JPS5871457A - 梅毒検査用試薬の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｐａｌｌｉｄｕｍ　Ｎｉｃｏｌｓ，以下ＴＰと略記する
）菌の破砕菌体を動物赤血球等の担体に感作し、得られ
た抗原感作担体を対応する抗体の存在によって凝集させ
る反応を利用して梅毒感染の診断を行う、いわゆるＴＰ
Ｂ古改良に関する。

をらに詳しくは、梅毒初期感染を高感度に検出しうる梅
毒検査用試薬の製造法に関する。

梅毒感染の検査法としては古くから脂質抗原法が用いら
れていたが、この方法は特異性が不足しており、そのだ
め近年ではＴＰ菌を直接抗原として用いて患者血清中の
ＴＰ抗体との抗原抗体反応を利用する検査法が多用され
ている。ＴＰ菌を抗原とする検査法としては、ＴＰ菌体
と直接反応した特異抗体の存在を螢光標識した抗ガンマ
ーグロブリン抗体で検出するＦＴＡテストが早くがら実
用化されたが、この方法は手段の煩雑さから普及率が低
く、その後富沢らによって開発されたＴＰＨＡテストが
鋭敏性、特異性、操作の簡便性等の利点から現在広く用
いられており、梅毒の代表的な臨床検査法として世界中
にその優秀性が認められている。

しかしながら、従来のＴＰＨＡテストには初期梅毒の診
断が不確実であるという欠点があった。すなわち、梅毒
感染後２〜３力月まではＴＰＨＡテストでは陽性になら
ないことが多い。そこで、初期梅毒をも確実に診断する
ためには、非特異反応は多いが初期梅毒に対する鋭敏性
の高い脂質抗原法を併用しなければならないという実用
上の大きな問題点があった。

本発明者らは、繰作が簡便であってかつ後期梅毒と同様
に初期梅提に対しても特異性と鋭敏性が高い梅毒検査用
試薬を開発することを目的として種々研究の結果、ＴＰ
ＨＡテストのごとき間接凝集反応を利用した免疫測定法
に用いる抗原感作担体を製造する場合に、抗原を担体に
感作するまえにあらかじめ抗原含有物から特定の不純物
を除去することによって、初期感染をも確実に検出しう
る試薬を製造しうろことを見出し、これに基いて本発明
を完成した。すなわち、従来のＴＰＨＡテストにおいて
動物赤血球の感作に用いられていたＴＰ抗原原液は製法
上必然的に不純物が多く、不純蛋白の９０チ以上がＴＰ
菌を培養した家兎華丸由来の不純物であったが、本発明
においては感作に先立ちこれら不純物のうち特に比重１
．０１以下の画分を除去した精製ＴＰ抗原原液を担体の
感作に用いることに特徴がある。

ＴＰ抗原原液の取得方法はいかなる方法でもよいが、Ｔ
ＰＨＡテストで慣用されている方法をそのままイ１なえ
ばよい。ＴＰ種菌には、例えばＷＨＯ病原性標準ニコル
ス株あるいは各検査機関が梅毒検査用に使用しているＴ
Ｐ菌をそのまま用いればよい。なお、ＷＨＯ病原性標準
ニコルス株は例えばＣＤＣ（Ｃｅｒ＋ｔｅｒｆｏｒ　Ｄ
ｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅ
ａｌｔｈ　５ｅｒｖｊｃｅ＋Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍ
ｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　
ａｎｄＷｅｌｆａｒｅ、　Ａｔ１ａｎｔａ、　Ｇｅｏｒ
ｇｉａ　）から容易に入手することができる。ＴＰ菌の
培養集菌方法としては、例えば家兎翠丸に種菌を接種し
て１１〜１４日間培養後ミラーらの方法（ＭＨｌｅｒ　
ｅｔ　ａｌ、＊　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ、　Ｖｏｌ、９６．　ｐ４５０（１９６６））に
従って集菌すればよい。すなわち、不活性化した家兎血
清と１／７Ｍ食塩水とを等置台む溶媒で、培養後ミンチ
化した亀丸砕片から増殖したＴＰ菌を抽出する。抽出液
を２００　ｘｇで十分遠心し、皐丸組識の大きな粒子を
沈澱除去する。その後１９．ＯＯＯｘｇで９０分間遠心
してＴＰ菌を沈澱させる。得られた沈澱物を０１０７５
Ｍ−冷蓚酸ナトリウムで３回洗浄する。本発明における
ＴＰｉｌの培養方法および培養物からの集菌方法はこの
ような例に制限されるものではなく、公知方法のなかか
ら任意に採用することかでき・る。

