JP2957195B2 - Ｂ型肝炎ウイルス抗体検出システム - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＢ型肝炎ウイルス表面抗原（以下HBs抗原と
記す）に対する抗体（以下HBs抗体と記す）を検出する
方法及びそのための試薬に関する。詳しくはHBs抗原を
コードする遺伝子がゲノムに組み込まれている天然の細
胞株、及び／又は、遺伝子工学技術を用いてHBs抗原を
コードする遺伝子が人為的に細胞内に組み込まれた細胞
株を培養することにより培養物中に産生されたHBs抗原
を含んでなる、免疫学的反応によるHBs抗体検出用試薬
及びそれを用いる検出方法に関するものである。

したがって本発明は、Ｂ型肝炎の診断、検査、ひいて
はその治療にも広く利用できるものである。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕

Ｂ型肝炎を引き起こすＢ型肝炎ウイルスは感染性が極
めて強く、そのキャリアーは全世界で厖大な数に上ると
言われている。感染しても自覚症状のない場合もある
が、劇症肝炎で死に至ることもあり、更にキャリアーの
一部は慢性肝炎から肝硬変、肝癌へと進行することから
社会的に大きな問題となっている。このようなＢ型肝炎
の感染を未然に予防し、かつ患者の治療を全うすること
が現代臨床医学上の大きな課題の一つとなっているので
ある。Ｂ型肝炎に感染すると血清中にHBs抗体が出現す
る。このHBs抗体を高感度に検出することは、Ｂ型肝炎
に関するほぼ全てのステージ、即ち初期感染の有無、ワ
クチン接種の可・不可、ワクチン接種後の有効性の判
定、或いはＢ型肝炎患者の病状経過の診断などにおいて
必須のこととなっている。

一般に、HBs抗体の検出法としてはオクタロニー法、
交差免疫電気泳動法、エンザイムイムノアッセイ、受身
赤血球凝集反応法、ラジオイムノアッセイ等が知られて
いる。そしてこれらの検出法においては、特異性と検出
感度の点から、高度に精製されたHBs抗原の使用が不可
欠となっている。

従来は、HBs抗原陽性のヒト血漿若しくはヒト血清か
ら硫安分画、エタノール分画、超遠心分画、密度勾配遠
心分画、アフィニティークロマトグラフィー等公知の精
製法により精製したＢ型肝炎ウイルスがHBs抗原の原料
として用いられて来ている。

しかしながら、Ｂ型肝炎ウイルスを何ら処理すること
なくこれをそのまま使用した場合、感染の危険性が非常
に高い。従って、感染を防ぐ目的で、HBs抗原ワクチン
の製法の分野で行われている技術、即ち精製Ｂ型肝炎ウ
イルスに対して加熱処理やホルマリン処理などの不活化
処理を行ったHBs抗原をHBs抗体検出用試薬に用いている
のが現状である。

この場合でも、不活化処理の際には生のＢ型肝炎ウイ
ルスを取り扱う必要があり、やはり危険性がつきまと
う。

以上のようなヒト血液を原料としているHBs抗原は、
感染の危険性が高いだけでなく、血液成分中の非特異的
凝集を呈する混在因子の影響を受け易く、又HBs抗原の
精製に複雑な工程を必要とし、しかも大量供給が難しい
など、多々の問題を有している。

近年、HBs抗原をコードする遺伝子が組み込まれてい
る天然のヒト細胞株、或いは遺伝子工学技術を用いて該
遺伝子が人為的に組み込まれたヒト或いはマウス等の動
物細胞株を培養することによりHBs抗原を得て、これを
診断剤に応用する報告が幾つか開示されている（特開昭
59−74991号、特開昭61−268177号、特開昭61−158798
号、特開昭61−231997号、特開昭62−55088号、特開昭6
3−45227号、特開昭63−22098号など）。しかしなが
ら、これらの報告は何れも製造されたHBs抗原が診断剤
として利用できる可能性を記載しているに留まってお
り、診断剤として実用化できるほど具体的に完成される
までには至っていないのである。

