JPH0937777A - 脊椎動物形質転換細胞の製造方法およびその細胞カルチャー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 組換えＤＮＡ技術を用いて脊椎動物宿主細胞
培養系でポリペプチドを効率的に産生する。 【解決手段】 ポリペプチドをコードしている複製可能
な発現ベクターを内包しておりかつこのベクターの発現
により前記ポリペプチドを産生し得る脊椎動物形質転換
細胞カルチャーの製造方法、および、ポリペプチドをコ
ードしている複製可能な発現ベクターを内包しておりか
つこのベクターの発現により前記ポリペプチドを産生し
得る脊椎動物形質転換細胞カルチャー。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、脊椎動物細胞カル
チャー中でポリペプチドを産生するための組換えＤＮＡ
技術の利用に係る。具体的には、本発明は、発現を起こ
すプロモーター系に有効に結合されておりかつポリペプ
チドをコードしているＤＮＡ配列を含有する発現ベヒク
ルであって、微生物系と特に種々の脊椎動物細胞培養
（カルチャー）系との両者において複製可能であり、か
つコードされたポリペプチドＤＮＡ配列を発現すること
ができる発現ベヒクルで形質転換され、したがって上記
のＤＮＡ配列の発現に向けられる脊椎動物細胞カルチャ
ーおよびその製法に係る。

【０００２】好適具体例において、本発明では、複製、
表現型選択、並びにＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）遺
伝子およびそのための発現プロモーターへの結合に用い
られるＤＮＡ配列を利用する特定の発現ベクターを使用
しうる。前記配列は使用する宿主脊椎動物細胞系に対し
自然であって何ら悪影響がない。ＨＢｓＡｇは約２２ｎ
ｍの粒子の形態で培養基（培地）中に分泌され、Ｂ型肝
炎ウイルス（ＨＢＶ）の抗原決定基を含有する。このよ
うに産生されたＢ型肝炎表面抗原は、Ｂ型肝炎ウイルス
に対するワクチンの製造に使用するのに適しており、本
発明はさらにこの種の細胞培養発現の最終生産物である
ＨＢｓＡｇをＨＢＶに対して有用な、たとえばワクチン
のような実体に変換する手段および方法に関するもので
ある。

【０００３】本発明の背景を説明しかつ特にその実施に
関しさらに詳細な説明を記載している刊行物およびその
他資料をここに参考のため引用し、便宜上参照符号を付
し参考文献として本明細書末尾に記載する。

【０００４】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】組換
えＤＮＡ技術を用いることにより極めて多くの有用なポ
リペプチドの制御された微生物的産生が可能となった。
たとえば、ヒト成長ホルモン、ヒトプロインシュリン、
デアセチルチモシン（desacetylthymosin ）α１、ヒト
およびハイブリッド白血球インターフェロン、ヒト繊維
芽細胞インターフェロンならびに多くの他の生産物のよ
うな、多くの脊椎動物ポリペプチドが既に各種の微生物
により産生されている。この技術の力は極めて多くの種
類の有用なポリペプチドの微生物的産生を可能にし、広
範な種類の薬剤が目標とする用途に有用なホルモン、酵
素、抗体およびワクチンの微生物的製造を可能にする。

【０００５】組換えＤＮＡ技術の基礎的要素はプラスミ
ド、すなわち１個の細胞当り多数のコピーとして、しば
しば細菌中に見出される二本鎖ＤＮＡの染色体外ループ
である。プラスミドＤＮＡにコードされている情報に
は、娘細胞中にプラスミドを再生するのに必要な情報
（「レプリコン」すなわち複製のオリジン）が含まれ、
さらに通常１種もしくはそれ以上の表現型選択特性、た
とえば抗生物質耐性が含まれ、これらは目的とするプラ
スミドを含有する宿主細胞のクローンを識別し、かつ優
先的に選択され培地中で増殖させることを可能にする。
細菌性プラスミドの有用性は、これらプラスミドＤＮＡ
上の異なる部位をそれぞれ識別する種々の制限エンドヌ
クレアーゼすなわち「制限酵素」によりプラスミドを特
定的に開裂させうるという事実にある。その後、開裂部
位でまたは開裂部位に隣接する再構成末端で端部結合
（末端−末端結合）させることにより、異種遺伝子もし
くは遺伝子断片をプラスミド中に挿入することができ
る。いわゆる複製しうる発現ベヒクルはこのようにして
生成される。

【０００６】ＤＮＡ組換えは宿主生物の体外で行なわ
れ、得られる「組換え体」複製可能発現ベヒクルすなわ
ちプラスミドは形質転換として知られる方法により、微
生物細胞中に導入することができ、かつ多量の組換えベ
ヒクルを形質転換体の増殖により得ることができる。さ
らに遺伝子がコードしているＤＮＡメッセージの転写お
よび翻訳を支配するプラスミドの部分に関し適切に遺伝
子を挿入すれば、得られる発現ベヒクルを使用して、挿
入遺伝子がコードしているポリペプチドの産生を指令す
ることができる。この過程を発現という。

【０００７】発現はプロモーターとして知られるＤＮＡ
領域において開始される。発現の転写期において、ＤＮ
Ａはほどけ、開始したＤＮＡ配列からメッセンジャーＲ
ＮＡへの合成の鋳型として露呈される。次いで、メッセ
ンジャーＲＮＡはリボソームに結合し、ここでメッセン
ジャーＲＮＡはこのｍＲＮＡがコードしているアミノ酸
配列を有するポリペプチド鎖に翻訳される。各アミノ酸
はヌクオチドトリプレット、すなわち「コドン」により
コードされており、このコドンが集合して「構造遺伝
子」、すなわち発現ポリペプチド産生物のアミノ酸配列
をコードしているＤＮＡ配列部分を構成する。翻訳は
「開始」信号（通常ＡＴＧ。これは得られるメッセンジ
ャーＲＮＡにおいてはＡＵＧとなる）において開始され
る。いわゆる停止コドンは翻訳の終了を規定し、したが
ってそれ以上のアミノ酸単位の産生を規定する。得られ
る産生物は必要に応じ微生物系において宿主細胞を溶菌
させ、かつ他の蛋白質からの適当な精製により産生物を
回収することにより得られることができる。

【０００８】実際上、組換えＤＮＡ技術の使用は完全に
異種のポリペプチドの発現、いわゆる直接的発現を可能
にし、或いは同種ポリペプチドのアミノ酸配列の一部に
融合した異種ポリペプチドの発現を可能にする。後者の
場合、目的とする生物活性産生物は、しばしば融合した
同種／異種ポリペプチド内において、このポリペプチド
が菌体外環境で開裂されるまで生物不活性にされてい
る。英国特許公開公報第２，００７６７６Ａ号およびＷ
ｅｔｚｅｌ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，
第６８巻，第６６４頁（１９８０）参照。

【０００９】組換えＤＮＡ技術がその有望性を充分に保
持しようとするならば、目的とするポリペプチド産生物
を制御環境においてかつ高収率で入手しうるよう遺伝子
挿入物の発現を最適化する系を案出させねばならない。

【００１０】遺伝学および細胞生理学を研究するための
細胞培養または組織培養の技術は充分に確立されてい
る。単離正常細胞の連続的転移（継代）によって製造さ
れた永久細胞系を維持するための手段および方法を使用
することができる。研究に使用するには、この種の細胞
系は液状媒体中で固体支持体上に維持されるか、或いは
支持栄養物を含有する懸濁物中で増殖させて維持され
る。大規模製造に対するスケールアップは機械的問題を
課するだけであると思われる。その他の技術的背景につ
いてはＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｈａｒｐｅ
ｒおよびＲｏｗ出版社、Ｈａｇｅｒｓｔｏｗｎ，Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ（１９７３）、特に第１１２２頁以降、およ
びＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，第２４５
巻、第６６頁以降（１９８１）を参照することができ
る。そのおのおのを参考のためここに引用する。

【００１１】本発明は、組換えＤＮＡ技術を脊椎動物宿
主細胞培養系において成功裡にかつ効率的にポリペプチ
ドを産生させるのに使用しうるという知見に基づくもの
であり、したがってこの種の系はたとえばグリコシル
化、燐酸化、メチル化ならびに天然に産生される動物性
蛋白質により近縁の糖質および脂質結合という利点を有
し、これに対し細菌もしくは酵母宿主においてはそのよ
うなレベルの洗練された工程による産生は不可能であ
る。さらに、脊椎動物細胞培養は疑いもなく充分にポリ
ペプチド産生物を許容し得、特に或る場合には細胞培養
培地中にその産生物を分泌することさえでき、回収およ
び精製法において著しく有益である。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、このように産
生されたポリペプチド並びにその製造方法および手段に
係る。さらに、本発明は、この種のポリペプチドを発現
しうる上記の発現ベヒクルで形質転換された脊椎動物細
胞カルチャーに係る。さらに他の態様において、本発明
は、このようなＤＮＡ配列、ＤＮＡ発現ベヒクルおよび
カルチャーの製造に有用な種々の方法、ならびにその特
定具体例に係る。

