KR100234876B1 - 면역블럿을 이용한 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증의 동시 감별 진단방법, 진단키트 및 이의 제조방법 - Google Patents
면역블럿을 이용한 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증의 동시 감별 진단방법, 진단키트 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 면역블럿을 이용한 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증의 동시 감별 진단방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병 및 렙토스피라증의 항원을 각각 니트로셀룰로오스막 상의 일정 위치에 블럿팅하는 단계; 검체와 대조혈청을 상기 항원들이 블럿된 니트로셀룰로오스막과 접촉시켜 각각 반응시키는 단계; 상기 반응을 통해 생성된 항원-항체 반응물을 알칼라인 포스파테이즈 표지 염소 항 사람 이뮤노그로블린 항체 및 비씨아이피/엔비티(BCIP/NBT) 기질액을 이용하여 각각 검출하는 단계; 및 검체와 대조혈청에서의 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하여 구성되는 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증의 동시 감별 진단방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병 및 렙토스피라증의 항원을 각각 니트로셀룰로오스막 상의 일정 위치에 블럿팅하여 얻어지는, 항원이 블럿된 니트로셀룰로오스막을 포함하고 있는 진단키트에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 숙련된 검사원과 특수한 장비 없이 간편하게 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증을 동시에 감별진단할 수 있다.
Description
본 발명은 면역블럿을 이용한 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증의 동시 감별 진단방법, 진단키트 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근 한국에서는 매년 임상적으로 유사한 증상을 나타내는 급성 출혈성 질환이 유행하고 있다는 사실이 확인되었으며, 이중에는 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병 (scrup typhus) 및 렙토스피라증이 있음이 혈청학적으로 증명되었고, 이들 질환의 환자들은 매년 신증후출혈열이 유행하는 늦가을에 발생하여 임상적으로 감별진단이 용이하지 않다.
신증후출혈열 진단에 있어는, 면역형광항체법이 현재까지 가장 보편적인 방법으로 이용되고 있기는 하지만, 대량 검사시 처리 검체수가 제한되며, 조직 배양시설 및 형광 현미경과 같은 특수장비가 필요하고, 결과의 정확한 판단을 위한 숙련된 검사원이 필요하다는 점 등의 단점이 있다. 이외에, 엘라이자법(ELISA), 혈구응집 저지반응 및 적혈구 응집반응 등이 신증후 출혈열의 혈청학적 진단과 연구를 위한 목적으로 이용되고 있으나, 특정 연구분야에서만 제한되어 사용되고 있다.
한편, 국내에서 개발된 신증후출혈열 진단키트로는 불용성 담체 입자 응집 (High Density Particle Agglutination)법, 엘라이자법을 이용한 진단키트가 있지만, 어느 방법에 의한 것이든 사용할 때 검사원이 검체의 희석 및 검사시약을 조제하고, 플레이트로 충전해야 하므로 불편이 따른다.
쯔쯔가무시병의 진단은 주로 혈청학적 진단법에 의존하고 있고, 상업화되어 공급되는 진단키트로는 적혈구응집법을 이용한 진단키트가 한 종류 개발되어 있다. 따라서, 우리나라를 비롯하여 대부분의 국가에서 쯔쯔가무시병의 진단은 일부 연구기관에서 제한되어 수행되고 있다. 혈청학적 진단법으로 가장 널리 쓰이고 있는 방법은 간접면역형광항체법인데, 민감도와 특이도가 높아 쯔쯔가무시병의 진단에 표준방법으로 이용되고 있다. 그러나, 이 방법은 숙련된 검사원과 형광현미경과 같은 특수장비를 요하기 때문에 일선 병원이나 의원에서는 실시하기 어려운 단점이 있다. 효소 면역 측정법은 간접면역 항체법과 민감도 및 특이도가 비슷하나, 널리 쓰이지 않고 제한적으로 사용되고 있다. 피동적혈구 응집법은 검사법이 간편하고, 결과 판독이 객관적이며, 검사에 소요되는 시간과 노력이 적어 널리 사용될 수 있는 방법이기는 하나, IgG 항체와 IgM 항체를 구분하여 측정할 수 없는 단점이 있다. 웨일-펠릭스(Weil-Felix)검사법에서는 쯔쯔가무시병 환자의 혈청 및 리켓치아에 속한 세균에 감염된 환자의 혈청과 프로터스(Proteus)속 세균이 비특이적으로 반응하여 세균을 응집시킨다. 매우 간편하나, 민감도와 특이도가 매우 낮아 현재 거의 사용하지 않는다.
