関する。より詳細には、本発明は、メチロトローフな（ｍｅｔｈｙ
ｌｏｔｒｏｐｉｃ）酵母であるピキア．パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓ）（以下Ｐ．パストリスという）の遺伝子からヒトのインターフェロンア
ルファのクローニング及び発現、並びにそのタンパク質の精製工程に関する。
の生産工程に関する。より詳細には、本発明は、メチロトローフな（ｍｅｔｈｙ
ｌｏｔｒｏｐｉｃ）酵母であるピキア．パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓ）（以下Ｐ．パストリスという）の遺伝子からヒトのインターフェロンア
ルファのクローニング及び発現、並びにそのタンパク質の精製工程に関する。
【０００４】
関連技術の記載
ウィルスに対して人体が最も迅速に生成する防御である、インターフェロンは
、ウィルス、微生物、及び異なる種類の高分子にさらされた場合に、体細胞から
分泌されるタンパク質である。次いで、分泌されたインターフェロンは、ウィル
スの増殖、免疫反応、細胞成長及び他の細胞機能を順次制御するであろう別のタ
ンパク質を生成するために周辺細胞を刺激する。ヒトのインターフェロンには３
種類のクラスがある： （ｉ）白血球により分泌されるインターフェロンアルファ、 （ｉｉ）線維芽細胞により分泌されるインターフェロンベータ、 （ｉｉｉ）リンパ球により分泌されるインターフェロンガンマ。
、ウィルス、微生物、及び異なる種類の高分子にさらされた場合に、体細胞から
分泌されるタンパク質である。次いで、分泌されたインターフェロンは、ウィル
スの増殖、免疫反応、細胞成長及び他の細胞機能を順次制御するであろう別のタ
ンパク質を生成するために周辺細胞を刺激する。ヒトのインターフェロンには３
種類のクラスがある： （ｉ）白血球により分泌されるインターフェロンアルファ、 （ｉｉ）線維芽細胞により分泌されるインターフェロンベータ、 （ｉｉｉ）リンパ球により分泌されるインターフェロンガンマ。
【０００５】
インターフェロンアルファ及びインターフェロンベータは、Ｉ型インターフェ
ロンと呼ばれ、インターフェロンガンマはＩＩ型インターフェロンと呼ばれてい
る。ヒトのインターフェロンアルファのタンパク質は、一般的に１６５若しくは
１６６のアミノ酸を含み、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように１７００
０乃至２００００ダルトンの範囲の分子量を有する。
ロンと呼ばれ、インターフェロンガンマはＩＩ型インターフェロンと呼ばれてい
る。ヒトのインターフェロンアルファのタンパク質は、一般的に１６５若しくは
１６６のアミノ酸を含み、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように１７００
０乃至２００００ダルトンの範囲の分子量を有する。
【０００６】
インターフェロンアルファは、例えば、ウィルス感染のＢ、Ｃ及びＤ型肝炎並
びに毛状細胞白血病、先天性免疫不全症候群に関するカポジ肉腫、慢性骨髄性白
血病、及び腎臓部の細胞癌などのガン疾病などの、様々なウィルス及びガンに関
する疾病の治療にて使用されている。
びに毛状細胞白血病、先天性免疫不全症候群に関するカポジ肉腫、慢性骨髄性白
血病、及び腎臓部の細胞癌などのガン疾病などの、様々なウィルス及びガンに関
する疾病の治療にて使用されている。
【０００７】
ヒトの白血球のインターフェロンアルファは、組織培養したヒトの細胞株から
若しくは血液ドナーから集められたヒトの白血球の何れかにより生産される。Ｈ
ｏｒｏｗｉｔｚ等の１９８２年の米国特許出願番号４６８０２６１、５５０３８
２８、５３９１７１３、４７３２６８３、４６９６８９９、５７８９５５１及び
欧州特許出願番号ＥＰ０９４５４６３。それらの工程は困難であり、退屈であり
、時間を浪費する。使用される培地はコストがかかり、得られる生成物質の収率
は低い。未確認の感染因子により、白血球の調製のために使用された血液の汚染
の危険性がある。
若しくは血液ドナーから集められたヒトの白血球の何れかにより生産される。Ｈ
ｏｒｏｗｉｔｚ等の１９８２年の米国特許出願番号４６８０２６１、５５０３８
２８、５３９１７１３、４７３２６８３、４６９６８９９、５７８９５５１及び
欧州特許出願番号ＥＰ０９４５４６３。それらの工程は困難であり、退屈であり
、時間を浪費する。使用される培地はコストがかかり、得られる生成物質の収率
は低い。未確認の感染因子により、白血球の調製のために使用された血液の汚染
の危険性がある。
【０００８】
組換えＤＮＡ技術の到来によって、微生物でヒトインターフェロンアルファ遺
伝子のクローンが可能となり、それらの微生物から十分に大量のヒトインターフ
ェロンアルファの生産が可能となった。１９８１年のＳｔａｈｅｌｉｎ等、１９
８９年のＨｏ等、１９９２年のＹａｎｇ等、１９８６年のＴａｒｎｏｗｓｋｉ等
、１９８６年のＴｈａｔｃｈｅｒ等、１９８２年のＴｉｕｔｅ等の米国特許出願
番号５７１００２７、５６６１００９、４７６５９０３、５１９６３２３、４３
１５８５２、４８４５０３２、４５３０９０１並びに欧州特許出願番号ＥＰ００
３２１３４及びＥＰ０６７９７１８は、組換えＥ．コリ及びサッカロミセス セ
レビシエ（以下Ｓ．セレビシエという）からヒトインターフェロンアルファの生
産工程を記載している。Ｅ．コリでのヒトインターフェロンアルファの発現と精
製は自然生成に関する問題と危険性を克服したが、その手法自体の問題を有する
。数多の事例での発現されたタンパク質は性格に処理されなかった。精製された
タンパク質は細菌の菌体内毒素を有するべきではない。追加的な精製段階が、菌
体内毒素を除去するために必要とされる。加えて、使用される工程は、複数のク
ロマトグラフィー段階を含み、したがって時間を浪費する。それらの工程は、大
規模生産用の先行条件として、スケールアップすることが困難である。サッカロ
ミセスで発現される組換え体ヒトインターフェロンアルファの収率は低い。した
がって、適切な宿主でヒトインターフェロンアルファの発現するための必要性が
あり、及び簡素で効率的で容易く計量可能な精製処理の必要がある。
伝子のクローンが可能となり、それらの微生物から十分に大量のヒトインターフ
ェロンアルファの生産が可能となった。１９８１年のＳｔａｈｅｌｉｎ等、１９
８９年のＨｏ等、１９９２年のＹａｎｇ等、１９８６年のＴａｒｎｏｗｓｋｉ等
、１９８６年のＴｈａｔｃｈｅｒ等、１９８２年のＴｉｕｔｅ等の米国特許出願
番号５７１００２７、５６６１００９、４７６５９０３、５１９６３２３、４３
１５８５２、４８４５０３２、４５３０９０１並びに欧州特許出願番号ＥＰ００
３２１３４及びＥＰ０６７９７１８は、組換えＥ．コリ及びサッカロミセス セ
レビシエ（以下Ｓ．セレビシエという）からヒトインターフェロンアルファの生
産工程を記載している。Ｅ．コリでのヒトインターフェロンアルファの発現と精
製は自然生成に関する問題と危険性を克服したが、その手法自体の問題を有する
。数多の事例での発現されたタンパク質は性格に処理されなかった。精製された
タンパク質は細菌の菌体内毒素を有するべきではない。追加的な精製段階が、菌
体内毒素を除去するために必要とされる。加えて、使用される工程は、複数のク
ロマトグラフィー段階を含み、したがって時間を浪費する。それらの工程は、大
規模生産用の先行条件として、スケールアップすることが困難である。サッカロ
ミセスで発現される組換え体ヒトインターフェロンアルファの収率は低い。した
がって、適切な宿主でヒトインターフェロンアルファの発現するための必要性が
あり、及び簡素で効率的で容易く計量可能な精製処理の必要がある。
【０００９】
メチロトローフな酵母であるＰ．パストリスは、タンパク質発現システムとし
