JPH0743385B2

JPH0743385B2 - 梅毒抗原の製造法

Info

Publication number: JPH0743385B2
Application number: JP2067986A
Authority: JP
Inventors: 耕平永原; 文雄石川
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1990-03-16
Filing date: 1990-03-16
Publication date: 1995-05-15
Anticipated expiration: 2010-05-15
Also published as: EP0447322A2; EP0447322A3; EP0718627B1; EP0718627A1; CA2038423A1; DE69132257D1; DE69132257T2; CA2038423C; DE69131431D1; AU7290891A; JPH03267760A; AU646023B2; EP0447322B1; DE69131431T2

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は梅毒感染の診断を行う診断試薬に用いられる梅
毒トレポネーマ（病原性Treponema Pallidum Nicols、
以下TPと略する。）抗原の製造法に関する。更に詳しく
は、特異性が高く、梅毒初期感染を高感度に検出しうる
梅毒検査用試薬の製造を可能とする抗原の製造法に関す
る。

〔従来の技術〕

TP菌を直接抗原として用いて患者血清中の抗梅毒トレポ
ネーマ抗体（以下TP抗体）との抗原抗体反応を利用する
検査法が行われており、その中では富沢らによって開発
されたTPHAテストが鋭敏性、特異性、操作の簡便性等の
利点から現在広く用いられており、梅毒の代表的な臨床
検査法として行われている。

上記方法において用いられているTP菌由来抗原は、従来
はTP菌を家兎睾丸で培養したものから採取した菌体を適
当な緩衝液に懸濁し、ホオジナイザー処理、超音波処理
などによってTP菌体を破砕し、直接あるいはこれを可溶
化して抗原感作用抗原液として用いていた。

しかしながら、従来技術には以下のような問題点があ
る。

従来の梅毒トレポネーマ菌由来の抗原を感作した担体を
用いた梅毒検査用試薬には初期梅毒の診断が不確実であ
る欠点があった。即ち、梅毒感染後２〜３カ月まではTP
HAテスト等の検査用試薬では陽性にならないことが多い
ため、初期梅毒をも確実に診断するためには、非特異反
応は多くても初期梅毒に対する鋭敏性の高い脂質抗原法
を併用しなければならないという実用上の多きな問題点
があった。

TPHAのような抗原抵抗反応を利用した梅毒抗体検出法に
おいて、後期抗体（Ig−Ｇ）に比較して初期抗体（Ig−
Ｍ）に対する抗原感作担体の感度が低かったのは担体に
感作する抗原の純度が原因であった。即ち、従来のTPHA
テストにおいて動物赤血球の感作に用いられていたTP抗
原原液は製法上必然的に不純物が多く、不純蛋白の90％
以上がTP菌を培養した家兎睾丸由来の不純物や抗原性の
ない菌体由来の蛋白である。そのため、不純物画分が抗
原画分に比べかなり高い分量で混入しているので、従来
の抗原では初期抗体（Ig−Ｍ）を検出できなかった。

従来のTPHAテストに用いていた抗原は、その製法上非特
異反応の原因となる家兎組織由来の成分の混入を避ける
ことはできない。そのためTPHAテストでは非特異反応を
抑えるために、TPHAテストの緩衝液に家兎組織由来成分
を添加することにより、比検血清中の異好抗体を吸収す
るようにしなければならなかった。

上記の問題点を解決するための技術として、特開昭58−
71457号公報に梅毒トレポネーマ菌培養物のうち比重1.0
1以下の画分を除去した抗原含有物を用いる例が記載さ
れている。

しかし、上記の比重の差による分画法では兎組織とTP菌
体由来の抗原分画を厳密に分けることは困難であり、上
記の方法で抗原を精製してもかなりの兎組織由来の不純
物が混入してくる。また、上記の方法は、TP菌体破砕後
であっても、適用可能であると述べられているが、この
方法では密度勾配に用いているジアトリゾエイトナトリ
ウムなどの抗原液への混入は避けられず、またその後こ
れを除去する工程が必要であり、菌体破砕後にはこの方
法は適用できない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、梅毒トレポネーマ菌由来の抗原の製造法にお
いて、上記担体に担持する抗原の中に不純物分画が多く
共存するという問題点を解決するものであり、その目的
とするところは、後期梅毒と同様に初期梅毒も検出で
き、非特異的反応の起こらない梅毒検査用試薬の製造を
可能にする梅毒抗原の製造法を提供することを目的とし
ている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の梅毒抗原の製造法は梅毒トレポネーマ菌由来の
抗原の製造法において、梅毒トレポネーマ菌体由来抽出
物から陽イオン交換体によって不純物を吸着除去した蛋
白抗原を、非イオン性界面活性剤を含有する溶液中にお
いてハイドロキシアパタイトゲルに吸着させ、溶出させ
ることを特徴とするものであり、そのことにより上記目
的が達成される。