렙토스피라증은 그 임상상이 비특이적이어서 발병초기에 기타 발열성 질환과 감별 진단하는 데 어려움이 따르며, 균배양 및 혈청학적 진단이 중요한 위치를 차지하고 있다. 렙토스피라균에 대한 항체를 검출하는 데는 현미경응집법이 표준진단방법으로 사용되고 있으나, 여러 혈청형의 균주를 계속 계대 배양하여야 하는 제한이 있다. 근래에는 효소면역측정법, 혈구응집법, 마이크로-캡슐 응집법 등이 연구분야에서 사용되고 있다. 적혈구응집법을 이용한 진단키트가 제품화되어 있으나 현미경응집법과 결과 일치율이 낮아 해석에 어려움이 있어 널리 이용되고 있지 않는 실정이다.
따라서, 본 발명에서는 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하여, 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증을, 특별한 시설 및 숙련된 검사원 없이, 신속하게 감별 진단하는 방법과 이에 사용될 수 있는 진단키드 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.
이러한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의하면 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병 및 렙토스피라증의 항원을 각각 니트로셀룰로오스막 상의 일정 위치에 블럿팅하는 단계, 검체와 대조혈청을 상기 항원들이 블럿된 니트로셀룰로오스막과 각각 반응시키는 단계, 반응 항체의 검출 단계, 및 검체와 대조혈청에서의 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하여 구성되는 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증의 동시 감별 진단방법이 제공된다.
상기 각 질환에 대한 항원으로는, 신증후출혈열의 경우, 적절한 방법으로 정제된 한탄 바이러스(TC0163BP), 마지바이러스/마지-I(고려의대 미생물학 교실) 또는 마지바이러스/마지-II(KFCC-1087)를 사용할 수 있으며, 쯔쯔가무시병의 경우에는 정제된 리켓치아 쯔쯔가무시(길리암, 카프, 카토; 국립보건원 분양)를, 렙토스피라증의 경우에는 렙토스피라 인터로간즈 항원을 사용하는 것이 바람직하다.
양성대조혈청으로는 면역형광항체법에 의하여 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병 양성으로 판명된 환자 혈청과 현미경응집법에 의하여 렙토스피라증 양성으로 판명된 환자 혈청을, 음성대조혈청으로는 면역형광광체법 및 현미경응집법에 의하여 음성으로 판명된 정상인 혈청을 사용할 수 있다. 또는 각 바이러스에 의하여 면역화된 동물의 혈청 및 정상 동물의 혈청을 사용할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 검출단계는 알칼라인 포스파테이즈 표지 염소 항 사람 이뮤노그로블린 항체 및 비씨아이피/엔비티(BCIP/NBT) 기질액을 이용하여 행한다.
또한, 본 발명에 의한 방법은 진단키트를 이용하여 행할 수 있으며, 진단키트는 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병 및 렙토스피라증의 항원을 각각 니트로셀룰로오스막 상의 일정 위치에 블럿팅하여 얻어지는 니트로셀룰로오스막을 포함하고 있는 것을 특징으로 한다.
예를 들어, 본 발명에 의한 진단키트는, 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병 및 렙토스피라증의 항원이 블럿팅된 니트로셀룰로오스막이 부착되어 있는 콤 카드(comb card)와, 배양 트레이(incubation tray) 그리고 양성 및 음성대조혈청을 포함하여 이루어진다.
콤 카드의 치부의 수와 배양 트레이의 가로 웰의 수는 일치하며, 12웰 트레이를 사용하는 것이 바람직하다.
