JPH06502075A

JPH06502075A - Ｃ型肝炎ウイルス抗体

Info

Publication number: JPH06502075A
Application number: JP3518583A
Authority: JP
Inventors: ミラー、マーロン・エフ; レスニエフスキー、リチャード・アール; ピーターソン、デイビッド・エー; ブライス、ウォレン・ヒュー
Original assignee: アボット・ラボラトリーズ
Priority date: 1990-10-12
Filing date: 1991-10-09
Publication date: 1994-03-10
Also published as: EP0552297A1; KR930702506A; EP0552297A4; CA2093919A1; TW216797B; AU8945791A; WO1992007001A1; AU663064B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｃ型針炎ウィルス抗体本発明は、感染した患者から単離したＣ型肝炎ウィルス粒子の抗原に選択的に結合する抗体、およびＨＣＶを部分精製する手順を含む、血漿からのＣ型肝炎ウィルスの単離方法に関する。

発明の背景０型肝炎ウイルスまたは）（ＣＶ（）（ＣＩ、’は歴史的には非Ａ非Ｂ型肝炎またはＮＡ　Ｎ　Ｂ　Ｈと呼ばれている）は、汚染された血液または血液製剤により転移することか確立されている。輸血を受けた患者中、１０％もの多くの患者が輸血後肝炎にかかるであろう。該疾壱にかかっている患者のうち、約９０％がＨＣＶを有していると診断されるであろう。この形の肝炎の血液および血液製剤による転移を防くには、ＨＣＶ保菌者並びに汚染された血液および血液製剤を同定するのに用いることのできる、信頼性があり高感度で特異的な診断および予後アッセイが必要である。

これら必要とされる診断および予後アッセイの開発は、ＨＣＶに特異的な免疫反〔試薬が手に入らないことにより行き詰まっていた。必要とされる試薬の開発における進歩は、とりわけＨＣＶ抗原および抗体を同定および単離することの困難さにより妨害されていた。たとえば、ウオンズ（Ｗａｎｄｓ）らの米国特許第４，８７０．０７６号、ヘリングス（Ｈｅｌｌｉｎｇｓ）のＶＯＸ　Ｓａｎｇ、５１．ｌｉ遺ｌ：６３〜６６（＋９８６）、リンケ（Ｌｉｎｋｅ）ら［引用する必要あり・プロダク／ヨン・オフ・モノクローナル・アンタイボディーズ・スベンフィノク・フォア・ノンーＡ、／ノーＢ・ヘパティティス・インフエクテノド・リバー（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｍｏｎｏｃｌ。

ｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏｒ　Ｎｏｎ−Ａ、Ｎｏｎ−Ｂ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｉ　ｎｆｅｃｔｅｄ　Ｌｉｖｅｒ）：ウオノズらのＰｒｏｃ、ＮａＬ’１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８３　：　６６０８〜６６１２（１９８６）、オホリ（Ｏｈｏｒｉ）らのＪ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、、］　２　：　１６１〜１７８（１９８３）、プラノドリー（Ｂ　ｒａｄｌｅｙ）らのＰｒｏｃ、Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８４　：　６２７７〜６２８１（＋９８７）、アカツカ（Ａ　ｋａｔｓｕｋａ、　Ｔ　、　）らのＪ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、２０　：　４３〜５６（１９８６）、セト（Ｓ　ｅｔｏ、　Ｂ、）らの米国特許出願第０７／２３４，６４１号（商務省゛アメリカ技術情報サービス、スプリングフィールド、バージニア州、Ｎｏ。

８９１３８１６８から入手可）、タカハシ（Ｔ　ａｋａｈａｓｈｉ、　Ｋ、　）らのヨーロッパ特許出騨第０２９３２７４号、１９８８年１１月３０日公開、およびシーリング（Ｓｅに存在する抗体と免疫学的に反応する抗原をコードする単離ｃＤＮＡ配列に関する最近の報告により、組換えにより製造した抗原を用いる一つの診断アッセイが得られた。ヒユートン（Ｈｏｕｇｈ　ｔｏｎ）らのヨーロッパ特許出願公開第０３１８２１６号および関連する論文クオ（Ｋｕｏ）らのＳ　ｃｉｅｎｃｅ、２４４　：　３５９〜３６１（１９８９）およびチｘ　−（Ｃｈｏｏ）らのＳ　ｃｉｅｎｃｅ、２４４　：３６２〜３６４（１９８９）を参照。

