JPH0250426B2 - - Google Patents

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JPH0250426B2
JPH0250426B2 JP56083736A JP8373681A JPH0250426B2 JP H0250426 B2 JPH0250426 B2 JP H0250426B2 JP 56083736 A JP56083736 A JP 56083736A JP 8373681 A JP8373681 A JP 8373681A JP H0250426 B2 JPH0250426 B2 JP H0250426B2
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JP
Japan
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hepatitis
serum
substance
present
antibodies
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Junichi Fujimatsu
Tomiaki Morimoto
Toshio Shikata
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Eisai Co Ltd
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Eisai Co Ltd
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Publication date
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Priority to CA000404236A priority patent/CA1184846A/en
Priority to EP82104830A priority patent/EP0066296B1/en
Priority to DE8282104830T priority patent/DE3267389D1/de
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Publication of JPH0250426B2 publication Critical patent/JPH0250426B2/ja
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    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5767Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
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    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K2039/55566Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
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    • C12N2770/24011Flaviviridae
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Description

【発明の詳现な説明】
本発明は非非型肝炎関連抗原および蚺断薬
に関する。さらに詳しくは、非非型肝炎関連
抗原および圓該抗原の結合䜓䞊びにこれらを䞻芁
な構成成分ずしお含有する非非型肝炎蚺断薬
に関する。 りむルス肝炎に぀いおは埓来より型および
型の存圚が知られおおり、すでに関連抗原抗䜓系
も明らかにされ、これを利甚した免疫血枅孊的な
蚺断が可胜ずなり、さらにワクチンの開発、導入
にたで至぀おいる。 しかしながら、これに䌎぀お非非型肝炎、
すなわち、埓来から知られおいる型肝炎および
型肝炎のいずれにも属さないりむルス肝炎の存
圚が知られるようになり、しかもその発生頻床が
予想以䞊に高いこずが明らかずな぀お来た。䟋え
ば、茞血埌肝炎の80〜90あるいはさらにこれ以
䞊のものが非非型肝炎であり、散発的に発生
する急性肝炎に぀いおも玄50は非非型肝炎
であるこずが報告されるに至぀おいる。たた正垞
䟛血者の䞭にさえ非非型肝炎りむルスの保有
者がかなりの数存圚するこずが明らかずな぀お来
た。以䞋に蚘茉する文献は非非型肝炎に関す
る䞊述の状況を報告するものであり、参考のため
に列挙する。 (1) Prince、A.M.et al.Long−incubation
post−transfusion hepatitis without
serological evidence of exposure to
hepatitis− virus.Lancet.241−246、
1974. (2) Alter、H.J.et al.Clinical and
serological analysis of transfusion−
associated hepatitis.Lancet.838−841、
1975. (3) Feinstons、S.M.et al.Transfusion−
associated hepatitis not due to viral
hepatitis type  or B.N.Engl.J.Med.292
767−770、1975. (4) Meyers、J.D.et al.Parenterally
transmitted non−、non− hepatitis.
Ann.Intern.Med.8757−59、1977. (5) Villarejos、V.M.et al.Evidence for
viral hepatitis other than type  or type
 among persons in Costa Rica.N.Engl.J.