【００１３】一好適具体例において、本発明は、脊椎動
物細胞カルチャー中でＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）
を、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の免疫原性決定基を含
む分離した粒子形態として産生する手段および方法に係
る。このＨＢｓＡｇは個々の粒子形態として細胞カルチ
ャー培地中に分泌され、ＨＢＶゲノムのその他の部分に
より、或いは使用するベクターに同種のＤＮＡによりコ
ードされているかどうかに係わらず、いかなる付加的な
融合ポリペプチド人為構造も含有しない。

【００１４】Ｂ型肝炎（血清肝炎）ウイルスは人間の間
で伝染し、慢性弱質感染として現われ、徐々に重傷の肝
臓障害、初期癌および死亡へと漸次進行する。大抵の場
合、Ｂ型肝炎感染からの完全な回復を期待することがで
きるが、特に多くのアフリカおよびアジア諸国における
人口の多数は慢性保菌者であって、この病気を広い範囲
に伝染させるという危険な潜在性を有している。

【００１５】肝炎はウイルスベクター（Ｂ型肝炎ウイル
スすなわちＨＢＶ）によって引きおこされ、このウイル
スベクターはその完全な状態、すなわちいわゆるデーン
粒子においてビリオンを示し、かつＤＮＡ分子を包封す
る２７ｎｍのヌクレオカプシドとこのヌクレオカプシド
を包囲するエンベロープとから構成されている。ビリオ
ンに関連する蛋白質は、コア抗原（ＨＢｃＡｇ）、ＤＮ
Ａポリメラーゼ、および感染した保菌者の血清中に見出
される表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を包含する。ＨＢｓＡｇ
に対する抗体もＨＢＶ感染者の血清中に見出されてい
る。ＨＢｓＡｇはＨＢＶ抗原であって、抗体（抗−ＨＢ
ｓ）の免疫原性産生を誘発しうると信じられ、したがっ
てＨＢＶワクチンにおける主要素であろう。これについ
ては次の文献を参照することができる：Ｄａｎｅ ｅｔ
ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ（１９７０）（Ｉ），６９５
（１９７０）；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０７，１０９９（１９７
１）；Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ，１０９， ８３４（１９７２）；Ｂｌｕｍｂｅｒ
ｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７， １７（１９７７）；Ｐ
ｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ，Ａｃ
ａｄ，Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７４，１５３０（１９７
７）およびＶｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，Ａ Ｃｏ
ｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ
Ｅｔｉｏｌｏｇｙ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｔ
ｈｏｇｅｎｅｓｉｓおよびＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．（Ｖ
ｙａｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ），Ｆｒａｎｋｌｉｎ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐ
ｈｉａ，１９７８。これら文献のそれぞれを本発明の背
景をさらに説明するためここに参考として引用する。

【００１６】ＨＢｓＡｇは、約１６〜２５ｎｍの範囲の
直径を有する球状粒子、いわゆる「２２ｎｍ粒子」の形
態で、主として感染血漿中に存在する。これらは、非感
染性ウイルスエンベロープであると思われる。ＨＢｓＡ
ｇに対する抗体はＨＢＶ感染に対して予防効果を有する
ので、これらの非感染性粒子をワクチンとして有効に使
用することができる。

【００１７】Ｂ型肝炎ウイルスは細胞培養物（カルチャ
ー）中では感染性でなく、感染したヒトまたは高級霊長
類からしか得られないので、ＨＢＶに対する免疫化用の
抗原を産生させるために使用する充分なＨＢＶの供給源
を獲得しかつ維持する手段は得られなかった。

【００１８】英国特許出願公開第２，０３４，３２３Ａ
号およびヨーロッパ特許出願公開第１３，８２８号及び
第２０，２５１号明細書には、それぞれＨＢＶゲノムの
単離およびクローン化、ＨＢＶコア抗原の発現、ならび
にＨＢｓＡｇの一部を含有するとされている融合蛋白質
のＥ．ｃｏｌｉにおける産生が記載されている。Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），第７７
巻、第４５４９頁（１９８０）は、タンデムクローン化
Ｂ型肝炎ゲノムを用いるマウス細胞の形質転換による、
マウス染色体の一体化（ｉｎｔｅｒｇｒａｔｉｏｎ）を
報告している。

【００１９】Ｍｏｒｉａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），第７８
巻、第２６０６頁（１９８１）はＨＢＶ−ＤＮＡの断片
を有するサルウイルス４０（ＳＶ４０）組換え体）の作
成を記載している。サル腎臓細胞の培養物にウイルス組
換え体を感染させ、そしてＢ型肝炎に感染した患者の血
清中に見出されると同じ特性を有するとされている２２
ｎｍ粒子を産生させた。Ｍｏｒｉａｒｔｙ ｅｔ ａ
ｌ．によれば、組換え体ベクターはＨＢｓＡｇ配列を有
するＨＢＶゲノムの大型セグメントを含有し、かつＳＶ
４０腫瘍蛋白質およびその他のＨＢＶ蛋白質をコードし
ているＤＮＡ配列を包含していた。さらに、それらの作
成は、ＳＶ４０ウイルスのＶＰ−２蛋白質をコードして
いる配列と同じ枠で（ｉｎ ｆｒａｍｅ）ＨＢｓＡｇ
ＤＮＡを組み込んだ。成熟（完全な）ＨＢｓＡｇが発現
されたかどうかは明確でない。

【００２０】

【発明の実施の形態】第１図はＶＰ−１蛋白質をコード
している領域が欠除したＳＶ４０ ＤＮＡを含有するプ
ラスミドｐＳＶＲの作成を示している。

【００２１】第２図はＨＢｓＡｇ ＤＮＡを有するプラ
スミドｐＨＳ９４の作成を示している。

【００２２】第３図はＨＢｓＡｇ ＤＮＡ並びにＳＶ４
０およびｐＢＲ３２２から誘導されたＤＮＡの配列を含
有するプラスミドｐＳＶＨＢＳＡの作成を示している。
第３図Ｂにおいて、ＶＰ−１蛋白質のＡＴＧ開始コドン
（上部の線内に囲われている）を包囲するＤＮＡ配列を
組換え体（下方の線内に囲われたＡＴＧ）で作られるＨ
ＢｓＡｇのＤＮＡ配列と比較した。ＥｃｏＲＩ部位に変
換されたＨinｄIII 部位に下線を施す。

【００２３】第４図はサル細胞におけるプラスミドＤＮ
Ａの複製を示している。単層Ｃｏｓ細胞が６ｃｍのプラ
スチック皿においてコンフルエントの５０〜６０％まで
成長した。これらの細胞をダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ）の改良培地で洗浄し、そして１μｇのプラスミドＤ
ＮＡと２００μｇのＤＥＡＥ−デキストランとを含有す
る培地２ｍｌを１２時間３７℃にした。ＤＮＡ溶液を除
去し、細胞を培地で１回洗浄し、１０％牛胎児血清を含
有する培地５ｍｌを加え、そして細胞をＤＮＡ抽出の前
に３７℃にて１日間または３日間インキュベートした。
これらの場合、小さなスーパーコイルプラスミドＤＮＡ
をＨｉｒｔ（後記参考文献１４参照。以下同じ）の方法
に従って単離した。ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に
かけ、そしてニトロセルロースに移した（１５参照）。
複製プラスミドを可視化するため、ニトロセルロースフ
ィルターを³²Ｐで標識したＨＢＶ ＤＮＡでプローブし
た。レーン（ａ）：ｐＲＩ−Ｂｇｌでトランスフェクシ
ョンした細胞のハート（Ｈｉｒｔ）溶菌物からのＤＮ
Ａ。レーン（ｂ）：ｐＨＢｓ３４８−Ｌでトランスフェ
クションした細胞のハート溶菌物からのＤＮＡ。レーン
（Ｍ）：ｐＨＢｓ３４８−Ｌ ＤＮＡ １μｇ。矢印は
閉環ＤＮＡ（Ｉ）と開環ＤＮＡ（II）の位置を示してい
る。

