JP3479073B2

JP3479073B2 - 抗ｈｐａ抗体の検出

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Publication number: JP3479073B2
Application number: JP51183994A
Authority: JP
Inventors: ハゴープベーソンズ; ウィリアムジェラードマーフィー
Original assignee: コモンサーヴィシスエージェンシー
Priority date: 1992-11-07
Filing date: 1993-11-08
Publication date: 2003-12-15
Anticipated expiration: 2018-12-15
Also published as: DE69331549D1; JPH08503770A; EP0667961B1; WO1994011740A1; AU5425194A; ES2172518T3; EP0667961A1; DE69331549T2; GB9223390D0

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、特定の遺伝子型のヒト血小板抗原１又は３
（HPA1又はHPA3）に対する抗体の免疫学的検出用免疫分
析法及び免疫分析系、及び特にその検出用酵素結合免疫
分析（ELISA）に関する。

背景 HPA1は、GP III aのＮ末端領域に位置する血小板膜糖
タンパク質（GP）II b/III a複合体についての多型決定
基である。この複合体は、非共有結合で結合した２つの
サブユニットGP II b及びGP III aからなる。サブユニ
ット結合にはCa²⁺及びMg²⁺のような２価のカチオンが必
要である。HPA1の免疫原性は、輸血後紫斑病（PTP）及
び新生児同種免疫血小板減少症（NAITP）を含む種々の
免疫性血小板減少症を引き起こす（参考文献１、２）。
HPAはHPA1a及びHPA1b型として存在するものである。白
色人種の人口の約72％は、HPA1a（血小板抗原１、即ちP
LA1）の同型接合であり、HPA1b（血小板抗原２、即ちPL
A2）は２％であり、26％は異型接合である（参考文献
２）。PTPは稀な症状（世界で約200の報告例）である
が、NAITPは2000の生存出産中１人の割合で比較的頻繁
に現れ、その症例の約50％が最初の妊娠である（参考文
献２、３）。これらの症状においては、抗HPA1a抗体
（即ち、1a型抗体）がHPA1a抗原をもつ血小板を攻撃し
て患者の血液中の血小板の破壊を生じる。これは、NAIT
Pの場合、血小板計数の減少又は血小板活性の低下及び
その結果としての血液凝固系の損傷のために出血傾向の
増加した乳児として現れる。

抗HPA1a抗体の初期の検出は、迅速な診断が患者の治
療、特に妊婦の型別を助けることができるので極めて重
要なものである。抗HPA1a抗体の検出には、血小板懸濁
免疫蛍光試験（PSIFT）、血小板抗原のモノクローナル
抗体固定化（MAIPA）、フローサイトメトリー及び免疫
吸着分析を含む数種の方法がある（参考文献４、５、
６、７）。そういった方法は十分に確立されているが、
非常に感受性のあるMAIPAの場合には、時間を要し、自
動化及び広範囲な適用で処理することができない。

Pytelaら（参考文献８）は、アミノ酸配列Arg−Gly−
Asp（RGD）を含むペプチドに対する血小板膜糖タンパク
質GP II b/III aの結合特性を記載している。糖タンパ
ク質は、セファロースに結合したヘプタペプチドGRGDSP
Kを用いて血小板抽出液のアフィニティークロマトグラ
フィーにより精製されたものである。

Kirchhofferら（参考文献９）は、同様の精製手順を
用いて純粋なGP II b/III aを生成した。ニトロセルロ
ースフィルターに移した純粋な糖タンパク質は、モノク
ローナル抗II b抗体と反応して酵素標識第２抗体を用い
て明らかにされる免疫複合体を形成した。アフィニティ
ークロマトグラフィーからの溶出液は、糖タンパク質に
結合したヘキサペプチドを含み、更にMg²⁺及びMn²⁺イオ
ンを含むものである。ペプチド及び金属イオンが存在す
ると、抗HPA抗体の試験において糖タンパク質の使用を
妨害することがある。更に、Kirchhofferは、遺伝子型
血小板の使用を示唆していない。

R.Kekomakiら（J.Clin.Invest.,88,847−854,1991）
（参考文献10）は、セファロースに吸着させることによ
りGP II b/III aを精製して粗分離物を得、次いで、ヘ
パリン−セファロースカラムに通過させて残存する汚染
物を除去し、セファクリルＳ−300とゲルろ過し、コム
ギ胚芽凝集素アフィニティークロマトグラフィーにより
微量のフィブリノーゲンを除去した。

