JPS62174659A - 抗レジオネラ菌多糖体抗体感作ラテツクス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は抗レジオネラ菌多糖体抗体感作ラテックスに関
する。更に詳しくは、特異精製した抗レジオネラ菌多糖
体抗体を感作させたラテックス粒子を含有する感作ラテ
ックスに関する。

［従来技術及びその問題点］ レジオネジ症又はレジオネラ感染症は、在郷軍人病とも
よばれ、レジオネラ拳ニューモフィラ（Ｌｅｇｔｏｎｅ
ｌＬａ　ｐｎｅｕａ＋ａｐｈｉｌａ）をはじめとするレ
ジオネラ菌による感染症で、臨床的には肺炎として認め
られることが多く、特発性肺炎の１〜２％、診断困難な
ウィルス様肺炎の４〜１１％を占める。

この疾患は１９７６年にはじめてアメリカで発見された
が、その後ヨーロッパ、アフリカ、オーストラリア、イ
ンド、日本などでも発見されるようになり、有効な治療
薬が少ないこともあって、肺炎の中でも重要な疾患の一
つになっているが、臨床的には特有の症状がないために
診断は未菌の分離培養に基づいている。しかし、この閑
のための優れた選択培養法がないために、モルモットに
接種して感染させてから屠殺して分離する方法がとられ
ている。この方法は検出率という点で優れた方法である
が、多くの費用、労力と日数を要し、臨床検査に応用す
るのは容易ではない。

しかし、ヒトにレジオネラ菌感染が成立すると、まず菌
体成分の血中及び尿中への遊離、放出がおこり、抗原血
症を起すので、抗原となる菌体成分を体液から特異的に
検出することができれば、レジオネラ菌感染症を極めて
早期に診断することが可能となる。この場合、検出の対
象となる抗原は、安定な物質で、すべての菌株に含まれ
るレジオネラ菌独自の抗原でなければならない。

また、感染によって血中にＭｌｉｌｉシた抗原は患者血
中に存在していた抗体と結合して、抗原抗体結合物、即
ち免疫複合体を形成し、＊＊の抗原として存在している
ことは少ないので、この免疫複合体から容易に抗原を解
離させて測定に供試しうるようなシステムが可能な物質
でなければならない。

このような観点から１本発明者は、抗原としてすべての
レジオネラ菌菌株に含まれる多糖体を抗原として用いた
。レジオネラ菌は、その属する菌種毎に一定の多糖体を
その細胞壁中に含有し感染後血中に可溶化して放出され
る耐熱性の極めて安定な物質である。この多糖体は多糖
体技体と特異的に結合するので、免疫によって作製した
レジオネラ菌体抗体から抗レジオネラ菌多糖体抗体（以
下「ＰＳ抗体」という。）を特異的に分離精製し、これ
をラテックスに感作し、逆受身ラテックス凝集反応によ
って、多糖体抗原を検出する方法を確立し、本発明を完
成するに至った。

従来１体液中に存在するレジオネジ抗原検出法として酵
素抗体法が報告されているが、この方法は煩雑な手技と
多くの労力を要し、臨床検査に応用するのは容易ではな
い、しかし、逆受身ラテックス凝集法を用いれば、レジ
オネラ菌感染症を極めて簡単な操作で、発症初期に確実
に診断することができる。

［発明の構成］ 本発明は１表面にＰＳ抗体を担持したラテックス粒子を
含有するＰＳ抗体感作ラテックスに関するものである。

次に、本発明を更に詳細に説明する。

本発明の感作ラテックスを製造するために用いるラテッ
クスは、ポリスチレン、カルボキシル化ポリスチレン、
アミノ基を有するカルボキシル化ポリスチレン、ポリビ
ニルトルエン、スチレン−ブタジェン共重合体、カルボ
キシル化スチレン−ブタジェン共重合体、スチレン−ジ
ビニルベンゼン共重合体、ビニルトルエン−第三ブチル
スチレン共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポ
リメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、アクリロニト
リル−ブタジェン−スチレン共重合体、ポリ酢酸ビニル
アクリレート、ポリビニルピロリドン、塩化ビニル−ア
クリレート共重合体等の合成高分子ラテックス粒子から
なるラテックスであり、更にこれらの合成高分子ラテッ
クス粒子の表面を非イオン界面活性剤等で処理したもの
であってもよい。上記した合成高分子ラテックスのなか
でもポリスチレンラテックスが好ましい。ラテックス粒
子の粒径は、通常０．０１〜１０延であり、好ましくは
０．１〜１．０　ＩＬであるが、分析試験結果の再現性
をよくするためには、粒径分布の幅が狭いもの、例えば
、±５％以下のものが望ましい。