従来は前記洗浄済みの沈澱物を適当な緩衝液に懸濁し、
直ちにホモグナイザー処理、超音波処理などによってＴ
Ｐ菌体を破砕し、これを担体感作用原液として用いてい
た。本発明法においては、前記抗原感作用原液中のＴＰ
菌以外の不純物のうち特に比重が１．０１以下の両分を
菌体破砕前または後に何らかの方法で分離除去する工程
を付加して、精製したＴＰ抗原を感作用原液に用いたと
ころに特徴がある〇 不純物の分離除去方法は一般の分子量分画について知ら
れている方法のなかから適宜選択すればよく、例えば密
度勾配法、グル濾過法、遠心沈降法、限外濾過法、硫安
分画法、電気泳動法などによって分画除去すれはよい。

これらのなかでは、特に孔度勾配法および遠心沈降法が
この目的に適している。この分離方法は分子量分画法の
みでなく、例えば固相化したＴＰ抗体にＴＰ菌を抗原抗
体反応で選択吸着させる方法であってもよい。

本発明は、従来のＴＰＨＡ（ｐ−ごとき抗原抗体反応に
基づく間接凝集反応を利用した梅毒抗体検出法において
、後期抗体（ＩｉＧ）に比較して初期抗体（ＩｉＭ）に
対する抗原感作担体の感度が低かったのは、このＴＰＨ
Ａテストの本質的な欠陥ではなく、担体に感作する抗原
の純度が原因であったこと、更に詳しくは特定の不純物
画分の共存に起因するという新知見に基づくものである
。従って、本発明においては、比重１．０１以下の画分
は抗原感作担体と梅毒１９−Ｍ抗体との抗原抗体反応を
阻害しなくなる程度にまで除かれていればよく、必ずし
も完全に除去される必要はない。またこの除去は、ＴＰ
菌体の破砕前であっても破砕後であっても本発明の目的
を達しうるが、工業的には菌体破砕前に密度勾配法で分
画することが最も好ましい。本発明においてはＴＰ菌培
養物中の不純物のうち比重が１．０１以下のものを除去
するのであるが、抗原感作担体の充分な感度を確保する
観点から、比重が１．０５以下の画分を除去するほうが
よシ望ましく、また、比重が１．２０以上の画分も併せ
て除去したほうがよい。従来のＴＰＨＡの製法における
家兎皐丸よシ抽出し洗浄したＴＰ抽出液すなわちＴＰ抗
原原液はＴＰ菌１０９個あたり　０．６１ｎ９以上の蛋
白質を含んでいるが、本発明法で得られる精製抗原原液
は大址の不純蛋白を除去しているためＴＰ菌１０９個あ
たりの蛋白質はＱ、　３　ｍｇ以下であシ、通常は０．
１〜以下になる。なお、この場合の蛋白濃度はローリ−
法（Ｌｏｗｒｙ　ｅｔ　ａｌ、ｙ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、、　Ｖｏｌ、　１９３゜ｐｐ　２６５−２７５　
（１９５，１））によって測定し、ＴＰ菌数は細菌計数
器（Ｃ６Ａ、　Ｈａｕｓｅｒ　＆　Ｓｏｎ社製）上に被
検液を取って暗視野顕微鏡にて直接数えた。

ＴＰ菌体の破砕は従来のＴＰＨＡ試薬作成の常法に従っ
て行なえばよく、例えば、ホモグナイザー処理、超音波
処理、界面活性剤処理、酵素処理、自己融解法、凍結融
解法などを用いうる。抗原の精製が菌体破砕前に行なわ
れる場合には、不純物を除去したＴＰ菌区分を必要によ
り緩衝液などに懸濁して遠沈するなどして菌体を洗浄し
てから破砕する。

破砕菌体は、必要により緩衝液などで希釈してから、常
法によってヒツジ赤血球等の担体に感作する。担体には
、このほかニワトリ赤血球等の各種動物の赤血球やラテ
ックスなど、抗原抗体反応に基づく間接凝集反応に用い
うるものであればいかなるものであっても本発明の方法
に適用しうる。

抗原感作担体はそのままあるいは凍結乾燥して、常法ど
おシ標準血清、未感作担体、非特異抗原吸収液、希釈液
、復元液等と組合せて梅毒検査用試薬キットとする。

本発明で得られた検査用試薬を用いれば梅毒検査が簡単
であシ、この試薬は感染後相当期間経過した梅毒患者の
みならず感染後１力月以内の初期感染患者の血清につい
ても特異的に安定して陽性を示す。これは、従来の抗原
感作担体において梅毒Ｉ、９−　Ｇ抗体に対する感度に
比較して梅毒Ｉｇ−Ｍ抗体に対する感度を相対的に低下
せしめていた不純物を除去することによって得られたも
ので６．？、本発明で得られた製品では、初期感染患者
血清中に特異的に含まれる梅毒Ｉ、９−Ｍ抗体に対する
感度と中、後期患者血清に含まれる梅毒Ｉｇ−Ｇ抗体に
対する感度との比が従来品よシ大きくなっている。

