JPH0587518B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0587518B2 JPH0587518B2 JP57150627A JP15062782A JPH0587518B2 JP H0587518 B2 JPH0587518 B2 JP H0587518B2 JP 57150627 A JP57150627 A JP 57150627A JP 15062782 A JP15062782 A JP 15062782A JP H0587518 B2 JPH0587518 B2 JP H0587518B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- hepatitis
- hbsag
- surface antigen
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 119
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 75
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 59
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 claims description 58
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 41
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 41
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 40
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 39
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 38
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 35
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 19
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 17
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 16
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 16
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 11
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 10
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 7
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 49
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 30
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 18
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 101150056105 PHB1 gene Proteins 0.000 description 10
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241001105470 Valenzuela Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 101710165741 Virion-associated protein Proteins 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004576 lipid-binding Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007442 viral DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＢ型肝炎表面抗原の製造方法、該方法
により製造されるＢ型肝炎表面抗原からなる粒
子、および該粒子を含有するワクチンに係る。 本発明の背景を説明しかつ特にその実施に関し
さらに詳細な説明を記載している刊行物およびそ
の他資料をここに参考のため引用し、便宜上参照
符号を付し参考文献として本明細書末尾に記載す
る。 組換えDNA技術を用いることにより極めて多
くの有用なポリペプチドの制御された微生物的産
生が可能となつた。たとえば、ヒト成長ホルモ
ン、ヒトプロインシユリン、デアセチルチモシン
（desacetylthymosin）α1、ヒトおよび雑種（ハ
イブリツド）白血球インターフエロン、ヒト繊維
芽細胞インターフエロンならびに多くの他の生産
物のような、多くの脊椎動物ポリペプチドが既に
各種の微生物により産生されている。この技術の
力は極めて多くの種類の有用なポリペプチドの微
生物的産生を可能にし、広範な種類の薬剤が目標
とする用途に有用なホルモン、酵素、抗体および
ワクチンの微生物的製造を可能にする。 組換えDNA技術の基礎的要素はプラスミド、
すなわち１個の細胞当り多数のコピーとして、し
ばしば細菌中に見出される二本鎖DNAの染色体
外ループである。プラスミドDNAにコードされ
ている情報には、娘細胞中にプラスミドを再生す
るのに必要な情報（「レプリコン」すなわち複製
のオリジン）が含まれ、さらに通常１種もしくは
それ以上の表現型選択特性、たとえば抗生物質耐
性が含まれ、これらは目的とするプラスミドを含
有する宿主細胞のクローンを識別し、かつ優先的
に選択培地中で増殖させることを可能にする。細
菌性プラスミドの有用性は、これらプラスミド
DNA上の異なる部位をそれぞれ識別する種々の
制限エンドヌクレアーゼすなわち「制限酵素」に
よりプラスミドを特定的に開裂させうるという事
実にある。その後、開裂部位でまたは開裂部位に
隣接する再構成末端で端部結合（末端−末端結
合）させることにより、異種遺伝子もしくは遺伝
子断片をプラスミド中に挿入することができる。
いわゆる複製しうる発現ベヒクルはこのようにし
て生成される。 DNA組換えは宿主生物の体外で行なわれ、得
られる「組換体」複製可能発現ベヒクルすなわち
プラスミドは形質転換として知られる方法によ
り、微生物細胞中に導入することができ、かつ多
量の組換えベヒクルを形質転換体の増殖により得
ることができる。さらに遺伝子がコードしている
DNAメツセージの転写および翻訳を支配するプ
ラスミドの部分に関し適切に遺伝子を挿入すれ
ば、得られる発現ベヒクルを使用して、挿入遺伝
子がコードしているポリペプチドの産生を指令す
ることができる。この過程を発現という。 発現はプロモータとして知られるDNA領域に
おいて開始される。発現の転写期において、
DNAはほどけてこれを開始したDNA配列からメ
ツセンジヤRNAへの合成の鋳形として露呈する。
次いで、メツセンジヤRNAはリボソームに結合
し、ここでメツセンジヤRNAはこのmRNAがコ
ードしているアミノ酸配列を有するポリペプチド
鎖に翻訳される。各アミノ酸はヌクレオチドトリ
プレツト、すなわち「コドン」によりコードされ
ており、このコドンが集合して「構造遺伝子」、
すなわち発現ポリペプチド産生物のアミノ酸配列
をコードしているDNA配列部分を構成する。翻
訳は「開始」信号（通常ATG、これは得られる
メツセンジヤRNAにおいてはAUGとなる）にお
いて開始される。いわゆる停止コドンは翻訳の終
了を規定し、したがつてそれ以上のアミノ酸単位
の産生を規定する。得られる産生物は必要に応じ
微生物系中において宿主細胞を溶菌させ、かつ他
の蛋白質からの適当な精製により産生物を回収す
ることにより得ることができる。 実際上、組換えDNA技術の使用は完全に異種
のポリペプチドの発現、いわゆる直接的発現を可
能にし、或いは同種ポリペプチドのアミノ酸配列
の一部に融合した異種ポリペプチドの発現を可能
にする。後者の場合、目的とする生物活性産生物
は、しばしば融合した同種／異種ポリペプチド内
において、このポリペプチドが菌体外環境で開裂
されるまで生物不活性にされている。英国特許公
開公報第2007676A号およびWetzel，American
Scientist，第68巻、第664頁（1980）参照。 組換えDNA技術がその有望性を充分に保持し
ようとするならば、目的とするポリペプチド産生
物を制御環境においてかつ高収率で入手しうるよ
う遺伝子挿入物の発現を最適化する系を案出せね
ばならない。 遺伝学および細胞生理学を研究するための細胞
培養または組織培養の技術は充分に確立されてい
る。単離正常細胞の連続的転移（transfer）によ
つて製造された永久細胞系（permanent
cellline）を維持するための手段および方法を使
用することができる。研究に使用するには、この
種の細胞系は液状媒体中で固体支持体上に維持さ
れるか、或いは支持栄養物を含有する懸濁物中で
増殖させて維持される。大規模製造に対するスケ
ールアツプは機械的問題を課するだけであると思
われる。その他の技術的背景については
Microbiology，第２版，HarperおよびRow出版
社、Hagerstown，Maryland（1973）、特に第
1122頁以降、およびScientific American，第245
巻、第66頁以降（1981）を参照することができ
る。そのおのおのを参考のためここに引用する。 本発明は、組換えDNA技術を脊椎動物宿主細
胞培養系において成功りにかつ効率的にポリペプ
チドを産生させるのに使用しうるという知見に基
づくものであり、したがつてこの種の系はたとえ
ばグリコシル化（glycosylation）、燐酸化
（phosphorylation）、メチル化（methylation）、
ならびに天然に産生される動物性蛋白質に一層近
縁の糖質および脂質結合という利点を有し、これ
に対し細菌もしくは酵母宿主においてはそのよう
なレベルの洗練された工程による産生は不可能で
ある。さらに、脊椎動物細胞培養は疑いもなく充
分にポリペプチド産生物を許容し得、特に或る場
合には細胞培養培地中にその産生物を分泌するこ
とさえでき、回収および精製法において著しく有
益である。 一好適具体例において、本発明は、脊椎動物細
胞カルチヤー中でＢ型肝炎表面抗原（HBsAg）
を、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）の免疫原性決定
基を含む分離した粒子形態として産生する手段お
よび方法に係る。このHBsAgは個々の粒子形態
として細胞カルチヤー培地中に分泌され、HBV
ゲノムのその他部分により或いは使用するベクタ
ーに同種のDNAによりコードされているかどう
かに拘わらず、いかなる付加的な融合ポリペプチ
ド人為構造も含有しない。本発明は、HBVに対
する免疫原性を感受性のヒトに付与するのに有用
なワクチンの製造に対し、かく産生された
HBsAgを使用することに関し、さらにこの種の
ワクチンならびにHBVに対する免疫原性を感受
性のヒトに対し接種および付与するためのその使
用方法に向けられる。 Ｂ型肝炎（血清肝炎）ウイルスは人間の間で伝
染し、慢性弱質感染として現われ、徐々に重症の
肝臓障害、初期癌および死亡へと漸次進行する。
大低の場合、Ｂ型肝炎感染からの完全な回復を期
待することができるが、特に多くのアフリカおよ
びアジア諸国における人口の多数は慢性保菌者で
あつて、この病気を広い範囲に伝染させるという
危険な潜在性を有している。 肝炎はウイルスベクター（Ｂ型肝炎ウイルスす
なわちHBV）によつて引きおこされ、このウイ
ルスベクターはその完全な状態、すなわちいわゆ
るデーン粒子においてビリオンを示し、かつ
DNA分子を包封する27nmのヌクレオカプシドと
このヌクレオカプシドを包囲するエンベロプとか
ら構成されている。ビリオンに関連する蛋白質
は、コア抗原（HBcAg）、DNAポリメラーゼ、
および感染した保菌者の血清中に見出される表面
抗原（HBsAg）を包含する。HBsAgに対する抗
体もHBV感染者の血清中に見出されている。
HBsAgはHBV抗原であつて、抗体（抗−HBs）
の免疫原性産生を誘発しうると信じられ、したが
つてHBVワクチンにおける主要素であろう。こ
れについては次の文献を参照することができる：
Dane et al・，Lancet（1970）（），695
（1970）；Hollinger et al・，Ｊ・Immunology，
107，1099（1971）；Ling et al・，Ｊ・
Immunology，109，834（1972）；Blumberg，
Science，197，17（1977）；Peterson et al・，
Proc.Nat，Acad，Sci.（USA），74，1530（1977）
およびViral Hepatitis，Ａ Centemporary
Assessment of Etiology，Epidemiology，
PathogenesisおよびPrevention.（Vyas et al・，
eds），Franklin Institute Press，Philadelphia，
1978。これらの文献のそれぞれを本発明の背景を
さらに説明するためここに参考として引用する。 HBsAgは、約16〜25nmの範囲の直径を有する
球状粒子、いわゆる「22nm粒子」の形態で、主
として感染血漿中に存在する。これらは、非感染
性ウイルスエンベロプであると思われる。
HBsAgに対する抗体はHBV感染に対して予防効
果を有するので、これらの非感染性粒子をワクチ
ンとして有効に使用することができる。 Ｂ型肝炎ウイルスは細胞培養物（カルチヤー）
中では感染性でなく、感染したヒトまたは高級霊
長類からしか得られないので、HBVに対する免
疫化用の抗原を産生させるために使用する充分な
HBVの供給源を獲得しかつ維持する手段は得ら
れなかつた。 英国特許出願公開第2034323A号およびヨーロ
ツパ特許出願公開第13828号および第20251号明細
書には、それぞれHBVゲノムの単離およびクロ
ーン化、HBVコア抗原の発現、ならびにHBsAg
の一部を含有するとされている融合蛋白質のＥ・
coliにおける産生が記載されている。Proc・
Natl・Acad・Sci・（USA），第77巻、第4549頁
（1980）は、タンデムクローン化Ｂ型肝炎ゲノム
を用いるマウス細胞の形質転換による、マウス染
色体の一体化（intergration）を報告している。 Moriarty et al・，Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA），第78巻、第2606頁（1981）はHBV−
DNAの断片を有するサルウイルス40（SV40）組
換体の作成を記載している。サル腎臓細胞の培養
物にウイルス組換体を感染させ、そしてＢ型肝炎
に感染した患者の血清中に見出されると同じ特性
を有するとされている22nm粒子を産生させた。
Moriarty et al・によれば、組換体ベクターは
HBsAg配列を有するHBVゲノムの大型セグメン
トを含有し、かつSV40腫瘍蛋白質およびその他
HBV蛋白質をコードしているDNA配列を包含し
ていた。さらに、それらの作成は、SV40ウイル
スのVP−２蛋白質をコードしている配列と同じ
枠で（in frame）HBsAgDNAを組み込んだ。
成熟（完全な）HBsAgが発現されたかどうかは
明確でない。 第１図はVP−１蛋白質をコードしている領域
が欠如したSV40DNAを含有するプラスミド
pSVRの作成を示している。 第２図はHBsAgDNAを有するプラスミドpHS
94の作成を示している。 第３図はHBsAgDNA並びにSV40および
pBR322から誘導されたDNAの配列を含有する
プラスミドpSVHBSAの作成を示している。第
３図Ｂにおいて、VP−１蛋白質のATG開始コド
ン（上部の線内に囲われている）を包囲する
DNA配列を組換体（下方の線内に囲われた
ATG）で作られるHBsAgのDNA配列と比較し
た。EcoR部位に変換されたHind部位に下線
を施こす。 第４図はサル細胞におけるプラスミドDNAの
複製を示している。単層Cos細胞が６cmのプラス
チツク皿において全面（confluency）の50〜60％
まで成長した。これらの細胞をドルベツコ
（Dulbecco）の改良培地で洗浄し、そして1μgの
プラスミドDNAと200μgのDEAE−デキストラ
ンとを含有する培地２mlを12時間37℃にした。
DNA溶液を除去し、細胞を培地で１回洗浄し、
10％胎児牛（calf）血清を含有する培地５mlを加
え、そして細胞をDNA抽出の前に37℃にて１日
間または３日間インキユベートした。これらの場
合、小さなスーパーコイルプラスミドDNAを
Hirt（後記参考文献14参照。以下同じ）の方法に
従がつて単離した。DNAをアガロースゲル電気
泳動にかけ、そしてニトロセルロースに移した
（15参照）。複製プラスミドを可視化するため、ニ
トロセルロースフイルターをP32で標識したHBV
DNAでプローブした。レーン(a)：pRI−Bglでト
ランスフエクシヨン（transfection、形質変換）
した細胞のハート（Hirt）溶菌物からのDNA。
レーン(b)：pHBs348−Ｌでトランスフエクシヨ
ンした細胞のハート溶菌物からのDNA。レーン
（Ｍ）：pHBs348−Ｌ DNA1μg。矢印は閉環
DNA（）と開環DNA（）の位置を示してい
る。 第５図はCos細胞における組換体プラスミドに
より合成されたHBsAgの定量化を示している。
単層Cos細胞を６cmのプラスチツク皿において全
面の約50％まで成長させ、上記第４図の説明に記