感染因子自体は、単離および特徴付けに成功していない。たとえば、ファウラー（Ｆｏｔｖｌｅｒ）らのＪ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、、　Ｉ　２　：　２０５〜２　］　３（１９８３）およびウニイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）らのＪ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、、２１　：　２３９〜２４７（１９８７）を参照。

モリ（〜４ｏｒｉ）らのＬ　ａｎｃｅｔ、３１８（１９８０年８月９日）、セトらのＬａｎｃｅｔ　９４１〜９４３（１９８４年１０月２７日）、およびプラノドリーらのＪ　、　Ｍｅｄ、　Ｖ　１ｒｏｌ。

、３　：　２５３−２６９（１９７９）。プラノドリーらのＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、　８８　ニア７３（１９８５）、には、ポリカーボネートフィルターを用いたＨＣＶウィルス粒子のサイジング（ｓｉｚｉｎｇ）が報告されている。接種したチンパンジー血液の血漿からヒトロタウィルスを精製するための一連のグレードのポリカーボネートフィルターを用いた、この技術の変法は、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）らのプロシーディンゲス・オフ・ザ・４６ｔｈ・アニュアル・ミーティング・オフ・ザ・エレクトロン・マイクロスコピー・ソサイエティ・オフ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　４６ｔｈＡｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｒ　Ａｍｅｒｉｃａ）、７６〜７７頁（１９８８年８月）およびミラーらのプロシーディンゲス・オフ・ザ・１２ｔｈ・インターナシ３ナル・フンブレス・フォア・エレクトロン・マイクロスフビー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　１２ｔｈ　Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｆｏｒ　Ｅ　１ｅｃｔ■ ｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、３０８〜３０９頁（１９９０年８月）に一層詳細に記載されている。

明らかに、ＨＣＶの感染因子を単離し完全に特徴付ける必要性が存在する。感染因子の１１１離に成功することにより、診断および予後アッセイがさらに開発され本発明は、忠音において免疫応答を生じる全ウィルス粒子の１または２以上のＨＣＶ抗原と選択的に結合することのできる抗体に関する。ウィルス粒子のＨＣＶ抗ＩＱｌ；ｔ、好ましくはチンパンジーおよびヒトよりなる群から選ばれた哺乳動物から単離される。

モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方がこの発明により提供される。これらタイプの抗体の両方とも、免疫攻撃した哺乳動物からハイブリドーマ細胞を産生ずるための当該技術分野で公知の方法に従って調製することができる。とりわけ、これら抗体は、ハイブリドーマ細胞株Ｈ１８Ｃ２７およびＨＩ　Ｆ３Ｃ６８（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンヨン（ＡＴＣＣ）、＋２３０１パークローノ・ドライブ、口ｌクビル、メリーラント州、２０８５２にそれぞれＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ１０５２９およびＨＢ１０５３０として１９９０年８月１５日に寄託しである）よりなる群から選ばれた細胞株から単離することができる。

この発明はまた、感染した患者から採取した血漿試料中の感染性ＨＣＶ粒子の単離方法をも提供するものであり、該方法は、血漿試料を遠心分離により清澄化し、該清澄化した血漿を順番に小さくなる孔径を有する一連のフィルター（フィルターの孔径は、それぞれ、３０．１．０．０８．０６．０，４、および０．２ミクロンである）で濾過し、濾過した血漿を１０％ンヨ糖溶液でペレット化し：ついて該ベレ、トシた物質を再懸濁することを含む。

