JPH10239313A - ヘパリン親和性物質の測定方法 - Google Patents
ヘパリン親和性物質の測定方法Info
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- JPH10239313A JPH10239313A JP4334397A JP4334397A JPH10239313A JP H10239313 A JPH10239313 A JP H10239313A JP 4334397 A JP4334397 A JP 4334397A JP 4334397 A JP4334397 A JP 4334397A JP H10239313 A JPH10239313 A JP H10239313A
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- Japan
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- heparin
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ヘパリン親和性物質に、ヘパリンを担持
させた不溶性担体粒子と該物質に対する抗体を反応さ
せ、生成する免疫凝集体を直接光学的に測定することを
特徴とするヘパリン親和性物質の測定方法。 【効果】 簡便かつ迅速に検体中のヘパリン親和性物質
を測定することができる。
させた不溶性担体粒子と該物質に対する抗体を反応さ
せ、生成する免疫凝集体を直接光学的に測定することを
特徴とするヘパリン親和性物質の測定方法。 【効果】 簡便かつ迅速に検体中のヘパリン親和性物質
を測定することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ホモジニアスな系
で簡便かつ迅速に検体中のヘパリン親和性物質を検出又
は定量することができる測定法に関する。
で簡便かつ迅速に検体中のヘパリン親和性物質を検出又
は定量することができる測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヘパリンは、動物のマスト細胞で合成さ
れる平均分子量５，０００〜３０，０００のムコ多糖の
１種で、エステル硫酸基など多くの負電荷をもつ高分子
電解質である。ヘパリンは血液凝固阻止作用を有するこ
とから、腸粘膜などから蛋白を含まない製品が工業的に
生産され、医薬品として用いられている。また、ヘパリ
ンが種々の蛋白質と結合することから、ヘパリンを担持
させたアガロースなどのゲルを用い、血液凝固因子をは
じめとした数多くの蛋白質の精製が行われている。この
ようにヘパリンは、医療、生化学、疫学等の分野におい
て重要な物質の一つとなっている。
れる平均分子量５，０００〜３０，０００のムコ多糖の
１種で、エステル硫酸基など多くの負電荷をもつ高分子
電解質である。ヘパリンは血液凝固阻止作用を有するこ
とから、腸粘膜などから蛋白を含まない製品が工業的に
生産され、医薬品として用いられている。また、ヘパリ
ンが種々の蛋白質と結合することから、ヘパリンを担持
させたアガロースなどのゲルを用い、血液凝固因子をは
じめとした数多くの蛋白質の精製が行われている。この
ようにヘパリンは、医療、生化学、疫学等の分野におい
て重要な物質の一つとなっている。
【０００３】このヘパリンに結合する生体内物質の多く
は、各種疾患により生体内濃度が変動することが知られ
ている。従って、これらヘパリン親和性物質を測定する
ことは、各種疾患を診断する指標を得ることとなり、重
要である。
は、各種疾患により生体内濃度が変動することが知られ
ている。従って、これらヘパリン親和性物質を測定する
ことは、各種疾患を診断する指標を得ることとなり、重
要である。
【０００４】
【発明が解決しようすとる課題】ヘパリン親和性物質の
測定法としては、ＥＩＡ法や抗原抗体反応に基づく凝集
反応を利用した方法（以下「凝集法」という）が一般に
用いられている。
測定法としては、ＥＩＡ法や抗原抗体反応に基づく凝集
反応を利用した方法（以下「凝集法」という）が一般に
用いられている。
【０００５】しかし、ＥＩＡ法は、抗原抗体反応によっ
て形成された複合物をその他の成分と分離（以下「Ｂ／
Ｆ分離」という）した後、標識物の量を標識物に由来し
た信号として間接的に測定するものであり、分離等の操
作が煩雑であるという問題点を有している。
て形成された複合物をその他の成分と分離（以下「Ｂ／
Ｆ分離」という）した後、標識物の量を標識物に由来し
た信号として間接的に測定するものであり、分離等の操
作が煩雑であるという問題点を有している。
【０００６】また、この他のヘパリン親和性物質の測定
方法として、測定対象物質（抗原）に対する抗体又はヘ
パリンのいずれか一方を大粒径の不溶性担体等に担持さ
せ、他方に検出可能なマーカーを結合した検出系による
測定方法が開示されている（特開平４−２６２２５７号
公報）。この方法は、ヘパリン親和性物質と抗体とヘパ
リンを反応させることにより、ヘパリン親和性物質を介
して不溶性担体上に検出可能なマーカーを付けたヘパリ
ン又は抗体を結合させ、マーカー由来の信号を測定する
ことにより、ヘパリン親和性物質を検出する方法であ
る。しかしながら、この方法も、反応後にＢ／Ｆ分離を
行い、不溶性担体に結合したマーカー又は結合しなかっ
たマーカーのいずれかを適当な方法で測定する必要があ
り、ＥＩＡ法と同様に操作が煩雑である。なお、このよ
うなＢ／Ｆ分離は、検出可能なマーカーが結合した不溶
性担体を遠心により選択的に沈殿させたり、系全体を洗
浄したり、あるいは洗浄時に磁力を利用する方法等が一
般に用いられるが、このためにはヘパリン又は抗体を担
持する不溶性担体は、アガロースゲルやポリスチレンビ
ーズ等のサンドイッチＥＩＡ法で通常用いられる大粒径
を有した担体や磁化された特殊な担体を用いなければな
らない。
方法として、測定対象物質（抗原）に対する抗体又はヘ
パリンのいずれか一方を大粒径の不溶性担体等に担持さ
せ、他方に検出可能なマーカーを結合した検出系による
測定方法が開示されている（特開平４−２６２２５７号
公報）。この方法は、ヘパリン親和性物質と抗体とヘパ
リンを反応させることにより、ヘパリン親和性物質を介
して不溶性担体上に検出可能なマーカーを付けたヘパリ
ン又は抗体を結合させ、マーカー由来の信号を測定する
ことにより、ヘパリン親和性物質を検出する方法であ
る。しかしながら、この方法も、反応後にＢ／Ｆ分離を
行い、不溶性担体に結合したマーカー又は結合しなかっ
たマーカーのいずれかを適当な方法で測定する必要があ
り、ＥＩＡ法と同様に操作が煩雑である。なお、このよ
うなＢ／Ｆ分離は、検出可能なマーカーが結合した不溶
性担体を遠心により選択的に沈殿させたり、系全体を洗
浄したり、あるいは洗浄時に磁力を利用する方法等が一
般に用いられるが、このためにはヘパリン又は抗体を担
持する不溶性担体は、アガロースゲルやポリスチレンビ
ーズ等のサンドイッチＥＩＡ法で通常用いられる大粒径
を有した担体や磁化された特殊な担体を用いなければな
らない。
【０００７】一方、凝集法は、免疫凝集体の形成過程に
おいて、不溶性担体を用いる方法と用いない方法の２つ
の方法に大別されるが、いずれの方法もＢ／Ｆ分離を必
要とせず抗原抗体反応によって形成される免疫凝集体の
量を光学的な変化として直接測定することが可能である
ため、簡便であり、自動分析装置への適用をはじめとし
た測定の自動化の面で有用性が高い方法である。
おいて、不溶性担体を用いる方法と用いない方法の２つ
の方法に大別されるが、いずれの方法もＢ／Ｆ分離を必
要とせず抗原抗体反応によって形成される免疫凝集体の
量を光学的な変化として直接測定することが可能である
ため、簡便であり、自動分析装置への適用をはじめとし
た測定の自動化の面で有用性が高い方法である。
【０００８】しかし、ヘパリン親和性物質を測定する凝
集法において、抗体としてポリクローナル抗体を使用し
た場合は、ポリクローナル抗体が測定対象物質（抗原）
と異なる物質を認識することがあり、検体中の極わずか
な夾雑成分や、測定対象物質と構造が類似する他の成分
と交差反応を起こす等の問題があった。このような問題
点を解決する方法としては、抗原の特定のアミノ酸配列
部分に対応した数個から数十個のペプチドを抗原として
動物に免疫し、得られたポリクローナル抗体を用いる方
法が挙げられる。しかし、このようにして得られた抗体
は、抗原中の抗原抗体反応に関与する部分（以下「認識
部位」という）が狭い領域に限定されているため、抗体
どうしの立体障害が生じやすい等の理由により、免疫凝
集体を形成しにくいという問題がある。
集法において、抗体としてポリクローナル抗体を使用し
