JPH06502075A - C型肝炎ウイルス抗体 - Google Patents
C型肝炎ウイルス抗体Info
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
C型針炎ウィルス抗体
本発明は、感染した患者から単離したC型肝炎ウィルス粒子の抗原に選択的に結
合する抗体、およびHCVを部分精製する手順を含む、血漿からのC型肝炎ウィ
ルスの単離方法に関する。
発明の背景
0型肝炎ウイルスまたは)(CV()(CI、’は歴史的には非A非B型肝炎ま
たはNA N B Hと呼ばれている)は、汚染された血液または血液製剤によ
り転移することか確立されている。輸血を受けた患者中、10%もの多くの患者
が輸血後肝炎にかかるであろう。該疾壱にかかっている患者のうち、約90%が
HCVを有していると診断されるであろう。この形の肝炎の血液および血液製剤
による転移を防くには、HCV保菌者並びに汚染された血液および血液製剤を同
定するのに用いることのできる、信頼性があり高感度で特異的な診断および予後
アッセイが必要である。
これら必要とされる診断および予後アッセイの開発は、HCVに特異的な免疫反
〔試薬が手に入らないことにより行き詰まっていた。必要とされる試薬の開発に
おける進歩は、とりわけHCV抗原および抗体を同定および単離することの困難
さにより妨害されていた。たとえば、ウオンズ(Wands)らの米国特許第4
,870.076号、ヘリングス(Hellings)のVOX Sang、5
1.li遺l:63〜66(+986)、リンケ(Linke)ら[引用する必
要あり・プロダク/ヨン・オフ・モノクローナル・アンタイボディーズ・スベン
フィノク・フォア・ノンーA、/ノーB・ヘパティティス・インフエクテノド・
リバー(Production or Monocl。
nal Antibodies 5pecific for Non−A、No
n−B Hepatitis I nfected Liver):ウオノズら
のProc、NaL’1.Acad、Sci、、83 : 6608〜6612
(1986)、オホリ(Ohori)らのJ、Med、Virol、、] 2
: 161〜178(1983)、プラノドリー(B radley)らのPr
oc、Nat’1.Acad、Sci、、84 : 6277〜6281(+9
87)、アカツカ(A katsuka、 T 、 )らのJ、Med、Vir
ol、20 : 43〜56(1986)、セト(S eto、 B、)らの米
国特許出願第07/234,641号(商務省゛アメリカ技術情報サービス、ス
プリングフィールド、バージニア州、No。
89138168から入手可)、タカハシ(T akahashi、 K、 )
らのヨーロッパ特許出騨第0293274号、1988年11月30日公開、お
よびシーリング(Seに存在する抗体と免疫学的に反応する抗原をコードする単
離cDNA配列に関する最近の報告により、組換えにより製造した抗原を用いる
一つの診断アッセイが得られた。ヒユートン(Hough ton)らのヨーロ
ッパ特許出願公開第0318216号および関連する論文クオ(Kuo)らのS
cience、244 : 359〜361(1989)およびチx −(C
hoo)らのS cience、244 :362〜364(1989)を参照
。
感染因子自体は、単離および特徴付けに成功していない。たとえば、ファウラー
(Fotvler)らのJ、Med、Virol、、 I 2 : 205〜2
] 3(1983)およびウニイナー(Weiner)らのJ、Med、Vi
rol、、21 : 239〜247(1987)を参照。
モリ(〜4ori)らのL ancet、318(1980年8月9日)、セト
らのLancet 941〜943(1984年10月27日)、およびプラノ
ドリーらのJ 、 Med、 V 1rol。
、3 : 253−269(1979)。プラノドリーらのGastroent
erology、 88 ニア73(1985)、には、ポリカーボネートフィ
ルターを用いたHCVウィルス粒子のサイジング(sizing)が報告されて