배양 트레이의 세로줄을 따라 단계별로 필요한 검사시약을 순서대로 충전하게 되므로, 이의 수는 항원-항체 반응 및 검출에 필요한 반응시약에 따라 결정된다. 예를 들어, 알칼라인 포르파테이즈 표지 염소 항 사람 이뮤노글로블린 G 항체와 비씨아이피/엔비티(BCIP/NBT) 기질액을 이용하여 검출하는 경우, 검체희석액, 세척액, 알칼라인 포르파테이즈 표지 염소 항 사람 이뮤노글로블린 G 항체 함유 인산완충염용액, 세척액, BCIP/NBT 기질액이 세로로 5줄을 따라 순서대로 충전하여 사용할 수 있다. 이 경우, 종래의 키트 이용시 필수적인 희석 검체시약의 조제 및 플레이트로의 충전단계가 불필요하고, 준비된 트레이 내에서 순서대로 시약을 사용하여 검체 또는 대조 혈청을 콤 카드와 반응시켜 반응 여부를 검출함으로써, 간편하게 진단할 수 있다.
본 발명에 의한 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병 및 렙토스피라증의 동시 감별 진단키트는 세가지의 바이러스 항원을 니트로셀룰로오스막으로 블럿팅하여 얻은 니트로셀룰로오스막을 콤 카드의 치부에 부착하여 콤 카드를 제조하는 단계, 반응단계별시약을 충전하여 배양 트레이를 제조하는 단계, 대조 혈청을 제조하는 단계를 통하여 제조할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 ; 진단키트의 제조
1) 항원의 정제
① 마지바이러스/마지-II(KFCC-1087)
마우스 뇌내배양 마지바이러스/마지-II 시이드를 생후 1일령의 젖빨이 마우스의 뇌에 접종하여 6-7일 후 심한 마비증상을 보이는 마우스로부터 뇌를 채취하고 5mM EDTA 함유 인산완충염용액으로 10% 뇌유제를 제조하여 4℃, 4,000rpm에서 30분간 원침하여 상등액을 취하였다. 상등액에 프로타민설페이트를 처리하고 10,000g에서 1시간 동안 원심분리하여 바이러스 원액을 얻었다. 바이러스 원액을 5배 농축한 후 100,000g에서 4시간 초원심분리하여 바이러스 항원을 침전시켰다. 이 침전물을 인산염 완충액으로 용해시키고 초음파 분쇄기로 처리한 후 정제 항원으로 사용하였다.
② 리켓치아 쯔쯔가무시(길리암; 국립보건원 분양)
리켓치아 배양을 위해 마우스 섬유아세포(mouse fibroblast : L cell)를 숙주세포로 사용하여 37℃, 5% CO2항온기에서 10% 우태아혈청 함유 EMEM(Eagle's Minimum Essential Media, Gibco사)으로 단층 배양하였다. 단층 배양된 L 세포를 인산완충액으로 2회 세척한 후 리켓치아를 2시간 흡착시켜 5% 우태아혈청 함유 EMEM으로 배양하였다. 접종후 도립현미경으로 관찰하여 70-80%의 세포병리현상을 보일 때 세포와 배양액을 15,000g, 30분 원심분리한 후 침전물을 0.03M Tris-HCl, 0.25M 수크로오스(TS완충액)에 재부유하여, 균질화기(homogenizer)로 세포를 파쇄한 후, 1,000g, 10분간 원침하여 상등액을 분리하였다. 퍼콜(1.130g/ml, 폴리비닐피롤리돈이 피복된 콜로이드 실리카, LKB)을 TS 완충액으로 90%가 되게 조절한 용액에 상기 세포 파쇄 상청액을 최종농도가 40%가 되도록 섞어, 15,000g, 1시간 초원심분리하여 원심분리관의 아래쪽에 형성된 리켓치아층을 분리하여 인산염완충액으로 5회 세척하고 초음파분쇄기 처리한 후 정제 항원으로 사용하였다.