た場合は、ポリクローナル抗体が測定対象物質（抗原）
と異なる物質を認識することがあり、検体中の極わずか
な夾雑成分や、測定対象物質と構造が類似する他の成分
と交差反応を起こす等の問題があった。このような問題
点を解決する方法としては、抗原の特定のアミノ酸配列
部分に対応した数個から数十個のペプチドを抗原として
動物に免疫し、得られたポリクローナル抗体を用いる方
法が挙げられる。しかし、このようにして得られた抗体
は、抗原中の抗原抗体反応に関与する部分（以下「認識
部位」という）が狭い領域に限定されているため、抗体
どうしの立体障害が生じやすい等の理由により、免疫凝
集体を形成しにくいという問題がある。
【０００９】また、不溶性担体粒子に固定化する抗体と
して１種類又は２種類のモノクローナル抗体を用いる凝
集法もあるが、１種類のモノクローナル抗体を用いる方
法は、認識部位が複数存在する特殊な抗原にしか利用で
きず、用途が極めて限定される。一方、２種類のモノク
ローナル抗体を用いる方法は、認識部位の数を抗体の数
に相当する数にまで増やすことで免疫凝集体を形成させ
るものであるが、同じ抗原に対するモノクローナル抗体
ならばどの２種の組み合わせでも使用できるわけではな
く、目的に応じて反応性が高く、しかも認識部位の異な
る特殊な２つの抗体の組み合わせを選択しなければなら
ないという問題がある。
して１種類又は２種類のモノクローナル抗体を用いる凝
集法もあるが、１種類のモノクローナル抗体を用いる方
法は、認識部位が複数存在する特殊な抗原にしか利用で
きず、用途が極めて限定される。一方、２種類のモノク
ローナル抗体を用いる方法は、認識部位の数を抗体の数
に相当する数にまで増やすことで免疫凝集体を形成させ
るものであるが、同じ抗原に対するモノクローナル抗体
ならばどの２種の組み合わせでも使用できるわけではな
く、目的に応じて反応性が高く、しかも認識部位の異な
る特殊な２つの抗体の組み合わせを選択しなければなら
ないという問題がある。
【００１０】従って、本発明の目的は、Ｂ／Ｆ分離を必
要としないホモジニアスな系で簡便かつ迅速に検体中の
ヘパリン親和性物質を検出又は定量することができる方
法を提供することにある。
要としないホモジニアスな系で簡便かつ迅速に検体中の
ヘパリン親和性物質を検出又は定量することができる方
法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】斯かる実情に鑑み、本発
明者は、ヘパリン親和性物質を含む検体に、ヘパリンを
担持させたラテックス粒子等の不溶性担体粒子とヘパリ
ン親和性物質に対する抗体を反応させれば、懸濁状態を
保ちつつ凝集体が生成し、これを直接光学的に測定すれ
ば、感度が高く、しかも簡便かつ迅速にヘパリン親和性
物質を定量できることを見出し本発明を完成した。
明者は、ヘパリン親和性物質を含む検体に、ヘパリンを
担持させたラテックス粒子等の不溶性担体粒子とヘパリ
ン親和性物質に対する抗体を反応させれば、懸濁状態を
保ちつつ凝集体が生成し、これを直接光学的に測定すれ
ば、感度が高く、しかも簡便かつ迅速にヘパリン親和性
物質を定量できることを見出し本発明を完成した。
【００１２】すなわち、本発明は、ヘパリン親和性物質
に、ヘパリンを担持させた不溶性担体粒子と該ヘパリン
親和性物質に対する抗体を反応させ、生成する免疫凝集
体を直接光学的に測定することを特徴とするヘパリン親
和性物質の測定方法を提供するものである。
に、ヘパリンを担持させた不溶性担体粒子と該ヘパリン
親和性物質に対する抗体を反応させ、生成する免疫凝集
体を直接光学的に測定することを特徴とするヘパリン親
和性物質の測定方法を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明は、検体中の測定対象抗原
たるヘパリン親和性物質に、ヘパリンを担持させた不溶
性担体粒子（以下「固定化ヘパリン」という）とヘパリ
ン親和性物質に対する抗体（抗体は１種でも２種以上で
もよい）を反応させ、生成する免疫凝集体の吸光度等を
直接光学的に測定することにより、該ヘパリン親和性物
質の検出又は定量を行うものである。
たるヘパリン親和性物質に、ヘパリンを担持させた不溶
性担体粒子（以下「固定化ヘパリン」という）とヘパリ
ン親和性物質に対する抗体（抗体は１種でも２種以上で
もよい）を反応させ、生成する免疫凝集体の吸光度等を
直接光学的に測定することにより、該ヘパリン親和性物
質の検出又は定量を行うものである。
【００１４】本発明において用いられる不溶性担体粒子
としては、平均粒径が１．６μｍ以下のものが好まし
く、特に平均粒径が０．０５〜１μｍ、更に０．０５〜
０．５μｍのものが免疫凝集体を直接光学的に測定する
上で好ましい。
としては、平均粒径が１．６μｍ以下のものが好まし
く、特に平均粒径が０．０５〜１μｍ、更に０．０５〜
０．５μｍのものが免疫凝集体を直接光学的に測定する
上で好ましい。
【００１５】不溶性担体粒子の材質は特に限定されず、
従来、ホモジニアス系で不溶性担体を用いて抗原又は抗
体を測定する場合に使用される公知の物質であればいず
れも使用することができる。このような物質としては、
有機高分子物質、無機物質、細胞膜、血球、微生物等が
挙げられる。このうち、有機高分子物質としてはラテッ
クス粒子が好ましく、特に、アクリル酸重合体、スチレ
ン重合体、メタクリル酸重合体等の樹脂から選ばれた１
種又は２種以上の微粉末を均一に懸濁させたラテックス
粒子が好ましい。また、無機物質としては、シリカ、ア
ルミナ等の微粒子が挙げられる。
従来、ホモジニアス系で不溶性担体を用いて抗原又は抗
体を測定する場合に使用される公知の物質であればいず
れも使用することができる。このような物質としては、
有機高分子物質、無機物質、細胞膜、血球、微生物等が
挙げられる。このうち、有機高分子物質としてはラテッ
クス粒子が好ましく、特に、アクリル酸重合体、スチレ
ン重合体、メタクリル酸重合体等の樹脂から選ばれた１
種又は２種以上の微粉末を均一に懸濁させたラテックス
粒子が好ましい。また、無機物質としては、シリカ、ア
ルミナ等の微粒子が挙げられる。
【００１６】不溶性担体粒子にヘパリンを担持させる方
法は特に限定されず、公知の物理吸着や化学結合法によ
る方法等を用いることができる。ヘパリンが吸着しにく
い材料（例えばポリスチレン）を用いる場合には、その
担体とよく吸着する他の蛋白質（例えばフィブロネクチ
ン）を最初に吸着させ、続いてヘパリンをその蛋白質に
結合させればよい（特開平２−１８４３３９号公報）。
法は特に限定されず、公知の物理吸着や化学結合法によ
る方法等を用いることができる。ヘパリンが吸着しにく
い材料（例えばポリスチレン）を用いる場合には、その
担体とよく吸着する他の蛋白質（例えばフィブロネクチ
ン）を最初に吸着させ、続いてヘパリンをその蛋白質に
結合させればよい（特開平２−１８４３３９号公報）。
【００１７】本発明で使用する抗体は、抗原たるヘパリ
ン親和性物質に高い特異性を有していれば、モノクロー
ナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよ
い。また抗体は、遊離抗体であっても、不溶性担体粒子
に担持させた抗体（以下「固定化抗体」という）であっ
てもよいが、固定化抗体が測定感度の点で好ましい。不
溶性担体粒子に抗体を固定する場合、その方法は特に限
定されず、物理吸着、化学結合、免疫的結合を利用する
方法のほか、あらかじめ抗体に対して結合性を有する物
質を単体に担持させ、この物質を介して抗体を結合させ
る方法等を用いることができる。また、本発明では、１
種類の抗体があればよいが、より高感度な測定を行うた
めに２種以上の抗体を用いてもよい。
ン親和性物質に高い特異性を有していれば、モノクロー
ナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよ
い。また抗体は、遊離抗体であっても、不溶性担体粒子
に担持させた抗体（以下「固定化抗体」という）であっ
てもよいが、固定化抗体が測定感度の点で好ましい。不
溶性担体粒子に抗体を固定する場合、その方法は特に限
定されず、物理吸着、化学結合、免疫的結合を利用する
方法のほか、あらかじめ抗体に対して結合性を有する物
質を単体に担持させ、この物質を介して抗体を結合させ
る方法等を用いることができる。また、本発明では、１
種類の抗体があればよいが、より高感度な測定を行うた
めに２種以上の抗体を用いてもよい。
【００１８】固定化ヘパリン又は固定化抗体を懸濁する
液は、特に限定されないが一般的にはリン酸緩衝液、グ
リシン緩衝液、トリス緩衝液、グッドの緩衝液等の緩衝
液が使用される。反応におけるpHは５〜１０、特に６〜
９が好ましい。