いる。接種したチンパンジー血液の血漿からヒトロタウィルスを精製するための
一連のグレードのポリカーボネートフィルターを用いた、この技術の変法は、ミ
ラー(Miller)らのプロシーディンゲス・オフ・ザ・46th・アニュア
ル・ミーティング・オフ・ザ・エレクトロン・マイクロスコピー・ソサイエティ
・オフ・アメリカ(Proceedings or the 46thAnnu
al Meeting of the Electron Microscop
y 5ociety or America)、76〜77頁(1988年8月
)およびミラーらのプロシーディンゲス・オフ・ザ・12th・インターナシ3
ナル・フンブレス・フォア・エレクトロン・マイクロスフビー(Proceed
ings or the 12th I nternational Cong
ress for E 1ect■
on Microscopy)、308〜309頁(1990年8月)に一層詳
細に記載されている。
明らかに、HCVの感染因子を単離し完全に特徴付ける必要性が存在する。感染
因子の111離に成功することにより、診断および予後アッセイがさらに開発さ
れ本発明は、忠音において免疫応答を生じる全ウィルス粒子の1または2以上の
HCV抗原と選択的に結合することのできる抗体に関する。ウィルス粒子のHC
V抗IQl;t、好ましくはチンパンジーおよびヒトよりなる群から選ばれた哺
乳動物から単離される。
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方がこの発明により提供され
る。これらタイプの抗体の両方とも、免疫攻撃した哺乳動物からハイブリドーマ
細胞を産生ずるための当該技術分野で公知の方法に従って調製することができる
。とりわけ、これら抗体は、ハイブリドーマ細胞株H18C27およびHI F
3C68(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンヨン(ATCC)、+2
301パークローノ・ドライブ、口lクビル、メリーラント州、20852にそ
れぞれATCCNo、HB10529およびHB10530として1990年8
月15日に寄託しである)よりなる群から選ばれた細胞株から単離することがで
きる。
この発明はまた、感染した患者から採取した血漿試料中の感染性HCV粒子の単
離方法をも提供するものであり、該方法は、血漿試料を遠心分離により清澄化し
、該清澄化した血漿を順番に小さくなる孔径を有する一連のフィルター(フィル
ターの孔径は、それぞれ、30.1.0.08.06.0,4、および0.2ミ
クロンである)で濾過し、濾過した血漿を10%ンヨ糖溶液でペレット化し:つ
いて該ベレ、トシた物質を再懸濁することを含む。
本発明の方法は、最初の血漿試料中のペレZ)化か可能な全タンパク質の約1%
未満、好ましくは01%未満しか含んでいないにも拘わらず、約10’CID/
mIまでの感染価を有する再懸濁物質を提供する。
本発明の抗体は、HCVと特異的に合体した抗原を検出するための免疫学的ア。
セイに有用である。
本発明の他の側面および利点は、この発明の実施の具体例を含む下記詳細な読本
発明は、ヒトおよびチンパンジーHCVをもたらすことが知られている因子を単
離および視覚化する方法を提供する。推定ウィルスを免疫凝集させ、高度免疫血
清を産生させ、あるいはこの架空の因子をクローニングする過去の努力は、血液
の血漿から適切にウィルスを精製する可能性の欠如によって阻まれていた。
この感染因子の物理的性質については、おそらく約1100nのフィルターを通
過てきるクロロホルムおよびB−プロピオラクトン感受性のウィルスであること
以外は殆どわかっていなかった。このウィルスの浮遊密度を決定するための他の
研究者による試みからは曖昧な結果しか得られておらず、現在までのところ、こ
のウィルスを精製し、また同時に濃縮するための信頼性のある手段は得られてい
ない。本発明は、全感染血液血漿を精製および濃縮(enriching) L
、得られた単離物を用いて抗体を生成するための概略を記載する。
血液血漿または細胞抽出物からウィルス粒子を精製する方法は、伝統的に、単離