③ 렙토스피라 인터로간즈(serovar canicola, lai : 국립보건원 분양)
렙토스피라균은 EMJH(Difco사) 배지에서 7일간 배양하여 원심분리하였고, 그 침점물을 생리식염수로 2번 세척하여 배양액 성분을 제거하였다. 회수한 균체에 10mM EDTA, 1%(v/v) Triton X-100, 0.2%(w/v) 소디움 디옥시클로레이트, 0.1%(w/v) SDS 함유 10mM Tris 완충액을 5×109셀/10ml 농도로 첨가하고, 37℃, 1시간 반응시킨 후, 15,000rpm, 10분 원심분리하여 상등액을 취하고, 침전물을 상기와 동일한 방법으로 처리하여 상등액을 취하여 전단계의 상등액과 합하였다. 상등액에 10배의 찬 아세톤을 가하여 0℃에서 1시간 방치한 후, 15,000rpm, 30분 원심분리하여 침전물을 회수하고 인산염완충액에 용해시켜 항원으로 사용하였다.
2) 니트로셀룰로오스막으로 항원의 블럿팅
상기 1) 단계에서 얻은 정제된 마지 바이러스, 리켓치아, 렙토스피라 항원을 각각 100㎍/ml,150㎍/ml, 50㎍/ml의 농도로 정량하여 도트/슬롯 블럿 장치 (dot/slot blot apparatus; Bio-Rad)를 이용하여 20㎕/웰씩 넣고, 진공 상태에서 니트로셀룰로오스막의 일정위치로 각각 블럿팅하였다. 블럿팅 후 니트로셀룰로오스막을 5% 탈지분유 함유 인산염완충액으로 실온에서 2시간 블록킹한 후 완전히 건조시켜 사용하였다.
3) 콤 카드의 제작
상기 2)의 세가지 항원이 블럿된 니트로셀룰로오스막을 5% 탈지분유 함유 인산완충염 용액에 2시간 블록킹한 후 완전히 건조시켜 콤 카드의 치부에 부착하였다.
4) 배양 트레이에 시약 충전
가로 12웰(1-12)×세로5줄(A-E)로 구성된 플라스틱 트레이의 각 웰에 하기 시약을 400㎕씩 충전하였다.
A 웰 : 검체 희석액, 1% BSA 함유 인산완충염 용액
B 웰 : 세척액, 0.05% Tween 20 함유 인산완충염 용액
C 웰 : 알카라인 포스파테이즈 표지 염소 항 사람 이뮤노글로블린 G 항체 함유 인산완충염 용액
D 웰 : 세척액, 0.05% Tween 20 함유 인산완충염 용액
E 웰 : 기질액, BCIP/NBT
5) 대조 혈청
양성 대조혈청으로 면역형광광체법에 의하여 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병 양성으로 판명된 사람 혈청 및 현미경응집법에 의하여 렙토스피라증 양성으로 판명된 사람의 혈청을 준비하였다.
음성 대조혈청으로 면역형광광체법과 현미경응집법에 의하여 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병 및 렙토스피라증 음성으로 판명된 사람의 혈청을 준비하였다.
실시예 2; 감도시험
실시예 1에 따라 제조된 진단키트를 이용하여 검체에 대한 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증 항체의 유무를 검사하였다.
먼저, 면역형광항체법에 의하여 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병 양성으로 판명된 각각 72, 48 검체와 현미경응집법에 의하여 렙토스피라증 양성으로 판명된 27 검체, 그리고 각 질환의 양성대조 환자혈청 및 음성대조 정상인 혈청을 A줄 웰의 1% BSA 함유 인산염 완충액으로 1:100으로 희석한 후 콤 카드를 넣어 각각 30분 반응시켰다. B웰의 세척액으로 세척 후 C웰의 알칼라인 포스파테이즈 표지 염소 항 사람 이뮤노그로블린 항체와 30분 반응시킨 다음 D웰로 옮겨 세척하고, E웰의 비씨아이피/엔비티(BCIP/NBT) 기질액을 이용하여 충분히 발색반응시킨 후, 수돗물에 세척하고 건조시켜, 발색반응을 대조혈청과 비교하여 판독하였다.