〔課題を解決するための手段〕

かかる現状に鑑みて、本発明者らは鋭意研究を行った
結果、遺伝子工学技術或いは細胞工学技術によって得ら
れたHBs抗原が、全く予期せざることに、Ｂ型肝炎ウイ
ルスの感染による生体の免疫応答で成立したHBs抗体と
特異的に反応することを新たに見い出し、この有用な新
知見に基づき本発明を完成させるに至った。即ち、本発
明はＢ型肝炎ウイルスゲノムのプレーS1領域、プレーS2
領域、並びにＳ遺伝子のうちの少なくとも一種以上を保
持している細胞から産生されたHBs抗原を含有してなる
ことを特徴とする、HBs抗体検出システムに関するもの
である。

本発明でいうＢ型肝炎ウイルスゲノムのプレーS1領
域、プレーS2領域、並びにＳ遺伝子のうちの少なくとも
一種以上を保持している細胞とは、まず、遺伝子工学技
術によりＢ型肝炎ウイルスゲノムのプレーS1領域、プレ
ーS2領域、並びにＳ遺伝子のうちの少なくとも一種以上
を人為的に組み込んだ細胞が挙げられる。このように人
為的に創製した細胞株においては、該遺伝子が挿入され
たプラスミドが細胞核外にエピゾームとして存在してい
る場合と、該遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれている
場合とがあるが、本発明ではこれらの両方のタイプの細
胞株が利用され得る。次に、Ｂ型肝炎ウイルスに自然感
染した結果、該ウイルスのプレーS1領域、プレーS2領
域、並びにＳ遺伝子のうちの少なくとも一種以上の遺伝
子がゲノムに組み込まれたヒト細胞株、例えばヒト肝癌
細胞を挙げられる。以上のような条件を満たす細胞株で
公知のものとして、遺伝子工学技術により創製された細
胞株ではクローンA123（特開昭63−132845号）やMS128
（第61回日本生化学会大会抄録、60、No.8、p.699及び
特願昭63−65070号）が挙げられ、又Ｂ型肝炎ウイルス
に自然感染した結果該ウイルスの遺伝子がゲノムに組み
込まれたヒト細胞株では、huSP（特開昭60−45535
号）、huGK−14（特開昭61−158798号）等を挙げること
が出来る。これらの細胞株は何れも本発明に係るHBs抗
原を取得するのに使用され得るが、特にhuGK−14或いは
MS128の産生するHBs抗原を利用することが好ましい。

そして酵母若しくはバクテリアなどの動物細胞以外の
細胞にＢ型肝炎ウイルスゲノムのプレーS1領域、プレー
S2領域、並びにＳ遺伝子のうちの少なくとも一種以上を
組み込んだ細胞は本発明では使用されない。

本発明で用いられるHBs抗原は、上で述べた細胞株が
産生するプレS1蛋白質、プレS2蛋白質、Ｓ抗原のうちの
少なくとも一種以上を含むものである。しかして本発明
のHBs抗原は、Ｂ型肝炎ウイルス粒子に非常に類似した
ウイルス外被を有しておりHBs抗体と特異的に結合する
が非感染性のものであり、また一部がグリコシル化され
ている場合もある。

上述の細胞株を培養することにより培養液、培養上
清、培養濾液、培養細胞体といった培養物中に得られた
HBs抗原は、任意の公知方法を用いて精製を行えばよ
い。一例として、限外濾過膜により培養上清を適当に濃
縮後、硫安塩析或いは超遠心分離を行い、その後塩化セ
シウムによる平衡遠心法、庶糖濃度勾配遠心法を組み合
わせて精製する方法（特開昭61−158798号）が挙げられ
る。

以上のようにして得られたHBs抗原は、当分野で通常
用いられている免疫学的反応に基づく抗体の検出方法、
例えばオクタロニー法、交差免疫電気泳動法、エンザイ
ムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫分
析法、受身赤血球凝集反応法、並びに血球、ラテックス
或いはその他の人工粒子を担体として用いた間接凝集反
応等によってHBs抗体を検出するための試薬の主成分と
して使用される。

本発明においては、後記するように、ヒト肝癌細胞由
来の細胞株、肝炎ウイルスDNAの形質転換細胞株といっ
た既知の細胞株を使用できるが、特にこのような場合に
は危険なＢ型肝炎ウイルスを直接取扱う必要がないた
め、感染することもなくきわめて安全である。

