WO2019026870A1 - ｓＦｌｔ－１（可溶型血管内皮増殖因子受容体－１）の新規測定法 - Google Patents

ｓＦｌｔ－１（可溶型血管内皮増殖因子受容体－１）の新規測定法 Download PDF

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澁谷　正史
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds

Definitions

  • the present invention is directed to sFlt-1 (soluble Fms-like tyrosine kinase-1) protein (soluble vascular endothelial growth factor receptor-1, sVEGFR-1 (soluble vascular endothelial growth factor receptor), which is a major cause of pregnancy and hypertension.
  • sFlt-1 soluble Fms-like tyrosine kinase-1 protein
  • sVEGFR-1 soluble vascular endothelial growth factor receptor
  • angiogenesis plays an important role in fetal development, individual maturation, wound healing, etc., and also plays an important role in maternal placenta formation and maturation.
  • Angiogenesis involves many factors such as VEGF (vascular endothelial growth factor), FGF (fibroblast growth factor; fibroblast growth factor), Angiopoietin, among which VEGF and its receptor VEGFR are central It is becoming clear that it plays a key role (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • the present inventors first isolated and reported a novel tyrosine kinase receptor gene Flt-1 (Fms-like tyrosine kinase-1) in 1990 (Non-patent Document 3).
  • Flt-1 binds to VEGF and acts as a receptor, it is also called VEGFR-1.
  • the Flt-1 gene together with a mature mRNA that expresses the receptor, expresses a short-chain mRNA for producing a protein of only the extracellular region of Flt-1 (Non-patent Document 4)
  • sFlt-1 binds to VEGF and PlGF (placental growth factor) to suppress its function, and causes hypertension and proteinuria in the mother, so it is an important causative agent of this disease. It is considered to be one, and the amount of sFlt-1 in the body, for example, the amount of sFlt-1 in the blood of pregnant women is now an important biological indicator / biomarker (Non-patent Document 7).
  • Non-Patent Document 5-7 a sandwich ELISA method using two specific antibodies against sFlt-1 has been fundamental as the sFlt-1 measurement method.
  • sandwich ELISA method with two types of specific antibodies is expensive, and the measurement method is also manual. Since multiple steps and time are also required, it has been difficult to be widely used obstetrically from early pregnancy as a biomarker test.
  • the present invention overcomes the difficulties of such sFlt-1 assay and aims to develop a convenient and widely available assay.
  • Non-patent Document 11 As a method of attempting to treat pregnancy-hypertensive syndrome, an attempt to reduce the sFlt-1 by circulating the blood of a pregnant woman who has developed this disease through a heparin column is also used in clinical trials (Non-patent Document 12). However, it was unclear whether sFlt-1 bound to heparin could be stably bound to the specific antibody simultaneously and could be used as a convenient measurement method.
  • the object of the present invention is to use an immunological measurement method based on a sandwich method in which sFlt-1 is sandwiched between a specific antibody against heparin and sFlt-1 by using binding of sFlt-1 protein to heparin. It is to provide a new, inexpensive and practical sFlt-1 assay.
  • the present inventors have found that (1) beads to which heparin has been bound to sFlt-1 samples (those already marketed), (2) anti-human sFlt-1 specific mouse antibodies (hereinafter referred to as primary antibodies), and (3) Simple sandwich of immobilized heparin and specific antibody by mixing alkaline phosphatase-labeled or HRP (horseradish peroxidase) -labeled anti-mouse immunoglobulin / goat antibody (hereinafter referred to as secondary antibody) It has been found that the sFlt-1 assay can be established, and the present invention has been completed.
  • the present invention by utilizing the heparin binding property of sFlt-1, the number of anti-sFlt-1 specific antibodies required is reduced from two to one, and the new sFlt-1 whose reaction time is also shortened is inexpensive.
  • a measurement method can be provided.
  • the present invention is as follows.
  • [1] A method of measuring sFlt-1 in a sample by forming a sandwich complex in which sFlt-1 is sandwiched between heparin and anti-sFlt-1 antibody, and heparin or anti-sFlt-1 immobilized on a carrier The antibody is brought into contact with the sample, and a complex of heparin or anti-sFlt-1 antibody and sFlt-1 in the sample is formed on the carrier, and the presence of the complex is labeled as anti-sFlt-1 antibody or anti-sFlt- (1)
  • a method of measuring sFlt-1 in a sample which comprises detection using an antibody and a labeled anti-immunoglobulin antibody bound thereto or a labeled heparin.
  • the sFlt- of [1], wherein the carrier on which the heparin or anti-sFlt-1 antibody is immobilized is a film-like formation or steric formation formed by synthetic resin, synthetic fiber or fibers derived from natural products.
