DK173592B1 - Rekombinant viral ekspressionsvektor, som er i stand til i en transformant hvirveldyrcellekultur at udtrykke en DNA-sekvens - Google Patents

Description

i DK 173592 B1

OPFINDELSENS OMRÅDE

Opfindelsen angår anvendelsen af rekombinant-DNA-teknolo-gi til fremstilling af modent hepatitis B-overfladeanti-gen (HBsAg) i hvirveldyrcellekultur. Nærmere bestemt an-5 går opfindelsen en rekombinant viral ekspressionsvektor, som er i stand til i en transformant hvirveldyrcellekultur at udtrykke en DNA-sekvens, der koder for modent HBsAg uden nogen sekvens, der koder for HBsAg-forstadiesekvens. Desuden angår opfindelsen en hvirveldyrcellekul-10 tur transformeret med en sådan vektor og en fremgangsmåde til fremstilling af modent HbsAg.

I foretrukne udførelsesformer tilvejebringer opfindelsen bestemte ekspressionsvektorer, der udnytter DNA-sekvenser til replikation, fænotypisk selektion og sammenknytning 15 med hepatitis B-overfladeantigen-(HBsAg)-genet og ekspressionspromotoren for dette, hvilke sekvenser er naturlige for og uskadelige i det anvendte værtshvirveldyrcel-lesystem. HBsAg secerneres til dyrkningsmediet i partikelform på omkring 22 nm og indeholder antigeniske deter-20 minanter for hepatitis B virus (HBV). Det således producerede hepatitis B-overfladeantigen er egnet til brug ved fremstilling af vacciner over for hepatitis B virus.

De publikationer og andre materialer, der anvendes til at belyse opfindelsens baggrund og, i særlige tilfælde, til 25 at give yderligere detaljer med hensyn til dens udøvelse, skal betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved henvisning og er af nemhedsgrunde samlet i den afsluttende bibliografi, til hvis numre der henvises iden følgende tekst.

30 DK 173592 B1 2 OPFINDELSENS BAGGRUND A. Rekombinant-DNA-teknologi

Med fremkomsten af rekombinant-DNA-teknologien er den styrede mikrobielle produktion af en enorm række forskel-5 lige polypeptider blevet mulig. Mange hvirveldyrpolypep-tider, såsom humant væksthormon, humant proinsulin, desacetyl thymosin-al , humane og hybride leukocytinterferoner og humant fibroblast-interferon, såvel som et antal andre produkter er allerede produceret af forskellige mikroor-10 ganismer. Teknologiens kraft tillader den mikrobielle produktion af en enorm række forskellige nyttige polypeptider og bringer den mikrobielt dirigerede fremstilling af hormoner, enzymer, antistoffer og vacciner, der er nyttige til en lang række forskellige målrettede lægemid-15 delanvendelser, inden for rækkevidde.

Et grundelement i rekombinant-DNA-teknologi er plasmidet, en ekstrachromosomal løkke af dobbeltstrenget DNA, der findes i bakterier, ofte i flere kopier pr. celle. Inkluderet i den information, der er indkodet i plasmid-20 DNA'en, er den der kræves til at reproducere plasmidet i datterceller (dvs. et "replicon" eller replikationsori-gin) og almindeligvis en eller flere fænotypiske selektionsegenskaber, såsom resistens over for antibiotica, som gør det muligt at kende kloner af værtscellen indeholden-25 de det pågældende plasmid og dyrke dem med fortrin i selektive medier. Anvendeligheden af bakterielle plasmider ligger i, at de kan spaltes specifikt af en eller anden restriktionsendonuclease eller "restriktionsenzym", som hvert genkender et forskelligt sted på plasmid-DNA'en.

30 Derefter kan heterologe gener eller genfragmenter indsættes i plasmidet ved sammenføjning ende-mod-ende ved spaltningsstedet eller ved rekonstruerede ender op til DK 173592 B1 3 spaltningsstedet. Således dannes såkaldte replicerbare ekspressionsmedier.

DNA-kombination gennemføres uden for værtsorganismen, og det resulterende "rekombinante" replicerbare ekspressi-5 onsmedium eller plasmid kan indføres i cellerne af organismen ved en proces, der kendes som transformation, og store mængder af det rekombinante medium kan opnås ved dyrkning af transformanten. Når genet endvidere indsættes rigtigt med hensyn til dele af plasmidet, som styrer 10 transkriptionen og translationen af det indkodede DNA-budskab, kan det resulterende ekspressionsmedium anvendes til at dirigere produktionen af det polypeptid, for hvilket det indsatte gen koder, en proces der betegnes som ekspression.

15 Ekspression startes i et DNA-område, der kendes som promotoren. I ekspressionens transkriptionsfase udfoldes DNA'en og blotlægges som skabelon for påbegyndt syntese af budbringer-RNA (mRNA) fra DNA-sekvensen. mRNA'en bindes igen af ribosomer, hvor mRNA'en translateres til en 20 polypeptidkæde med den aminosyresekvens, som er indkodet af mRNA'en. Hver aminosyre er indkodet af en nucleotid-triplet eller "codon", og alle disse udgør tilsammen "strukturgenet", dvs. den del af DNA-sekvensen, som koder for aminosyresekvensen af det udtrykte polypeptidprodukt.

25 Translation startes ved et "start"-signal (almindeligvis ATG, som i den resulterende mRNA bliver AUG). Såkaldte stopcodoner definerer afslutningen af translationen og dermed produktionen a_f yderligere aminosyreenheder. Det resulterende produkt kan i mikrobielle systemer, om nød-30 vendigt, opnås ved lysering af værtscellen og udvinding af produktet ved passende rensning fra andre proteiner.

I praksis kan anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi udtrykke helt heterologe polypeptider, såkaldt direkte DK 173592 B1 4 ekspression, eller den kan alternativt udtrykke et heterologt polypeptid sammensmeltet med en del af aminosyre-sekvensen af et homologt polypeptid. I sidstnævnte tilfælde gøres det ønskede bioaktive produkt sommetider 5 bioinaktivt i det sammensatte homologe/heterologe polypeptid, indtil det spaltes i et ekstracellulært miljø; se GB offentliggørelsesskrift nr. 2 007 676 A og Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980).

Hvis rekombinant-DNA-teknologien fuldt ud skal holde, 10 hvad den lover, må der udvikles systemer, som optimerer ekspressionen af genindsætninger, således at de pågældende polypeptidprodukter kan bringes til rådighed i kontrollerede miljøer og i høje udbytter.

B. Cellekultur-teknologi 15 Teknikken med celle- eller vævskulturer til undersøgelse af genetik og cellefysiologi er veletableret. Der forefindes midler og fremgangsmåder til opretholdelse af permanente cellelinier, fremstillet ved successive rækkeoverførsler fra isolerede normalceller. Til brug ved 20 forskning holdes sådanne cellelinier enten på et fast underlag i flydende medium eller dyrkes i suspension indeholdende næringsstoffer. Opskalering til præparationer i stor målestok synes kun at frembyde mekaniske problemer.

Med hensyn til yderligere baggrund rettes opmærksomheden 25 på Microbiology, 2nd Edition, Harper and Row Publishers,

Inc., Hagerstown, Maryland (1973), især side 1122 og følgende sider, og Scientific Ameriean 245, side 66 og følgende sider (1981), der begge betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning.

30 C. Hepatitis B virus

Hepatitis B (serum hepatitis) virus overføres blandt mennesker og manifesterer sig som kronisk svækkende infekti- DK 173592 B1 5 oner, der kan resultere fremadskridende i alvorlig leverskade, primær carcinoma og død. I de fleste tilfælde kan der forventes fuldstændig helbredelse fra hepatitis B infektioner, men store dele af befolkningen, især i mange 5 afrikanske og asiatiske lande, er kroniske bærere med den farlige mulighed at overføre sygdommen pandemisk.