Med.2931350−1352.1975. (6) Dienstag、J.L.et al.Etiology of
sporadic hepatitis  surface antigen−
negative he−patitis.Ann.Intern.Med.87
−、1977. さお、ここで非非型肝炎ずは型肝炎りむ
ルス、型肝炎りむルス、サむトメガロりむル
ス、゚プスタむンバヌりむルスなど埓来知られた
りむルス以倖のりむルスが病原䜓ずしお関䞎する
こずにより発生するず考えられる肝炎であ぀お、
HA抗䜓、HBs抗䜓、HBc抗䜓、HBe抗䜓に぀
いお有意の䞊昇が認められないものを蚀う。埓぀
お、非非型肝炎患者ずは、肝炎りむルスに起
因する肝炎患者であ぀お型肝炎蚺断および型
肝炎蚺断においお陰性を瀺し、型肝炎からも
型肝炎からも陀倖された患者であるず定矩され
る。䞀般に非非型肝炎では、型肝炎に比范
するず茞血から発症たでの平均朜䌏期が短く、た
たGPTの最倧倀も䜎いずいう傟向がある。しか
しその反面、持続性があり、䟋えばGPT異垞は
慢性化しおかなりの長期間に及ぶずいう特城があ
る。しかし、いずれにせよ、非非型肝炎は茞
血埌肝炎の倧郚分を占めおおり、か぀非非型
肝炎りむルスが原因ずなる肝疟患は肝硬倉、肝癌
など広範囲に及んでおり、適切なる察応策が早急
に開発されるこずが望たれおいるのである。しか
るに、非非型肝炎に぀いおは、未だそのりむ
ルス本態あるいはそれに関連した抗原抗䜓系が確
立されおおらず、埓぀お適切なる蚺断およびワク
チンの補造がなされおいないのが珟状である。 非非型肝炎関連抗原に関する先行技術ずし
おは特開昭55−122156公報に蚘茉された発明があ
り、HC抗原ず呜名される物質の提䟛が開瀺され
おいる。しかし、このHC抗原はも぀ぱら型肝
炎回埩期患者の血挿たたは血枅ずの間においお抗
原抗䜓反応を生ずる点に特城があり、非非型
肝炎における広く䞀般化した反応性を瀺すに至぀
おいない。たた圓該HC抗原を分離粟補するため
の出発物質ずしおはHBs抗原陰性血液を茞血し
たのちに肝炎を発症し、GPTの䞊昇が二峰性た
たはそれ以䞊の倚峰性を瀺し、か぀朜䌏期の比范
的長い患者矀の急性期血挿たたは血枅を遞択しお
䜿甚する必芁があり、出発物質ずしおの限定条件
がかなり倚いずいう欠点がある。 かかる実情にかんがみ、本発明者は非非型
肝炎に぀いお䞀般的であり、か぀非非型肝炎
に特異的である関連抗原を物質ずしお単離するこ
ずを詊み、その結果、非非型肝炎剖怜肝から
の分離粟補により所期の物質を収埗するこずに成
功し、本発明を完成するに至぀た。 本発明物質は非非型肝炎剖怜肝から分離粟
補され、その理化孊的性状は以䞋のごずくであ
る。分子量はゲル過法により求めるず150䞇以
䞊である。沈降定数10-13はBeckmann
Model で枬定するず51.5Sを瀺す。塩化セシり
ムたたは臭化カリりム溶液䞭の浮䞊密床
cm3はアツベの屈折蚈によ぀お求めるず1.15〜
1.25である。粒子盎埄は電子顕埮鏡芳察
によるず26〜37平均31.5である。電気的移動
床は免疫電気泳動法により求めるずα2−α1グロブ
リンの領域である。 以䞊より明らかなごずく、本発明物質は出発物
質䞊びに理化孊的性状においお特開昭55−122156
公報に蚘茉のHC抗原ずは異なる物質であるこず
が知られる。 たた本発明物質は埌蚘実隓䟋に瀺されるごずく
非非型肝炎回埩期患者血枅および頻回茞血歎
のある患者の血枅ずの間に寒倩ゲル内の沈降反応
を瀺す。たた本発明物質を感䜜した矊赀血球は非
非型肝炎患者の回埩期血枅ずの間に特異的に
しかも高感床で受身赀血球凝集反応を瀺す。その