以下、実験例をもって本発明の効果を説明する。

実験例１ 施 実メ例で得られた粗ＴＰ原液をタンニン酸法にょ覧 りヒツジ赤血球に感作して抗原感作血球液を隔弊した。

梅毒抗体血清としては、Ｉ、９−Ｍ抗体だけの血清とＩ
５＋−Ｇ抗体だけの血清をいずれも前記抗原感作血球液
を用いてＴＰＨＡテストを行なった場合に同じ力価を示
すようにプールして調整しておいた。

遠沈管の下層には２５％ジアドリゾエイトナトリウム液
（ｄ＝１．ｔ６ｔ　）、そして上層には第１図に示す各
種比重のジアドリゾエイトナトリウム液をおき、そのう
えに実施例で得られた粗ＴＰ原液を重層して遠心沈降さ
せ、二つのジアドリゾエイトナトリウム液の層間に集ま
った画分を分取した。

上層の比重を変えて得られたこの中間層画分の各各につ
いて、蛋白濃度をローリ−法で測定するとともに、ヒツ
ジ赤血球を用いてタンニン酸法で抗原感作血球液を作成
し、前記の１９−　Ｍ抗体血清および■ｇ−ａ抗体血清
を用いてＴＰＨＡテストで得られた各抗原感作血球液の
力価を測定した。

測定結果を第１図に示す。図の横軸は遠心沈降の際に用
いた上層のノぼりグゾエイトナトリウムの比重を示し、
左方の縦軸は抗原感作血球液の１９−Ｍ抗体に対する力
価／ｌ９−Ｇ抗体に対する力価の比（ＲＭ）を示してい
る。右方の縦軸は蛋白蹟度を示しておシ、図中の丸印は
ＲＭ値を、そして三角印は蛋白濃度を表わしている。

図から明らかな如く、低比重側の画分を除去することに
よって梅毒Ｉｇ−Ｍ抗体に対する感度は梅毒Ｉｇ−Ｇ抗
体に対する感度を大きく上まわって向上しており、特に
比重１．０１以下の画分を除去することの効果が大きい
。この実験例において従来法で得られた抗原感作血球の
ＲＭ値は１．０であるから、従来法では不可能であった
ＲＭ値を本発明によってはじめて達成したのである。

なお、従来品のいくつかについて前記のＩｇ−Ｈ抗体血
清およびＩｇ−Ｇ抗体血清を用いてＴＰＨＡテストを行
なって得られたＲＭ値を第１図の左端にＸ印で示す。そ
の結果かられ力・るように、この実験に用いた対照例の
抗原感作血球は従来品のなかではＲＭ値がもっとも高い
ものであった。

実験例２ ＴＰＨＡ試薬を用い、充分治療した古い梅毒で１．９−
Ｇ抗体のみを含む３検体（Ｇ、＃　Ｇ２．　Ｇ５）およ
び感染後３〜４週間の初期梅毒でＩｇ−Ｍ抗体のみを含
む３検体（Ｍｌ　＋　Ｍ２　ｅ　Ｍ　ｓ　）について感
作血球凝集反応の有無を測定したところ第１表に示すよ
うな結果が得られた。

すなわち１．従来品では総て陰性となる初期梅毒３検体
について、本発明品はいずれも陽性を示す。

なお、上記の初期梅毒３検体（ｙｌｌ、　Ｍ２　ｐ　Ｍ
５　）に対する他の梅毒検査法の反応結果を第２表に示
す。

実施例 国立予防衛生研究所より分与を受けたＷＨＯ病原性標準
ニコルス株トレポネーマ・・ぐリーダムの６、　ＯＸ　
１０’／ｍｌの懸濁液を家兎拳丸実質１個当シ、１　ｍ
ｌずつ接種した。１２日間培養後、家兎１０羽よりｅ丸
を採取し、ミ・チ後、不可性化した家兎血清と１／７Ｍ
食塩水とを等置台む抽出溶媒１０１００Ｏにて、増殖し
たＴＰ菌を抽出した。抽出液を２００×ｇ１０分間遠心
分離し、沈澱を除去、上清をさらに１９，０００Ｘ９で
９０分間遠心し、ＴＰ菌を沈澱させた。得られた沈澱を
０．０７５Ｍ冷シュウ酸ナトリウムで３回洗浄した後Ｐ
Ｈ６，４の１／１５Ｍ＋、ｌン酸緩衝液１’Ｏｍｌに懸
濁して菌数計算後２　Ｘ　１０９／ｍｅに調整踵”これ
を粗ＴＰ原液とした。