しかしながら、これらの文献は、特定の遺伝子型のHP
A抗体の検出に適切な免疫分析を開示していない。

発明の要約本発明は、１態様においては、遺伝子型糖タンパク質
抗原GP II b及び／又はGP III aを被覆した基質を含
む、ヒト血小板抗原１又は３（HPA1又はHPA3）に対する
抗体の免疫学的検出用免疫分析系を提供するものであ
る。

即ち、抗HPA1及び抗HPA3抗体は、特にNAITPにおいて
重要な役割を果たすことが判明した。

血小板の遺伝子型は、Williamsonら（1992）に記載さ
れている手法を用いて型別された（参考文献11）。以前
には、抗原の対立遺伝子の相違（HPA−１−４）は血小
板糖タンパク質をコードするDNAに含まれる多型性によ
ることが判明している。

供血者又は患者の血小板を分子手法を用いて型別する
ことは可能である。これは、抽出したゲノムDNAをポリ
メラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて増幅し、次いで、制
限断片長多型（RFLP）分析にかけることにより達成され
る。このようにして、HPA1又はHPA3抗原を含む血小板を
同定及び単離することができる。

本発明は、もう１つの態様においては、下記の工程を
含む、ヒト血小板抗原１又は３（HPA1又はHPA3）に対す
る抗体の試験管内検出用免疫分析法を提供するものであ
る。

−マイクロタイタープレートを遺伝子型糖タンパク質抗
原GP II b及び／又はGP III aで被覆する工程； −非特異的に遮断する工程； −試験されるべき血清と接触させる工程； −固定化糖タンパク質抗原と血清中に存在する抗HPA1又
は抗HPA3抗体との間に形成された免疫複合体の存在を検
出する工程。

一般に、免疫複合体は、酵素標識（例えば、ホースラ
ディッシュペルオキシダーゼHRP）、放射能標識、蛍光
標識又は当該技術において既知の他の標識系のような適
切な標識で標識された抗ヒトIgG又はIgMによって評価さ
れる。酵素標識を用いる酵素結合免疫吸着分析（ELIS
A）が提供され、これは感受性があって、特異的で、安
価で、迅速でかつ抗HPA1抗体の大量スクリーニングに用
いることが可能である。有利なことには、インキュベー
ションが免疫複合体の生産に関与し、標識抗体によるそ
の評価を室温で行うことができかつインキュベーターの
使用を必要としないことが判明した。

本発明は、問題の要求したHPA遺伝子型を検出するた
めに遺伝子型糖タンパク質抗原の使用に基づくものであ
る。HPA1の抗原決定基はGP III aサブユニット上に存在
するので、抗HPA1抗体の免疫分析は糖タンパク質GP III
aサブユニットを含まねばならない。抗HPA1抗体は1a及
び1b型として存在するので、抗HPA1a抗体を検出するた
めに、糖タンパク質GP III aサブユニットの遺伝子型1a
が選ばれねばならない。NAITPの出現率の約98％が抗HPA
1a又は抗HPA3a抗体の存在によるものであり、前者は後
者の約４倍頻繁であることがわかっている。即ち、NAIT
P用の明確な試験には、抗HPA3a抗体（HPA3は同じように
遺伝子型3a及び3bとして存在する）も含めねばならな
い。HPA3の抗原決定基はGP II bサブユニット上にあ
り、そのためこれを抗HPA3a抗体の免疫分析において含
めねばならない。

抗体がHPA1aあるいはHPA1b（又はHPA3aあるいはHPA3
b）に対するものであるかを評価するために、適切な糖
タンパク質又は糖タンパク質混合液がマイクロタイター
プレートの分離ウェルに供給される、例えば、HPA1a1a/
3a3a、HPA1b1b/3b3b、HPA1a1a/3b3b又はHPA1b1b/3a3a
（いずれも各遺伝子型血液成分分離血小板から精製し
た）。

本発明の実用的実施態様は、HPA1a1a/3b3b糖タンパク
質を含むウェル（抗HPA1a抗体を検出するため）及びHPA
1b1b/3a3a糖タンパク質を別個に含むウェル（抗HPA3a抗
体を検出するため）；及び任意に対照として働く糖タン
パク質を含まないウェルを有する酵素結合免疫分析（EL
ISA）の多ウェルマイクロタイタープレートを含む。典
型的には、各ウェルは１ウェル当たり0.05〜0.5マイク
ログラム；好ましくは0.1マイクログラムの糖タンパク
質を含有する。

