JPS6078999A - ＨＢｓ抗原の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＢ型肝炎ウィルスの表面抗原（以下ＨＢｓ抗原
と略称する）の精製法、さらに詳しくは、組換えＤＮＡ
技術を利用した組換え体により産生されるＨＢｓ抗原の
工業的精製法に関するものである。

発明の技術的背景と産業上利用分野 Ｂｆｉ肝炎は、Ｂ型肝炎ウィルス（以下）　ＬＩ３Ｖと
略称する）によって起こり、疫学的にも、臨床的にも非
稀′に重大なる問題を含む、いまだ有効な治療対策が見
出されていない疾病である。これは世界ＩＩ　ｉこ広く
分布しているが、特にアジア、アフリカ地域に多発し問
題となっている。

予防する対策としては、１４１３　ｓ抗原を有効成分と
するワクチンが最も有効であると考えられ、天川化段階
に入っている。すなわち、キャリアーと称されるＢ型肝
炎ウィルス潜伏持続感染者の血漿より得られるＨＢＳ抗
原を高度に精製し、これを不活化して”Ｊｌ肝炎ワクチ
ンがつくられている。

しかしながら、このように血液由来のワクチンは原料を
血液にもとめるため、またＢ型肝炎ウィルスあるいは他
の血液由来のウィルスなどの感染性ノ因子の残存を否定
するために、チンパンジーによる安全性確認試験が必要
であること、検定用のチンパンジーの確保が非常に困難
であることなどの問題点もあり、製造上に多くの制約が
ある。

このような懸案を解消する方策として、組換えＤＮＡ技
術を利用して、大腸菌や、酵母菌に１Ｉｎｓ抗原蛋白質
をコードするＩ（ＢＶのＩ）ＮＡを導入、発現させるこ
とにより、ワクチンの原材料となるＨＢ　ｓ抗原のみを
大量に作り出す研究か多くの研究者らによって推進され
てきた。最近、これら組換え体によるＨＢｓ抗原の発現
が成功を収め、特に組換え酵母によるＨＢｓ抗原の産生
については、工業的応用を可能とする段階に至った。な
お、実用化のためには、残された重要課題として、組換
え体によって産生されたＨＢ　ｓ抗原を、ワクチン材料
あるいは診断用試薬材料となしつる程度まで、高度に精
製する方法の開発が挙Ｕノられる。

従来技術 血液由来のＨＢｓ抗原の精製法としては、密度勾配遠心
法［Ｖｙａｓ　、　Ｇ、　Ｎ等、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ。

１０８．１１１４　（１９７２））　、ポリエチレング
リコール分画とゲル口過、遠心分離を組み合わせた方法
（特公昭５７−２１２４６）および、硫安塩析とゲル口
過を組み合わせた方法（特開昭５３−３８６１７）など
が提案されている。また組換え体由来のＨＢｓ抗原の精
製を試みた例として、水性ニー分配とイオン交換、ゲル
口過を組み合わせた精製法〔出ｔｚｅｍａｎ、　Ｒ，Ａ
等、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ　ｉｄ　几ａｓｃｒｃｂ、　
１１−２７４５　（１９８３）　）等がある。しかしな
がら、これらの方法は、組換え体由来のＨＢｓ抗原の精
製における種々の問題点に対し、いずれも対処できるも
のではなく、いわんや工業的精製法として適用すること
は難がしい。

すなわち、組換え体由来のＨＢｓ抗原を精製するうえで
解決すべき重要な課題は、原材料中の夾雑成分たとえば
組換え由来の蛋白質、脂質類その他の成分が、質的およ
び量的に人血液山来ｉ（Ｂ　ｓ抗原の場合と全く異なっ
ていることであり、またその量が産出されるＨＢｓ抗原
量に比して非常に多いことである。さらに次の問題点と
して本発明者らは夾雑物中に存在する細胞由来のプロテ
アーゼ活性物質によって、ｉ（Ｂ　ｓ抗原が急速に失活
されることを見出した。このためＨＢｓ抗原とプロテア
ーゼ活性物質を、出来るたり早い段階で完全に分離しな
ければ、精製工程において収率の大ｌ］な低下をきたし
てしまうという問題点を解決する必要かある。