〔作用〕

本発明のHBs抗体検出用試薬を、HBs抗原陽性のヒト血
漿若しくはヒト血清を原料として製造されたHBs抗原を
主成分として含有する従来のHBs抗体検出用試薬と比較
すると、以下に記す有利な点を有している。

まずHBs抗体検出用試薬の主成分であるHBs抗原の製造
に当たっては、 １）従来、感染予防の目的で精製されたHBs抗原に対し
て行われてきたホルマリン処理或いは加熱処理などの不
活性処理が不要である。

２）従来のHBs抗原陽性ヒト血漿由来のHBs抗原を主成分
とする試薬のつきものの、血液成分に起因する非特異的
反応が起こらない。

３）従来のHBs抗原陽性ヒト血漿由来のHBs抗原を主成分
とするHBs抗体検出用試薬を用いては全く検出出来ない
か、或いは極く僅かの検出感度しか得ることの出来なか
ったHBs抗体を、特異性よく、しかも高感度に検出でき
る。

等の優れた特性を有しているのである。

次に本発明に係るHBs抗原の製造例を示す。

〔製造例〕

（１）培養細胞由来のHBs抗原の製造 ヒト肝癌細胞由来の細胞株huGK−14（微生物工業技術
研究所に寄託番号FERM P−10665として寄託されてい
る）についてはその培養上清より、特許協力条約に基づ
いて公開された国際特許出願国際公開番号WO86/03975に
記載の方法に従ってHBs抗原を精製した。簡単に述べる
と、（ａ）培養上清を限外濾過膜により10〜30倍に濃
縮、（ｂ）得られた濃縮液を抗HBs抗原モノクローナル
抗体を結合させたアフィニティークロマトグラフィーカ
ラムに負荷、（ｃ）カラムに吸着している蛋白質を溶
出、（ｄ）溶出液を塩化セシウムを用いた平衡密度勾配
超遠心にかける、（ｅ）抗原画分を取り出して緩衝液で
透析、（ｆ）メンブレンフィルターに通すことにより濾
過滅菌、というステップを踏んで精製HBs抗原を得た。

Ｒ−IIIマウス由来の培養細胞C127（ATCC CRL1616）
にＢ型肝炎ウイルスのDNAをトランスフェクトして得ら
れた形質転換細胞株MS128（微生物工業技術研究所に寄
託番号FERM P−9773として寄託されている）についても
huGK−14の場合と同じ方法で培養上清より精製HBs抗原
を得た。

（２）血清由来のHBs抗原の製造 HBs抗原陽性プール血清より常法により精製した。具
体的に用いた方法は以下の通りである。HBs抗原陽性血
清20lをpH7.0において飽和硫安50〜55％で沈殿分画後生
理食塩水で溶解し、同溶液で塩析した。塩析内液をセフ
ァロース6B（ファルマシア社製）カラム（φ５×100c
m）に負荷して分画しつつゲル濾過した。280nmにおける
吸光度の最初のピークの画分を取り、これを粗HBs抗原
とした。この粗HBs抗原を抗HBsモノクローナル抗体（シ
ノテスト社製）結合セファロース4B（ファルマシア社
製）カラム（φ５×3cm）に負荷し、pH7.6のPBS（本明
細書の比較例及び実施例で用いられたPBSのpHは、以下
全て7.6であった）で洗浄後、3MのKSCNを含むPBSにより
カラムに吸着された物質を溶出した。これをPBSで透析
後、透析内液を塩化セシウムによる平衡遠心法を用い
て、超遠心機（日立製作所製SCP85H）にて130,000×
ｇ、50時間遠心し、HBs抗原画分を得た。この画分をPBS
で透析した後、透析内液を取って60℃で10時間の不活化
処理を行って精製HBs抗原を得た。