ウェルは、一般に、血清と接触させる前にウシ血清ア
ルブミンのような非特異的タンパク質混合液で遮断され
る。

更に、本発明の態様は、下記工程を含む、ヒト血小板
抗原糖タンパク質GP II b及び／又はGP III aの精製方
法を提供するものである：（ａ）遺伝子型ヒト血小板を供給する工程；（ｂ）その血小板を溶解して溶解物を形成する工程；（ｃ）その溶解物を配列Arg−Gly−Asp（RGD）を含むペ
プチドを結合したアフィニティークロマトグラフィー基
質に加える工程；及び（ｄ）遺伝子型糖タンパク質を溶離する工程。

好ましい実施態様の詳細な説明ここで、本発明の実施例は、下記に示す図面に関する
実施例によってのみ記載される。

図１は、種々の量の被覆HPAに対する抗GP III a、II
b及びI bモノクローナル抗体（MAb）（各々50、250及び
1,000ng/ml）の結合を示すものである。

図２は、２つの抗HPA1a血清を用いてHPA1aELISAの感
受性を示すものである。

図３は診断試験としてHPA1aELISAの実用例を示すもの
である。

実施例１（GP II b/III aの抽出）試薬は、Analarグレードに属し、BDH Chemicals社
（英国）又はAldrich Chemicals社（英国）から購入し
た。抗GP II b及びII b/III aモノクローナル抗体（MA
b）は、the Institute for Clinical Immunology and T
ransfusion Medicine,Justus Liebeg University,Giess
enによって供給された。抗GP I b及びIII aMAbは、Dako
patts（デンマーク）から購入した。HRP結合ヒツジ抗ヒ
トIgG及びIgMは、Scottish Antibody Production Unit
から入手し、HRP結合ヤギ抗マウスIgG及びIgMはBio−Ra
d（英国）から購入した。抗HPA1a及び正常血清は、各々
NAITPのある乳児の母親及び我々のセンターの篤志供血
者から入手した。

GP II b/III aの抽出及び精製は、Pytelaら及びKirch
hofferらの方法を少し変更した（参考文献８、９）。簡
単に述べると、遺伝子型血液成分分離血小板（Cambridg
e Transfusion Centreから入手）を洗浄し、血小板を50
mMトリス/HCl及び150mM NaCl、pH7.5（TBS）を含むバッ
ファー中10mlの100mMオクチルグルコピラノシド（OG）
及び2mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（Sigma、
英国）で抽出した。次いで、この抽出液を遠心し、上清
をカチオンで補足し（参考文献９）、2gの配列GRGDSPK
の固定化ヘプタペプチド（Novabiochem、英国製のペプ
チド；及びPharmacia製のCNBr活性化セファロース4B）
の12mgペプチド/gセファロース4Bと４℃で一晩回転混合
した。次に、ビーズを1000rpm、室温のベンチ遠心機（M
SE、英国）で５分間遠心し、上清を除去した。ビーズ
を、280nmの吸光度が非特異的結合タンパク質不純物が
洗い落とされたことを示す＜0.05（Pye Unicam,Philip
s、英国）に下がるまで遠心により洗浄した。糖タンパ
ク質は、セファロースビーズに固定化されたヘプタペプ
チドに結合する。次いで、ビーズを1mg/mlGRGDSPヘキサ
ペプチド（Novabiochem、英国）を含有する最初の混合
バッファーとともにTBS中5mlの1mM MgCl₂及び1mM MnCl₂
と３回室温で15分間回転混合することにより、結合GP I
I b/III aを溶離した。溶離バッファー中にヘキサペプ
チドを用いると、固定化ペプチドと競合し、ヘキサペプ
チド−糖タンパク質複合体を遊離する。溶離を３回繰り
返した。上記のように遠心により回収した３溶出上清を
プールし、１回以上遠心して残留ビーズ粒子を除去し
た。溶出液の吸光度を記録した後、１リットルの10mMト
リス/HCl、150mM NaCl、pH7.4に対して４℃で２回透析
した。透析は、ペプチド及び残留金属イオンを除去する
とともに遊離糖タンパク質を残すのに有効である。ペプ
チド分子は透析膜を通過し、遊離GP II b/III aへの解
離のために複合体の形成／解離の平衡を妨害する。即
ち、糖タンパク質は、実質的にペプチドを含まず、金属
イオンを含まない。GP II b/III a複合体に対するモノ
クローナル抗体は、Binding Site社、英国、バーミンガ
ムから購入し、透析糖タンパク質より非透析GP II b/II
I aに親和性が大きく結合した。これは、糖タンパク質
が実質的にペプチド及び金属イオンを含まないこと、即
ち全く複合体を形成しなかったことを示す。最後に、透
析溶出液の吸光度を記し、−40℃で分割して貯蔵した。
固定化RGDペプチドを洗浄し、再使用のために４℃で貯
蔵した。GP II b/III aのタンパク質濃度及び純度を、
以前のように（10）各々二シンコニン分析（Pierce、英
国）及びSDA−PAGE（銀染色）により評価した。1.4mgま
でのGP II b/III aは、１単位の純度90％以上の血液成
分分離血小板濃縮物から得ることができた。