容ｉ１５＋＋Ａ’のセルローズチューブ内にジアドリゾ
エイトナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｄｉａｔｒｉｚｏａ
ｔｅ　）で６０．０％、３７．５％、２５．０チ、１９
．０％（いずれも％／′％Ｉ％）の順に密度勾配をつく
シ、最、後に粗ＴＰ原液１　ｍｌを重層した。この重層
物をミューズ社製超遠心機（５ｕｐｅｒ　５ｐｅｅｄ　
６５　）にて、２５，０００ｒ、ｐ、ｍ、（７，６００
Ｘ９　）　Ｔ２０　′Ｃ’；４時間遠心した。

遠心後重層物の上端からｌ　ｍｌずっ１５のフラクショ
ンに分取した。

粗ＴＰ廉液のＴＰ菌数、蛋白濃度および上記各フラクシ
ョンの菌数、密度、蛋白濃度、ＴＰ抗原活性を測定し、
第２図の結果を得た。使用した測定方法を以下に略記す
る。

菌　　数：　　Ｃ，Ａ、　Ｈａｕｓｓｅｒ　＆　Ｓｏｎ
社製細菌計、７数器上に被検液を取シ、暗視野顕微鏡に
て計数した。

蛋白濃度二　ローリ−法で測定した。すなわち、試料に
酒石酸カリウムナトリウムと、硫酸銅を含む炭酸ナトリ
ウム溶液を加え、室温で１０分以上反応させてからフォ
ーリン試薬を加え３０分以上経過してから７５０λで比
色した。

抗原活性：　被検液を超音波処理し、ＴＰ菌体を破壊後
次の術式に従って実施した。

（１）各抗原フラクションをマイクロトレーの左端に２
５μノずつとる。

（２）一定ｖｋ度に希釈した梅毒抗体を希釈液として、
（１）でとった抗原をトレー上で倍倍希釈してゆく。

（３）３７℃３０分反応させる、このときトレーの左の
方のウェル内の抗体は抗原と結合して消費されてしまう
が、抗原濃度のうすい右方のウェル内の抗体は、消費さ
れずに残る。

（４）感作血球を加え、消費されずに残っている抗体と
凝集反応を起したウェルＮｏ、をもって抗原活性とする
。

第２図中ＴＰ菌磯度高く蛋白濃度の低い区分、すなわち
フラクション４〜７を合わせ精製抗原原液１、０　ｍｌ
を得た。本原液中のＴＰ菌数は１．９１　Ｘ　１０９、
上白含量は０．１１６ｍ１７であった。粗抗原原液中の
ＴＰ菌数は２．０Ｘ１０９、蛋白含量は１．２１３ｍ９
であった。したがって、ＴＰ　１０９個当シの蛋白含量
は未精製抗原原液で０．６０７■、精製抗原原液で０．
０５．８Ｉｎ９であった。

精製原液を用い、タンニン酸法によシ、それぞれ羊赤血
球に感作、凍結乾燥し、復元液、希釈液、吸収液、標準
血清と組み合せ、梅毒診断用検査試薬（キット）とした
。

【図面の簡単な説明】

粗ＴＰｉ液から分画した各比重の区分について、第１図
はＩ＆−Ｍ抗体価／ｌ９−Ｇ抗体価の比と蛋白濃度を測
定した結果を示すものであシ、第２図はＴＰ菌数、抗原
活性、比重および蛋白濃度を測定した結果を示すもので
ある。 特許出願人富士臓器製薬株式会社 代理人弁理士田中政浩 手続補正書 特許庁長官　島　１）春　樹　殿 ２発明の名称 梅毒検査用試薬の製造法 ３補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　富士臓器製薬株式会社 ４代理人〒１０４ 住所　東京都中央区京橋二丁目１番３号明細書の記載を
以下のとおシに補正する。 補正個所　　　　誤　　　　　正 １０頁１６行　［−ＨＪ　　　　「−Ｍ１１６頁　１行
　ｒ　７，６００　ｊ　　　ｒ　７６，０００　Ｊ〃　
　５行　　「の菌数ｄ　　「の菌数（三角印）、」〃〃
「密度、」　　「密度（白丸印）、」〃〃「濃度、ＴＪ
　　　ｒ濃度（Ｘ印）、Ｔ」Ｉ　　〃　　「原活性」　
　「原活性（黒丸印）、」以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 梅毒トレポネーマ菌由来の抗原を感作した担体が対応す
   る抗体の存在によって凝集することをオリ用した梅毒検
   査用試薬の製造法において、前記担体に感作する抗原原
   液として、梅毒トレポネーマ菌培養物のうち比重１．０
   １以下の画分を除去した抗原含有物を用いることを特徴
   とする梅毒検査用試薬の製造法。