上記の目的を達成するために本発明のTP菌由来抗原精製
方法は以下のような手段をとった。即ち、まず公知の方
法によりTP菌体を培養し、集菌する。次に菌体を緩衝液
に懸濁し、冷却破砕したものを可溶化することによりTP
菌体由来抽出物を得る。次いで陽イオン交換体によって
あらかじめ前処理を行うことにより不純物を除去する。
それからハイドロキシアパタイトゲルによるTP抗原精製
を実施する。

本発明法においては、まずTP菌体由来抽出物より、好ま
しくはpH5.0〜8.0、イオン強度2mM〜30mMで、更に好ま
しくはpH5.5〜7.0、イオン強度10mM〜20mMでハイドロキ
シアパタイトゲルに抗原を含む蛋白を吸着させる。

次いで、好ましくはpH5.0〜11.0、イオン強度10〜360m
M、更に好ましくはpH5.5〜10.0、50〜120mMの範囲で溶
出させることにより得られる分画を梅毒抗原とする。

ハイドロキシアパタイトゲルは製法、またはメーカーに
よってその特性が異なることがある。したがって本発明
を効果的に実施するには、使用するゲルの特性に応じて
適当な条件を選択する必要がある。

即ち、本発明は陽イオン交換体およびハイドロキシアパ
タイトゲルによって抗原蛋白以外の蛋白を除去する工程
を付加して、精製したTP抗原を感作用原液に用いたとこ
ろに特徴がある。

本発明に用いるTP菌体由来抽出物の取得方法は次の通り
である。

１）菌体の選択、培養、集菌 TP種菌は、例えばWHO病原性標準ニコルス株あるいは各
検査機関が梅毒検査用に使用しているTP菌をそのまま用
いればよい。なお、WHO病原性標準ニコルス株は例えばC
DC（Center for Disease Control,Public Health Servi
ce,U.S.Department of Health,Education and Welfare,
Atlanta Georgia）から容易に入手することができる。
また、本発明におけるTP菌の培養方法、培養物からの集
菌方法および菌体処理方法は、公知の方法の中から任意
に採用することができる。

２）TP菌体の破砕、可溶化方法次に、集菌した菌体を緩衝液に懸濁し、冷却破砕後可溶
化することによりTP菌体由来抽出物を得る。その方法は
一般に知られている方法の中から適宜選択すれば良い。
破砕方法はホモジナイザー処理、超音波処理、凍結融解
法などが用いられる。可溶化方法は界面活性剤、カオト
ロピックイオンや尿素およびアルカリによる蛋白の可溶
化処理、酵素処理、自己融解法などが用いられる。これ
らの中では、とくに低イオン強度の緩衝液に非イオン系
または両性の界面活性剤を加えた溶液を使用する可溶化
処理が適している。

３）前処理本発明においては、TP菌体由来抽出物からあらかじめ不
純物を除去するために前処理を行う。

前処理法としては、イオン交換クロマトグラフィーによ
る粗精製であり、陽イオン交換体を用いて抗原画分以外
の画分をあらかじめ除去する。

以下、本発明におけるハイドロキシアパタイトゲル処理
を実施するのに当たって好ましい形態を説明する。しか
し、本発明はそれらに制限されるものではない。

１）溶液の種類用いる溶液は、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グ
リシン緩衝液など一般の生化学実験に用いられるところ
の緩衝液ならば広く使用できるが、好ましくはリン酸緩
衝液が挙げられる。

２）溶液のpH 抗原の吸着 pHの範囲は、好ましくはpH5.0からpH8.0まで、更に好ま
しくは5.5から7.0である。pH5.0未満になると、抗原性
が失われ易くなるため、TP抗原の回収率が低下する。ま
た、pH8.0を超えると、ゲルに対する蛋白質の吸着効率
の低下のため、収率が低下する。

抗原の溶出好ましくはpH5.0から11.0まで、更に好ましくはpH5.5か
ら10.0である。とりわけpH8.0以上の緩衝液を用いる場
合は、イオン強度10〜60mMの緩衝液で溶出が可能であ
る。

pH5.0未満であると、抗原性が失われ易くなるため好ま
しくない。また、pH11.0を超えると、抗原とともに不純
物も溶出され易くなるので好ましくない。

３）溶液のイオン強度抗原の吸着ハイドロキシアパタイトゲルにTP菌体由来抽出物を吸着
させるときは、好ましくは2mM〜30mMのイオン強度で、
更に好ましくは10mM〜20mMのイオン強度でハイドロキシ
アパタイトゲルに抗原を含む蛋白を吸着させる。

イオン強度が2mM未満であると、不純物がハイドロキシ
アパタイトゲルに吸着され易くなる。更に、緩衝液の緩
衝能が低下するので実用的でない。また、30mMを超える
と、抗原がハイドロキシアパタイトゲルに吸着されにく
くなり収率が低下する。

抗原の溶出溶出の際のイオン強度は、好ましくは10〜360mM、更に
好ましくは50〜120mMである。イオン強度が10mM未満で
あると、酸性側のpHでは溶出されにくい。また、360mM
を超えると不純物も溶出されてくるので好ましくない。