Hepatitis forårsages af en virus-vektor (hepatitis B virus eller HBV), som i hel tilstand - den såkaldte Dane partikel - repræsenterer virionet og består af et 27 nm 10 nucleocapsid indesluttende et DNA-molekyle og et hylster, der omgiver nucleocapsidet. Proteiner forbundet med virionet inkluderer kerneantigenet (HBcAg), en DNA-polymerase og overfladeantigenet (HBsAg), soro er blevet fundet i serum hos humane inficerede og bærere. Antistof-15 fer over for HBsAg er også blevet fundet i serum-HBV-inficerede mennesker. Det antages, at HBsAg er det HBV-antigen, som kan inducere immunogen produktion af antistof (anti-HBs), og det ville således være det aktive princip i en HBV-vaccine. Opmærksomheden rettes mod: Dane 20 et al., Lancet 1970 (1), 594; Rollinger et al., J. Immunology 107, 1099 (1971); Ling et al., J. Immunology 109, 834 (1972); J. Immunology 109, 834 (1972); Blumberg, Science 197, 17 ( 1977 ); Peterson et al., Proc. Nat. Acad.

Sci. (USA) 74, 1530 (1977) og Viral Hepatitis, A Contem-25 porary Assessment of Etiology, Epidemiology, Pathogenesis and Prevention (Vyas et al., eds.) Franklin Institute Press, Philadelphia 1978, som hver for sig betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning, til yderligere at belyse baggrunden for opfindelsen.

30 HBsAg er overvejende til stede i inficeret plasma i form af kuglerunde partikler med diametre i området fra omkring 16 til omkring 25 nm, den såkaldte "22 nm partikel". Disse antages at repræsentere et ikke-infektiøst viralt hylster. Da antistoffer over for HBsAg beskytter DK 173592 B1 6 mod HBV-infektion, kan disse ikke-infektløse partikler effektivt anvendes som vaccine.

Eftersom hepatitis B virus ikke har været infektiøst i cellekultur og kun kan opnås fra inficerede mennesker el-5 ler højere primater, har der ikke været midler til rådighed til opnåelse og bevarelse af tilstrækkelige forsyninger af HBV til brug ved fremstilling af antigen til immunisering over for HBV.

D. Teknikkens stade 10 I GB offentliggørelsesskrift nr. 2 034 323 A og EP offentliggørelsesskrifterne nr. 13 828 og 20 251 er beskrevet henholdsvis isolering og kloning af HBV-genomet, ekspression af HBV-kerneantigen og produktion i E. coli af et fusionsprotein, som angives at indeholde en del af 15 HBsAg.

Dubois et al. beskriver i Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77(8), 4549-4553 (1980) integrationen af museehromosom ved transformation af museceller med tandemklonede hepatitis B genomer. De indsætter to kopier af .EcoRI-HBV-DNA 20 i plasmidet pBR322, således at celler transformeret med det rekombinante plasmid udtrykker hele HBsAg-forstadie-sekvensen

Moriarty et al.beskriver i Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78(4), 2606-2610 (1981) konstruktionen af en abevirus 40-25 (SV40)-rekombinant bærende et fragment af HBV-DNA. Den konstruerede rekombinante vektor kodede for en fusion af kodesekvensen for det modne S-protein (HBsAg) med den største del af den præ-S-kodende sekvens såvel som en portion af pBR322-vektoren og den største del af genet 30 for modent SV40-VP2. Desuden inkluderede den DNA-sekven-ser, som kodede for SV40-tumor-proteiner og muligvis andre HBV-proteiner. Kulturer af abenyreceller blev infice- DK 173592 B1 7 ret med den vir ale rekombinant og producerede en 22 nm partikel, som angiveligt var karakteristisk for dem, der findes i sera fra hepatitis B inficerede patienter. Det er ikke klart, om der blev udtrykt modent HBsAg.

5 Spørgsmålet om forsekvensens sekretoriske rolle er stadig uløst, og tilstedeværelsen af den største del af forsekvensen for HBsAg i slutproduktet er stadig et alvorligt problem ifølge Moriarty et al. ovenfor. Det er derfor overraskende, at disse problemer har kunnet løses ifølge 10 den foreliggende opfindelse som forklaret i det følgende.

SAMMENFATNING AF OPFINDELSEN

Den foreliggende opfindelse er baseret på den erkendelse, at rekombinant-DNA-teknologi kan anvendes med held til effektivt at producere polypeptider i et hvilket som 15 helst hvirveldyrcellekultursystem som vært, så man kan drage nytte af fordelene ved sådanne systemer, nemlig glycosylering, phosphorylering, methylering og sukker- og lipidtilknytning nærmere beslægtet med de naturligt producerede proteiner i forhold til deres produktion i bak-20 terie- eller endog gærværter, som er ude af stand til et sådant niveau af forfinet forarbejdning. Desuden vil hvirveldyrcellekulturerne uden tvivl tolerere polypeptid-produktet godt og kan især i nogle tilfælde secernere produktet til cellekulturmediet, hvilket i umådelig grad 25 hjælper med til udvindings- og rensningsmetoderne.

I overensstemmelse hermed tilvejebringes ifølge opfindelsen en rekombinant viral ekspressionsvektor, som er i stand til i en transformant hvirveldyrcellekultur at udtrykke en DNA-sekvens, der koder for modent hepatitis B-30 overfladeantigen (HBsAg) uden nogen sekvens, der koder for HBsAg-forsekvens, hvor den nævnte HBsAg-kodesekvens erstatter kodesekvensen af et viralt vektorgen, således DK 173592 B1 8 at den er under den rette styring af promotoren for det virale gen, som er heterolog for HBsAg.

I en foretrukken udførelsesform af ekspressionsvektoren ifølge opfindelsen er translationsstartcodonen for DNA-5 sekvensen, som koder for det modne HBsAg, lokaliseret i den oprindelige position, der blev indtaget af translationsstartcodonen for det virale protein, der normalt styres af den virale promotor, eller inden for ét basepar fra den oprindelige position.

10 Normalt vil ekspressionsvektoren ifølge opfindelsen også indeholde et gen til faenotypisk selektion i en mikrobiel vært.

En anvendelig viral vektor til konstruktion af ekspressionsvektoren ifølge opfindelsen er SV40-vektoren.

15 Opfindelsen omfatter også en hvirveldyrcellekultur trans-ficeret med en ekspressionsvektor ifølge opfindelsen. En sådan hvirveldyrcellekultur kan f. eks. være opnået ved transformation af CV-1 linien af abenyrefibroblaster.

Endvidere omfatter opfindelsen en fremgangsmåde til frem- 20 stilling af HBsAg i en hvirveldyrcellekultur, hvilken fremgangsmåde er særegen ved, at man lader en hvirveldyr-cellekulturtransfektant ifølge opfindelsen vokse under sædvanlige betingelser i medium, indtil det nævnte HBsAg er produceret deri, og udvinder det nævnte HBsAg.

25 Mere specifikt tilvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af modent hepatitis B-overfladeantigen (HBsAg) , som er særegen ved ekspression af en DNA-sekvens, der koder for det nævnte HBsAg, men er uden nogen sekvens, der koder for HBsAg-forsekvensen, i en hvir- 30 veldyrcellekultur transficeret med en replikerbar ekspressionsvektor ifølge opfindelsen indeholdende den nævn- DK 173592 B1 9 te sekvens og udvinding af antigenet i form af 22 run partikler.