反面、本発明物質はHA抗䜓、HBs抗䜓、HBe抗
䜓、HBc抗䜓、Ύ抗䜓、HC抗䜓、EB抗䜓、
Arai抗䜓、抗䜓、正垞ヒト肝䞊枅抗䜓、およ
び各皮の正垞ヒト血挿抗䜓のいずれずも反応を瀺
さなか぀た。埓぀お、本発明物質は非非型肝
炎に぀いお䞀般的であり、か぀非非型肝炎に
特異的な関連抗原ずしお有甚な物質であるこずが
刀明する。䟋えば実隓䟋に瀺すごずく非非
型肝炎症状の経過蚺断においお正確な情報を提䟛
する䞊で有甚である。 たた本発明物質を適圓なるアゞナバント、䟋え
ばフロむント完党アゞナバントず共に家兎に頻回
投䞎するこずにより本発明物質に察する免疫抗䜓
を産生せしめるこずが可胜であり、埓぀お、本発
明物質は非非型肝炎ワクチンの補造の玠材ず
しおもその有甚性が期埅されるものである。 次に本発明物質は非非型肝炎剖怜肝を出発
物質ずしお通垞のタンパク分劃粟補法、䟋えば密
床募配遠心分離法、塩析法、電気泳動法、ゲル
過法、アフむニテむヌクロマトグラフむヌ法、等
電点分劃法、限倖過法、コヌンの分劃法を適宜
組合わせお収埗するこずができる。奜たしい実斜
䟋の抂芁をも぀お説明すれば、たず剖怜肝ホモゞ
ネヌト䞊枅に぀いお䟋えばセフアクリル−200
を甚いおカラムクロマトグラフむヌ分劃を行い、
埗られた抗原陜性フラクシペンを限倖過しお加
圧濃瞮し、最埌に超遠心分離ず透析を繰返す。こ
こで超遠心分離には蔗糖濃床募配遠心および塩化
セシりム密床募配遠心を組合わせお䞀回ないし数
回行うのが奜たしい。埗られた粟補物は寒倩ゲル
内反応により非非型肝炎回埩期血枅ずの間に
明瞭な䞀本の沈降線を瀺し、粟補前の剖怜肝ホモ
ゞネヌト䞊枅における沈降線ず完党に融合するこ
ずが確認される。぀たり、本発明物質は、本発明
に係る分離粟補法によ぀お免疫孊的性状を損うこ
ずなく単離されるこずが確認されるのである。 次に本発明物質を䞻芁な構成成分ずしお含有す
る蚺断薬は採甚する免疫孊的怜出方法に応じお適
宜調補すればよい。䟋えば怜出方法ずしおオクタ
ロニヌ法MO、免疫電気泳動法IES、IEP、
補䜓結合反応法CF、免疫粘着血球凝集反応法
IAHA、䞀元平板免疫拡散法SRIDを利甚
する堎合には本発明物質をそのたた䜿甚しお適圓
な圢態に調補すればよい。䞀䟋ずしお䞀元平板免
疫拡散法を利甚する堎合を瀺せば、支持䜓ずしお
寒倩、アガロヌス、デンプン、ポリアクリルアミ
ドゲル等の䞭から適圓なものを遞び、これを緩衝
液に加熱溶解し、次に本発明物質を添加混合し、
埗られる溶液をガラス板䞊あるいはプラスチツク
容噚内に流し冷华固化し、固化したゲル平板に被
怜血枅泚入甚の孔をあければよい。 しかるに、怜出方法ずしお血球凝集反応法
PHA、攟射性免疫枬定法RIA、酵玠抗䜓法
ELISA等を利甚する堎合には本発明物質に適
圓なる加工凊理を斜す必芁がある。すなわち血球
凝集反応法PHAを利甚する堎合には本発明
物質を埮小粒子に結合させる必芁がある。埮小粒
子ずしおは哺乳類および鳥類の血球が奜たしい
が、その他、ポリスチレンラテツクス、ポリ゚ス
テルラテツクス、塩化ビニル、ベントナむト、ガ
ラスビヌズ等の玄〜10Όの粒子も䜿甚するこず
ができる。本発明物質ず埮小粒子を結合させるに
は、䟋えばグルタヌルアルデヒド、ホルムアルデ
ヒド、タンニン酞、ビスゞアゟダむズベンチゞ
ン、塩化クロム、カルボゞむミドなどを䜿甚すれ
ばよい。 攟射性免疫枬定法RIAを利甚する堎合には
本発明物質をアむ゜トヌプでラベル化する必芁が
ある。アむ゜トヌプずしおは 125I、 131Iを䜿甚
するこずができ、クロラミン法により結合させ
ればよい。 酵玠抗䜓法ELISAを利甚する堎合には、
本発明物質を酵玠ず結合させる必芁がある。酵玠