載したようにDNAでトランスフエクシヨンした。
トランスフエクシヨンの後10％の胎児牛血清を含
有するDulbecco改良培地２mlを加え、そして培
地をそれぞれの時点でHBsAg発現につき24時間
の蓄積後に分析した。HBsAg発現は、RIA
（Abbott Labs）により分析し、0.2mlの未希釈培
地中における１分間当りのカウント数（cpm）と
して表わされる。 第６図はサル細胞から誘導されたHBsAgの免
疫原性を示している。pHBs348−Ｌでトランス
フエクシヨンしたCos細胞の20個の15cm皿から培
地をとり、そして電子顕微鏡検査用に上記のとお
りHBsAgを精製した。５匹のマウスからなる３
群を、それぞれ完全フロイントアジユバント
（complete Freund´s adjuvant）の存在下で
2.8μg、0.6μg、または0.006μgの精製HBsAgで免
疫化した。コントロールマウスについてはヒト血
清（North American Biologicals Inc.）から得
られた真正HBsAgの同量で免疫化した。免疫化
の後、種々の時点で、マウス尾から採血し、抗−
HBsAg抗体をRIA（Abbott Labs）により定量
し、そしてそれらの結果をマウス１匹当りの平均
タイターとして表わした。組織培養から得られた
HBsAgで免疫化したマウスは、ヒト血清から得
られたHBsAgで免疫化したマウスと同一のタイ
ターを示した。 第７図はSV40の１部として複製するHBV配列
の存在を示している。 第８Ａ図はこの組換体ベクターにより合成され
たHBsAgの蔗糖濃度勾配沈降の結果を示してい
る。第８Ｂ図は対応するCsCl濃度勾配遠心分離
の結果である。 第９図は本発明に従がつて、22nm粒子として
合成されたHBsAgの電子顕微鏡写真を示してい
る。 細胞培養系／細胞培養ベクター 培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖
は、近年日常的方法となつた（Tissue Culture
Academic Press社、KruseおよびPatterson編、
1973参照）。ここでは、HBsAgを産生するための
宿主としてCV−１系サル腎臓繊維芽細胞を使用
した。しかしながら、ここで詳細に記載した実験
は適合性のベクターの複製および発現を可能とす
る任意の細胞系、たとえばW138，BHK，3T3，
CHO，VEROおよびHeLa細胞系で行なうことが
できた。さらに、発現ベクターに要求されるもの
は、複製のオリジンと発現すべき遺伝子の前方か
つそれと一致する解読相にあるプロモータと、さ
らに任意の必要なリボソーム結合部位、RNAス
プライス（splice）部位、ポリアデニル化
（polyadenylation）部位および転写終止配列とで
ある。本発明ではSV40のこれら必須の要素を利
用したが、ここに好適具体例として記載した本発
明はこれら配列のみに限定するものでないと了解
される。たとえば、他のウイルス（たとえば
Polyma，Adeno，Retro，VSV，BPVなど）ベ
クターの複製オリジンを使用することができ、さ
らに非一体化状態で機能しうるDNA複製の細胞
オリジンも使用することができる。さらに、
SV40DNAの複製は独特の部位で始まり、二方向
性で進行する（19参照）。遺伝学的証明によれば、
ウイルスDNAの複製には１個のみのウイルス遺
伝子生産物が必要とされる。これはＡ遺伝子（Ｔ
抗原）の生産物であり、ウイルスDNA合成のそ
れぞれの段階を開始させるのに必要である（12参
照）。ここに記載された実験が示すところによれ
ば、SV40のDNA複製のオリジンを含有する組換
体プラスミドはSV40大型Ｔ抗原の存在下にサル
細胞中で複製することができる（20，21参照）。
複製およびプロモータ機能の両者を保持するベク
ターを作成することが望ましかつた。相補的補助
ウイルスの非存在下でこの種の系を使用して異種
遺伝子を発現しうることも確立されている。 ポリペプチド産生物 本発明は、生理学的目的で生体生物内で天然に
産生されるポリペプチドならびに不用蛋白質の開
裂除去、折り畳み組み合せなどによりこの種のポ
リペプチドに変換処理しうる中間体と同様な生物
活性を示す広範な種類のポリペプチドを製造する
のに有用である。これらの例はホルモン、たとえ
ばヒト成長ホルモン、牛（bovine）成長ホルモ
ンなど；リンフオカイン（lymphokine）；酵素た
とえばスーパーオキシドジスムターゼ（超過酸化
物不均化酵素）など；インターフエロン、たとえ
ばヒト繊維芽細胞ならびにヒトおよび雑種白血球
インターフエロンなど；ウイルス抗原もしくはイ
ムノゲン（免疫原）たとえばフツト・アンド・マ
ウス病（口蹄病）抗原、インフルエンザ抗原性蛋
白質、肝炎コア抗原および表面抗原など；各種の
その他ポリペプチド、たとえばヒトインシユリ
ン、ACTH、各種のグリコ蛋白質、免疫グロブ
リン、ビタミンＫを必要とする血液フアクター、
たとえば因子およびなどである。 これらの発現ベクターは、特にCOS−７系サ
ル細胞において異種ポリペプチドの合成を有効に
指令する。SV40の初期および後期プロモータの
使用を開発したが、その他のプロモータもこの点
に関し有用である。潜在的に有用なポリペプチド
（たとえば成長因子、リンフオカイン、ウイルス
抗原、インターフエロン）の効率的発現に加え
て、この系はその他の面でも有用である。たとえ
ば、著しいレベルのRNAがこれらのベクターか
ら合成され、このことはイントロンを含有するゲ
ノム挿入物が著しいレベルの処理RNAを生成し、
そこからcDNAクローンを容易に得ることができ
ることを示している。したがつて、この系はゲノ
ム挿入物をcDNAクローンに変換させるのに有用
であることが判かる。さらに、非溶菌発現系にお
いて、この方法を使用して遺伝子を発現させるこ
とができ、その目的で選択圧（たとえばジヒドロ
葉酸還元酵素、チミジンキナーゼ、薬剤耐性遺伝
子、腫瘍遺伝子）などを作用させることができ、
この結果ウイルス、DNA複製オリジンでなく宿
主に依在するベクター、ならびに宿主配列（たと
えば動原体）を獲得することにより安定して複製
するベクターの両者を得ることができる。 VP−１蛋白質のコード領域を含有しないSV40
DNAの作成 SV40 DNAの完全なヌクレオチド配列は公知
であり（１参照）、したがつて種々のSV40がコー
ドしている蛋白質の物理的位置を種々の制限酵素
開裂部位と直接に相関させることができる。VP
−１蛋白質をコードしている領域を包含するヌク
レオチド配列（１参照）の検査により、２つのう
まく配置している制限エンドヌクレアーゼ開裂部
位が判明した（第１図）。第１のものはヌクレオ
チド位置1493における制限エンドヌクレアーゼ
Hind の開裂部位であつて、VP−１蛋白質に
対する開始コドンに対しヌクレオチド６個分5′側
である。第２のもの、すなわちヌクレオチド2533
における制限エンドヌクレアーゼBam HIに対
する開裂部位は、VP−１蛋白質に対する終止コ
ドンに対してヌクレオチド50個分5′側である。
1493におけるHind 部位と2533におけるBam
HI部位との間が欠如したSV40 DNAを得るた
め、第１図に示したような実験を行なつた。要す
るに、野性型のSV40 DNAを先ずBam HIで開
裂させて充分な長さの線状DNAを得、次いでこ
れを各DNA分子が平均して、１個のみの開裂を
受ける（SV40ゲノム全体には６個のHind 開
裂部位が分布している）を受けるような条件下
で、Hind により開裂した。理論上12種の得
られる消化DNA混合物の１種は所望の１種の組
合せである筈である。次いで、合成デカヌクレオ
チド、すなわちdAGCTGAATTC（２参照）をこ
れらのBam HIおよびHind 処理された
SV40 DNAに対しHind 開裂部位の結合性末
端（−TCGA）とデカヌクレオチドの結合性末
端とを介して結紮させた。次いで、全混合物を
Eco RIで消化し（添加デカヌクレオチド上の
Eco RI部位における結合性末端を生ぜしめ）、
そしてBamおよびEcoRI（３参照）部位を介して
pBR 322中へクローン化させた。SV40配列を有
するプラスミドDNAを制限分析（４参照）によ
りスクリーニングし、規定した欠如部を有するそ
の断片を単離し、pSVRと名付けた。 合成デカヌクレオチドの添加には２つの目的が
ある。第１に、添加デカヌクレオチドは制限エン
ドヌクレアーゼEco RIに対する開裂部位を有
し、この部位はSV40 DNAのこの部分に存在し
ない。したがつて、E.coli（５参照）中でpSVR
プラスミドを繁殖させ、次いでエンドヌクレアー
ゼEco RIおよびBam HIにより開裂させるこ
とにより、多量のこのSV40 DNAベクター断片
を容易に得ることができる。第２に、この添加デ
カヌクレオチドは、外来遺伝子のコード配列を有
する適切に作成されたDNAをEco RI開裂部位
を介してこのSV40 DNAに結紮させると、Hind
開裂部位とVP−１蛋白質に対する開始コド
ンとの間の本来の物理的間隔を回復する（第３Ｂ
図参照）。 8μgのBamHIで開裂した線状で完全な長さの
SV40のウイルスDNA（これは野性型SV40ウイル
スDNAまたはクローン化されたSV40 DNAを
BamHIを用いてpBR322のBamHI部位にて開裂
させて得ることができる）を20mMtris−Cl（PH
7.5）と60mMNaClと7mMMgCl2とを含有する反
応混合物50μ中において、２単位のHind
（BRL）により消化させた。37℃にて30分間イン
キユベーシヨンした後、過剰のEDTAを添加し
て反応を止め、反応混合物をフエノール抽出によ
り除蛋白し、次いでエタノール沈澱させた。次い
で、部分消化したDNAを10μのTE緩衡液
（10mM tris−Cl（PH7.5）、1mM EDTA）中に再
懸濁させた。 Hind部位結合性末端をEcoRI部位結合性末
端に変換させるため、先ず0.1n molの合成デカ
ヌクレオチドdAGCTGAATTCをATPを用い
て、50mMグリシン緩衡液（PH9.1）と10mM
MgCl2と5mM DTTと0.5mM ATPと10単位の
キナーゼとを含有する反応混合物10μ中におい
てT4ポリヌクレオチドキナーゼにより燐酸化さ
せた。インキユベーシヨンを37℃にて１時間行な
つた。次いで、キナーゼ反応混合物の１アリコー
ト（3μ）を66mM tris−Cl（PH7.5）と6.6mM
MgCl2と10mM DTTと0.05mg／mlのBSAと
0.5mM ATPと4μgのHind で部分消化された
SV40 DNA（上記）と10単位のT4DNAリガーゼ
とを含有する結紮混合物（20μ）へ加えた。結
紮反応のためのインキユベーシヨンを20℃にて約
16時間行なつた。 結紮されたDNAを制限エンドヌクレアーゼ
Eco RIで処理して、結紮リンカー上にEco RI
結合性末端を生ぜしめた後、次いでこれをフエノ
ールによつて除蛋白し、エタノールで沈澱させ、
15μの結紮混合物（上記参照）中にてpBR 322
（0.5μg）のBam HI−Eco RI断片に結紮させ、
これを使用してＥ．coli 294を形質転換させた。
次いで、これら形質転換体から単離されたプラス
ミドを種々の制限酵素消化により適正なSV40
DNA断片の挿入に関しスクリーニングした。 HBsAg構造遺伝子の単離 上記で作成したSV40ベクターをＢ型肝炎ウイ
ルスの表面抗原（HBsAg）をコードしている遺
伝子を発現するよう設計した。分子量25000のポ
リペプチドであるHBsAgは通常複合粒子状構造
（22nm粒子）として存在し、これは部分的にグリ
コシル化されており、感染した肝臓細胞の外部に
分泌される（６参照）。 上記で作成したSV40ベクターにおいてHBsAg
を発現させるため、HBsAgのコード配列を有す
る理想的なDNA断片は次の条件に一致する。第
１に、このDNAは一方の末端部にEco RI制限
部位を有し、他方の末端部にBam HI部位を有
する。第２に、Eco RI部位はHBsAgの開始コ
ドンに対し直ぐ5′側に位置し、したがつてVP−
１蛋白質におけるATGの本来の位置を回復する
ことができる。最後に、得られた組換体SV40分
子はその寸法において野性型SV40 DNAと同様
であり、ウイルス粒子中に効率的に包封される。
上記の条件を満たすため、第２図に詳細に示した
一連の実験を行なつた。この作成の１つの重要な
特徴は、HBsAgの推定開始コドン（ATG）に対
し直ぐ5′側にEco RI制限部位を生成させること
である。これは、合成12量体
（dATGGAGAACATC）を使用することにより
行なわれ、この12量体はHBsAgにおける開始コ
ドンおよびそれに続く３個のアミノ酸に対応する
配列であり、Ｅ．coli DNAポリメラーゼが単
一鎖クローン化、HBV DNAからDNAを合成す
るための部位特定的なプライマーである。適正に
酵素処理した後、合成DNAをクローン化HBV
DNAと共に切り継ぎ、完全HBsAg遺伝子を再編
成させ、処理されたベクターDNAは末端に、規
定のEco RI部位を再編成するためのEco RI部
位を有している。このプラスミドをpHS 94と名
付ける。 pBR 322のEco RI部位中にクローン化した
HBVの完全ゲノムを含有するプラスミド
（pHBV−Ｔ−1A）から、HBsAgをコードして
いる構造遺伝子を回収した。このクローンは
Valenzuela et al（７および８参照）により最
近発表されたと同様な方法により得られた。 この構造遺伝子を２種の方法で変性し、(1)開始
ATGメチオニンコドンの前部に直接的に独特な
制限部位を組み込み、かつ(2)HBsAg遺伝子から
離れて位置するHBV Hpa 部位をpBR 322
の充填されたEco RI部位に平滑末端結紮させ
た。HBsAg構造遺伝子を含有するDNA断片に対
するこれら２つの改良は下記のようにして行なつ
た： (1) 先ず50μgのpHBV−Ｔ−IA DNAを200μ
の反応混合物中で酵素供給業者（BRL）の反
応条件に従つてHpa （80単位）により消化
させて、1.7kbのDNA断片を得、このDNA断
片においてはHBsAgのコード配列に対する開
始コドンがセンス−ストランド（約400bp）の
5′末端に近接位置する。このDNAをポリアク
リルアミドゲル電気泳動法（PAGE）により精
製した。次いで、精製されたHpa 断片を
100μの反応混合物（New England Biolab）
中でλエキソヌクレアーゼ（２単位）により37
℃で30分間処理した。λエキソヌクレアーゼは
二重鎖DNAを消化する5′エキソヌクレアーゼ
である。この反応は“センス−ストランド”
DNAのHBsAgコード配列から5′側半分を分裂
させ、アンチセンスストランドを露出して添加
プライマと対にする。λエキソヌクレアーゼ処
理されたDNAを除蛋白し、そして40mM燐酸
カリウム緩衡液（PH7.4 ）と1mM DTTと
50μg／ml BSAと6mM MgCl2と0.5mM各
dNTPと0.2n molのdATGGAGAACATC（ポ
リヌクレオチドキナーゼにより5′末端において
p32標識したもの）とを含有する反応混合物50μ
に再懸濁させた。この混合物を先ず90℃で１
分間加熱し、０℃で30分間アニールし、次いで
２単位のＥ．coli DNAポリメラーゼクレノ
ー断片（９参照）の存在下に37℃で３時間イン
キユベートした。このDNAポリメラーゼは添
加プライマーによりプライムされたDNAを合
成し、かつ3′−OH末端を有する単一鎖DNAを
分裂させ、したがつて、平滑末端化DNA分子
を生成した。次いで、得られたDNAを除蛋白
し、HBsAg遺伝子内に位置する部位にてXbaI
（45単位）により100μの反応混合物中で消化
させ、そしてPAGEにより分画した。HBsAg
遺伝子の最初の30個のコドンを有する91塩基対
のDNA断片をオートラジオグラフイー検出法
によつて単離した（断片Ａ）。 HBsAg遺伝子の直ぐ5′側に独特な制限部位
を生成させるため、プラスミドpBR 322の誘
導体（いわゆるpNCV）を利用した。この誘導
体はEcoRI部位に位置する配列： AATTCTGCAG GACGTCTTAA を有する合成DNAセグメントを含有する。こ
の合成DNA配列中に、Pst Ｉ部位を組み込ん
だ。10μgのpNCV DNA を先ず100μの反
応混合物中で24単位のPstI酵素によつて切断
し、次いで上記と同様な反応混合物50μ中で
２単位のＥ．coli DNAポリメラーゼクレノ
ー断片によつて８℃にて１時間処理した。この
DNAポリメラーゼ処理はPstI消化により生成
された４個の塩基対3′オーバーハングを除去し
て、完全なEco RI制限部位を有する平滑末端
DNAを残し、pBR 322の複製のオリジンを含
有する断片Ｂを与えた。上記のように調製され
た平滑末端HBsAg遺伝子断片Ａを、断片Ｂの
Eco RI部位に結紮させた。これは、プラスミ
ドpHS 94を生成させるための３断片結紮にお
いて行なつた。第３の断片（断片Ｃ）は次のよ
うに調製した： (2) プラスミドpHBV−Ｔ−1AからのHBsAg遺
伝子をHBsAg遺伝子から離れた部位において
Hpaにより開裂させた。このHpa部位を予
かじめDNAポリメラーゼクレノー断片（９参
照）が充填されているpBR 322のEco RI部位
に結紮させた。これはpBR 322の誘導体をサ
ブクローン化してpHS 42を生じしめることに
より行なわれた。このプラスミドをXba
（これはコドン31において開裂を行なう）と
BamHI（これはpBR322のEcoRI部位から375の
塩基対を開裂する）によつて開裂させ、殆んど
のHBsAg遺伝子と、このHBsAg遺伝子から離
れた約150個の塩基対と、プロモータ／オペレ
ータと、テトラサイクリン耐性遺伝子の最初の
200個の塩基対とを含有するDNA断片を生成さ
せた。ＸbaおよびBamHIにより限定される
DNA断片ＣをPAGEにより単離し、これを上
記の３断片結紮に使用してプラスミドpHS 94
を生成させた（第２図）。 HBsAgを合成しうる組換体SV40 DNAの作成 サル細胞をトランスフエクシヨンするよう適正
に結紮されたDNAを多量に得るため、結紮DNA