本発明の方法は、最初の血漿試料中のペレＺ）化か可能な全タンパク質の約１％未満、好ましくは０１％未満しか含んでいないにも拘わらず、約１０’ＣＩＤ／ｍＩまでの感染価を有する再懸濁物質を提供する。

本発明の抗体は、ＨＣＶと特異的に合体した抗原を検出するための免疫学的ア。

セイに有用である。

本発明の他の側面および利点は、この発明の実施の具体例を含む下記詳細な読本発明は、ヒトおよびチンパンジーＨＣＶをもたらすことが知られている因子を単離および視覚化する方法を提供する。推定ウィルスを免疫凝集させ、高度免疫血清を産生させ、あるいはこの架空の因子をクローニングする過去の努力は、血液の血漿から適切にウィルスを精製する可能性の欠如によって阻まれていた。

この感染因子の物理的性質については、おそらく約１１００ｎのフィルターを通過てきるクロロホルムおよびＢ−プロピオラクトン感受性のウィルスであること以外は殆どわかっていなかった。このウィルスの浮遊密度を決定するための他の研究者による試みからは曖昧な結果しか得られておらず、現在までのところ、このウィルスを精製し、また同時に濃縮するための信頼性のある手段は得られていない。本発明は、全感染血液血漿を精製および濃縮（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ）　Ｌ、得られた単離物を用いて抗体を生成するための概略を記載する。

血液血漿または細胞抽出物からウィルス粒子を精製する方法は、伝統的に、単離すべきウィルスの浮遊密度に基づいていた。示差遠心分離法および密度勾配法（等密度または速度・ノーンバンディングなど）の両方法とも、所定の遠心分離工程においてウィルスと類似の密度を有するすべてのクラスの細胞破片が回収される。

そのような破片は全体のサイズが相当変化に富んでおり、そのような破片が存在するために、電子顕微鏡を用いてウィルス粒子を検出または同定することが一般に困難になっている。

ウィルス分類の補助として、超遠心分離によるウィルス粒子のサイジングが用いられてきている。すでに記載したように、ブラ、ドリーらはＨＣＶ粒子のサイズについての情報を得るために定められた孔径のポリカーボネートフィルターを用いることを報告している。この発明は、孔径が減少する一連のポリカーボネートフィルターに血液血漿を連続的に通すことに基づいたＨＣＶ精製法を提供する。

ＨＣＶ粒子を単離するには、ポリカーボネートフィルターが好ましい。その理由は、編み合わせ繊維の比較的厚手の網からなるニトロセルロース、ポリエステルや他のタイプのフィルターと違って、ポリカーホ不−トフィルターは薄く、サイズが正確で真っすくにあけられた穴を有するからである。これら特徴は、ニトロセルロース、ポリエステルや他のタイプのフィルターの場合にみられるようなフィルターマトリックス中での非特異的な吸着や捕捉により引き起こされる粒子の損失を制限する。

最初の実験においては、グレード化した一連のフィルターが全血液血漿中に存在する粒子のサイズを連続的に減少させる能力を調べた。直径が２５ｍｍのヌクレヂア（Ｎ　ｕｃ　１ｅｐｏｒｅ）フィルターをスウィンロノク（Ｓ　ｖｉｎｌｏｃｋ）ホルダー中に載せ、該ホルタ−を合間は血漿を充填した１Ｑｃｃ容皮下注射器に結合させた。しかしながら、この構成では、栓をする前に一連のフィルターに少量の血漿しかうまく通すごとができない。一つの解決として、血漿の希釈を行わないようにした。なぜなら、これは取り扱う血漿の全量を増加させるだけであり、最終ウィルス単離物を濃縮するために超遠心分離工程を過剰に行うことになるからである。結局、ｉ＠通過程を簡単にするために小さな圧力を加えた。