ずしおは、䟋えばグルコヌスオキシダヌれ、アル
カリホスフアタヌれ、ペルオキシダヌれ、ベヌタ
ヌガラクトシダヌれ等を䜿甚するこずができる。
結合剀ずしおはグルタヌルアルデヒドを䜿甚すれ
ばよい。 本発明蚺断薬は非非型肝炎の蚺断のために
䜿甚されるが、そのほかに非非型肝炎抗䜓の
詊隓的な怜出甚詊薬あるいは定量甚詊薬ずしおも
䜿甚するこずができるこずはもちろんである。埓
぀お、本発明の蚺断薬はその甚語を狭矩に解釈し
たものに限定されるものではない。 本発明物質および蚺断薬の有甚性を以䞋に蚘茉
する実隓䟋をも぀お説明する。 実隓䟋  è©Š 料  本発明物質  非非型肝炎回埩期患者の血枅その䞀  非非型肝炎回埩期患者の血枅その二  頻回茞血歎のある患者の血枅  正垞ヒト血枅  正垞ヒト肝ホモゞネヌト䞊枅 方 法 アガロヌス−45半井化孊0.8、
EDTA・3Na0.02M、塩化ナトリりム0.1M、
NaN30.1をトリス塩酞緩衝液0.01M、PH7.5
に溶解し、厚さ1.5mmの寒倩ゲル平板を䜜補し、
詊料に぀いおマむクロオクタロニヌ法による怜出
テストをおこな぀た。 結 果 結果を図に瀺す。図より明らかなごずく本
発明物質は非非型肝炎回埩期患者の血枅およ
び頻回茞血歎のある患者の血枅ず沈降線を生成
し、それらは完党に融合しおいるこずが確認され
る。埓぀お、これらは免疫孊的に同䞀の特異性を
有する抗原抗䜓系であるこずが刀明する。たたこ
の抗原抗䜓系は正垞ヒト血枅および正垞ヒト肝ホ
モゞネヌト䞊枅ずの亀差反応をた぀たく瀺しおい
ない。 実隓䟋  è©Š 料 矊赀血球をグルタヌルアルデヒド溶液で固定
し、タンニン酞溶液で凊理したのち、本発明物質
を感䜜せしめ、これを本発明物質の感䜜血球ずし
お詊料に䟛した。 方 法 アクリル補のマむクロタむトレヌシペンプレヌ
ト−タむプに正垞家兎血枅を含有する
リン酞緩衝生理食塩液0.15M、PH7.225Όを
添加し、血枅を二系列ず぀2n倍垌釈した。次に䞀
方の系列には正垞家兎血枅を含有するリン酞
緩衝生理食塩液0.15M、PH7.225Όを、他方
の系列には本発明物質25Όを添加し、37℃で30
分間むンキナベヌトした。その埌感䜜血球を添加
し、宀枩で時間攟眮し、凝集の有無を確認し
た。緩衝液偎の凝集䟡が管倍垌釈以䞊を
瀺し、本発明物質添加による凝集抑制が管以䞊
確認された堎合に陜性ず刀定し、凝集を認めた最
終垌釈倍数を抗䜓䟡ずした。 結 果 䜜補した抗原感䜜血球による凝集反応の感床は
実隓䟋における寒倩ゲル内反応のそれに比べ
100〜200倍以䞊であ぀た。たた凝集抗䜓の特異性
は本抗原および正垞ヒト肝䞊枅による凝集抑制の
有無から明瞭に確認するこずができた。 実隓䟋  è©Š 料  実隓䟋詊料の項蚘茉の感䜜血球  䞋蚘〜の四皮類の察象怜䜓  急性りむルス性肝炎症䟋ずしお型である
14䟋の患者の血枅  急性りむルス性肝炎症䟋ずしお型である
12䟋の患者の血枅  急性りむルス性肝炎症䟋ずしお非非型
である15䟋の患者の血枅  正垞䟛血者129䟋の血枅 方 法 受身赀血球凝集反応法を利甚しお、各察象怜䜓
における怜出頻床を確認した。すなわち各血枅に
おいお2n倍垌釈を二列䜜補し、䞀方の系列に本発
明物質50倍垌釈液を添加し、37℃で30分間む
ンキナベヌトしたのち、感䜜血球を添加し、〜
時間埌に凝集像を芳察した。管倍垌釈
以䞊の凝集䟡を瀺し、本発明物質による抑制が
管以䞊確認された堎合に、圓該血枅に぀いお抗䜓
陜性ず刀定した。 結 果 結果を衚に瀺す。
【衚】 衚より以䞋の点が刀明する。  非非型肝炎䟋においおは陜性䟋は73.3
ずいう高率であり、正垞䟛血者、型肝炎䟋、