Herved opnås hepatitis B-overfladeantigen (HBsAg) i form af adskilte partikler omfattende immunogene determinanter 5 for hepatitis B virus (HBV). HBsAg secerneres til cellekulturmediet i adskilt partikelform uden noget yderligere tilknyttet polypeptid-kunstprodukt, hvad enten det er kodet for af en anden del af HBV-genomet eller af DNA homolog til den anvendte vektor.

10 KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGERNE

Fig. 1 belyser konstruktionen af plasmidet pSVR indeholdende SV40-DNA med fjernelse af kodeområdet for VP-1-proteinet.

Fig. 2 belyser konstruktionen af plasmidet pHS94, der hu-15 ser HBsAg-DNA.

Fig. 3 belyser konstruktionen af plasmidet pSVHBSA indeholdende HBsAg-DNA og sekvenser af DNA afledt fra SV40 og pBR322. I del B sammenlignes DNA-sekvensen,der omgiver ATG-startcodonen i VP-l-protein (indrammet i den øverste 20 linie) med den tilsvarende i HBsAg skabt i rekombinanten (indrammet ATG i den nederste linie). Hind III stedet, som blev omdannet til et EcoRI sted, er understreget.

Fig. 4 belyser replikationen af plasmid-DNA i abeceller. Monolag af COS-celler blev dyrket til 50-60% sammenflyd-25 ning i 6 cm plastic-petriskåle. Cellerne blev vasket med Dulbecco's modificerede medium, og der påførtes 2 ml medium indeholdende 1 pg plasmid-DNA og DEAE-dextran ved 200 pg i 12 timer ved 37 °C. DNA-opløsningen blev fjernet, cellerne vasket en gang med medium, og der tilsattes 30 5 ml medium indeholdende 10% fetalt kalveserum, og cel lerne blev inkuberet ved 37 °C i enten 1 eller 3 dage før DK 173592 B1 10 DNA-ekstraktion. Ved disse tidspunkter blev en lille su-perspiraliseret plasmid-DNA isoleret ifølge den af Hirt (14) beskrevne fremgangsmåde. DNA'en blev underkastet agarosegel-elektroforese og overført til nitrocellulose 5 (15). For at synliggøre replikerende plasmider blev ni trocellulosefiltret sonderet med 3ZP-mærket HBV-DNA. Banerne (a) - DNA fra Hirt-lysater af celler transficeret med pRI-Bgl. Banerne (b) - DNA fra Hirt-lysater af celler transficeret med pHBs348-L. Bane (M) - 1 pg pHBs348-L- 10 DNA. Pilene henviser til beliggenheden af lukket cirkulær DNA (I) og åben cirkulær DNA (II).

Fig. 5 viser den mængde HBsAg, der blev syntetiseret af rekombinante plasmider i COS-celler. Monolag af COS-celler blev dyrket til omkring 50 % sammenflydning i 6 cm 15 plastic-petriskåle og præpareret til DNA-transfektion som beskrevet i forbindelse med fig. 4. 2 ml af Dulbeccos modificerede medium indeholdende 10% fetalt kalveserum blev tilsat efter transfektionen, og mediet blev prøvet til forskellige tider for HBsAg-ekspression efter 24 timers 20 akkumulation. HBsAg-ekspression angives som tællinger pr. minut (min'1) i 0,2 ml ufortyndet medium, prøvet ved RIA (Abbott Labs).

Fig. 6 viser immunogenicitet af HBsAg afledt fra abeceller. Medium fra 20 15 cm skåle med COS-celler transfice-25 ret med pHBs348-L blev høstet, og HBsAg renset som beskrevet ovenfor til elektronmikroskopisk undersøgelse.

Tre grupper på hver 5 mus blev immuniseret med 2,8 pg, 0,6 pg eller 0,006 pg renset HBsAg i nærvær af "complete Freund's adjuvant". Kontrolmus blev immuniseret med lig-30 nende mængder autentisk HBsAg afledt fra humant serum (North American Biologicals Inc.). Musene blev blodtappet fra halen til forskellige tider efter immunisering, anti-HBsAg-antistof kvantiseret ved RIA (Abbott Labs), og resultaterne udtrykt som gennemsnitstiter pr. mus. Mus im- DK 173592 B1 11 muniseret med HBsAg afledt fra vævskultur udviklede identiske titere med mus immuniseret med HBsAg afledt fra humant serum.

Fig. 7 viser tilstedeværelsen af HBV-sekvenser replike-5 rende soro del af SV40.

Fig. 8A belyser en saccharosegradientsedimentering af HBsAg syntetiseret via den rekombinante vektor deraf.

Fig.8B er en tilsvarende CsCl-gradient-centrifugering deraf.

10 Fig. 9 viser et elektronmikrografi af HBsAg syntetiseret som en 22 nra partikel i overensstemmelse med opfindelsen.

DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

Cellekultursystemer/cellekul turvektorer

Formering af hvirveldyrceller i kultur (vævskultur) er 15 blevet en rutineprocedure i de seneste år (se Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson eds., 1973).

Her blev CV-l-linien af abenyrefibroblaster anvendt som vært for fremstillingen af HBsAg. Immidlertid kunne de her beskrevne eksperimenter gennemføres i enhver celleli-20 nie, som er i stand til at replikere og udtrykke en kompatibel vektor, f. eks. W138, ΒΗΚ, 3T3, CHO, VERO og HeLa cellelinier. Desuden er det, der kræves af en ekspressionsvektor, et replikationsorigin og en promotor lokaliseret foran i aflæsningsfase med det gen, som skal udtryk-25 kes, sammen med eventuelle nødvendige ribosombindingssteder, RNA-splejsningssteder, polyadenyleringssted og tran-skriptionsafslutningssekvenser. Selv om disse nødvendige elementer i SV40 er blevet udnyttet, vil det forstås, at opfindelsen hermed er beskrevet i en foretrukken udførel-30 sesform og ikke er begrænset til disse sekvenser. F. eks. kunne replikationsoriginet hos andre virale (f. eks. Po- DK 173592 B1 12 lyoma, Adeno, Retro, VSV, BPV o.s.v.) vektorer anvendes såvel som cellulære originer til DNA-replikation, som kunne fungere i ikke-integreret tilstand.

Desuden begynder replikationen af SV40-DNA ved et unikt 5 sted og skrider frem i to retninger (19). Genetiske undersøgelsesresultater tyder på, at der kun kræves ét viral t gen-produkt til replikationen af den virale DNA.

Dette er produktet af A-genet (T-antigen),som kræves til at starte hver runde af viral DNA-syntese (12). De her 10 beskrevne forsøg har påvist, at rekombinante plasmider indeholdende originet for DNA-replikation hos SV40 er i stand til at replikeres i abeceller i nærvær af det store T-antigen fra SV40 (20, 21). Det var ønsket at konstruere vektorer, som bevarede både replikations- og promotor-15 funktioner. At et sådant system kan anvendes til at udtrykke heterologe gener i fravær af et komplementerende hjælper-virus er også blevet fastslået.

Polypeptidproduktejr

Den foreliggende opfindelse er anvendelig til fremstil-20 ling af hepatitis B-overfladeantigen.