また、使用されるラテックス粒子の比重は０．９〜２．
０であることが好ましい。

レジオネラ菌はＢ−ＣＹＥ寒天培地などを用いて３７℃
で炭酸ガス培養をすれば約２日間で容易に菌体を得るこ
とができる。この菌体を生理食塩水などで洗浄してから
１００℃で約３０分加熱して、常法通りウサギ、ヤギな
どに免疫すれば容易に抗レジオネラ菌抗体が得られる。

この抗体の中にはＰＳ抗体も含まれているので、これか
らＰＳ抗体を特異的に分離する。

多糖体抗原の抽出法にはフェノール水抽出法、トリクロ
ル酢醜抽出法、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）抽
出法などいくつかの方法が知られている。このうち、フ
ェノール水抽出法は操作が容易で、この目的に適した方
法である。即ち、培養した菌体を洗浄後、熱湯に懸濁し
てから８８℃に保ち、これに６８℃の９０％フェノール
を同量加え、１０分この温度に保つ。これを冷却してか
ら、３０００ｒｐｍで約１５分遠心すると上層と下層に
別れるので。

上層をとり蒸留水に対して透析し、１００，０ＯＯＸ　
ｇで２時間超遠心すると多糖体が透明な沈殿物として得
られる。この沈殿物を水にＱ濁して超遠心することを数
回繰り返せば不純物の少い標品が得られる。

次に抗レジオネラ菌抗体からＰＳ抗体を分離精製するた
めには次の方法に従う。先ず、抗体中に多糖体抗原を加
えてよく混合し、免疫複合体を作らせ、遠心して分取し
、生理食塩水で十分に洗浄する。これにｐＨ２，８の酢
酸緩衝液を加えると抗原と抗体が解離して可溶性となる
。これにｐ）１２　、８の飽和硫酸アンモニウム水溶液
を加えると多糖体は沈殿せず抗体のみが沈殿するので、
遠心してこれを集め、展飽和硫酸アンモニウム水溶液で
洗浄した後、水に溶解し、生理食塩水などに対して透析
して、硫酸アンモニウムを除けばＰＳ抗体が精製される
。

次に、ＰＳ抗体をラテックス粒子に感作させる為には、
当該ラテックス粒子と抗体とを水、生理食塩水、ｐＨ５
，５〜１０、好ましくはｐ）１１３．４〜７．６の各種
緩衝液等の中で、濃度０．０５〜３％のラテックス粒子
と抗体とを４〜４０℃において３０分〜２４時間ゆるや
かに攪拌しながら接触させることによって行なう、緩衝
液としては１例えばリン酸塩緩衝食塩水、グリシン緩衝
食塩水などがある。

感作終了後は水性溶媒、例えば前記緩衝液で洗浄するこ
とにより、ラテックス粒子に吸着されない抗体を完全に
除去する。更にこのラテックスは希釈液に懸濁させてラ
テックス粒子の抗体未感作部分を蛋白質で飽和しておく
とよい。

希釈液としては、グリシン緩衝食塩水、リン酸塩緩衝食
塩水等に牛血清アルブミン（以下ｒＢＳＡＪという、）
約０．１％を加えたものを用い、０．０１〜０．５％の
ナトリウムアジド（ＮａＮ３）を加えておく。