液は、特に限定されないが一般的にはリン酸緩衝液、グ
リシン緩衝液、トリス緩衝液、グッドの緩衝液等の緩衝
液が使用される。反応におけるpHは５〜１０、特に６〜
９が好ましい。
【００１９】固定化ヘパリンと検体との反応、及び抗体
と検体との反応は同時に行ってもよいし、またいずれか
を先に行ってもよい。
と検体との反応は同時に行ってもよいし、またいずれか
を先に行ってもよい。
【００２０】本発明における測定対象物質としてはヘパ
リンと親和性のある物質であれば特に限定されず、例え
ばアンチトロンビンIII（以下「ＡＴIII」という）、血
液凝固第IX、Ｘ、XI、XII、XIIIa因子、プロトロンビ
ン、トロンビン、トロンビン・アンチトロンビンIII複
合体（以下「ＴＡＴ」という）、補体因子、リポ蛋白
質、及びリパーゼ類、インターフェロン、エストロゲン
等が挙げられる。
リンと親和性のある物質であれば特に限定されず、例え
ばアンチトロンビンIII（以下「ＡＴIII」という）、血
液凝固第IX、Ｘ、XI、XII、XIIIa因子、プロトロンビ
ン、トロンビン、トロンビン・アンチトロンビンIII複
合体（以下「ＴＡＴ」という）、補体因子、リポ蛋白
質、及びリパーゼ類、インターフェロン、エストロゲン
等が挙げられる。
【００２１】本発明では小粒径の不溶性担体粒子が使用
されているので本発明方法により得られた免疫凝集体は
懸濁状態が保たれており、従ってこれを直接光学的に測
定することができる。光学的な吸光度の測定は、汎用の
分光光度計、分光光度測定を測定原理とした生化学用自
動分析装置（日立製作所社製、日立７１５０、７０７
０、７１７０等、東芝社製、東芝ＴＢＡ−８ＯＲ等）、
近赤外を測定波長とした装置（三菱化成社製、ＬＰＩＡ
等）、積分球濁度を測定原理とした装置（協和発酵社
製、ＥＬシステム等）、散乱光強度を測定する装置（ベ
ーリンガー社製、ＢＮＡシステム等）等の光学的測定機
器を用いて行うことができる。
されているので本発明方法により得られた免疫凝集体は
懸濁状態が保たれており、従ってこれを直接光学的に測
定することができる。光学的な吸光度の測定は、汎用の
分光光度計、分光光度測定を測定原理とした生化学用自
動分析装置（日立製作所社製、日立７１５０、７０７
０、７１７０等、東芝社製、東芝ＴＢＡ−８ＯＲ等）、
近赤外を測定波長とした装置（三菱化成社製、ＬＰＩＡ
等）、積分球濁度を測定原理とした装置（協和発酵社
製、ＥＬシステム等）、散乱光強度を測定する装置（ベ
ーリンガー社製、ＢＮＡシステム等）等の光学的測定機
器を用いて行うことができる。
【００２２】
【実施例】以下、製造例、実施例並びに比較例を挙げて
本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定
されるものではない。
本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定
されるものではない。
【００２３】製造例１．固定化ヘパリン液の調製 アミノ化ポリスチレンラテックス（平均粒径０．２μ
ｍ、インターヘイシャル・ダイナミックス社製）を２％
の濃度で０．０５Ｍホウ酸緩衝液（pH８）に懸濁した液
６mlに、ヘパリンナトリウム（第一化学薬品社製）を８
mg／mlの濃度で上記ホウ酸緩衝液に溶解した溶液３mlと
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩（同仁化学研究所製）を２mg／mlの濃
度で上記ホウ酸緩衝液に溶解した溶液３mlを加え、２５
℃で４時間反応させた。次いでグリシンを２％含有した
上記ホウ酸緩衝液４mlを加え、２５℃で一晩インキュベ
ートして反応混合物中に残存する過剰の上記カルボジイ
ミドを消費させた。この後、０．０５Ｍグリシン緩衝液
（pH８）にて遠心洗浄を２回行った後、同じ０．０５Ｍ
グリシン緩衝液１２mlに再分散させ、固定化ヘパリン液
を得た。
ｍ、インターヘイシャル・ダイナミックス社製）を２％
の濃度で０．０５Ｍホウ酸緩衝液（pH８）に懸濁した液
６mlに、ヘパリンナトリウム（第一化学薬品社製）を８
mg／mlの濃度で上記ホウ酸緩衝液に溶解した溶液３mlと
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩（同仁化学研究所製）を２mg／mlの濃
度で上記ホウ酸緩衝液に溶解した溶液３mlを加え、２５
℃で４時間反応させた。次いでグリシンを２％含有した
上記ホウ酸緩衝液４mlを加え、２５℃で一晩インキュベ
ートして反応混合物中に残存する過剰の上記カルボジイ
ミドを消費させた。この後、０．０５Ｍグリシン緩衝液
（pH８）にて遠心洗浄を２回行った後、同じ０．０５Ｍ
グリシン緩衝液１２mlに再分散させ、固定化ヘパリン液
を得た。
【００２４】製造例２．固定化ヘパリン緩衝液の調製 固定化ヘパリン液１容を、０．０５Ｍグリシン緩衝液
（pH８）４容に懸濁することにより固定化ヘパリン懸濁
液を得た。
（pH８）４容に懸濁することにより固定化ヘパリン懸濁
液を得た。
【００２５】製造例３．抗ＴＡＴ固定化抗体液の調製 抗ＴＡＴモノクローナル抗体は、特開平７−２３８０９
９号公報の第７頁右欄の表２（段落番号００３８）に示
す抗体Ｎｏ．２６２１０のものを用いた。この抗ＴＡＴ
モノクローナル抗体を１．４mg／mlの濃度で０．２５Ｍ
グリシン緩衝液（pH８）に混和した液５mlに、平均粒径
０．２μｍのポリスチレンラテックス（積水化学工業社
製）の２％懸濁液５mlを加え、４℃にて５時間攪拌し
た。次に２％牛血清アルブミンを含むグリシン緩衝液
（pH８）を加え、４℃で一晩攪拌した。遠心洗浄により
上清を除去した後、グリシン緩衝液５０mlを加えてよく
混和し、抗ＴＡＴ固定化抗体液を調製した。
９号公報の第７頁右欄の表２（段落番号００３８）に示
す抗体Ｎｏ．２６２１０のものを用いた。この抗ＴＡＴ
モノクローナル抗体を１．４mg／mlの濃度で０．２５Ｍ
グリシン緩衝液（pH８）に混和した液５mlに、平均粒径
０．２μｍのポリスチレンラテックス（積水化学工業社
製）の２％懸濁液５mlを加え、４℃にて５時間攪拌し
た。次に２％牛血清アルブミンを含むグリシン緩衝液
（pH８）を加え、４℃で一晩攪拌した。遠心洗浄により
上清を除去した後、グリシン緩衝液５０mlを加えてよく
混和し、抗ＴＡＴ固定化抗体液を調製した。
【００２６】製造例４．抗ＡＴIII固定化抗体液の調製 （抗ＡＴIIIモノクローナル抗体の製造） ＡＴIIIは市販のＡＴIII製剤（ヘキストジャパン社製）
を用いた。（１）免疫 上記ＡＴIIIの１００μｇを１回の免疫に使用した。初
回免疫はフロインドの完全アジュバントを用い、追加免
疫ではフロインドの不完全アジュバントを使用した。Ａ
ＴIII１００μｌとフロインドのアジュバント１００μ
ｌを混合し、得られたエマルジョン２００μｌを１回の
免疫につき１匹のＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスの腹腔に注射
を行い、４回免疫を２週間間隔で繰り返した。マウスの
眼底静脈から採血し、抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定し
て、抗体価の高いマウスを選んで細胞融合に使用した。
を用いた。（１）免疫 上記ＡＴIIIの１００μｇを１回の免疫に使用した。初
回免疫はフロインドの完全アジュバントを用い、追加免
疫ではフロインドの不完全アジュバントを使用した。Ａ
ＴIII１００μｌとフロインドのアジュバント１００μ
ｌを混合し、得られたエマルジョン２００μｌを１回の
免疫につき１匹のＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスの腹腔に注射
を行い、４回免疫を２週間間隔で繰り返した。マウスの
眼底静脈から採血し、抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定し
て、抗体価の高いマウスを選んで細胞融合に使用した。
【００２７】（２）細胞融合 ４回目の免疫から２週間後に生理食塩水の２００μｌに
希釈したＡＴIII１００μｇをマウス腹腔に注射し、そ
の３日後にマウスから脾臓を摘出した。摘出した脾臓を
ＲＰＭＩ １６４０培地中でピンセット及びスライドグ
ラスの磨りの部分でよくほぐし、脾細胞を回収した。こ
れを１５００rpm で５分間遠心して脾細胞を集め、更に
同培地で洗浄、遠心した。最終的に１５％牛胎児血清
（ＦＣＳ）を含む同培地２mlを加え、脾細胞懸濁液を調
製した。生きた脾細胞数は、アクリジンオレンジ／臭化
エチジュウム溶液（各０．１mgをＰＢＳ１mlに溶解）と
懸濁液を１：１で混ぜ蛍光顕微鏡下で数えた。生きた脾