を次のようにしてＥ．coli中でクローン化した。
第３図に示したように、pSVRからのSV40
DNAを含有するBamHI乃至EcoRI断片を、先ず
pHS94からの肝炎表面抗原を有するEcoRI乃至
BamHI断片に、そのEcoRI部位を介して結紮さ
せ、得られた断片を次いでpBR 322のBamHI部
位にクローン化させた。 次いで、適正に作成されたDNA、pSVHBSA
を制限エンドヌクレアーゼBamHIで開裂させて
5382個のヌクレオチドのDNA断片を生成させる
ことができ、このDNA断片はそのVP−１蛋白質
のコード領域が肝炎表面抗原をコードしている遺
伝子により交換されている組換体SV40ゲノムよ
りなつている。 pSVHBSA DNAを作成するため、BamHI＋
EcoRIで消化されたpSVR DNAからのDNA断
片を含有するSV40 DNA0.3μgと、BamHIで消
化されたpHBV−Ｔ−IA DNA（詳細な構造につ
いては第２図参照）からのDNA断片を含有する
pBR 322 50ngと、Bam HI＋Eco RIで消化
されたpHS 94からのDNAを含有するHBsAg
コード配列0.2μgとを15μの結紮混合物中におい
て、それらの各BamHIおよびEco RI部位を介
し、T4 DNAリガーゼにより１晩インキユベー
シヨンして結紮させた。１つの種類の適正に結紮
されたDNA生産物はpBR 322の完全なtetR遺伝
子を再編成し、したがつてベクターDNAの自己
結紮から生じた多数のtetS組換体からtetRにより
選別することができる。次いで、pSVHBSAの
構造を制限酵素消化によつて証明した。 組換体SV40ウイルスの繁殖およびサル細胞にお
けるHBsAgの発現 この種のベクター系中における肝炎表面抗原の
合成の効率を試験するため、BamHIで開裂され
たpSVHBSA DNAをDEAEデキストラン法（11
参照）により単層CV−１細胞（10参照）中に導
入し、細胞をtsA 28もしくはtsA 58ウイルス
（12参照）のいずれかにより感染させた。次いで、
この単層CV−１細胞を適正な培養条件下で41℃
にてインキユベートした（11参照）。tsA 28と
tsA 58との両者はSV40 Ｔ抗原において温度感
受性の突然変異株を示し、したがつて41℃にて増
殖することができない（１参照）。同様に、組換
体SV40ゲノム（pSVHBSA）のみを含有する
CV−１細胞は、pSVHBSAがVP−１遺伝子を
欠如するため、感染性ウイルスを生成しない。予
想した通り、tsSV40ウイルスと組換体SV40ゲノ
ムとの両者を含有するCV−１細胞においては、
４日後に細胞変性効果が観察された。インキユベ
ーシヨンの２週間後に完全な溶菌が観察された。
組換体SV40ゲノムまたtsSV40ウイルスのいずれ
か一方のみを有するCV−１細胞においては細胞
変性効果は観察されなかつた。HBsAgに対する
一般的なラジオイムノアツセイ（13参照）を用い
て、培地中の表面抗原産生をDNAの導入４日後
できるだけ早く検出した。定量分析が示したとこ
ろでは１×106個の単層CV−１細胞は3.8μgの
HBsAgを各感染サイクルにつき産生し、これは
９×107分子／細胞に相当する。この数は単一の
感染サイクル（１参照）で産生されるSV40 VP
−１蛋白質分子の推定個数に殆ど同一である。 組換体SV40ゲノムがSV40ウイルスと同様に
CV−１細胞中に封入されているかまたは繁殖し
ているかどうかを決定するため、CV−１細胞の
プレートに元来の共感染された細胞からの溶菌物
のアリコートとtsSV40ウイルスとを41℃にて感
染させた。感染した細胞からの低分子量のDNA
を感染の72時間後にハートの方法（14参照）によ
り単離した。単離したDNAを処理しないか、或
いは制限エンドヌクレアーゼで開裂させ、そして
アガロース上でのゲル電気泳動により分画した。
次いで、分画されたDNAを変性させ、サウザー
ンの方法（15参照）によりニトロセルロース紙に
移し、P32−標識pHS 94 DNAでプローブした。
第７図から判かるように、肝炎遺伝子配列を有す
る組換DNA分子は、殆どSV40ウイルスDNA（レ
ーンＡ）から区別できない寸法の閉環DNAとし
て存在する。大部分の組換DNAは生体内（in
vivo）結紮によりそのBamHI部位を再生する
（レーンＢ）。予想通り、Ｂ型肝炎表面抗原のコー
ド領域を含有するBam−Eco RI断片（第３図
参照）は、未変化の形態で単離することができ
る。 全面の90％まで繁殖したCV−１細胞の150mmプ
レートに、元来のトランスフエクシヨン実験から
調製された溶菌物（組換体とtsA 28ウイルスと
を含有する）を感染させ、過剰のtsA28ウイルス
を補充した後41℃にてインキユベートした。感染
後70時間で培地を収穫して合成されたHBsAgを
特性化した。さらに、細胞内低分子量DNAをハ
ートの方法（14参照）に従がつて単離した。この
単離されたDNAをtris−Cl（PH7.4）、1mM
EDTAを含有する緩衡液１ml中に再懸濁させた。
次いで、5μの未切断DNAと5μのBamHIで
消化されたDNAとをTBE緩衡液中の0.8％アガロ
ースゲルにより電気泳動で分画し、さらにSV40
DNAもコントロールとして同様に処理した。ゲ
ル上のDNAパターンをニトロセルロース紙のシ
ートに移し、HBsAg遺伝子プローブソースとし
てP32−標識pHS 94 DNA（15参照）にハイブリ
ダイズした。第７図は、ハイブリダイゼーシヨン
後のP32−標識pHS 94 DNAのオートラジオグラ
フイー像を示している。レーンＡおよびＢは、そ
れぞれ未処理のハート上澄液およびBamHIで消
化されたハート上澄液のDNAである。，お
よびは、コントロールSV40 DNAの型、
型および型の位置を示し、それらの位置は
DNAをニトロセルロース紙に移す前にエチジウ
ムブロマイド染色により決定した。 pSVHBSAによりコードされている肝炎表面抗
原は粒子形態で合成される 肝炎表面抗原は合成されて、感染肝臓細胞から
粒子として分泌される（６参照）。各種のクロー
ン化肝炎DNAの配列分析は、成熟表面抗原が大
型先駆体蛋白質から開裂されうる可能性を示唆し
ている（８参照）。成熟HBsAg分子プラス幾つか
の3′末端未翻訳配列をコードしているDNAのみ
が上記の作成においてSV40ゲノム中に組み込ま
れるので、問題とする先駆体ペプチドが22nm粒
子を組み立てる際に、および細胞からのその分泌
の際に機能的役割を演ずるかどうか疑問である。
この目的で、合成した肝炎表面抗原をその性質に
つき沈降速度、沈降平衡、および電子顕微鏡分析
により標準蛋白質と比較して特性化した。第８図
に示されるように、このベクター系で合成された
肝炎表面抗原は感染肝臓細胞系の培地から単離さ
れた肝炎表面抗原（17参照）とは区別しえない沈
降速度を有し、1.22ｇ／cm3の浮遊密度を有し、こ
れも標準表面抗原22nm粒子と同様であつた（６
参照）。精製された表面抗原の電子顕微鏡による
検査も平均直径220Å（22nm）の主として粒状の
構造を示し、形態学的に標準22nm粒子と同一で
あつた（第８および９図）。したがつて、成熟肝
炎表面抗原蛋白質モノマーは22nm粒子の組み立
てに必要とされる肝炎ウイルスによりコードされ
ている唯一の必須構造成分である。 A.CV−１細胞で合成されたHBsAgの沈降速
度とヘパトーマ細胞系PLCにより合成かつ分泌
されたHBsAg（17および18参照）の沈降速度とを
比較した（第８Ａ図）。第７図に記載した実験か
ら収穫された培地を、HBsAgの原料としてこの
実験に使用した。PLC細胞系により産生された
HBsAg（17および18参照）を培地から収穫した。
両カルチヤーからのHBsAgを先ず45％飽和硫酸
アンモニウムで沈澱させ、かつ20mM tris−Cl
（PH7.4）と0.5mM EDTAと0.5mM NaClとを含
有する緩衡液中に再懸濁させた（HBsAgの最終
濃度0.5μg／ml）。200μの各試料を同じ緩衡液中
の２つのパラレルの５ml蔗糖濃度勾配（５〜20％
蔗糖）に装填した。ベツクマン（Beckman）
SW50.1型ローターにて45000rpmで遠心分離を４
℃にて80分間行なつた。市販のHBsAg分析キツ
ト（Ausria −125、Abbott Lab）を用いて
HBsAgを検出した。HBsAgの回収率は常に80％
以上であつた。 B.CV−１細胞で合成されたHBsAgの浮遊密度
を測定した（第８Ｂ図）。プールした感染カルチ
ヤー培地からのHBsAg2μgを45％飽和硫酸アン
モニウムで沈澱させ、アガロースゲル侵透カラム
（A5.0M、Bio−Rad）上で分画し、次いでＡ項
で記載した通り５〜20％蔗糖濃度勾配により沈降
させた。蔗糖濃度勾配遠心分離の後、プールした
HBsAgを蔗糖を含まない濃度勾配緩衡液に対し
て透析し、次いで固体のCsClを加えて最終密度
1.2ｇ／ceの溶液（７ml）を与えた。次いで、こ
れをソルバール（Sorvall）T865.1型ローターに
おいて50000rpmで68時間遠心分離した。次いで、
Ａ項に記載したと同様に分析を行なつた。CsCl
濃度勾配におけるHBsAgの回収率は約70％であ
つた。次いで、ピークフラクシヨン（画分）をプ
ールし、10mM Tris Clと100mM NaClと
0.5mM EDTA緩衡液に対して透析し、濃縮し、
そして電子顕微鏡検査のための試料を調製した。 電子顕微鏡写真用の抗原を調製するため、炭素
被覆した銅グリツドを作成した。HBsAg蛋白質
（1μg／ml）を含有する緩衡液１滴をグリツド上
に室温で30分間載置した。蛋白質溶液をグリツト
から半径方向に吸い取り、４滴のH2Ｏで１回洗
浄した。次いで、このグリツドを1.0％ホスホタ
ングステン酸ナトリウム（PH7.6）で１分間染色
し、そして紙により乾燥させた。次いで、
Phillips E.M.400型により倍率77700倍にて電子
顕微鏡写真を撮つた。これは陰画を与え、これか
ら第９図に示すように拡大して（約10倍）陽画を
作成した。 HBsAgを発現する非溶菌ベクターの作成 組換プラスミドを作成したが、このプラスミド
はプラスミドpML（21参照）から生じたpBR 322
配列と、DNA複製のオリジン領域と初期および
後期の両方の転写単位に対するプロモータ配列と
からなるSV40 DNAの348塩基対と、HBsAg用
の遺伝子をコードしているHBV配列とを含有す
る。SV40のオリジンは、SV40 DNAをHind
により消化させ、かつHind末端をコンバータ
（AGCTGAATTC）の添加によりEco RI末端に
変換させることにより単離した。このDNAを
Pvuで切断し、かつRIリンカーを加えた。Eco
RIでの消化の後、オリジンにわたる348塩基対断
片をポリアクリルアミドゲル電気泳動および電気
溶出によつて単離し、pBR 322にクローン化さ
せた。HBVのEco RIおよびBglでの消化から
生ずる1986塩基対断片（22参照）（これはHBsAg
をコードしている遺伝子にわたる）をEco RIお
よびBamHI部位にてプラスミドpML（21参照）
中でクローン化させることにより、発現プラスミ
ドpHBs 348−ＥおよびpHBs 348−Ｌを作成し
た。（pMLはサル細胞におけるプラスミド複製に
対し抑制的である配列を除去する欠如部を有する
pBR322の誘導体である（21参照）。）次いで、得
られたプラスミド（pRI−Bgl）をEco RIによつ
て線状化させ、そしてSV40オリジン領域を示す
348塩基対断片をpRI−BglのEco RI部位に導入
した。オリジン断片は、いずれの配向性でも挿入
することができる。この断片は複製のオリジンに
加えて初期および後期のSV40プロモータの両者
をコードしているので、HBV遺伝子はこの配向
性に応じていずれかのプロモータの制御下に発現
させることができる（HBsを代表するpHBS 348
−Ｅは初期プロモータの制御下で発現され、かつ
HBsを代表するpHBs 348−Ｌは後期プロモータ
の制御下で発現される）。 サル細胞におけるSV40−HBVプラスミドの複製 COS−７系サル細胞におけるHBV−SV40組換
プラスミドの複製を次のように行なつた： DEAE−デキストラン技術によるDNAトラン
スフエクシヨンの後の種々の時点で、低分子量の
DNAをハートの方法（14参照）により単離し、
アガロースゲルでの電気泳動により分画し、そし
てサウザーンのブロツトハイブリダイゼーシヨン
（15参照）によつて分析した。第４図は、トラン
スフエクシヨン直後に殆んどまたは全くスーパー
コイルプラスミドがCOS細胞中に存在しないこ
とを示している。しかしながら、トランスフエク
シヨンの３日後、投入したDNAの著しい複製が
pHBs 348−Ｌ DNA（レーンｂ）またはpHBs
348−Ｅ DNAのいずれかの導入の後に生じた。
予想通り、プラスミドpRI−Bgl（これはSV40オ
リジン配列を欠如しているが、その他の点では上
記の発現プラスミドと同一である）のトランスフ
エクシヨンの後プラスミド複製は全く観察されな
かつた（レーンａ）。 組換えプラスミドでトランスフエクトしたサル細
胞におけるHBsAgの合成 DEAE−デキストランおよびDNAに対する細
胞の処理および露出時間を12時間に増大させるこ
とによりDEAE−デキストラン法（11参照）を改
変して、プラスミドpML、pRI−Bgl、pHBs
348−ＥおよびpHBs 348−ＬをCOS−７系サル
細胞（23参照）中に導入した。このCOS−７細
胞系はSV40の初期領域の一体化コピーを有し、
SV40A遺伝子産生物（Ｔ抗原）を構成的に発現
する。SV40 DNA複製の機能的オリジンを含有
するプラスミドは、SV40T抗原の存在下にサル
細胞中で複製することが示された（20，21参照）。
第５図は、プラスミドpHBs 348−Ｅおよび
pHBS 348−ＬでトランスフエクトしたCOS細胞
が２日目までに著量のHBsAgを発現し始め、２
週間以上にわたり発現し続けることを示してい
る。pHBs 348−Ｌにより指令される発現のレベ
ルはpHBs 348−Ｅにより指令されるレベルより
若干高い。これらの結果の１つの解釈は、後期の
SV40プロモータがこの系においては初期プロモ
ータより有効になりうることである。 組織培養で誘導れたHBsAgは動物において免疫
原性である。 組織培養から得られたHBsAgの粒子は抗原活
性であることを示したが、これら粒子が動物にお
いて免疫原性であるかどうかを決定することが望
ましい。したがつて、COS−７細胞により産生
された抗原を硫酸アンモニウム沈澱を蔗糖濃度勾
配遠心分離とCsCl密度勾配遠心分離との組合せ
により精製した。組織培養で得られたHBsAgを
各マウスに注射する一方、コントロールマウスを
ヒト血清から得られた市販のHBsAg（North
American Biologicals Inc.）の同量で免疫化し
た。次いで、免疫化の後の種々の時点で、抗−
HBsAgのタイターを決定した。第６図は、抗−
HBsAgの著量のタイターが標準HBsAgで免疫化
したマウスならびに組織培養で得られたHBsAg
で免疫化したマウスにおいて現われたことを示し
ている。さらに、組織培養から得られたHBsAg
で免疫化したマウスでの抗−HBsAg抗体現出の
動力学およびタイターは標準HBsAgで免疫化し
たマウスでの観察とは区別できなかつた。したが
つて、結論として、組換DNA技術によりサル細
胞中で合成されたHBsAgは、同一と言わないま
でも、免疫原性においてヒト血清から得られた
HBsAgと類似であり、そのワクチンとしての効
果が充分に示された。 薬剤組成物 本発明の産生物を公知方法により調合して薬剤
的に有用な組成物を製造することができ、それに
よりこのポリペプチドを薬剤上許容しうる担体ベ
ヒクルと混合する。適するベヒクルおよびその配
合はE.W.MartinによりRemingtonの
Pharmaceutical Scienceに記載されており、こ
れを参考のためここに引用する。この種の組成物
は有効量のポリペプチド産生物を、宿主に対し有
効投与するのに適する薬剤上許容しうる組成物を
製造するための適当量の担体ベヒクルと混合して
含有する。１つの好適な投与方式は非経口ルート
である。適する動物衛生製剤は、必要に応じ変更
を加えて、薬剤組成物の場合と同様に調製され
る。 ワクチン製造 本明細書中に記載したように製造した適するポ
リペプチドを混入した本発明のワクチンは、公知
方法に従がつて調製することができ、ここでこの
ポリペプチドを適するベヒクルと混合する。適す
るベヒクルは、たとえば食塩溶液、各種の公知ア
ジユバント、またはウイルス感染を予防するため
使用される組成物に使用するための当業界で認め
られたその他添加物を包含する。この種のワクチ
ンは有効量のポリペプチドと、宿主に対し有効投
与するのに有用なワクチンを製造するための適当
量のベヒクルとを含有する。これについては、文
献「ワクチンにおける新たな傾向および開発」編
集者A.VollerおよびH.Friedman，University
Park Press，Baltimore，1978を参照するとが
でき、これをワクチンの製造に関するさらに詳細
な背景を示すため参考としてここに引用する。 これらワクチンの活性成分を製造する方法が独
特であるため、このワクチンは実質的に外来蛋白
質ならびにその他のウイルス性および細胞成分を
含有しないと思われる。したがつて、これらワク
チンは完全に死滅した、または不活化されたウイ
ルスワクチン製剤の副作用を殆ど生じないと思わ
れる。 上記の説明から本発明は、たとえば目的とする
ポリペプチド産生物の選択におけるように、ここ
に記載した好適具体例のみに限定されないことが
当業者には明らかであろう。 参考文献 １ N.H.Acheson in Molecular Biology of
Tumor Viruses.（J.Tooze ed.）Cold Spring
Harbor Lab.N.Y.2nd edi.Part 2.pp.125−204
（1980）． ２ R.Crea，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.