４）溶液への添加剤吸着および溶出に用いる溶液に添加剤として、TP菌体の
可溶化に使用できる界面活性剤である非イオン性界面活
性剤を添加する。

５）応用範囲本発明で得られた抗原は、被検血清中の対応する抗体を
検出する用途に使用される。検出方法は、ニワトリ赤血
球、ヒツジ赤血球等の各種動物の赤血球、ラテックス等
の合成高分子担体またはシリカなどの無機材質の担体等
に該抗原を固定したのち、抗原抗体反応に基づく凝集反
応によって測定するもののほか、プラスチックビーズ、
プラスチックプレートなどの合成高分子などに該抗原を
固定化して測定するEIA、FIA法などに用いることが可能
である。その他抗原抗体反応に基づく検査に用いうるも
のであればいかなるものであっても本発明の方法に適用
しうる。

また、本発明で得られた抗原は、ワクチンにも使用可能
である。

６）抗原の精製度本発明による方法では、ハイドロキシアパタイトゲルへ
の吸着が抗原蛋白と同じ挙動を示す抗原活性のない蛋白
等が抗原に混入するかもしれないが、実際には殆ど純粋
な抗原を得ることが可能である。抗原以外の蛋白が混入
したとしてもごく微量であり、実用上の問題はない。

〔作用〕

TP菌体由来抽出物をハイドロキシアパタイトゲルに低い
塩濃度の緩衝液中で接触させると抗原がゲルに吸着し、
ある範囲内の塩濃度で抗原がゲルより溶出されて抗原純
度の高いものが得られる。

〔実施例〕

以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説明する。但
し、本発明は、これら実施例に限定されるものではな
い。

実施例１抗原精製法本発明によってTP抗原を精製した。

1.試薬等１）緩衝液１−１）リン酸塩緩衝液（pH6.5）（以下PBS）：リン酸
二水素カリウムとリン酸水素二ナトリウム（12水和物）
と塩化ナトリウムより、リン酸濃度0.36M、NaCl濃度0.1
56M、pH6.5の緩衝液を調整し、NaN₃を0.1％（w/v）とな
るように添加して調製した。

１−２）１％BSA/PBS:ウシ血清アルブミン（BSA、マイ
ルス・ラボラトリーズ社製）をPBSに１％（w/v）となる
ように溶解した。

１−３）10mMリン酸カリウム緩衝液（以下KPB）（pH6.0
およびpH7.0）： 10mMリン酸二水素カリウム溶液、10mMリン酸水素二カリ
ウム溶液を混合してpH6.0およびpH7.0に調整した。

１−４）350mM KPB（pH6.0）： 350mMリン酸二水素カリウム溶液、350mMリン酸水素二カ
リウム溶液を混合してpH6.0に調整した。

２）界面活性剤オクチルグリコピラノシド（１−Ｏ−
ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）（以下OGと
略す）：難溶性タンパク質研究用（ナカライテスク社
製）を使用した。

３）蛋白精製用クロマトグラフィーゲル３−１）陽イオン交換体Ｓ−Sepharose Fast Flow（ファルマシア社）を使用し
た。これはアガロースゲルの表面にスルホン酸基が導入
された陽イオン交換体である。

３−２）ハイドロキシアパタイトゲルバイオゲルHTP（バイオラッド）およびHCA−200L（三井
東圧化学）を使用した。

４）TP菌体以下に述べる方法によって培養採取したも
のを用いた。

病原性標準ニコルス株トレポネーマ・パリダムの6.0×1
0⁷ヶ/mlの懸濁液を家兎睾丸実質１個当たり、1mlずつ接
種した。10日間培養後、家兎10羽より睾丸を採取し、ミ
ンチ後、2.2％クエン酸ナトリウム溶液500mlにて37℃30
分振とうし、増殖したTP菌を抽出した。抽出液を200×
ｇで５分間遠心し、兎組織の沈澱を除去し、上清を3000
×ｇで30分間遠心分離し、TP菌を沈澱させた。得られた
TP菌体をPBSでくり返し洗浄した後、PBSに懸濁して暗視
野顕微鏡を使用して菌数計算後１×10⁹ヶ/mlに調整し、
これをTP菌体懸濁液とした。この菌体懸濁液を暗視野顕
微鏡で観察し、兎精子および兎組織の混入が認められな
いことを確認した。

５）蛋白濃度測定用試薬:BCA Protein Ass ay Reagent
（PIERCE社）を用いた。

６）マイクロタイタープレート：ヌンク社の96穴マイク
ロプレート（Ｕ底）を用いた。

７）TP抗原感作血球：市販TPHAキットであるセロクリッ
トTP（化学および血清療法研究所）に使用されているも
のを使った。

８）梅毒陽性家兎血清：トレポネーマ・パリダムを家兎
睾丸中で45日間培養した家兎から血清を採取して使用し
た。抗体価を市販TPHAキットで測定したところ102,400
であった。１％BSA/PBSで希釈して使用した。

2.実験方法２−１）TP菌体より抗原の可溶化及び抽出 TP菌体懸濁液10mlに対しPBS50mlを用いて洗浄を３回行
ってからPBS20mlに懸濁した。この懸濁液を超音波破砕
機で処理し、TP菌体を破砕した。これを12,600×ｇで30
分遠心して沈澱を取った。