  • the sFlt-1 in the sample collected from the subject is measured by the method of any one of [1] to [5], and the sFlt-1 concentration in the sample is higher than that in a healthy person.
  • a method of detecting pregnancy and hypertension which assesses that the subject suffers from pregnancy and hypertension.
  • a kit for measuring sFlt-1 in a sample comprising a carrier on which at least heparin or anti-sFlt-1 antibody is immobilized, and labeled anti-sFlt-1 antibody or heparin.
  • a kit for measuring sFlt-1 in a sample comprising at least a heparin-immobilized carrier, an anti-sFlt-1 antibody, and a labeled secondary antibody that binds to the anti-sFlt-1 antibody.
  • the carrier on which the heparin or anti-sFlt-1 antibody is immobilized is a film-like formation or steric formation formed by a synthetic resin, a synthetic fiber or a fiber derived from a natural product, [7] or [8] Kit for measuring sFlt-1 in a sample.
  • Kit for measuring sFlt-1 according to any of [7] to [9] which is an ELISA method kit or an immunochromatographic method kit.
  • a kit for measuring sFlt-1 according to any of [7] to [10] using heparin-bound beads.
  • kits for measuring [13] A kit for measuring sFlt-1 according to any of [7] to [12], for detecting pregnancy-induced hypertension.
  • the present specification includes the disclosure contents of Japanese Patent Application Nos. 2017-149280 and 2018-042917 based on the priority of the present application.
  • sFlt-1 measurement method for sFlt-1 protein which is inexpensive, easy in procedure, and can be shortened in time. That is, in the present invention, by utilizing the sFlt-1 binding property of heparin, the number of anti-sFlt-1 specific antibodies required is reduced to one type, and it is inexpensive by the sandwich method of immobilized heparin and one type of specific antibody. Can provide a new sFlt-1 assay that has a reduced reaction time.
  • FIG. 1 shows an outline of a novel sandwich sFlt-1 ELISA method using heparin beads and an anti-sFlt-1 specific antibody.
  • an anti-sFlt-1 specific antibody primary antibody
  • FIG. 1 shows an outline of a novel sandwich sFlt-1 ELISA method using heparin beads and an anti-sFlt-1 specific antibody, which uses a labeled primary antibody.
  • the labeled secondary antibody is unnecessary, and thus, it is further simplified than the case shown in FIG.
  • FIG. 5 shows the measured values of sFlt-1 ELISA assay using heparin beads and a commercially available specific antibody.
  • the present invention is a method of measuring sFlt-1 in blood by an immunoassay based on sandwich method.
  • the immunological assay based on the sandwich method of the present invention is captured by sandwiching the target substance sFlt-1 with heparin and anti-sFlt-1 antibody that binds to sFlt-1.
  • a method to measure sFlt-1 also referred to simply as a sandwich method.
  • the complex formed by sandwiching sFlt-1 with heparin and anti-sFlt-1 antibody is called a sandwich complex.
  • immunological assay methods based on the sandwich method include immunochromatography, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)), Western blotting, and the like.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Western blotting and the like.
  • the term "measurement” includes any of quantitative, semi-quantitative, and detection.
  • heparin is immobilized on an immobilized carrier, an analyte possibly containing sFlt-1 is added to the immobilized carrier and brought into contact, and heparin is added to the immobilized carrier.
  • an analyte possibly containing sFlt-1 is added to the immobilized carrier and brought into contact, and heparin is added to the immobilized carrier.
  • Form a complex of sFlt-1 Furthermore, a specific antibody (anti-sFlt-1 antibody) against human sFlt-1 is added and brought into contact, and the anti-sFlt-1 antibody is bound to the complex of heparin and sFlt-1 on the solid phase carrier, A sandwich complex of heparin, sFlt-1 and anti-sFlt-1 antibody may be detected.
  • anti-sFlt-1 antibody is an enzyme such as alkaline phosphatase (ALP) or horseradish peroxidase (HRP), radioactive isotopes, fluorescent substances, luminescent substances, colored particles such as colored polystyrene particles, colloidal particles such as gold colloid, etc. It can be carried out by measuring the signal emitted by the labeling substance.
  • ALP alkaline phosphatase
  • HRP horseradish peroxidase
  • the measurement may be carried out by adding a substrate for each enzyme when the label is an enzyme, causing an enzyme reaction, and measuring the color development by measuring the absorbance.
  • the label is a fluorescent substance
  • the fluorescence may be measured using a fluorescence detector. Labeling of the antibody can be carried out by known methods.
  • the anti-sFlt-1 antibody is not limited to mouse monoclonal antibodies, but antibodies produced by any animal such as rats, rabbits and goats may be used, and may be polyclonal antibodies.
  • a secondary antibody that is a secondary antibody that binds to the anti-sFlt-1 antibody may be used instead of labeling the anti-sFlt-1 antibody.