Ekspressionsvektorerne herfor dirigerer effektivt syntesen af heterologe polypeptider, bl. a. i C0S-7-linien af abeceller. Anvendelsen af både den tidlige og den sene promotor fra SV40 er blevet udforsket, selv om også andre 25 promotorer skulle være nyttige i denne henseende. Foruden til den effektive ekspression af potentielt nyttige polypeptider (f. eks. vækstfaktorer, lymphokiner, virale antigener, interferoner) skulle systemet være nyttigt i andre henseender. F. eks. syntetiseres væsentlige niveauer 30 af RNA fra disse vektorer, hvilket tyder på, at en geno-misk indsætning indeholdende introner skulle frembringe væsentlige niveauer af forarbejdet RNA, hvorudfra der let kunne opnås cDNA-kloner. Således skulle systemet vise sig DK 173592 B1 13 nyttigt til omdannelse af genomiske indsætninger til cDNA-kloner. Desuden skulle det i det ikke-lytiske ekspressionssystem være muligt at anvende denne arbejdsmåde til at udtrykke gener, for hvilke der kan udøves et se-5 lektionstryk (f. eks. dihydrofolatreductase, thymidinki-nase, lægemiddelresistens-gener, oncogener) med det formål at opnå både vektorer, som er afhængige af værtsfremfor virale originer for DNA-replikation, og vektorer, som replikerer stabilt, måske via en erhvervelse af 10 værtssekvenser (f. eks. centromere).

Konstruktion af en SV40-DNA uden kodeområdet for VP-J-protein

Den komplette nueleotidsekvens af SV40-DNA er kendt (1), og derfor kan de fysiske lokaliseringer af forskellige 15 SV40-kodede proteiner korreleres direkte med forskellige restriktionsenzym-spaltningssteder. Undersøgelse af nu-cleotidsekvensen, der indbefatter kodeområdet for VP-1-protein (1) angav to velplacerede restriktionsendonuclea-se-spaltningssteder (fig. 1). Det første er et spalt-20 ningssted for restriktionsendonueleasen Hind III ved nu-cleotid-position 1493, 6 nucleotider i 5'-retningen for startcodonen for VP-l-protein. Det andet er et spaltningssted for restriktionsendonueleasen BamHI ved nueleo-tidet 2533, 50 nucleotider i 5'-retningen for afslut- 25 ningscodonen for VP-l-protein. For at opnå SV40-DNA med deletion mellem Hind III-stedet ved 1493 og BamHI-stedet ved 2533 udførtes forsøg som skitseret i fig. 1. Kort fortalt blev vild-type-SV40-DNA først spaltet med BamHI til opnåelse af en lineær DNA i fuld længde og derpå 30 spaltet med Hind III under den betingelse, at hvert DNA-molekyle i gennemsnit kun fik én spaltning (der er 6 Hind III-spaltningssteder fordelt igennem SV40-genomet). I teorien skulle 1 ud af 12 fragmenter af den resulterende nedbrudte DNA-blanding være den ene ønskede kombination.

DK 173592 B1 14

Derefter blev et syntetisk decanucleotid, dAGCTGAATTC

(2), ligeret til disse BamHI- og Hind III-behandlede SV4 0-DNA-fragmenter via kohæsive ender af Hind III-spaltningssteder (-TCGA)og decanucleotidet. Hele blandin-5 gen blev derpå nedbrudt med EcoRI (til frembringelse af en kohæsiv ende i EcoRI-stedet på det tilføjede decanucleotid) og klonet ind i pBR322 via Barn- og EcoRI-steder (3). Plasmid-DNA'en indeholdende SV40-sekvenser blev screenet ved restriktionsanalyse (4), og det frag-10 ment med den stipulerede fjernelse blev isoleret og betegnet som pSVR.

Der er to formål med tilsætning af syntetisk decanucleotid. For det første indeholder det tilsatte decanucleotid et spaltningssted for restriktionsendonucleasen EcoRI, 15 som mangler i denne del af SV40-DNA. Derfor kan der let opnås store mængder af dette SV40-DNA-vektorfragment ved formering af pSVR-plasmid i E. coli (5) og efterfølgende spaltning med endonuclease EcoRI og BamHI.For det andet vil det tilsatte decanucleotid genoprette den oprindelige 20 fysiske afstand mellem Hind III-spaltningsstedet og startcodonen for VP-l-protein, når en rigtigt konstrueret DNA indeholdende kodesekvenser af et fremmed gen ligeres til denne SV40-DNA via EcoRI-spaltningsstedet (se fig.

3B) .

25 8 ug BamHI-spaltet lineær fuld-længde SV40-viral DNA

(denne kan opnås ved spaltning af vildtype-SV40-viral DNA eller SV40-DNA klonet ved BamHI-stedet af pBR322 med BamHI) blev nedbrudt med 2 enheder Hind III (BRL) i 50 μΐ reaktionsblanding indeholdende 20 mM "tris"-Cl (pH 7,5), 30 60 mM NaCl og 7 mM MgCl2. Efter inkubation ved 37 °C i 30 minutter blev reaktionen stoppet ved tilsætning af overskud af EDTA, og reaktionsblandingen blev deproteineret ved phenolekstraktion efterfulgt af ethanolfældning. Den DK 173592 B1 15 delvis nedbrudte DNA blev derpå gensuspenderet i 10 μΐ TE-puffer (10 mM "tris''-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA).

Til omdannelse af den Hind III sted-kohæsive ende til den EcoRI sted-kohæsive ende blev 0,1 nmol syntetisk deca-5 nucleotid, dAGCTGAATTC, først phosphoryleret med ATP ved hjælp af T4-polynucleotid-kinase i 10 μΐ reaktionsblanding indeholdende 50 mM glycin-puffer(pH 9,1), 10 mM

MgCl2 , 5 mM DTT, 0,5 mM ATP og 10 enheder kinase. Inkubationen foregik ved 37 °C i 1 time.En alikvot (3 μΐ) af 10 kinase-reaktionsblandingen blev derpå tilsat til en ligeringsblanding (20 μΐ) indeholdende 66 mM "tris"-Cl (pH 7,5), 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,05 mg/ml BSA, 0,5 mM

ATP, 4 μς delvis Hind IIl-nedbrudt SV40-DNA (ovenfor) og 10 enheder T4-DNA-ligase. Inkubationen for ligeringsreak-15 tionen foregik ved 20 °C i omkring 16 timer.

Den ligerede DNA blev behandlet med restriktionsendo-nucleasen EcoRI til frembringelse af en EcoRI-kohæsiv ende på den ligerede linker, og den blev derpå deproteine-ret med phenol, fældet med ethanol, ligeret til BamHI-20 EcoRI-fragmentet af pBR322 (0,5 pg) i en 15 μΐ ligeringsblanding (se ovenfor) og anvendt til at transformere E. coli 294. Plasmider isoleret fra disse transformanter blev derpå screenet for indsætningen af de rette SV40-DNA-fragmenter ved forskellig restriktionsenzym-25 nedbrydning.

Isolerinq af HBsAg-strukturgen

Den ovenfor konstruerede SV40-vektor blev udformet til at udtrykke det gen, der koder for overfladeantigenet af hepatitis B virus (HBsAg). HBsAg, et polypeptid med en mo-30 lekylvægt på 25 000, eksisterer normalt som en kompleks partikelformet struktur (22 nm partikel), der er delvis glycosyleret og secerneres til det ydre af den inficerede levercelle (6).

DK 173592 B1 16

Til ekspression af HBsAg i den ovenfor konstruerede SV40-vektor ville et ideelt DNA-fragment indeholdende kodesekvensen for HBsAg være i overensstemmelse med de følgende betingelser. For det første har denne DNA et EcoRI-5 restriktionssted på den ene ende og et BamHI-sted på den anden. For det andet er EcoRI-stedet lokaliseret umiddelbart i 5'-retningen for startcodonen for HBsAg, således at den oprindelige position af ATG i VP-l-proteinet kan genoprettes. Endelig skal det resulterende rekombinante 10 SV40-molekyle være af lignende størrelse som vild-type-SV40-DNA for at opnå effektiv pakning til virale partikler. For at opfylde de ovenstående betingelser udførtes en række forsøg belyst detaljeret i fig. 2. Et af de vigtige træk for denne konstruktion er skabelsen af et Eco-15 RI-restriktionssted umiddelbart i 5'-retningen for den antagne startcodon (ATG) for HBsAg. Dette blev gjort ved anvendelse af en syntetisk 12-mer (dATGGAGAACATC), som er den sekvens der svarer til startcodonen og codonerne af de følgende 3 aminosyrer i HBsAg, som en sted-specifik 20 primer for E. coli DNA-polymerase til at syntetisere DNA fra enkeltstrenget klonet HBV-DNA. Efter rigtig enzymatisk behandling blev den syntetiske DNA derpå splejset med den klonede HBV-DNA for at rekonstituere et intakt HBsAg-gen og med en behandlet vektor-DNA indeholdende et 25 EcoRI-sted på enden for at rekonstituere det stipulerede EcoRI-sted. Plasmidet betegnes pHS94.