すべきウィルスの浮遊密度に基づいていた。示差遠心分離法および密度勾配法(
等密度または速度・ノーンバンディングなど)の両方法とも、所定の遠心分離工
程においてウィルスと類似の密度を有するすべてのクラスの細胞破片が回収され
る。
そのような破片は全体のサイズが相当変化に富んでおり、そのような破片が存在
するために、電子顕微鏡を用いてウィルス粒子を検出または同定することが一般
に困難になっている。
ウィルス分類の補助として、超遠心分離によるウィルス粒子のサイジングが用い
られてきている。すでに記載したように、ブラ、ドリーらはHCV粒子のサイズ
についての情報を得るために定められた孔径のポリカーボネートフィルターを用
いることを報告している。この発明は、孔径が減少する一連のポリカーボネート
フィルターに血液血漿を連続的に通すことに基づいたHCV精製法を提供する。
HCV粒子を単離するには、ポリカーボネートフィルターが好ましい。その理由
は、編み合わせ繊維の比較的厚手の網からなるニトロセルロース、ポリエステル
や他のタイプのフィルターと違って、ポリカーホ不−トフィルターは薄く、サイ
ズが正確で真っすくにあけられた穴を有するからである。これら特徴は、ニトロ
セルロース、ポリエステルや他のタイプのフィルターの場合にみられるようなフ
ィルターマトリックス中での非特異的な吸着や捕捉により引き起こされる粒子の
損失を制限する。
最初の実験においては、グレード化した一連のフィルターが全血液血漿中に存在
する粒子のサイズを連続的に減少させる能力を調べた。直径が25mmのヌクレ
ヂア(N uc 1epore)フィルターをスウィンロノク(S vinlo
ck)ホルダー中に載せ、該ホルタ−を合間は血漿を充填した1Qcc容皮下注
射器に結合させた。しかしながら、この構成では、栓をする前に一連のフィルタ
ーに少量の血漿しかうまく通すごとができない。一つの解決として、血漿の希釈
を行わないようにした。なぜなら、これは取り扱う血漿の全量を増加させるだけ
であり、最終ウィルス単離物を濃縮するために超遠心分離工程を過剰に行うこと
になるからである。結局、i@通過程を簡単にするために小さな圧力を加えた。
表1にHCV粒子を単離するための好ましい手順を示す。まず全血血漿を低速遠
心分離により清澄化し、ついで30.1.0.0.8.0.6.0.4および0
22ミフロンヌクレボアフイルター順番に圧濾過した。ついで、0.2ミクロン
濾液を緩衝10%ンヨ糖の上部に重層し、105.000Xgで4時間ベレット
化した。10%/ヨ糖でペレット化した後、微細タンパク質が取り除かれた。ペ
レットをリン酸緩衝食塩水中に再懸濁してI OOXスト、り濃縮物を得、つい
で、これを所望によりさらに希釈した。感染性研究のために使用する最終濃縮物
の部分は、低温保護剤(cryoprotectanL)として2%BSAを含
有する緩衝液中で希釈した。
」4
工程′il 全希釈血漿(2000rpmで20分間清澄化)工程f2 3.0
ミクロンフィルター
工程93 1.0ミクロンフィルター
薯
工(呈1 0.8ミクロンフィルター
工程#5 06ミクロンフィルター
工程16 0.4ミクロンフィルター
1t呈f7 0.2ミクロンフイルター工程!8 10%ンヨ糖ペレット(10
5,000Xgで4時間)■
工程#9 100Xに再懸濁
部分精製した血漿はフィルターを容易に通過し、ミラー(ミラー(M i 1l
er、 M。
F、)、E 1ectron Microscopy in B iology
、 vol、 2、グリフイスO、D、 Grlffith)[、ジョノウイリ
ーアンドサンズ、ニューヨーク、ニューヨーク州、1982.305〜339頁
)によって開発された方法(市販のベノクマンエアヒュージ(Beckman
Airfuge)超遠心管およびEm−90i1i子顕微鏡粒子カウントロータ
を用いる)を用い、電子顕微鏡観察のために精製の各工程において100μmの
血漿アリコートを調製した。簡単に説明すると、原料の血漿およびポリカーボネ
ートフィルター精製工程の各段階から得られた血漿100μmを、EM90ロー
タ中て100.OOOXgにて5mm’ミリポアフィルター支持体へ沈降させる
。