このようにして得られた感作ラテックスは約０．２５ｉ
量％に希釈液に懸濁させた状態で氷室に保存すればよい
。

本発明のＰＳ抗体感作ラテックスはレジオネラ菌多糖体
抗原により凝集されるので、先ずヒトの血清や尿などの
体液を蒸留水で例えば４倍に希釈し、これを１００℃で
ｌθ〜２０分程度加熱して、免疫複合体を構成する抗体
部分を失活させて多糖体抗原を遊離の状態にし、この溶
液又はその希釈液にＰＳ抗体感作ラテックスを接触させ
ると、加熱体液又はその希釈液中に抗原が存在すれば感
作ラテックスは凝集反応を起す。

この反応をマイクロタイター法で行なう場合、マイクロ
プレート上に管底凝集像として認めることができる。即
ち、プレートに一定量の希釈液を滴下分注し、次いで第
１六目に一定量の加熱体液を加え、グイリュータ−で順
次希釈する。これに感作ラテックスを滴下分注し、一定
時間後に管底凝集像を判定する。この場合、濃度既知の
標準多糖体を併用するならば、この標準物質についての
凝集値から比例計算することにより未知の体液濃度を計
算することが容易であり、未知体液中の多糖体濃度を求
めることができる。

［発明の効果］ 本発明の感作ラテックスは次の点で極めて大きな利点を
有している。即ち、体液中にはラテックスそのものに対
する非特異的凝集素、即ち担体に対する抗体が全く存在
しえず、また実際に発見されていないので被検体液は無
処理でも加熱処理してもよい、またその為の確認試験も
必要としない。マイクロプレートのウェルに加熱した体
液又はその希釈液を入れ、これに感作ラテックスを滴下
するだけでよい、即ち、多糖体抗原の定量は極めて容易
かつ簡便であり、特別の技術を全く要しない。しかも抗
体は精製されているので極めて特異的であり、しかも感
度は人体液中の測定には不足はないし、同時に多数の検
体の定性及び／又は定量を行なうことができる。

本発明の感作ラテックスを用いれば、従来容易に実施す
る方法がなかった体液中のレジオネラ菌多糖体抗原濃度
を短時間に容易かつ簡便に定量することができ、レジオ
ネラ感染症の早期診断が正確に行えるようになり、早期
から適切な治療を行うことができるようになる。

現在、逆受身凝集反応によるレジオネラ症の診断方法は
全く知られておらず、ＰＳ抗体感作ラテックスを記載し
た文献は全くなく、ＰＳＳ抗体感作ラテックス用いるレ
ジオネラ菌抗原の凝集反応は全く新規である。

また、この感作ラテックスはレジオネラ菌多糖体にのみ
反応し、他種菌の多糖体又は血漿蛋白に全く反応しない
こと、未感作ラテックスはレジオネラ菌多糖体に全く反
応しないことから、この感作ラテックスはＰＳ抗体が結
合しているものであるといえる。

［発明の実施例］ 次に本発明を調製例及び実施例によって更に詳廁に説明
するが９本発明はその要旨を超えない限りこれらによっ
て限定されるものではない。

レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐ
ｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）Ａ　Ｔ　ＣＣ３３１５２をＢ−
ＣＹＥ寒天培地に接種し、炭醜ガス卿卵器中において３
７℃で４８時間培養した。寒天上の菌体をコンラージ棒
でかきとって集め、生理食塩水で３回洗浄してから。

生理食塩水に懸濁して１００℃の水浴中で３０分加熱し
て死菌菌体とした。

鳳製側」 ４レジオネラ　　　１　　・ 調製ｌの菌体を生理食塩水に約ｔｏ’　７ｔになるよう
に！ｇ濁し、この菌液を約２．５ｋｇのウサギの耳静脈
に１回１．０−ずつ２日おきに１０回注射して免疫し、
最後の免疫から１週間後に頚動脈から全採血を行ない、
常法通り血清を分離し、５６℃で３０分加熱して抗レジ
オネラ菌菌体抗体を得た。

調製例１で調製したレジオネラ菌菌体５０ｇを水に懸濁
して２００−と′し、湯煎して１００℃にしてから６８
℃の恒温水槽で保温した。これに予め６８℃にした９０
％フェノール２００−を加え１０分処理した。氷室にお
いて冷却してから３０００ｒｐｍで１５分遠心して上層
を分取し、透析チューブに入れて蒸留水に対し一夜透析
した。これを超遠心機を用いてｔｏｏ、ｏｏｏｘ　ｇで
２時間遠心して透明な沈殿物をとり、水に懸濁してから
同様に遠心した。この遠心を３回綴り返して、レジオネ
ラ菌多糖体とした。