て一般的になってきている。ピキア（Ｐｉｃｈｉａｓ）は、下記の利点を有して
いる：第一に細胞内タンパク質の著しい収率；第二に高い細胞密度への容易い発
酵；第三に遺伝的な安定性及び収率を損なわないスケールアップ；及び第四とし
て菌体内毒素感染がないことである。
て一般的になってきている。ピキア（Ｐｉｃｈｉａｓ）は、下記の利点を有して
いる：第一に細胞内タンパク質の著しい収率；第二に高い細胞密度への容易い発
酵；第三に遺伝的な安定性及び収率を損なわないスケールアップ；及び第四とし
て菌体内毒素感染がないことである。
【００１０】
このように、Ｅ．コリ発現及び組換え体インターフェロンの精製に関する欠点
は、メチロトローフな酵母であるＰ．パストリスでヒトインターフェロンアルフ
ァのクローニング及び発現によって克服できる。したがって、本発明の目的はＰ
．パストリスでヒトインターフェロンアルファ遺伝子のクローニング及び発現を
行なうことである。本発明の別の目的は、Ｐ．パストリスで発現された組換え体
ヒトインターフェロンアルファにおいて容易くスケールアップできる効率的な精
製工程を発展することである。
は、メチロトローフな酵母であるＰ．パストリスでヒトインターフェロンアルフ
ァのクローニング及び発現によって克服できる。したがって、本発明の目的はＰ
．パストリスでヒトインターフェロンアルファ遺伝子のクローニング及び発現を
行なうことである。本発明の別の目的は、Ｐ．パストリスで発現された組換え体
ヒトインターフェロンアルファにおいて容易くスケールアップできる効率的な精
製工程を発展することである。
【００１１】
詳細な記載
この発明は、遺伝子工学的に改変された酵母から生理学的に活性なヒトインタ
ーフェロンアルファを生産する工程を提供する。この工程は下記の段階を有する
。プロモーターを有し、機能上融合領域がない状態でヒトインターフェロンアル
ファ遺伝子にリンクされるプラスミドは、線形化されたプラスミドを生産するた
めに酵素（好ましくはＮｏｔＩ）で切断される。Ｐ．パストリス細胞は、Ｐ．パ
ストリスクローンを形成するために相同性組換え体によって線形化されたプラス
ミドに形質転換される。Ｐ．パストリスクローンは、インターフェロンの収率が
高いＰ．パストリスクローンを探索するために高い発現のインターフェロンアル
ファにおいてスクリーニングされる。インターフェロンの収率が高いＰ．パスト
リスクローンを成長させる。生理学的に活性なヒトインターフェロンアルファタ
ンパク質は、インターフェロンの収率が高いＰ．パストリスクローンから精製さ
れる。
ーフェロンアルファを生産する工程を提供する。この工程は下記の段階を有する
。プロモーターを有し、機能上融合領域がない状態でヒトインターフェロンアル
ファ遺伝子にリンクされるプラスミドは、線形化されたプラスミドを生産するた
めに酵素（好ましくはＮｏｔＩ）で切断される。Ｐ．パストリス細胞は、Ｐ．パ
ストリスクローンを形成するために相同性組換え体によって線形化されたプラス
ミドに形質転換される。Ｐ．パストリスクローンは、インターフェロンの収率が
高いＰ．パストリスクローンを探索するために高い発現のインターフェロンアル
ファにおいてスクリーニングされる。インターフェロンの収率が高いＰ．パスト
リスクローンを成長させる。生理学的に活性なヒトインターフェロンアルファタ
ンパク質は、インターフェロンの収率が高いＰ．パストリスクローンから精製さ
れる。
【００１２】
好ましくは、プラスミドはＡＯＸ１プロモーターを含有するプラスミドｐＨＩ
Ｌ−Ｄ２にヒトインターフェロンアルファ遺伝子をクローニングすることによっ
て構築される。ＧＡＰ、ＭＯＸ、ＦＭＤ、ＡＤＨ、ＬＡＣ４、ＸＰＲ２、ＬＥＵ
２、ＧＡＭ１、ＰＧＫ１、ＧＡＬ７、ＧＡＤＰＨ、ＣＹＣ１、及びＣＵＰ１など
の他のプロモーターが周知であり、同様な成功率で機能するだろう。Ｅ．コリは
、クローニングされたヒトインターフェロンアルファ遺伝子を含有するプラスミ
ドｐＨＩＬ−Ｄ２に形質転換される。次いで、形質転換されたＥ．コリは、プラ
スミドｐＨＩＬ−Ｄ２のＡＯＸ１プロモーターに関して適切な配位のインターフ
ェロンアルファ遺伝子を含んでいる組換えクローンにおいてスクリーニングされ
る。プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２は、インビトロジェンコーポレーション（アメリ
カ合衆国、カリフォルニア州、カールスバッド）から市販されて入手可能であり
、インビトロジェンコーポレーションのカタログに記載されている。ヒトインタ
ーフェロンアルファを発現する形質転換されたＰ．パストリスクローンは、２０
００年２月３日にアメリカ合衆国２０１１０−２２０９バージニア州マナサス１
０８０１ユニバーシティビルディングのアメリカンタイプカルチャーコレクショ
ンに寄託され、ＰＴＡ−１２７６の受託番号で入手可能である。
Ｌ−Ｄ２にヒトインターフェロンアルファ遺伝子をクローニングすることによっ
て構築される。ＧＡＰ、ＭＯＸ、ＦＭＤ、ＡＤＨ、ＬＡＣ４、ＸＰＲ２、ＬＥＵ
２、ＧＡＭ１、ＰＧＫ１、ＧＡＬ７、ＧＡＤＰＨ、ＣＹＣ１、及びＣＵＰ１など
の他のプロモーターが周知であり、同様な成功率で機能するだろう。Ｅ．コリは
、クローニングされたヒトインターフェロンアルファ遺伝子を含有するプラスミ
ドｐＨＩＬ−Ｄ２に形質転換される。次いで、形質転換されたＥ．コリは、プラ
スミドｐＨＩＬ−Ｄ２のＡＯＸ１プロモーターに関して適切な配位のインターフ
ェロンアルファ遺伝子を含んでいる組換えクローンにおいてスクリーニングされ
る。プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２は、インビトロジェンコーポレーション（アメリ
カ合衆国、カリフォルニア州、カールスバッド）から市販されて入手可能であり
、インビトロジェンコーポレーションのカタログに記載されている。ヒトインタ
ーフェロンアルファを発現する形質転換されたＰ．パストリスクローンは、２０
００年２月３日にアメリカ合衆国２０１１０−２２０９バージニア州マナサス１
０８０１ユニバーシティビルディングのアメリカンタイプカルチャーコレクショ
ンに寄託され、ＰＴＡ−１２７６の受託番号で入手可能である。
【００１３】
好ましくは、遺伝子工学的に改変した酵母からのヒトインターフェロンアルフ
ァの生産は下記の段階を使用する： １．プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２へのヒトインターフェロンアルファのクローニ
ング； ２．クローニングされたヒトインターフェロン遺伝子を含有するプラスミドｐ
ＨＩＬ−Ｄ２に形質転換； ３．プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２のＡＯＸ１プロモーターに関して適切な配位の
インターフェロンアルファ遺伝子を含んでいる組換えクローンにおいて形質転換
されたＥ．コリをスクリーニング； ４．ｐＨＩＬ−Ｄ２のＮｏｔＩフラグメントを得るためにＮｏｔＩ酵素でＥ．
コリのプラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２を切断； ５．相同性組換え体によってインターフェロンアルファ遺伝子を含んでいるｐ
ＨＩＬ−Ｄ２のＮｏｔＩフラグメントをＰ．パストリス細胞に形質転換； ６．インターフェロンアルファの発現においてＰ．パストリスクローンをスク
リーニングし、インターフェロンの高い収率のクローンからインターフェロンア
ルファ遺伝子のヌクレオチド配列の確定； ７．ここに記載されるような適切な状態下の発酵器で高い収率のＰ．パストリ
スクローンの成長； ８．ここに記載されるようなバッファーで発酵器から得られるＰ．パストリス
細胞を洗浄； ９．ここに記載されるように、プロテアーゼ阻害剤の存在下において、ビーズ