さらに、組換え体由来１１Ｂ　ｓ抗原は、そのアフィニ
ティー（生物学的親和力）の特性か人血液由来１−ＩＢ
　ｓ抗原と必すしも同一でない面があり、このことも精
製においての重要な問題点の１っである。

これらのことから、先に挙げた血液由来のｔ４Ｂｓ抗原
の精製法に関する従来技術のみでは、組換え体由来のＨ
Ｂ　ｓ抗原含有にみられる特異条件を克服し充分な精製
効果を発揮することができない。組換え体由来ＨＢｓ抗
原の精製を試みた口ｉｔｚｃｍａ＋ｉらの方法等におい
ても、その精製の内容は、いずれもＨＢｓ抗原の生化学
的分析用の標品をうるためになされたもので、単に分析
可能な程度にまで精製したにすぎず、ワクチンや診断用
試薬に１１」い得る程度の精製効果を期待しうる方法で
はない。さらに精製工程における収率等も検討されてお
らす、またプロテアーゼ活性物質等による［ｉＢ　ｓ抗
原の失活に対する考慮は全くなされておらず、工業的精
製法として応用しつるものではない。

発明の目的 本発明者らは、組換え体に由来する１４１λＳ抗１３Ｘ
の工業的精製法を見出すべく、種々検ｆｌ’Ｊを重ねた
結果、組換え体の培養物から得られる、細胞由来成分等
を含有するＨＢｓ抗原原材オニ４液に、酸を添加してｐ
Ｈを酸性側にもってゆくことにより、クロマトグラフィ
ーの妨げとなる脂質類や夾雑蛋白質の大部分を沈殿物と
してｌ−ｌＢｓ抗原と分別・除去できること、および、
次の工程でハイドロキシアパタイトによるアフイニテイ
クロマトグラフイーを行えば、）１１３　ｓ抗原がきわ
めて高度に精製できることを見出し、本発明を完成する
に至った。

すなわち本発明の目的は、安全で有効なり型肝炎ワクチ
ンを安定かつ大量に供給することを可能ならしめること
にあり、本発明は、組み換えＤＮＡ技術を利用した組み
換え体により産生されるＩ（Ｅ　ｓ抗原を、工業的に効
率よく、大量に、しかもきわめて高純度に精製する方法
を提供するものである。

発明の構成および効果 本発明は、組換えＤＮＡ技術を利用した組換え体により
産生されるＨＢ　ｓ抗原を精製するに除し、組換え体の
培養物から得られる、ｌｌＢｓ抗ｊＪλおよび♀ｉ１ｊ
胞由来成分を含有する原材料液に、酸を添加し原材料液
のｐＨを酸性側に移行せしめ、クロマトグラフィー法の
妨げとなる脂質類や夾雑蛋白質等の大部分を沈殿として
除去し、次いてそのままの状態でもしくは、必要に応じ
硫安塩析による精製および該縮操作を加えたのち、ハイ
ドロキンアパタイトによるアフィニティークロマトクラ
フィーを行うことをも徴とする。

本発明におけるＨＢ　ｓ抗原材料液とは、組換え１）Ｎ
Ａ技術を利用して、１（ＢＳ抗原を産生ずるように）１
ジ賃転換された組換え体、例えば犬腸閑あるいは酵１：
ｊ菌等を、適当な、培地および培養条件で培養して、Ｈ
Ｂｓ抗原を産生、蓄積させた後に、この培介物から適当
な方法でＨＢｓ抗原を粗抽出して得られるものである。

