JPS58216123A - 抗血清 - Google Patents
抗血清Info
- Publication number
- JPS58216123A JPS58216123A JP9956682A JP9956682A JPS58216123A JP S58216123 A JPS58216123 A JP S58216123A JP 9956682 A JP9956682 A JP 9956682A JP 9956682 A JP9956682 A JP 9956682A JP S58216123 A JPS58216123 A JP S58216123A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- toxin
- toxins
- antiserum
- clostridium difficile
- purified
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、抗血清に関する。
腸内常在嫌気性菌であるクロストリディウム・ディフィ
シｈ （Ｏｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｉｆｆｉｃｉｌｅ
）の産生毒素（特にＤ−／、Ｄ−，２）が、−偽膜性大
腸炎の直接的な原因であることは知られている（え２え
イ、上野ら、ｉ■言斉。−−ｊＧ式奪ｒｎ’ａ−臨床的
には偽膜性腸炎は粘液を含む水様側の下痢症状を持続し
、体力の衰弱をともない時には死亡する例４ある。
シｈ （Ｏｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｉｆｆｉｃｉｌｅ
）の産生毒素（特にＤ−／、Ｄ−，２）が、−偽膜性大
腸炎の直接的な原因であることは知られている（え２え
イ、上野ら、ｉ■言斉。−−ｊＧ式奪ｒｎ’ａ−臨床的
には偽膜性腸炎は粘液を含む水様側の下痢症状を持続し
、体力の衰弱をともない時には死亡する例４ある。
これらの臨床診断にはＳ状結腸鏡や直腸の生検を行い、
また細菌の便よ如の検出も必要であり診断を行うには著
しく時間と技術を必要とするものである。
また細菌の便よ如の検出も必要であり診断を行うには著
しく時間と技術を必要とするものである。
本発明者らは、これらの鑑別診断を、よシ簡便に、正確
かつ迅速に行うため、原因菌であるクロストリデイウム
デイフィシルの産生する毒素の検出法を検討し、この過
程で本発明に到達した。
かつ迅速に行うため、原因菌であるクロストリデイウム
デイフィシルの産生する毒素の検出法を検討し、この過
程で本発明に到達した。
すなわち、本発明の要旨は、クロストリデイウムデイフ
イシルの産生する毒素を弱毒化し、次いで動物に免疫し
て得られる毒素抗血清にある。
イシルの産生する毒素を弱毒化し、次いで動物に免疫し
て得られる毒素抗血清にある。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明における毒素は嫌気性菌クロストリデイウムデイ
フイシルの産生ずるものである。
フイシルの産生ずるものである。
本発明に係る抗血清は、この毒素から、たとえば上記バ
イオケミストリーインターナショナル誌に記１され穴上
針らの方法で得ることができる。
イオケミストリーインターナショナル誌に記１され穴上
針らの方法で得ることができる。
すなわち、まずクロストリデイウムデイフイシル菌株を
、嫌気的培養して毒素の産生を行々う。培養稜、遠心分
離し、上清よ如得られた毒素を精製して、精製毒素Ｄ−
／、及びＤ−コを得ることができる。
、嫌気的培養して毒素の産生を行々う。培養稜、遠心分
離し、上清よ如得られた毒素を精製して、精製毒素Ｄ−
／、及びＤ−コを得ることができる。
もちろん、毒素としてさらにＤ−／又けＤ−λのいずれ
か一つのみを分離精製して次の抗血清の製造に供するこ
ともできる。
か一つのみを分離精製して次の抗血清の製造に供するこ
ともできる。
そしてこれらの毒素を例えばホルムアルデヒド、ゲルタ
ールアルデヒド等で処理して弱毒化毒素を得、次いでこ
れに対しウサギ、モルモット、ヤギ等の実験動物に免疫
を行なＩ、、ｔ Ｄ −／及び／又けＤ−コ毒素に特異
性の高い抗血清を得ることができる。これらの得られた
抗血清はオフテロニーや免疫電気泳動法でその抗体価を
確認することができる。
ールアルデヒド等で処理して弱毒化毒素を得、次いでこ
れに対しウサギ、モルモット、ヤギ等の実験動物に免疫
を行なＩ、、ｔ Ｄ −／及び／又けＤ−コ毒素に特異
性の高い抗血清を得ることができる。これらの得られた
抗血清はオフテロニーや免疫電気泳動法でその抗体価を
確認することができる。
得られた抗血清は、これよ多免疫グロブリン（ＩｇＧ
）を分画し、その工ｇＧをポリスチレン等ラテックス粒
子に感作して、毒素検出用試薬を調製することができる
。
）を分画し、その工ｇＧをポリスチレン等ラテックス粒
子に感作して、毒素検出用試薬を調製することができる
。
次に、得られたラテックス試薬を用いて糞便中のクロス
トリディウムディフィシルにより産生される毒素を検出
する方法について説明する。
トリディウムディフィシルにより産生される毒素を検出
する方法について説明する。
素の検定をするために、ラテックス表面上の工ｇＧと抽