〔比較例〕

本発明に係るHBs抗原と従来のHBs抗原とのHBs抗体に
対する検出感度を受身赤血球凝集法によって比較した。

（１）HBs抗原感作赤血球の調製 市販のヒツジ赤血球を生理食塩水で洗浄した後、PBS
で５％（v/v）に浮遊させたもの４容に対し、2.5％（w/
v）のグルタルアルデヒドのPBS溶液１容を加え、室温で
２時間反応させた。反応終了後PBSで遠心洗浄し、グル
タルアルデヒド固定化ヒツジ赤血球を得た。該固定化ヒ
ツジ赤血球の５％PBS浮遊液１容に、0.005％（w/v）タ
ンニン酸を含むPBS溶液１容を加え室温で30分間反応さ
せた後PBSで遠心洗浄して、タンニン酸処理固定化ヒツ
ジ赤血球を得た。このタンニン酸処理固定化赤血球の５
％PBS浮遊液１容に対し、製造例に従って調製されたhuG
K−14細胞由来のHBs抗原のPBS懸濁液（1mg/ml）、若し
くは血清由来のHBs抗原のPBS懸濁液（1mg/ml）１容を加
え、室温で３時間反応させた。これらの反応液をそれぞ
れPBSで遠心洗浄し、赤血球濃度が0.5％（w/v）となる
ように１％（v/v）正常ウサギ血清を含むPBSに浮遊させ
た。

以上のようにして得られたhuGK−14細胞由来のHBs抗
原若しくは血清由来のHBs抗原を結合させたタンニン酸
処理固定化ヒツジ赤血球（以下HBs抗原感作固定化ヒツ
ジ赤血球という）を以下の試験に供した。

（２）検出方法 市販のラジオイムノアッセイ用試薬でHBs抗体陽性と
された血清22検体について、上記（１）に従って調製さ
れたhuGK−14細胞由来HBs抗原感作固定化ヒツジ赤血球
若しくは血清由来HBs抗原感作固定化ヒツジ赤血球を用
いて、受身赤血球凝集法によりHBs抗体を下記の要領に
て検出を試みた。

まず上記検体をPBSで10倍に希釈した後、これらの各
希釈検体25μｌをＵ型96穴マイクロプレート（住友ベー
クライト社製）の各ウェルに入れ、１％（v/v）正常ウ
サギ血清を含むPBS 25μｌを加えて検体を希釈した（20
倍希釈）。この20倍希釈液から25μｌを取って別のウェ
ルに入れ、１％（v/v）正常ウサギ血清を含むPBS 25μ
ｌを加えて検体を希釈した（40倍希釈）。このような希
釈操作を繰り返すことにより、希釈倍数が20〜2,560倍
（2¹〜2⁸×10）の検体を得た。次に各ウェルに前記
（１）で得られたHBs抗原感作固定化ヒツジ赤血球（huG
K−14細胞由来HBs抗原若しくは血清由来HBs抗原）のPBS
浮遊液（0.5％（w/v）25μｌづつを加え、プレート全体
をマイクロミキサーで１分間振盪し、室温にて２時間静
置した後、赤血球凝集の有無によるHBs抗体の検出を行
って、各HBs抗原感作固定化ヒツジ赤血球の検出感度を
凝集価で評価した。

凝集価は各検体において赤血球の凝集が認められた終
末点（end point）における希釈倍数値で表わした。

HBs抗原を感作していない固定化ヒツジ赤血球のPBS浮
遊溶液を用いた他は上記と同じ方法及び試薬による実験
を対照実験として行った。

凝集価の測定結果を第１図に示す。第１図においては
横軸にhuGK−14細胞由来HBs抗原感作赤血球の凝集価
を、縦軸に血清由来HBs抗原感作赤血球の凝集価を取
り、各々の検体の両HBs抗原感作赤血球による凝集価を
座標としてグラフ上に●又は○でポイントした。この図
の座標のN.D.は全ての検出濃度に亙って検出されなかっ
たこと（not detected）を意味する。

この図に示されているように、HBs抗原として血清由
来のHBs抗原を用いた場合に比べて、huGK−14細胞由来
のHBs抗原を用いた場合の方が、一部の例外を除き、同
一検体に対して２倍以上高い検出感度を有することが判
明した。これら22検体の内、特に２検体（第１図中の○
で示した検体No.1及びNo.2）に関しては、血清由来のHB
s抗原感作固定化赤血球を用いた場合には、殆ど凝集し
なかったのに対し、huGK−14細胞由来のHBs抗原感作固
定化赤血球を用いた場合には高い凝集価を示した。

すなわち、検体No.2においては、従来法（血清由来HB
s抗原を用いた試薬）によれば凝集が生じなかった（N.
D.）のに対して、本発明によれば640倍もの高稀釈でも
抗体が検出された。また検体No.1において、従来法によ
れば20倍の希釈でやっと抗体が検出されたのに対して、
本発明によれば320倍希釈でも抗体が検出され、160倍も
の高い検出感度を有することが実証された。