抽出の方法は、まず菌体を遠心分周ｌＬにより培疵物か
ら分離し、適当な緩衝液中て破壊する。破壊の方法とし
ては、超音波破砕、クラスヒーズ破砕、マントン・ゴー
リン破砕、あるいは細胞の扁胞壁を酵素的に溶解せしめ
てスフェロプラストとした後、これに界面活性剤を作用
させて破壊する等の陳々の方法を用いうる。この細胞破
壊物を低速遠心分離にかけ、細胞壁破片等を分離し、さ
らに必要に応じメンブランフィルタ−で口過して）−［
３ｓ抗原原材料とする。

本発明において、酸添加処理に用いる酸としては、塩酸
、硫酸、リン酸等の無機酸類および、酢酸、シュウ酸等
の有機酸類などｍ　Ｖｉａ’　Ｊ４Ｊいられるものがい
ずれも適用される。酸添加処理の方法は、原材料液のｐ
Ｈが６以下、好ましくは５．０〜５．５の範囲に収まる
ように、酸を加えてｐｈのｗ１Ｍ整を行う。酸処理の温
度は好ましくは２０℃以下、さらに好ましくは１０℃以
下で実施した方がよい。ｐＨの調整がすんだ後、析出沈
殿物を遠心分離しＪ−４Ｂｓ抗原を含む上清液を得る。

つぎに必要であれば、硫安塩析による精製および譲縮の
操作を行う。酸添加処理によって得られたＨＢｓ抗原含
有上清液に、適当な濃度のアンモニア水を加え、上清液
のｐＨを６．０〜８．０の範囲に保ちなから硫安を７゛
つ≦加し、ｌＢｓ抗原を沈殿さぜ、これを遠心分離にか
け上（θと分）ｌｌＩＬする。得られた沈殿をイオン強
度が０．００１〜１．０　程度である中性付近の適当な
緩衝液、例えは０．１　Ｉ’ｖｉ　ＩＪン酸緩ｍｉ液等
に溶解し、これを同緩衝液に透析してハイドロキシアパ
タイトによるクロマトグラフィーに付すサンプルとする
。

硫安塩析を実施しない場合は、ｌｉ貼抗原含有上清液に
アンモニア水を加えてｐ　１−ｉを７０に＝１整した後
、前目己と同様の緩衝液に透析あるいは希釈することに
よりクロマトグラフィー用サンプルとする。

本発明において用いるハイドロギンアパタイトとは、リ
ン酸カルシウムかその成分であるアフイニテイクロマト
グラフイー用ケルのことてあり、ｌ−１ｙｄｒｏｘｙａ
ｐａｔｉｔｅ　（生化学工業社、ＡＬＢ　ＩＯＣ［庄Ｉ
ＶＩ−ＢＥＨＲＩＩ’Ｃ社）、１４ｙｄｒｏｘｙｌａｐ
ａｔｉｔｅ（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ社）の名称で市販されて
おり、これらのものを用いるとよい。このハイドロキシ
アパタイトを用いたアフイニテイクロマトグラフイーを
欠施するにあたっては次のような方法で行う。

ハイドロキンアパタイトへのｌ１１３ｓ抗原の吸着は、
カラム法およびハツチ法の両方法か実施可能である。カ
ラム法の場合、ハイドロキシアパタイトを充填したカラ
ムに、クロマトグラフィー用ザンプル調整時に用いたと
同一の緩衝牧を通液して平衡化を行った後、サンプルを
通液し　１（Ｊ３ｓ抗原を吸着させることにより、プロ
テアーゼ活性物質をはしめとする夾雑物質と分離する。