出液中のＤ−／、Ｄ−コ毒素とを反応させると、多価抗
体反応によシラテックスの凝集塊を生じる。その凝集塊
の程度をスライドガラス上で肉眼的に観察することによ
ｐ、腸炎患者中のＤ−／、Ｄ−，２嵩素の検出を半定量
的に行うことができる。その迅速さと相まってクロスト
リディウム・デイフイシルによる偽膜性腸炎の判定が従
来の方法と比べて著しく迅速にしかも粘度良く行うこと
ができる。
出液中のＤ−／、Ｄ−コ毒素とを反応させると、多価抗
体反応によシラテックスの凝集塊を生じる。その凝集塊
の程度をスライドガラス上で肉眼的に観察することによ
ｐ、腸炎患者中のＤ−／、Ｄ−，２嵩素の検出を半定量
的に行うことができる。その迅速さと相まってクロスト
リディウム・デイフイシルによる偽膜性腸炎の判定が従
来の方法と比べて著しく迅速にしかも粘度良く行うこと
ができる。
上記のような方法によって診断されて患者糞便中の毒に
よるラテックス試薬の凝集反応を、正常人の糞便抽出物
のものと比較すると、ラテックス試薬の凝集の有無によ
シ明瞭に毒素の検出を行うことができ偽膜性腸炎の鑑別
を臨床検実施例／ 上野らの方法（バイオケミストリーインターナショナル
■０１．λ、Ａ６．６コター４．３ｊ頁、１９♂／）に
より、精製したＤ−／及びＤ−λ毒素を得た。
よるラテックス試薬の凝集反応を、正常人の糞便抽出物
のものと比較すると、ラテックス試薬の凝集の有無によ
シ明瞭に毒素の検出を行うことができ偽膜性腸炎の鑑別
を臨床検実施例／ 上野らの方法（バイオケミストリーインターナショナル
■０１．λ、Ａ６．６コター４．３ｊ頁、１９♂／）に
より、精製したＤ−／及びＤ−λ毒素を得た。
偽膜性腸炎患者の糞便より得られた嫌気性菌クロストリ
デイウムデイフイシル菌株を採取し、コレ’ｔ−ｔ％プ
レインハートインフュージョン、／％プロニアーゼベプ
トン培地内で嫌気的培養し、二種類のＤ−／及びＤ−２
毒素の産生を行う。３７℃で４ｔｔ時間インキュベート
した後、培養液を♂θｏｏｙ、３０分間遠心し、上清を
θ、４ｔ！μｍのメンブランフィルターを通し、ろ液に
、ｒｍＭのメルカプトエタノールを加え、７０％の飽和
硫安溶液にすることによシ塩析し、毒素の濃縮を行ない
、ＡａＡ （Ｌ Ｋ Ｂ社製）クロマトグラフィーによ
り精製し、純粋な一２種類のＤ−／毒素（推定分子量６
００，０θθ）とＤ−λ毒素（推定分子量４ｔ？、θθ
θ）を得る。
デイウムデイフイシル菌株を採取し、コレ’ｔ−ｔ％プ
レインハートインフュージョン、／％プロニアーゼベプ
トン培地内で嫌気的培養し、二種類のＤ−／及びＤ−２
毒素の産生を行う。３７℃で４ｔｔ時間インキュベート
した後、培養液を♂θｏｏｙ、３０分間遠心し、上清を
θ、４ｔ！μｍのメンブランフィルターを通し、ろ液に
、ｒｍＭのメルカプトエタノールを加え、７０％の飽和
硫安溶液にすることによシ塩析し、毒素の濃縮を行ない
、ＡａＡ （Ｌ Ｋ Ｂ社製）クロマトグラフィーによ
り精製し、純粋な一２種類のＤ−／毒素（推定分子量６
００，０θθ）とＤ−λ毒素（推定分子量４ｔ？、θθ
θ）を得る。
次いで、この精製毒素をθ、４ｔ％ノホルムアルデヒド
溶液中で７．２時間、３２℃で処理し、弱毒化する。こ
の弱毒化した毒素を生理食塩水で、約Ｓθθμｆ／ｍｌ
の濃度に調製し、等量のフロイント完全アジュバン）
（ｆ（７１”’ｃ’ｏ社製）を混ぜ、強く混和し粘性を
生じたところで免疫動物（ウサギ）投与し、初回免疫後
２回、隔週ごとに追加免疫し、最後の免疫からλ週間後
に免疫動物より採血し抗血清を得た。
溶液中で７．２時間、３２℃で処理し、弱毒化する。こ
の弱毒化した毒素を生理食塩水で、約Ｓθθμｆ／ｍｌ
の濃度に調製し、等量のフロイント完全アジュバン）
（ｆ（７１”’ｃ’ｏ社製）を混ぜ、強く混和し粘性を
生じたところで免疫動物（ウサギ）投与し、初回免疫後
２回、隔週ごとに追加免疫し、最後の免疫からλ週間後
に免疫動物より採血し抗血清を得た。
抗体価はオフテルロニー法、及び免疫電気泳動法にてそ
の確認を行なった。
の確認を行なった。
参考例／（ラテックス試薬の調製）
実施例／により得られた抗血清を、３♂％硫安溶液とし
沈殿する分画を免疫グロブリン（工ｇＧ ）分画とし、
この分画を透析し、部分精製してＤ−／、Ｄ−コ毒素診
断用ラテックス試薬を得た。
沈殿する分画を免疫グロブリン（工ｇＧ ）分画とし、
この分画を透析し、部分精製してＤ−／、Ｄ−コ毒素診
断用ラテックス試薬を得た。
すなわちＤ−／・・、Ｄ−一毒素に対する抗血清よシ３
／％硫安塩析に士り析出するＩｇＧをとり、ラテックス
粒子（粒調ｏ、’、ｔ、ｚμｍ ダウケミカル社製品）
当ｐｔｒｏｏ−ｉｒｏｏ個相当量となるように０．２Ｍ
−ホウ酸緩衝液（ｐＨ／、θ）に溶解し、等量のラテッ
クス−ホウ酸緩衝液（ｐＨ１、θ）と室温で撹拌下に混
合し、充分感作させる。遠心分離後、上清を除き適轟量
の牛血消アルプきンで処理する。このようにして得られ
たラテックスを該ホウ酸緩衝液に懸濁して使用する。
／％硫安塩析に士り析出するＩｇＧをとり、ラテックス
粒子（粒調ｏ、’、ｔ、ｚμｍ ダウケミカル社製品）
当ｐｔｒｏｏ−ｉｒｏｏ個相当量となるように０．２Ｍ
−ホウ酸緩衝液（ｐＨ／、θ）に溶解し、等量のラテッ
クス−ホウ酸緩衝液（ｐＨ１、θ）と室温で撹拌下に混
合し、充分感作させる。遠心分離後、上清を除き適轟量