１翌１」 調製例２で作製した抗レジオネラ菌菌体抗体４０−に調
製例３で調製した多糖体を４ｍｌ加えた。

抗原と抗体が結合して生じた免疫複合体が直ちに沈殿し
てきたので、　３０００ｒｐｍで３０分遠心して分取し
、生理食塩水で３回洗浄した。これをｐ）Ｉ　２．８、
Ｑ、ＩＭの酢酸緩衝液１０ｍ１に溶解し、ｐｉ（２，８
とした飽和硫酸アンモニウム水溶液を１〇−加えた。室
温で１時間スターラーをかけて混和した後、１０．００
Ｏｒｐｍで６０分間遠心して抗体のみを沈殿させ、この
沈殿物を展飽和硫醜アンモニウム水溶液で３回洗浄した
。これを５−の蒸留水に溶解し、生理食塩水に対し１８
時間透析して硫酸アンモニウムを除去した。この間２回
外液を交換した。透析後、１０．０００ｒｐｍで６０分
遠心して不溶物を除き、上清を抗争糖体抗体とした。こ
の抗体はオクタ−ローニー法で多糖体と一本の沈降線を
生じ、単一の抗体であることが証明できた。

支凰皇ユ Ｐ　　Ｓ　Ｌ゛　戚　　ラー　−ス　　・１７１５Ｍリ
ン酸塩緩衝液（ｐｉ（７，２）　１容と生理食塩液３容
との混合液（以下ｒＰＢｓＪという、）にラテックス［
武田薬品工業■製、５ＤＬ５９（比重１．１８、粒径Ｑ
、９ＪＬ）　］をソノ粒子濃度が０．２５％になるよう
に懸濁し、これに、更にＰＢＳを用いて１　：　１８０
になるように希釈した調製例４のＰＳ抗体を等量加え、
室温に３時間保ち、３０００ｒｐ１１で１０分遠心分離
してラテックス粒子を分取し、ＰＢＳ、次いで希釈液で
洗浄した後、希釈液に０．２５％になるように懸濁して
Ｐｓ抗体感作ラテックスを得た。この感作ラテックスは
、レジオネラ菌多糖体とマイクロプレー）ｋで凝集した
。またＰＳ抗体を感作しないラテックスは同一の条件で
レジオネラ菌多糖体を加えても凝集しなかった。

即ち、この感作ラテックスはレジオネラ菌多糖体に特異
的に反応して凝集することが確認できた。

希釈液は１７１３０Ｍ、　ＰＩ（７，２のリン酸塩緩衝
食塩水にＢＳＡを０．１％になるように加えたものであ
る。

血清は蒸留水で１：４とし、尿はそのまま、１００℃で
２０分加熱して試料とした。

合 体濃度を計算した。　　　　　　　　　　　　　　　　
　悠。０ア９ユよ−ｖ　ｚ　ｅ　ｈ　＊ｍ’ｐＥｔＵＲ
’ｐ＊工、　　１度を測定した結果は次表の通りであっ
た。

以上の結果から明らかな如く、血中及び尿中多糖体はレ
ジオネジ症でのみ検出された。即ち１体液中多糖体抗原
濃度を測定することはレジオネジ症の早期診断に極めて
有用であるといえる。

本発明の感作ラテックスを用いれば０．Ｑ２５１ｍｌ程
度の微量の試料で、試料を加熱するだけで極めて容易に
多糖体抗原を定量することができるので臨床診断に特に
適しているといえる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）表面に抗レジオネラ菌多糖体抗体を担持したラテ
   ックス粒子を含有する抗レジオネラ菌多糖体抗体感作ラ
   テックス。
2. （２）ラテックス粒子が平均粒径０．０１〜１０μのラ
   テックス粒子である特許請求の範囲第１項記載の感作ラ
   テックス。
3. （３）ラテックス粒子の比重が０．９〜２．０である特
   許請求の範囲第１項記載の感作ラテックス。