【００２４】第５図はＣｏｓ細胞における組換え体プラ
スミドにより合成されたＨＢｓＡｇの定量化を示してい
る。単層Ｃｏｓ細胞を６ｃｍのプラスチック皿において
コンフルエントの約５０％まで成長させ、上記第４図の
説明に記載したようにＤＮＡでトランスフェクションし
た。トランスフェクションの後１０％の牛胎児血清を含
有するＤｕｌｂｅｃｃｏ改良培地２ｍｌを加え、そして
培地をそれぞれの時点でＨＢｓＡｇ発現につき２４時間
の蓄積後に分析した。ＨＢｓＡｇ発現は、ＲＩＡ（Ａｂ
ｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）により分析し、０．２ｍｌの未希
釈培地中における１分間当りのカウント数（ｃｐｍ）と
して表わされる。

【００２５】第６図はサル細胞から誘導されたＨＢｓＡ
ｇの免疫原性を示している。ｐＨＢｓ３４８−Ｌでトラ
ンスフェクションしたＣｏｓ細胞の２０個の１５ｃｍ皿
から培地をとり、そして電子顕微鏡検査用に上記のとお
りＨＢｓＡｇを精製した。５匹のマウスからなる３群
を、それぞれ完全フロイントアジュバントの存在下で
２．８μｇ、０．６μｇ、または０．００６μｇの精製
ＨＢｓＡｇで免疫化した。コントロールマウスについて
はヒト血清（Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）から得られた真正ＨＢｓＡ
ｇの同量で免疫化した。免疫化の後、種々の時点で、マ
ウス尾から採血し、抗−ＨＢｓＡｇ抗体をＲＩＡ（Ａｂ
ｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）により定量し、そしてそれらの結
果をマウス１匹当りの平均タイターとして表わした。組
織培養から得られたＨＢｓＡｇで免疫化したマウスは、
ヒト血清から得られたＨＢｓＡｇで免疫化したマウスと
同一のタイターを示した。

【００２６】第７図はＳＶ４０の１部として複製するＨ
ＢＶ配列の存在を示している。

【００２７】第８Ａ図はこの組換え体ベクターにより合
成されたＨＢｓＡｇの蔗糖濃度勾配沈降の結果を示して
いる。第８Ｂ図は対応するＣｓＣｌ濃度勾配遠心分離の
結果である。

【００２８】第９図は本発明に従って、２２ｎｍ粒子と
して合成されたＨＢｓＡｇの電子顕微鏡写真を示してい
る。

【００２９】細胞培養系／細胞培養ベクター 培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、近年
日常的方法となった（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、ＫｒｕｓｅおよびＰ
ａｔｔｅｒｓｏｎ編、１９７３参照）。ここでは、ＨＢ
ｓＡｇを産生するための宿主としてＣＶ−１系サル腎臓
繊維芽細胞を使用した。しかしながら、ここで詳細に記
載した実験は適合性のベクターの複製および発現を可能
とする任意の細胞系、たとえばＷＩ３８、ＢＨＫ、３Ｔ
３、ＣＨＯ、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞系で行なうこ
とができた。さらに、発現ベクターに要求されるもの
は、複製のオリジンと発現すべき遺伝子の前方かつそれ
と一致する解読相にあるプロモーターと、さらに任意の
必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポ
リアデニル化部位および転写終止配列とである。本発明
ではＳＶ４０のこれら必須の要素を利用したが、ここに
好適具体例として記載した本発明はこれら配列のみに限
定するものでないと了解される。たとえば、他のウイル
ス（たとえばＰｏｌｙｍａ，Ａｄｅｎｏ，Ｒｅｔｒｏ，
ＶＳＶ，ＢＰＶなど）ベクターの複製オリジンを使用す
ることができ、さらに非一体化状態で機能しうるＤＮＡ
複製の細胞オリジンも使用することができる。さらに、
ＳＶ４０ ＤＮＡの複製は独特の部位で始まり、二方向
性で進行する（１９参照）。遺伝学的証明によれば、ウ
イルスＤＮＡの複製には１個のみのウイルス遺伝子生産
物が必要とされる。これはＡ遺伝子（Ｔ抗原）の生産物
であり、ウイルスＤＮＡ合成のそれぞれの段階を開始さ
せるのに必要である（１２参照）。ここに記載された実
験が示すところによれば、ＳＶ４０のＤＮＡ複製のオリ
ジンを含有する組換え体プラスミドはＳＶ４０大型Ｔ抗
原の存在下にサル細胞中で複製することができる（２
０，２１参照）。複製およびプロモーター機能の両者を
保持するベクターを作成することが望ましかった。相補
的補助ウイルスの非存在下でこの種の系を使用して異種
遺伝子を発現しうることも確立されている。

【００３０】ポリペプチド産生物 本発明は、生理学的目的で生体生物内で天然に産生され
るポリペプチドならびに不用蛋白質の開裂除去、折り畳
み、組み合せなどによりこの種のポリペプチドに変換処
理しうる中間体と同様な生物活性を示す広範な種類のポ
リペプチドを製造するのに有用である。これらの例はホ
ルモン、たとえばヒト成長ホルモン、牛成長ホルモンな
ど；リンフォカイン；酵素たとえばスーパーオキシドジ
スムターゼなど；インターフェロン、たとえばヒト繊維
芽細胞ならびにヒトおよびハイブリッド白血球インター
フェロンなど；ウイルス抗原もしくはイムノゲン（免疫
原）たとえば口蹄病抗原、インフルエンザ抗原性蛋白
質、肝炎コア抗原および表面抗原など；各種のその他ポ
リペプチド、たとえばヒトインシュリン、ＡＣＴＨ、各
種のグリコ蛋白質、免疫グロブリン、ビタミンＫを必要
とする血液ファクター、たとえば因子VIIIおよびIXなど
である。

【００３１】本発明の発現ベクターは、特にＣＯＳ−７
系サル細胞において異種ポリペプチドの合成を有効に指
令する。ＳＶ４０の初期および後期プロモーターの使用
を開発したが、その他のプロモーターもこの点に関し有
用である。潜在的に有用なポリペプチド（たとえば成長
因子、リンフォカイン、ウイルス抗原、インターフェロ
ン）の効率的発現に加えて、この系はその他の面でも有
用である。たとえば、著しいレベルのＲＮＡがこれらの
ベクターから合成され、このことはイントロンを含有す
るゲノム挿入物が著しいレベルのプロセッシングされた
ＲＮＡを生成し、そこからｃＤＮＡクローンを容易に得
ることができることを示している。したがって、この系
はゲノム挿入物をｃＤＮＡクローンに変換させるのに有
用であることが分かる。さらに、非溶解発現系におい
て、この方法を使用して遺伝子を発現させることがで
き、その目的で選択圧（たとえばジヒドロ葉酸還元酵
素、チミジンキナーゼ、薬剤耐性遺伝子、腫瘍遺伝子）
などを作用させることができ、この結果ウイルス、ＤＮ
Ａ複製オリジンでなく宿主に依在するベクター、ならび
に宿主配列（たとえば動原体）を獲得することにより安
定して複製するベクターの両者を得ることができる。

【００３２】ＶＰ−１蛋白質のコード領域を含有しない
ＳＶ４０ ＤＮＡの作成 ＳＶ４０ ＤＮＡの完全なヌクレオチド配列は公知であ
り（１参照）、したがって種々のＳＶ４０がコードして
いる蛋白質の物理的位置を種々の制限酵素開裂部位と直
接に相関させることができる。ＶＰ−１蛋白質をコード
している領域を包含するヌクレオチド配列（１参照）の
検査により、２つのうまく配置している制限エンドヌク
レアーゼ開裂部位が判明した（第１図）。第１のものは
ヌクレオチド位置１４９３における制限エンドヌクレア
ーゼＨinｄIII の開裂部位であって、ＶＰ−１蛋白質に
対する開始コドンに対しヌクレオチド６個分５’側であ
る。第２のもの、すなわちヌクレオチド２５３３におけ
る制限エンドヌクレアーゼＢamＨＩに対する開裂部位
は、ＶＰ−１蛋白質に対する終止コドンに対してヌクレ
オチド５０個分５’側である。１４９３におけるＨinｄ
III 部位と２５３３におけるＢamＨＩ部位との間が欠除
したＳＶ４０ ＤＮＡを得るために、第１図に示したよ
うな実験を行なった。要するに、野生型のＳＶ４０ Ｄ
ＮＡを先ずＢamＨＩで開裂させて充分な長さの線状ＤＮ
Ａを得、次いでこれを各ＤＮＡ分子が平均して１個のみ
の開裂を受ける（ＳＶ４０ゲノム全体には６個のＨinｄ
III 開裂部位が分布している）を受けるような条件下
で、ＨinｄIII により開裂した。理論上１２種の得られ
る消化ＤＮＡ混合物の１種は所望の１種の組合せである
筈である。次いで、合成デカヌクレオチド、すなわちｄ
ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣ（２参照）をこれらのＢamＨＩお
よびＨinｄIII 処理されたＳＶ４０ ＤＮＡに対しＨin
ｄIII 開裂部位の結合性末端（−ＴＣＧＡ）とデカヌク
レオチドの結合性末端とを介して連結させた。次いで、
全混合物をＥcoＲＩで消化し（添加デカヌクレオチド上
のＥcoＲＩ部位における結合性末端を生ぜしめ）、そし
てＢamおよびＥcoＲＩ（３参照）部位を介してｐＢＲ３
２２中へクローン化させた。ＳＶ４０配列を有するプラ
スミドＤＮＡを制限分析（４参照）によりスクリーニン
グし、規定した欠如部を有するその断片を単離し、ｐＳ
ＶＲと名付けた。