A.）75，5765（1978）． ３ D.V.Goeddel，et al.，Proc.Natl.Acad.Sei.
（U.S.A.）76，106（1979）． ４ R.W.Davia，et al.，Advanced Bacterial
Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory.
N.Y.pp.116−125（1980）． ５ D.H.HamerおよびP.Leder，Cell，18，1299
（1979）． ６ O.Blumberg，Science 197，19（1977）． ７ P.Valenzuela，et al.，Nature，280，815
（1979）． ８ P.Charnay et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.（U.
S.A.）76，2222（1979）． ９ H.Jacobsen et al.，Eur.J.Biochem.45，623
（1974）． 10 J.E.MertzおよびP.Berg.，Virology，62，
112（1974）． 11 J.H.McCutchanおよびJ.S.Pagano，J.Nat.
Cancer Inst.41，351（1968）． 12 P.J.Tegtmeyer，J.Virology 10，591（1972）． 13 Ausria II−125.Abbott Lab. 14 B.J.Hirt，J.Mol.Biol.26，365（1967）． 15 E.M.J.Southern，J.Mol.Biol.98，503
（1975）． 16 Ｃ−J.LaiおよびD.Nathans，J.Mol.Biol.89，
179（1974）． 17 J.J.Alexander et al.，S.Afr.Med.J.50，
2124（1976）． 18 P.L.Marion et al.，J.of Virol.32，796
（1979）． 19 DNA Tumor Viruses 2nd Ed.（Ed J.
Tooze），Cold Spring Harbor Lab.，N.Y.
（1980）． 20 MyersおよびTjian，Proc.Natl.Acad.Sci.
（U.S.A）77，6491（1980）． 21 LuskyおよびBotchan，Nature 293，79
（1981）． 22 Animal Virus Genetics（Ed.Fields，
JaenischおよびFox），Chapter ５，ｐ 57，
Academic Press，N.Y.（1980）． 23 Gluzman，Cell 23，175（1981）．
により製造されるＢ型肝炎表面抗原からなる粒
子、および該粒子を含有するワクチンに係る。 本発明の背景を説明しかつ特にその実施に関し
さらに詳細な説明を記載している刊行物およびそ
の他資料をここに参考のため引用し、便宜上参照
符号を付し参考文献として本明細書末尾に記載す
る。 組換えDNA技術を用いることにより極めて多
くの有用なポリペプチドの制御された微生物的産
生が可能となつた。たとえば、ヒト成長ホルモ
ン、ヒトプロインシユリン、デアセチルチモシン
（desacetylthymosin）α1、ヒトおよび雑種（ハ
イブリツド）白血球インターフエロン、ヒト繊維
芽細胞インターフエロンならびに多くの他の生産
物のような、多くの脊椎動物ポリペプチドが既に
各種の微生物により産生されている。この技術の
力は極めて多くの種類の有用なポリペプチドの微
生物的産生を可能にし、広範な種類の薬剤が目標
とする用途に有用なホルモン、酵素、抗体および
ワクチンの微生物的製造を可能にする。 組換えDNA技術の基礎的要素はプラスミド、
すなわち１個の細胞当り多数のコピーとして、し
ばしば細菌中に見出される二本鎖DNAの染色体
外ループである。プラスミドDNAにコードされ
ている情報には、娘細胞中にプラスミドを再生す
るのに必要な情報（「レプリコン」すなわち複製
のオリジン）が含まれ、さらに通常１種もしくは
それ以上の表現型選択特性、たとえば抗生物質耐
性が含まれ、これらは目的とするプラスミドを含
有する宿主細胞のクローンを識別し、かつ優先的
に選択培地中で増殖させることを可能にする。細
菌性プラスミドの有用性は、これらプラスミド
DNA上の異なる部位をそれぞれ識別する種々の
制限エンドヌクレアーゼすなわち「制限酵素」に
よりプラスミドを特定的に開裂させうるという事
実にある。その後、開裂部位でまたは開裂部位に
隣接する再構成末端で端部結合（末端−末端結
合）させることにより、異種遺伝子もしくは遺伝
子断片をプラスミド中に挿入することができる。
いわゆる複製しうる発現ベヒクルはこのようにし
て生成される。 DNA組換えは宿主生物の体外で行なわれ、得
られる「組換体」複製可能発現ベヒクルすなわち
プラスミドは形質転換として知られる方法によ
り、微生物細胞中に導入することができ、かつ多
量の組換えベヒクルを形質転換体の増殖により得
ることができる。さらに遺伝子がコードしている
DNAメツセージの転写および翻訳を支配するプ
ラスミドの部分に関し適切に遺伝子を挿入すれ
ば、得られる発現ベヒクルを使用して、挿入遺伝
子がコードしているポリペプチドの産生を指令す
ることができる。この過程を発現という。 発現はプロモータとして知られるDNA領域に
おいて開始される。発現の転写期において、
DNAはほどけてこれを開始したDNA配列からメ
ツセンジヤRNAへの合成の鋳形として露呈する。
次いで、メツセンジヤRNAはリボソームに結合
し、ここでメツセンジヤRNAはこのmRNAがコ
ードしているアミノ酸配列を有するポリペプチド
鎖に翻訳される。各アミノ酸はヌクレオチドトリ
プレツト、すなわち「コドン」によりコードされ
ており、このコドンが集合して「構造遺伝子」、
すなわち発現ポリペプチド産生物のアミノ酸配列
をコードしているDNA配列部分を構成する。翻
訳は「開始」信号（通常ATG、これは得られる
メツセンジヤRNAにおいてはAUGとなる）にお
いて開始される。いわゆる停止コドンは翻訳の終
了を規定し、したがつてそれ以上のアミノ酸単位
の産生を規定する。得られる産生物は必要に応じ
微生物系中において宿主細胞を溶菌させ、かつ他
の蛋白質からの適当な精製により産生物を回収す
ることにより得ることができる。 実際上、組換えDNA技術の使用は完全に異種
のポリペプチドの発現、いわゆる直接的発現を可
能にし、或いは同種ポリペプチドのアミノ酸配列
の一部に融合した異種ポリペプチドの発現を可能
にする。後者の場合、目的とする生物活性産生物
は、しばしば融合した同種／異種ポリペプチド内
において、このポリペプチドが菌体外環境で開裂
されるまで生物不活性にされている。英国特許公
開公報第2007676A号およびWetzel，American
Scientist，第68巻、第664頁（1980）参照。 組換えDNA技術がその有望性を充分に保持し
ようとするならば、目的とするポリペプチド産生
物を制御環境においてかつ高収率で入手しうるよ
う遺伝子挿入物の発現を最適化する系を案出せね
ばならない。 遺伝学および細胞生理学を研究するための細胞
培養または組織培養の技術は充分に確立されてい
る。単離正常細胞の連続的転移（transfer）によ
つて製造された永久細胞系（permanent
cellline）を維持するための手段および方法を使
用することができる。研究に使用するには、この
種の細胞系は液状媒体中で固体支持体上に維持さ
れるか、或いは支持栄養物を含有する懸濁物中で
増殖させて維持される。大規模製造に対するスケ
ールアツプは機械的問題を課するだけであると思
われる。その他の技術的背景については
Microbiology，第２版，HarperおよびRow出版
社、Hagerstown，Maryland（1973）、特に第
1122頁以降、およびScientific American，第245
巻、第66頁以降（1981）を参照することができ
る。そのおのおのを参考のためここに引用する。 本発明は、組換えDNA技術を脊椎動物宿主細
胞培養系において成功りにかつ効率的にポリペプ
チドを産生させるのに使用しうるという知見に基
づくものであり、したがつてこの種の系はたとえ
ばグリコシル化（glycosylation）、燐酸化
（phosphorylation）、メチル化（methylation）、
ならびに天然に産生される動物性蛋白質に一層近
縁の糖質および脂質結合という利点を有し、これ
に対し細菌もしくは酵母宿主においてはそのよう
なレベルの洗練された工程による産生は不可能で
ある。さらに、脊椎動物細胞培養は疑いもなく充
分にポリペプチド産生物を許容し得、特に或る場
合には細胞培養培地中にその産生物を分泌するこ
とさえでき、回収および精製法において著しく有
益である。 一好適具体例において、本発明は、脊椎動物細
胞カルチヤー中でＢ型肝炎表面抗原（HBsAg）
を、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）の免疫原性決定
基を含む分離した粒子形態として産生する手段お
よび方法に係る。このHBsAgは個々の粒子形態
として細胞カルチヤー培地中に分泌され、HBV
ゲノムのその他部分により或いは使用するベクタ
ーに同種のDNAによりコードされているかどう
かに拘わらず、いかなる付加的な融合ポリペプチ
ド人為構造も含有しない。本発明は、HBVに対
する免疫原性を感受性のヒトに付与するのに有用
なワクチンの製造に対し、かく産生された
HBsAgを使用することに関し、さらにこの種の
ワクチンならびにHBVに対する免疫原性を感受
性のヒトに対し接種および付与するためのその使
用方法に向けられる。 Ｂ型肝炎（血清肝炎）ウイルスは人間の間で伝
染し、慢性弱質感染として現われ、徐々に重症の
肝臓障害、初期癌および死亡へと漸次進行する。
大低の場合、Ｂ型肝炎感染からの完全な回復を期
待することができるが、特に多くのアフリカおよ
びアジア諸国における人口の多数は慢性保菌者で
あつて、この病気を広い範囲に伝染させるという
危険な潜在性を有している。 肝炎はウイルスベクター（Ｂ型肝炎ウイルスす
なわちHBV）によつて引きおこされ、このウイ
ルスベクターはその完全な状態、すなわちいわゆ
るデーン粒子においてビリオンを示し、かつ
DNA分子を包封する27nmのヌクレオカプシドと
このヌクレオカプシドを包囲するエンベロプとか
ら構成されている。ビリオンに関連する蛋白質
は、コア抗原（HBcAg）、DNAポリメラーゼ、
および感染した保菌者の血清中に見出される表面
抗原（HBsAg）を包含する。HBsAgに対する抗
体もHBV感染者の血清中に見出されている。
HBsAgはHBV抗原であつて、抗体（抗−HBs）
の免疫原性産生を誘発しうると信じられ、したが
つてHBVワクチンにおける主要素であろう。こ
れについては次の文献を参照することができる：
Dane et al・，Lancet（1970）（），695
（1970）；Hollinger et al・，Ｊ・Immunology，
107，1099（1971）；Ling et al・，Ｊ・
Immunology，109，834（1972）；Blumberg，
Science，197，17（1977）；Peterson et al・，
Proc.Nat，Acad，Sci.（USA），74，1530（1977）
およびViral Hepatitis，Ａ Centemporary
Assessment of Etiology，Epidemiology，
PathogenesisおよびPrevention.（Vyas et al・，
eds），Franklin Institute Press，Philadelphia，
1978。これらの文献のそれぞれを本発明の背景を
さらに説明するためここに参考として引用する。 HBsAgは、約16〜25nmの範囲の直径を有する
球状粒子、いわゆる「22nm粒子」の形態で、主
として感染血漿中に存在する。これらは、非感染
性ウイルスエンベロプであると思われる。
HBsAgに対する抗体はHBV感染に対して予防効
果を有するので、これらの非感染性粒子をワクチ
ンとして有効に使用することができる。 Ｂ型肝炎ウイルスは細胞培養物（カルチヤー）
中では感染性でなく、感染したヒトまたは高級霊
長類からしか得られないので、HBVに対する免
疫化用の抗原を産生させるために使用する充分な
HBVの供給源を獲得しかつ維持する手段は得ら
れなかつた。 英国特許出願公開第2034323A号およびヨーロ
ツパ特許出願公開第13828号および第20251号明細
書には、それぞれHBVゲノムの単離およびクロ
ーン化、HBVコア抗原の発現、ならびにHBsAg
の一部を含有するとされている融合蛋白質のＥ・
coliにおける産生が記載されている。Proc・
Natl・Acad・Sci・（USA），第77巻、第4549頁
（1980）は、タンデムクローン化Ｂ型肝炎ゲノム
を用いるマウス細胞の形質転換による、マウス染
色体の一体化（intergration）を報告している。 Moriarty et al・，Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA），第78巻、第2606頁（1981）はHBV−
DNAの断片を有するサルウイルス40（SV40）組
換体の作成を記載している。サル腎臓細胞の培養
物にウイルス組換体を感染させ、そしてＢ型肝炎
に感染した患者の血清中に見出されると同じ特性
を有するとされている22nm粒子を産生させた。
Moriarty et al・によれば、組換体ベクターは
HBsAg配列を有するHBVゲノムの大型セグメン
トを含有し、かつSV40腫瘍蛋白質およびその他
HBV蛋白質をコードしているDNA配列を包含し
ていた。さらに、それらの作成は、SV40ウイル
スのVP−２蛋白質をコードしている配列と同じ
枠で（in frame）HBsAgDNAを組み込んだ。
成熟（完全な）HBsAgが発現されたかどうかは
明確でない。 第１図はVP−１蛋白質をコードしている領域
が欠如したSV40DNAを含有するプラスミド
pSVRの作成を示している。 第２図はHBsAgDNAを有するプラスミドpHS
94の作成を示している。 第３図はHBsAgDNA並びにSV40および
pBR322から誘導されたDNAの配列を含有する
プラスミドpSVHBSAの作成を示している。第
３図Ｂにおいて、VP−１蛋白質のATG開始コド
ン（上部の線内に囲われている）を包囲する
DNA配列を組換体（下方の線内に囲われた
ATG）で作られるHBsAgのDNA配列と比較し
た。EcoR部位に変換されたHind部位に下線
を施こす。 第４図はサル細胞におけるプラスミドDNAの
複製を示している。単層Cos細胞が６cmのプラス
チツク皿において全面（confluency）の50〜60％
まで成長した。これらの細胞をドルベツコ
（Dulbecco）の改良培地で洗浄し、そして1μgの
プラスミドDNAと200μgのDEAE−デキストラ
ンとを含有する培地２mlを12時間37℃にした。
DNA溶液を除去し、細胞を培地で１回洗浄し、
10％胎児牛（calf）血清を含有する培地５mlを加
え、そして細胞をDNA抽出の前に37℃にて１日
間または３日間インキユベートした。これらの場
合、小さなスーパーコイルプラスミドDNAを
Hirt（後記参考文献14参照。以下同じ）の方法に
従がつて単離した。DNAをアガロースゲル電気
泳動にかけ、そしてニトロセルロースに移した
（15参照）。複製プラスミドを可視化するため、ニ
トロセルロースフイルターをP32で標識したHBV
DNAでプローブした。レーン(a)：pRI−Bglでト
ランスフエクシヨン（transfection、形質変換）
した細胞のハート（Hirt）溶菌物からのDNA。
レーン(b)：pHBs348−Ｌでトランスフエクシヨ
ンした細胞のハート溶菌物からのDNA。レーン
（Ｍ）：pHBs348−Ｌ DNA1μg。矢印は閉環
DNA（）と開環DNA（）の位置を示してい
る。 第５図はCos細胞における組換体プラスミドに
より合成されたHBsAgの定量化を示している。
単層Cos細胞を６cmのプラスチツク皿において全
面の約50％まで成長させ、上記第４図の説明に記
載したようにDNAでトランスフエクシヨンした。
トランスフエクシヨンの後10％の胎児牛血清を含
有するDulbecco改良培地２mlを加え、そして培
地をそれぞれの時点でHBsAg発現につき24時間
の蓄積後に分析した。HBsAg発現は、RIA
（Abbott Labs）により分析し、0.2mlの未希釈培
地中における１分間当りのカウント数（cpm）と
して表わされる。 第６図はサル細胞から誘導されたHBsAgの免
疫原性を示している。pHBs348−Ｌでトランス
フエクシヨンしたCos細胞の20個の15cm皿から培
地をとり、そして電子顕微鏡検査用に上記のとお
りHBsAgを精製した。５匹のマウスからなる３
群を、それぞれ完全フロイントアジユバント
（complete Freund´s adjuvant）の存在下で
2.8μg、0.6μg、または0.006μgの精製HBsAgで免
疫化した。コントロールマウスについてはヒト血
清（North American Biologicals Inc.）から得
られた真正HBsAgの同量で免疫化した。免疫化
の後、種々の時点で、マウス尾から採血し、抗−
HBsAg抗体をRIA（Abbott Labs）により定量
し、そしてそれらの結果をマウス１匹当りの平均
タイターとして表わした。組織培養から得られた
HBsAgで免疫化したマウスは、ヒト血清から得
られたHBsAgで免疫化したマウスと同一のタイ
ターを示した。 第７図はSV40の１部として複製するHBV配列
の存在を示している。 第８Ａ図はこの組換体ベクターにより合成され
たHBsAgの蔗糖濃度勾配沈降の結果を示してい
る。第８Ｂ図は対応するCsCl濃度勾配遠心分離
の結果である。 第９図は本発明に従がつて、22nm粒子として
合成されたHBsAgの電子顕微鏡写真を示してい
る。 細胞培養系／細胞培養ベクター 培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖
は、近年日常的方法となつた（Tissue Culture
Academic Press社、KruseおよびPatterson編、
1973参照）。ここでは、HBsAgを産生するための
宿主としてCV−１系サル腎臓繊維芽細胞を使用
した。しかしながら、ここで詳細に記載した実験