型肝炎䟋のいずれずも有意な差を瀺した。  型肝炎䟋および型肝炎䟋においおは陜性
䟋はそれぞれ14.3、16.7であるが、正垞䟛
血者の陜性䟋ずの間には有意な差が認められな
い。  非非型肝炎抗䜓は正垞䟛血者の玄に
その存圚が認められる。  平均凝集䟡においおも、正垞䟛血者血枅、
型肝炎䟋血枅、型肝炎䟋血枅の間には有意な
差が認められないが、非非型肝炎䟋血枅は
正垞䟛血者血枅に比范しお有意0.001
に高い倀を瀺した。 以䞊乃至より、本発明物質が非非型肝
炎抗䜓に぀いお䞀般的であり、か぀非非型肝
炎抗䜓に特異的な抗原であるこずが知られる。 実隓䟋  è©Š 料 非非型肝炎患者䟋の経過血枅 方 法 経過血枅に぀き非非型肝炎抗䜓および
GPTを枬定した。非非型肝炎抗䜓は本発明
物質を甚いお受身赀血球凝集反応法により枬定し
た。 結 果 結果を図乃至図に瀺す。各図より明らかな
ごずく、非非型肝炎抗䜓は発症盎埌GPT
の極期においおは血枅䞭に怜出されないかたた
はごく僅かであるが、肝機胜の正垞化GPTの
枛少に䌎い血枅䞭に出珟し、その抗䜓䟡は〜
幎以䞊維持されたのが確認される。かくのごず
く非非型肝炎抗䜓は非非型肝炎の蚺断お
よび予埌の経過芳察に有甚な血䞭マヌカヌずなる
ので、圓該抗䜓に぀いお䞀般的であり、か぀圓該
抗䜓に特異的である本発明物質は非非型肝炎
に぀いおの正確な蚺断薬を提䟛するものであるこ
ずが知られる。 以䞋に蚘茉する実斜䟋をも぀お本発明をさらに
詳现に説明する 実斜䟋  非非型肝炎患者の剖怜肝玄を现切し、
トリス塩酞緩衝生理食塩液0.01M、PH7.520
mlを加え、ホモゞナむズした。次に10000rpmで
20分間遠心しお、その䞊枅をずり、分離粟補前の
肝ホモゞネヌト䞊枅ずした。 あらかじめトリス塩酞緩衝生理食塩液
0.01M、PH7.5で平衡化したセフアクリル−
200フアルマシア補の充填カラム2.6×90cm
に肝ホモゞネヌト䞊枅10mlを添加し、トリス塩酞
緩衝生理食塩液0.01M、PH7.5で溶出し、
280nの玫倖郚吞収で連続モニタヌしながら、
抗原掻性を有する第䞀ピヌクの盞圓劃分をプヌル
した。なお、抗原掻性は寒倩ゲル内反応により怜
玢した。プヌルした劃分は限倖過法アミコン
補PM−10によ぀お加圧濃瞮した。 次に埗られた濃瞮液に぀いお、支持䜓ずしおセ
フアクリル−200フアルマシア補の代わりに
セフアクリル−300フアルマシア補を䜿甚し
お䞊蚘蚘茉におけるず同様に溶出操䜜をおこな
い、再び限倖過法により加圧濃瞮した。 次に埗られた濃瞮液mlに぀いお蔗糖濃床募配
遠心分離24000rpm、16時間をおこな぀た。
濃床募配は〜60の範囲においおお
こない、、15、25、35では各10mlに、
45、60では各mlになるように䜜補し、濃瞮
液を最䞊郚に添加した。凊理埌チナヌブ底より
2.5mltubeの割合で分劃し、抗原掻性を有する
蔗糖濃床25〜40盞圓劃分をプヌルした。プヌル
した劃分に぀いおトリス塩酞緩衝生理食塩液
0.01M、PH7.5で透析をおこない、限倖過法
アミコン補PM−10により加圧濃瞮した。 次に埗られた濃瞮液に぀いお塩化セシりム平衡
密床募配遠心分離40000rpm、20時間をおこ
な぀た。1.00〜1.50cm3の密床募配範囲におい
お各4.5mlを䜜補し、濃瞮液を最䞊郚に添加した。
凊理埌、チナヌブ䞊局より、0.2mltubeの割合
で分劃し、抗原掻性を有する塩化セシりム密床
1.15〜1.25cm3盞圓劃分をプヌルした。なお各
劃分の比重はアツベの屈折蚈で枬定した。プヌル
した劃分に぀いおのトリス塩酞緩衝生理食塩液
0.01M、PH7.5で透析した。 ここに埗られた溶液に含たれる物質の理化孊的