表１にＨＣＶ粒子を単離するための好ましい手順を示す。まず全血血漿を低速遠心分離により清澄化し、ついで３０．１．０．０．８．０．６．０．４および０２２ミフロンヌクレボアフイルター順番に圧濾過した。ついで、０．２ミクロン濾液を緩衝１０％ンヨ糖の上部に重層し、１０５．０００Ｘｇで４時間ベレット化した。１０％／ヨ糖でペレット化した後、微細タンパク質が取り除かれた。ペレットをリン酸緩衝食塩水中に再懸濁してＩ　ＯＯＸスト、り濃縮物を得、ついで、これを所望によりさらに希釈した。感染性研究のために使用する最終濃縮物の部分は、低温保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎＬ）として２％ＢＳＡを含有する緩衝液中で希釈した。

」４工程′ｉｌ　全希釈血漿（２０００ｒｐｍで２０分間清澄化）工程ｆ２　３．０ミクロンフィルター工程９３　１．０ミクロンフィルター薯工（呈１　０．８ミクロンフィルター工程＃５　０６ミクロンフィルター工程１６　０．４ミクロンフィルター１ｔ呈ｆ７　０．２ミクロンフイルター工程！８　１０％ンヨ糖ペレット（１０５，０００Ｘｇで４時間）■ 工程＃９　１００Ｘに再懸濁部分精製した血漿はフィルターを容易に通過し、ミラー（ミラー（Ｍ　ｉ　１ｌｅｒ、　Ｍ。

Ｆ、）、Ｅ　１ｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ｉｎ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、　２、グリフイスＯ、Ｄ、　Ｇｒｌｆｆｉｔｈ）［、ジョノウイリーアンドサンズ、ニューヨーク、ニューヨーク州、１９８２．３０５〜３３９頁）によって開発された方法（市販のベノクマンエアヒュージ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ａｉｒｆｕｇｅ）超遠心管およびＥｍ−９０ｉ１ｉ子顕微鏡粒子カウントロータを用いる）を用い、電子顕微鏡観察のために精製の各工程において１００μｍの血漿アリコートを調製した。簡単に説明すると、原料の血漿およびポリカーボネートフィルター精製工程の各段階から得られた血漿１００μｍを、ＥＭ９０ロータ中て１００．ＯＯＯＸｇにて５ｍｍ’ミリポアフィルター支持体へ沈降させる。

沈降した粒子を有する支持体を３％グルタルアルデヒドついで四酸化オスミウムで固定し、脱水し、エポキ７樹脂中に包埋する。ついで、包埋したフィルター支持体を薄片にし、酢酸ウラニルついでクエン酸鉛で染色する。

低倍率では、ＥＭ観察のために調製した全未濾過チンパンジー血液血漿の様子は、多量の小さなタンパク質様物質、フィブリンの塊および様々なサイズの微細粒子を示した。もっと高倍率では、チンパンジー血漿の０．２ミクロン濾液の様子は、０．２ミクロンよりも大きい微細粒子はすべて濾過により取り除かれたこと、およびｌＯ％ン３糖ペレット化工程後に小さなタンパク質が取り除かれたことを示した。これらの結果は、上記精製法が、大きな微細粒子を選択的に除去し、小さなタンパク質を取り除くのに有効であることを明らかに示している。

このａｉ５法を用いたウィルス回収を評価するため、１ｍ’１当たり約１０Ｉ０粒子の高度精製ヒトロタウィルスを全チンパンジー血漿に接種した。ロタウィルスは非血液由来であるが、直径が約６５〜７Ｑｎｍであり、非精製試料の薄片中に比較的容易に認識しカウントすることができる。精製の種々の段階からの接種血漿試料を上記と同様にしてＥＭ観察用に調製し、ウィルス粒子をカウントした。試料はまた、高感度分光測光タンパク質ア、セイを用い、ペレット化し得る全タンパク質についてもアッセイした。精製に際して対数期のウィルスの画分のみが失われたが、ペレット化し得る全タンパク質に関しては全体で２５０倍の減少があったことがわかった。

上記濾過法は、ＨＣＶの感染因子を単離するために必要な濃縮血漿を得るために用いることができる。ＨＣＶを単離するための一つの方法、免疫凝集電子顕微鏡法は、適当な濃度の血漿濃縮物と適当な抗体とを混合し、得られた免疫凝集物を透過電子顕微鏡を用いて１Ｓ−１Ｊ化することにより行うことができる。抗体は、一般に旧態て約４０．ＯＯＯＲＰＭで１０分間遠心分離にかけることにより、たいていの血清中に認められる所望でないバックグラウンド微細粒子を除いておく。