通液終了後、平衡化緩衝液を通液し、カラムを洗浄し、
夾雑物を洗い出す。

またバッチ法の場合は、緩衝液にて平衡化したハイドロ
キシアパタイトを、サンプル液に添加し緩速度にて０．
５〜２時間程度攪拌して１１１３ｓ抗原を吸着させる。

吸堝後、口過器上てハイドロキシアパタイトを口過し、
このゲルに平衡化緩衝液を加えて洗浄・口過分離を数回
繰り返す。

次に溶出操作は、吸着をハツチ法で実施した場合も、Ｈ
Ｂｓ抗原を吸着したハイドロキシアパタイトをカラムに
充填して、カラム法による溶出を実施した方かよい。

浴出は、イオン強度か０１〜５０杆度であり、かつ平衡
化緩衝液よりイオン強度か犬である中性付近の緩衝液を
用いて、段階１容出あるいは一度勾配溶出を実施し、成
層夾雑物質とｌ−Ｉｎ５抗原を分ＹＩＦ溶出させ、ＨＢ
ｓ抗原を含有するフラクションを分取する。かかる操作
により、きわめて有効にかつ高度にＨＢ　ｓ抗原を精製
することかてきる。Ｖ一度勾配溶出は例えば、０．１１
質−〇、５１ν孟のリン酸緩衝液濃度勾配を用いてもよ
いし、０．１　Ｍ’　！Ｊン酸緩衝液・食塩添加０．１
　Ｍ　−１，ＯＰＶＩ履ｆｌ勾配を月」いてもよく、Ｈ
Ｂ　ｓ抗原と夾雑物質との分離良好な他の適当な０１３
度勾配緩衝液を用いてもよい。段階溶出の場合は、ｌ′
ｉＢｓ抗原と夾雑物質のとちらか一方のみが射出される
イオン強度の緩衝液を血液し、続いて他方かイオン強度
の大きい緩衝液を通液することにより、高度に精製され
たＨＢｓ抗原を含有するフラクションを分取する。

このようにして得られた１（Ｂｓ抗原を、次の工程とし
て、蔗糖ステップグラジェント超遠心または蔗糖リニア
グラジェント超遠心、および必要てあれは塩化センラム
を用いた沈降平衡超遠心またはリニアグラジェント超遠
心にかりることにより、はぼ完全に精製された）ＩＢｓ
抗原を得ることができる。

本発明の方法によれは、酸処理−ハイドロキシアパタイ
トクロマトグラフィーの組み合わせという、簡単でしか
も工業的に実施できる方法により、組換え体由来ｌ−ｌ
Ｂｓ抗原を、きわめて効率よく、かつ高純度に精製する
ことか可能である。

酸処理寥より、クロマトグラフィーの妨けとなる夾雑蛋
白質、脂質類等の大部分か沈殿として除去されるため、
ハイドロキシアパタイトケル１−当たりｌ　ｍ１以上の
［ｉＢＳ抗原が吸Ｚｉされ、これによりクロマトグラフ
ィーゲルの使用量、設備ともに小規模で済み非常に効率
的である。このハイドロキンアパタイトクロマトグラフ
ィーの工程において、比活性（ｆ−ｉＢｓ抗原量／含有
蛋白質Ｊ５１　）は１００〜１５０倍程度上昇し、著し
く精製効果が得られる。

また酸処理−ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ーの工程で、原材料中に含まれる７”ｏテアーゼ活性物
質か完全に除去されるため、収率も高く、クロマトグラ
フィー終了まてのｔ１１３　ｓ抗１ｔｉの収率は５０〜
６０％というきわめて高い値に達する。このプロテアー
ゼ活性物質の存在は実際１１１３Ｓ抗原の安定性に係わ
る重要な問題であって、原材料液のｆｌＢ　ｓ抗原粗抽
出液を４℃あるいは一２０°Ｃて保存しても、わずか１
週間はどて、ＨＢｓ抗原のほとんどが失活してしまうほ
どの悪影響を与える。