  • a secondary antibody that is a secondary antibody that binds to the anti-sFlt-1 antibody.
  • a sandwich complex of heparin, sFlt-1, anti-sFlt-1 antibody and secondary antibody is formed on the solid phase carrier, and the signal emitted from the labeling substance of the secondary antibody may be measured.
  • an antibody that specifically binds to an anti-sFlt-1 antibody can be used, and an antibody against the immunoglobulin of the animal used for the preparation of an sFlt-1 antibody such as an anti-mouse immunoglobulin or goat antibody is used. Just do it.
  • FIG. 1 A schematic diagram of the ELISA method in the case of using a secondary antibody is shown in FIG. 1, and a schematic diagram of the ELISA method in the case of not using a secondary antibody is shown in FIG.
  • the antibody may be an immunoglobulin fragment such as Fab or F (ab ') 2 or a recombinant antibody such as scFv expressed as a recombinant, dsFv, diabody or minibody.
  • ab ' immunoglobulin fragment
  • a recombinant antibody such as scFv expressed as a recombinant, dsFv, diabody or minibody.
  • the term "antibody” also includes these fragments. These fragments can be prepared by known methods.
  • the antibody may be added in a three-step method to form a sandwich complex of heparin, sFlt-1 and anti-sFlt-1 antibody (primary antibody) and secondary antibody
  • the binding reaction between heparin and sFlt-1, and the antigen-antibody reaction can be carried out at 4 ° C. to 45 ° C., preferably 20 ° C. to 40 ° C., more preferably 25 ° C. to 38 ° C.
  • the reaction time in one step is about 10 minutes to 18 hours, preferably about 10 minutes to 3 hours, and more preferably about 30 minutes to 2 hours.
  • the above method is performed by immobilizing heparin on a carrier, but in an immunoassay based on the sandwich method as the measurement principle, it is also possible to reverse the positions of heparin and the specific antibody. . That is, an anti-sFlt-1 specific antibody is immobilized on a carrier, and bound to sFlt-1 in a sample, to which heparin having an appropriate size and labeled is bound to form a sandwich complex. It is also possible to measure it.
  • the present invention is a method of measuring sFlt-1 in a sample by forming a sandwich complex in which sFlt-1 is sandwiched between heparin and an anti-sFlt-1 antibody, and the heparin or the antibody immobilized on a carrier is used.
  • a sample is brought into contact with an sFlt-1 antibody, and a complex of heparin or anti-sFlt-1 antibody and sFlt-1 in the sample is formed on the carrier, and the presence of the complex is labeled as an anti-sFlt-1 antibody or It is a method of measuring sFlt-1 in a sample, including detection using an anti-sFlt-1 antibody and a labeled anti-immunoglobulin antibody that binds thereto, or a labeled heparin.
  • Examples of carriers on which heparin or anti-sFlt-1 antibody is immobilized include film-like formations or three-dimensional formations formed of synthetic resin, synthetic fibers, fibers derived from natural products, etc.
  • ELISA a variety of things can be used such as microtiter plates, slide glasses, nitrocellulose membranes, cellulose membranes, sepharose membranes, resin beads such as cellulose beads and sepharose beads, magnetized beads and the like.
  • commercially available resin beads conjugated with heparin can be used, for example, using commercially available heparin beads conjugated with heparin on sepharose beads (Heparin Sepharose 6 Fast Flow, 17-0998-01, GE Healthcare) it can.
  • a gel or fiber membrane immobilized so as not to elute heparin may be used.
  • a method in which resin beads or the like on which heparin or an anti-sFlt-1 antibody is immobilized is used as a carrier and the resin beads are added to the wells of a microtiter plate for ELISA is also called ELISA.
  • the binding of heparin or anti-sFlt-1 antibody to a carrier can be performed by known methods such as physical adsorption and covalent bonding using a functional group.
  • the amount of immobilization is not particularly limited, but when the carrier is a 96-well microtiter plate, several ng to several tens of ⁇ g per well is desirable.
  • the immobilization can be carried out by contacting the solution of heparin or anti-sFlt-1 antibody to be immobilized with a carrier.
  • a carrier For example, when using a microtiter plate, it can be immobilized by dividing a solution of heparin or anti-sFlt-1 antibody into the wells of the microtiter plate and leaving it for a certain period of time.
  • blocking is performed using a blocking solution containing bovine serum albumin, human serum albumin, rabbit serum albumin, ovalbumin etc to prevent nonspecific binding in the assay. It is preferred to do.
  • Heparin is chemically a kind of glycosaminoglycan and is a macromolecular substance in which D-glucuronic acid or L-idronic acid and glucosamine are polymerized by 1,4 bond to form a disaccharide repeating unit. .