抗体力価が未知である場合には、系統的な試行錯誤法を用いて最適希釈を実験的に決定しておく必要かある。希釈し過ぎたり濃縮し過ぎたりすると、抗体溶液の凝集は不完全となったり凝集しなかったりするであろう。

種々の肝炎ウィルスを研究するために好ましい凝集法には、（ａ）２０μｌの充分に分散させた血漿濃縮物を５０μｍのＰＢＳ、　ｐＨ７，２、および２０μｌの抗体と混合し、（ｂ）この混合物を室温にて１時間、ついで４°Ｃで一夜インキコベートし、（ｃ）得られた免疫凝集物をベノクマンエアヒュージ超遠心管中、２０ｐｓ１にて３０分間ベレット化し、（ｄ）上澄み液を捨て、得られたベレットを２０μｍの水中に再懸濁し、（ｅ）５μｌ小滴の懸濁液をフオームバー（Ｆ　ｏｒｓｖａｒ）コーティングＥＭ試料グリッドに適用し、（ｆ）この小滴を吸取紙で吸い取り、ついで（ｇ）付着した微細粒子を２％リンタングステン酸でネガティブ染色することが含まれる。ついで、１０〜４５，０ＯＯＸの倍率の透過電子顕微鏡を用い、免疫凝集について試料グリッドを注意深く調べる。

そのモノクローナル抗体または上記単離ＨＣＶＩｍ製物を用いて得られた他のモノクローナル抗体は、独立に、互いに組み合わせて、またはヒト、チンパンジー、ウサギまたは他の哺乳動物ポリクローナル抗体と組み合わせて、ＨＣＶの抗原のための診断試験に用いることができる。

幾つかの別のアッセイ法を本発明の抗体に用いることができる。たとえば、抗体を適当な固体支持体に結合させ、ＨＣＶを含有する試料またはアリコートに接触させ、ついで発色して検出可能なシグナルを生成する第二の標識抗体と接触させるごとができる。シグナル生成残基で標識した本発明の抗体を使用するアッセイは、また別の方法である。加えて、該標識した抗体を競合抗体アッセイに用いることもできる。このタイプのアッセイでは、試料中に含まれる抗原の免疫優勢（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープを有する抗原をコーティングした固体支持体の存在下、該標識抗体を試料またはアリコートとともにインキュベートする。試料中に存在するＨＣＶに対する抗体は、該標識抗体および該結合抗体と、結合について競合するであろう。それゆえ、ＨＣＶに対する抗体を含有する試料からは、標識抗体を添加しないアッセイで生じるシグナルに比べて低い検出可能なシグナルを本発明の方法により調製した精製ウィルスはまた、未知のＨＣＶ抗原を特徴付けるのにも用いることができる。抗体を生成するのに用いる精製ウィルスは、界面活性剤でウィルスを可溶化する前または後に、確立された方法に従ってクロラミンＴおよびボルトンノ・ンターの両方の反応条件を用い、放射性ヨウ素で標識することかできる。これら抗体を免疫沈降実験に用いることができ、その際、抗体は溶液中で可溶化障識ウィルスと反応する。このインキュベーション期間の後、Ｂｕｇの固定化スタフィロフノカス・アウレウス（Ｓ　ｔａｐｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓＸＳ　ｔａｐｈＡ）細胞を上記抗原−抗体混合物とともにインキュベートする。これら細胞上の免疫グロブリンレセプターは、遊離の免疫グロブリンと同様、抗原−抗体複合体と結合するであろう。結合した細胞を遠心分離によりペレ、）化し、繰返し洗浄して未吸着の標識抗原を除く。ついで、腹合体が吸着した５ｔａｐｈＡ細胞を、２−メルカプトエタノール、界面活性剤および緩衝液を含有する溶液中で１００°Ｃに加熱することにより解離させ、ついでポリアクリルアミドスラブゲル上で電気泳動にかける。電気泳動後、ゲルを固定し、放射能の検出を高めることが知られている薬品で処理し、乾燥し、何日間、何週間または何カ月間もの長期間、−７０″ＣにてＸ−線フィルムに暴露する。Ｘ−線フイルムを感光すると、放射性標識抗原がその分子サイズに基づいてゲル中を移動した位置にてフィルム上にバントが現れるであろう。これらバンドの位置を分子量が知られた放射能標準の位置と比較することにより、沈降したウィルス抗原の分子サイズを決定することができる。この情報は、現在未知であるＨ　ＣＶの実際の遺伝子生成物のサイズを決定する上で価値があるものである。