さらに精製の条件によっては、プロテアーゼ活ｉ生が更
に強まり、わずかの時間で）（１＼Ｓ抗原か失活してし
まうこともある。

本発明者らは、ハイドロキシアパタイトに替えて、Ｄ　
Ｅ　Ａ　Ｅセルロース、ＤＥＡＥファロース、ＣＭセル
ロース、６Ｍセファロース、リン酸セルロース、ブルー
デキストランセファロース等のクロマトグラフィー用ゲ
ルを、種々条件を変えて、組敦え体由来ＨＢｓ抗原の精
製に用いるべく試みたか、精製効果が全く期待されない
はかりか、ＨＢ　ｓ抗原の失活を主原因とする極端な低
収率のため、工業１１′」な応用の用能性を見い出すこ
とはできなかった。

本発明の方法において、ハイドロギノアパタイトクロマ
トグラフイーによって得られたｌ−１４３ｓ抗原を、蔗
糖グラ／エンド超遠心および塩化センウムクラジエント
超遠心により精製してえられた精製ＮＢｓ抗原は、Ｓ　
ｌ）　Ｓ−ポリアクリルアミドケル電気泳動分析におい
て、ｉ４Ｂ　ｓ抗原の単一バンドを示し、きわめて高純
度のものである。

つきに実施例を挙けて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１ 組換え酵母サツカロミセス・セレビシェＡ）（２２／Ｐ
ＡＳＩＯＩ　（特１１ｊｌ昭５７−１４２４６０号を参
照）を培養後、遠心により果菌した画像線Ｉ　Ｋグに、
ｏ、ＩＭ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，２）５１を加え、
これを６００〜７００　Ｋ９／ｃａの圧力で約７回マン
トン・コーリン破砕機にかけ菌体を破壊する。菌体破壊
物を遠心にかけ、粗大菌体破片を分に１［シて、ＮＢｓ
抗原−＆１．３μ９／ｍｌ　［ＲＩＡキッＩ−Ａｕ５ｒ
ｉａ　１１（アボット社）にて測定〕、蛋白質ｉＪ［７
，８’２〜／１７１／（ＬＯＷｒｙ法にて測定）である
）ＩＩ込抗原粗抽出液を得る。次いて、ｐＨメーターで
チェックしつつ粗抽出液に酢酸（６０％水浴液）を滴下
し、ＰＩｉを５．２に調整する。４℃で約３０分間攪拌
した後、遠心により沈殿物を除去する。

遠心上澄にアンモニア水を加えてＰＩｉを約６．５に保
ぢつつ、最終謡度２，５Ｍとなるように硫安を徐々に加
える。約３０分放置後遠心により口Ｂｓ抗原を含有する
沈殿を分離回収する。

回収した沈殿を、０．１Ｍリン酸緩衝液（Ｙｉ４７．２
）約３００ｒｎｌに懸濁させ、透析チューブにて約１０
０倍量の同緩衝液に対して透析する。

透析後０．１　＋ｖｉ　リン酸緩衝液で約３倍に希釈し
、同緩衝液で平衡化しておいたハイドロキンアパタイト
カラム１（ゲル同約１１）に通液り、　ｆ４Ｂｓ抗原を
吸着させる。平衡化緩４ｔｘｉ液てカラムを充分に洗浄
した後、約４１の０．１−０．５　Ｍ’７１３ｔ’勾配
リン酸緩衝液を通液し溶出を行い、１１］３Ｓ抗原を含
むフラクションを氷める。

次にＢｅｃｋｍａｎ　ＳＷ　−２８用超遠心チユーブに
、５０％蔗糖溶液、２０％蔗糖溶液、　ＨＢｓＢｓ抗原
フラクションれぞれ６　ｍｌ　、　１７　ｍｌ　、　１
５　ｍ１重層し、２７．００Ｏｒｐｍ、４℃て１６時１
１４」超遠心を行い、ＮＢｓ抗原を２１２４’Ｊｊｊ液
脂界而にθ畏縮・精製する。

得られた精製ｌ−Ｉｎ５抗原画分を０．１１ｖｌｌ’Ｂ
Ｓ緩衝液に透析した後、塩化セシウムを１．２　＆／ｍ
ｌ　の一度となるように加えて、Ｂｃｃｋｍａｎ　５Ｗ
−２８で２５、ＯＣｌＯｒＰｍ、１０℃で６０時間超遠
心しｍｌ縮・精製されたＮＢｓ抗原を得る。