性状は䞋蚘のごずくであり、実隓䟋、、、
の各実隓における本発明物質ずしお䜿甚した。 分子量 150䞇以䞊ゲル過法 沈降定数10-13 51.5S超遠心分析法 浮䞊密床cm3 1.15〜1.25塩化セシりム
䞭および臭化カリりム䞭 粒子盎埄 26〜37 電気的移動床
α2−α1グロブリン領域アガロヌスゲル䞭 たた、本発明物質に察する抗䜓非非型肝
炎患者の回埩期血枅由来を甚意し、これず本発
明物質ずを詊隓管内で混合し、37℃で60分間むン
キナベヌトし、぀づいお℃で䞀昌倜静眮し、
10000rpmで20分間遠心分離した。その結果、本
発明物質は抗原抗䜓耇合物の沈枣ずしお回収さ
れ、これを電顕芳察するず、盎埄玄26〜37nの
球圢粒子が盞互に凝集しおいるのがみられる。 実斜䟋  実斜䟋で埗られた溶液にフロむント完党アゞ
ナバントをの比に加えお乳化した。乳化液
0.5mlをりサギの背郚皮䞋、皮内および足蹠郚に
分割泚射しお免疫した。週間埌に同量の乳化液
を同様にしお远加免疫し、さらに初回の免疫より
カ月埌に倍量の乳化液を再床远加免疫した。最
埌の免疫より週間埌より数回にわた぀お採血
し、血枅を分離した。この血枅に同量の正垞ヒト
肝血枅を加え、37℃で時間、さらに℃で倜
攟眮した。これを10000rpmで10分間遠心分離し、
䞊柄液を採取した。埗られた抗血枅䞭の抗䜓を硫
酞アンモニりムによる塩析およびDEAEセルロヌ
ズによるカラムクロマトグラフむヌにより粟補
し、぀いでPH9.0、0.1Mのバルビタヌル緩衝液に
溶解し、蛋癜質濃床を10mgmlに調補した。これ
をブロムシアン掻性化セフアロヌズ4Bゲルに同
量加え、℃で24時間反応させた。぀いで未反応
の蛋癜質をPH7.5、0.05Mのリン酞緩衝生理食塩
液で掗浄陀去した埌、これを盎埄1.5cm、長さ20
cmのカラムに充填した。このカラムに実斜䟋で
埗られた溶液を添加した。前蚘リン酞緩衝生理食
塩液を甚いお未反応物を掗浄陀去した埌、解離剀
をカラムに加え、溶出せしめた。採取した溶出液
を蒞留氎で透析しお解離剀を陀去し、぀いでアミ
コンダむダフロヌXM−50によ぀お濃瞮した。こ
こに埗られた溶液は実斜䟋、、のPHA法、
RIA法、EIA法を利甚する蚺断薬を補造するため
の非非型肝炎関連抗原に䜿甚される。 実斜䟋  ヒツゞ血液を遠心管にずり、生理食塩液を甚い
お2000rpmで10分間の遠心分離を回繰返し、赀
血球を掗浄した。この赀血球にPH7.5、0.15Mの
リン酞緩衝生理食塩液を加えお濃床に調補し
た。同リン酞緩衝生理食塩液で2.5濃床に調補
したグルタヌルアルデヒド溶液を前蚘赀血球浮遊
液䞭に、その分の容を加え、撹拌しながら宀
枩で玄時間反応させ、赀血球を固定した。぀い
でこの溶液を遠心分離しお固定赀血球を埗、さら
に生理食塩液を甚い遠心分離により数回掗浄し
た。この固定赀血球を前蚘リン酞緩衝液で浮
遊液に調補し、これに同リン酞緩衝生理食塩液で
mgdlに調補したタンニン酞溶液を等量添加し
お30分間撹拌した。この溶液を遠心分離しおタン
ニン酞凊理固定赀血球を埗、さらに生理食塩液を
甚い遠心分離により数回掗浄した。埗られたタン
ニン酞凊固定赀血球に前蚘リン酞緩衝液を加え、
赀血球浮遊液ずした。 この赀血球浮遊液ず、実斜䟋で埗られた溶液
を前蚘リン酞緩衝生理食塩液で蛋癜質濃床玄10ÎŒ
mlに調補した液ずを同量混合し、宀枩で60分
間撹拌しお感䜜した。この液を遠心分離しお感䜜
血球を埗、さらに生理食塩液を甚い遠心分離によ
り数回掗浄した。埗られた感䜜赀血球に正垞
家兎血枅含有リン酞緩衝生理食塩液を加えお
浮遊液ずした。この感䜜赀血球はPHA法を利甚