Strukturgenet, der koder for HBsAg, blev udvundet fra et plasmid (pHBV-7-lA) indeholdende hele genomet af HBV klonet ind i EcoRI-stedet af pBR322. Denne klon blev opnået 30 ved fremgangsmåder af lignende art som dem, der fornyligt er publiceret af Valenzuela et al. (7) og (8).

Strukturgenet blev modificeret på 2 måder: 1) for at inkorporere et unikt restriktionssted direkte foran start-ATG-methionin-codonen og 2) for at stump-ende-ligere HBV- DK 173592 B1 17

Hpa I-stedet, lokaliseret fjernest fra HBsAg-genet, til det udfyldte EcoRI-sted i pBR322. Disse to modifikationer af DNA-fragmentet indeholdende HBsAg-strukturgenet blev gennemført som beskrevet nedenfor: 5 1) 50 μg pHBV-T-IA-DNA blev først nedbrudt med Hpa II (80 enheder) i 200 μΐ reaktionsblanding ifølge enzymleverandørens (BRL) reaktionsbetingelser til opnåelse af et DNA-fragment på 1,7 kb, hvori startcodonen for kodesekvenserne af HBsAg var lokaliseret tæt ved 5'-enden af menings-10 strengen (omkring 400 bp). DNA'en blev renset ved elek-troforese på polyacrylamidgeler (PAGE). Det rensede Hpa

Il-fragment blev derpå behandlet med λ-exonuclease (2 enheder) i 100 μΐ reaktionsblanding (New England BioLab) i 30 minutter ved 37 °C. λ-exonuclease er en 5'-exonucle-15 ase, som nedbryder dobbeltstrenget DNA. Denne reaktion nedbrød 5'-halvdelen af "raenings-streng"-DNA'en fra HBsAg-kodesekvenser og blotlagde antiroenings-strengen til pardannelse med tilsat primer. Den λ-exonuclease-behandlede DNA blev deproteineret og gensuspenderet i 50 20 μΐ reaktionsbalnding indeholdende 40 raM kaliumphosphat-puffer (pH 7,4), 1 mM DTT, 50 μg/ml BSA, 6 mM MgClz, 0,5 mM hver af dNTP'er og 0,2 nmol dATGGAGAACATC (3ZP-mærket ved 5'-enden ved hjælp af polynueleotidkinase). Blandingen blev først opvarmet til 90 °C i 1 minut, annealet ved 25 0 °C i 30 minutter og derpå inkuberet ved 37 °C i 3 timer i nærvær af 2 enheder E. coli DNA-polymerase I Klenow-fragment (9). DNA-polymerasen syntetiserede DNA primet af den tilsatte primer og nedbrudt enkeltstrenget DNA med 3'-OH-ender og skabte derfor stump-endede DNA-molekyler.

30 Den resulterende DNA blev derpå deproteineret, nedbrudt med Xbal (45 enheder) ved et sted lokaliseret inde i HBsAg-genet i 100 μΐ reaktionsblanding og fraktioneret ved PAGE. Et DNA-fragment på 91 bp indeholdende de første 30 codoner af HBsAg-genet blev isoleret efter autoradio-35 grafisk detektion (fragment A).

DK 173592 B1 18

For at skabe et unikt restriktionssted umiddelbart op til HBsAg-genet i 5'-retningen drog man fordel af et derivat af plasmidet pBR322 (kaldet pNCV), som indeholder et syntetisk DNA-segment med sekvensen:

5 AATTCTGCAG

GACGTCTTAA

lokaliseret ved EcoRI-stedet. Inkorporeret i denne syntetiske DNA-sekvens er et Pstl-sted. 10 pg pNCV-DNA blev først skåret med 24 enheder Pstl-enzym i en 100 μΐ reak-10 tionsblanding og derpå behandlet med 2 enheder E. coli DNA-polymerase Klenow-fragment i 50 μΐ reaktionsblanding som beskrevet oven for ved 8 °C i 1 time. DNA-polymerase-behandlingen fjernede det 4 basepars 3'-udhæng,der var skabt ved Pstl-nedbrydningen og efterlod en stump-endet 15 DNA med et intakt EcoRI-restriktionssted, hvilket gav fragmentet B indeholdende originet for replikation af pBR322. Det ovenfor fremstillede stump-endede HBsAg-genfragment A blev ligeret til EcoRI-stedet af fragment B. Dette blev gennemført ved 3-fragment-ligering til ska-20 belse af et plasmid pHS94. Det tredje fragment (fragment C) blev fremstillet som følger: 2) HBsAg-genet fra plasmidet pHBV-T-ΙΑ blev spaltet med Hpal ved et sted fjernt fra HBsAg-genet. Hpal-stedet blev ligeret til et EcoRI-sted i pBR322, som i forvejen var 25 fyldt ud med DNA-polymerase I Klenow-fragment (9). Dette blev gennemført ved subkloning af derivatet af pBR322 til opnåelse af pHS42. Dette plasmid blev spaltet med Xbal (som spalter ved codon 31) og med BamHI(som spalter 375 basepar fra EcoRI-stedet i pBR322) til opnåelse af et 30 DNA-fragment indeholdende det meste af HBsAg-genet, ca.

150 basepar bort fra HBsAg-genet og promotor/operatoren og de første 200 basepar af tetracyclinresistens-genet.

DNA-fragmentet C afgrænset af Xbal og BamHI blev isoleret DK 173592 B1 19 ved PAGE og anvendt ved den ovenfor beskrevne 3-fragment-ligering til opnåelse af plasmidet pHS94 (fig. 2).

Konstruktion af rekombinant-SV40-DNA, som er i stand til at syntetisere HBsAg 5 For at sikre store mængder rigtigt ligeret DNA til at transficere abeceller blev den ligerede DNA klonet i E. coli på følgende måde. Som vist i fig. 3 blev BamHI-til-EcoRI-fragmentet indeholdende SV40-DNA fra pSVR først ligeret til EcoRI-til-BamHI-fragmentet indeholdende hepati-10 tis-overfladeantigen fra pHS94 via dets EcoRI-sted, og det resulterende fragment blev derpå klonet i BamHI-stedet af pBR322.Den rigtigt konstruerede DNA, pSVHBSA, kan derpå spaltes med restriktionsendonucleasen BamHI til skabelseaf et DNA-fragment på 5382 nucleotider, som be-15 står af et rekombinant SV40-genom med kodeområdet for dets VP-l-protein erstattet med genet, der koder for hepatitis-overfladeantigen.