各工程までのＮＢｓ抗原の回収率（対粗抽出液中１１Ｂ
ｓ抗原量）、及び精製度を表わす比活性値の比（対粗抽
出液）を第１表に示す。

ハイドロキンアパタイトクロマト溶出画分の精製度は６
３７倍に及び、本方法か極めて精製効果か高いことを示
している。

第１表 注）　１−ｉＴＰ画分：ハイドロキンアパタイトクロマ
トグラフィー画分 なお、各工程のサンプルにつきプロテアーゼ活性をＰｒ
ｏｔｅａｓｅ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｇｅｌ　１’ａｂ
ｌｃｔｓ　（Ｂｉ。

Ｒａｄ社）をハ］いて測定した、その結果粗抽出液はト
リプシン含量約８００μ９７ｍ１相当のプロテアーゼ活
性があったか、硫安塩析沈殿は間約５０μＩ／−の活性
であり、ハイドロキンアパタイトクロマトグラフィー画
分は全く活性か存在しなかった。

実施例２ 組換、ｊ　ｎ　ｆｉｌサツカロミセス・セレヒソエ甜２
２／１’Ａ１１２Ｑ３　（特願昭５７−１４２４６（Ｊ
号を参照）を培養後、遠心により釆菌した菌１イ、（１
００ｇ）に、０．１　Ｍ酸緩衝液（ｐＨ７，２）５ｕｕ
−を加え、これを約９０分間、Ｉ　Ｕ　’Ｃ以下にて超
音波処理にかけ菌シＩ・を破壊する。

遠心により菌体（ｌｌ）片を除き粗抽出液を得る。次い
て、Ｉ）ＨメーターでｐＨをチェックしながらこの粗抽
出液に塩酸を滴下しｐＨを約５．２に１ＪｒｌＪ整する
。４℃で約３０分間攪拌した後、遠心により沈殿物を除
去する。遠心上清にアンモニア水を加えテｐＨを約７．
ｕとした後、０．１Ｍリン酸緩独」ｌ夜（ｐＨ７，２）
で３〜５倍に希釈する。次いて、同じ緩衝液で平衡化し
ておいたハイドロキシアパタイトカラムに超液し、１−
ＩＢｓ抗原を吸着さぜる。ｉｆｌ衡化緩衝液て充分に洗
浄した後、約３ＵＬ１ｍｌの０．２へ４リン酸緩衝液（
ｐＨ７，２）を前液して吸着している夾雑物を溶出する
。次に約　３００ｍ１の０．５　Ｍ　’Ｊン酸緩衝液（
ｐＨ７，２）を通液し、ＨＢｓ抗原を含む画分を回収す
る。

以下実施例１と同様にして、蔗糖超遠心およびＣｓＣｌ
　超咲心を実施し、精製１−ｆＢｓ抗原を得る。

各工程までのＨＢｓ抗原の回収率、精製度を第２表に示
す。

実施例１における、蔗糖超遠心画分および実施例２のＣ
ｓＣ１超遠心画分の各ザンプルを、Ｓ■）Ｓ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動分析にかけたところ、いずれも
団り抗原の構成サブユニット蛋白質である分子量約２４
，０００　の単一ハンドを示し、きわめて高純度なもの
であった。