【００３３】合成デカヌクレオチドの添加には２つの目
的がある。第１に、添加デカヌクレオチドは制限エンド
ヌクレアーゼＥcoＲＩに対する開裂部位を有し、この部
位はＳＶ４０ ＤＮＡのこの部分に存在しない。したが
って、Ｅ．ｃｏｌｉ（５参照）中でｐＳＶＲプラスミド
を増殖させ、次いでエンドヌクレアーゼＥcoＲＩおよび
ＢamＨＩにより開裂させることにより、多量のこのＳＶ
４０ ＤＮＡベクター断片を容易に得ることができる。
第２に、この添加デカヌクレオチドは、外来遺伝子のコ
ード配列を有する適切に作成されたＤＮＡをＥcoＲＩ開
裂部位を介してこのＳＶ４０ ＤＮＡに連結させると、
ＨinｄIII 開裂部位とＶＰ−１蛋白質に対する開始コド
ンとの間の本来の物理的間隔を回復する（第３Ｂ図参
照）。

【００３４】８μｇのＢamＨＩで開裂した線状で完全な
長さのＳＶ４０のウイルスＤＮＡ（これは野生型ＳＶ４
０ウイルスＤＮＡまたはクローン化されたＳＶ４０ Ｄ
ＮＡをＢamＨＩを用いてｐＢＲ３２２のＢamＨＩ部位に
て開裂させて得ることができる）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−Ｃｌ（ｐＨ７．５）と６０ｍＭ ＮａＣｌと７ｍＭＭ
ｇＣｌ₂ とを含有する反応混合物５０μｌ中において、
２単位のＨinｄIII（ＢＲＬ）により消化させた。３７
℃にて３０分間インキュベーションした後、過剰のＥＤ
ＴＡを添加して反応を止め、反応混合物をフェノール抽
出により除蛋白し、次いでエタノール沈殿させた。次い
で、部分消化したＤＮＡを１０μｌのＴＥ緩衝液（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）中に再懸濁させた。

【００３５】ＨinｄIII 部位結合性末端をＥcoＲＩ部位
結合性末端に変換させるため、先ず０．１ｎｍｏｌの合
成デカヌクレオチドｄＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣをＡＴＰを
用いて、５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．１）と１０
ｍＭ ＭｇＣｌ₂ と５ｍＭＤＴＴと０．５ｍＭ ＡＴＰ
と１０単位のキナーゼとを含有する反応混合物１０μｌ
中においてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより燐酸化
させた。インキュベーションを３７℃にて１時間行なっ
た。次いで、キナーゼ反応混合物の１アリコート（３μ
ｌ）を６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）と６．
６ｍＭ ＭｇＣｌ₂ と１０ｍＭ ＤＴＴと０．０５ｍｇ
／ｍｌのＢＳＡと０．５ｍＭ ＡＴＰと４μｇのＢamＨ
Ｉで部分消化されたＳＶ４０ ＤＮＡ（上記）と１０単
位のＴ４ ＤＮＡリガーゼとを含有する連結混合物（２
０μｌ）へ加えた。連結反応のためのインキュベーショ
ンを２０℃にて１６時間行なった。

【００３６】連結されたＤＮＡを制限エンドヌクレアー
ゼＥcoＲＩで処理して、連結リンカー上にＥcoＲＩ結合
性末端を生ぜしめた後、次いでこれをフェノールによっ
て除蛋白し、エタノールで沈殿させ、１５μｌの連結混
合物（上記参照）中にてｐＢＲ３２２（０．５μｇ）の
ＢamＨＩ−ＥcoＲＩ断片に連結させ、これを使用して
Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４を形質転換させた。次いで、これ
ら形質転換体から単離されたプラスミドを種々の制限酵
素消化により適正なＳＶ４０ ＤＮＡ断片の挿入に関し
スクリーニングした。

【００３７】ＨＢｓＡｇ構造遺伝子の単離 上記で作成したＳＶ４０ベクターをＢ型肝炎ウイルスの
表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をコードしている遺伝子を発現
するよう設計した。分子量２５，０００のポリペプチド
であるＨＢｓＡｇは通常複合粒子状構造（２２ｎｍ粒
子）として存在し、これは部分的にグリコシル化されて
おり、感染した肝臓細胞の外部に分泌される（６参
照）。

【００３８】上記で作成したＳＶ４０ベクターにおいて
ＨＢｓＡｇを発現させるため、ＨＢｓＡｇのコード配列
を有する理想的なＤＮＡ断片は次の条件に一致する。第
１に、このＤＮＡは一方の末端部ＥcoＲＩ制限部位を有
し、他方の末端部にＢamＨＩ部位を有する。第２に、Ｅ
coＲＩ部位はＨＢｓＡｇの開始コドンに対し直ぐ５’側
に位置し、したがってＶＰ−１蛋白質におけるＡＴＧの
本来の位置を回復することができる。最後に、得られた
組換え体ＳＶ４０分子はその寸法において野生型ＳＶ４
０ ＤＮＡと同様であり、ウイルス粒子中に効率的に包
封される。上記の条件を満たすため、第２図に詳細に示
した一連の実験を行なった。この作成の１つの重要な特
徴は、ＨＢｓＡｇの推定開始コドン（ＡＴＧ）に対し直
ぐ５’側にＥcoＲＩ制限部位を生成させることである。
これは、合成１２量体（ｄＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣ）
を使用することにより行なわれ、この１２量体はＨＢｓ
Ａｇにおける開始コドンおよびそれに続く３個のアミノ
酸に対応する配列であり、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメ
ラーゼが単一鎖クローン化ＨＢＶ ＤＮＡからＤＮＡを
合成するための部位特定的なプライマーである。適正に
酵素処理した後、合成ＤＮＡをクローン化ＨＢＶ ＤＮ
Ａと共に切り継ぎ、完全ＨＢｓＡｇ遺伝子を再編成さ
せ、処理されたベクターＤＮＡは末端に、規定のＥcoＲ
Ｉ部位を再編成するためのＥcoＲＩ部位を有している。
このプラスミドをｐＨＳ９４と名付ける。

【００３９】ｐＢＲ３２２のＥcoＲＩ部位中にクローン
化したＨＢＶの完全ゲノムを含有するプラスミド（ｐＨ
ＢＶ−Ｔ−１Ａ）から、ＨＢｓＡｇをコードしている構
造遺伝子を回収した。このクローンはＶａｌｅｎｚｕｅ
ｌａ ｅｔ ａｌ（７および８参照）により最近発現さ
れたと同様な方法により得られた。