  • D-glucuronic acid or L-idronic acid and glucosamine are polymerized by 1,4 bond to form a disaccharide repeating unit.
  • Compounds having a structure similar to heparin and binding to sFlt-1 include, for example, polysaccharide sulfated esters of mucopolysaccharides, and representative substances include heparan sulfate.
  • sFlt-1 is not limited to human, and in mice, i13-type sFlt-1 is expressed from vascular endothelial cells, placental trophoblast cells and the like, and has been shown to bind to heparin. Therefore, the present invention can also be applied to a mouse sFlt-1 measurement system.
  • heparin or a substance having a similar structure to heparin which binds to sFlt-1 in mammals, birds and amphibians it can be applied to measurement of sFlt-1 in mammals including mammals including humans and mice, and birds and amphibians. it can.
  • the origin of the substance having a similar structure to heparin and heparin is not limited, and for example, those derived from the intestinal mucosa of bovine or porcine can be used.
  • e15a sFlt-1 protein and i13 sFlt-1 protein which are short isoforms of sFlt-1 are produced, and these proteins are more than twice as large as those in a normal pregnant woman in the blood of pregnancy hypertension syndrome , 3 times or more, for example, 2 to 5 times, 3 to 5 times, or 5 to 10 times the concentration.
  • an anti-sFlt-1 antibody may be used which binds to both the e15a sFlt-1 protein and the i13 sFlt-1 protein.
  • the term sFlt-1 also includes the e15a sFlt-1 protein and the i13 sFlt-1 protein.
  • the sFlt-1 to be measured in the present invention is not limited to human sFlt-1, but also includes mammalian, avian and amphibian sFlt-1 including human.
  • the sample is not only serum, plasma, whole blood, but almost all body fluids such as pleural fluid, ascites fluid, cerebral spinal fluid, saliva, urine, etc. including.
  • plasma prepared using heparin as a blood anticoagulant can be used after heparin removal.
  • the amount of sample and each reagent to be added is several ⁇ L to several hundred ⁇ L.
  • the sample may be diluted several fold to several tens fold and used.
  • sFlt-1 By measuring sFlt-1 in a sample collected from a subject, it can be assessed whether the subject suffers from pregnancy hypertension syndrome or supplementary data can be obtained to assess. That is, if the sFlt-1 concentration in a sample collected from a subject is high as compared to a healthy subject, the subject can be evaluated as suffering from gestational hypertension syndrome.
  • sFlt-1 in a sample of a healthy individual may be measured in advance, and a cutoff value (threshold) may be defined for the concentration measurement value of sFlt-1 based on the measurement value. If the sFlt-1 concentration in the sample collected from the subject is above the cutoff value or above the cutoff value based on the cutoff value, then the subject is considered to be suffering from pregnancy and hypertension syndrome It can be evaluated.
  • the concentration of sFlt-1 in serum is measured in the case of normal labor Is about 12 ng / ml (+/- about 7 ng / ml) and averages about 56 ng / ml in pregnancy / hypertension syndrome cases (+/- about 33 ng / ml), which is about 4.7 times that of normal delivery cases .
  • the average value is about 70 ng / ml, which is about 5.8 times that of normal delivery cases. Furthermore, in late-onset cases that gave birth after 38 weeks of gestation, the average value of sFlt-1 is about 24 ng / ml, which is about twice that of normal delivery cases.
  • a cutoff value of sFlt-1 concentration in serum can be set to a value of 12 ng / ml ⁇ 2 to 5.
  • This cut-off value is a value as measured by a method of forming sFlt-1 by sandwiching sFlt-1 with a heparin and anti-sFlt-1 antibody of the present invention preferably and measuring sFlt-1 in a sample. .
  • the present invention also includes methods of obtaining ancillary data for detecting gestational hypertension.
  • the present invention includes a kit for measuring sFlt-1 in a sample, the kit comprising at least heparin or a carrier on which a substance having structural similarity to heparin is immobilized, and further, a labeled anti-sFlt- 1 antibody or anti-sFlt-1 antibody and a labeled secondary antibody that binds to the anti-sFlt-1 antibody.
  • the kit comprises a carrier on which an anti-sFlt-1 antibody is immobilized, and further contains labeled heparin or a substance having structural similarity to heparin.
  • Example 1 [SFlt-1 ELISA assay using heparin beads and specific antibody]
  • the following assay was attempted using an alkaline phosphatase-labeled secondary antibody.