一方対照実験においては、何れの検体の場合でも固定
化ヒツジ赤血球の凝集は認められなかった。

上記の血清由来のHBs抗原感作固定化赤血球を用いた
場合とhuGK−14細胞由来のHBs抗原感作固定化赤血球を
用いた場合とで著しい検出感度の差が見られた２検体
（No.1及びNo.2）について、これがHBs抗体に対する特
異的な反応によるものであることを確認するために、Hb
s抗原による吸収試験を以下の（３）に記載の方法によ
り行った。

（３）HBs抗原による吸収試験 上記（２）においてhuGK−14細胞由来のHBs抗原感作
固定化赤血球のみに高い凝集性を示した血清２検体（第
１図の○で示した検体No.1及びNo.2）と、市販の抗HBs
モノクローナル抗体（英国ケンブリッジラボ社製）を１
μg/mlの割合で添加されたヒト正常血清（ポジティブコ
ントロールとして使用）を用意し、これらの計３検体を
PBSで10倍に希釈した。この10倍希釈された各検体25μ
ｌをＵ型96穴マイクロプレート（住友ベークライト社
製）のウェルに入れ、１％（v/v）正常ウサギ血清を含
むPBS25μｌを用いて上記（２）と同じ様にして各検体
を倍々希釈した系列（20〜2560倍）を作った。次いでhu
GK−14細胞由来の精製HBs抗原（２μg/ml）の１％（v/
v）正常ウサギ血清−PBS懸濁液10μｌを前記の各ウェル
に添加し、プレート全体をマイクロミキサーで１分間振
盪した後、室温で２時間反応させた。

huGK−14細胞由来の精製HBs抗原の代わりに１％（v/
v）正常ウサギ血清−PBS10μｌを用いた他は上と同じ条
件の実験を対照実験として行った。

反応終了後、各ウェルに0.5％（w/v）huGK−14細胞由
来のHBs抗原感作固定化ヒツジ赤血球の浮遊液25μｌづ
つを加え、プレートをマイクロミキサーで１分間振盪し
て、室温にて２時間静置後の赤血球凝集反応の有無から
上記（２）と同様にして凝集価を決定した。

この結果を表１に示す。

対照実験を基準とすると、３つの検体の何れにおいて
もhuGK−14細胞由来のHBs抗原を添加することにより大
幅に赤血球凝集が阻止されることが表１から示された。
このことから上記（２）において２つの検体No.1及びN
o.2について血清由来のHBs抗原感作固定化赤血球を用い
た場合の凝集価に比べてhuGK−14細胞由来のHBs抗原感
作固定化赤血球を用いた場合の凝集価が大変高く、著し
い検出感度の差が見られたのは、HBs抗体に対する特異
的な反応においてhuGK−14細胞由来のHBs抗原感作固定
化赤血球を用いた場合の高い検出感度によるためである
ことが確認された。

（４）結論 以上の比較例における実験結果から、本発明でHBs抗
体検出用試薬として使用されるhuGK−14細胞由来のHBs
抗原は当業者の予想を越えた検出感度を有し、しかもそ
の検出感度の高さはHBs抗体に対する特異的な反応によ
るものであって、非特異的な反応によるものではないこ
とが示された。

以上の比較例において、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムのプ
レーS1領域、プレーS2領域、並びにＳ遺伝子のうちの少
なくとも一種以上を保持している細胞としてhuGK−14を
一例として用い、その培養上清から得られたHBs抗原に
ついて、血清由来のHBs抗原との検出感度の比較及び、H
Bs抗体に対する反応特異性を述べた。

〔実施例〕

本発明に係るhuGK−14細胞或いはMS128細胞の培養上
清より得られた精製HBs抗原をHBs抗体検出用試薬の主成
分として用いて、HBs抗体を免疫学的反応により検出し
た例を以下に実施例として記載する。