沈澱は10mM KPB pH7.0で12,600×ｇで30分間の遠心洗浄
を２回繰り返した後、OGを１％（w/v）含む10mM KPB pH
7.0を25ml加え、沈澱をよく懸濁した後、軽く超音波破
砕して可溶化した。４℃で16時間以上放置してから50,0
00×ｇで１時間遠心分離し、得られた上清を0.22μｍの
フィルター（ミリポア社製、商品名マイレクスGS）で濾
過した。このようにして得られたTP菌体由来抽出物を、
以下抽出抗原と称する。

２−２）前処理（１）抗原の透析抽出抗原はpH7.0の緩衝液に溶解されているので、これ
をpH6.0の緩衝液に透析した。透析液：抽出抗原液＝４
容:1容の体積比で行い、透析外液を３度以上交換した。
最終透析の後、透析外液のpHを測定し、pH6.0±0.1の範
囲にあることを確認した。

（２）Ｓ−セファロースゲル30mlを充填したカラム
（ファルマシア社、SR25/45）に（１）の抗原を通し、
素通り画分50mlを抗原分画として回収した。（以下これ
を粗精製抗原と称す。）２−３）ハイドロキシアパタイトによる抗原の精製（１）ハイドロキシアパタイトゲルの洗浄ハイドロキシアパタイトゲル8mlをカラム（ファルマシ
ア社、HR10/10）に充填した後、pH6.0の１％OGを含む10
mM KPBで平衡化した。洗浄液のO.D.280を測定し、吸光
度が0.010に低下するまで洗浄した。

（２）粗精製抗原の添加ハイドロキシアパタイトカラムに粗精製抗原を添加し、
添加後pH6.0の１％OGを含む10mM KPBをカラムに流し、
O.D.280での吸収が0.010以下になるまで、カラムを洗浄
した。このときの分画を素通り分画とした。

（３）抗原の溶出 pH6.0の１％のOGを含む10mM KPBに対して１％OGを含む3
50mM KPBの比率を０から40％まで徐々に増加させ、リニ
アグラジェントで溶出させた後、350mM KPBの比率を100
％にあげ溶出させた。350mM KPBの緩衝液の比率が０−
８％、８−16％、16−24％、24−32％、32−40％の溶出
分画をそれぞれ集めた。350mM KPB 100％で溶出された
分画を集め、これを40％以上分画とした。

（４）各フラクションのアッセイ素通り分画、０−８％分画、８−16％分画、16−24％分
画、24−32％分画、32−40％分画、40％以上分画の各フ
ラクションの抗原活性、蛋白濃度を以下の方法でもと
め、これより比活性を算出した。

２−４）抗原アッセイ法（１）蛋白濃度ローリー法の改変法の一つであるbicinchoninic acidを
用いた測定法（Smith,P.K.,Krohn,R.I.etc.（1985） An
al.Biochem.150,76−85.）を原理とするBCA Protein As
say Reagent（PIERCE社製）によって測定した。スタン
ダードは１％OGを含む10mM KPBにBSAを溶解したものを
用い、単位は（μg/ml）で示した。

（２）抗原活性１％BSA/PBSをマイクロタイタープレートの各ウェ
ルに25μずつ滴下する。

各抗原フラクションをマイクロタイタープレートの
手前側のウェルに25μずつとり、これをプレート上で
１％BSA/PBS溶液により倍々希釈してゆく。

抗体価を50に希釈した梅毒陽性家兎血清を、で倍
々希釈した抗原に加えて混合する。

室温で30分以上反応させる。このときプレートの手
前側の抗原濃度の高いウェルの抗体は抗原と結合して消
費されてしまうが、抗原濃度の低いウェルの抗体は消費
されずに残る。

次に各ウェルにTP抗原感作血球を加え、消費されず
に残っている抗体と凝集反応を起こしたウェル中の家兎
活性の最終希釈率（8,16,32,・・・）をもって抗原活性
とし、これをタイター（titer/ml）と称する。

抗原比活性は抗原活性を蛋白濃度で割った値で示
し、単位は（titer/μｇ）で示した。

抗原活性を示した分画のうち、比活性12titer/μｇ
以上を示した分画を集め、蛋白質濃度50μg/ml以上にな
るまで、セロファンチューブ（和光純薬工業）を用いて
減圧下で濃縮した。これによって得られた分画をHAp精
製抗原と称す。

3.結果バイオゲルHTPおよびHCA−200Lを用いて抗原精製を行っ
たが、その操作は全く同じように行った。上記のフラク
ションのほか、抽出抗原、粗精製抗原でも蛋白濃度およ
び抗原活性を測定し、総抗原活性、総蛋白量、抗原比活
性を算出した。その結果を表１に示す。

4.結論第１表の結果から明らかなように、TP菌対由来抽出物を
ハイドロキシアパタイトゲルに吸着させた後、一定の範
囲の塩濃度で溶出させると、バイオゲルHTPでは塩濃度
８％（37.2mM）から40％（146.0mM）までの範囲で溶出
される分画に抗原が溶出され、HCA−200Lでは塩濃度８
％（37.2mM）から32％（118.8mM）までの範囲で溶出さ
れる分画に抗原が溶出され、これらを集めることによっ
て抗原比活性が、それぞれ26.6、36.7（titer/μｇ）の
高純度のTP抗原が得られた。