  • reaction solution (a) 0, 20 or 50 ng of control 7N-Flt-1 protein (100 ⁇ l in physiological saline) or sFlt-1 sample (human e15a sFlt-1 production) in 1 ml of solution Culture supernatant (CM) 100 ⁇ l of 293 cell line, (b) 100 ⁇ l of fetal bovine serum, (c) 25 ⁇ l of heparin beads, (d) about 75 ng of anti-human sFlt-1 mouse monoclonal specific antibody KM 1750, (e) alkaline phosphatase A reaction solution was prepared containing about 0.3 ⁇ l of a labeled anti-mouse immunoglobulin goat antibody (KURABO ZT 6550), (f) about 100 ⁇ g of skimmed milk (Snowmark-Hokkaido), (g) 775 ⁇ l of physiological saline supplemented with 0.1% Tween-20. .
  • CM Culture supernatant
  • CM 100 ⁇
  • Measurement value indicates the value measured by the plate reader.
  • Average value indicates the average value of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 and 16.
  • mean value -208 is a value obtained by subtracting the mean value 208 of background Nos. 1 and 2 to which sFlt-1 is not added. As shown in FIG. 5, the amount of sFlt-1 in the reaction solution is expected to be better quantitative when it is 20 ng or less.
  • Example 2 [SFlt-1 ELISA assay using heparin beads and a commercially available specific antibody] In order to confirm whether the novel ELISA assay of the present invention exerts an effect by the commercially available anti-sFlt-1 antibody, the following assay was tried.
  • the method is basically the same as Example 1, except that anti-human sFlt-1 mouse monoclonal antibody KM1750 used in Example 1 as a primary antibody, anti-sFlt-1 antibody, and a commercial alternative to it. Both anti-human sFlt-1 mouse monoclonal antibodies (PK-AB704-64426, PromoKine) were compared. Since the antibody titer of the commercially available antibody was considered to be about half that of KM1750 from the preliminary experiment, a 2-fold amount was used as the antibody amount. The results are shown in FIG. 100 ⁇ l of the culture supernatant of e15a-expressing 293 cell line as a sample was measured.
  • the measured values are shown in FIG.
  • the values measured by the plate reader are shown in [measured values] in FIG. [Average value] indicates the average value of 1 to 3, 4 to 6, 7 and 8, 9 to 11, 12 to 14, and 15 and 16.
  • the average value 228 of the background No. 1 to 3 without sFlt-1 added [average value] from 228, 398 and 663 It is the subtracted value.
  • the lower half [average value-210] 0, 78, 364 is the average value 210 of background Nos. 9 to 11 without sFlt-1 added, subtracted from [average value] 210, 288 and 574 It is a value.
  • Example 3 (1) Reaction method In order to increase the measurement sensitivity, measurement was performed using HRP (horseradish peroxidase) -labeled secondary antibody (ab 6789, Abcam) instead of the alkaline phosphatase-labeled secondary antibody used in Examples 1 and 2. Did. As the amount of sFlt-1, 0, 0.1, 0.3 and 1 ng were used per reaction tube, and three reactions were performed for each. The volume of the reaction solution was the same as in Examples 1 and 2, but the primary antibody KM1750 150 ng / tube, and the HRP-labeled secondary antibody about 200 ng / tube were used.
  • HRP horseradish peroxidase
  • FIG. 9 shows measured values in each measurement
  • FIG. 10 shows a graph.
  • the average of the measured values of 0, 0.1, 0.3 and 1 ng at 7N Flt-1 is 303, 386, 552 and 807 respectively, and the value obtained by subtracting the average of 0 ng is 83 at 0.1 ng and 0.3 ng at 0.3 ng It was 249, and it became 504 at 1 ng, and increased quantitatively to some extent.
  • the sensitivity is increased about 100 times as compared with the alkaline phosphatase-labeled secondary antibody method (measured to 10-50 ng of 7N Flt-1) used in Examples 1 and 2. It was possible.
  • Example 4 [Measurement of clinical sample] (1) Method It was examined whether this measurement method could actually measure sFlt-1 in the serum of clinical patients.
  • 20 ⁇ l, 50 ⁇ l or 100 ⁇ l of serum was used.
  • the total amount of human serum and bovine serum in 1 ml of reaction solution was adjusted to 100 ⁇ l.
  • reaction time was measured as 4 ° C., 3 hours (measurement-1), or as room temperature (about 25 ° C.), 30 minutes (measurement-2).
  • FIG. 11 shows the results of measurement of sFlt-1 in serum of pregnancy hypertensive syndrome patients-1 (reaction temperature 4 ° C., reaction time 3 hours) with photographs.
  • standard sFlt-1 (0 ng, 0.3 ng, 1 ng, 3 ng
  • sFlt-1 was measured before and 5 days after pregnancy hypertensive syndrome case a
  • sFlt-1 was measured before and 5 days after pregnancy hypertensive syndrome case b.
  • 20 ⁇ l of serum was used.
  • the serum sFlt-1 level showed a high value of about 100 ng / ml before parturition, but it was shown that the serum concentration of sFlt-1 decreased rapidly 5 days after parturition.