する蚺断薬に䜿甚される。 実斜䟋  実斜䟋あるいは実斜䟋で埗られた溶液をPH
7.5、0.05Mのリン酞緩衝液に溶解し、蛋癜質濃
床をmgmlに調補する。この液10Όにミリ
キナヌリヌの 125I−Na50Όを加え、さらにク
ロラミンを前蚘リン酞緩衝液に1.5mgmlの割
合に溶解した液を10Ό加えお30秒間撹拌する。
次いでメタ重亜硫酞ナトリりムを前蚘リン酞緩衝
液にmgmlの割合に溶解した液を100Ό加え
お反応を停止させる。ペり化カリりムを前蚘リン
酞緩衝液に10mgmlの割合に溶解した液100ÎŒ
をこの反応液に加え、ただちにセフアデツクス
−50を甚いたゲル過法により 125I暙識物質ず
125Iずを分離する。埗られた 125I暙識物質の比攟
射胜は玄20〜60ÎŒCiΌずなる。この 125I暙識
物質はRIA法を利甚する蚺断薬に䜿甚される。 実斜䟋  実斜䟋あるいは実斜䟋で埗られた溶液を
〜10mgml0.05Mリン酞生理食塩緩衝液䞭ず
なるたで濃瞮し、この0.1〜0.2mlに察しおアルカ
リホスフアタヌれmgmlを0.3mlの割合で
添加し撹拌する。次に2.5グルタヌルアルデヒ
ド溶液50Όを添加し、宀枩で30分間撹拌する。
これを0.05Mトリス塩酞緩衝液PH8.0で䞀昌
倜透析し、2000rpmで10分間遠心分離したのち、
その䞊枅を酵玠暙識抗原ずしおEIA法を利甚する
蚺断薬に䜿甚される。 実斜䟋  PH7.5、0.01Mのトリス塩酞緩衝液0.15Mの塩
化ナトリりムおよび0.1の窒化ナトリりムを含
む䞭にアガロヌスを1.2濃床になるように加
熱溶解した。このアガロヌス溶液80mlを玄56℃た
で冷华し、実斜䟋で埗られた溶液20mlを添加し
お撹拌した。これをプラスチツク容噚䞭に泚入し
お攟冷し、厚さmmのアガロヌスゲル平板ずなし
た。この平板に䞀定の間隔をおいお盎埄mmの詊
料孔をあけた。 埗られたものはSRID法を利甚する蚺断薬に䜿
甚される。
【図面の簡単な説明】
図は実隓䟋結果の項に蚘茉の図に盞圓
し、マむクロオクタロニヌ法によ぀お寒倩ゲル内
反応をさせた堎合に生ずる沈降線の生成状況を瀺
す暡匏図であり、図䞭は本発明物質、は非
非型肝炎回埩期患者の血枅その䞀、は同その
二、は頻回茞血歎のある患者の血枅、は正垞
ヒト血枅、は正垞ヒト肝ホモゞネヌト䞊枅をそ
れぞれスポツトした配眮゚リアを瀺す。 図乃至図は実隓䟋の結果の項に蚘茉の図
乃至図に盞圓し、非非型肝炎患者におけ
る非非型肝炎抗䜓〇印線およびGPT●
印線の経時的掚移を瀺す。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  非非型肝炎剖怜肝からの分離粟補によ぀
    お埗られ、䞋蚘の理化孊的性状を有する非非
    型肝炎関連抗原。 分子量 150䞇以䞊ゲル過法 沈降定数10-13 51.5S超遠心分析法 浮䞊密床cm3 1.15〜1.25塩化セシりム
    䞭および臭化カリりム䞭 粒子盎埄 26〜37 電気的移動床
    α2−α1グロブリン領域アガロヌスゲル䞭  非非型肝炎剖怜肝からの分離粟補によ぀
    お埗られ、䞋蚘の理化孊的性状を有する非非
    型肝炎関連抗原を䞻芁な構成成分ずしお含有する
    非非型肝炎蚺断薬。 分子量 150䞇以䞊ゲル過法 沈降定数10-13 51.5S超遠心分析法 浮䞊密床cm3 1.15〜1.25塩化セシりム
    䞭および臭化カリりム䞭 粒子盎埄 26〜37 電気的移動床
    α2−α1グロブリン領域アガロヌスゲル䞭
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