参考例１ SDS−PAGEによる蛋白純度の確認 1.材料１）電気泳動装置:PhastSystem（ファルマシア社）を使
用し、操作方法はその説明書に減った。

２）分子量マーカー:LMW kitE（ファルマシア社）を使
用した。

３）資料処理用緩衝液:10mM Tris−HCl,2mM EDTA（pH8.
0）にドデシル硫酸ナトリウムを５％、メルカプトエタ
ノールを10％となるように添加して調製した。

４）ポリアクリルアミドゲル:PhastGel Gradient 10−1
5（PhastSystem用）を使用した。

５）染色液：電気泳動用高感度銀染色液セット「シルベ
ストステイン」（ナカライテクス社製）を使用し、操作
方法は説明書に従った。

2.操作方法１）試料の調製：実施例（１）で得られた抽出抗原、粗
精製抗原またはHAp精製抗原と試料処理用緩衝液を等量
ずつ混合し、100℃で５分間インキュベートした。

２）分子量マーカーの調製：分子量マーカーは、精製水
で２倍希釈した試料処理用緩衝液に溶解し、100℃で５
分間インキュベートして用いた。

３）上記の調製済試料をポリアクリルアミドケルの上に
１μずつのせ、電気泳動を行った。

４）泳動後、ポリアクリルアミドゲルを染色し、分子量
マーカーの位置より蛋白質の分子量を算出した。

3.結果抽出抗原は20本程度のバンドが観察されたが、粗精製抗
原では10本程度、HAp精製抗原では３本のバンド（分子
量31,000、41,000、47,000付近）が観察された。

4.結論結果から明らかなように、ハイドロキシアパタイトゲル
を用いることによって極めて純度の高いTP抗原が得られ
た。

応用例１ TPHA 本発明で得られた精製抗原を用いて羊赤血球に担持さ
せ、TPHA法での本発明の効果を確認した。

1.材料特に示さない限り、実施例１と同一名の試薬および緩衝
液は実施例１と同じように調製した。

１）緩衝液（１） 0.15Mリン酸緩衝液（pH7.4）:0.15Mリン酸二水
素ナトリウム（２水和物）および0.15Mリン酸水素二ナ
トリウム（12水和物）水溶液を混合してpH7.4に調整す
る。

（２）生理食塩水:9.0gの塩化ナトリウムを1000gの精
製水に溶解したもの（３） McIlvaine緩衝液、（以下McIと略す）:0.10Mク
エン酸と0.20Mリン酸水素２ナトリウム（12水和物）を
混合し、pH6.5になるように調整したもの。

（４）１％OG/McI:McIにOGを１％（w/v）溶解したも
の。

（５） PHA緩衝液以下の溶液および試薬を混合して作成した（緩衝液1000
mlあたりの量）。

兎正常血清 30ml 羊赤血球ストローマ 10ml アジ化ナトリウム 1g 0.15M リン酸ナトリウム緩衝液pH7.4 100ml 生理食塩水 860ml ２）試薬等（１）タンニン酸ナカライテスク（株）から購入し
た。

（２）固定羊血球羊赤血球をグルタルアルデヒド固
定処理したものを用いた。

（３）市販TPHAキット：セロディアTP（富士レビオ）およびセロクリットTP（化血研）を使用した。

３）検体（１）梅毒陽性検体：十分治療した後期梅毒検体でIg
−Ｃ抗体が多く含まれる３検体で（G₁、G₂、G₃）（およ
び感染後３〜５週間の初期梅毒でIg−Ｇ抗体があまり産
生されておらずIg−Ｍ抗体が多く産生されている３検体
（M₁、M₂、M₃）を用いた。

（２）梅毒陰性検体:3検体（N₁、N₂、N₃）を用いた。
いずれも市販のTPHAキットで非特異反応の見られた検体
で、FTA−ABSで梅毒陰性であることが確認された検体で
ある。

（３）抗家兎組織抗血清：正常家兎睾丸をミンチ後、
１％OGで可溶化したものを山羊に免疫して得た。

（４）抗Reiter株抗血清:Treponema phagedenis biot
ype Reiterの菌体成分を１％OGで可溶化したものを山羊
に免疫して得た。

４）TP抗原実施例１で得られた抽出抗原、粗精製抗原、HAp精製抗
原を用いた。各抗原液の抗原活性、蛋白濃度は第２票に
示したとおりである。

2.方法（１）血球調製法固定羊血球を生理食塩水で700×ｇで５分間の遠心
洗浄を４回行ってから、生理食塩水で固形分６％になる
ように懸濁した。タンニン酸を生理食塩水に溶解し、こ
れを血球懸濁液に加え、撹拌した。