細胞１０8 個と予め培養しておいた対数増殖期のマウス
骨髄種細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４の
１０7 個を混合した後に１５００rpm で５分遠心した。
上清を除去後、細胞をよく解きほぐした後、ＧＫＮ溶液
（ＮａＣｌ：８ｇ，ＫＣｌ：０．４ｇ，グルコース：２
ｇ，Ｎａ2ＨＰＯ4：１．４１ｇ，ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2
Ｏ：０．７８ｇを精製水１Ｌに溶解）にて懸濁し、１５
００rpm で５分間遠心を行い、細胞の洗浄を行った。同
洗浄を繰り返した後、５０％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレン
グリコール１５４０を含むＧＫＮ溶液０．５mlを徐々に
加え、静かに１分間攪拌した。これにＫＧＮ溶液１０ml
を徐々に静かに加えて反応を停止させ、１５００rpm で
５分間遠心した。得られた細胞を１５％ＦＣＳを含むＲ
ＰＭＩ １６４０ ３０mlに浮遊し、ＨＡＴ培地（１０
-4Ｍヒポキサンチン、４×１０-7Ｍアミノプテリン、
１．５×１０-5Ｍチミジン及び１５％ＦＣＳ含有ＲＰＭ
Ｉ １６４０培地）及びフィーダー細胞が含まれる（１
ウエル当り２００μｌ）９６穴マイクロカルチャープレ
ート３枚に１ウエル当り０．１mlづつ分注して３７℃５
％炭酸ガス培養器中で培養した。１０日後に全てのウエ
ルで融合細胞の増殖を確認した。
希釈したＡＴIII１００μｇをマウス腹腔に注射し、そ
の３日後にマウスから脾臓を摘出した。摘出した脾臓を
ＲＰＭＩ １６４０培地中でピンセット及びスライドグ
ラスの磨りの部分でよくほぐし、脾細胞を回収した。こ
れを１５００rpm で５分間遠心して脾細胞を集め、更に
同培地で洗浄、遠心した。最終的に１５％牛胎児血清
（ＦＣＳ）を含む同培地２mlを加え、脾細胞懸濁液を調
製した。生きた脾細胞数は、アクリジンオレンジ／臭化
エチジュウム溶液（各０．１mgをＰＢＳ１mlに溶解）と
懸濁液を１：１で混ぜ蛍光顕微鏡下で数えた。生きた脾
細胞１０8 個と予め培養しておいた対数増殖期のマウス
骨髄種細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４の
１０7 個を混合した後に１５００rpm で５分遠心した。
上清を除去後、細胞をよく解きほぐした後、ＧＫＮ溶液
（ＮａＣｌ：８ｇ，ＫＣｌ：０．４ｇ，グルコース：２
ｇ，Ｎａ2ＨＰＯ4：１．４１ｇ，ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2
Ｏ：０．７８ｇを精製水１Ｌに溶解）にて懸濁し、１５
００rpm で５分間遠心を行い、細胞の洗浄を行った。同
洗浄を繰り返した後、５０％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレン
グリコール１５４０を含むＧＫＮ溶液０．５mlを徐々に
加え、静かに１分間攪拌した。これにＫＧＮ溶液１０ml
を徐々に静かに加えて反応を停止させ、１５００rpm で
５分間遠心した。得られた細胞を１５％ＦＣＳを含むＲ
ＰＭＩ １６４０ ３０mlに浮遊し、ＨＡＴ培地（１０
-4Ｍヒポキサンチン、４×１０-7Ｍアミノプテリン、
１．５×１０-5Ｍチミジン及び１５％ＦＣＳ含有ＲＰＭ
Ｉ １６４０培地）及びフィーダー細胞が含まれる（１
ウエル当り２００μｌ）９６穴マイクロカルチャープレ
ート３枚に１ウエル当り０．１mlづつ分注して３７℃５
％炭酸ガス培養器中で培養した。１０日後に全てのウエ
ルで融合細胞の増殖を確認した。
【００２８】（３）抗ＡＴIII抗体産生細胞の選択とク
ローン化 培養上清中の抗ＡＴIII抗体の存在の有無をＥＬＩＳＡ
法で測定した。すなわち、ＡＴIII（２μｇ／ml）を固
相化した９６穴マイクロプレートを用いてスクリーニン
グを行った。詳細には、ＡＴIIIを０．７２％ＮａＣｌ
を含む１３mMリン酸緩衝液pH７．２（ＰＢＳ）で２μｇ
／mlに希釈し５０μｌ／ウエルの割合で９６穴マイクロ
プレートに分注し、４℃で一夜放置した。これを１％牛
血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓ pH７．２（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で３回洗浄した。プレ
ートの各ウエルに培養上清５０μｌを加え３７℃で１時
間保温した。次いでＰＢＳで３回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウ
スＩｇＧ抗体（Ｆｃ部位に特異的，ヤギ由来：第一化学
薬品（株）販売）を５０μｌ加えて３７℃で１時間保温
した。これをＰＢＳで５回洗浄後、０．２％オルトフェ
ニレンジアミン、０．０２％過酸化水素水を含むクエン
酸−リン酸緩衝液pH５．０を５０μｌ／ウエル加えて室
温で３０分反応後、４．５Ｍ硫酸を５０μｌ／ウエル加
えて反応を停止させた。５００nmの波長で測定し、吸光
度の高いウエルを選択した。単クローン化は限界希釈法
で行った。すなわちフィーダー細胞としてＢＡＬＢ／ｃ
マウスの胸腺細胞を１ウエル当り１０6 個／０．２mlず
つ分注した９６穴マイクロカルチャープレートに特異抗
体陽性ウエル中のハイブリドーマを１０個／mlとなるよ
うに希釈したものを０．１mlづつ分注した。培地は初回
はＨＴ培地を、２回目以降は１５％ＦＣＳを含むＲＰＭ
Ｉ １６４０を用い、３７℃５％炭酸ガス培養器中で１
０日間培養した。ＥＬＩＳＡ法による特異抗体陽性ウエ
ルの選択及び限界希釈法による単クローン化操作を各３
回繰り返して抗ＡＴIIIモノクローナル抗体産生細胞を
得た。
ローン化 培養上清中の抗ＡＴIII抗体の存在の有無をＥＬＩＳＡ
法で測定した。すなわち、ＡＴIII（２μｇ／ml）を固
相化した９６穴マイクロプレートを用いてスクリーニン
グを行った。詳細には、ＡＴIIIを０．７２％ＮａＣｌ
を含む１３mMリン酸緩衝液pH７．２（ＰＢＳ）で２μｇ
／mlに希釈し５０μｌ／ウエルの割合で９６穴マイクロ
プレートに分注し、４℃で一夜放置した。これを１％牛
血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓ pH７．２（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で３回洗浄した。プレ
ートの各ウエルに培養上清５０μｌを加え３７℃で１時
間保温した。次いでＰＢＳで３回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウ
スＩｇＧ抗体（Ｆｃ部位に特異的，ヤギ由来：第一化学
薬品（株）販売）を５０μｌ加えて３７℃で１時間保温
した。これをＰＢＳで５回洗浄後、０．２％オルトフェ
ニレンジアミン、０．０２％過酸化水素水を含むクエン
酸−リン酸緩衝液pH５．０を５０μｌ／ウエル加えて室
温で３０分反応後、４．５Ｍ硫酸を５０μｌ／ウエル加
えて反応を停止させた。５００nmの波長で測定し、吸光
度の高いウエルを選択した。単クローン化は限界希釈法
で行った。すなわちフィーダー細胞としてＢＡＬＢ／ｃ
マウスの胸腺細胞を１ウエル当り１０6 個／０．２mlず
つ分注した９６穴マイクロカルチャープレートに特異抗
体陽性ウエル中のハイブリドーマを１０個／mlとなるよ
うに希釈したものを０．１mlづつ分注した。培地は初回
はＨＴ培地を、２回目以降は１５％ＦＣＳを含むＲＰＭ
Ｉ １６４０を用い、３７℃５％炭酸ガス培養器中で１
０日間培養した。ＥＬＩＳＡ法による特異抗体陽性ウエ
ルの選択及び限界希釈法による単クローン化操作を各３
回繰り返して抗ＡＴIIIモノクローナル抗体産生細胞を
得た。
【００２９】（４）モノクローナル抗体の分離及び精製 前項の方法によって得たＡＴIIIモノクローナル抗体産
生細胞をマウス腹腔内で培養してモノクローナル抗体を
作らせた。前処理として８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの
腹腔内に０．５mlのプリスタン（２，６，１０，１４−
テトラメチルペンタデカン）を投与した。８日後０．５
mlのＲＰＭＩ １６４０培地に浮遊した細胞４〜１５×
１０5 個をこのマウスの腹腔内に投与した。投与後９日
目から腹水を繰り返し採取してプールした。集めた腹水
は３，０００rpm で１０分間遠心分離を行い、細胞等の
不溶物を除去した。上清部分に等量の飽和硫酸アンモニ
ウム溶液を攪拌しながら加え、一夜４℃に放置して得ら
れた沈澱を遠心分離によって回収した。沈澱を２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH８．０）に溶解、透析し