特許出願人　財団法人化学及血清療法ｍ［究所代理人弁
理士青山　葆ほか１名 手続補正書（し恨〕 ］　事件の表示 昭和５８年特許願第　１８６１８７　号２発明の名称 １１Ｂｓ抗原のｉｉ’ｊ製方法 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　熊不県熊木市清水町太窪６６８番地名称　財団法
人化学及血清療法４ｉ１Ｆ究所４代理人 手続補正書（ｌ牧） 昭和５９年５　月　９１」 チ 特許庁長官　殿 １事件の表示 昭和５８年特許願第　１８６１８７　号２発明の名称 ■旧３Ｓ抗原の精製方法 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　熊本県熊本市清水町大窪６６８番地名称　１し団
法人化学及血清療法研究ノッｒ４代理人 ５補正命令の日付　自発 ７　補正の内容 明細よ（昭和５９イト２月９１−１イ・］ｆ′−鯖袖Ｉ
Ｉよにで提出のもの）の下記箇所を補ｊｉ−Ｕる。

（１ン第？は２０行：（−１卒酋′ｔの１を［Ｊ）１′
茅、１の１と補ｊＦ。

（２）第５頁１′１行：［絹１９λ１を［９１１換え体
」と補正１゜ （，３）　Ｗｊ６頁８？＋　：　Ｎ−１１３ｓ抗１６ｊ
　’Ｃｒ右ｌ　ノｉｌ’＋とに「材料」を挿入。

（７′Ｉ）第７Ｅｒｉ　Ｉ　ＩＩ　ｔｉｉＬ３．Ｊ：Ｕ
　１　！’ｉｉ’ｉ　：　ｒ絹み換工１）Ｎ△」および
「組み換え（４１」をされそれ［組換え１）　Ｎ　Ａ　
Ｊおよび「ｌ１ｆＪ換え１本」どン山１■−６（５）第
８ｖ（８イーＴ　：　［７、／　イーーｔイー　１を１
アフイニｉイ」と補ＩＦ０ （（３）第８い１Ｇ行：「であく：）１、」のあとにつ
き゛の文ト；を挿入。

「該組換えイホ山来ｌ−ｌ　Ｂ　ｓ抗１京（よ、粗挽え
Ｉ）ＮΔ技術を用いて、Ｂ型肝炎ウィルスのＤＮＡから
取出されたｌ−Ｉ　Ｂ　ｓ抗原をコー１−りる逍仏了を
・大腸菌、酵１′８１．！！ＩＪ物培養細胞などに尋人
し、形質転換さけ、ＨＢ　Ｓ　ＩＡ原原遺吊子１すｊが
ぜてｌ−１＋３　Ｓ抗Ｂ：ミを１１１１さけることによ
り１１ノら１＋るもの（あ−）て、Ｊｌ）らの方法はづ
てに公５．ａである。（９１ｊえ（」、相換え酵し］由
来のＨＥ’ｒ　ｓ　）Ａ原のｑ二成法としく（３Ｌ、ハ
レンス［）の方法［Ｖ　ａｌｅｎｚｕｅｌａ、Ｎ　ａｔ
ｕｒｅ、　２　！１　Ｐ＋　、　３４７＜１９８２）、
待聞昭５８−７°７８２３Ｆ３　’、ｉ　、　−？：之
Ｉｉｋらのｂｉ人［Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａｔ　ｌ　、△
ｃ；＋ｄ　Ｓｏｉ　、　、　ＩＪ　ｓ△、化工、１　（
１９８３）　、’ｌ’＋１９１１１１ｉｔ、’）７−１
４２４（ｉｏ号１、ヒララマンらのｙｊ法［ｉｌ　ニア
ｅｎｌａｌｌ。

Ｎ　ｕｃｌｃｉｃ　Ａ　ｃｉｄｓ　Ｒｏｓ（！（＋ｒｃ
ｌ＋、↓二しＮ−））、２７４５（１９８３）、特開１
１８５８−１０９／ｌ　２７シ〕１など、組換え動物細
胞由来の１１］３δ抗１東（ｈ／１八にン人とじＣ１野
萌らの方法Ｉ　ｕ：　３０回［−１本ウィルスを会総会
、演説抄録１１１０６ε）　（１９８２）　、　ｌｓ＋
願昭５７　１４　ｂ　Ｏ９２Ｌｊ　］　／丁どの１．１
か、ｉ′＋　ＩＦＩ　１ｌｉ１５８−５６６８５号、特
開昭５８−０りＪｌ）シ′Ｊｄｉ　、Ｊ、ひ９Ｊｊ間昭
５７−３９７８／Ｉ昼４１とに１並載のツノ（）、が挙
げられる。」 （７）第１２員１／１行；Ｉ’（Ｉ！！／ｊが」のあと
に、「）８出される。」を挿入。