実施例１ エンザイムイムノアッセイによるHBs抗体の検出 （１）HBs抗原結合マイクロプレートの調製 huGK−14細胞の培養上清より得られた精製HBs抗原をP
BSで１μg/mlに希釈し、これをエンザイムイムノアッセ
イ用96穴マイクロプレート（住友ベークライト社製）の
各ウェルに50μｌずつ分注した。このプレートを４℃で
10時間放置してHBs抗原をウェルに吸着させた後PBSで洗
浄し、１％（v/v）BSA−PBS溶液を200μｌ加えて４℃で
５時間放置することによりウェルの抗原未吸着部分を覆
い、HBs抗原結合マイクロプレートを調製した。

以上のようにして得られたHBs抗原結合マイクロプレ
ートを以下の実験に供した。

（２）パーオキシダーゼで標識された抗ヒトIgG抗体の
調製 西洋ワサビパーオキシダーゼ（ベーリンガー社製、グ
レードＩ）5mgを0.3M炭酸緩衝液（pH8.1）1mlに溶解
し、これに2,4−ジニトロフルオロベンゼン（DNFB）の
１％溶液 0.2mlを加え、室温で１時間撹拌した。得ら
れたDNFB結合パーオキシダーゼを0.01M炭酸緩衝液（pH
9.5）に対して透析した。透析内液を取り、これに精製
抗ヒトIgGウサギ抗体（カッペル社製）5mgを含む0.01M
炭酸緩衝液1mlを添加して、室温で２時間撹拌した。こ
の反応液を予めPBSで平衡化しておいたセファロース6B
（ファルマシア社製）カラム（φ2.5×100cm）に負荷し
て5mlづつ分画しつつゲル濾過した。得られた各画分に
ついて280nmにおける吸光度（蛋白質濃度）及び403nmに
おける吸光度（西洋ワサビパーオキシダーゼ）を測定し
て、両吸光度の最初のピークに溶出されてきた画分を取
って、これをパーオキシダーゼで標識化された抗ヒトIg
G抗体とした。

（３）HBs抗体の検出 比較例の（２）のHBs抗体の検出で用いたHBs抗体陽性
ヒト血清のうちのhuGK−14細胞由来のHBs抗原感作固定
化赤血球のみに高い凝集性を示した２検体及びHBs抗体
陰性ヒト血清１検体の計３検体を１％BSA（w/v）−PBS
溶液によりそれぞれ50倍希釈した。これらの50倍希釈液
を１倍として試験管内で１％BSA（w/v）−PBS溶液によ
り倍々希釈（100〜12,800倍）した。これらの各希釈血
清50μｌを上記HBs抗原結合マイクロプレートの各ウェ
ルに添加して、ウェットチェンバー内で37℃３時間反応
させた。反応終了後該マイクロプレートの各ウェルを0.
05％ツィーン20−PBS溶液で十分に洗浄し、上記（２）
で得られた西洋ワサビパーオキシダーゼ標識化抗ヒトIg
Gウサギ抗体の１％BSA（w/v）−PBS希釈液50μｌを添加
して、ウェットチェンバー内で37℃３時間反応させた。
その後各ウェルを0.05％ツィーン20−PBS溶液を用いて
十分に洗浄し、OPD溶液（Method in Enzymology,70,p.4
32）を100μｌずつ添加して、37℃で30分間反応させ
た。次いで4N硫酸を100μｌづつ各ウェルに添加して反
応を停止させ、各ウェルの吸光度をマイクロプレートリ
ーダー（コロナ電気社製）によって計測した。対照実験
として、HBs抗原を結合していないマイクロプレートを
用いて以上と同様の実験を行った。

結果を第２図に示す。

この図が示すように、本発明に係るHBs抗体検出用試
薬を結合せしめたマイクロプレートによりHBs抗体を特
異的に検出することが出来た。

実施例２ マイクロプレートを用いた間接凝集法によるHBs抗体の
検出;HBs抗原としてhuGK−14細胞由来の精製HBs抗原を
使用 （１）HBs抗原結合担体粒子の調製 PBSに対して２％（w/v）となるように浮遊させた高比
重粒子（徳山曹達社製）１容に対し、huGK−14細胞より
得られた精製HBs抗原（20μg/ml）１容を加え、４℃で
１時間保持して、粒子にHBs抗原を結合させた。そして
該粒子をPBSで洗浄し、非特異的吸着を抑えるために１
（w/v）BSA−PBS中に更に４℃10時間該粒子を浸漬し
た。その後この粒子を１％（v/v）正常ウサギ血清−PBS
で１回遠心洗浄し、最終的に0.3％（w/v）となるように
１％（v/v）正常ウサギ血清−PBSに浮遊させたHBs抗原
結合粒子を得た。