は適合性のベクターの複製および発現を可能とす
る任意の細胞系、たとえばW138，BHK，3T3，
CHO，VEROおよびHeLa細胞系で行なうことが
できた。さらに、発現ベクターに要求されるもの
は、複製のオリジンと発現すべき遺伝子の前方か
つそれと一致する解読相にあるプロモータと、さ
らに任意の必要なリボソーム結合部位、RNAス
プライス（splice）部位、ポリアデニル化
（polyadenylation）部位および転写終止配列とで
ある。本発明ではSV40のこれら必須の要素を利
用したが、ここに好適具体例として記載した本発
明はこれら配列のみに限定するものでないと了解
される。たとえば、他のウイルス（たとえば
Polyma，Adeno，Retro，VSV，BPVなど）ベ
クターの複製オリジンを使用することができ、さ
らに非一体化状態で機能しうるDNA複製の細胞
オリジンも使用することができる。さらに、
SV40DNAの複製は独特の部位で始まり、二方向
性で進行する（19参照）。遺伝学的証明によれば、
ウイルスDNAの複製には１個のみのウイルス遺
伝子生産物が必要とされる。これはＡ遺伝子（Ｔ
抗原）の生産物であり、ウイルスDNA合成のそ
れぞれの段階を開始させるのに必要である（12参
照）。ここに記載された実験が示すところによれ
ば、SV40のDNA複製のオリジンを含有する組換
体プラスミドはSV40大型Ｔ抗原の存在下にサル
細胞中で複製することができる（20，21参照）。
複製およびプロモータ機能の両者を保持するベク
ターを作成することが望ましかつた。相補的補助
ウイルスの非存在下でこの種の系を使用して異種
遺伝子を発現しうることも確立されている。 ポリペプチド産生物 本発明は、生理学的目的で生体生物内で天然に
産生されるポリペプチドならびに不用蛋白質の開
裂除去、折り畳み組み合せなどによりこの種のポ
リペプチドに変換処理しうる中間体と同様な生物
活性を示す広範な種類のポリペプチドを製造する
のに有用である。これらの例はホルモン、たとえ
ばヒト成長ホルモン、牛（bovine）成長ホルモ
ンなど；リンフオカイン（lymphokine）；酵素た
とえばスーパーオキシドジスムターゼ（超過酸化
物不均化酵素）など；インターフエロン、たとえ
ばヒト繊維芽細胞ならびにヒトおよび雑種白血球
インターフエロンなど；ウイルス抗原もしくはイ
ムノゲン（免疫原）たとえばフツト・アンド・マ
ウス病（口蹄病）抗原、インフルエンザ抗原性蛋
白質、肝炎コア抗原および表面抗原など；各種の
その他ポリペプチド、たとえばヒトインシユリ
ン、ACTH、各種のグリコ蛋白質、免疫グロブ
リン、ビタミンＫを必要とする血液フアクター、
たとえば因子およびなどである。 これらの発現ベクターは、特にCOS−７系サ
ル細胞において異種ポリペプチドの合成を有効に
指令する。SV40の初期および後期プロモータの
使用を開発したが、その他のプロモータもこの点
に関し有用である。潜在的に有用なポリペプチド
（たとえば成長因子、リンフオカイン、ウイルス
抗原、インターフエロン）の効率的発現に加え
て、この系はその他の面でも有用である。たとえ
ば、著しいレベルのRNAがこれらのベクターか
ら合成され、このことはイントロンを含有するゲ
ノム挿入物が著しいレベルの処理RNAを生成し、
そこからcDNAクローンを容易に得ることができ
ることを示している。したがつて、この系はゲノ
ム挿入物をcDNAクローンに変換させるのに有用
であることが判かる。さらに、非溶菌発現系にお
いて、この方法を使用して遺伝子を発現させるこ
とができ、その目的で選択圧（たとえばジヒドロ
葉酸還元酵素、チミジンキナーゼ、薬剤耐性遺伝
子、腫瘍遺伝子）などを作用させることができ、
この結果ウイルス、DNA複製オリジンでなく宿
主に依在するベクター、ならびに宿主配列（たと
えば動原体）を獲得することにより安定して複製
するベクターの両者を得ることができる。 VP−１蛋白質のコード領域を含有しないSV40
DNAの作成 SV40 DNAの完全なヌクレオチド配列は公知
であり（１参照）、したがつて種々のSV40がコー
ドしている蛋白質の物理的位置を種々の制限酵素
開裂部位と直接に相関させることができる。VP
−１蛋白質をコードしている領域を包含するヌク
レオチド配列（１参照）の検査により、２つのう
まく配置している制限エンドヌクレアーゼ開裂部
位が判明した（第１図）。第１のものはヌクレオ
チド位置1493における制限エンドヌクレアーゼ
Hind の開裂部位であつて、VP−１蛋白質に
対する開始コドンに対しヌクレオチド６個分5′側
である。第２のもの、すなわちヌクレオチド2533
における制限エンドヌクレアーゼBam HIに対
する開裂部位は、VP−１蛋白質に対する終止コ
ドンに対してヌクレオチド50個分5′側である。
1493におけるHind 部位と2533におけるBam
HI部位との間が欠如したSV40 DNAを得るた
め、第１図に示したような実験を行なつた。要す
るに、野性型のSV40 DNAを先ずBam HIで開
裂させて充分な長さの線状DNAを得、次いでこ
れを各DNA分子が平均して、１個のみの開裂を
受ける（SV40ゲノム全体には６個のHind 開
裂部位が分布している）を受けるような条件下
で、Hind により開裂した。理論上12種の得
られる消化DNA混合物の１種は所望の１種の組
合せである筈である。次いで、合成デカヌクレオ
チド、すなわちdAGCTGAATTC（２参照）をこ
れらのBam HIおよびHind 処理された
SV40 DNAに対しHind 開裂部位の結合性末
端（−TCGA）とデカヌクレオチドの結合性末
端とを介して結紮させた。次いで、全混合物を
Eco RIで消化し（添加デカヌクレオチド上の
Eco RI部位における結合性末端を生ぜしめ）、
そしてBamおよびEcoRI（３参照）部位を介して
pBR 322中へクローン化させた。SV40配列を有
するプラスミドDNAを制限分析（４参照）によ
りスクリーニングし、規定した欠如部を有するそ
の断片を単離し、pSVRと名付けた。 合成デカヌクレオチドの添加には２つの目的が
ある。第１に、添加デカヌクレオチドは制限エン
ドヌクレアーゼEco RIに対する開裂部位を有
し、この部位はSV40 DNAのこの部分に存在し
ない。したがつて、E.coli（５参照）中でpSVR
プラスミドを繁殖させ、次いでエンドヌクレアー
ゼEco RIおよびBam HIにより開裂させるこ
とにより、多量のこのSV40 DNAベクター断片
を容易に得ることができる。第２に、この添加デ
カヌクレオチドは、外来遺伝子のコード配列を有
する適切に作成されたDNAをEco RI開裂部位
を介してこのSV40 DNAに結紮させると、Hind
開裂部位とVP−１蛋白質に対する開始コド
ンとの間の本来の物理的間隔を回復する（第３Ｂ
図参照）。 8μgのBamHIで開裂した線状で完全な長さの
SV40のウイルスDNA（これは野性型SV40ウイル
スDNAまたはクローン化されたSV40 DNAを
BamHIを用いてpBR322のBamHI部位にて開裂
させて得ることができる）を20mMtris−Cl（PH
7.5）と60mMNaClと7mMMgCl2とを含有する反
応混合物50μ中において、２単位のHind
（BRL）により消化させた。37℃にて30分間イン
キユベーシヨンした後、過剰のEDTAを添加し
て反応を止め、反応混合物をフエノール抽出によ
り除蛋白し、次いでエタノール沈澱させた。次い
で、部分消化したDNAを10μのTE緩衡液
（10mM tris−Cl（PH7.5）、1mM EDTA）中に再
懸濁させた。 Hind部位結合性末端をEcoRI部位結合性末
端に変換させるため、先ず0.1n molの合成デカ
ヌクレオチドdAGCTGAATTCをATPを用い
て、50mMグリシン緩衡液（PH9.1）と10mM
MgCl2と5mM DTTと0.5mM ATPと10単位の
キナーゼとを含有する反応混合物10μ中におい
てT4ポリヌクレオチドキナーゼにより燐酸化さ
せた。インキユベーシヨンを37℃にて１時間行な
つた。次いで、キナーゼ反応混合物の１アリコー
ト（3μ）を66mM tris−Cl（PH7.5）と6.6mM
MgCl2と10mM DTTと0.05mg／mlのBSAと
0.5mM ATPと4μgのHind で部分消化された
SV40 DNA（上記）と10単位のT4DNAリガーゼ
とを含有する結紮混合物（20μ）へ加えた。結
紮反応のためのインキユベーシヨンを20℃にて約
16時間行なつた。 結紮されたDNAを制限エンドヌクレアーゼ
Eco RIで処理して、結紮リンカー上にEco RI
結合性末端を生ぜしめた後、次いでこれをフエノ
ールによつて除蛋白し、エタノールで沈澱させ、
15μの結紮混合物（上記参照）中にてpBR 322
（0.5μg）のBam HI−Eco RI断片に結紮させ、
これを使用してＥ．coli 294を形質転換させた。
次いで、これら形質転換体から単離されたプラス
ミドを種々の制限酵素消化により適正なSV40
DNA断片の挿入に関しスクリーニングした。 HBsAg構造遺伝子の単離 上記で作成したSV40ベクターをＢ型肝炎ウイ
ルスの表面抗原（HBsAg）をコードしている遺
伝子を発現するよう設計した。分子量25000のポ
リペプチドであるHBsAgは通常複合粒子状構造
（22nm粒子）として存在し、これは部分的にグリ
コシル化されており、感染した肝臓細胞の外部に
分泌される（６参照）。 上記で作成したSV40ベクターにおいてHBsAg
を発現させるため、HBsAgのコード配列を有す
る理想的なDNA断片は次の条件に一致する。第
１に、このDNAは一方の末端部にEco RI制限
部位を有し、他方の末端部にBam HI部位を有
する。第２に、Eco RI部位はHBsAgの開始コ
ドンに対し直ぐ5′側に位置し、したがつてVP−
１蛋白質におけるATGの本来の位置を回復する
ことができる。最後に、得られた組換体SV40分
子はその寸法において野性型SV40 DNAと同様
であり、ウイルス粒子中に効率的に包封される。
上記の条件を満たすため、第２図に詳細に示した
一連の実験を行なつた。この作成の１つの重要な
特徴は、HBsAgの推定開始コドン（ATG）に対
し直ぐ5′側にEco RI制限部位を生成させること
である。これは、合成12量体
（dATGGAGAACATC）を使用することにより
行なわれ、この12量体はHBsAgにおける開始コ
ドンおよびそれに続く３個のアミノ酸に対応する
配列であり、Ｅ．coli DNAポリメラーゼが単
一鎖クローン化、HBV DNAからDNAを合成す
るための部位特定的なプライマーである。適正に
酵素処理した後、合成DNAをクローン化HBV
DNAと共に切り継ぎ、完全HBsAg遺伝子を再編
成させ、処理されたベクターDNAは末端に、規
定のEco RI部位を再編成するためのEco RI部
位を有している。このプラスミドをpHS 94と名
付ける。 pBR 322のEco RI部位中にクローン化した
HBVの完全ゲノムを含有するプラスミド
（pHBV−Ｔ−1A）から、HBsAgをコードして
いる構造遺伝子を回収した。このクローンは
Valenzuela et al（７および８参照）により最
近発表されたと同様な方法により得られた。 この構造遺伝子を２種の方法で変性し、(1)開始
ATGメチオニンコドンの前部に直接的に独特な
制限部位を組み込み、かつ(2)HBsAg遺伝子から
離れて位置するHBV Hpa 部位をpBR 322
の充填されたEco RI部位に平滑末端結紮させ
た。HBsAg構造遺伝子を含有するDNA断片に対
するこれら２つの改良は下記のようにして行なつ
た： (1) 先ず50μgのpHBV−Ｔ−IA DNAを200μ
の反応混合物中で酵素供給業者（BRL）の反
応条件に従つてHpa （80単位）により消化
させて、1.7kbのDNA断片を得、このDNA断
片においてはHBsAgのコード配列に対する開
始コドンがセンス−ストランド（約400bp）の
5′末端に近接位置する。このDNAをポリアク
リルアミドゲル電気泳動法（PAGE）により精
製した。次いで、精製されたHpa 断片を
100μの反応混合物（New England Biolab）
中でλエキソヌクレアーゼ（２単位）により37
℃で30分間処理した。λエキソヌクレアーゼは
二重鎖DNAを消化する5′エキソヌクレアーゼ
である。この反応は“センス−ストランド”
DNAのHBsAgコード配列から5′側半分を分裂
させ、アンチセンスストランドを露出して添加
プライマと対にする。λエキソヌクレアーゼ処
理されたDNAを除蛋白し、そして40mM燐酸
カリウム緩衡液（PH7.4 ）と1mM DTTと
50μg／ml BSAと6mM MgCl2と0.5mM各
dNTPと0.2n molのdATGGAGAACATC（ポ
リヌクレオチドキナーゼにより5′末端において
p32標識したもの）とを含有する反応混合物50μ
に再懸濁させた。この混合物を先ず90℃で１
分間加熱し、０℃で30分間アニールし、次いで
２単位のＥ．coli DNAポリメラーゼクレノ
ー断片（９参照）の存在下に37℃で３時間イン
キユベートした。このDNAポリメラーゼは添
加プライマーによりプライムされたDNAを合
成し、かつ3′−OH末端を有する単一鎖DNAを
分裂させ、したがつて、平滑末端化DNA分子
を生成した。次いで、得られたDNAを除蛋白
し、HBsAg遺伝子内に位置する部位にてXbaI
（45単位）により100μの反応混合物中で消化
させ、そしてPAGEにより分画した。HBsAg
遺伝子の最初の30個のコドンを有する91塩基対
のDNA断片をオートラジオグラフイー検出法
によつて単離した（断片Ａ）。 HBsAg遺伝子の直ぐ5′側に独特な制限部位
を生成させるため、プラスミドpBR 322の誘
導体（いわゆるpNCV）を利用した。この誘導
体はEcoRI部位に位置する配列： AATTCTGCAG GACGTCTTAA を有する合成DNAセグメントを含有する。こ
の合成DNA配列中に、Pst Ｉ部位を組み込ん
だ。10μgのpNCV DNA を先ず100μの反
応混合物中で24単位のPstI酵素によつて切断
し、次いで上記と同様な反応混合物50μ中で
２単位のＥ．coli DNAポリメラーゼクレノ
ー断片によつて８℃にて１時間処理した。この
DNAポリメラーゼ処理はPstI消化により生成
された４個の塩基対3′オーバーハングを除去し
て、完全なEco RI制限部位を有する平滑末端
DNAを残し、pBR 322の複製のオリジンを含
有する断片Ｂを与えた。上記のように調製され
た平滑末端HBsAg遺伝子断片Ａを、断片Ｂの
Eco RI部位に結紮させた。これは、プラスミ
ドpHS 94を生成させるための３断片結紮にお
いて行なつた。第３の断片（断片Ｃ）は次のよ
うに調製した： (2) プラスミドpHBV−Ｔ−1AからのHBsAg遺
伝子をHBsAg遺伝子から離れた部位において
Hpaにより開裂させた。このHpa部位を予
かじめDNAポリメラーゼクレノー断片（９参
照）が充填されているpBR 322のEco RI部位
に結紮させた。これはpBR 322の誘導体をサ
ブクローン化してpHS 42を生じしめることに
より行なわれた。このプラスミドをXba
（これはコドン31において開裂を行なう）と
BamHI（これはpBR322のEcoRI部位から375の
塩基対を開裂する）によつて開裂させ、殆んど
のHBsAg遺伝子と、このHBsAg遺伝子から離
れた約150個の塩基対と、プロモータ／オペレ
ータと、テトラサイクリン耐性遺伝子の最初の
200個の塩基対とを含有するDNA断片を生成さ
せた。ＸbaおよびBamHIにより限定される
DNA断片ＣをPAGEにより単離し、これを上
記の３断片結紮に使用してプラスミドpHS 94
を生成させた（第２図）。 HBsAgを合成しうる組換体SV40 DNAの作成 サル細胞をトランスフエクシヨンするよう適正
に結紮されたDNAを多量に得るため、結紮DNA
を次のようにしてＥ．coli中でクローン化した。
第３図に示したように、pSVRからのSV40
DNAを含有するBamHI乃至EcoRI断片を、先ず
pHS94からの肝炎表面抗原を有するEcoRI乃至
BamHI断片に、そのEcoRI部位を介して結紮さ
せ、得られた断片を次いでpBR 322のBamHI部
位にクローン化させた。 次いで、適正に作成されたDNA、pSVHBSA
を制限エンドヌクレアーゼBamHIで開裂させて
5382個のヌクレオチドのDNA断片を生成させる
ことができ、このDNA断片はそのVP−１蛋白質
のコード領域が肝炎表面抗原をコードしている遺
伝子により交換されている組換体SV40ゲノムよ
りなつている。 pSVHBSA DNAを作成するため、BamHI＋
EcoRIで消化されたpSVR DNAからのDNA断
片を含有するSV40 DNA0.3μgと、BamHIで消
化されたpHBV−Ｔ−IA DNA（詳細な構造につ
いては第２図参照）からのDNA断片を含有する
pBR 322 50ngと、Bam HI＋Eco RIで消化
されたpHS 94からのDNAを含有するHBsAg
コード配列0.2μgとを15μの結紮混合物中におい
て、それらの各BamHIおよびEco RI部位を介
し、T4 DNAリガーゼにより１晩インキユベー
シヨンして結紮させた。１つの種類の適正に結紮
されたDNA生産物はpBR 322の完全なtetR遺伝
子を再編成し、したがつてベクターDNAの自己
結紮から生じた多数のtetS組換体からtetRにより
選別することができる。次いで、pSVHBSAの
構造を制限酵素消化によつて証明した。 組換体SV40ウイルスの繁殖およびサル細胞にお
けるHBsAgの発現 この種のベクター系中における肝炎表面抗原の
合成の効率を試験するため、BamHIで開裂され
たpSVHBSA DNAをDEAEデキストラン法（11
参照）により単層CV−１細胞（10参照）中に導
入し、細胞をtsA 28もしくはtsA 58ウイルス
（12参照）のいずれかにより感染させた。次いで、
この単層CV−１細胞を適正な培養条件下で41℃
にてインキユベートした（11参照）。tsA 28と
tsA 58との両者はSV40 Ｔ抗原において温度感
受性の突然変異株を示し、したがつて41℃にて増
殖することができない（１参照）。同様に、組換
体SV40ゲノム（pSVHBSA）のみを含有する
CV−１細胞は、pSVHBSAがVP−１遺伝子を
欠如するため、感染性ウイルスを生成しない。予
想した通り、tsSV40ウイルスと組換体SV40ゲノ
ムとの両者を含有するCV−１細胞においては、