実施例２（モデルELISA） ELISAは、下記工程から構成された：マイクロタイタープレート（Greiner、ドイツ）を、
１、２又は３μg/ml（１ウェル当たり100μｌ）の次の
表現型GP II b/III a糖タンパク質の１種:HPA1a1a/3a3
a、HPA1b1b/3b3b、HPA1a1a/3b3b又はHPA1b1b/3a3a（コ
ーティングバッファーのみバックグラウンドとして含ん
だ）で37℃において一晩被覆した（ELISAコーティング
バッファー、洗浄バッファー及び発色バッファー並びに
洗浄手順は参考文献12の通りである）。ウェルを洗浄
し、コーティングバッファー（300μl/ウェル）中５％
ウシ血清アルブミン（Boseral;Organon Technika）で37
℃において１時間遮断した。洗浄後、プレートを100μl
/ウェルのヒト血清又はマウスMAbの希釈液と37℃で１時
間３回繰り返してインキュベートした。ウェルを再び洗
浄し、HRP結合抗ヒトIgGもしくはIgM又は抗マウスIgGも
しくはIgMと各々37℃で１時間インキュベートした。ま
た、インキュベーションはすべて室温で行うことができ
る。最後に、プレートを洗浄し、比色基質としてテトラ
メチルベンジジンを用いて発色した（発色は37℃で高め
られる）。450nmの比吸光度は、GP被覆ウェルの吸光度
からコーティングバッファーのみ含むウェルの吸光度を
引いたものと等しかった。ヒト試験及び対照試料を５個
中１個の血清希釈液を用いてスクリーンした。

GP III a及びGP II bの存在を示す、被覆GP II b/III
aの対応MAbに対する特異的かつ用量依存結合があった
（図１）。比較として、比較的高濃度の抗GP I bは最高
量の被覆GP II b/III aに結合しなかった。特異的結合
は、抗GP II b/III aMAbでも認められた（データは示さ
れていない）。更に、２つのヒト抗HPA1a陽性血清（陰
性対照として正常血清とともに）用いる分析により、1:
80〜1:160の希釈度で非常に感受性があることがわかっ
た（図２）。実際に、分析により1:1000〜1:3000の陽性
血清希釈度で行うことが可能であることがわかった。更
に、分析の特異性は、抗HPA1a抗血清がHPA1a1a/3a3a及
びHPA1a1a/3b3bにのみ結合し、HPA1b1b/3a3a及びHPA1b1
b/3b3bに結合しない場合に証明された（データは示され
ていない）。

実施例３（貯蔵寿命） HPA1a1a/3a3a又はHPA1b1b/3b3bで一晩被覆し、洗浄
し、風乾し、密封したマイクロタイタープレートを４℃
で放置した。その後12週まで毎週行った分析は、２つの
抗HPA1a血清の一致したかつ特異的結合を示したが、正
常血清には示さなかった（データは示されていない）。
更に、現在までの結果は、−20℃で11ヵ月まで貯蔵した
プレートは同様に働くことを示し、４℃及び−20℃で貯
蔵した被覆プレートの評価は継続している。

実施例４（ヒト血清中の抗HPA−１の検出）ヒト抗HPA1a血清のスクリーニングに対するELISAの適
合性を、NAITPをもつ乳児の母親の血清を用いて評価し
た。抗HPA1a抗体に陽性の31の血清、抗HPA1aに陰性及び
弱い陽性の各々２及び８血清及び抗体状態が未知の４血
清（すべてPSIFT及びMAIPAで求めた）はCLB、アムステ
ルダムにより供給され、ELISAで盲検試験した。引き続
いて解析により次の結果が示された：陽性血清の一致29
/31;弱い陽性血清の一致6/8、他の２つはELISAに陰性で
あった;2つの陰性血清はELISAに陽性であった；及び４
つの未知血清のうち２つは弱い陽性であり２つは被覆さ
れないウェルと反応した（被覆プレートをELISAのCLBに
送ると同様の相関が認められた）。引き続いて結果は、
ELISAと処理赤血球細胞を用いる凝集反応分析であるCap
ture−Ｐ分析（Immucor社、米国）との間に完全な相関
を示した。