【００４０】この構造遺伝子を２種の方法で変性し、
（１）開始ＡＴＧメチオニンコドンの前部に直接的に独
特な制限部位を組み込み、かつ（２）ＨＢｓＡｇ遺伝子
から離れて位置するＨＢＶ ＨｐａＩ部位をｐＢＲ３２
２の充填されたＥcoＲＩ部位に平滑末端連結させた。Ｈ
ＢｓＡｇ構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片に対するこれ
ら２つの改良は下記のようにして行なった： （１） 先ず５０μｇのｐＨＢＶ−Ｔ−１Ａ ＤＮＡを
２００μｌの反応混合物中で酵素供給業者（ＢＲＬ）の
反応条件に従ってＨｐａII（８０単位）により消化させ
て、１．７ｋｂのＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片にお
いてはＨＢｓＡｇのコード配列に対する開始コドンがセ
ンス−ストランド（約４００ｂｐ）の５’末端に近接位
置する。このＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動
法（ＰＡＧＥ）により精製した。次いで、精製されたＨ
ｐａII断片を１００μｌの反応混合物（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）中でλエキソヌクレアーゼ
（２単位）により３７℃で３０分間処理した。λエキソ
ヌクレアーゼは二重鎖ＤＮＡを消化する５’エキソヌク
レアーゼである。この反応は“センス−ストランド”Ｄ
ＮＡのＨＢｓＡｇコード配列から５’側半分を分裂さ
せ、アンチセンスストランドを露出して添加プライマー
と対にする。λエキソヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを
除蛋白し、そして４０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．４）と１ｍＭ ＤＴＴと５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡと
６ｍＭ ＭｇＣｌ₂ と０．５ｍＭ各ｄＮＴＰと０．２ｎ
ｍｏｌのｄＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣ（ポリヌクレオチ
ドキナーゼにより５’末端において³²Ｐ標識したもの）
とを含有する反応混合物５０μｌに再懸濁させた。この
混合物を先ず９０℃で１分間加熱し、０℃で３０分間ア
ニールし、次いで２単位のＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメ
ラーゼクレノー断片（９参照）の存在下に３７℃で３時
間インキュベートした。このＤＮＡポリメラーゼは添加
プライマーによりプライムされたＤＮＡを合成し、かつ
３’−ＯＨ末端を有する単一鎖ＤＮＡを分裂させ、した
がって、平滑末端化ＤＮＡ分子を生成した。次いで、得
られたＤＮＡを除蛋白し、ＨＢｓＡｇ遺伝子内に位置す
る部位にてＸbaＩ（４５単位）により１００μｌの反応
混合物中で消化させ、そしてＰＡＧＥにより分画した。
ＨＢｓＡｇ遺伝子の最初の３０個のコドンを有する９１
塩基対のＤＮＡ断片をオートラジオグラフィー検出法に
よって単離した（断片Ａ）。

【００４１】ＨＢｓＡｇ遺伝子の直ぐ５’側に独特な制
限部位を生成させるため、プラスミドｐＢＲ３２２の誘
導体（いわゆるｐＮＣＶ）を利用した。この誘導体はＥ
coＲＩ部位に位置する配列： を有する合成ＤＮＡセグメントを含有する。この合成Ｄ
ＮＡ配列中に、ＰｓｔＩ部位を組み込んだ。１０μｇの
ｐＮＣＶ ＤＮＡを先ず１００μｌの反応混合物中で２
４単位のＰｓｔＩ酵素によって切断し、次いで上記と同
様な反応混合物５０μｌ中で２単位のＥ．ｃｏｌｉ Ｄ
ＮＡポリメラーゼクレノー断片によって８℃にて１時間
処理した。このＤＮＡポリメラーゼ処理はＰｓｔＩ消化
により生成された４個の塩基対３’オーバーハングを除
去して、完全なＥcoＲＩ制限部位を有する平滑末端ＤＮ
Ａを残し、ｐＢＲ３２２の複製のオリジンを含有する断
片Ｂを与えた。上記のように調製された平滑末端ＨＢｓ
Ａｇ遺伝子断片Ａを、断片ＢのＥcoＲＩ部位に連結させ
た。これは、プラスミドｐＨＳ９４を生成させるための
３断片連結において行なった。第３の断片（断片Ｃ）は
次のように調製した：（２）プラスミドｐＨＢＶ−Ｔ−
１ＡからのＨＢｓＡｇ遺伝子をＨＢｓＡｇ遺伝子から離
れた部位においてＨｐａＩにより開裂させた。このＨｐ
ａＩ部位を予めＤＮＡポリメラーゼクレノー断片（９参
照）が充填されているｐＢＲ３２２のＥcoＲＩ部位に連
結させた。これはｐＢＲ３２２の誘導体をサブクローン
化してｐＨＳ４２を生じせしめることにより行なわれ
た。このプラスミドをＸbaＩ（これはコドン３１におい
て開裂を行なう）とＢamＨＩ（これはｐＢＲ３２２のＥ
coＲＩ部位から３７５の塩基対を開裂する）によって開
裂させ、殆どのＨＢｓＡｇ遺伝子と、このＨＢｓＡｇ遺
伝子から離れた約１５０個の塩基対と、プロモーター／
オペレーターと、テトラサイクリン耐性遺伝子の最初の
２００個の塩基対とを含有するＤＮＡ断片を生成させ
た。ＸbaＩおよびＢamＨＩにより限定されるＤＮＡ断片
ＣをＰＡＧＥにより単離し、これを上記の３断片連結に
使用してプラスミドｐＨＳ９４を生成させた（第２
図）。

【００４２】ＨＢｓＡｇを合成しうる組換え体ＳＶ４０
ＤＮＡの作成 サル細胞をトランスフェクションするよう適正に連結さ
れたＤＮＡを多量に得るため、連結ＤＮＡを次のように
してＥ．ｃｏｌｉ中でクローン化した。第３図に示した
ように、ｐＳＶＲからのＳＶ４０ ＤＮＡを含有するＢ
amＨＩ乃至ＥcoＲＩ断片を、先ずｐＨＳ９４からの肝炎
表面抗原を有するＥcoＲＩ乃至ＢamＨＩ断片に、そのＥ
coＲＩ部位を介して連結させ、得られた断片を次いでｐ
ＢＲ３２２のＢamＨＩ部位にクローン化させた。

【００４３】次いで、適正に作成されたＤＮＡ、ｐＳＶ
ＨＢＳＡを制限エンドヌクレアーゼＢamＨＩで開裂させ
て５３８２個のヌクレオチドのＤＮＡ断片を生成させる
ことができ、このＤＮＡ断片はそのＶＰ−１蛋白質のコ
ード領域が肝炎表面抗原をコードしている遺伝子により
交換されている組換え体ＳＶ４０ゲノムよりなってい
る。

【００４４】ｐＳＶＨＢＳＡ ＤＮＡを作成するため、
ＢamＨＩ＋ＥcoＲＩで消化されたｐＳＶＲ ＤＮＡから
のＤＮＡ断片を含有するＳＶ４０ ＤＮＡ０．３μｇ
と、ＢamＨＩで消化されたｐＨＢＶ−Ｔ−１Ａ ＤＮＡ
（詳細な構造については第２図参照）からのＤＮＡ断片
を含有するｐＢＲ３２２ ５０ｎｇと、ＢamＨＩ＋Ｅco
ＲＩで消化されたｐＨＳ９４からのＤＮＡを含有するＨ
ＢｓＡｇコード配列０．２μｇとを１５μｌの連結混合
物中において、それらの各ＢamＨＩおよびＥcoＲＩ部位
を介し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより１晩インキュベーシ
ョンして連結させた。１つの種類の適正に連結されたＤ
ＮＡ生産物はｐＢＲ３２２の完全なｔｅｔ^R 遺伝子を再
編成し、したがってベクターＤＮＡの自己連結から生じ
た多数のｔｅｔ^S 組換え体からｔｅｔ^R により選別する
ことができる。次いで、ｐＳＶＨＢＳＡの構造を制限酵
素消化によって証明した。

【００４５】組換え体ＳＶ４０ウイルスの増殖およびサ
ル細胞におけるＨＢｓＡｇの発現 この種のベクター系中における肝炎表面抗原の合成の効
率を試験するため、ＢamＨＩで開裂されたｐＳＶＨＢＳ
Ａ ＤＮＡをＤＥＡＥデキストラン法（１１参照）によ
り単層ＣＶ−１細胞（１０参照）中に導入し、細胞をｔ
ｓＡ２８もしくはｔｓＡ５８ウイルス（１２参照）のい
ずれかにより感染させた。次いで、この単層ＣＶ−１細
胞を適正な培養条件下で４１℃にてインキュベートした
（１１参照）。ｔｓＡ２８とｔｓＡ５８との両者はＳＶ
４０ Ｔ抗原において温度感受性の突然変異株を示し、
したがって４１℃にて増殖することができない（１参
照）。同様に、組換え体ＳＶ４０ゲノム（ｐＳＶＨＢＳ
Ａ）のみを含有するＣＶ−１細胞は、ｐＳＶＨＢＳＡが
ＶＰ−１遺伝子を欠除するため、感染性ウイルスを生成
しない。予想した通り、ｔｓＳＶ４０ウイルスと組換え
体ＳＶ４０ゲノムとの両者を含有するＣＶ−１細胞にお
いては、４日後に細胞変性効果が観察された。インキュ
ーベーションの２週間後に完全な溶解が観察された。組
換え体ＳＶ４０ゲノムまたはｔｓＳＶ４０ウイルスのい
ずれか一方のみを有するＣＶ−１細胞においては細胞変
性効果は観察されなかった。ＨＢｓＡｇに対する一般的
なラジオイムノアッセイ（１３参照）を用いて、培地中
の表面抗原産生をＤＮＡの導入４日後できるだけ早く検
出した。定量分析が示したところでは１×１０⁶ 個の単
層ＣＶ−１細胞は３．８μｇのＨＢｓＡｇを各感染サイ
クルにつき産生し、これは９×１０⁷ 分子／細胞に相当
する。この数は単一の感染サイクル（１参照）で産生さ
れるＳＶ４０ ＶＰ−１蛋白質分子の推定個数に殆ど同
一である。