以上のようにして得られたHBs抗原結合粒子を以下の
実験に供した。

（２）HBs抗原結合測定マイクロプレートの調製 PBSで１μg/mlに希釈した精製HBs抗原をＵ型96穴マイ
クロプレート（住友ベークライト社製）の各ウェルに50
μｌずつ分注し、４℃で一晩放置して該HBs抗原を該マ
イクロプレートに吸着させた。その後各ウェルをPBSで
洗浄し、１％（w/v）BSA−PBS200μｌを加え、最後に４
℃で３時間放置してウェルの抗原未吸着部分を覆うこと
によりHBs抗原の結合したマイクロプレートを調製し
た。

（３）HBs抗体の検出 比較例の（２）のHBs抗体の検出で用いたヒト血清検
体のうちからhuGK−14細胞由来HBs抗原感作固定化赤血
球のみに高い凝集性を示した２検体（No.1及びNo.2）、
抗HBsモノクローナル抗体（英国ケンブリッジラボ社
製）を１μg/mlとなるように添加したヒト正常血清HBs
抗体（ポジティブコントロールとして使用）、及びHBs
抗体陰性ヒト血清（ネガティブコントロールとして使
用）、の計４検体をPBSでそれぞれ10倍に希釈した。こ
れらの希釈血清25μｌを0.2％（w/v）ツィーン20及び２
％（w/v）BSAを含むPBS25μｌを用いて、前記（２）で
調製したHBs抗原結合マイクロプレートの各ウェル中に
て倍々希釈（20〜2,560倍）した。次に各ウェルに前記
（１）で調製されたHBs抗原結合粒子の浮遊液を25μｌ
づつ加え、マイクロプレートをマイクロミキサーで１分
間振盪後、室温で１時間静置して凝集像を肉眼で判定し
た。

一方これとは別に、HBs抗原を結合していない高比重
粒子の浮遊液を用い、他の方法と試薬は同一とした実験
を対照実験として行った。

凝集価は各検体において凝集像が認められた終末点に
おける希釈倍数値で表わした。

結果を第２表に示す。

この表２が示すように、本発明に係るhuGK14細胞由来
のHBs抗体検出用試薬を結合せしめた粒子の凝集反応に
より、HBs抗体を特異的に検出することが出来た。

実施例３ マイクロプレートを用いた間接凝集法によるHBs抗体の
検出;HBs抗原としてMS 128細胞由来の精製HBs抗原を使
用 （１）HBs抗原結合担体粒子の調製 HBs抗原としてMS128細胞の培養上清より得られた精製
HBs抗原を用いた以外は実施例２（１）と同じ方法でHBs
抗原結合担体粒子を調製した。

（２）HBs抗原結合測定マイクロプレートの調製 HBs抗原としてMS128細胞の培養上清より得られた精製
HBs抗原を用いた以外は実施例２（２）と同じ方法でHBs
抗原結合測定マイクロプレートを調製した。

（３）HBs抗体の検出 市販のラジオイムノアッセイ用試薬でHBs抗体陽性と
された血清80検体をPBSで20倍に希釈した。これらの希
釈血清25μｌを0.2％（w/v）ツィーン20及び２％（w/
v）BSAを含むPBS25μｌを用いて、前記（２）で調製し
たHBs抗原結合マイクロプレートの各ウェル中にて倍々
希釈（40〜10,240倍）した。次に各ウェルに前記（１）
で調製されたHBs抗原結合粒子の浮遊液を25μｌづつ加
え、マイクロプレートをマイクロミキサーで１分間振盪
後、室温で１時間静置して凝集像を肉眼で判定した。各
検体の凝集価の決定は実施例２と同じである。

対照として、huGK−14細胞由来の精製HBs抗原を用い
て上と全く同じ方法で調製したHBs抗原結合マイクロプ
レート及びHBs抗原結合粒子により、上記80検体に対し
て凝集価を求めた。

結果については、MS128細胞由来の精製HBs抗原を用い
た試薬による凝集価と、対照のhuGK−14細胞由来の精製
HBs抗原を用いた試薬による凝集価との相関を示す形で
第３図に表示した。