撹拌終了後、生理食塩水で２回、McIで１回遠心洗
浄し、McIに固形分６％となるように懸濁し、直ちに抗
原感作に使用した。

TP抗原液（抽出抗原液、粗精製抗原液、HAp精製抗
原液）をあらかじめ１％OG/McIで透析した。この抗原液
を第３表のように調製し、抗原感作液とした。感作液Ａ
は抗原活性が100（titer/ml）になるように調製したも
のである。感作液Ｂは蛋白濃度が10μg/mlになるように
調整したものである。上記の血球懸濁液と第３表の抗
原感作液を等量混合し、25℃１時間撹拌した。

感作血球を２回生理食塩水で洗浄後、PHA緩衝液中
に血球固形分0.2％となるように懸濁した。常温で３時
間放置後、アッセイに用いた。

（２） TPHAアッセイ方法 PHA緩衝液をマイクロタイタープレートの手前側の
ウェルに100μずつ、それ以外のウェルに250μずつ
分注した。

各検体を手前側のウェルに25μずつ分注し、これ
をプレート上で倍々希釈した。一方、手前側のウエルか
ら、希釈検体液を75μ取り出すことにより、手前側の
ウエルに残った希釈検体液量を25μになるようにし
た。

（１）で作成した血球液をよく振って均一な浮遊液
としたものを各ウエルに75μずつ滴下した。

フレートの角を軽くボルテックスミキサーに当てて
十分に混合してから、蒸発を防ぐために空のプレートで
蓋をし、振動を与えないように注意して常温に静置し
た。２時間後判定した。

白紙の上にプレートを置き、血球凝集像を観察し、
肉眼で判定した。凝集を示した最高の希釈倍数（20,40,
80,・・・）を抗体価とした。

3.結果上記の方法によって得られた感作血球を用い、各検体の
血球凝集反応の有無および抗体価を測定し、第４表に示
すような結果を得た。

第４表より、まず抽出抗原を用いた感作血球では総て陰
性となる初期梅毒３検体について、本発明品のHAp精製
抗原を用いた感作血球はいずれも陽性をしめす。また、
市販TPHAキットで非特異的反応の見られた梅毒陰性３検
体では、凝集反応を示していない。さらに本発明品を用
いた感作血球は、抗家兎組織抗血清、抗Reiter株抗血清
とも凝集反応を示さなかった。

4.結論結果から明らかなように、本発明によって精製した抗原
を用いれば、初期梅毒でも検出可能であり、また、非特
異反応による偽陽性もみられない。

応用例２ラテックス試薬（全自動分析装置を用いた測
定法）梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体を定量する場合の本
発明の効果を全自動分析装置を用いてラテックス診断試
薬の凝集を測定することにより確認した。特に示さない
限り、実施例１、応用例１と同一名の試薬および検体は
実施例１、応用例１と同様に調製した。

1.試薬および検体の調製１）ラテックス：積水化学工業（株）製の0.400μｍの
ポリスチレンラテックス（固形分10％）を用いた。

２）PBS（pH7.4）：リン酸１ナトリウム（２水和物）、
リン酸２ナトリウム（２水和物）、塩化ナトリウムか
ら、0.02Mリン酸、0.15M塩化ナトリウムを調製した。0.
1％NaN₃を含む。

３）NaCl−PBS（pH6.5）：リン酸１ナトリウム（２水和
物）、リン酸２ナトリウム（２水和物）、塩化ナトリウ
ムから、0.02Mリン酸、1.00M塩化ナトリウムを調製し
た。0.1％NaN₃を含む。

４）100mM NaPB:リン酸水素２ナトリウム（無水）、リ
ン酸２水素ナトリウム（12水和物）より100mM NaPB（pH
7.50）を調製した。0.1％NaN₃を含む。

５）１％BSA−NaPB:100mM NaPBにBSAが１％になるよう
に調製したもの。

６）５％BSA−NaPB:100mM NaPBにBSAが５％になるよう
に調製したもの。

７）希釈液:5％BSA−NaPBにポリエチレングリコール
（平均分子量500,000:和光純薬）を0.25％（w/v）とな
るように溶解させたもの。

８）装置：日立7050型全自動分析装置を用いて測定を
行った。

2.方法１）抗原感作液の調製第２表に示した抗原価、蛋白濃度の各抗原液に、NaCl−
PBS、１％OGを含む10mM KPBをそれぞれ第５表に示した
量で混合したものを抗原感作液とした。感作液Ａは抗原
活性を250（titer/ml）になるように調整したものであ
り、感作液Ｂは蛋白濃度を約25μg/mlになるように調整
したものである。

２）梅毒抗原の固定化固形分10％のポリスチレンラテックス100μを４℃の
インキュベーター中でマグネチックスターラーで撹拌し
ながら、１）の梅毒抗原液400μを素早く混合し、４
℃にて１時間撹拌した。その後１％BSAを5mlを添加し、
４℃にて1.5時間撹拌した。その後、15000rpmで１時間
遠心分離した。得られた沈澱に、もう一度１％BSA−NaP
B5ml添加し、同様に遠心して沈澱を洗浄した。この沈澱
に１％BSA−NaPB5mlを添加し、よく分散して固形分が0.
2％のラテックス試薬とした。ラテックス試薬は４℃で
保存した。