４日後に細胞変性効果が観察された。インキユベ
ーシヨンの２週間後に完全な溶菌が観察された。
組換体SV40ゲノムまたtsSV40ウイルスのいずれ
か一方のみを有するCV−１細胞においては細胞
変性効果は観察されなかつた。HBsAgに対する
一般的なラジオイムノアツセイ（13参照）を用い
て、培地中の表面抗原産生をDNAの導入４日後
できるだけ早く検出した。定量分析が示したとこ
ろでは１×106個の単層CV−１細胞は3.8μgの
HBsAgを各感染サイクルにつき産生し、これは
９×107分子／細胞に相当する。この数は単一の
感染サイクル（１参照）で産生されるSV40 VP
−１蛋白質分子の推定個数に殆ど同一である。 組換体SV40ゲノムがSV40ウイルスと同様に
CV−１細胞中に封入されているかまたは繁殖し
ているかどうかを決定するため、CV−１細胞の
プレートに元来の共感染された細胞からの溶菌物
のアリコートとtsSV40ウイルスとを41℃にて感
染させた。感染した細胞からの低分子量のDNA
を感染の72時間後にハートの方法（14参照）によ
り単離した。単離したDNAを処理しないか、或
いは制限エンドヌクレアーゼで開裂させ、そして
アガロース上でのゲル電気泳動により分画した。
次いで、分画されたDNAを変性させ、サウザー
ンの方法（15参照）によりニトロセルロース紙に
移し、P32−標識pHS 94 DNAでプローブした。
第７図から判かるように、肝炎遺伝子配列を有す
る組換DNA分子は、殆どSV40ウイルスDNA（レ
ーンＡ）から区別できない寸法の閉環DNAとし
て存在する。大部分の組換DNAは生体内（in
vivo）結紮によりそのBamHI部位を再生する
（レーンＢ）。予想通り、Ｂ型肝炎表面抗原のコー
ド領域を含有するBam−Eco RI断片（第３図
参照）は、未変化の形態で単離することができ
る。 全面の90％まで繁殖したCV−１細胞の150mmプ
レートに、元来のトランスフエクシヨン実験から
調製された溶菌物（組換体とtsA 28ウイルスと
を含有する）を感染させ、過剰のtsA28ウイルス
を補充した後41℃にてインキユベートした。感染
後70時間で培地を収穫して合成されたHBsAgを
特性化した。さらに、細胞内低分子量DNAをハ
ートの方法（14参照）に従がつて単離した。この
単離されたDNAをtris−Cl（PH7.4）、1mM
EDTAを含有する緩衡液１ml中に再懸濁させた。
次いで、5μの未切断DNAと5μのBamHIで
消化されたDNAとをTBE緩衡液中の0.8％アガロ
ースゲルにより電気泳動で分画し、さらにSV40
DNAもコントロールとして同様に処理した。ゲ
ル上のDNAパターンをニトロセルロース紙のシ
ートに移し、HBsAg遺伝子プローブソースとし
てP32−標識pHS 94 DNA（15参照）にハイブリ
ダイズした。第７図は、ハイブリダイゼーシヨン
後のP32−標識pHS 94 DNAのオートラジオグラ
フイー像を示している。レーンＡおよびＢは、そ
れぞれ未処理のハート上澄液およびBamHIで消
化されたハート上澄液のDNAである。，お
よびは、コントロールSV40 DNAの型、
型および型の位置を示し、それらの位置は
DNAをニトロセルロース紙に移す前にエチジウ
ムブロマイド染色により決定した。 pSVHBSAによりコードされている肝炎表面抗
原は粒子形態で合成される 肝炎表面抗原は合成されて、感染肝臓細胞から
粒子として分泌される（６参照）。各種のクロー
ン化肝炎DNAの配列分析は、成熟表面抗原が大
型先駆体蛋白質から開裂されうる可能性を示唆し
ている（８参照）。成熟HBsAg分子プラス幾つか
の3′末端未翻訳配列をコードしているDNAのみ
が上記の作成においてSV40ゲノム中に組み込ま
れるので、問題とする先駆体ペプチドが22nm粒
子を組み立てる際に、および細胞からのその分泌
の際に機能的役割を演ずるかどうか疑問である。
この目的で、合成した肝炎表面抗原をその性質に
つき沈降速度、沈降平衡、および電子顕微鏡分析
により標準蛋白質と比較して特性化した。第８図
に示されるように、このベクター系で合成された
肝炎表面抗原は感染肝臓細胞系の培地から単離さ
れた肝炎表面抗原（17参照）とは区別しえない沈
降速度を有し、1.22ｇ／cm3の浮遊密度を有し、こ
れも標準表面抗原22nm粒子と同様であつた（６
参照）。精製された表面抗原の電子顕微鏡による
検査も平均直径220Å（22nm）の主として粒状の
構造を示し、形態学的に標準22nm粒子と同一で
あつた（第８および９図）。したがつて、成熟肝
炎表面抗原蛋白質モノマーは22nm粒子の組み立
てに必要とされる肝炎ウイルスによりコードされ
ている唯一の必須構造成分である。 A.CV−１細胞で合成されたHBsAgの沈降速
度とヘパトーマ細胞系PLCにより合成かつ分泌
されたHBsAg（17および18参照）の沈降速度とを
比較した（第８Ａ図）。第７図に記載した実験か
ら収穫された培地を、HBsAgの原料としてこの
実験に使用した。PLC細胞系により産生された
HBsAg（17および18参照）を培地から収穫した。
両カルチヤーからのHBsAgを先ず45％飽和硫酸
アンモニウムで沈澱させ、かつ20mM tris−Cl
（PH7.4）と0.5mM EDTAと0.5mM NaClとを含
有する緩衡液中に再懸濁させた（HBsAgの最終
濃度0.5μg／ml）。200μの各試料を同じ緩衡液中
の２つのパラレルの５ml蔗糖濃度勾配（５〜20％
蔗糖）に装填した。ベツクマン（Beckman）
SW50.1型ローターにて45000rpmで遠心分離を４
℃にて80分間行なつた。市販のHBsAg分析キツ
ト（Ausria −125、Abbott Lab）を用いて
HBsAgを検出した。HBsAgの回収率は常に80％
以上であつた。 B.CV−１細胞で合成されたHBsAgの浮遊密度
を測定した（第８Ｂ図）。プールした感染カルチ
ヤー培地からのHBsAg2μgを45％飽和硫酸アン
モニウムで沈澱させ、アガロースゲル侵透カラム
（A5.0M、Bio−Rad）上で分画し、次いでＡ項
で記載した通り５〜20％蔗糖濃度勾配により沈降
させた。蔗糖濃度勾配遠心分離の後、プールした
HBsAgを蔗糖を含まない濃度勾配緩衡液に対し
て透析し、次いで固体のCsClを加えて最終密度
1.2ｇ／ceの溶液（７ml）を与えた。次いで、こ
れをソルバール（Sorvall）T865.1型ローターに
おいて50000rpmで68時間遠心分離した。次いで、
Ａ項に記載したと同様に分析を行なつた。CsCl
濃度勾配におけるHBsAgの回収率は約70％であ
つた。次いで、ピークフラクシヨン（画分）をプ
ールし、10mM Tris Clと100mM NaClと
0.5mM EDTA緩衡液に対して透析し、濃縮し、
そして電子顕微鏡検査のための試料を調製した。 電子顕微鏡写真用の抗原を調製するため、炭素
被覆した銅グリツドを作成した。HBsAg蛋白質
（1μg／ml）を含有する緩衡液１滴をグリツド上
に室温で30分間載置した。蛋白質溶液をグリツト
から半径方向に吸い取り、４滴のH2Ｏで１回洗
浄した。次いで、このグリツドを1.0％ホスホタ
ングステン酸ナトリウム（PH7.6）で１分間染色
し、そして紙により乾燥させた。次いで、
Phillips E.M.400型により倍率77700倍にて電子
顕微鏡写真を撮つた。これは陰画を与え、これか
ら第９図に示すように拡大して（約10倍）陽画を
作成した。 HBsAgを発現する非溶菌ベクターの作成 組換プラスミドを作成したが、このプラスミド
はプラスミドpML（21参照）から生じたpBR 322
配列と、DNA複製のオリジン領域と初期および
後期の両方の転写単位に対するプロモータ配列と
からなるSV40 DNAの348塩基対と、HBsAg用
の遺伝子をコードしているHBV配列とを含有す
る。SV40のオリジンは、SV40 DNAをHind
により消化させ、かつHind末端をコンバータ
（AGCTGAATTC）の添加によりEco RI末端に
変換させることにより単離した。このDNAを
Pvuで切断し、かつRIリンカーを加えた。Eco
RIでの消化の後、オリジンにわたる348塩基対断
片をポリアクリルアミドゲル電気泳動および電気
溶出によつて単離し、pBR 322にクローン化さ
せた。HBVのEco RIおよびBglでの消化から
生ずる1986塩基対断片（22参照）（これはHBsAg
をコードしている遺伝子にわたる）をEco RIお
よびBamHI部位にてプラスミドpML（21参照）
中でクローン化させることにより、発現プラスミ
ドpHBs 348−ＥおよびpHBs 348−Ｌを作成し
た。（pMLはサル細胞におけるプラスミド複製に
対し抑制的である配列を除去する欠如部を有する
pBR322の誘導体である（21参照）。）次いで、得
られたプラスミド（pRI−Bgl）をEco RIによつ
て線状化させ、そしてSV40オリジン領域を示す
348塩基対断片をpRI−BglのEco RI部位に導入
した。オリジン断片は、いずれの配向性でも挿入
することができる。この断片は複製のオリジンに
加えて初期および後期のSV40プロモータの両者
をコードしているので、HBV遺伝子はこの配向
性に応じていずれかのプロモータの制御下に発現
させることができる（HBsを代表するpHBS 348
−Ｅは初期プロモータの制御下で発現され、かつ
HBsを代表するpHBs 348−Ｌは後期プロモータ
の制御下で発現される）。 サル細胞におけるSV40−HBVプラスミドの複製 COS−７系サル細胞におけるHBV−SV40組換
プラスミドの複製を次のように行なつた： DEAE−デキストラン技術によるDNAトラン
スフエクシヨンの後の種々の時点で、低分子量の
DNAをハートの方法（14参照）により単離し、
アガロースゲルでの電気泳動により分画し、そし
てサウザーンのブロツトハイブリダイゼーシヨン
（15参照）によつて分析した。第４図は、トラン
スフエクシヨン直後に殆んどまたは全くスーパー
コイルプラスミドがCOS細胞中に存在しないこ
とを示している。しかしながら、トランスフエク
シヨンの３日後、投入したDNAの著しい複製が
pHBs 348−Ｌ DNA（レーンｂ）またはpHBs
348−Ｅ DNAのいずれかの導入の後に生じた。
予想通り、プラスミドpRI−Bgl（これはSV40オ
リジン配列を欠如しているが、その他の点では上
記の発現プラスミドと同一である）のトランスフ
エクシヨンの後プラスミド複製は全く観察されな
かつた（レーンａ）。 組換えプラスミドでトランスフエクトしたサル細
胞におけるHBsAgの合成 DEAE−デキストランおよびDNAに対する細
胞の処理および露出時間を12時間に増大させるこ
とによりDEAE−デキストラン法（11参照）を改
変して、プラスミドpML、pRI−Bgl、pHBs
348−ＥおよびpHBs 348−ＬをCOS−７系サル
細胞（23参照）中に導入した。このCOS−７細
胞系はSV40の初期領域の一体化コピーを有し、
SV40A遺伝子産生物（Ｔ抗原）を構成的に発現
する。SV40 DNA複製の機能的オリジンを含有
するプラスミドは、SV40T抗原の存在下にサル
細胞中で複製することが示された（20，21参照）。
第５図は、プラスミドpHBs 348−Ｅおよび
pHBS 348−ＬでトランスフエクトしたCOS細胞
が２日目までに著量のHBsAgを発現し始め、２
週間以上にわたり発現し続けることを示してい
る。pHBs 348−Ｌにより指令される発現のレベ
ルはpHBs 348−Ｅにより指令されるレベルより
若干高い。これらの結果の１つの解釈は、後期の
SV40プロモータがこの系においては初期プロモ
ータより有効になりうることである。 組織培養で誘導れたHBsAgは動物において免疫
原性である。 組織培養から得られたHBsAgの粒子は抗原活
性であることを示したが、これら粒子が動物にお
いて免疫原性であるかどうかを決定することが望
ましい。したがつて、COS−７細胞により産生
された抗原を硫酸アンモニウム沈澱を蔗糖濃度勾
配遠心分離とCsCl密度勾配遠心分離との組合せ
により精製した。組織培養で得られたHBsAgを
各マウスに注射する一方、コントロールマウスを
ヒト血清から得られた市販のHBsAg（North
American Biologicals Inc.）の同量で免疫化し
た。次いで、免疫化の後の種々の時点で、抗−
HBsAgのタイターを決定した。第６図は、抗−
HBsAgの著量のタイターが標準HBsAgで免疫化
したマウスならびに組織培養で得られたHBsAg
で免疫化したマウスにおいて現われたことを示し
ている。さらに、組織培養から得られたHBsAg
で免疫化したマウスでの抗−HBsAg抗体現出の
動力学およびタイターは標準HBsAgで免疫化し
たマウスでの観察とは区別できなかつた。したが
つて、結論として、組換DNA技術によりサル細
胞中で合成されたHBsAgは、同一と言わないま
でも、免疫原性においてヒト血清から得られた
HBsAgと類似であり、そのワクチンとしての効
果が充分に示された。 薬剤組成物 本発明の産生物を公知方法により調合して薬剤
的に有用な組成物を製造することができ、それに
よりこのポリペプチドを薬剤上許容しうる担体ベ
ヒクルと混合する。適するベヒクルおよびその配
合はE.W.MartinによりRemingtonの
Pharmaceutical Scienceに記載されており、こ
れを参考のためここに引用する。この種の組成物
は有効量のポリペプチド産生物を、宿主に対し有
効投与するのに適する薬剤上許容しうる組成物を
製造するための適当量の担体ベヒクルと混合して
含有する。１つの好適な投与方式は非経口ルート
である。適する動物衛生製剤は、必要に応じ変更
を加えて、薬剤組成物の場合と同様に調製され
る。 ワクチン製造 本明細書中に記載したように製造した適するポ
リペプチドを混入した本発明のワクチンは、公知
方法に従がつて調製することができ、ここでこの
ポリペプチドを適するベヒクルと混合する。適す
るベヒクルは、たとえば食塩溶液、各種の公知ア
ジユバント、またはウイルス感染を予防するため
使用される組成物に使用するための当業界で認め
られたその他添加物を包含する。この種のワクチ
ンは有効量のポリペプチドと、宿主に対し有効投
与するのに有用なワクチンを製造するための適当
量のベヒクルとを含有する。これについては、文
献「ワクチンにおける新たな傾向および開発」編
集者A.VollerおよびH.Friedman，University
Park Press，Baltimore，1978を参照するとが
でき、これをワクチンの製造に関するさらに詳細
な背景を示すため参考としてここに引用する。 これらワクチンの活性成分を製造する方法が独
特であるため、このワクチンは実質的に外来蛋白
質ならびにその他のウイルス性および細胞成分を
含有しないと思われる。したがつて、これらワク
チンは完全に死滅した、または不活化されたウイ
ルスワクチン製剤の副作用を殆ど生じないと思わ
れる。 上記の説明から本発明は、たとえば目的とする
ポリペプチド産生物の選択におけるように、ここ
に記載した好適具体例のみに限定されないことが
当業者には明らかであろう。 参考文献 １ N.H.Acheson in Molecular Biology of
Tumor Viruses.（J.Tooze ed.）Cold Spring
Harbor Lab.N.Y.2nd edi.Part 2.pp.125−204
（1980）． ２ R.Crea，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.
A.）75，5765（1978）． ３ D.V.Goeddel，et al.，Proc.Natl.Acad.Sei.
（U.S.A.）76，106（1979）． ４ R.W.Davia，et al.，Advanced Bacterial
Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory.
N.Y.pp.116−125（1980）． ５ D.H.HamerおよびP.Leder，Cell，18，1299
（1979）． ６ O.Blumberg，Science 197，19（1977）． ７ P.Valenzuela，et al.，Nature，280，815
（1979）． ８ P.Charnay et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.（U.
S.A.）76，2222（1979）． ９ H.Jacobsen et al.，Eur.J.Biochem.45，623
（1974）． 10 J.E.MertzおよびP.Berg.，Virology，62，
112（1974）． 11 J.H.McCutchanおよびJ.S.Pagano，J.Nat.
Cancer Inst.41，351（1968）． 12 P.J.Tegtmeyer，J.Virology 10，591（1972）． 13 Ausria II−125.Abbott Lab. 14 B.J.Hirt，J.Mol.Biol.26，365（1967）． 15 E.M.J.Southern，J.Mol.Biol.98，503
（1975）． 16 Ｃ−J.LaiおよびD.Nathans，J.Mol.Biol.89，
179（1974）． 17 J.J.Alexander et al.，S.Afr.Med.J.50，
2124（1976）． 18 P.L.Marion et al.，J.of Virol.32，796
（1979）． 19 DNA Tumor Viruses 2nd Ed.（Ed J.
Tooze），Cold Spring Harbor Lab.，N.Y.
（1980）． 20 MyersおよびTjian，Proc.Natl.Acad.Sci.
（U.S.A）77，6491（1980）． 21 LuskyおよびBotchan，Nature 293，79
（1981）． 22 Animal Virus Genetics（Ed.Fields，
JaenischおよびFox），Chapter ５，ｐ 57，
Academic Press，N.Y.（1980）． 23 Gluzman，Cell 23，175（1981）．
第１図はVP−１蛋白質をコードしている領域
が欠如したSV40 DNAを含有するプラスミド
pSVRの作成を示す図、第２図はHBsAg DNA
を有するプラスミドpHS 94の作成を示す図、第
３図はSV40およびpBR 322から誘導されたDNA
配列並びにHBsAg DNAを含有するプラスミド