ウィルス復製を支持し得る細胞株中で産生される標識ウィルス抗原を同定するために、この方法の変法を用いることもできる。本質において、この方法は、ウィルス復製の存在について種々の細胞株をスクリーニングするために用いることができ、それゆえ、Ｃ型肝炎の診断のための組織培養系を確立するための手段として有用である。

本発明によるモノクローナル抗体は、ＨＣＶ感染、および体液、組織、実験試薬および実験流体中の感染因子を検出するためのアッセイに有用であろうことが期待される。

本発明のモノクローナル抗体はまた、ＨＣＶと特異的に合体した抗原をアフィニティークロマトグラフィーにより単離するのに用いることもできる。そのような免疫精製抗原は、複数のエピトープ特異性を有する抗体を得るために、ヤギやウサギなどの非霊長類種を免疫するのに用いることができる。別法として、単離抗原をマウスやラットを免疫するのに用いて、別のモノクローナル抗体を産生ずることのできるハイブリドーマ細胞株を調製することができる。

本発明に従って生成した抗体により、ＨＣＶ＠染と特異的に合体した抗原および感染因子を特徴付けることが可能になる。この観点から、分析用ゲル電気泳動や分離用ゲル電気泳動などの標準的な方法を用いて、この発明の抗体と反応性の抗原の分子量を決定することができる。かくして得られた反応性の単離物は、還元剤、プロテアーゼ、リパーゼ、グリコンダーゼなどを含む種々の選択剤を用いることによりさらに特徴付けを行うことができる。ＨＣＶウィルス抗原と反応する抗体は、競合および非競合イムノアッセイ、ラジオイムノア、セイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡなどを含む種々のイムノアッセイに利用することができる。

下記実施例は、この発明の詳細な説明するものであり、説明の目的のためにのみ記載したものである。これら実施例は、本発明の範囲または添付の請求の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例１は感染したチンパンジーからＨＣＶを精製する方法を記載し、実施例２はモノクローナル抗体の製造を記載し、実施例３は診断試験を記載する。

ＨＣＶのｉｏ’ｃＩＤ／ｍｌ（チンパンジー感染投与量／ｍｌ）感染価を有するチンパンジー血液血漿を下記のようにして精製した。原料の血漿をまず卓上の遠心管中、１１００ＯＸにて２０分間低速遠心して大きな細胞破砕物を除いて清澄化し、ついで直径３０．１．０．０．８．０．６．０．４および０．２ミクロンの孔径を何するポリカーボネートメンブランフィルタ−で順番に圧ｔｓ過した。

ついで、０２μｍａｌ液中に残留する微細粒子をリン酸緩衝１０％ショ糖で１０５，０００×ｇにて４時間超遠心分離することによりペレット化した。この工程により小さなりンバク質が除かれ、ウィルスが濃縮された。ペレット化したウィルスをリン衝液で希釈した。

精製したチンパンジー血漿から得られ沈降し薄片になった微細粒子を示す電子顕微鏡像を、同様に調製した原料の出発血漿と比較した。高感度の分光測光アッセイを用い、ペレット化し得る全タンパク質は２５０倍以上減少したことがわかった。精製したウィルス生成物をチンパンジーに接種した場合、感染性であることがわかった（血清酵素の特徴的な上昇および肝細胞の微細構造の変化によって明示されるように、力価が１００％回復した）。この精製した生成物を用いてモノクローナル抗体を調製した。