沈降した粒子を有する支持体を3%グルタルアルデヒドついで四酸化オスミウム
で固定し、脱水し、エポキ7樹脂中に包埋する。ついで、包埋したフィルター支
持体を薄片にし、酢酸ウラニルついでクエン酸鉛で染色する。
低倍率では、EM観察のために調製した全未濾過チンパンジー血液血漿の様子は
、多量の小さなタンパク質様物質、フィブリンの塊および様々なサイズの微細粒
子を示した。もっと高倍率では、チンパンジー血漿の0.2ミクロン濾液の様子
は、0.2ミクロンよりも大きい微細粒子はすべて濾過により取り除かれたこと
、およびlO%ン3糖ペレット化工程後に小さなタンパク質が取り除かれたこと
を示した。これらの結果は、上記精製法が、大きな微細粒子を選択的に除去し、
小さなタンパク質を取り除くのに有効であることを明らかに示している。
このai5法を用いたウィルス回収を評価するため、1m’1当たり約10I0
粒子の高度精製ヒトロタウィルスを全チンパンジー血漿に接種した。ロタウィル
スは非血液由来であるが、直径が約65〜7Qnmであり、非精製試料の薄片中
に比較的容易に認識しカウントすることができる。精製の種々の段階からの接種
血漿試料を上記と同様にしてEM観察用に調製し、ウィルス粒子をカウントした
。試料はまた、高感度分光測光タンパク質ア、セイを用い、ペレット化し得る全
タンパク質についてもアッセイした。精製に際して対数期のウィルスの画分のみ
が失われたが、ペレット化し得る全タンパク質に関しては全体で250倍の減少
があったことがわかった。
上記濾過法は、HCVの感染因子を単離するために必要な濃縮血漿を得るために
用いることができる。HCVを単離するための一つの方法、免疫凝集電子顕微鏡
法は、適当な濃度の血漿濃縮物と適当な抗体とを混合し、得られた免疫凝集物を
透過電子顕微鏡を用いて1S−1J化することにより行うことができる。抗体は
、一般に旧態て約40.OOORPMで10分間遠心分離にかけることにより、
たいていの血清中に認められる所望でないバックグラウンド微細粒子を除いてお
く。
抗体力価が未知である場合には、系統的な試行錯誤法を用いて最適希釈を実験的
に決定しておく必要かある。希釈し過ぎたり濃縮し過ぎたりすると、抗体溶液の
凝集は不完全となったり凝集しなかったりするであろう。
種々の肝炎ウィルスを研究するために好ましい凝集法には、(a)20μlの充
分に分散させた血漿濃縮物を50μmのPBS、 pH7,2、および20μl
の抗体と混合し、(b)この混合物を室温にて1時間、ついで4°Cで一夜イン
キコベートし、(c)得られた免疫凝集物をベノクマンエアヒュージ超遠心管中
、20ps1にて30分間ベレット化し、(d)上澄み液を捨て、得られたベレ
ットを20μmの水中に再懸濁し、(e)5μl小滴の懸濁液をフオームバー(
F orsvar)コーティングEM試料グリッドに適用し、(f)この小滴を
吸取紙で吸い取り、ついで(g)付着した微細粒子を2%リンタングステン酸で
ネガティブ染色することが含まれる。ついで、10〜45,0OOXの倍率の透
過電子顕微鏡を用い、免疫凝集について試料グリッドを注意深く調べる。
そのモノクローナル抗体または上記単離HCVIm製物を用いて得られた他のモ
ノクローナル抗体は、独立に、互いに組み合わせて、またはヒト、チンパンジー
、ウサギまたは他の哺乳動物ポリクローナル抗体と組み合わせて、HCVの抗原
のための診断試験に用いることができる。
幾つかの別のアッセイ法を本発明の抗体に用いることができる。たとえば、抗体
を適当な固体支持体に結合させ、HCVを含有する試料またはアリコートに接触
させ、ついで発色して検出可能なシグナルを生成する第二の標識抗体と接触させ
るごとができる。シグナル生成残基で標識した本発明の抗体を使用するアッセイ
は、また別の方法である。加えて、該標識した抗体を競合抗体アッセイに用いる
こともできる。このタイプのアッセイでは、試料中に含まれる抗原の免疫優勢(
immunodominant)エピトープを有する抗原をコーティングした固
体支持体の存在下、該標識抗体を試料またはアリコートとともにインキュベート
する。試料中に存在するHCVに対する抗体は、該標識抗体および該結合抗体と