pSVHBSAの作成を示す図、第４図はサル細胞
におけるプラスミドDNAの複製を示す図、第５
図はCos細胞における組換体プラスミドにより合
成されたHBsAgの定量化を示す図、第６図は組
織培養細胞中で発現したHBsAgに対するマウス
の免疫原性応答を示す図、第７図はCV−１細胞
中で複製する組換SV40−HBV DNAの存在を示
す図、第８Ａ図はこの組換体ベクターを介して合
成したHBsAgの蔗糖濃度勾配沈降の結果を示す
図、第８Ｂ図はその対応するCsCl濃度勾配遠心
分離の結果を示す図、第９図は本発明に従がつて
22nm粒子として合成されたHBsAgの電子顕微鏡
写真である。
が欠如したSV40 DNAを含有するプラスミド
pSVRの作成を示す図、第２図はHBsAg DNA
を有するプラスミドpHS 94の作成を示す図、第
３図はSV40およびpBR 322から誘導されたDNA
配列並びにHBsAg DNAを含有するプラスミド
pSVHBSAの作成を示す図、第４図はサル細胞
におけるプラスミドDNAの複製を示す図、第５
図はCos細胞における組換体プラスミドにより合
成されたHBsAgの定量化を示す図、第６図は組
織培養細胞中で発現したHBsAgに対するマウス
の免疫原性応答を示す図、第７図はCV−１細胞
中で複製する組換SV40−HBV DNAの存在を示
す図、第８Ａ図はこの組換体ベクターを介して合
成したHBsAgの蔗糖濃度勾配沈降の結果を示す
図、第８Ｂ図はその対応するCsCl濃度勾配遠心
分離の結果を示す図、第９図は本発明に従がつて
22nm粒子として合成されたHBsAgの電子顕微鏡
写真である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ Ｂ型肝炎表面抗原の製造方法であつて、 (a) 宿主細胞中で複製し得るDNAトランスフア
ーベクター断片を準備し、 (b) 宿主細胞に対して適合性のあるプロモーター
を含むDNA断片を準備し、 (c) 成熟Ｂ型肝炎表面抗原をコードしているがＢ
型肝炎表面抗原の前駆体ペプチドはコードして
いないDNA断片であつて、工程(b)の断片と結
合するのに適したDNA断片を準備し、 (d) 工程(a)，(b)および(c)の各断片を、適当な位置
に配置された転写終止部位、ポリＡ付加配列な
らびに翻訳の開始信号および停止信号と共に組
合せて複製可能な発現ベクターを形成し（ただ
し、この複製可能な発現ベクターは、工程(c)の
配列が前記プロモーターの制御下にあること
と、工程(c)のポリペプチドをコードしている
DNAの翻訳開始コドンが、通常前記プロモー
ターの制御下にある蛋白質の翻訳開始コドンに
よつて占められる本来の位置にあるかまたはそ
れから１塩基対以内に配置されていることとを
特徴とする）、 (e) 工程(d)のベクターにより脊椎動物細胞を形質
転換し、 (f) 脊椎動物形質転換細胞を通常の条件下培地中
で前記ポリペプチドが産生されるまで成育さ
せ、 (g) 前記ポリペプチドを回収する ことからなる方法。 ２ 工程(a)の断片が、微生物宿主において表現型
選択も可能であることを特徴とする特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 ３ 工程(a)のDNAベクターが複製のオリジンを
含有するSV40ベクターからなることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項または第２項に記載の方
法。 ４ 工程(e)の脊椎動物細胞がCV−１系サル腎臓
繊維芽細胞であることを特徴とする特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 ５ 工程(e)の脊椎動物細胞がCOS−７系サル腎
臓繊維芽細胞であることを特徴とする特許請求の
範囲第１項に記載の方法。 ６ ポリペプチドが前記培地中にばらばらの粒子
の形態で分泌されることを特徴とする特許請求の
範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の方法。 ７ 脊椎動物細胞中に配置された複製可能な発現
ベクターの発現により産生されるＢ型肝炎表面抗
原からなる約22nmの粒子であつて、前記ベクタ
ーが成熟Ｂ型肝炎表面抗原をコードしているがＢ
型肝炎表面抗原の前駆体ペプチドはコードしてい
ないことを特徴とする前記粒子。 ８ 前記細胞からその培地中へ分泌されることを
特徴とする特許請求の範囲第７項に記載の粒子。 ９ 薬剤上許容し得る基剤と、脊椎動物細胞中に
配置された複製可能な発現ベクターの発現により
産生されるＢ型肝炎表面抗原からなる約22nmの
粒子とからなるワクチンであつて、前記ベクター
が成熟Ｂ型肝炎表面抗原をコードしているがＢ型
肝炎表面抗原の前駆体ペプチドはコードしていな
いことを特徴とするワクチン。 １０ マウスに注射してから６週後に約250〜
2400単位（ラジオイムノアツセイ単位）の抗体力
価を生じることを特徴とする特許請求の範囲第９
項に記載のワクチン。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US29823581A | 1981-08-31 | 1981-08-31 | |
| US298235 | 1981-08-31 | ||
| US32698081A | 1981-12-03 | 1981-12-03 | |
| US326980 | 1999-06-07 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5189904A Division JP2634371B2 (ja) | 1981-08-31 | 1993-07-30 | 脊椎動物細胞内でｂ型肝炎表面抗原をコードするｄｎａを発現するベクター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5856685A JPS5856685A (ja) | 1983-04-04 |
| JPH0587518B2 true JPH0587518B2 (ja) | 1993-12-16 |
Family
ID=26970555
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57150627A Granted JPS5856685A (ja) | 1981-08-31 | 1982-08-30 | 脊椎動物細胞培養におけるポリペプチドの製造方法 |
| JP5189904A Expired - Lifetime JP2634371B2 (ja) | 1981-08-31 | 1993-07-30 | 脊椎動物細胞内でｂ型肝炎表面抗原をコードするｄｎａを発現するベクター |
| JP7201034A Expired - Lifetime JP2726641B2 (ja) | 1981-08-31 | 1995-08-07 | 形質転換脊椎動物細胞の製造方法およびその細胞 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5189904A Expired - Lifetime JP2634371B2 (ja) | 1981-08-31 | 1993-07-30 | 脊椎動物細胞内でｂ型肝炎表面抗原をコードするｄｎａを発現するベクター |
| JP7201034A Expired - Lifetime JP2726641B2 (ja) | 1981-08-31 | 1995-08-07 | 形質転換脊椎動物細胞の製造方法およびその細胞 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0291586A3 (ja) |
| JP (3) | JPS5856685A (ja) |
| AU (2) | AU555575B2 (ja) |
| BR (1) | BR8205078A (ja) |
| DE (1) | DE3280310D1 (ja) |
| DK (1) | DK173592B1 (ja) |
| ES (1) | ES515260A0 (ja) |
| GB (1) | GB2105344B (ja) |
| GR (1) | GR76906B (ja) |
| HK (1) | HK29689A (ja) |
| HU (1) | HU196238B (ja) |
| IE (1) | IE53873B1 (ja) |
| IL (1) | IL66637A (ja) |
| KE (1) | KE3838A (ja) |
| NO (1) | NO165598C (ja) |
| NZ (1) | NZ201706A (ja) |
| ZW (1) | ZW18282A1 (ja) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5196194A (en) * | 1979-05-24 | 1993-03-23 | The Regents Of The University Of California | Vaccines containing Hepatitis B S-protein |
| US4769238A (en) | 1981-08-04 | 1988-09-06 | The Regents Of The University Of California | Synthesis of human virus antigens by yeast |
| ZW18282A1 (en) | 1981-08-31 | 1983-03-23 | Genentech Inc | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
| JPS5936698A (ja) * | 1982-08-20 | 1984-02-28 | Science & Tech Agency | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞 |
| CA1209501A (en) * | 1982-09-16 | 1986-08-12 | Nikos Panayotatos | Expression vector |
| US4820642A (en) * | 1983-04-04 | 1989-04-11 | The Regents Of The University Of California | Amplified expression vector |
| US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| US7264817B1 (en) | 1983-08-30 | 2007-09-04 | Genentech, Inc. | Immunogenic composition based on a truncated derivative of a membrane bound protein and process for making it |
| NZ209308A (en) * | 1983-08-30 | 1991-08-27 | Genentech Inc | Vaccine against hsv involving a truncated membrane-free derivative of a membrane-bound protein |
| WO1985001516A1 (fr) * | 1983-10-03 | 1985-04-11 | Transgene S.A. | Vecteurs d'expression d'une proteine antigenique de la rage dans les cellules eucaryotes et leur application a la preparation d'un vaccin |
| FR2552776B1 (fr) * | 1983-10-03 | 1986-05-09 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression d'une proteine antigenique de la rage dans les cellules eucaryotes et leur application a la preparation d'un vaccin |
| JPS6078999A (ja) * | 1983-10-05 | 1985-05-04 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ＨＢｓ抗原の精製方法 |
| US5639639A (en) * | 1983-11-02 | 1997-06-17 | Genzyme Corporation | Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof |
| US5118627A (en) * | 1984-02-27 | 1992-06-02 | Amgen | Papova virus construction |
| FR2560890B1 (fr) * | 1984-03-07 | 1987-10-16 | Grp Genie Genetique | Composition utile pour la fabrication de vaccins contenant des particules portant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et le recepteur de l'albumine serique humaine polymerisee, cellules animales capables de produire de telles particules et procede pour leur obtention |
| US4777240A (en) * | 1984-03-08 | 1988-10-11 | Scripps Clinic And Research Foundation | SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker |
| US4855224A (en) * | 1984-03-09 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Molecularly cloned diagnostic product and method of use |
| US4663281A (en) * | 1984-03-22 | 1987-05-05 | Mass Institute Of Technology | Enhanced production of proteinaceous materials in eucaryotic cells |
| FR2564106B1 (fr) * | 1984-05-09 | 1988-04-22 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression du facteur ix, cellules transformees par ces vecteurs et procede de preparation du facteur ix. |
| US5683688A (en) * | 1984-05-31 | 1997-11-04 | Genentech, Inc. | Unglycosylated recombinant human lymphotoxin polypeptides and compositions |
| WO1986006405A1 (en) * | 1985-05-02 | 1986-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel transformant and its use |
| EP0213628A3 (en) * | 1985-09-03 | 1988-09-21 | Yeda Research And Development Company, Ltd. | Expression of superoxide dismutase in eukaryotic cells |
| SE8505027D0 (sv) * | 1985-10-24 | 1985-10-24 | Kabigen Ab | A lytic virulent phage, a hostcell containing same and a process for protein production |
| KR950001993B1 (ko) * | 1985-12-18 | 1995-03-08 | 마이크로제네시스,인코포레이티드 | B형 간염 표면항원의 제조방법 |
| AU582288B2 (en) * | 1986-03-07 | 1989-03-16 | Damon Biotech Inc. | Vector and method for achieving high level expression in eukaryotic cells |
| US5004693A (en) * | 1986-07-18 | 1991-04-02 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Pseudorabies virus recombinants and their use in the production of proteins |
| NZ219516A (en) * | 1987-02-10 | 1991-02-26 | Wellcome Found | Fusion proteins of hbcag (hepatitis b virus core antigen) |
| US5024939A (en) * | 1987-07-09 | 1991-06-18 | Genentech, Inc. | Transient expression system for producing recombinant protein |
| US5578468A (en) * | 1987-08-10 | 1996-11-26 | Duke University | Site-specific RNA cleavage |