Ｃ型杆炎に感染したチンパンジーからの肝臓切片上での免疫蛍光顕微鏡観察による血清の低反応性に基づき、６匹のメスＢａ１ｂｃ／Ｊマウスを選択した。

これら選択したマウスを用いて、精製ＨＣＶを接種した。ウィルスを接種する前に、すべてのマウスから播種前血液を採取した。接種物としては、実施例１に記載の方法により得た精製ウィルスを用いた。各２匹ずつのマウスを下記のようにして接種した：精製ウィルスストック　０．１ｍｌ、通常食塩水中のウィルスストックの１／１０希釈Ｑ、２ｍｌ、または通常食塩水中のウィルスストックの１／１００希釈Ｑ、　２ｍｌを腹腔内投与（ＩＰ）にて。２１日目に目からの採血により血液試料を回収した。３５日目に、すべてのマウスに初回免疫様式と同じ接種物および投与量でブースター投与した（ＩＰ）。４９日目に目からの採血により再び血液試料を回収した。１２９２９日目すべてのマウスに前回と同様に再びブースター投与した（Ｉ　Ｐ）。１４１４１日目からの採血により血液試料を回収した。１９９９９日目各投与カテゴリーのマウス１匹に精製ウィルスストックの１／ｌＯ希釈Ｑ、１ｍｌを静脈内（ＴＶ）接種した。３日後にＩＶジブ−ター投与したマウスを層殺し、肺臓リンパ球細胞を単離し、ケーラーとミルシュタインの方法（ケーラーおよびミルシュタイン、Ｎａｔｕｒｅ、２５６　：　４９５〜４９７．１９７５）に従って５Ｐ２１０マウスミエローマ細胞と融合した。

２４１４１日目りの３匹のマウスを上記と同様にしてＩＶジブ−ター投与し、３日後に層殺し、肺臓リンパ球を単離し、Ｓ　Ｐ　２１０細胞と融合した。

固体ポリスチレンビーズ上にコーティングした抗原としてカイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）ｃ−ｔｏｏクローン（ヨーロッパ特許出願公開第０３１８２１６（１’９８９年５月３１日公開）に記載されている）からの配列を示す合成ペプチドを用いたエンザイムイム／アッセイ（ＥＩＡ）により、マウスリンパ球と５Ｐ２１０細胞との融合から得られたハイブリドーマの上澄み液をスクリーニングした。ペプチドＥＩＡにおいて陽性のシグナルを生じるハイブリドーマ細胞株を限界希釈法によりクローニングした。カイロンＣ−１００配列内に含まれるエピトープに特異的なＩｇＭクラス抗体を産生ずるモノクローナル細胞株を単離した。これら細胞株のうち２つ、Ｈｌ　８Ｃ２７およびＨ１８Ｃ６８を細胞培養中に拡張し、液体窒素下で凍結し、現在、それぞれＨＢ１０５２９およびＨＢ１０５３０の受託番号にてＡＴＣＣに寄託しである。

固相ポリスチレンビーズ支持体に結合した抗原捕捉試薬として、実施例２の方法に従って調製したモノクローナル抗体を用いる。患者から採取した血清、血漿または脳を髄液などの体液のアリフートを、上記ビーズに結合した抗体とともにインキスペードする。インキュベーションの間、抗原または全ウィルスは固相に結合する。インキュベーンジン後、未結合抗原を固相支持体から洗浄して除く。

アッセイの第二工程において、西洋ワサビベルオキシダーゼに結合させた、同じ抗体、またはＨＣＶ抗原の異なるエピトープに結合する池のモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体を」１記ビーズとともにインキュベートする。この標識抗体は、固相上に捕捉された抗原と結合して抗体−抗原−抗体サンドイノチを形成するであろう。過剰のベルオキ／ダーゼ標識抗体を洗浄して除き、ビーズを０ＰＤ（オルトフェニレンジアミン）などの適当な酵素基質に暴露する。得られた発光的に検出する。