この図から明らかなように、MS 128細胞由来の精製HB
s抗原を用いた試薬による凝集価と、対照のhuGK−14細
胞由来の精製HBs抗原を用いた試薬による凝集価とはよ
く相関しており、MS 128細胞より得られた精製HBs抗原
もまたHBs抗体検出用試薬として有用である。

以上、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムのプレーS1領域、プレ
ーS2領域、並びにＳ遺伝子のうちの少なくとも一種以上
を保持している細胞として、細胞株huGK−14及びMS128
を用いた実施例を記載してきたが、これ以外の細胞株を
培養して得られた培養物から調製されたHBs抗原を利用
しても同様な効果を有するHBs抗体検出用試薬を得るこ
とが出来ることは当業者には明白であろう。

〔発明の効果〕

本発明のHBs抗体検出用試薬をエンザイムイムノアッ
セイ、ラジオイムノアッセイ、赤血球凝集法などのHBs
抗体検出法に利用することによって、HBs抗原陽性のヒ
ト血漿若しくはヒト血清を原料として製造されたHBs抗
原を主成分として含有する従来のＢ型肝炎ウイルス抗原
に対するHBs抗体検出用試薬では検出出来ないか、或い
は極く僅かの感度しか得ることの出来なかったHBs抗体
を高感度に検出できるようになった。しかも本発明のＢ
型肝炎ウイルス抗原に対するHBs抗体検出用試薬はその
製造に当たってＢ型肝炎の感染の危険が全く無いもので
ある。

そのうえ本発明によれば、遺伝子工学ないし細胞工学
の技術によりHBs抗体検出用試薬が大量に且つ低コスト
で工業生産することができる。しかも本発明においては
樹立された細胞株も使用することができるので、Ｂ型肝
炎感染の危険性はなく安全にHBs抗体検出用試薬を得る
こともできる。

【図面の簡単な説明】

第１図は受身赤血球凝集法でHBs抗体を検出するに際
し、血清由来のHBs抗原を用いた従来のHBs抗体検出用試
薬を使用した場合とhuGK−14細胞由来のHBs抗原を用い
た本発明に係るHBs抗体検出用試薬を使用した場合との
検出感度の違いを凝集価で比較したものである。 第２図は本発明のHBs抗体検出用試薬を結合させたマイ
クロプレートを用いたエンザイムイムノアッセイによる
HBs抗体の検出を示すものである。この図中で□−□はH
Bs抗体陽性ヒト血清No.1、○−○はHBs抗体陽性ヒト血
清No.2、●−●はHBs抗体陰性ヒト血清を示す。 第３図は間接凝集反応法においてMS128細胞由来のHBs抗
原を用いたHBs抗体検出用試薬を使用した場合と、huGK
−14細胞のHBs抗原を用いたHBs抗体検出用試薬を使用し
た場合との検出感度の相関を凝集価で表わしたものであ
る。

フロントページの続き (72)発明者 内藤 正宏 神奈川県伊勢原市東成瀬４―２―１― 407 (72)発明者 小田 宗宏 神奈川県小田原市成田540番地 明治乳 業ヘルスサイエンス研究所内 (56)参考文献 特開 昭62−55088（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−268177（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−158798（ＪＰ，Ａ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト肝癌細胞の培養物から精製して得られ
   るＢ型肝炎ウイルス表面抗原を含有することを特徴とす
   るＢ型肝炎ウイルス表面抗原に対する抗体検出用試薬。
2. 【請求項２】該ヒト肝癌細胞が細胞株huGK−14であるこ
   とを特徴とする、請求項１記載のＢ型肝炎ウイルス表面
   抗原に対する抗体検出用試薬。
3. 【請求項３】間接凝集反応による検出に用いることを特
   徴とする、請求項１又は２記載のＢ型肝炎ウイルス表面
   抗原に対する抗体検出用試薬。
4. 【請求項４】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に対する抗体を
   検出する方法において、抗原として、ヒト肝癌細胞の培
   養物から精製して得られるＢ型肝炎ウイルス表面抗原を
   用いることを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に
   対する抗体の検出方法。
5. 【請求項５】該ヒト肝癌細胞が細胞株huGK−14であるこ
   とを特徴とする、請求項４記載の検出方法。