３）測定条件測定条件を以下のように設定した。

試料容量 20μ（検体） R1容量 50μ（ラテックス試薬） R2容量 350μ（希釈液）波長 570nm ４）測定方法測定開始後、80秒後と320秒後の波長570nmの吸光度の差
をとり、O.D.570の変化量とした。

3.結果上記の方法によってTP抗原液より調製したラテックス試
薬を用い、各検体との反応をO.D.570での濁度の変化量
として測定したところ第６表に示すような結果が得られ
た。

まず、抽出抗原、粗精製抗原を用いたラテックス試薬で
は陰性となる初期梅毒検体について本発明品はいずれも
陽性と判定するのに十分な感度をしめす。また、市販の
TPHAキットでは非特異反応の見られた梅毒陰性３検体に
おいて、本発明品では非特異的反応は見られなかった。

さらに、本発明品を用いたラテックス試薬は、抗家兎細
胞抗血清、抗Reiter株抗血清とは陽性と判定されるよう
な値を示さなかった。

4.結論結果から明らかなように、本発明によって精製した抗原
を用いれば、従来の抽出抗原よりも反応性が大きい（す
なわち、感度が高い）。その結果、従来の抽出抗原では
検出できなかった初期梅毒でも検出できている。

また、市販のTPHAキットで検出できなかった初期梅毒も
検出できている。

また、従来の抽出抗原と異なり、非特異反応による偽陽
性がみられない。

応用例３ ELISAによる梅毒抗体アッセイ法本発明で得られた精製抗原を用いたELISA法で本発明の
効果を確認した。

1.試薬および検体の調製以下の試薬および検体を調製して用いた。ただし実施例
１、応用例１、２と同一名の試薬および検体は実施例
１、応用例１、２と同様に調製した。

（１） TP抗原実施例１で得られた抽出抗原、粗精製抗原、HAp精製抗
原を用いた。

（２）検体応用例１で使用したものを１％BSAで100倍に希釈して用
いた。

（３）ペルオキシダーゼ標識抗ヤギIg−Ｇマイルス・ラボラトリーズ社のペルオキシダーゼ標識抗
ヤギIg−Ｇ（ヒツジ由来）を１％BSA/PBSで1000倍に希
釈して用いた。

（４）ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIg−Ｇ及びIg−Ｍマイルス・ラボラトリーズ社のペルオキシダーゼ標識抗
ヤギIg−ＧおよびIg−Ｍ（ヒツジ由来）を１％BSA/PBS
で1000倍に希釈して用いた。

（５）マイクロタイタープレート：ヌンク社の96穴マ
イクロタイタープレート（ELISA用平底）を用いた。

（６）ペルオキシダーゼ基質：リン酸−クエン酸緩衝
液にｏ−フェニレンジアミン（２塩酸）を2mg/ml、過酸
化水素水を0.03％になるように溶解した。基質の調製は
使用直前に行った。

（７） 1N硫酸：濃硫酸を精製水で希釈して1N硫酸水溶
液とした。

2.方法１）TP抗原液の調製：応用例２と同様に各抗原液と１％
OGを含む10mM KPBとNaCl/PBSとを第７表に示した組成で
混合したものを用いた。

２）TP抗原の固定化マイクロタイタープレートに（１）のTP抗原液を50μ
ずつ分注し、室温で１時間インキュベートした。

インキュベート後、TP抗原液を吸引除去し、200μの
１％BSA/PBSで３回吸引洗浄した。吸引洗浄後、200μ
の１％BSA/PBSを加え、室温で１時間インキュベートし
ブロッキングを行った。ブロッキングが終わったプレー
トはすぐに抗原抗体反応に使用した。

３）抗原抗体反応第１抗体として、検体をそれぞれ１％BSA/PBSで100倍し
たものを100μずつ各ウェルに分注した。対照とし
て、抗原の代わりに１％BSA/PBSを添加したウェルにも
同様に検体を分注した。室温で１時間インキュベート
後、吸引除去し、200μの１％BSA/PBSで３回吸引洗浄
した。

吸引洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIg−Ｇ、抗ヒ
トIg−Ｍを初期梅毒検体、後期梅毒検体と梅毒陰性検体
を分注したウェルに、抗ヤギIg−Ｇを抗Reiter株抗血清
と抗家兎組織抗血清を分注したウェルに、100μずつ
分注して室温で１時間インキュベートした。インキュベ
ート後、各ウェルを吸引除去し、200μの１％BSA/PBS
で３回吸引洗浄した。洗浄後、すぐに各ウェルに結合し
た酵素活性を測定した。

４）酵素反応各ウェルに100μずつペルオキシダーゼ基質を添加
し、室温で15分間インキュベートした。基質ブランクと
して、抗原も第１抗体も第２抗体も含まないウェルにも
同様に基質を分注した。インキュベート後、1N硫酸を10
0μ添加し、酵素反応を停止させた。各ウェルの酵素
反応時間は一定になるように注意して行った。反応停止
後、マイクロタイタープレートリーダー（MTP−100,コ
ロナ社）により、基質ブランクを対照として492nmの吸
光度を測定した。