の牛血消アルプきンで処理する。このようにして得られ
たラテックスを該ホウ酸緩衝液に懸濁して使用する。
参考例−
腸炎患者糞便に７θ％の０．？％Ｎａｐ、／：溶液を加
えはげしく撹拌し３０θＯｒ、ｐ、ｍ、１０分遠心をＬ
上ｆｆ／をと＃） ０．￥ ６μｍのミリポアフィルタ
−により；５遇し、検体溶液とする。
えはげしく撹拌し３０θＯｒ、ｐ、ｍ、１０分遠心をＬ
上ｆｆ／をと＃） ０．￥ ６μｍのミリポアフィルタ
−により；５遇し、検体溶液とする。
スライドカラス板上に、１０θμｔのＯｌ、２％ウシア
ルプきンー生理食塩水溶液を滴下し、、ｔＯμｔの上記
検体をおき混和後、更に３０μノのラテックス試薬＆淘
液を加えてガラス板上で混和し、−２〜３分後にラテッ
クス粒子塊の生成を肉眼的に観察した。
ルプきンー生理食塩水溶液を滴下し、、ｔＯμｔの上記
検体をおき混和後、更に３０μノのラテックス試薬＆淘
液を加えてガラス板上で混和し、−２〜３分後にラテッ
クス粒子塊の生成を肉眼的に観察した。
正常者の糞便抽出液を検体に用いた場合はラテックス粒
子は懸濁したままで必セ全（粒子の凝集をみとめない。
子は懸濁したままで必セ全（粒子の凝集をみとめない。
一方、偽膜性腸炎患者よ如の糞便抽出検体は、明らかな
ラテックス粒子の凝集塊をみとめることができ、その凝
集の程度は毒素の濃度に対応した。
ラテックス粒子の凝集塊をみとめることができ、その凝
集の程度は毒素の濃度に対応した。
出 願 人 上 野 −恵ほか７名
代 理 人 弁理士 長谷用 −
ほか／名
Claims (1)
- （１） クロストリデイウムデイフイシル（Ｏｌｏｅ
−ｔｒｌｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ）の産生ずる毒
素を弱毒化し、次いで動物に免疫して得られる毒素抗血
清。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9956682A JPS58216123A (ja) | 1982-06-10 | 1982-06-10 | 抗血清 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9956682A JPS58216123A (ja) | 1982-06-10 | 1982-06-10 | 抗血清 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58216123A true JPS58216123A (ja) | 1983-12-15 |
Family
ID=14250676
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9956682A Pending JPS58216123A (ja) | 1982-06-10 | 1982-06-10 | 抗血清 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58216123A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8481692B2 (en) | 2011-04-22 | 2013-07-09 | Wyeth Llc | Compositions relating to a mutant Clostridium difficile toxin and methods thereof |
| US9717711B2 (en) | 2014-06-16 | 2017-08-01 | The Lauridsen Group | Methods and compositions for treating Clostridium difficile associated disease |
| US10787652B2 (en) | 2012-10-21 | 2020-09-29 | Pfizer Inc. | Compositions and methods relating to a mutant clostridium difficile toxin |
-
1982
- 1982-06-10 JP JP9956682A patent/JPS58216123A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BIOCHEMISTRY INTENRNATIONAL=1981 * |
Cited By (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8481692B2 (en) | 2011-04-22 | 2013-07-09 | Wyeth Llc | Compositions relating to a mutant Clostridium difficile toxin and methods thereof |
| US8557548B2 (en) | 2011-04-22 | 2013-10-15 | Wyeth Llc | Compositions relating to a mutant Clostridium difficile toxin and methods thereof |