ミルでガラスビーズを用いＰ．パストリス細胞を破壊； １０．ここに記載のような終濃度が４乃至８Ｍのタンパク質可溶化剤を添加し
、２００乃至３００ｒｐｍで４乃至７℃の遠心分離の有無に関係なく、２乃至１
０時間攪拌； １１．バッファーで１０乃至３０倍に前述の段階の抽出物を希釈し、抽出物の
濃縮の有無に関係なく遠心分離若しくはフィルター化の何れかによってここに記
載のように続いて浄化する； １２．バッファーで前述の抽出物のｐＨを調整、遠心分離若しくはフィルター
化に続いて、ｐＨを３乃至５に調整； １３．“ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ”（アメリカ合衆国、ニュージャージー州
、ニューマーケット、ファルマシアファインケミカル）の陽イオン交換カラムで
前述の抽出物を吸着し、アルカリ塩化物でヒトインターフェロンアルファを含有
するタンパク質を溶出； １４．ヒトインターフェロンアルファを含有している前述の溶出されたサンプ
ルのｐＨを中性ｐＨに調整し、マトリックスに結合している抗ヒトインターフェ
ロンアルファモノクローナル抗体を含有している免疫アフィニティカラムで調製
したサンプルを吸着、ここに記載されるようにｐＨ４．０以下でインターフェロ
ンアルファを溶出； １５．溶出されたインターフェロンアルファを無菌濾過によってダイアフィル
トレーション。
ァの生産は下記の段階を使用する： １．プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２へのヒトインターフェロンアルファのクローニ
ング； ２．クローニングされたヒトインターフェロン遺伝子を含有するプラスミドｐ
ＨＩＬ−Ｄ２に形質転換； ３．プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２のＡＯＸ１プロモーターに関して適切な配位の
インターフェロンアルファ遺伝子を含んでいる組換えクローンにおいて形質転換
されたＥ．コリをスクリーニング； ４．ｐＨＩＬ−Ｄ２のＮｏｔＩフラグメントを得るためにＮｏｔＩ酵素でＥ．
コリのプラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２を切断； ５．相同性組換え体によってインターフェロンアルファ遺伝子を含んでいるｐ
ＨＩＬ−Ｄ２のＮｏｔＩフラグメントをＰ．パストリス細胞に形質転換； ６．インターフェロンアルファの発現においてＰ．パストリスクローンをスク
リーニングし、インターフェロンの高い収率のクローンからインターフェロンア
ルファ遺伝子のヌクレオチド配列の確定； ７．ここに記載されるような適切な状態下の発酵器で高い収率のＰ．パストリ
スクローンの成長； ８．ここに記載されるようなバッファーで発酵器から得られるＰ．パストリス
細胞を洗浄； ９．ここに記載されるように、プロテアーゼ阻害剤の存在下において、ビーズ
ミルでガラスビーズを用いＰ．パストリス細胞を破壊； １０．ここに記載のような終濃度が４乃至８Ｍのタンパク質可溶化剤を添加し
、２００乃至３００ｒｐｍで４乃至７℃の遠心分離の有無に関係なく、２乃至１
０時間攪拌； １１．バッファーで１０乃至３０倍に前述の段階の抽出物を希釈し、抽出物の
濃縮の有無に関係なく遠心分離若しくはフィルター化の何れかによってここに記
載のように続いて浄化する； １２．バッファーで前述の抽出物のｐＨを調整、遠心分離若しくはフィルター
化に続いて、ｐＨを３乃至５に調整； １３．“ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ”（アメリカ合衆国、ニュージャージー州
、ニューマーケット、ファルマシアファインケミカル）の陽イオン交換カラムで
前述の抽出物を吸着し、アルカリ塩化物でヒトインターフェロンアルファを含有
するタンパク質を溶出； １４．ヒトインターフェロンアルファを含有している前述の溶出されたサンプ
ルのｐＨを中性ｐＨに調整し、マトリックスに結合している抗ヒトインターフェ
ロンアルファモノクローナル抗体を含有している免疫アフィニティカラムで調製
したサンプルを吸着、ここに記載されるようにｐＨ４．０以下でインターフェロ
ンアルファを溶出； １５．溶出されたインターフェロンアルファを無菌濾過によってダイアフィル
トレーション。
【００１４】
高い収率のＰ．パストリスクローンの成長における好ましい条件は、ｐＨ５．
０、２８乃至３０℃の発酵器で５００乃至１５００ｒｐｍを２日間の攪拌であり
、４８時間メタノールで誘発する。
０、２８乃至３０℃の発酵器で５００乃至１５００ｒｐｍを２日間の攪拌であり
、４８時間メタノールで誘発する。
【００１５】
発酵器から得られるＰ．パストリス細胞を洗浄するために使用される好ましい
バッファーは、重量モル濃度が２５乃至１００ｍＭで、ｐＨ６．５乃至８、１乃
至５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のリン酸ナトリウムバッファーで
ある。
バッファーは、重量モル濃度が２５乃至１００ｍＭで、ｐＨ６．５乃至８、１乃
至５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のリン酸ナトリウムバッファーで
ある。
【００１６】
ビーズミルで破壊に使用される好ましいプロテアーゼ阻害剤は、０．５乃至２
．０ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）である。
．０ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）である。
【００１７】
使用される好ましいタンパク質可溶化剤は４乃至８Ｍ濃度の塩化グアニジウム
若しくは尿素である。
若しくは尿素である。
【００１８】
抽出物を１０乃至３０倍に希釈するために使用される好ましいバッファーはト
リス塩酸２５乃至１００ｍＭ、尿素０乃至１Ｍ、ｐＨ６．５乃至８である。
リス塩酸２５乃至１００ｍＭ、尿素０乃至１Ｍ、ｐＨ６．５乃至８である。
【００１９】
遠心分離若しくは濾過及び濃縮によって好ましく実行される浄化は、好ましく
は超濾過（ｕｌｔｒａ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）による。
は超濾過（ｕｌｔｒａ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）による。
【００２０】
濃縮されたサンプルは、遠心分離及び濾過に続き、クエン酸バッファー（２５
乃至１００ｍＭ、ｐＨ４乃至５）で希釈される。
乃至１００ｍＭ、ｐＨ４乃至５）で希釈される。
【００２１】
浄化は、濃縮なしの遠心分離若しくは濾過の何れかであり、抽出物のｐＨはク
エン酸バッファー（１乃至２Ｍ、ｐＨ２乃至５）で調整される。
エン酸バッファー（１乃至２Ｍ、ｐＨ２乃至５）で調整される。
【００２２】
抽出物のｐＨを好ましくｐＨ３乃至５への調整に使用されるバッファーはクエ
ン酸で、抽出物の容量に依存して２５乃至１００ｍＭ若しくは１乃至２Ｍの何れ
かであり、ｐＨ２乃至５である。
ン酸で、抽出物の容量に依存して２５乃至１００ｍＭ若しくは１乃至２Ｍの何れ
かであり、ｐＨ２乃至５である。
【００２３】
ヒトインターフェロンアルファを含有するタンパク質を溶出するためのアルカ
リ塩化物は好ましくは塩化ナトリウムである。
リ塩化物は好ましくは塩化ナトリウムである。
【００２４】
使用される好ましいマトリックスは一次アミンを介するリガンドの結合におけ
るアフィニティサポートである。最も好ましいマトリックスはアメリカ合衆国、
カリフォルニア州、ヘルキュールスのバイオラッドから入手可能な“ＡＦＦＩ−
ＧＥＬ−１０”である。インターフェロンアルファは好ましくはｐＨ２乃至４で
溶出される。
るアフィニティサポートである。最も好ましいマトリックスはアメリカ合衆国、