  • FIG. 12 is a photograph showing the results of measurement of sFlt-1 in the serum of pregnancy hypertensive syndrome patients-2 (reaction temperature room temperature (about 25 ° C.), reaction time, about 30 minutes).
  • reaction temperature room temperature about 25 ° C.
  • standard sFlt-1 0. ng, 0.3 ng, 1 ng, 3 ng
  • sera of pregnancy hypertensive syndrome cases c (2 days before and immediately after parturition) and d were measured.
  • the blue response of standard sFlt-1 is slightly lower compared to the example of the reaction temperature 4 ° C. and the reaction time 3 hours (FIG. 11)
  • the measurement method is a relative comparison of the reaction of the standard and the sample. There was no problem.
  • sFlt-1 concentration (ng / ml serum) averages about 12 (+/- about 7) in normal delivery case, pregnancy hypertension syndrome
  • the average value was around 56 (+/- about 33), and this disease showed about 4.7 times higher value than normal delivery cases.
  • the average value was about 70 in the early-onset cases (9 cases of so-called severe cases) where labor was delivered before 6 days of gestation at 37 weeks, which is about 5.8 times that of normal cases.
  • late-onset cases (4 cases) that gave birth after 38 weeks gestation the average value of sFlt-1 was about 24 and remained about twice that of normal delivery cases.
  • the sFlt-1 assay of the present invention can provide a clinically easy-to-use sFlt-1 screening method that is inexpensive, easy to perform, and time-saving. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

sFlt-1タンパクに対して、新規で簡便かつ安価で実用的なsFlt-1測定法を提供すること。ヘパリンと抗sFlt-1抗体でsFlt-1を挟んだ複合体を形成させて検体中のsFlt-1を測定する方法であって、担体に固相化したヘパリンまたは抗sFlt-1抗体に検体を接触させ、該担体上にヘパリンまたは抗sFlt-1抗体と検体中のsFlt-1との複合体を形成させ、該複合体の存在を標識した抗sFlt-1抗体もしくは抗sFlt-1抗体とそれに結合する標識した抗イムノグロブリン抗体、または標識したヘパリンを用いて検出することを含む、検体中のsFlt-1を測定する方法。

Description

ｓＦｌｔ－１（可溶型血管内皮増殖因子受容体－１）の新規測定法
　本発明は、妊娠高血圧症候群の主要な原因であるsFlt-1（soluble Fms-like tyrosine kinase-1）タンパク質(可溶型血管内皮増殖因子受容体-1、sVEGFR-1（soluble vascular endothelial growth factor receptor-1）とも呼ばれるもの)の、１種類の特異抗体とヘパリンを利用することによる、短時間で手技的に単純な、また作製上安価な測定法に関する。
　近年においては、晩婚化や育児環境の困難さを背景に、世界的な出産児数の減少、すなわち少子化の状態となり、社会的に大きな問題となっている。このような状況においては、胎児や母体を傷害する疾患を克服し、母子ともに健康な出産をより確実にすることが喫緊の課題である。産科における疾患のなかでも妊娠の５～７％に発症する妊娠高血圧症候群（従来、妊娠中毒症と呼ばれていたもの）は、重症例においては胎児と母体の双方において致死的な結果をもたらすことから、その早期発見と早期治療は極めて重要な医学的課題である。