결과 판정 예
1. 신증후출혈열 양성대조혈청
2. 쯔쯔가무시병 양성대조혈청
3. 렙토스피라증 양성대조혈청
4. 음성대조혈청
5. 검체 ---〉 쯔즈가무시병 양성혈청으로 판정
그 결과를 표 1에 나타내었다. 면역블럿 키트는 신증후 출혈열과 쯔쯔가무시병의 경우 현재 기준검사법인 면역항체법과 각각 100%, 100%의 감도를 나타내어 일치율이 높았고, 렙토스피라증은 기준검사법인 현미경응집법과 84%의 감도로 약간 낮았다.
| 면역블럿 | 감도 | ||
| 양성 | 음성 | ||
| 신증후출혈열 양성혈청 72검체 | 72검체 | 0검체 | 100% |
| 쯔쯔가무시병 양성혈청 42검체 | 42검체 | 0검체 | 100% |
| 렙토스피라증 양성혈청 25검체 | 21검체 | 4검체 | 84% |
실시예 3; 특이도 시험
면역형광항체법에 의해 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병 음성이고, 현미경응집법에 의해 렙토스피라증 음성으로 판명된 100검체와 각 질환의 양성대조혈청 및 음성대조 혈청을 사용하여 상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 시험하여, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 면역블럿 키트는 현재 기준검사법인 면역형광항체법, 현미경응집법과 100%의 특이도를 나타내었다.
| 면역블럿 | 특이도 | ||
| 양성 | 음성 | ||
| 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증 음성혈청 100검체 | 0 | 100검체 | 100% |
본 발명의 방법에 의하면 특별한 시설 및 숙련된 검사원 없이도 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병 및 렙토스피라증을 신속하고 간편하게 동시 감별 진단할 수 있다.
Claims (7)
- 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병 및 렙토스피라증의 항원을 각각 니트로셀룰로오스막 상의 일정 위치에 블럿팅하는 단계; 검체와 대조혈청을 상기 항원들이 블럿된 니트로셀룰로오스막과 접촉시켜 각각 반응시키는 단계; 상기 반응을 통해 생성된 항원-항체 반응물을 알칼라인 포스파테이즈 표지 염소 항 사람 이뮤노그로블린 항체 및 비씨아이피/엔비티(BCIP/NBT) 기질액을 이용하여 각각 검출하는 단계; 및 검체와 대조혈청에서의 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하여 구성되는 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증의 동시 감별 진단방법.
- 제 1항에 있어서,상기 항원이 마지바이러스/마지-II, 리켓치아 쯔쯔가무시 및 렙토스피라 인터로간즈 항원임을 특징으로 하는 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증의 동시 감별 진단방법.
- 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병 및 렙토스피라증의 항원을 각각 니트로셀룰로오스막 상의 일정 위치에 블럿팅하여 얻어지는 니트로셀룰로오스막을 부착하고 있는 콤 카드(comb card), 배양 트레이(incubation tray) 및 양성 및 음성대조혈청을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증의 동시 감별 진단키트.
- 제3항에 있어서,상기 배양 트레이가 12웰×5줄의 트레이로 각 반응단계별 시약이 충전되어 있는 것을 특징으로 하는 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증의 동시 감별 진단키트.
- 제 4항에 있어서,상기 반응단계별시약이 세로줄을 따라 검체희석액, 세척액, 알칼라인 포르파테이즈 표지 염소 항 사람 이뮤노글로블린 G 항체 함유 인산완충염용액, 세척액, BCIP/NBT 기질액의 순으로 충전되어 있는 것을 특징으로 하는 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증의 동시 감별 진단키트.
- 제 3항에 있어서,신증후출혈열 및 쯔쯔가무시병의 양성대조혈청은 각각 면역형광항체법에 의하여 양성으로 판명된 혈청이고, 렙토스피라증의 양성대조혈청은 현미경응집법에 의하여 양성으로 판명된 혈청임을 특징으로 하는 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증의 동시 감별 진단키트.
- 제 3항에 있어서,상기 음성대조혈청은 면역형광항체법 및 현미경응집법에 의하여 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병 및 렙토스피라증 음성으로 판명된 혈청임을 특징으로 하는 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증의 동시 감별 진단키트.
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| KR100796772B1 (ko) * | 2006-09-04 | 2008-01-22 | 주식회사 이뮨메드 | 쯔쯔가무시병 진단 키트 |
-
1997
- 1997-04-24 KR KR1019970015237A patent/KR100234876B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR19980077901A (ko) | 1998-11-16 |
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