カリフォルニア州、ヘルキュールスのバイオラッドから入手可能な“ＡＦＦＩ−
ＧＥＬ−１０”である。インターフェロンアルファは好ましくはｐＨ２乃至４で
溶出される。
【００２５】
本発明は下記の流れ図及び実施例に関して記載されるだろう。
【００２６】
実施例１
Ｐ．パストリスでヒトインターフェロンアルファ遺伝子のクローニング段階を
概要する図１を参照するに、ヒトインターフェロンアルファ遺伝子は増幅（好ま
しくはＰＣＲによって）され、ＥｃｏＲＩで切断される。ＡＯＸ１プロモーター
を含有するプラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２は、ＥｃｏＲＩでの切断によって線形化さ
れる。インターフェロンアルファ遺伝子は、切断されたｐＨＩＬ−Ｄ２にライゲ
ーションされる。Ｅ．コリ細胞はｐＨＩＬ−Ｄ２−ＩＦＮプラスミドと形質転換
される。Ｅ．コリ形質転換体は、ＩＦＮアルファ遺伝子がｐＨＩＬ−Ｄ２プラス
ミドに存在するＡＯＸ１プロモーターに関して正確な配位である組換え体におい
てスクリーニングされる。Ｐ．パストリスは、ＮｏｔＩで切断されたｐＨＩＬ−
Ｄ２プラスミドで形質転換される。これは、相同性組換え体により酵母のゲノム
にＩＦＮ遺伝子が統合される結果となる。組換え体は、最低限の培地で成長する
組換え体の能力によって選択される。組換え体は、ヒトアルファインターフェロ
ンの細胞内発現においてスクリーニングされる。インターフェロンアルファを発
現するＰ．パストリスは最小限の培地の発酵器で成長され、ｐＨ５．０、２８乃
至３０℃、５００乃至１２００ｒｐｍを２日間、４８時間のメタノールで誘発さ
れる。
概要する図１を参照するに、ヒトインターフェロンアルファ遺伝子は増幅（好ま
しくはＰＣＲによって）され、ＥｃｏＲＩで切断される。ＡＯＸ１プロモーター
を含有するプラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２は、ＥｃｏＲＩでの切断によって線形化さ
れる。インターフェロンアルファ遺伝子は、切断されたｐＨＩＬ−Ｄ２にライゲ
ーションされる。Ｅ．コリ細胞はｐＨＩＬ−Ｄ２−ＩＦＮプラスミドと形質転換
される。Ｅ．コリ形質転換体は、ＩＦＮアルファ遺伝子がｐＨＩＬ−Ｄ２プラス
ミドに存在するＡＯＸ１プロモーターに関して正確な配位である組換え体におい
てスクリーニングされる。Ｐ．パストリスは、ＮｏｔＩで切断されたｐＨＩＬ−
Ｄ２プラスミドで形質転換される。これは、相同性組換え体により酵母のゲノム
にＩＦＮ遺伝子が統合される結果となる。組換え体は、最低限の培地で成長する
組換え体の能力によって選択される。組換え体は、ヒトアルファインターフェロ
ンの細胞内発現においてスクリーニングされる。インターフェロンアルファを発
現するＰ．パストリスは最小限の培地の発酵器で成長され、ｐＨ５．０、２８乃
至３０℃、５００乃至１２００ｒｐｍを２日間、４８時間のメタノールで誘発さ
れる。
【００２７】
発酵からのヒトインターフェロンアルファの下流の工程及び精製の第一の好ま
しい方法における段階を概要する図２を参照するに、発酵培養は採取され、細胞
は溶解バッファー、２５ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ８．０、２ｍＭＥ
ＤＴＡで洗浄される。洗浄された細胞は１ｍＭのＰＭＳＦ存在下のビーズミルで
ガラスビーズを用いて破壊される。細胞抽出物を破壊するために、固体の塩化グ
アニジウムが７Ｍ終濃度に添加され、遠心分離の有無に関係なく２００乃至３０
０ｒｐｍで４乃至６時間攪拌される。前述の段階の抽出物は１乃至１０μｌのＰ
ＭＳＦを含有している２５ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５バッファーで２０倍に希釈
され、遠心分離若しくは濾過によって浄化される。浄化された抽出物は、超濾過
によって１０倍に濃縮される。１０倍に濃縮された抽出物は、１μｌのＰＭＳＦ
を含有しているｐＨ４．０の５０ｍＭクエン酸バッファーで再度１０倍に希釈さ
れる。クエン酸で希釈された抽出物は遠心分離若しくは濾過により浄化され、超
濾過によって１０倍に濃縮される。前述の濃縮された抽出物はＳＰ−ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅで陽イオン交換クロマトグラフィーを受け、塩化ナトリウムの勾配で溶
出される。
しい方法における段階を概要する図２を参照するに、発酵培養は採取され、細胞
は溶解バッファー、２５ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ８．０、２ｍＭＥ
ＤＴＡで洗浄される。洗浄された細胞は１ｍＭのＰＭＳＦ存在下のビーズミルで
ガラスビーズを用いて破壊される。細胞抽出物を破壊するために、固体の塩化グ
アニジウムが７Ｍ終濃度に添加され、遠心分離の有無に関係なく２００乃至３０
０ｒｐｍで４乃至６時間攪拌される。前述の段階の抽出物は１乃至１０μｌのＰ
ＭＳＦを含有している２５ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５バッファーで２０倍に希釈
され、遠心分離若しくは濾過によって浄化される。浄化された抽出物は、超濾過
によって１０倍に濃縮される。１０倍に濃縮された抽出物は、１μｌのＰＭＳＦ
を含有しているｐＨ４．０の５０ｍＭクエン酸バッファーで再度１０倍に希釈さ
れる。クエン酸で希釈された抽出物は遠心分離若しくは濾過により浄化され、超
濾過によって１０倍に濃縮される。前述の濃縮された抽出物はＳＰ−ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅで陽イオン交換クロマトグラフィーを受け、塩化ナトリウムの勾配で溶
出される。
【００２８】
前述の溶出されたＩＦＮ分画のｐＨは７．０に調整され、この分画はＡＦＦＩ
−ＧＥＬ−１０マトリックス（アメリカ合衆国、カリフォルニア州、ヘルキュー
ルス、バイオ−ラッド）に結合されたモノクローナル抗体を含有している免疫ア
フィニティカラムにロードされる。純粋なインターフェロンは０．２Ｍ酢酸及び
０．１５Ｍ塩化ナトリウムで溶出される。溶出されたインターフェロンはダイア
フィルトレーションされ、無菌濾過される。
−ＧＥＬ−１０マトリックス（アメリカ合衆国、カリフォルニア州、ヘルキュー
ルス、バイオ−ラッド）に結合されたモノクローナル抗体を含有している免疫ア
フィニティカラムにロードされる。純粋なインターフェロンは０．２Ｍ酢酸及び
０．１５Ｍ塩化ナトリウムで溶出される。溶出されたインターフェロンはダイア
フィルトレーションされ、無菌濾過される。
【００２９】
実施例２
ヒトインターフェロンアルファ遺伝子は、実施例１で記載される同様な手法で
増幅され、クローニングされた。
増幅され、クローニングされた。
【００３０】
発酵からのヒトインターフェロンアルファの下流の工程及び精製の第一の好ま
しい方法における段階を概要する図３を参照するに、発酵培養は採取され、細胞
は溶解バッファー；２５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー；及び２ｍＭＥＤＴＡ
、ｐＨ８．０で洗浄される。洗浄された細胞は１ｍＭのＰＭＳＦ存在下のビーズ
ミルでガラスビーズを用いて破壊される。細胞抽出物を破壊するために、固体の
塩化グアニジウムが７Ｍ終濃度に添加され、遠心分離の有無に関係なく２００乃
至３００ｒｐｍで４乃至６時間攪拌される。前述の段階の抽出物は１乃至１０μ
ｌのＰＭＳＦを含有している２５ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５バッファーで２０倍
に希釈され、遠心分離若しくは濾過によって浄化される。前述の浄化された抽出