た。同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ
カラムに透析内容物を吸着させた後、同緩衝液中のＮａ
Ｃｌ ０−０．３Ｍの濃度勾配で溶出させ精製抗体を得
た。得られたモノクローナル抗体を表１に示す。
生細胞をマウス腹腔内で培養してモノクローナル抗体を
作らせた。前処理として８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの
腹腔内に０．５mlのプリスタン（２，６，１０，１４−
テトラメチルペンタデカン）を投与した。８日後０．５
mlのＲＰＭＩ １６４０培地に浮遊した細胞４〜１５×
１０5 個をこのマウスの腹腔内に投与した。投与後９日
目から腹水を繰り返し採取してプールした。集めた腹水
は３，０００rpm で１０分間遠心分離を行い、細胞等の
不溶物を除去した。上清部分に等量の飽和硫酸アンモニ
ウム溶液を攪拌しながら加え、一夜４℃に放置して得ら
れた沈澱を遠心分離によって回収した。沈澱を２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH８．０）に溶解、透析し
た。同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ
カラムに透析内容物を吸着させた後、同緩衝液中のＮａ
Ｃｌ ０−０．３Ｍの濃度勾配で溶出させ精製抗体を得
た。得られたモノクローナル抗体を表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】（抗ＡＴIII固定化抗体液の製造）上記抗
ＡＴIIIモノクローナル抗体のうちＮｏ．１３２０８を
選択し、これを１．４mg／mlの濃度で０．２５Ｍグリシ
ン緩衝液（pH８）に混和した液５mlに、平均粒径０．２
μｍのポリスチレンラテックス（積水化学工業社製）の
２％懸濁液５mlを加え、４℃にて５時間攪拌した。次に
２％牛血清アルブミンを含むグリシン緩衝液（pH８）を
加え、４℃で一晩攪拌した。遠心洗浄により上清を除去
した後、グリシン緩衝液５０mlを加えてよく混和し、抗
ＡＴIII固定化抗体液を調製した。
ＡＴIIIモノクローナル抗体のうちＮｏ．１３２０８を
選択し、これを１．４mg／mlの濃度で０．２５Ｍグリシ
ン緩衝液（pH８）に混和した液５mlに、平均粒径０．２
μｍのポリスチレンラテックス（積水化学工業社製）の
２％懸濁液５mlを加え、４℃にて５時間攪拌した。次に
２％牛血清アルブミンを含むグリシン緩衝液（pH８）を
加え、４℃で一晩攪拌した。遠心洗浄により上清を除去
した後、グリシン緩衝液５０mlを加えてよく混和し、抗
ＡＴIII固定化抗体液を調製した。
【００３２】製造例５．抗アポリポ蛋白Ｂ固定化抗体液
の調製 （抗アポリポ蛋白Ｂモノクローナル抗体の製造）（１）アポリポ蛋白Ｂの調製 健常人の血漿に臭化カリウムを加えてその比重を１．０
０６とし、これを遠心管に入れ４℃、１００，０００×
ｇで２４時間遠心した。上層のカイロミクロン、ＶＬＤ
Ｌ画分を取り除いた後、下層部分に臭化カリウムを加え
て比重１．０６３とし、更に４℃、１００，０００×ｇ
で４８時間遠心し、上層のＬＤＬ画分を回収した。この
ＬＤＬ画分を十分量の生理食塩液に対して透析操作を行
い、ＬＤＬ溶液を得た。
の調製 （抗アポリポ蛋白Ｂモノクローナル抗体の製造）（１）アポリポ蛋白Ｂの調製 健常人の血漿に臭化カリウムを加えてその比重を１．０
０６とし、これを遠心管に入れ４℃、１００，０００×
ｇで２４時間遠心した。上層のカイロミクロン、ＶＬＤ
Ｌ画分を取り除いた後、下層部分に臭化カリウムを加え
て比重１．０６３とし、更に４℃、１００，０００×ｇ
で４８時間遠心し、上層のＬＤＬ画分を回収した。この
ＬＤＬ画分を十分量の生理食塩液に対して透析操作を行
い、ＬＤＬ溶液を得た。
【００３３】（２）免疫 アポリポ蛋白Ｂ１００μｇに相当するＬＤＬ溶液を１回
の免疫に使用した。初回免疫はフロインドの完全アジュ
バントを用い、追加免疫ではフロインドの不完全アジュ
バントを使用した。アポリポ蛋白Ｂ１００μｌとフロイ
ンドのアジュバント１００μｌを混合し、得られたエマ
ルジョン２００μｌを１回の免疫につき１匹のＢＡＬＢ
／ｃ雄性マウスの腹腔に注射を行い、４回免疫を２週間
間隔で繰り返した。マウスの眼底静脈から採血し、抗体
価をＥＬＩＳＡ法で測定して、抗体価の高いマウスを選
んで細胞融合に使用した。
の免疫に使用した。初回免疫はフロインドの完全アジュ
バントを用い、追加免疫ではフロインドの不完全アジュ
バントを使用した。アポリポ蛋白Ｂ１００μｌとフロイ
ンドのアジュバント１００μｌを混合し、得られたエマ
ルジョン２００μｌを１回の免疫につき１匹のＢＡＬＢ
／ｃ雄性マウスの腹腔に注射を行い、４回免疫を２週間
間隔で繰り返した。マウスの眼底静脈から採血し、抗体
価をＥＬＩＳＡ法で測定して、抗体価の高いマウスを選
んで細胞融合に使用した。
【００３４】（３）細胞融合 ４回目の免疫から２週間後に生理食塩水の２００μｌに
希釈したアポリポ蛋白Ｂ１００μｇをマウス腹腔に注射
し、その３日後にマウスから脾臓を摘出した。摘出した
脾臓をＲＰＭＩ １６４０培地中でピンセット及びスラ
イドグラスの磨りの部分でよくほぐし、脾細胞を回収し
た。これを１５００rpm で５分間遠心して脾細胞を集
め、更に同培地で洗浄、遠心した。最終的に１５％牛胎
児血清（ＦＣＳ）を含む同培地２mlを加え、脾細胞懸濁
液を調製した。生きた脾細胞数は、アクリジンオレンジ
／臭化エチジュウム溶液（各０．１mgをＰＢＳ １mlに
溶解）と懸濁液を１：１で混ぜ蛍光顕微鏡下で数えた。
生きた脾細胞１０8 個と予め培養しておいた対数増殖期
のマウス骨髄種細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａ
ｇ１４の１０7 個を混合した後に、１５００rpm で５分
遠心した。上清を除去後、細胞をよく解きほぐした後、
ＧＫＮ溶液（ＮａＣｌ：８ｇ，ＫＣｌ：０．４ｇ，グル
コース：２ｇ，Ｎａ2ＨＰＯ4：１．４１ｇ，ＮａＨ2Ｐ
Ｏ4・２Ｈ2Ｏ：０．７８ｇを精製水１Ｌに溶解）にて懸
濁し、１５００rpm で５分間遠心を行い、細胞の洗浄を
行った。同洗浄を繰り返した後、５０％（Ｗ／Ｖ）のポ
リエチレングリコール１５４０を含むＧＫＮ溶液０．５
mlを徐々に加え、静かに１分間攪拌した。これにＧＫＮ
溶液１０mlを徐々に静かに加えて反応を停止させ、１５
００rpm で５分間遠心した。得られた細胞を１５％ＦＣ
Ｓを含むＲＰＭＩ １６４０ ３０mlに浮遊し、ＨＡＴ
培地（１０-4Ｍヒポキサンチン、４×１０-7Ｍアミノプ
テリン、１．５×１０-5Ｍチミジン及び１５％ＦＣＳ含
有ＲＰＭＩ １６４０培地）及びフィーダー細胞が含ま
れる（１ウエル当り２００μｌ）９６穴マイクロカルチ
ャープレート３枚に１ウエル当り０．１mlづつ分注して
３７℃５％炭酸ガス培養器中で培養した。１０日後に全
てのウエルで融合細胞の増殖を確認した。
希釈したアポリポ蛋白Ｂ１００μｇをマウス腹腔に注射
し、その３日後にマウスから脾臓を摘出した。摘出した
脾臓をＲＰＭＩ １６４０培地中でピンセット及びスラ
イドグラスの磨りの部分でよくほぐし、脾細胞を回収し
た。これを１５００rpm で５分間遠心して脾細胞を集
め、更に同培地で洗浄、遠心した。最終的に１５％牛胎
児血清（ＦＣＳ）を含む同培地２mlを加え、脾細胞懸濁
液を調製した。生きた脾細胞数は、アクリジンオレンジ
／臭化エチジュウム溶液（各０．１mgをＰＢＳ １mlに
溶解）と懸濁液を１：１で混ぜ蛍光顕微鏡下で数えた。
生きた脾細胞１０8 個と予め培養しておいた対数増殖期
のマウス骨髄種細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａ
ｇ１４の１０7 個を混合した後に、１５００rpm で５分
遠心した。上清を除去後、細胞をよく解きほぐした後、
ＧＫＮ溶液（ＮａＣｌ：８ｇ，ＫＣｌ：０．４ｇ，グル
コース：２ｇ，Ｎａ2ＨＰＯ4：１．４１ｇ，ＮａＨ2Ｐ
Ｏ4・２Ｈ2Ｏ：０．７８ｇを精製水１Ｌに溶解）にて懸
濁し、１５００rpm で５分間遠心を行い、細胞の洗浄を
行った。同洗浄を繰り返した後、５０％（Ｗ／Ｖ）のポ
リエチレングリコール１５４０を含むＧＫＮ溶液０．５
mlを徐々に加え、静かに１分間攪拌した。これにＧＫＮ
溶液１０mlを徐々に静かに加えて反応を停止させ、１５
００rpm で５分間遠心した。得られた細胞を１５％ＦＣ
Ｓを含むＲＰＭＩ １６４０ ３０mlに浮遊し、ＨＡＴ
培地（１０-4Ｍヒポキサンチン、４×１０-7Ｍアミノプ
テリン、１．５×１０-5Ｍチミジン及び１５％ＦＣＳ含