| US5443964A (en) * | 1987-08-10 | 1995-08-22 | Duke University | Poxvirus insertion/expression vector |
| JPH01285196A (ja) * | 1988-05-11 | 1989-11-16 | Chisso Corp | 発光蛋白エクオリンの製造法 |
| US5709995A (en) | 1994-03-17 | 1998-01-20 | The Scripps Research Institute | Hepatitis C virus-derived peptides capable of inducing cytotoxic T lymphocyte responses |
| JP4085231B2 (ja) * | 2000-02-28 | 2008-05-14 | 株式会社ビークル | タンパク質中空ナノ粒子とそれを用いた物質運搬体、ならびに細胞への物質導入方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56160993A (en) * | 1980-04-07 | 1981-12-11 | Univ California | Cloned dna segment derived from human genom |
| JPS5739784A (en) * | 1980-04-22 | 1982-03-05 | Pasteur Institut | Conversion of cell culture |
| JPS58995A (ja) * | 1981-03-31 | 1983-01-06 | ザ・リ−ジエンツ・オブ・ザ・ユニヴア−シテイ・オブ・カリフオルニア | ウイルス蛋白の合成 |
| JPS5813598A (ja) * | 1981-06-22 | 1983-01-26 | イーライ・リリー・アンド・カンパニー | 組み替えｄｎａクロ−ニング・ベクタ−ならびにその真核細胞性および原核細胞性被形質転換体 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3636191A (en) * | 1969-10-08 | 1972-01-18 | Cancer Res Inst | Vaccine against viral hepatitis and process |
| US4164565A (en) * | 1975-03-14 | 1979-08-14 | New York Blood Center, Inc. | Vaccine for active immunization containing hepatitis B surface antigen and associated antigen |
| FR2444713A1 (fr) | 1978-12-18 | 1980-07-18 | Pasteur Institut | Procede de production d'un adn comprenant le genome du virus de l'hepatite b et vecteur le comportant |
| FR2480779B2 (fr) * | 1979-08-30 | 1986-07-18 | Anvar | Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur |
| JP2530801B2 (ja) * | 1978-12-22 | 1996-09-04 | バイオゲン インコーポレイテッド | 組換えｄｎａ分子 |
| IE52036B1 (en) | 1979-05-24 | 1987-05-27 | Univ California | Non-passageable viruses |
| JPS5610119A (en) * | 1979-07-05 | 1981-02-02 | Alpha Therapeutic Corp | Manufacture of b type hepatitis infection preventive vaccine |
| US4399216A (en) * | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
| EP0038765B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1987-09-02 | Institut Pasteur | Vaccin contre l'hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin |
| ZW18282A1 (en) * | 1981-08-31 | 1983-03-23 | Genentech Inc | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
| NZ201705A (en) * | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
| US4442205A (en) * | 1981-09-22 | 1984-04-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Simian virus recombinant that directs the synthesis of hepatitis B surface antigen |
| AU561343B2 (en) * | 1981-10-19 | 1987-05-07 | Genentech Inc. | Human immune interferon by recombinant dna |
| FR2521165A1 (fr) * | 1982-02-08 | 1983-08-12 | Pasteur Institut | Fragments d'adn codant pour un peptide immunogene susceptible d'introduire in vivo la synthese d'anticorps anti-poliovirus |
| US4446235A (en) * | 1982-03-22 | 1984-05-01 | Genentech, Inc. | Method for cloning human growth hormone varient genes |
-
1982
- 1982-08-06 ZW ZW182/82A patent/ZW18282A1/xx unknown
- 1982-08-25 IL IL66637A patent/IL66637A/xx not_active IP Right Cessation
- 1982-08-25 NZ NZ201706A patent/NZ201706A/en unknown
- 1982-08-26 EP EP87202618A patent/EP0291586A3/en not_active Withdrawn
- 1982-08-26 DE DE8282304512T patent/DE3280310D1/de not_active Revoked
- 1982-08-26 ES ES515260A patent/ES515260A0/es active Granted
- 1982-08-26 EP EP82304512A patent/EP0073656B1/en not_active Revoked
- 1982-08-26 GB GB08224527A patent/GB2105344B/en not_active Expired
- 1982-08-27 IE IE2084/82A patent/IE53873B1/en not_active IP Right Cessation
- 1982-08-27 AU AU87798/82A patent/AU555575B2/en not_active Expired
- 1982-08-30 JP JP57150627A patent/JPS5856685A/ja active Granted
- 1982-08-30 HU HU822777A patent/HU196238B/hu unknown
- 1982-08-30 GR GR69154A patent/GR76906B/el unknown
- 1982-08-30 BR BR8205078A patent/BR8205078A/pt unknown
- 1982-08-30 NO NO822926A patent/NO165598C/no not_active IP Right Cessation
- 1982-08-30 DK DK198203869A patent/DK173592B1/da not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-08-20 AU AU61671/86A patent/AU589673B2/en not_active Expired
-
1988
- 1988-10-25 KE KE3838A patent/KE3838A/xx unknown
-
1989
- 1989-04-06 HK HK296/89A patent/HK29689A/xx not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-07-30 JP JP5189904A patent/JP2634371B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-08-07 JP JP7201034A patent/JP2726641B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56160993A (en) * | 1980-04-07 | 1981-12-11 | Univ California | Cloned dna segment derived from human genom |
| JPS5739784A (en) * | 1980-04-22 | 1982-03-05 | Pasteur Institut | Conversion of cell culture |
| JPS58995A (ja) * | 1981-03-31 | 1983-01-06 | ザ・リ−ジエンツ・オブ・ザ・ユニヴア−シテイ・オブ・カリフオルニア | ウイルス蛋白の合成 |
| JPS5813598A (ja) * | 1981-06-22 | 1983-01-26 | イーライ・リリー・アンド・カンパニー | 組み替えｄｎａクロ−ニング・ベクタ−ならびにその真核細胞性および原核細胞性被形質転換体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3280310D1 (de) | 1991-04-11 |
| ZW18282A1 (en) | 1983-03-23 |
| EP0073656B1 (en) | 1991-03-06 |
| AU555575B2 (en) | 1986-10-02 |
| JP2634371B2 (ja) | 1997-07-23 |
| EP0073656A3 (en) | 1984-10-24 |
| GB2105344B (en) | 1985-10-09 |
| AU8779882A (en) | 1983-03-10 |
| KE3838A (en) | 1988-12-02 |
| JPH06261748A (ja) | 1994-09-20 |
| IE822084L (en) | 1983-02-28 |
| NO822926L (no) | 1983-03-01 |
| GB2105344A (en) | 1983-03-23 |
| JPS5856685A (ja) | 1983-04-04 |
| NZ201706A (en) | 1986-05-09 |
| BR8205078A (pt) | 1983-08-09 |
| IL66637A0 (en) | 1982-12-31 |
| ES8401134A1 (es) | 1983-12-01 |
| AU589673B2 (en) | 1989-10-19 |
| NO165598B (no) | 1990-11-26 |
| EP0073656A2 (en) | 1983-03-09 |
| IL66637A (en) | 1991-11-21 |
| EP0291586A3 (en) | 1988-12-07 |
| DK173592B1 (da) | 2001-04-09 |
| JPH0937777A (ja) | 1997-02-10 |
| NO165598C (no) | 1991-03-06 |
| AU6167186A (en) | 1987-01-08 |
| HU196238B (en) | 1988-10-28 |
| DK386982A (da) | 1983-03-01 |
| ES515260A0 (es) | 1983-12-01 |
| IE53873B1 (en) | 1989-03-29 |
| EP0291586A2 (en) | 1988-11-23 |
| GR76906B (ja) | 1984-09-04 |
| JP2726641B2 (ja) | 1998-03-11 |
| HK29689A (en) | 1989-04-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0587518B2 (ja) | ||
| JP2511394B2 (ja) | 酵母菌中でのｂ型肝炎表面抗原の製造 | |
| JP2610015B2 (ja) | アデノウイルスプロモーターの制御下で所定のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む組換えｄｎａ | |
| JP2573817B2 (ja) | ヘテロポリマー系蛋白質の発現ベクターおよび該ベクターを含む細胞 | |
| US5314808A (en) | Method for the transformation of cells, particularly eukaryotes by a DNA originating from viruses of hepatitis, more particularly from virus of a B viral hepatitis, and preparations containing the expression products of said DNAs | |
| US5024938A (en) | Recombinant DNA inserted with hepatitis B virus gene, mammalian cells transformed with cloned viral DNA, and production of hepatitis B virus proteins | |
| LIU et al. | Direct expression of hepatitis B surface antigen in monkey cells from an SV40 vector | |
| JPH08198897A (ja) | ＨＢｓ抗原の免疫原特性を有し、ＨＢｓ抗原により担持されたエピトープに対して外来の抗原部位を担持する粒子及びかかる粒子の産生法 | |
| US4741901A (en) | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture | |
| JPH0314840B2 (ja) | ||
| US4803164A (en) | Preparation of hepatitis b surface antigen in yeast | |
| EP0182442B1 (en) | Recombinant dna molecules and their method of production | |
| EP0105141A2 (en) | Recombinant DNA molecules, process for their production, their use for production of hepatitis B surface antigen (HBsAg) and pharmaceutical compositions containing this HBsAg | |
| EP0062574A2 (en) | Virus protein synthesis | |
| AU4315689A (en) | Defective hepadnaviruses and producer cell line for vaccines and treatment of liver diseases and disorders | |
| Denniston et al. | Expression of hepatitis B virus surface and e antigen genes cloned in bovine papillomavirus vectors | |
| JP3305342B2 (ja) | Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の製造方法 | |
| Feitelson et al. | Nucleic acid sequencing of Dane particle DNA and expression of HBV genes | |
| Liu et al. | EXPRESSION OF HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN IN MAMMALIAN CELLS | |
| WATANASEREE et al. | COS-7 CELLS BY USING A RECOMBINANT pcDNA I VECTOR KRUAVON BALACHANDRA", KASAMA SUPANARANOND", CHUENCHIT | |
| JPH0775545B2 (ja) | Ｂ型肝炎表面抗原をコ−ドするベクタ− | |
| JPH01240182A (ja) | 新規なＢ型肝炎ウイルス表面抗原産生株ＭＳ１２８、及び該細胞株によるｐｒｅ Ｓ２蛋白質を含有するＢ型肝炎ウイルス表面抗原を生産する方法 |