物のｐＨは、１乃至２Ｍのクエン酸ｐＨ２乃至４でｐＨ４まで引き下げられる。
しい方法における段階を概要する図３を参照するに、発酵培養は採取され、細胞
は溶解バッファー；２５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー；及び２ｍＭＥＤＴＡ
、ｐＨ８．０で洗浄される。洗浄された細胞は１ｍＭのＰＭＳＦ存在下のビーズ
ミルでガラスビーズを用いて破壊される。細胞抽出物を破壊するために、固体の
塩化グアニジウムが７Ｍ終濃度に添加され、遠心分離の有無に関係なく２００乃
至３００ｒｐｍで４乃至６時間攪拌される。前述の段階の抽出物は１乃至１０μ
ｌのＰＭＳＦを含有している２５ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５バッファーで２０倍
に希釈され、遠心分離若しくは濾過によって浄化される。前述の浄化された抽出
物のｐＨは、１乃至２Ｍのクエン酸ｐＨ２乃至４でｐＨ４まで引き下げられる。
【００３１】
前述のｐＨ調整された抽出物は、ＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅで陽イオン交換ク
ロマトグラフィーを受け、塩化ナトリウムの勾配で溶出される。ＩＦＮを含有し
ている前述の溶出された分画のｐＨはｐＨ７．０に調整され、ＡＦＦＩ−ＧＥＬ
−１０マトリックスに結合されたモノクローナル抗体を含有している免疫アフィ
ニティカラムにロードされる。純粋なインターフェロンは０．２Ｍ酢酸及び０．
１５Ｍ塩化ナトリウムで溶出される。溶出されたインターフェロンはダイアフィ
ルトレーションされ、無菌濾過される。
ロマトグラフィーを受け、塩化ナトリウムの勾配で溶出される。ＩＦＮを含有し
ている前述の溶出された分画のｐＨはｐＨ７．０に調整され、ＡＦＦＩ−ＧＥＬ
−１０マトリックスに結合されたモノクローナル抗体を含有している免疫アフィ
ニティカラムにロードされる。純粋なインターフェロンは０．２Ｍ酢酸及び０．
１５Ｍ塩化ナトリウムで溶出される。溶出されたインターフェロンはダイアフィ
ルトレーションされ、無菌濾過される。
【００３２】
表１は精製された組換えインターフェロンアルファの特定の活性及び収率であ
る。インターフェロンアルファの生物学的活性はウイルスの細胞変性効果削減ア
ッセイによって決定される。マジンダービイウシの腎臓（Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂ
ｙ Ｂｏｖｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ） （ＭＤＢＫ）細胞及び水疱性口内炎ウイル
ス（ＶＳＶ）がアッセイに使用された。アッセイは生物学の標準及び制御のため
の国立研究所の連合王国のデータ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆ
ｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ，
Ｕ．Ｋ．Ｄａｔａ）から得られる国際的な参照標準で測定され、精製されたイ
ンターフェロンアルファの３つのバッチが表された。
る。インターフェロンアルファの生物学的活性はウイルスの細胞変性効果削減ア
ッセイによって決定される。マジンダービイウシの腎臓（Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂ
ｙ Ｂｏｖｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ） （ＭＤＢＫ）細胞及び水疱性口内炎ウイル
ス（ＶＳＶ）がアッセイに使用された。アッセイは生物学の標準及び制御のため
の国立研究所の連合王国のデータ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆ
ｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ，
Ｕ．Ｋ．Ｄａｔａ）から得られる国際的な参照標準で測定され、精製されたイ
ンターフェロンアルファの３つのバッチが表された。
【００３３】
【表１】
遺伝的に改変された酵母からインターフェロンアルファを生産する前述の工程
は、組換えＤＮＡ技術が使用される初期の工程にわたり数多の利点を有する。第
一に、Ｐ．パストリスは非常に高密度の細胞に成長でき、インターフェロン遺伝
子は高収率の組換えヒトインターフェロンアルファが獲得できるために強力なア
ルコールオキシダーゼプロモーターを用いて発現できる。さらに、メタノールは
安価な誘導物質である。第二に、相同性組換え体によって酵母のゲノムにインタ
ーフェロン遺伝子が安定して統合するためにプラスミドを維持するために抗生物
質を使用する必要はない。第三に、使用される精製工程は簡素で効率的であり、
発現されたタンパク質の高い回収率になる。第四に、工程はヒトインターフェロ
ンアルファの大量精製において容易くスケールアップできる。最後に、酵母は真
核生物であるために、真核生物のインターフェロンタンパク質のフォールディン
グにおいてより適切な環境を提供できる。たぶん、そのことは、前述の工程によ
り生産されたインターフェロンは、Ｅ．コリから精製されたインターフェロンに
おける初期報告の特定の活性よりも、さらにより高い特定の活性を与えることが
判明した理由のためである。
は、組換えＤＮＡ技術が使用される初期の工程にわたり数多の利点を有する。第
一に、Ｐ．パストリスは非常に高密度の細胞に成長でき、インターフェロン遺伝
子は高収率の組換えヒトインターフェロンアルファが獲得できるために強力なア
ルコールオキシダーゼプロモーターを用いて発現できる。さらに、メタノールは
安価な誘導物質である。第二に、相同性組換え体によって酵母のゲノムにインタ
ーフェロン遺伝子が安定して統合するためにプラスミドを維持するために抗生物
質を使用する必要はない。第三に、使用される精製工程は簡素で効率的であり、
発現されたタンパク質の高い回収率になる。第四に、工程はヒトインターフェロ
ンアルファの大量精製において容易くスケールアップできる。最後に、酵母は真
核生物であるために、真核生物のインターフェロンタンパク質のフォールディン
グにおいてより適切な環境を提供できる。たぶん、そのことは、前述の工程によ
り生産されたインターフェロンは、Ｅ．コリから精製されたインターフェロンに
おける初期報告の特定の活性よりも、さらにより高い特定の活性を与えることが
判明した理由のためである。
【００３４】
このように、遺伝子工学的に改変された酵母Ｐ．パストリスからの組換えヒト
インターフェロンアルファを生産する主題の工程は、簡素で効率的であり、大量
生産において計量可能である。精製されたインターフェロンアルファの収率及び
特定の活性は、他のシステムからの報告よりも高い。
インターフェロンアルファを生産する主題の工程は、簡素で効率的であり、大量
生産において計量可能である。精製されたインターフェロンアルファの収率及び
特定の活性は、他のシステムからの報告よりも高い。
【００３５】
本発明は、ここに例証されて記載された部分の特別の構造及び配置に制限され
ないで、請求項の範囲内で修正される形態を包含することは理解される。
ないで、請求項の範囲内で修正される形態を包含することは理解される。
【００３６】
書目
引用特許文献
ＥＰ４５３９００１ １９８５年７月 Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ
ＥＰ００４３９８０ １９８２年１月 Ｇｏｅｄｄｅｌ等
ＵＳ４６８０２６１ １９８７年７月 Ｎｏｂｕｈａｒａ等
ＵＳ５５０３８２８ １９９６年４月 Ｔｅｓｔａ等
ＵＳ５３９１７１３ １９９５年２月 Ｂｏｒｇ等
ＵＳ４７３２６８３ １９８８年３月 Ｇｅｏｒｇｉａｄｅｓ等