Til konstruktionen af pSVHBSA-DNA blev 0,3 μg af SV40-DNA'en indeholdende DNA-fragmentet fra den BamHI+EcoRI-20 nedbrudte pSVR-DNA, 50 ng af det pBR322-indeholdende DNA-fragment fra BamHI-nedbrudt pHBV-T- 1A-DNA (se fig. 2 mht detailstruktur) og 0,2 μ9 HBsAg-kodesekvens-indeholdende DNA fra BamHI+EcoRI-nedbrudt pHS94 ligeret med T4-DNA-ligase via deres respektive BamHI- og EcoRI-steder i 15 25 μΐ ligeringsblanding ved inkubation natten over. Én klasse af rigtigt ligerede DNA-produkter har rekonstitueret et intakt tetR-gen af pBR322 og kan derfor selekteres ved tetR blandt et stort antal tets-rekombinanter resulterende fra selvligering af vektor-DNA. Strukturen af pSVHBSA 30 blev derpå bekræftet ved restriktionsenzym-nedbrydning.

DK 173592 B1 20

Formering af rekombinant-SV40-virus og ekspression af HBsAG i abeceller

For at afprøve effektiviteten af hepatitis-overflade-antigen-syntese i et sådant vektorsystem blev den BamHI-5 spaltede pSVHBSA-DNA indført i et monolag af CV-l-celler (10) ved DEAE-dextran-metoden (11) og celler coinficeret med enten tsA28- eller tsA58-virus(12). CV-l-cellemono-laget blev derpå inkuberet ved 41 °C under de rette dyrkningsbetingelser (11). Både tsA28 og tsA58 repræsenterer 10 temperaturfølsomme mutanter i SV40T-antigenet og kan derfor ikke formere sig ved 41 °C (1). Ligeledes producerede CV-l-celler, som kun indeholdt rekombinant SV40-genom (pSVHBSA) ikke infektiøs virus, fordi pSVHBSA mangler VP-1-genet. Som forventet blev der iagttaget cytopatisk ef-15 fekt efter 4 dage i de CV-l-celler, som indeholdt både ts-SV40 virus og det rekombinante SV40-genom. Fuldstændig cellelyse blev iagttaget efter 2 ugers inkubation. Der blev ikke iagttaget nogen cytopatisk effekt i de CV-l-celler, som kun modtog rekombinant SV40-genom eller ts-20 SV40-virus. Ved anvendelse af kommerciel radioimmunprøv-ning for HBsAg (13) blev overfladeantigen-produktion i dyrkningsmediet detekteret så tidligt som 4 dage efter indførelsen afDNA. Kvantitative prøvninger viste, at et monolag på 1 x 106 CV-l-celler producerede op til 3,8 pg 25 HBsAg for hver infektiøs cyclus, ækvivalent med 9 x 107 molekyler/celle. Dette antal er næsten identisk med det antal SV40-VP-l-proteinmolekyler, der antages produceret i en enkelt infektiøs cyclus (1).

For at bestemme, om rekombinant-SV40-genomet er pakket og 30 formeret i CV-l-celler ligesom SV40-virus, blev en plade af CV-l-celler inficeret ved 41 °C med ts-SV40-virus plus en alikvot af lysatet fra de oprindelige coinficerede celler. Lavmolekylær DNA fra den inficerede celle blev isoleret ved den af Hirt (14) beskrevne fremgangsmåde 72 DK 173592 B1 21 timer efter infektion. Den isolerede DNA blev enten ikke behandlet eller spaltet med restriktionsendonucleaser og fraktioneret ved gelelektroforese på agarose. Den fraktionerede DNA blev derpå denatureret og overført til nitro-5 cellulosepapir ved den af Southern (15) beskrevne fremgangsmåde og sonderet med 3ZP-mærket pHS94-DNA. Som det kan ses i fig. 7, forefindes de rekombinante DNA-molekyler indeholdende hepatitis-gensekvens mest som næsten cirkulær DNA med en størrelse, der ikke kan skelnes 10 fra SV40-viral DNA (bane A). Hovedparten af den rekombinante DNA genskaber dens BamHI-sted ved in vivo ligering (bane B). Som forventet kan Bam-EcoRI-fragmentet, der indeholder kodeområdet for hepatitis B-overfladeantigen (se fig. 3) også isoleres i en uændret form.

15 En 150 mm plade af CV-l-celler dyrket til 90 % sammenflydning blev inficeret med et lysat fremstillet ud fra et oprindeligt transfektionsforsøg (som indeholdt både rekombinant og tsA28-virus) og inkuberetved 41 °C efter supplering med overskud af tsA28-virus. 70 timer efter 20 infektionen blev mediet høstet for at karakterisere det syntetiserede HBsAg. Desuden blev intracellulær lavmolekylær DNA isoleret ifølge de af Hirt (14) beskrevne metoder. Den isolerede DNA blev gensuspenderet i 1 ml puffer indeholdende "Tris"-Cl (pH 7,4), 1 mM EDTA.

25 5 μΐ uskåret DNA og 5 μΐ BamHI-nedbrudt DNA blev derpå fraktioneret ved elektroforese igennem en 0,8 % agarose-gel i TBE-puffer sammen med SV40-DNA behandlet på lignende måde som kontrol. DNA-mønstret på gelen blev overført til et ark nitrocellulosepapir og hybridiseret til 3ZP-30 mærket pHS94-DNA (15) som en kilde til HBsAg-gensonde.

Fig.7 repræsenterer det autoradiografiske billede af 3ZP-mærket pHS94-DNA efter hybridisering. Bane A og B er henholdsvis ubehandlet Hirt-supernatant-DNA og BamHI-nedbrudt Hirt-supernatant-DNA. I, II og III angiver positio DK 173592 B1 22 nen af form I, form II og form III af kontrol-SV40-DNA, hvis positioner blev bestemt ved ethidiumbromidfarvning, før DNA'en blev overført til nitrocellulosepapir.

Hepatitis-overfladeantigen indkodet af pSVHBSA syntetise-5 res i partikel form

Hepatitis-overfladeantigen syntetiseres og secerneres fra inficerede leverceller som en partikel (6). Sekvensanalyse af forskellig klonet hepatitis-DNA antyder muligheden af, at det modne overfladeantigen kan fraspaltes fra et 10 større forstadie-protein (8). Da kun DNA, der koder for det modne HBsAg-molekyle plus nogle 3'-utranslaterede sekvenser er inkorporeret i SV40-genomet ved den beskrevne konstruktion, kan det spørges, om det mulige forstadiepeptid spiller nogen funktionel rolle i samlingen af 22 15 nm partiklen og i dens eventuelle sekretion fra cellen.

Til dette formål er det syntetiserede hepatitisoverfladeantigen blevet karkateriseret ved sammenligning af dets egenskaber med autentisk protein med hensyn til sedimentationshastighed, sedimentationsligevægt og elek-20 tronmikroskopisk analyse. Som vist i fig. 8 har det i dette vektorsystem syntetiserede hepatitis-overfladeantigen en sedimentationshastighed, der ikke kan skelnes fra hepatitis-overfladeantigen isoleret fra mediet af en inficeret levercellelinie (17) og har en opdriftsdensitet 25 på 1,22 g/cirv5, igen svarende til en autentisk overflade-antigen-22 nm-partikel (6). Undersøgelse ved elektronmikroskopi af renset overfladeantigen har også afsløret en overvejende partikelformet struktur med en gennemsnitsdiameter på 220 Å (22 nm), morphologisk identisk med auten-30 tiske 22 nm partikler (fig. 8 og 9). Derfor er den modne hepatitis-overfladeantigen-proteinmonomer den eneste væsentlige strukturkomponent indkodet af hepatitis-virus, som kræves for samlingen af 22 nm partiklen.

DK 173592 B1 23 A. Sammenligning af sedimentationshastigheden af HBsAg-syntetiseret i CV-l-celler og af HBsAg syntetiseret og secerneret af en Hepatoma-cellelinie PLC (17 og 18).