、結合について競合するであろう。それゆえ、HCVに対する抗体を含有する試
料からは、標識抗体を添加しないアッセイで生じるシグナルに比べて低い検出可
能なシグナルを本発明の方法により調製した精製ウィルスはまた、未知のHCV
抗原を特徴付けるのにも用いることができる。抗体を生成するのに用いる精製ウ
ィルスは、界面活性剤でウィルスを可溶化する前または後に、確立された方法に
従ってクロラミンTおよびボルトンノ・ンターの両方の反応条件を用い、放射性
ヨウ素で標識することかできる。これら抗体を免疫沈降実験に用いることができ
、その際、抗体は溶液中で可溶化障識ウィルスと反応する。このインキュベーシ
ョン期間の後、Bugの固定化スタフィロフノカス・アウレウス(S taph
alococcus aureusXS taphA)細胞を上記抗原−抗体混
合物とともにインキュベートする。これら細胞上の免疫グロブリンレセプターは
、遊離の免疫グロブリンと同様、抗原−抗体複合体と結合するであろう。結合し
た細胞を遠心分離によりペレ、)化し、繰返し洗浄して未吸着の標識抗原を除く
。ついで、腹合体が吸着した5taphA細胞を、2−メルカプトエタノール、
界面活性剤および緩衝液を含有する溶液中で100°Cに加熱することにより解
離させ、ついでポリアクリルアミドスラブゲル上で電気泳動にかける。電気泳動
後、ゲルを固定し、放射能の検出を高めることが知られている薬品で処理し、乾
燥し、何日間、何週間または何カ月間もの長期間、−70″CにてX−線フィル
ムに暴露する。X−線フイルムを感光すると、放射性標識抗原がその分子サイズ
に基づいてゲル中を移動した位置にてフィルム上にバントが現れるであろう。こ
れらバンドの位置を分子量が知られた放射能標準の位置と比較することにより、
沈降したウィルス抗原の分子サイズを決定することができる。この情報は、現在
未知であるH CVの実際の遺伝子生成物のサイズを決定する上で価値があるも
のである。
ウィルス復製を支持し得る細胞株中で産生される標識ウィルス抗原を同定するた
めに、この方法の変法を用いることもできる。本質において、この方法は、ウィ
ルス復製の存在について種々の細胞株をスクリーニングするために用いることが
でき、それゆえ、C型肝炎の診断のための組織培養系を確立するための手段とし
て有用である。
本発明によるモノクローナル抗体は、HCV感染、および体液、組織、実験試薬
および実験流体中の感染因子を検出するためのアッセイに有用であろうことが期
待される。
本発明のモノクローナル抗体はまた、HCVと特異的に合体した抗原をアフィニ
ティークロマトグラフィーにより単離するのに用いることもできる。そのような
免疫精製抗原は、複数のエピトープ特異性を有する抗体を得るために、ヤギやウ
サギなどの非霊長類種を免疫するのに用いることができる。別法として、単離抗
原をマウスやラットを免疫するのに用いて、別のモノクローナル抗体を産生ずる
ことのできるハイブリドーマ細胞株を調製することができる。
本発明に従って生成した抗体により、HCV@染と特異的に合体した抗原および
感染因子を特徴付けることが可能になる。この観点から、分析用ゲル電気泳動や
分離用ゲル電気泳動などの標準的な方法を用いて、この発明の抗体と反応性の抗
原の分子量を決定することができる。かくして得られた反応性の単離物は、還元
剤、プロテアーゼ、リパーゼ、グリコンダーゼなどを含む種々の選択剤を用いる
ことによりさらに特徴付けを行うことができる。HCVウィルス抗原と反応する
抗体は、競合および非競合イムノアッセイ、ラジオイムノア、セイ、ELISA
、EIAなどを含む種々のイムノアッセイに利用することができる。
下記実施例は、この発明の詳細な説明するものであり、説明の目的のためにのみ
記載したものである。これら実施例は、本発明の範囲または添付の請求の範囲を
限定することを意図するものではない。
実施例1は感染したチンパンジーからHCVを精製する方法を記載し、実施例2
はモノクローナル抗体の製造を記載し、実施例3は診断試験を記載する。
HCVのio’cID/ml(チンパンジー感染投与量/ml)感染価を有する
チンパンジー血液血漿を下記のようにして精製した。原料の血漿をまず卓上の遠