【００４６】組換え体ＳＶ４０ゲノムがＳＶ４０ウイル
スと同様にＣＶ−１細胞中に封入されているかまたは繁
殖しているかどうかを決定するため、ＣＶ−１細胞のプ
レートに元来の共感染された細胞からの溶解物のアリコ
ートとｔｓＳＶ４０ウイルスとを４１℃にて感染させ
た。感染した細胞からの低分子量のＤＮＡを感染の７２
時間後にハートの方法（１４参照）により単離した。単
離したＤＮＡを処理しないか、或いは制限エンドヌクレ
アーゼで開裂させ、そしてアガロース上でのゲル電気泳
動により分画した。次いで、分画されたＤＮＡを変性さ
せ、サザーンの方法（１５参照）によりニトロセルロー
ス紙に移し、³²Ｐ−標識ｐＨＳ９４ ＤＮＡでプローブ
した。第７図から判るように、肝炎遺伝子配列を有する
組換えＤＮＡ分子は、殆どＳＶ４０ウイルスＤＮＡ（レ
ーンＡ）から区別できない寸法の閉環ＤＮＡとして存在
する。大部分の組換えＤＮＡは生体内（ｉｎ ｖｉｖ
ｏ）連結によりそのＢamＨＩ部位を再生する（レーン
Ｂ）。予想通り、Ｂ型肝炎表面抗原のコード領域を含有
するＢam−ＥcoＲＩ断片（第３図参照）は、未変化の形
態で単離することができる。

【００４７】コンフルエントの９０％まで増殖したＣＶ
−１細胞の１５０ｍｍプレートに、元来のトランスフェ
クション実験から調製された溶解物（組換え体とｔｓＡ
２８ウイルスとを含有する）を感染させ、過剰のｔｓＡ
２８ウイルスを補充した後４１℃にてインキュベートし
た。感染後７０時間で培地を収穫して合成されたＨＢｓ
Ａｇを特性化した。さらに、細胞内低分子量ＤＮＡをハ
ートの方法（１４参照）に従って単離した。この単離さ
れたＤＮＡをＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ
ＥＤＴＡを含有する緩衝液１ｍｌ中に再懸濁させた。次
いで、５μｌの未切断ＤＮＡと５μｌのＢamＨＩで消化
されたＤＮＡとをＴＢＥ緩衝液中の０．８％アガロース
ゲルにより電気泳動で分画し、さらにＳＶ４０ ＤＮＡ
もコントロールとして同様に処理した。ゲル状のＤＮＡ
パターンをニトロセルロース紙のシートに移し、ＨＢｓ
Ａｇ遺伝子プローブソースとして³²Ｐ−標識ｐＨＳ９４
ＤＮＡ（１５参照）にハイブリダイズした。第７図は、
ハイブリダイゼーション後の³²Ｐ−標識ｐＨＳ９４ Ｄ
ＮＡのオートラジオグラフィー像を示している。レーン
ＡおよびＢは、それぞれ未処理のハート上澄液およびＢ
amＨＩで消化されたハート上澄液のＤＮＡである。Ｉ、
IIおよびIII は、コントロールＳＶ４０ＤＮＡのＩ型、
II型、および III型の位置を示し、それらの位置はＤＮ
Ａをニトロセルロース紙に移す前にエチジウムブロマイ
ド染色により決定した。

【００４８】ｐＳＶＨＢＳＡによりコードされている肝
炎表面抗原は粒子形態で合成される 肝炎表面抗原は合成されて、感染肝臓細胞から粒子とし
て分泌される（６参照）。各種のクローン化肝炎ＤＮＡ
の配列分析は、成熟表面抗原が大型前駆体蛋白質から開
裂されうる可能性を示唆している（８参照）。成熟ＨＢ
ｓＡｇ分子プラス幾つかの３’末端未翻訳配列をコード
しているＤＮＡのみが上記の作成においてＳＶ４０ゲノ
ム中に組み込まれるので、問題とする前駆体ペプチドが
２２ｎｍ粒子を組み立てる際に、および細胞からのその
分泌の際に機能的役割を演ずるかどうか疑問である。こ
の目的で、合成した肝炎表面抗原をその性質につき沈降
速度、沈降平衡、および電子顕微鏡分析により標準蛋白
質と比較して特性化した。第８図に示されるように、こ
のベクター系で合成された肝炎表面抗原は感染肝臓細胞
系の培地から単離された肝炎表面抗原（１７参照）とは
区別しえない沈降速度を有し、１．２２ｇ／ｃｍ³ の浮
遊密度を有し、これも標準表面抗原２２ｎｍ粒子と同様
であった（６参照）。精製された表面抗原の電子顕微鏡
による検査も平均直径２２０オングストローム（２２ｎ
ｍ）の主として粒状の構造を示し、形態学的に標準２２
ｎｍ粒子と同一であった（第８および９図）。したがっ
て、成熟肝炎表面抗原蛋白質モノマーは２２ｎｍ粒子の
組み立てに必要とされる肝炎ウイルスによりコードされ
ている唯一の必須構造成分である。

【００４９】Ａ．ＣＶ−１細胞で合成されたＨＢｓＡｇ
の沈降速度とヘパトーマ細胞系ＰＬＣにより合成かつ分
泌されたＨＢｓＡｇ（１７および１８参照）の沈降速度
とを比較した（第８Ａ図）。第７図に記載した実験から
収穫された培地を、ＨＢｓＡｇの原料としてこの実験に
使用した。ＰＬＣ細胞系により産生されたＨＢｓＡｇ
（１７および１８参照）を培地から収穫した。両カルチ
ャーからのＨＢｓＡｇを先ず４５％飽和硫酸アンモニウ
ムで沈殿させ、かつ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ
７．４）と０．５ｍＭ ＥＤＴＡと０．５ｍＭ ＮａＣ
ｌとを含有する緩衝液中に再懸濁させた（ＨＢｓＡｇの
最終濃度０．５μｇ／ｍｌ）。２００μｌの各試料を同
じ緩衝液中の２つのパラレルの５ｍｌ蔗糖濃度勾配（５
〜２０％蔗糖）に装填した。ベックマン（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ）ＳＷ ５０．１型ローターにて４５，０００ｒｐｍ
で遠心分離を４℃にて８０分間行なった。市販のＨＢｓ
Ａｇ分析キット（ＡｕｓｒｉａII−１２５、Ａｂｂｏｔ
ｔ Ｌａｂ）を用いてＨＢｓＡｇを検出した。ＨＢｓＡ
ｇの回収率は常に８０％以上であった。

【００５０】Ｂ．ＣＶ−１細胞で合成されたＨＢｓＡｇ
の浮遊密度を測定した（第８Ｂ図）。プールした感染カ
ルチャー培地からのＨＢｓＡｇ ２μｇを４５％飽和硫
酸アンモニウムで沈殿させ、アガロースゲル浸透カラム
（Ａ５．０Ｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分画し、次いでＡ
項で記載した通り５〜２０％蔗糖濃度勾配により沈降さ
せた。蔗糖濃度勾配遠心分離の後、プールしたＨＢｓＡ
ｇを蔗糖を含まない濃度勾配緩衝液に対して透析し、次
いで固体のＣｓＣｌを加えて最終密度１．２ｇ／ｃｃの
溶液（７ｍｌ）を与えた。次いで、これをソルバール
（Ｓｏｒｖａｌｌ）Ｔ８６５．１型ローターにおいて５
０，０００ｒｐｍで６８時間遠心分離した。次いで、Ａ
項に記載したと同様に分析を行なった。ＣｓＣｌ濃度勾
配におけるＨＢｓＡｇの回収率は約７０％であった。次
いで、ピークフラクション（画分）をプールし、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌと１００ｍＭ ＮａＣｌと０．５ｍ
ＭＥＤＴＡ緩衝液に対して透析し、濃縮し、そして電子
顕微鏡検査のための試料を調製した。

【００５１】電子顕微鏡写真用の抗原を調製するため、
炭素被覆した銅グリッドを作成した。ＨＢｓＡｇ蛋白質
（１μｇ／ｍｌ）を含有する緩衝液１滴をグリッド上に
室温で３０分間載置した。蛋白質溶液をグリッドから半
径方向に吸い取り、４滴のＨ₂ Ｏで１回洗浄した。次い
で、このグリッドを１．０％ホスホタングステン酸ナト
リウム（ｐＨ７．６）で１分間染色し、そして濾紙によ
り乾燥させた。次いで、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ｅ．Ｍ．４
００型により倍率７７７００倍にて電子顕微鏡写真を撮
った。これは陰画を与え、これから第９図に示すように
拡大して（約１０倍）陽画を作成した。