有ＲＰＭＩ １６４０培地）及びフィーダー細胞が含ま
れる（１ウエル当り２００μｌ）９６穴マイクロカルチ
ャープレート３枚に１ウエル当り０．１mlづつ分注して
３７℃５％炭酸ガス培養器中で培養した。１０日後に全
てのウエルで融合細胞の増殖を確認した。
【００３５】（４）抗アポリポ蛋白Ｂ抗体産生細胞の選
択とクローン化 培養上清中の抗アポリポ蛋白Ｂ抗体の存在の有無をＥＬ
ＩＳＡ法で測定した。すなわち、アポリポ蛋白Ｂ（１μ
ｇ／ml）を固相化した９６穴マイクロプレートを用いて
スクリーニングを行った。詳細には、アポリポ蛋白Ｂを
０．７２％ＮａＣｌを含む１３mMリン酸緩衝液pH７．２
（ＰＢＳ）で１μｇ／mlに希釈し５０μｌ／ウエルの割
合で９６穴マイクロプレートに分注し４℃で一夜放置し
た。これを１％牛血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むＰＢＳ pH７．２（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で３
回洗浄した。プレートの各ウエルに培養上清５０μｌを
加え３７℃で１時間保温した。次いでＰＢＳで３回洗浄
後、ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシ
ダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆｃ部位に特異的，ヤ
ギ由来：第一化学薬品（株）販売）を５０μｌ加えて３
７℃で１時間保温した。これをＰＢＳで５回洗浄後、
０．２％オルトフェニレンジアミン、０．０２％過酸化
水素水を含むクエン酸−リン酸緩衝液pH５．０を５０μ
ｌ／ウエルを加えて室温で３０分反応後、４．５Ｍ硫酸
を５０μｌ／ウエル加えて反応を停止させた。５５０nm
の波長で測定し、吸光度の高いウエルを選択した。単ク
ローン化は限界希釈法で行った。すなわちフィーダー細
胞としてＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞を１ウエル当り
１０6 個／０．２mlづつ分注した９６穴マイクロカルチ
ャープレートに特異抗体陽性ウエル中のハイブリドーマ
を１０個／mlとなるように希釈したものを０．１mlづつ
分注した。培地は初回はＨＴ培地を、２回目以降は１５
％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０を用い、３７℃５％
炭酸ガス培養器中で１０日間培養した。ＥＬＩＳＡ法に
より特異抗体陽性ウエルの選択及び限界希釈法による単
クローン化操作を各３回繰り返して、抗アポリポ蛋白Ｂ
モノクローナル抗体産生細胞を得た。
択とクローン化 培養上清中の抗アポリポ蛋白Ｂ抗体の存在の有無をＥＬ
ＩＳＡ法で測定した。すなわち、アポリポ蛋白Ｂ（１μ
ｇ／ml）を固相化した９６穴マイクロプレートを用いて
スクリーニングを行った。詳細には、アポリポ蛋白Ｂを
０．７２％ＮａＣｌを含む１３mMリン酸緩衝液pH７．２
（ＰＢＳ）で１μｇ／mlに希釈し５０μｌ／ウエルの割
合で９６穴マイクロプレートに分注し４℃で一夜放置し
た。これを１％牛血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むＰＢＳ pH７．２（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で３
回洗浄した。プレートの各ウエルに培養上清５０μｌを
加え３７℃で１時間保温した。次いでＰＢＳで３回洗浄
後、ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシ
ダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆｃ部位に特異的，ヤ
ギ由来：第一化学薬品（株）販売）を５０μｌ加えて３
７℃で１時間保温した。これをＰＢＳで５回洗浄後、
０．２％オルトフェニレンジアミン、０．０２％過酸化
水素水を含むクエン酸−リン酸緩衝液pH５．０を５０μ
ｌ／ウエルを加えて室温で３０分反応後、４．５Ｍ硫酸
を５０μｌ／ウエル加えて反応を停止させた。５５０nm
の波長で測定し、吸光度の高いウエルを選択した。単ク
ローン化は限界希釈法で行った。すなわちフィーダー細
胞としてＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞を１ウエル当り
１０6 個／０．２mlづつ分注した９６穴マイクロカルチ
ャープレートに特異抗体陽性ウエル中のハイブリドーマ
を１０個／mlとなるように希釈したものを０．１mlづつ
分注した。培地は初回はＨＴ培地を、２回目以降は１５
％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０を用い、３７℃５％
炭酸ガス培養器中で１０日間培養した。ＥＬＩＳＡ法に
より特異抗体陽性ウエルの選択及び限界希釈法による単
クローン化操作を各３回繰り返して、抗アポリポ蛋白Ｂ
モノクローナル抗体産生細胞を得た。
【００３６】（５）モノクローナル抗体の分離及び精製 前項の方法によって得た抗アポリポ蛋白Ｂモノクローナ
ル抗体産生細胞マウス腹腔内で培養してモノクローナル
抗体を作らせた。前処理として８週齢のＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの腹腔内に０．５mlのプリスタン（２，６，１０，
１４−テトラメチルペンタデカン）を投与した。８日後
０．５mlのＲＰＭＩ １６４０培地に浮遊した細胞４〜
１５×１０5 個をこのマウスの腹腔内に投与した。投与
後９日目から腹水を繰り返し採取してプールした。集め
た腹水は３０００rpm で１０分間遠心分離を行い、細胞
等の不溶物を除去した。上清部分に等量の飽和硫酸アン
モニウム溶液を攪拌しながら加え、一夜４℃に放置して
得られた沈澱を遠心分離によって回収した。沈澱を２０
mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH８．０）に溶解、透析
した。同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅ
ｌカラムに透析内容物を吸着させた後、同緩衝液中のＮ
ａＣｌ ０−０．３Ｍの濃度勾配で溶出させ精製抗体を
得た。得られたモノクローナル抗体を表２に示す。
ル抗体産生細胞マウス腹腔内で培養してモノクローナル
抗体を作らせた。前処理として８週齢のＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの腹腔内に０．５mlのプリスタン（２，６，１０，
１４−テトラメチルペンタデカン）を投与した。８日後
０．５mlのＲＰＭＩ １６４０培地に浮遊した細胞４〜
１５×１０5 個をこのマウスの腹腔内に投与した。投与
後９日目から腹水を繰り返し採取してプールした。集め
た腹水は３０００rpm で１０分間遠心分離を行い、細胞
等の不溶物を除去した。上清部分に等量の飽和硫酸アン
モニウム溶液を攪拌しながら加え、一夜４℃に放置して
得られた沈澱を遠心分離によって回収した。沈澱を２０
mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH８．０）に溶解、透析
した。同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅ
ｌカラムに透析内容物を吸着させた後、同緩衝液中のＮ
ａＣｌ ０−０．３Ｍの濃度勾配で溶出させ精製抗体を
得た。得られたモノクローナル抗体を表２に示す。
【００３７】
【表２】
【００３８】（抗アポリポ蛋白Ｂ固定化抗体液の製造）
上記抗アポリポ蛋白Ｂモノクローナル抗体のうちＮｏ．
１６２０３を選択し、これを１．４mg／mlの濃度で０．
２５Ｍグリシン緩衝液（pH８）に混和した液５mlに、平
均粒径０．２μｍのポリスチレンラテックス（積水化学
工業社製）の２％懸濁液５mlを加え、４℃にて５時間攪
拌した。次に２％牛血清アルブミンを含むグリシン緩衝
液（pH８）を加え、４℃で一晩攪拌した。遠心洗浄によ
り上清を除去した後、グリシン緩衝液１０mlを加えてよ
く混和し、抗アポリポ蛋白Ｂ固定化抗体液を調製した。
上記抗アポリポ蛋白Ｂモノクローナル抗体のうちＮｏ．
１６２０３を選択し、これを１．４mg／mlの濃度で０．
２５Ｍグリシン緩衝液（pH８）に混和した液５mlに、平
均粒径０．２μｍのポリスチレンラテックス（積水化学
工業社製）の２％懸濁液５mlを加え、４℃にて５時間攪
拌した。次に２％牛血清アルブミンを含むグリシン緩衝
液（pH８）を加え、４℃で一晩攪拌した。遠心洗浄によ
り上清を除去した後、グリシン緩衝液１０mlを加えてよ