3.結果上記の方法によってTP抗原液を用いたELISA法により、
各検体との反応を492nmにおける吸光度を測定したとこ
ろ第８表に示すような結果が得られた。

即ち、まず最初梅毒３検体では、本発明品を用いること
によってIgMの検出感度が向上する。また梅毒陰性３検
体では抽出抗原では陽性値（OD0.057以上を陽性とす
る）を示すものがあるが本発明品では陽性値を示さな
い。

さらに本発明品のTP抗原は、抗家兎組織血清、抗Reiter
株抗血清とも陽性反応と診断されるような値を示さなか
った。

4.結論結果から明らかなように、本発明によって精製した抗原
を用いれば、従来の抽出抗原を用いたELISA法では、検
出できなかった初期梅毒でも検出可能であり、また非特
異反応による偽陽性は見られない。

参考例２イムノブロッティングアッセイによる抗原蛋
白の確認 1.試薬および試料特に示さない限り、実施例１、参考例１、応用例３と同
一名の試薬および試料は実施例１、参考例１、応用例３
と同じように調製した。

１）ブロッティング用緩衝液:25mMトリス、192mMグリシ
ン、20％メタノールを混合し、pH8.3であることを確認
した。

２）ニトロセルロースメンブレン（以下NCと略す。）：
バイオラッド社製のポアサイズ0.45μ、９×12cmシート
を使用した。

３）梅毒陽性血清：初期梅毒検体および後期梅毒検体は
それぞれプールしたものを使用した。

４）ペルオキシダーゼ基質:4−Chloro−１−Naphtol
（ナカライテスク（株）社製）10mgを氷冷したメタノー
ル3.34mlに溶解してから、クエン酸リン酸緩衝液（pH6.
0）16.66mlと混合し、使用直前に、30％過酸化水素水10
μを加えた。基質は用時調整した。

2.操作方法１）参考例１の方法と同様にして、抽出抗原、粗精製抗
原およびHAp精製抗原の電気泳動を行った。泳動済ゲル
は同じものを５種類用意した。

２）あらかじめNCをブロッティング用緩衝液に浸し平衡
化してから、１）のゲルの上に密着させ、ブロッティン
グ用緩衝液中で蛋白をゲルからNCへ電気泳動によって転
写した。

３）PBSで３回洗浄後、NCを３％BSAを含むPBS緩衝液に
浸し、ブロッキングを行った。

４）初期梅毒検体、後期梅毒検体、梅毒陰性検体、抗家
兎組織血清、抗Reiter株抗血清を１％BSA/PBSで100倍に
希釈し、各血清を上記のNCに転写された各抗原と反応さ
せた。

５）１％BSA/PBSで３回洗浄後、初期梅毒検体、後期梅
毒検体と梅毒陰性検体を反応させたNCをそれぞれペルオ
キシダーゼ標識抗ヒトIg−Ｇ、抗ヒトIg−Ｍを含む１％
BSA/PBS中に浸漬、反応させた。同様に抗Reiter株抗血
清と抗家兎組織抗血清を反応させたNCを抗ヤギIg−Ｇを
含む１％BSA/PBS中に浸漬、反応させた。室温で１時間
インキュベートした後、PBSで３回吸引洗浄した。洗浄
後、すぐに、各NCに結合した酵素活性をみた。

６）ペルオキシダーゼ基質を添加し室温でインキュベー
トした。適当なメンブレンノ発色像が得られたところ
で、メンブレンを脱塩水で洗浄後、乾燥させてから、発
色の位置、程度を観察した。

3.結果参考例１の結果にあるHAp精製抗原の３本のバンド（分
子量31,000、41,000、47,000付近）は、梅毒陽性血清と
のみ特異的に反応する蛋白であることが確認された。抽
出抗原、粗精製抗原では抗家兎組織血清、抗Reiter株抗
血清と反応するバンドが見られたが、HAp精製抗原では
見られなかった。

4.結論結果から明らかなように、ハイドロキシアパタイトゲル
を用いることによって得られたTP抗原は、梅毒陽性血清
とのみ特異的に反応する成分からなる純度の高い抗原で
ある。

〔発明の効果〕

本発明の梅毒抗原の製造法によれば、従来品に比し、極
めて純度の高い梅毒トレポネーマ抗原を得ることがで
き、該抗原を用いることにより、後期梅毒と同様に初期
梅毒も検出することが可能で偽陽性のみられない梅毒検
査用試薬を提供することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】梅毒トレポネーマ菌体由来抽出物から陽イ
オン交換体によって不純物を吸着除去した蛋白抗原を、
非イオン性界面活性剤を含有する溶液中においてハイド
ロキシアパタイトゲルに吸着させ、溶出させることを特
徴とする梅毒抗原の製造法。
【請求項２】吸着に用いる溶液のpHが5.0〜8.0でイオン
強度が２〜30mMである請求項１記載の製造法。
【請求項３】溶出に用いる溶液のpHが5.0〜11.0でイオ
ン強度が10〜360mMである請求項１又は請求項２に記載
の製造法。