本発明を特定の方法および組成により説明したが、本発明を考慮することにより変更およびｔｌｌｉを施し得ることは当業者には理解されるであろう。

国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，Ｓ　識別記号　庁内Ｍ理番号Ｃ１２Ｎ　７１０２　８９３１−４８ＧＯＩＮ　３３１５７６　Ｚ　９０１５−２Ｊ３３１５７７　Ｂ　９０１５−２Ｊ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０８８９３１−４Ｂ（７２）発明者　レスニエフスキー、リチャード・アールアメリカ合衆国５３１４２ウイスコンシン州ケノシヤ、ワン・ハンドレッド・アンド・テンス・アベニュー８７０６番ｐ　ＦＩＣ１２Ｎ　７１０２（７２）発明者　ピーターワン、ディピッド・ニーアメリカ合衆国５３１０４ウイスコンシン州ブリストル、ツー・ハンドレッド・アンド・エイティーンス・アベニュー６１３４番（７２）発明者　プライス、ウオレン・ヒユーアメリカ合衆国６００９９イリノイ州ザイオン、ピーコック・ロード１２９７１番

Claims

【特許請求の範囲】

１．チンパンジーおよびヒトよりなる群から選ばれた哺乳動物で免疫応答を生じる全ウイルス粒子の１または２以上のＣ型肝炎ウイルス抗原と選択的に結合し得る抗体。
２．該抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である請求項１に記載の抗体。
３．ハイブリドーマ細胞により産生されたものである請求項１に記載の抗体。
４．ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１０５２９およびＨＢ１０５３０よりなる群から選ばれた細胞株により産生されたものである請求項３に記載の抗体。
５．ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１０５２９およびＨＢ１０５３０よりなる群から選ばれるＣ型肝炎ウイルスの抗原に選択的に結合する抗体を産生し得る細胞株。
６．感染した患者から採取した血漿試料からの感染性Ｃ型肝炎ウイルスの単離方法であって、（ａ）遠心分離により該血漿試料を清澄化し、（ｂ）清澄化した血漿を順番に小さくなる孔径を有する下記一連のポリカーボネートフィルターを用いて濾過し、その際、該フィルターの一連の孔径は、それぞれ３．０、１．０、０．８、０．６、０．４、および０．２ミクロンであり、（ｃ）該濾過した血漿を１０％ショ糖溶液でベレット化し、ついで（ｄ）該ベレット化した物質を再懸濁することを特徴とする方法。
７．該再懸濁した物質の感染価が約１０５ＣＩＤ／ｍｌ以上であり、該再懸濁した物質が血漿試料の全タンパク質の約１％未満である請求項６に記載の方法。
８．感染した患者から採取した血漿試料から単離したＣ型肝炎ウイルスに対する免疫応答により生成させた抗体の製造方法において、請求項６に記載の方法により調製した精製血漿に対する抗体を生成させ、該精製血漿が約１０５ＣＩＤ／ｍｌ以上の感染価を有することを特徴とする方法。
９．Ｃ型肝炎ウイルスに特異的に合体した抗原を検出するための免疫学的アッセイであって、該抗原に特異的な抗体との選択的な免疫学的反応に基づいたアッセイにおいて、請求項１に記載の抗体を用い、該抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とするアッセイ。
１０．該モノクローナル抗体がＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１０５２９およびＨＢ１０５３０よりなる群から選ばれた細胞様により産生されたものである請求項９に記載のアッセイ。
１１．感染した患者から採取した血漿試料からの感染性Ｃ型肝炎ウイルスの単離方法であって、（ａ）遠心分離により血漿試料を清澄化し、（ｂ）清澄化した血漿を順番に小さくなる孔径を有する一連のフィルターを用いて濾過し、（ｃ）該濾過した血漿を１０％ショ糖溶液でベレット化し、ついで（ｄ）該ベレット化した物質を再懸濁することを特徴とする方法。