| US8900597B2 (en) | 2011-04-22 | 2014-12-02 | Wyeth Llc | Compositions relating to a mutant Clostridium difficile toxin and methods thereof |
| US9187536B1 (en) | 2011-04-22 | 2015-11-17 | Wyeth Llc | Compositions relating to a mutant Clostridium difficile toxin and methods thereof |
| USRE46376E1 (en) | 2011-04-22 | 2017-04-25 | Wyeth Llc | Compositions relating to a mutant Clostridium difficile toxin and methods thereof |
| US11535652B2 (en) | 2011-04-22 | 2022-12-27 | Wyeth Llc | Compositions relating to a mutant clostridium difficile toxin and methods thereof |
| USRE46518E1 (en) | 2011-04-22 | 2017-08-22 | Wyeth Llc | Compositions relating to a mutant Clostridium difficile toxin and methods thereof |
| US9745354B2 (en) | 2011-04-22 | 2017-08-29 | Wyeth Llc | Compositions relating to a mutant Clostridium difficile toxin and methods thereof |
| USRE48863E1 (en) | 2011-04-22 | 2021-12-28 | Wyeth Llc | Compositions relating to a mutant Clostridium difficile toxin and methods thereof |
| US10597428B2 (en) | 2011-04-22 | 2020-03-24 | Wyeth Llc | Compositions relating to a mutant clostridium difficile toxin and methods thereof |
| US10774117B2 (en) | 2011-04-22 | 2020-09-15 | Wyeth Llc | Compositions relating to a mutant clostridium difficile toxin and methods thereof |
| USRE48862E1 (en) | 2011-04-22 | 2021-12-28 | Wyeth Llc | Compositions relating to a mutant Clostridium difficile toxin and methods thereof |
| US10982198B2 (en) | 2012-10-21 | 2021-04-20 | Pfizer Inc. | Compositions and methods relating to a mutant Clostridium difficile toxin |
| US11208633B2 (en) | 2012-10-21 | 2021-12-28 | Pfizer Inc. | Compositions and methods relating to a mutant Clostridium difficile toxin |
| US10787652B2 (en) | 2012-10-21 | 2020-09-29 | Pfizer Inc. | Compositions and methods relating to a mutant clostridium difficile toxin |
| US11952597B2 (en) | 2012-10-21 | 2024-04-09 | Pfizer Inc. | Compositions and methods relating to a mutant Clostridium difficile toxin |
| US10010531B2 (en) | 2014-06-16 | 2018-07-03 | The Lauridsen Group | Methods and compositions for treating clostridium difficile associated disease |
| US9717711B2 (en) | 2014-06-16 | 2017-08-01 | The Lauridsen Group | Methods and compositions for treating Clostridium difficile associated disease |
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