心管中、1100OXにて20分間低速遠心して大きな細胞破砕物を除いて清澄
化し、ついで直径30.1.0.0.8.0.6.0.4および0.2ミクロン
の孔径を何するポリカーボネートメンブランフィルタ−で順番に圧ts過した。
ついで、02μmal液中に残留する微細粒子をリン酸緩衝10%ショ糖で10
5,000×gにて4時間超遠心分離することによりペレット化した。この工程
により小さなりンバク質が除かれ、ウィルスが濃縮された。ペレット化したウィ
ルスをリン衝液で希釈した。
精製したチンパンジー血漿から得られ沈降し薄片になった微細粒子を示す電子顕
微鏡像を、同様に調製した原料の出発血漿と比較した。高感度の分光測光アッセ
イを用い、ペレット化し得る全タンパク質は250倍以上減少したことがわかっ
た。精製したウィルス生成物をチンパンジーに接種した場合、感染性であること
がわかった(血清酵素の特徴的な上昇および肝細胞の微細構造の変化によって明
示されるように、力価が100%回復した)。この精製した生成物を用いてモノ
クローナル抗体を調製した。
C型杆炎に感染したチンパンジーからの肝臓切片上での免疫蛍光顕微鏡観察によ
る血清の低反応性に基づき、6匹のメスBa1bc/Jマウスを選択した。
これら選択したマウスを用いて、精製HCVを接種した。ウィルスを接種する前
に、すべてのマウスから播種前血液を採取した。接種物としては、実施例1に記
載の方法により得た精製ウィルスを用いた。各2匹ずつのマウスを下記のように
して接種した:精製ウィルスストック 0.1ml、通常食塩水中のウィルスス
トックの1/10希釈Q、2ml、または通常食塩水中のウィルスストックの1
/100希釈Q、 2mlを腹腔内投与(IP)にて。21日目に目からの採血
により血液試料を回収した。35日目に、すべてのマウスに初回免疫様式と同じ
接種物および投与量でブースター投与した(IP)。49日目に目からの採血に
より再び血液試料を回収した。12929日目すべてのマウスに前回と同様に再
びブースター投与した(I P)。14141日目からの採血により血液試料を
回収した。19999日目各投与カテゴリーのマウス1匹に精製ウィルスストッ
クの1/lO希釈Q、1mlを静脈内(TV)接種した。3日後にIVジブ−タ
ー投与したマウスを層殺し、肺臓リンパ球細胞を単離し、ケーラーとミルシュタ
インの方法(ケーラーおよびミルシュタイン、Nature、256 : 49
5〜497.1975)に従って5P210マウスミエローマ細胞と融合した。
24141日目りの3匹のマウスを上記と同様にしてIVジブ−ター投与し、3
日後に層殺し、肺臓リンパ球を単離し、S P 210細胞と融合した。
固体ポリスチレンビーズ上にコーティングした抗原としてカイロン(Chiro
n)c−tooクローン(ヨーロッパ特許出願公開第0318216(1’98
9年5月31日公開)に記載されている)からの配列を示す合成ペプチドを用い
たエンザイムイム/アッセイ(EIA)により、マウスリンパ球と5P210細
胞との融合から得られたハイブリドーマの上澄み液をスクリーニングした。ペプ
チドEIAにおいて陽性のシグナルを生じるハイブリドーマ細胞株を限界希釈法
によりクローニングした。カイロンC−100配列内に含まれるエピトープに特
異的なIgMクラス抗体を産生ずるモノクローナル細胞株を単離した。これら細
胞株のうち2つ、Hl 8C27およびH18C68を細胞培養中に拡張し、液
体窒素下で凍結し、現在、それぞれHB10529およびHB10530の受託
番号にてATCCに寄託しである。
固相ポリスチレンビーズ支持体に結合した抗原捕捉試薬として、実施例2の方法
に従って調製したモノクローナル抗体を用いる。患者から採取した血清、血漿ま
たは脳を髄液などの体液のアリフートを、上記ビーズに結合した抗体とともにイ
ンキスペードする。インキュベーションの間、抗原または全ウィルスは固相に結
合する。インキュベーンジン後、未結合抗原を固相支持体から洗浄して除く。
アッセイの第二工程において、西洋ワサビベルオキシダーゼに結合させた、同じ
抗体、またはHCV抗原の異なるエピトープに結合する池のモノクローナル抗体