(Fig. 8A) . Dyrkningsmedium høstet fra det i fig. 7 be- 5 skrevne forsøg var kilden til det HBsAg, der anvendtes i dette forsøg. HBsAg produceret af PLC-cellelinien (17 og 18) blev høstet fra dyrkningsmediet. HBsAg fra begge kulturer blev først fældet med ammoniumsulfat ved 45% mætning og gensuspenderet (til en slutkoncentration af HBsAg 10 på 0,5 μg/πιl) i en puffer indeholdende 20 mM "tris"-Cl (pH 7,4), 0,5 mM EDTA og 0,5 mM NaCl. 200 μΐ af hver prøve blev fyldt på 2 parallelle 5 ml saccharosegradienter (5-20 % saccharose) i den samme puffer. Centrifugering udførtes ved 45 000 omdr./min i en "Beckman® SW 50.1" 15 rotor i 80 minutter ved 4 °C. HBsAg blev detekteret under anvendelse af det kommercielle HBsAg-prøvningssæt (Ausria 11-125, Abbott Lab).Genvindingen af HBsAg var uvægerligt større end 80 %.

B. Opdriftsdensitetbestemmelse på HBsAg syntetiseret i 20 CV-l-celler (fig. 8B). 2 μg HBsAg fra sammenhældt inficeret dyrkningsmedium blev fældet med ammoniumsulfat ved 45 % mætning, fraktioneret over en agarosege1-permeations-søjle (A 5.0 M, Bio-Rad) og derpå sedimenteret igennemen 5-20 % saccharosegradient som beskrevet i A. Efter sac- 25 charosegradientcentrifugering blev det sammenhældte HBsAg dialyseret imod gradient-puffer uden saccharose og derpå tilsattes fast CsCl for at give opløsningen (7 ml) en slutdensitet på 1,2 g/cm3. Den blev derpå centrifugeret ved 50 000 omdr./min i en Sorvall T 865.1 rotor i 68 ti-30 mer. Prøvninger gennemførtes som beskrevet i A. Genvindingen af HBsAg i CsCl-gradienter var omkring 70 %. Topfraktioner blev derpå hældt sammen, dialyseret imod 10 mM "Tris"-Cl, 100 mM NaCl og 0,5 mM EDTA-puffer, koncentreret og præpareret til elektronmikroskopisk undersøgelse.

DK 173592 B1 24

For at præparere antigenet til elektronmikrografier blev der fremstillet carbonovertrukne kobbernet. En dråbe puffer indeholdende HBsAg-protein (1 pg/ml) blev anbragtpå et net i 30 minutter ved stuetemperatur. Proteinopløsnin-5 gen blev afduppet radialt fra nettet, og det blev vasket en gang med 4 dråber vand. Nettet blev derpå farvet med 1,0 % Na-phosphowolframat, pH 7,6, i 1 minut og tørret med filterpapir. Elektronmikrografier blev taget på en "Phillips® E. M. 400" ved forstørrelse 77 700. Dette gav 10 et negativ, fra hvilket et positivt billede blev fremstillet ved forstørrelse (ca. 10 gange) som vist i fig.

9.

Konstruktion af ikke~lytiske vektorer, der udtrykker HBsAg 15 Der blev samlet rekombinant-plasmider, som indeholder pBR322-sekvenser afledt fra plasmidet pML (21), 348 basepar af SV40-DNA, som omfatter originområdet for DNA-replikation såvel som promotorsekvenserne for både de tidlige og sene transkriptionsenheder og HBV-sekvenser, 20 som har indkodet genet for HBsAg. Originet fra SV40 blev isoleret ved nedbrydning af SV40-DNA med Hind III og omdannelse af Hind ΙΙΙ-enderne til EcoRI-ender ved tilsætning af en omdanner (AGCTGAATTC) . Denne DNA blev skåret med PvuII, og RI-linkere blev tilsat. Efter nedbrydning 25 med EcoRI blev fragmentet på 348 basepar, som omspænder originet, isoleret ved PAGE og elektroeleuring og klonet i pBR322. Ekspressionsplasmider pHBs348-E og pHBs348-L blev konstrueret ved kloning af fragmentet på 1986 basepar, opnået ved EcoRI- og BglIl-nedbrydning af HBV (22) 30 (som omspænder genet, der koderfor HBsAg), ind i plasmidet pML (21) ved EcoRI- og BamHI-stederne. (pML er et derivat af pBR322, som har en deletion, der fjerner sekvenser, som er inhiberende for plasmid-replikation i abeceller (21). Det resulterende plasmid (pRI-Bgl) blev derpå DK 173592 B1 25 lineariseret med EcoRl, og fragmentet på 348 basepar, der repræsenterer SV40-originområdet, blev indført i EcoRI-stedet af pRI-Bgl. Originfragmentet kan indsættes i valgfri orientering. Da dettefragment koder for både de tid-5 lige og sene SV40-promotorer foruden replikationsorigi-net, vil HBV-gener kunne udtrykkes under styring af den ene eller den anden promotor afhængigt af denne orientering (pHBs348-E repræsenterer HB'er udtrykt under styring af den tidlige promotor; pHBs348-L repræsenterer HB'er 10 udtryktunder styring af den sene promotor).

Replikat ion af SV40-HBV-plasmider i abeceller

Replikationen af HBV-SV40-rekombinant-plasmider i COS-7-linien af abeceller blev påvist som følger: Til forskellige tider efter DNA-transfektion ved DEAE-dextran-15 teknikken blev lavmolekylær DNA isoleret ved den af Hirt(14) beskrevne metode, fraktioneret ved elektroforese iagarosegeler og analyseret ved Southern-duppe-hybridisering (15). Fig. 4 viser, at der umiddelbart efter transfektionen kun er lidt eller intet superspirali-20 seret plasmid til stede i COS-cellerne. 3 dage efter transfektionen er der imidlertid sket omfattende replika-tion af den indførte DNA efter indførelse af enten pHBs348-L-DNA (bane b) eller pHBs348-E-DNA. Som forventet iagttages ingen plasmid-replikation efter transfektion af 25 plasmid pRI-Bgl (som mangler SV40-originsekvenser, men ellers er identisk med de ovennævnte ekspressionsplasmi-der) (banerne a).

Syntese af HBsAg i abeceller transficeret med rekombinan-te pi asmider 30 Plasmiderne pML, pRI-Bgl, pHBs348-E og pHBs348-L blev indført i COS-7-linien af abeceller (23), idet DEAE-dextran-proceduren (11) blev modificeret ved forøgelse af tiden for behandling og udsættelse af cellerne for DEAE- DK 173592 B1 26 dextran og DNA til 12 timer. C0S-7-cellelinien huser en integreret kopi af det tidlige områdeaf SV40 og udtrykker konstitutivt SV40-A-genproduktet (T-antigen). Plasmiderne indeholdende et funktionelt origin for SV40-DNA-replika-5 tion er blevet påvist at replikeres i abeceller i nærvær af SV40-T-antigen (20,21). Fig. 5 viser, at COS-celler transficeret med plasmiderne pHBs348-E og pHBs348-L begynder at udtrykke væsentlige mængder HBsAg ved dag 2 og fortsætter med at udtrykke ud over en 2 ugers periode.

10 Det ekspressionsniveau, der dirigeres af pHBs348-L, er noget højere end det, der dirigeres af pHBs348-E. En fortolkning af disse resultater er, at den sene SV40-promotor kan være mere effektiv end den tidlige promotor i dette system.

15 Vævskultur-afledt HBsAg er immunogent i dyr

Efter at have påvist, at vævskultur-afledte partikler af HBsAg er antigenisk aktive, ønskede man at bestemme, om disse partikler er immunogene i dyr. Derfor blev det af COS-7-cellerne producerede antigen renset ved en kombina-20 tion af ammoniumsulfatfældning, saccharosegradient-cen-trifugering og CsCl-densitetsgradient-centrifugering. Vævskultur-afledt HBsAg blev injiceret i hver mus, medens kontrolmus blev immuniseret med identiske mængder af kommercielt tilgængeligt HBsAg (North American Biologicals 25 Inc.) afledt fra humant serum. Titere af anti-HBsAg blev derpå bestemt til forskellige tider efter immunisering.