【００５２】ＨＢｓＡｇを発現する非溶解ベクターの作
成 組換えプラスミドを作成したが、このプラスミドはプラ
スミドｐＭＬ（２１参照）から生じたｐＢＲ３２２配列
と、ＤＮＡ複製のオリジン領域と初期および後期の両方
の転写単位に対するプロモーター配列とからなるＳＶ４
０ ＤＮＡの３４８塩基対と、ＨＢｓＡｇ用の遺伝子を
コードしているＨＢＶ配列とを含有する。ＳＶ４０のオ
リジンは、ＳＶ４０ ＤＮＡをＨinｄIII により消化さ
せ、かつＨinｄIII 末端をコンバータ（ＡＧＣＴＧＡＡ
ＴＴＣ）の添加によりＥcoＲＩ末端に変換させることに
より単離した。このＤＮＡをＰvuIIで切断し、かつＲＩ
リンカーを加えた。ＥcoＲＩでの消化の後、オリジンに
わたる３４８塩基対断片をポリアクリルアミドゲル電気
泳動および電気溶出によって単離し、ｐＢＲ３２２にク
ローン化させた。ＨＢＶのＥcoＲＩおよびＢglIIでの消
化から生ずる１９８６塩基対断片（２２参照）（これは
ＨＢｓＡｇをコードしている遺伝子にわたる）をＥcoＲ
ＩおよびＢamＨＩ部位にてプラスミドｐＭＬ（２１参
照）中でクローン化させることにより、発現プラスミド
ｐＨＢｓ３４８−ＥおよびｐＨＢｓ３４８−Ｌを作成し
た（ｐＭＬはサル細胞におけるプラスミド複製に対し抑
制的である配列を除去する欠如部を有するｐＢＲ３２２
の誘導体である（２１参照））。次いで、得られたプラ
スミド（ｐＲＩ−Ｂｇｌ）をＥcoＲＩによって線状化さ
せ、そしてＳＶ４０オリジン領域を示す３４８塩基対断
片をｐＲＩ−ＢｇｌのＥcoＲＩ部位に導入した。オリジ
ン断片は、いずれの配向性でも挿入することができる。
この断片は複製のオリジンに加えて初期および後期のＳ
Ｖ４０プロモーターの両者をコードしているので、ＨＢ
Ｖ遺伝子はこの配向性に応じていずれかのプロモーター
の制御下に発現させることができる（ＨＢｓを代表する
ｐＨＢｓ３４８−Ｅは初期プロモーターの制御下で発現
され、かつＨＢｓを代表するｐＨＢｓ３４８−Ｌは後期
プロモーターの制御下で発現される）。

【００５３】サル細胞におけるＳＶ４０−ＨＢＶプラス
ミドの複製 ＣＯＳ−７系サル細胞におけるＨＢＶ−ＳＶ４０組換え
プラスミドの複製を次のように行なった。

【００５４】ＤＥＡＥ−デキストラン技術によるＤＮＡ
トランスフェクションの後の種々の時点で、低分子量の
ＤＮＡをハートの方法（１４参照）により単離し、アガ
ロースゲルでの電気泳動により分画し、そしてサザーン
のブロットハイブリダイゼーション（１５参照）によっ
て分析した。第４図は、トランスフェクション直後に殆
どまたは全くスーパーコイルプラスミドがＣＯＳ細胞中
に存在しないことを示している。しかしながら、トラン
スフェクションの３日後、投入したＤＮＡの著しい複製
がｐＨＢｓ３４８−Ｌ ＤＮＡ（レーンｂ）またはｐＨ
Ｂｓ３４８−ＥＤＮＡのいずれかの導入の後に生じた。
予想通り、プラスミドｐＲＩ−Ｂｇｌ（これはＳＶ４０
オリジン配列を欠除しているが、その他の点では上記の
発現プラスミドと同一である）のトランスフェクション
の後プラスミド複製は全く観察されなかった（レーン
ａ）。

【００５５】組換えプラスミドでトランスフェクトした
サル細胞におけるＨＢｓＡｇの合成 ＤＥＡＥ−デキストランおよびＤＮＡに対する細胞処理
および露出時間を１２時間に増大させることによりＤＥ
ＡＥ−デキストラン法（１１参照）を改変して、プラス
ミドｐＭＬ、ｐＲＩ−Ｂｇｌ、ｐＨＢｓ３４８−Ｅおよ
びｐＨＢｓ３４８−ＬをＣＯＳ−７系サル細胞（２３参
照）中に導入した。このＣＯＳ−７細胞系はＳＶ４０の
初期領域の一体化コピーを有し、ＳＶ４０のＡ遺伝子産
生物（Ｔ抗原）を構成的に発現する。ＳＶ４０ ＤＮＡ
複製の機能的オリジンを含有するプラスミドは、ＳＶ４
０Ｔ抗原の存在下にサル細胞中で複製することが示され
た（２０、２１参照）。第５図は、プラスミドｐＨＢｓ
３４８−ＥおよびｐＨＢｓ３４８−Ｌでトランスフェク
トしたＣＯＳ細胞が２日目までに著量のＨＢｓＡｇを発
現し始め、２週間以上にわたり発現し続けることを示し
ている。ｐＨＢｓ３４８−Ｌにより指令される発現のレ
ベルはｐＨＢｓ３４８−Ｅにより指令されるレベルより
若干高い。これらの結果の１つの解釈は、後期のＳＶ４
０プロモーターがこの系においては初期プロモーターに
より有効になりうることである。

【００５６】組織培養で誘導されたＨＢｓＡｇは動物に
おいて免疫原性である 組織培養から得られたＨＢｓＡｇの粒子は抗原活性であ
ることを示したが、これら粒子が動物において免疫原性
であるかどうかを決定することが望ましい。したがっ
て、ＣＯＳ−７細胞により産生された抗原を硫酸アンモ
ニウム沈殿を蔗糖濃度勾配遠心分離とＣｓＣｌ密度勾配
遠心分離との組合せにより精製した。組織培養で得られ
たＨＢｓＡｇを各マウスに注射する一方、コントロール
マウスをヒト血清から得られた市販のＨＢｓＡｇ（Ｎｏ
ｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ
Ｉｎｃ．）の同量で免疫化した。次いで、免疫化の後の
種々の時点で、抗−ＨＢｓＡｇのタイターを決定した。
第６図は、抗−ＨＢｓＡｇの著量のタイターが標準ＨＢ
ｓＡｇで免疫化したマウスならびに組織培養で得られた
ＨＢｓＡｇで免疫化したマウスにおいて現われたことを
示している。さらに、組織培養から得られたＨＢｓＡｇ
で免疫化したマウスでの抗−ＨＢｓＡｇ抗体出現の動力
学およびタイターは標準ＨＢｓＡｇで免疫化したマウス
での観察と区別できなかった。したがって、結論とし
て、組換えＤＮＡ技術によりサル細胞中で合成されたＨ
ＢｓＡｇは、同一と言わないまでも、免疫原性において
ヒト血清から得られたＨＢｓＡｇと類似であり、そのワ
クチンとしての効果が充分に示された。

【００５７】薬剤組成物 本発明の産生物を公知方法により調合して薬剤的に有用
な組成物を製造することができる。すなわち、本発明の
ポリペプチドを薬剤上許容しうる担体ベヒクルと混合す
る。適するベヒクルおよびその配合はＥ．Ｗ．Ｍａｒｔ
ｉｎによりＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅに記載されており、これを参
考のためここに引用する。この種の組成物は有効量のポ
リペプチド産生物を、宿主に対し有効投与するのに適す
る薬剤上許容しうる組成物を製造するための適当量の担
体ベヒクルと混合して含有する。１つの好適な投与方式
は非経口ルートである。適する動物衛生製剤は、必要に
応じ変更を加えて、薬剤組成物の場合と同様に調製され
る。

【００５８】ワクチン製造 本明細書中に記載したように製造した適するポリペプチ
ドを混入した本発明のワクチンは、公知方法に従って調
製することができる。すなわち、本発明のポリペプチド
を適するベヒクルと混合する。適するベヒクルは、たと
えば食塩溶液、各種の公知アジュバント、またはウイル
ス感染を予防するため使用される組成物に使用するため
の当業界で認められたその他添加物を包含する。この種
のワクチンは有効量のポリペプチドと、宿主に対し有効
投与するのに有用なワクチンを製造するための適当量の
ベヒクルとを含有する。これについては、文献「ワクチ
ンにおける新たな傾向および開発」編集者Ａ．Ｖｏｌｌ
ｅｒおよびＨ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９
７８を参照することができ、これをワクチンの製造に関
するさらに詳細な背景を示すため参考としてここに引用
する。