　血管新生の制御機構は、胎児の発育、個体の成熟、創傷治癒等において重要な役割を果たす他、母体側の胎盤の形成と成熟においても重要な役割を果たしていることが明らかになりつつある。血管新生にはVEGF（血管内皮細胞増殖因子）、FGF（fibroblast growth factor；線維芽細胞増殖因子）、Angiopoietinなど多くの因子が関与するが、なかでもVEGFとその受容体であるVEGFRは、中心的な役割を果たすことが明らかになりつつある（非特許文献１および２）。本発明者らは1990年に新規チロシンキナーゼ型受容体遺伝子Flt-1 (Fms-like tyrosine kinase-1)を最初に単離し、報告した（非特許文献３）。Flt-1はVEGFに結合し受容体として働くことから、VEGFR-1とも呼ばれている。Flt-1遺伝子は受容体を発現する成熟型mRNAとともに、Flt-1の細胞外領域のみのタンパク質を産生するための短鎖mRNAを発現するが（非特許文献４）、妊娠高血圧症候群の胎盤からは主に２種類の短鎖Flt-1 mRNAとその産物であるe15a sFlt-1およびi13 sFlt-1タンパク質が正常妊娠時よりも大量に産生され、血清レベルでは正常妊婦の5～10倍に達することが明らかとなっている（非特許文献５、６および７）。これらの異常に産生されたsFlt-1はVEGFやPlGF(胎盤増殖因子）と結合してその働きを抑制すること、また母体に高血圧やタンパク尿を引き起こすことから、本疾患の重要な原因物質のひとつと考えられており、体内のsFlt-1量、たとえば妊婦血液中のsFlt-1量は、現在では重要な生物学的指標・バイオマーカーとなっている（非特許文献７）。
　さらに、昨年(2016年)には、sFlt-1の血中レベルは産科における妊娠高血圧症候群に限らず、急性膵臓炎においても重傷例においては軽症例よりも高値であることが報告された（非特許文献８）。他の疾患では、加齢黄斑変性症における網膜組織のsFlt-1発現低下や、実験動物において腎臓・足細胞のsFlt-1発現低下とネフローゼ様の慢性タンパク尿発症が報告されている（非特許文献９、１０）。今後、血液中や体液中のsFlt-1がバイオマーカーとして利用される疾患がさらに増加する可能性が高い。
　これまでにsFlt-1測定法としてはsFlt-1に対する２種類の特異抗体を利用したサンドイッチELISA法が基本であった（非特許文献５－７）。しかし、２種類の適切な特異抗体を開発し測定法を確立するには時間と費用がかかり、その結果、２種類の特異抗体によるサンドイッチELISA法は高価格であり、また測定法も手技的に多段階で時間も必要であることから、バイオマーカー検査法として妊娠早期から産科的に広く利用するには困難があった。本発明はそのようなsFlt-1測定法の困難を克服し、広く利用できる簡便な測定法の開発を目指す。
　これまでに、sFlt-1タンパク質はその糖鎖修飾などからヘパリンと結合することが知られていた。この性質により、組織や培養細胞から得られたsFlt-1を精製するためにヘパリンカラムが用いられてきた（非特許文献１１）。妊娠高血圧症候群の治療を試みる方法として、本疾患を発症した妊婦の血液をヘパリンカラムを通して還流させ、sFlt-1を減少させる試みも臨床試験で用いられている（非特許文献１２）。しかし、ヘパリンに結合したsFlt-1が同時に特異抗体と安定に結合し、簡便な測定法として利用できるかは不明であった。
Endocr. Rev. 25, 581-611, 2004. review Angiogenesis, 9:225-230, 2006. review Oncogene 5, 519-524, 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10705-10709,1993. J. Clin. Invest. 111, 649-658, 2003. J. Clin. Endocrinol. Metab. 88, 2348-2351, 2003. N. Engl. J. Med. 350, 672-683, 2004. Int J Mol Sci. 2016 Dec 6;17(12). pii: E2038. Elife, 2013 Jun 18;2:e00324. doi: 10.7554/eLife.00324. Cell, 151:384-399, 2012. Jpn. J. Cancer Res., 88, 867-876, 1997. Circulation 124, 940-950, 2011.
　本発明の課題は、sFlt-1タンパク質がヘパリンと結合することを利用して、ヘパリンとsFlt-1に対する特異抗体でsFlt-1を挟むサンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法を用い、新規で安価で実用的なsFlt-1測定法を提供することにある。
　本発明者は、sFlt-1試料に、（１）ヘパリンを結合させたビーズ（既に市販されているもの）、（２）抗ヒトsFlt-1特異マウス抗体（以下、一次抗体と称する）、ならびに（３）アルカリフォスファターゼ標識もしくはHRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識の抗マウス免疫グロブリン・ヤギ抗体（以下、二次抗体と称する）、の三者を混ぜることにより、固定化ヘパリンと特異抗体による簡便なサンドイッチsFlt-1測定法が確立し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明において、sFlt-1のヘパリン結合性を利用することにより、必要な抗sFlt-1特異抗体の数を２種類から１種類に減らし、安価で反応時間も短縮された新規sFlt-1測定法を提供することができる。
　本発明は以下のとおりである。
[１]　ヘパリンと抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んだサンドイッチ複合体を形成させて検体中のsFlt-1を測定する方法であって、担体に固相化したヘパリンまたは抗sFlt-1抗体に検体を接触させ、該担体上にヘパリンまたは抗sFlt-1抗体と検体中のsFlt-1との複合体を形成させ、該複合体の存在を標識した抗sFlt-1抗体もしくは抗sFlt-1抗体とそれに結合する標識した抗イムノグロブリン抗体、または標識したヘパリンを用いて検出することを含む、検体中のsFlt-1を測定する方法。
[２]　ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化する担体が、合成樹脂、合成繊維または天然物由来の繊維により形成された膜状形成物または立体形成物である、[１]のsFlt-1を測定する方法。