更に、ELISAの利点を図３に示す。冠動脈バイパスを
行った後、血小板を輸注した60歳の女性患者が１週間後
重篤な血小板減少症に罹った。彼女はヘパリンを受けて
いたので、血小板減少症の原因を決定することは重要で
あった。我々は、ELISAを用いて強力抗HPA1a抗体を含む
彼女の血清試料を受け取った3.5時間以内に決定するこ
とができた。

我々の結果は、新たに開発されたELISAが簡便で、安
価で、迅速で、特異的でかつ感受性のある分析であるこ
とを示すものである。非特異的な高反応性が被覆されな
いウェルで生じる例外的場合には、高度希釈液が用いら
れるか又は別の分析を用いて確認が探索される。しかし
ながら、被覆プレートの安定性、他のHPA4抗体用ELISA
を開発する可能性及び自動化の従順性は、ELISAをNAITP
の大規模な集団の実験を含む抗血小板抗体のスクリーニ
ングに広く用いられることを可能にしなければならな
い。更に、PSIFT/MAIPAとELISAとの間の相関が高いこと
を見ると、ELISAが診断試験として開発することができ
ることが示される。最後に、ELISAは、その感受性及び
接触性が高いために他の分析で見落とした抗体を検出す
ることが可能である。

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Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト血小板糖タンパク質抗原1a及び／又は
3a（HPA1a及び／又HPA3a）に対する抗体の免疫学的検出
用の酵素結合免疫分析を実施するための免疫分析系であ
って、抗HPA1a抗体を検出するためにHPA1a1a/3b3b抗原で被覆
したウェル；及び抗HPA3a抗体を検出するためにHPA1b1b
/3a3a抗原で被覆したウェル；非特異的阻止物質；酵素標識で標識された抗ヒト免疫グロブリン；及び前記酵素標識と比色反応を生じることができる基質を含む免疫分析系。
【請求項２】該糖タンパク質抗原が配列Arg−Gly−Asp
（RGD）を含むペプチドを結合した親和性基質によるバ
ッチアフィニティークロマトグラフィーによって精製さ
れたものである、請求項１記載の免疫分析系。
【請求項３】該ペプチドが配列Gly−Arg−Gly−Asp−Se
r−Pro−Lys（GRGDSPK）を有する請求項２記載の免疫分
析系。
【請求項４】該糖タンパク質抗原が、実質的にRGD配列
を含むペプチドを含まない請求項２又は３記載の免疫分
析系。
【請求項５】該糖タンパク質抗原が、実質的にMg²⁺及び
／又はMn²⁺イオンを含まない請求項１〜４のいずれか１
項に記載の免疫分析系。
【請求項６】基質が多ウェルマイクロタイタープレート
である請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫分析
系。
【請求項７】ヒト血小板糖タンパク質抗原１及び／又は
３（HPA1及び／又HPA3）に対する抗体の免疫学的検出用
の免疫分析系であって、遺伝子型HPA1a1a又はHPA1b1bの
精製された遺伝子型糖タンパク質抗原GP III a、及び／
又は、遺伝子型HPA3a3a又はHPA3b3bの精製された遺伝子
型糖タンパク質抗原GP II bを被覆した固体基質を含
み、該糖タンパク質が実質的に配列RGDを含むペプチド
と、Mg²⁺及び／又はMn²⁺イオンを含まない免疫分析系。
【請求項８】該基質が遺伝子型HPA1a1a/3a3a、HPA1a1a/
3b3b、HPA1b1b/3a3a及び／又はHPA1b1b/3b3bの精製され
た遺伝子型糖タンパク質抗原GP II b/III aで被覆され
ている請求項７の免疫分析系。
【請求項９】ヒト血小板糖タンパク質抗原1a及び／又は
3a（HPA1a及び／又HPA3a）に対する抗体の免疫学的検出
用の免疫分析系であって、遺伝子型HPA1a1a/3a3a、HPA1
a1a/3b3b及び／又はHPA1b1b/3a3aの精製された遺伝子型
糖タンパク質抗原GP II b/III aで被覆されている固体
基質を含み、該糖タンパク質が実質的に配列RGDを含む
ペプチドと、Mg²⁺及び／又はMn²⁺イオンを含まない免疫
分析系。