、またはポリクローナル抗体を」1記ビーズとともにインキュベートする。この
標識抗体は、固相上に捕捉された抗原と結合して抗体−抗原−抗体サンドイノチ
を形成するであろう。過剰のベルオキ/ダーゼ標識抗体を洗浄して除き、ビーズ
を0PD(オルトフェニレンジアミン)などの適当な酵素基質に暴露する。得ら
れた発光的に検出する。
本発明を特定の方法および組成により説明したが、本発明を考慮することにより
変更およびtlliを施し得ることは当業者には理解されるであろう。
国際調査報告
フロントページの続き
(51) Int、C1,S 識別記号 庁内M理番号C12N 7102 8
931−48
GOIN 331576 Z 9015−2J331577 B 9015−2
J
//(C12P 21108
8931−4B
(72)発明者 レスニエフスキー、リチャード・アールアメリカ合衆国531
42ウイスコンシン州ケノシヤ、ワン・ハンドレッド・アンド・テンス・アベニ
ュー8706番
p FI
C12N 7102
(72)発明者 ピーターワン、ディピッド・ニーアメリカ合衆国53104ウ
イスコンシン州ブリストル、ツー・ハンドレッド・アンド・エイティーンス・ア
ベニュー6134番(72)発明者 プライス、ウオレン・ヒユーアメリカ合衆
国60099イリノイ州ザイオン、ピーコック・ロード12971番
Claims (11)
- 1.チンパンジーおよびヒトよりなる群から選ばれた哺乳動物で免疫応答を生じ る全ウイルス粒子の1または2以上のC型肝炎ウイルス抗原と選択的に結合し得 る抗体。
- 2.該抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である請求項1に記 載の抗体。
- 3.ハイブリドーマ細胞により産生されたものである請求項1に記載の抗体。
- 4.ATCCNo.HB10529およびHB10530よりなる群から選ばれ た細胞株により産生されたものである請求項3に記載の抗体。
- 5.ATCCNo.HB10529およびHB10530よりなる群から選ばれ るC型肝炎ウイルスの抗原に選択的に結合する抗体を産生し得る細胞株。
- 6.感染した患者から採取した血漿試料からの感染性C型肝炎ウイルスの単離方 法であって、 (a)遠心分離により該血漿試料を清澄化し、(b)清澄化した血漿を順番に小 さくなる孔径を有する下記一連のポリカーボネートフィルターを用いて濾過し、 その際、該フィルターの一連の孔径は、それぞれ3.0、1.0、0.8、0. 6、0.4、および0.2ミクロンであり、(c)該濾過した血漿を10%ショ 糖溶液でベレット化し、ついで(d)該ベレット化した物質を再懸濁することを 特徴とする方法。
- 7.該再懸濁した物質の感染価が約105CID/ml以上であり、該再懸濁し た物質が血漿試料の全タンパク質の約1%未満である請求項6に記載の方法。
- 8.感染した患者から採取した血漿試料から単離したC型肝炎ウイルスに対する 免疫応答により生成させた抗体の製造方法において、請求項6に記載の方法によ り調製した精製血漿に対する抗体を生成させ、該精製血漿が約105CID/m l以上の感染価を有することを特徴とする方法。
- 9.C型肝炎ウイルスに特異的に合体した抗原を検出するための免疫学的アッセ イであって、該抗原に特異的な抗体との選択的な免疫学的反応に基づいたアッセ イにおいて、請求項1に記載の抗体を用い、該抗体がモノクローナル抗体である ことを特徴とするアッセイ。
- 10.該モノクローナル抗体がATCCNo.HB10529およびHB105 30よりなる群から選ばれた細胞様により産生されたものである請求項9に記載 のアッセイ。
- 11.感染した患者から採取した血漿試料からの感染性C型肝炎ウイルスの単離 方法であって、 (a)遠心分離により血漿試料を清澄化し、(b)清澄化した血漿を順番に小さ くなる孔径を有する一連のフィルターを用いて濾過し、 (c)該濾過した血漿を10%ショ糖溶液でベレット化し、ついで(d)該ベレ ット化した物質を再懸濁することを特徴とする方法。
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