ＵＳ４６９６８９９ １９８７年９月 Ｔｏｔｈ等
ＵＳ５７８９５５１ １９９８年８月 Ｐｅｓｔｋａ
ＥＰ０９４５４６３ １９９９年９月 Ａｔｔａｌｌａ等
ＵＳ５７１００２７ １９９８年１月 Ｈａｕｐｔｍａｎｎ等
ＵＳ５６６１００９ １９９７年８月 Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ
ＥＰ００３２１３４ １９８１年７月 Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ
ＵＳ１０５６２９ １９８８年８月 Ｄ’Ａｎｄｒｅａ等
ＵＳ５１９６３２３ １９９３年３月 Ｂｏｄｏ Ｇｅｒｈａｒｄ等
ＵＳ４３１５８５２ １９８２年２月 Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ等
ＥＰ０６７９７１８ １９９５年１１月 Ｅｔｔｌｉｎ等
ＵＳ４８４５０３２ １９８９年７月 Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒ
他の参照文献
Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ，Ｔ．等、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍ
ｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｗｉ
ｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８１年、第７８巻、ｐ．５０５−５１２ Ｈｏ， Ｌ．Ｊ．等、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕ
ｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｂｙ ｃｏｎｔｒ
ｏｌ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｉｎ ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅ
ｎｔａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８９年、
第１１巻、ｐ．６９５−６９８ Ｙａｎｇ， Ｘ．Ｍ．等、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｐｈａ ｂｙ Ｅ．ｃｏｌｉ
ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｕｌｔｉｖａｔ
ｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、１９９２年、第２３巻、ｐ．２９１−３０１ Ｇｗｙｎｎｅ， Ｄ．Ｌ．等、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅ
ｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒ
ｏｎ ａｎｄ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ ｆｒｏ
ｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、１９８７年、第５巻、ｐ．７１３−７１９ Ｔｉｕｔｅ， Ｍ．Ｆ．等、Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅ
ｎｃｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａ
ｌｐｈａ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｈｅ
ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、１９８２年、第１巻、ｐ．６０３−６０８ Ｈｏｒｏｗｉｔｚ， Ｂ．、Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔ
ｅｒｆｅｒｏｎ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｅｕｋｏｃ
ｙｔｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８６年、第１１
９巻、ｐ．３９−４７ Ｔａｒｎｏｗｓｋｉ， Ｊ．Ｓ．等、Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ
ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８
６年、第１９９巻、ｐ．１５３−１６５ Ｔｈａｔｃｈｅｒ， Ｄ．Ｒ．等、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＩＦＮ−α２、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、１９８６年、第１１９巻、ｐ．１６６−１７７ Ｓｕｄｂｅｒｔ， Ｐ．Ｅ．、Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｙｅａｓｔｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９６年、第７巻、ｐ
．５１７−５２４ Ｒｏｍａｎｏｓ， Ｍ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ Ｐ
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｇｅｎｅ ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ、１９９８年、第６巻、ｐ．５２７−５３３
ｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｗｉ
ｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８１年、第７８巻、ｐ．５０５−５１２ Ｈｏ， Ｌ．Ｊ．等、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕ
ｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｂｙ ｃｏｎｔｒ
ｏｌ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｉｎ ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅ
ｎｔａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８９年、
第１１巻、ｐ．６９５−６９８ Ｙａｎｇ， Ｘ．Ｍ．等、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｐｈａ ｂｙ Ｅ．ｃｏｌｉ
ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｕｌｔｉｖａｔ
ｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、１９９２年、第２３巻、ｐ．２９１−３０１ Ｇｗｙｎｎｅ， Ｄ．Ｌ．等、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅ
ｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒ
ｏｎ ａｎｄ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ ｆｒｏ
ｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、１９８７年、第５巻、ｐ．７１３−７１９ Ｔｉｕｔｅ， Ｍ．Ｆ．等、Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅ
ｎｃｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａ
ｌｐｈａ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｈｅ
ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、１９８２年、第１巻、ｐ．６０３−６０８ Ｈｏｒｏｗｉｔｚ， Ｂ．、Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔ
ｅｒｆｅｒｏｎ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｅｕｋｏｃ
ｙｔｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８６年、第１１
９巻、ｐ．３９−４７ Ｔａｒｎｏｗｓｋｉ， Ｊ．Ｓ．等、Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ
ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８
６年、第１９９巻、ｐ．１５３−１６５ Ｔｈａｔｃｈｅｒ， Ｄ．Ｒ．等、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＩＦＮ−α２、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、１９８６年、第１１９巻、ｐ．１６６−１７７ Ｓｕｄｂｅｒｔ， Ｐ．Ｅ．、Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｙｅａｓｔｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９６年、第７巻、ｐ
．５１７−５２４ Ｒｏｍａｎｏｓ， Ｍ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ Ｐ
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｇｅｎｅ ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ、１９９８年、第６巻、ｐ．５２７−５３３
【図１】
インターフェロンのクローンの発達の概略図である。
【図２】
インターフェロンアルファの下流の工程及び精製の第一の好ましい実施態様を
概要するフローチャートである。
概要するフローチャートである。
【図３】
インターフェロンアルファの下流の工程及び精製の第二の好ましい実施態様を
概要するフローチャートである。
概要するフローチャートである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ
)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，
ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，
ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ
Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ
，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，
ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ
Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ
，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，
ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ
Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ
，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ヨグランマ，チャガンティ レヴァティ
インド国，アンドラ・プラデシュ，セクン
ドラバード 500 015，ティルマルゲリィ
ー，オーピーピー・アールティーシー・コ
ロニー，ドゥーガ・ヴィハー，プロット・
ナンバー17
(72)発明者 スリラム，アクンディ ヴェンカタ
インド国，アンドラ・プラデシュ，セクン
ドラバード 500 026，ウェスト・マレッ
ドパリー，レパクシ・コロニー，プロッ
ト・ナンバー11
(72)発明者 プラサッド，コリー サトヤ ナラヤナ
インド国，アンドラ・プラデシュ，ハイデ
ラーバード 500 007，ハブシグダ，スト
リート・ナンバー ８／９，４−69／７
(72)発明者 ラマナ，コンディボイナ ヴェンカタ
インド国，アンドラ・プラデシュ，ハイデ
ラーバード 500 007，ハブシグダ，スト
リート・ナンバー １，１−２−90／３
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA23 CA04 DA12 EA04
FA02 GA11 HA01
4B064 AG09 CA06 CA19 CC24 CE11
CE12 DA01
4H045 AA10 AA20 BA10 CA40 DA16
EA28 FA74 GA23 GA26
Claims (22)
- 【請求項１】 ａ．プロモーターを有し、機能上融合領域がない状態でヒト
インターフェロンアルファ遺伝子にリンクされるプラスミドにおいて、線形化さ
れたプラスミドを生産するための酵素での切断と； ｂ．ピキア．パストリスクローンを形成するために相同性組換え体によって前
記線形化されたプラスミドへのピキア．パストリス細胞の形質転換と； ｃ．インターフェロンの収率が高いピキア．パストリスクローンを探索するた
めに高い発現のインターフェロンアルファにおける前記ピキア．パストリスクロ
ーンのスクリーニングと； ｄ．前記インターフェロンの収率が高いピキア．パストリスクローンの成長と
；及び ｅ．前記インターフェロンの収率が高いピキア．パストリスクローンからの生
理学的に活性なヒトインターフェロンアルファタンパク質の精製と を含有する遺伝子工学的に改変された酵母であるピキア．パストリスから生理学
的に活性なヒトインターフェロンアルファを生産する工程。 - 【請求項２】 前記切断されたプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーターを含有
するプラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２へのヒトインターフェロンアルファのクローニン
グと；前記クローニングされたヒトインターフェロン遺伝子を含有する前記プラ
スミドｐＨＩＬ−Ｄ２への形質転換と；及び前記プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２の前
記ＡＯＸ１プロモーターに関して適切な配位の前記インターフェロンアルファ遺
伝子を含んでいる組換えクローンにおいて形質転換されたエシェリヒア．コリの