Fig.6 viser, at væsentlige titere af anti-HBsAg viste sig i mus immuniseret med autentisk HBsAg såvel som i mus immuniseret med vævskultur-afledt HBsAg. Desuden var kine-30 tikken og titerne af anti-HBsAg-antistof-forekomsti mus immuniseret med vævskultur-afledt HBsAg ikke til at skelne fra kinetikken og titerne, der blev iagttaget i mus immuniseret med autentisk HBsAg. Det kan derfor konkluderes, at HBsAg syntetiseret i abeceller ved rekombinant- DK 173592 B1 27 DNA-teknik mht immunogenicitet er sammenligneligt, hvis det ikke er identisk, med HBsAg afledt fra humant serum, hvis effektivitet som vaccine er blevet tilstrækkeligt påvist.

5 Farmaceutiske præparater

De ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser kan sammensættes ved kendte metoder til fremstilling af farmaceutisk nyttige præparater, hvorved det omhandlede poly-peptid kombineres i blanding med et farmaceutisk accepta-10 belt bæremedium. Egnede medier og deres sammensætning er beskrevet i Remington's Pharmaceutical Science ved E.W. Martin, der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse med denne henvisning. Sådanne præparater vil indeholde en effektiv mængde af det omhandlede polypeptidprodukt 15 sammen med en egnet mængde bæremedium til fremstilling af farmaceutisk acceptable præparater, der er egnet til effektiv indgivelse til værten. En foretrukken indgivelsesmåde er parenteral. Egnede veterinære sammensætninger fremstilles som det er tilfældet med farmaceutiske præpa-20 rater med de nødvendige ændringer.

Vaccinefremstilling

Vacciner der indeholder et egnet polypeptid, fremstillet ifølge opfindelsen, kan fremstilles ved kendte metoder, hvorved polypeptidet kombineres i blanding med et egnet 25 medium. Egnede medier inkluderer f. eks. saltvandsopløsninger, forskellige kendte tilsætningsstoffer eller andre additiver, der kendes inden for faget til brug i præparater indgivet for at forhindre virusinfektioner. Sådanne vacciner vil indeholde en effektivt mængde af det omhand-30 lede polypeptid og et egnet medium til fremstilling af vaccine, som er nyttig til effektiv indgivelse hos værten. Opmærksomheden rettes også på New Trends and Developments in Vaccines, Editors: A. Voller and H. Friedman, DK 173592 B1 28

University Park Press, Baltimore 1978, der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse med denne henvisning for at give yderligere baggrundsdetaljer om fremstillingen af vacciner. På grund af de unikke fremgangsmåder, hvorved 5 den aktive komponent i disse vacciner er fremstillet, vil de pågældende vacciner være i det væsentlige frie for fremmed protein og andre virale og cellulære komponenter. Derfor er de mindre tilbøjelige til at frembringe de komplikationer som kan forekomme med vaccinepræparater på 10 basis af hel dræbt eller svækket virus.

BIBLIOGRAFI

1. N.H. Acheson i Molecular Biology of Tumor Viruses (Ed. J. Tooze) Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 2nd edition, Part 2, side 125-204 (1980).

15 2. R. Crea, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)_75, 5755 (1978).

3. D.V. Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 76 , 106 ( 1979) .

4. R. W. Davis, et al., Advanced Bacterial Genetics, 20 Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., side 116-125 ( 1980) .

5. D.H. Hamer og P. Leder, Cell 18, 1299 (1979).

6. 0. Blumberg, Science 197, 19 (1977).

7. P. Valenzuela et al., Nature 280, 815 (1979).

25 8. P. Charnay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 76, 2222 (1979).

9. H. Jacobsen et al., Eur. J. Biochem. 45, 623 (1974).

10. J.E. Mertz og P. Berg, Virology 62, 112 (1974).

DK 173592 B1 29 11. J.H. McCutchan og J.S. Pagano, J. Nat. Cancer Inst.

41, 351 (1968).

12. P.J. Tegtmeyer, J. Virology 10, 591 (1972).

13. Ausria 11-125. Abbott Lab.

5 14. B.J. Hirt, J. Mol. Biol. 26, 365 (1967).

15. E.M.J. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503 (1975).

16. C-J. Lai og D. Nathans, J. Mol. Biol. 89, 179 (1974).

17. J.J. Alexander et al., S. Afr. Med. J. 50, 2124 10 (1976).

18. P.L. Marion et al., J. of Virol. 32, 796 (1979).

19. DNA Tumor Viruses 2nd Edition (Ed. J. Tooze), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1980).

20. Myers og Tjian, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 77, 15 6491 (1980).

21. Lusky and Botchan, Nature 293, 79 (1981).

22. Animal Virus Genetics (Eds. Fields, Jaenisch and Fox), Chapter 5, side 57, Academic Press, N.Y.

(1980).

20 23. Gluzman, Cell 23, 175 (1981).

Claims (11)

1. Rekombinant viral ekspressionsvektor, som er i stand til i en transformant hvirveldyrcellekultur at udtrykke en DNA-sekvens, der koder for modent hepatitis B-over-5 fladeantigen (HBsAg) uden nogen sekvens, der koder for HBsAg-forsekvens, hvor den nævnte HBsAg-kodesekvens erstatter kodesekvensen af et viralt vektorgen, således at den er under den rette styring af promotoren for det vi-rale gen, som er heterolog for HBsAg.

2. Vektor ifølge krav 1, hvori translationsstartcodonen for DNA-sekvensen, som koder for det modne HBsAg, er lokaliseret i den oprindelige position, der blev indtaget af translationsstartcodonen for det virale protein, der normalt styres af den virale promotor, eller inden for ét 15 basepar fra den oprindelige position.

3. Vektor ifølge krav 1 eller 2, som også indeholder et gen til fænotypisk selektion i en mikrobiel vært.

4. Vektor ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, hvori den virale vektor er SV40-vektoren.

5. Vektor ifølge krav 4, hvori en hvirveldyrcelle trans- ficeret dermed producerer mindst ca. 9 x 107 HBsAg-molekyler ved afslutningen af vektorens infektionscyclus.

6. Vektor ifølge krav 5, som er valgt blandt pSVHBSA, pHBs348-E og pHBs348-L fremstillet som angivet i beskri- 25 velsen.

7. Hvirveldyrcellekultur transficeret med en vektor ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6.

8. Cellekultur ifølge krav 7, som er opnået ved transformation af CV-1 linien af abenyrefibroblaster. DK 173592 B1 31

9. Fremgangsmåde til fremstilling af HBsAg i en hvirveldyrcellekultur, kendetegnet ved, at man: a) lader en hvirveldyrcellekulturtransfektant ifølge krav 7 eller 8 vokse under sædvanlige betingelser i 5 medium, indtil det nævnte HBsAg er produceret deri, og b) udvinder det nævnte HBsAg.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, hvorved det nævnte HBsAg secerneres i adskilt partikelform til dyrkningsmediet.

11. Fremgangsmåde til fremstilling af modent hepatitis B- overfladeantigen (HBsAg), kendetegnet ved ekspression af en DNA-sekvens, der koder for det nævnte HBsAg, men er uden nogen sekvens, der koder for HBsAg-forsekvensen, i en hvirveldyrcellekultur transficeret med 15 en replikerbar ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6 indeholdende den nævnte sekvens og udvinding af antigenet i form af 22 nm partikler.