【００５９】これらワクチンの活性成分を製造する方法
が独特であるため、このワクチンは実質的に外来蛋白質
ならびにその他のウイルス性および細胞成分を含有しな
いと思われる。したがって、これらワクチンは完全に死
滅した、または不活化されたウイルスワクチン製剤の副
作用を殆ど生じないと思われる。

【００６０】上記の説明から本発明は、たとえば目的と
するポリペプチド産生物の選択におけるような、ここに
記載した好適具体例のみに限定されないことが当業者に
は明らかであろう。

【００６１】参考文献 1. N. H. Acheson in Molecular Biology of Tumor
Viruses. (J. Tooze ed.) Cold Spring Harbor Lab. N.
Y. 2nd edi. Part 2. pp.125-204 (1980). 2. R. Crea, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
(U. S. A.) 75, 5765 (1978). 3. D. V. Goeddel, et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. (U. S. A.) 76,106 (1979). 4. R. W. Davis, et al., Advanced Bacterial Ge
netics , Cold SpringHarbor Laboratory. N. Y. pp.1
16-125 (1980). 5. D. H. Hamer およびP. Leder, Cell, 18, 1299 (1
979). 6. O. Blumberg, Science 197, 19 (1977). 7. P. Valenzuela, et al., Nature, 280, 815
(1979). 8. P. Charnay et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
(U. S. A.) 76, 2222(1979). 9. H. Jacobsen et al., Eur. J. Biochem . 45, 6
23 (1974). 10. J. E. Mertz およびP. Berg., Virology, 62, 11
2 (1974). 11. J. H. McCutchan およびJ. S. Pagano, J. Nat.
Cancer Inst . 41, 351(1968). 12. P. J. Tegtmeyer, J. Virology 10, 591 (197
2). 13. Ausria II-125. Abbott Lab. 14. B. J. Hirt, J. Mol. Biol. 26, 365 (1967). 15. E.M. J. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503 (197
5). 16. C-J. LaiおよびD. Nathans, J. Mol. Biol. 89,
179 (1974). 17. J. J. Alexander et al., S. Afr. Med. J. 5
0, 2124 (1976). 18. P. L. Marion et al., J. of Virol . 32, 79
6 (1979). 19. DNA Tumor Viruses 2nd Ed. (Ed J. Tooze), C
old Spring Harbor Lab., N. Y. (1980). 20. Myers および Tjian, Proc. Natl. Acad. Sci.
(U. S. A.) 77, 6491(1980). 21. Lusky およびBotchan, Nature 293, 79 (198
1). 22. Animal Virus Genetics (Ed. Fields, Jaenisch
およびFox), Chapter 5,p57, Academic Press, N. Y.
(1980). 23. Gluzman, Cell 23, 175 (1981).

【図面の簡単な説明】

【図１】ＶＰ−１蛋白質をコードしている領域が欠除し
たＳＶ４０ ＤＮＡを含有するプラスミドｐＳＶＲの作
成を示す。

【図２】ＨＢｓＡｇ ＤＮＡを有するプラスミドｐＨＳ
９４の作成を示す。

【図３】ＳＶ４０およびｐＢＲ３２２から誘導されたＤ
ＮＡ配列並びにＨＢｓＡｇ ＤＮＡを含有するプラスミ
ドｐＳＶＨＢＳＡの作成を示す。

【図４】サル細胞におけるプラスミドＤＮＡの複製を示
す電気泳動写真である。

【図５】ＣＯＳ細胞における組換え体プラスミドにより
合成されたＨＢｓＡｇの定量化を示す。

【図６】組織培養細胞中で発現したＨＢｓＡｇに対する
マウスの免疫原性応答を示す。

【図７】ＣＶ−１細胞中で複製する組換えＳＶ４０−Ｈ
ＢＶ ＤＮＡの存在を示す電気泳動写真である。

【図８】第８Ａ図はこの組換え体ベクターを介して合成
したＨＢｓＡｇの蔗糖濃度勾配沈降の結果を示し、第８
Ｂ図はその対応するＣｓＣｌ濃度勾配遠心分離の結果を
示す。

【図９】本発明に従って２２ｎｍ粒子として合成された
ＨＢｓＡｇの電子顕微鏡写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ダニエル・ジー・ヤンスーラ アメリカ合衆国、カリフオルニア・94134、 サン・フランシスコ、ピオチエ・125

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリペプチドをコードしている複製可能
   な発現ベクターを内包しておりかつこのベクターの発現
   により前記ポリペプチドを産生し得る脊椎動物形質転換
   細胞カルチャーの製造方法であって、(a) 宿主細胞カル
   チャー中で複製し得るＤＮＡトランスファーベクター断
   片を準備し、(b) 宿主細胞カルチャーに対して適合性の
   あるプロモーターを含むＤＮＡ断片を準備し、(c) ポリ
   ペプチドをコードしており、かつ工程(b) の断片と結合
   するのに適しているがそれとは異種であるＤＮＡ断片を
   準備し、(d) 工程(a) 、(b) および(c) の各断片を、適
   当な位置に配置された転写終止部位、ポリＡ付加配列な
   らびに翻訳の開始信号および停止信号と共に組合せて複
   製可能な発現ベクターを形成し（ただし、この複製可能
   な発現ベクターは、工程(c) の前記配列が前記プロモー
   ターの制御下にあることと、工程(c) のポリペプチドを
   コードしているＤＮＡの翻訳開始コドンが、通常前記プ
   ロモーターの制御下にある蛋白質の翻訳開始コドンによ
   って占められる本来の位置にあるかまたはそれから１塩
   基対以内に配置されていることとを特徴とする）、(e)
   工程(d) のベクターにより脊椎動物細胞カルチャーを形
   質転換することからなる脊椎動物形質転換細胞カルチャ
   ーの製造方法。
2. 【請求項２】 工程(a) の断片が、微生物宿主において
   表現型選択が可能であることを特徴とする請求項１に記
   載の方法。
3. 【請求項３】 工程(a) のＤＮＡベクターが複製のオリ
   ジンを含有するＳＶ40ベクターからなることを特徴とす
   る請求項１または２に記載の方法。
4. 【請求項４】 工程(e) の脊椎動物細胞カルチャーがＣ
   Ｖ‐１系サル腎臓繊維芽細胞であることを特徴とする請
   求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 工程(e) の脊椎動物細胞カルチャーがＣ
   ＯＳ‐７系サル腎臓繊維芽細胞であることを特徴とする
   請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 ポリペプチドをコードしている複製可能
   な発現ベクターを内包しておりかつこのベクターの発現
   により前記ポリペプチドを産生し得る脊椎動物形質転換
   細胞カルチャーであって、(A) 前記ポリペプチドをコー
   ドしておりかつ発現プロモーターの制御下にあるＤＮＡ
   配列を含む複製可能なＤＮＡ発現ベクターと、(B) 前記
   細胞カルチャーを栄養的に支持するための通常の培地と
   からなっており、前記発現プロモーターが(a) 前記形質
   転換細胞に対して適合性でありかつ(b) 前記ポリペプチ
   ドをコードしている配列とは異種であり、前記ポリペプ
   チドをコードしている配列の翻訳開始信号は通常前記プ
   ロモーターの制御下にある蛋白質の翻訳開始コドンによ
   って占められる本来の位置にあるかまたはそれから１塩
   基対離れて配置されており、前記ポリペプチドをコード
   している配列は翻訳の開始信号および停止信号と共に前
   記ベクター中に配置されていることを特徴とする、脊椎
   動物形質転換細胞カルチャー。
7. 【請求項７】 ＣＶ−１系サル腎臓繊維芽細胞を形質転
   換して得られることを特徴とする請求項６に記載の細胞
   カルチャー。
8. 【請求項８】 ＣＯＳ−７系サル腎臓繊維芽細胞を形質
   転換して得られることを特徴とする請求項６に記載の細
   胞カルチャー。
9. 【請求項９】 Ｂ型肝炎表面抗原をコードしている複製
   可能な発現ベクターを内包しておりそのベクターの発現
   によってＢ型肝炎表面抗原含有粒子を細胞溶解すること
   なく分泌し得、前記ベクターが成熟Ｂ型肝炎表面抗原を
   コードしているがＢ型肝炎表面抗原前駆体ペプチドはコ
   ードしていないことを特徴とする請求項６に記載の細胞
   カルチャー。