スクリーニングとによって構成されることを特徴とする請求項１に記載の工程。 - 【請求項３】 前記（ａ）の切断段階は、ＮｏｔＩ酵素での切断を含むこと
を特徴とする請求項１に記載の工程。 - 【請求項４】 前記（ｄ）の成長段階は、前記高い収率のピキア．パストリ
スクローンは、ｐＨ５．０、２８乃至３０℃で発酵器にて成長し、５００乃至１
５００ｒｐｍを２日間の攪拌を含み、さらに４８時間メタノールで前記高い収率
のピキア．パストリスクローンの誘発を含有することを特徴とする請求項１に記
載の工程。 - 【請求項５】 前記（ｅ）の精製段階は、 ｉ．バッファーで前記高い収率のピキア．パストリスクローンの洗浄と； ｉｉ．前記高い収率のピキア．パストリスクローンの破壊と； ｉｉｉ．抽出物を形成するために前記高い収率のピキア．パストリスクローン
へのタンパク質可溶化剤の添加と； ｉｖ．バッファーで前記抽出物の希釈、次いで前記希釈された抽出物の浄化と
； ｖ．前記抽出物のｐＨをバッファーでｐＨを３乃至５に調整し、次いで前記抽
出物の遠心分離若しくは濾過と； ｖｉ．陽イオン交換カラムで前記抽出物を吸着し、前記生理学的に活性なヒト
インターフェロンアルファタンパク質の溶出と； ｖｉｉ．前記生理学的に活性なヒトインターフェロンアルファタンパク質のｐ
Ｈを中性ｐＨに調整し、マトリックスに結合している抗ヒトインターフェロンア
ルファモノクローナル抗体を含有している免疫アフィニティカラムで前記生理学
的に活性なヒトインターフェロンアルファタンパク質を吸着し、ｐＨ４．０以下
で純粋な生理学的に活性なインターフェロンアルファタンパク質を溶出；及び ｖｉｉｉ．ダイアフィルトレーションと；次いで ｉｘ．前記溶出された生理学的に活性なヒトインターフェロンアルファタンパ
ク質の無菌濾過と を含有することを特徴とする請求項１に記載の工程。 - 【請求項６】 前記（ｉｉ）の破壊段階はプロテアーゼ阻害剤の存在下にお
いて、ビーズミルでガラスビーズを用いる破壊を含むことを特徴とする請求項５
に記載の工程。 - 【請求項７】 前記（ｉｉ）の段階は、プロテアーゼ阻害剤が０．５乃至２
．０ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含むことを特徴と
する請求項６に記載の工程。 - 【請求項８】 前記（ｉ）の段階は、前記バッファーがｐＨ６．５乃至８．
０の２５乃至１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファーを含むことを特徴とする請
求項５に記載の工程。 - 【請求項９】 前記（ｉｉｉ）の段階は、添加が終濃度４乃至８Ｍの前記タ
ンパク質可溶化剤の添加を含み、４乃至７℃で２００乃至３００ｒｐｍの条件で
２乃至１０時間の攪拌を特徴とする請求項５に記載の工程。 - 【請求項１０】 前記（ｉｉｉ）の段階は、前記タンパク質可溶化剤が４乃
至８Ｍ濃度の塩化グアニジウム若しくは尿素を含むことを特徴とする請求項９に
記載の工程。 - 【請求項１１】 前記（ｉＶ）の段階は、前記希釈が１０乃至３０倍への希
釈を含み、前記バッファーが２５乃至１００ｍＭのトリス塩酸、、ｐＨ６．５乃
至８である０乃至１Ｍの尿素を含み、浄化は、遠心分離若しくは濾過を含むこと
を特徴とする請求項５に記載の工程。 - 【請求項１２】 超濾過による前記抽出物の濃縮をさらに含むことを特徴と
する請求項１１に記載の工程。 - 【請求項１３】 前記（ｉＶ）の段階は、浄化が遠心分離若しくは濾過の何
れかを含むことを特徴とする請求項５に記載の工程。 - 【請求項１４】 前記（Ｖ）の段階は、バッファーでの前記抽出物のｐＨ調
整が、２５乃至１００ｍＭ若しくは１乃至２Ｍの何れかでｐＨ２乃至５であるク
エン酸での調整を含むことを特徴とする請求項５に記載の工程。 - 【請求項１５】 前記（Ｖｉ）の段階は、吸着が陽イオン交換カラムでの前
記抽出物の吸着を含むことを特徴とする請求項５に記載の工程。 - 【請求項１６】 前記濃縮された抽出物を２５乃至１００ｍＭでｐＨ４乃至
５のクエン酸バッファーで希釈し、次いで遠心分離若しくは濾過をさらに含むこ
とを特徴とする請求項１５に記載の工程。 - 【請求項１７】 前記（Ｖｉ）の段階は、前記溶出がアルカリ塩化物での溶
出を含むことを特徴とする請求項５に記載の工程。 - 【請求項１８】 前記（Ｖｉ）の段階は、前記溶出が塩化ナトリウムでの溶
出を含むことを特徴とする請求項５に記載の工程。 - 【請求項１９】 前記（Ｖｉ）の段階は、吸着が一次アミンを介するリガン
ドの結合におけるアフィニティサポートであるマトリックスに結合している抗ヒ
トインターフェロンアルファモノクローナル抗体を含有する免疫アフィニティカ
ラムへの吸着を含むことを特徴とする請求項５に記載の工程。 - 【請求項２０】 前記（Ｖｉ）の段階は、前記溶出が２乃至４間のｐＨで純
粋な生理学的に活性なインターフェロンアルファタンパク質の溶出を含むことを
特徴とする請求項５に記載の工程。 - 【請求項２１】 ａ．融合領域がない状態でＡＯＸ１プロモーターを含有す
るプラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２へのヒトインターフェロンアルファ遺伝子のクロー
ニングと； ｂ．前記クローニングされたヒトインターフェロン遺伝子を含有する前記プラ
スミドｐＨＩＬ−Ｄ２への形質転換と； ｃ．前記プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２の前記ＡＯＸ１プロモーターに関して適切
な配位の前記インターフェロンアルファ遺伝子を含んでいる組換えクローンにお
いて形質転換されたＥ．コリのスクリーニングと； ｄ．ｐＨＩＬ−Ｄ２のフラグメントを生成するために前記プラスミドｐＨＩＬ
−Ｄ２を酵素での切断と； ｅ．ピキア．パストリスクローンを形成するために相同性組換え体によってイ
ンターフェロンアルファ遺伝子を有している前記ｐＨＩＬ−Ｄ２のフラグメント
をピキア．パストリス細胞への形質転換と； ｆ．インターフェロンの収率が高いピキア．パストリスクローンを探索するた
めに高い発現のインターフェロンアルファにおける前記ピキア．パストリスクロ
ーンのスクリーニングと； ｇ．前記インターフェロンの収率が高いピキア．パストリスクローンの成長と
； ｈ．前記インターフェロンの収率が高いピキア．パストリスクローンのバッフ
ァーでの洗浄と； ｉ．前記インターフェロンの収率が高いピキア．パストリスクローンの破壊と
； ｊ．抽出物を形成するために前記インターフェロンの収率が高いピキア．パス
トリスクローンへのタンパク質可溶化剤の添加と； ｋ．バッファーで前記抽出物の希釈、次いで前記希釈された抽出物の浄化と； ｌ．前記抽出物のｐＨをバッファーでｐＨを３乃至５に調整し、次いで前記抽
出物の遠心分離若しくは濾過と； ｍ．前記抽出物を陽イオン交換カラムで吸着し、前記生理学的に活性なヒトイ
ンターフェロンアルファを含有するタンパク質の混合物の溶出と； ｎ．前記生理学的に活性なヒトインターフェロンアルファを含有するタンパク
質の混合物のｐＨを中性ｐＨに調整し、マトリックスに結合している抗ヒトイン
ターフェロンアルファモノクローナル抗体を含有している免疫アフィニティカラ
ムで前記生理学的に活性なヒトインターフェロンアルファを含有するタンパク質
の混合物を吸着し、ｐＨ４．０以下での純粋な生理学的に活性なインターフェロ
ンアルファタンパク質の溶出と；及び ｏ．ダイアフィルトレーションと；次いで前記溶出された生理学的に活性なヒ
トインターフェロンアルファタンパク質の無菌濾過と を含有する遺伝子工学的に改変された酵母であるピキア．パストリスから生理学
的に活性なヒトインターフェロンアルファを生産する工程。 - 【請求項２２】 請求項１の方法から生産された組換えヒトインターフェロ
ン。
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