く混和し、抗アポリポ蛋白Ｂ固定化抗体液を調製した。
【００３９】製造例６．抗ＴＡＴ抗体液（Ａ）の調製 抗ＴＡＴモノクローナル抗体は、特開平７−２３８０９
９号公報の第７頁右欄の表２に示す抗体Ｎｏ．２６２１
０のものを用いた。この抗ＴＡＴモノクローナル抗体
（Ａ）を０．１４mg／mlの濃度で０．０５Ｍグリシン緩
衝液（pH８）に混和し、抗ＴＡＴ抗体液（Ａ）を調製し
た。
９号公報の第７頁右欄の表２に示す抗体Ｎｏ．２６２１
０のものを用いた。この抗ＴＡＴモノクローナル抗体
（Ａ）を０．１４mg／mlの濃度で０．０５Ｍグリシン緩
衝液（pH８）に混和し、抗ＴＡＴ抗体液（Ａ）を調製し
た。
【００４０】製造例７．抗ＴＡＴ抗体液（Ｂ）の調製 製造例６で使用したモノクローナル抗体とは異なる認識
部位を有する抗ＴＡＴモノクローナル抗体（Ｂ）（特開
平７−２３８０９９号公報の第７頁右欄の表２に示す抗
体Ｎｏ．２６２１３のもの）を０．１４mg／mlの濃度で
０．０５Ｍグリシン緩衝液（pH８）に混和し、抗ＴＡＴ
抗体液（Ｂ）を調製した。
部位を有する抗ＴＡＴモノクローナル抗体（Ｂ）（特開
平７−２３８０９９号公報の第７頁右欄の表２に示す抗
体Ｎｏ．２６２１３のもの）を０．１４mg／mlの濃度で
０．０５Ｍグリシン緩衝液（pH８）に混和し、抗ＴＡＴ
抗体液（Ｂ）を調製した。
【００４１】製造例８．抗ＴＡＴ抗体液（Ａ−Ｂ）の調
製 製造例６及び７で使用した抗ＴＡＴモノクローナル抗体
（Ａ）及び抗ＴＡＴモノクローナル抗体（Ｂ）をそれぞ
れ０．１４mg／mlの濃度で０．０５Ｍグリシン緩衝液
（pH８）に混和し、抗ＴＡＴモノクローナル抗体液（Ａ
−Ｂ）を調製した。
製 製造例６及び７で使用した抗ＴＡＴモノクローナル抗体
（Ａ）及び抗ＴＡＴモノクローナル抗体（Ｂ）をそれぞ
れ０．１４mg／mlの濃度で０．０５Ｍグリシン緩衝液
（pH８）に混和し、抗ＴＡＴモノクローナル抗体液（Ａ
−Ｂ）を調製した。
【００４２】実施例１．固定化ヘパリンと固定化抗体を
用いたＴＡＴの測定 第１試薬として１０％グリセリンを含有した０．０２Ｍ
トリス緩衝液（pH９）を用い、その２００μｌにＴＡＴ
を含有する試料液２０μｌを加えて３７℃で５分間加温
後、第２試薬として固定化ヘパリン懸濁液１容に対して
１容の抗ＴＡＴ固定化抗体液を混和した溶液１００μｌ
を加え攪拌した。その後１〜５分の波長６００nmにおけ
る吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とＴＡＴ濃
度の関係を図１に示した。
用いたＴＡＴの測定 第１試薬として１０％グリセリンを含有した０．０２Ｍ
トリス緩衝液（pH９）を用い、その２００μｌにＴＡＴ
を含有する試料液２０μｌを加えて３７℃で５分間加温
後、第２試薬として固定化ヘパリン懸濁液１容に対して
１容の抗ＴＡＴ固定化抗体液を混和した溶液１００μｌ
を加え攪拌した。その後１〜５分の波長６００nmにおけ
る吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とＴＡＴ濃
度の関係を図１に示した。
【００４３】比較例１． ０．０５Ｍグリシン緩衝液（pH８）１容に対して１容の
抗ＴＡＴ固定化抗体液を混和した溶液を第２試薬とする
以外は、実施例１と同様に操作してＴＡＴの測定を実施
した。得られた吸光度変化量を図１に示した。
抗ＴＡＴ固定化抗体液を混和した溶液を第２試薬とする
以外は、実施例１と同様に操作してＴＡＴの測定を実施
した。得られた吸光度変化量を図１に示した。
【００４４】比較例２． ０．０５Ｍグリシン緩衝液（pH８）１容を固定化ヘパリ
ン懸濁液１容に混和した溶液を第２試薬とする以外は、
実施例１と同様に操作してＴＡＴの測定を実施した。得
られた吸光度変化量を図１に示した。
ン懸濁液１容に混和した溶液を第２試薬とする以外は、
実施例１と同様に操作してＴＡＴの測定を実施した。得
られた吸光度変化量を図１に示した。
【００４５】図１に示したように、実施例１ではＴＡＴ
濃度に依存した吸光度変化を示すのに対して、比較例１
及び２共に吸光度の変化は認められなかった。
濃度に依存した吸光度変化を示すのに対して、比較例１
及び２共に吸光度の変化は認められなかった。
【００４６】実施例２．固定化ヘパリンと固定化抗体を
用いたＡＴIIIの測定 第１試薬として１０％グリセリンを含有した０．０２Ｍ
トリス緩衝液（pH９）を用い、その２００μｌにＡＴII
Iを含有する試料液２０μｌを加えて３７℃で５分間加
温後、第２試薬として固定化ヘパリン懸濁液１容に対し
て１容の抗ＡＴIII固定化抗体液を混和した溶液１００
μｌを加え攪拌した。その後１〜５分の波長６００nmに
おける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とＡＴ
III濃度の関係を図２に示した。
用いたＡＴIIIの測定 第１試薬として１０％グリセリンを含有した０．０２Ｍ
トリス緩衝液（pH９）を用い、その２００μｌにＡＴII
Iを含有する試料液２０μｌを加えて３７℃で５分間加
温後、第２試薬として固定化ヘパリン懸濁液１容に対し
て１容の抗ＡＴIII固定化抗体液を混和した溶液１００
μｌを加え攪拌した。その後１〜５分の波長６００nmに
おける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とＡＴ
III濃度の関係を図２に示した。
【００４７】比較例３． ０．０５Ｍグリシン緩衝液（pH８）１容に対して１容の
抗ＡＴIII固定化抗体液を混和した溶液を第２試薬とす
る以外は、実施例２と同様に操作してＡＴIIIの測定を
実施した。得られた吸光度変化量を図２に示した。
抗ＡＴIII固定化抗体液を混和した溶液を第２試薬とす
る以外は、実施例２と同様に操作してＡＴIIIの測定を
実施した。得られた吸光度変化量を図２に示した。
【００４８】比較例４． ０．０５Ｍグリシン緩衝液（pH８）１容を固定化ヘパリ
ン懸濁液１容に混和した溶液を第２試薬とする以外は、
実施例２と同様に操作してＡＴIIIの測定を実施した。
得られた吸光度変化量を図２に示した。
ン懸濁液１容に混和した溶液を第２試薬とする以外は、
実施例２と同様に操作してＡＴIIIの測定を実施した。
得られた吸光度変化量を図２に示した。
【００４９】図２に示したように、実施例２ではＡＴII
I濃度に依存した吸光度変化を示すのに対して、比較例
３及び４共に吸光度の変化は認められなかった。
I濃度に依存した吸光度変化を示すのに対して、比較例
３及び４共に吸光度の変化は認められなかった。
【００５０】実施例３．固定化ヘパリンと固定化抗体を
用いたアポリポ蛋白Ｂの測定 第１試薬として固定化ヘパリン液１容に対して１９容の
０．０２Ｍトリス緩衝液（pH８）を混和した溶液を用
い、その２００μｌにアポリポ蛋白Ｂを含有する試料液
２０μｌを加えて３７℃で５分間加温後、第２試薬とし
て抗アポリポ蛋白Ｂ固定化抗体液１容に対して１１容の
０．０２Ｍトリス緩衝液を混和した溶液１００μｌを加
え攪拌した。その後１０〜１５分の波長６００nmにおけ
る吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とアポリポ
蛋白Ｂ濃度の関係を図３に示した。
用いたアポリポ蛋白Ｂの測定 第１試薬として固定化ヘパリン液１容に対して１９容の
０．０２Ｍトリス緩衝液（pH８）を混和した溶液を用
い、その２００μｌにアポリポ蛋白Ｂを含有する試料液
２０μｌを加えて３７℃で５分間加温後、第２試薬とし
て抗アポリポ蛋白Ｂ固定化抗体液１容に対して１１容の
０．０２Ｍトリス緩衝液を混和した溶液１００μｌを加
え攪拌した。その後１０〜１５分の波長６００nmにおけ
る吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とアポリポ
蛋白Ｂ濃度の関係を図３に示した。
【００５１】比較例５． ０．０５Ｍグリシン緩衝液（pH８）１容に対して１９容
の０．０２Ｍトリス緩衝液（pH８）を混和した溶液を第
１試薬とする以外は、実施例３と同様に操作してアポリ
ポ蛋白Ｂの測定を実施した。得られた吸光度変化量を図
３に示した。
の０．０２Ｍトリス緩衝液（pH８）を混和した溶液を第
１試薬とする以外は、実施例３と同様に操作してアポリ
ポ蛋白Ｂの測定を実施した。得られた吸光度変化量を図
３に示した。
【００５２】比較例６． ０．０５Ｍグリシン緩衝液（pH８）１容に対して１１容
の０．０２Ｍトリス緩衝液を混和した溶液を第２試薬と
する以外は、実施例３と同様に操作してアポリポ蛋白Ｂ
の測定を実施した。得られた吸光度変化量を図３に示し
た。
の０．０２Ｍトリス緩衝液を混和した溶液を第２試薬と
する以外は、実施例３と同様に操作してアポリポ蛋白Ｂ