（８）第１３貞１８？ｊ：Ｍ’；Ｌ・（１のあとに１良
θ１４１］を挿入。

（１））第一１１ｊ’Ｎ７行、Ｉ−絹変；４：組換Ｊと
袖１−８ Ｌスに 手続補正書（１啄） 昭和５９年１０月１５］」 昭和５８年特許願第　１８６１８７　号２発明の名称 １−Ｉ　Ｂ　ｓ抗原の精製方法 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 注所　熊本県熊本市清水町人窪６６８番地名称　財団法
人化学及血清療′別研究所４代理人 ７補正の自答 （Ｉｌ明薊書（ＩＥ和５９年２月９１」イー１−Ｔ続ソ
１１１正書にて提出のもの）の発明の詳細な説明の根・
１中、下記箇所を補正する。

（１）第１０頁１５行、「ＡＬ１３ＩＯＣＩ　ＩＩ弘４
．ｊト、９ルｅ［ＣＡＬＢＩＯＱ−ＩＥＭ、　ｊ　と補
正。

（２）第１１頁５行「調整時」とあるを「調製時」と補
正。

（３）第１４頁１４イ１、「フ１１１−ス」とあるを「
セフマロース」と補正。

（４）第１，８頁下から８行、「（１３ｉｏｊ　とある
をｒｔＢｉｏ−」と補正。

（５）第１９頁３行、「０１Δ１酸」とあるを「０１Δ
１リン酸」と補正。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （ｌｌ　ＨＢｓ抗原を精製するにあたり、ＨＢ　＠抗原
   原材料を酸添加処理し、つぎに硫安塩析を行うかまたは
   行わないで、続いてハイドロキシアパタイトゲル・アフ
   ィニティクロマトグラフィーを行うことを特徴とするＨ
   Ｂｇ抗原の精製方法。 ＋２１　）Ｉｎｓ抗原が、組換えＤＮＡ手法により形質
   転換されＨＢｓ抗原産生能を付与された組換え体によっ
   て発現生成されたものである前記第（１）項記載の方法
   。 １３）　ＨＢｓ抗原原材料が、組換え体細胞を超音波破
   砕、グラスビーズ破砕、マントン・ゴーりン破砕、ある
   いは界面活性剤処理等に、より破壊して得られるＨＢｓ
   抗原粗抽出物である前記第（１）項記載の方法。 （４）　酸添加処理が、ＨＢｓ抗原原材料に酸を加えて
   夾雑蛋白質、および脂質を沈殿として分離することであ
   る前記第（１）項、ｌｉじ載の方法。 （５）酸添加処理に用いる酸が、塩酸、硫酸、燐酸、酢
   酸、シュウ酸の中から選ばれる少くとも１種である前記
   第（１）項および第（４）項占己載の方法。 （６）ハイドロキシアパタイトゲル・アフイニテイクロ
   マトグラフイーにおいて段階溶出または一度勾配溶出を
   行う前記第（１）項記載の方法。 （７）　ＨＢｓ抗原原材料を酸添加処理し、つぎに硫安
   塩析を行うかまたは行わないで、続いてハイドロキシア
   パタイトゲル・アフイニテイクロマトグラフイーを行い
   、プロテアーゼ活性物質を完全に除去したＨＢｓ抗原を
   得る前＆じ第（１）項記載の方法。 （８）組換え体が、組換え大腸菌または組換え酵母菌で
   ある前記第（２）項記載の方法。