の測定を実施した。得られた吸光度変化量を図３に示し
た。
【００５３】図３に示したように、実施例３ではアポリ
ポ蛋白Ｂ濃度に依存した吸光度変化を示すのに対して、
比較例５及び６共に吸光度の変化は認められなかった。
ポ蛋白Ｂ濃度に依存した吸光度変化を示すのに対して、
比較例５及び６共に吸光度の変化は認められなかった。
【００５４】実施例４．固定化ヘパリンと遊離抗体を用
いたＴＡＴの測定 第１試薬として１０％グリセリンを含有した０．０２Ｍ
トリス緩衝液（pH９）を用い、その２００μｌにＴＡＴ
を含有する試料液２０μｌを加えて３７℃で５分間加温
後、第２試薬として固定化ヘパリン懸濁液１容に対して
１容の抗ＴＡＴ抗体液（Ａ）又は抗ＴＡＴ抗体液（Ｂ）
又は抗ＴＡＴ抗体液（Ａ−Ｂ）を混和した溶液１００μ
ｌを加え攪拌した。その後１〜５分の波長６００nmにお
ける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とＴＡＴ
濃度の関係を図４に示した。
いたＴＡＴの測定 第１試薬として１０％グリセリンを含有した０．０２Ｍ
トリス緩衝液（pH９）を用い、その２００μｌにＴＡＴ
を含有する試料液２０μｌを加えて３７℃で５分間加温
後、第２試薬として固定化ヘパリン懸濁液１容に対して
１容の抗ＴＡＴ抗体液（Ａ）又は抗ＴＡＴ抗体液（Ｂ）
又は抗ＴＡＴ抗体液（Ａ−Ｂ）を混和した溶液１００μ
ｌを加え攪拌した。その後１〜５分の波長６００nmにお
ける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とＴＡＴ
濃度の関係を図４に示した。
【００５５】比較例７． ０．０５Ｍグリシン緩衝液（pH８）１容に対して１容の
抗ＴＡＴ抗体液（Ａ）又は抗ＴＡＴ抗体液（Ｂ）又は抗
ＴＡＴ抗体液（Ａ−Ｂ）を混和した溶液を第２試薬とす
る以外は、実施例４と同様に操作してＴＡＴの測定を実
施した。得られた吸光度変化量を図４に示した。
抗ＴＡＴ抗体液（Ａ）又は抗ＴＡＴ抗体液（Ｂ）又は抗
ＴＡＴ抗体液（Ａ−Ｂ）を混和した溶液を第２試薬とす
る以外は、実施例４と同様に操作してＴＡＴの測定を実
施した。得られた吸光度変化量を図４に示した。
【００５６】比較例８． 固定化ヘパリン懸濁液１容に対して１容の０．０５Ｍグ
リシン緩衝液（pH８）を混和して第２試薬とする以外
は、実施例４と同様に操作してＴＡＴの測定を実施し
た。得られた吸光度変化量を図４に示した。
リシン緩衝液（pH８）を混和して第２試薬とする以外
は、実施例４と同様に操作してＴＡＴの測定を実施し
た。得られた吸光度変化量を図４に示した。
【００５７】図４より、実施例４では固定化ヘパリンと
遊離の抗ＴＡＴ抗体の存在下で、ＴＡＴ濃度に依存した
吸光度変化を示した。しかも、１種の抗体使用時よりも
２種の抗体使用時の方がより大きな吸光度変化を示し
た。一方比較例では、２種の抗体使用時も含めていずれ
の場合も吸光度の変化は認められなかった。
遊離の抗ＴＡＴ抗体の存在下で、ＴＡＴ濃度に依存した
吸光度変化を示した。しかも、１種の抗体使用時よりも
２種の抗体使用時の方がより大きな吸光度変化を示し
た。一方比較例では、２種の抗体使用時も含めていずれ
の場合も吸光度の変化は認められなかった。
【００５８】
【発明の効果】本発明によれば、Ｂ／Ｆ分離等の煩雑な
操作を必要とせず、簡便かつ迅速に検体中のヘパリン親
和性物質を検出又は定量することができる。
操作を必要とせず、簡便かつ迅速に検体中のヘパリン親
和性物質を検出又は定量することができる。
【図１】 固定化ヘパリンと抗ＴＡＴ固定化抗体を組み
合わせて用いた場合の、ＴＡＴ濃度と吸光度の関係を示
す図である。
合わせて用いた場合の、ＴＡＴ濃度と吸光度の関係を示
す図である。
【図２】 固定化ヘパリンと抗ＡＴIII 固定化抗体を組
み合わせて用いた場合の、ＡＴIII濃度と吸光度の関係
を示す図である。
み合わせて用いた場合の、ＡＴIII濃度と吸光度の関係
を示す図である。
【図３】 固定化ヘパリンと抗アポリポ蛋白Ｂ固定化抗
体を組み合わせて用いた場合の、アポリポ蛋白Ｂ濃度と
吸光度の関係を示す図である。
体を組み合わせて用いた場合の、アポリポ蛋白Ｂ濃度と
吸光度の関係を示す図である。
【図４】 固定化ヘパリンと種々の抗ＴＡＴ遊離抗体を
組み合わせて用いた場合の、ＴＡＴ濃度と吸光度の関係
を示す図である。
組み合わせて用いた場合の、ＴＡＴ濃度と吸光度の関係
を示す図である。
Claims (7)
- 【請求項１】 ヘパリン親和性物質に、ヘパリンを担持
させた不溶性担体粒子と該ヘパリン親和性物質に対する
抗体を反応させ、生成する免疫凝集体を直接光学的に測
定することを特徴とするヘパリン親和性物質の測定方
法。 - 【請求項２】 抗体が不溶性担体粒子に担持されている
ことを特徴とする請求項１記載の測定方法。 - 【請求項３】 抗体が遊離抗体であることを特徴とする
請求項１記載の測定方法。 - 【請求項４】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
１、２又は３記載の測定方法。 - 【請求項５】 抗体がポリクローナル抗体である請求項
１、２又は３記載の測定方法。 - 【請求項６】 不溶性担体粒子がラテックス粒子である
請求項１〜５のいずれか１項記載の測定方法。 - 【請求項７】 不溶性担体粒子が平均粒径１．６μｍ以
下の粒子である請求項１〜６のいずれか１項記載の測定
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4334397A JPH10239313A (ja) | 1997-02-27 | 1997-02-27 | ヘパリン親和性物質の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4334397A JPH10239313A (ja) | 1997-02-27 | 1997-02-27 | ヘパリン親和性物質の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10239313A true JPH10239313A (ja) | 1998-09-11 |
Family
ID=12661207
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4334397A Pending JPH10239313A (ja) | 1997-02-27 | 1997-02-27 | ヘパリン親和性物質の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10239313A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007527504A (ja) * | 2003-06-19 | 2007-09-27 | アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ | プリオン変換を調節する因子の使用 |
| WO2019026870A1 (ja) * | 2017-08-01 | 2019-02-07 | 学校法人学文館 | ｓＦｌｔ－１（可溶型血管内皮増殖因子受容体－１）の新規測定法 |
-
1997
- 1997-02-27 JP JP4334397A patent/JPH10239313A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007527504A (ja) * | 2003-06-19 | 2007-09-27 | アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ | プリオン変換を調節する因子の使用 |
| WO2019026870A1 (ja) * | 2017-08-01 | 2019-02-07 | 学校法人学文館 | ｓＦｌｔ－１（可溶型血管内皮増殖因子受容体－１）の新規測定法 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A977 | Report on retrieval |
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| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050208 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050407 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20051011 |