[３]　ELISA法またはイムノクロマト法である、[１]または[２]のsFlt-1を測定する方法。
[４]　ヘパリンを結合したビーズを用いる、[１]～[３]のいずれかのsFlt-1を測定する方法。
[５]　ヘパリンの代りに、ヘパリンと構造類似性を有し、ヒトを含む哺乳類、鳥類、両生類のsFlt-1と結合する物質を用いる、[１]～[４]のいずれかのsFlt-1を測定する方法。
[６]　[１]～[５]のいずれかの方法で、被験体から採取した検体中のsFlt-1を測定し、検体中のsFlt-1濃度が健常者に比較して高い場合、該被験体は妊娠高血圧症候群に罹患していると評価する、妊娠高血圧症候群の検出方法。
[７]　少なくともヘパリンもしくは抗sFlt-1抗体を固相化した担体、ならびに標識した抗sFlt-1抗体もしくはヘパリンを含む、検体中のsFlt-１を測定するためのキット。
[８]　少なくともヘパリンを固相化した担体、抗sFlt-1抗体および該抗sFlt-1抗体に結合する標識した二次抗体を含む、検体中のsFlt-１を測定するためのキット。
[９]　ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化する担体が、合成樹脂、合成繊維または天然物由来の繊維により形成された膜状形成物または立体形成物である、[７]または[８]の検体中のsFlt-１を測定するためのキット。
[１０]　ELISA法キットまたはイムノクロマト法キットである、[７]～[９]のいずれかのsFlt-1を測定するためのキット。
[１１]　ヘパリンを結合したビーズを用いる、[７]～[１０]のいずれかのsFlt-1を測定するためのキット。
[１２]　ヘパリンの代りに、ヘパリンと構造類似性を有し、ヒトを含む哺乳類、鳥類、両生類のsFlt-1と結合する物質を用いる、[７]～[１１]のいずれかのsFlt-1を測定するためのキット。
[１３]　妊娠高血圧症候群を検出するための、[７]～[１２]のいずれかのsFlt-1を測定するためのキット。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-149280号、2018-042917号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、sFlt-1タンパク質に対する、安価で手技的にも容易で、時間も短縮可能なsFlt-1測定法を提供することができる。すなわち、本発明において、ヘパリンのsFlt-1結合性を利用することにより、必要な抗sFlt-1特異抗体の数を１種類に減らし、固相化ヘパリンと特異抗体１種類のサンドイッチ法による、安価で反応時間も短縮された新規sFlt-1測定法を提供することができる。
ヘパリンビーズと抗sFlt-1特異抗体による新規サンドイッチsFlt-1 ELISA法の概略を示す図である。この図では抗sFlt-1特異抗体（一次抗体）は酵素などで標識されていない通常の単クローン抗体を用いる例を示しており、一次抗体に結合する標識二次抗体を加えている。 ヘパリンビーズと抗sFlt-1特異抗体による新規サンドイッチsFlt-1 ELISA法であって、標識された一次抗体を用いる方法の概略を示す図である。この場合には標識二次抗体が不要となるため、図１に示す場合よりも、さらに単純化される。 ヘパリンビーズと特異抗体を用いたsFlt-1 ELISAアッセイの結果を示す写真である。 ヘパリンビーズと特異抗体を用いたsFlt-1 ELISAアッセイの測定値を示す図である。 ヘパリンビーズと特異抗体を用いたsFlt-1 ELISAアッセイの結果を示すグラフである。 ヘパリンビーズと市販の特異抗体を用いたsFlt-1 ELISAアッセイの結果を示す写真である。 ヘパリンビーズと市販の特異抗体を用いたsFlt-1 ELISAアッセイの測定値を示す図である。 酵素としてHRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を用いたsFlt-1 ELISAアッセイの結果を示す写真である。 酵素としてHRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を用いたsFlt-1 ELISAアッセイの測定値を示す図である。 酵素としてHRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を用いたsFlt-1 ELISAアッセイの結果を示すグラフである。 妊娠高血圧症候群患者の血清中 sFlt-1の測定-1（反応温度４℃, 反応時間３時間）の例の結果を示す図である。 妊娠高血圧症候群患者の血清中 sFlt-1の測定-2（反応温度室温（約25℃）,反応時間、約３０分）の例の結果を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、血液中のsFlt-1をサンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法により測定する方法である。ここで本発明のサンドイッチ法を測定原理とした免疫学的測定法とは、標的物質であるsFlt-1をsFlt-1に結合するヘパリンおよび抗sFlt-1抗体を用いて挟み込むように捕捉して、sFlt-1を測定する方法をいい、単にサンドイッチ法ともいう。ヘパリンおよび抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んで形成された複合体をサンドイッチ複合体と呼ぶ。サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法としては、例えばイムノクロマト法、酵素免疫測定吸着法（ELISA（Enzyme-linked immune-sorbent assay）法）、ウエスタンブロット法等が挙げられる。
　なお、本発明において、「測定」という場合、定量、半定量、検出のいずれも含む。
　本発明の方法の一例として、固相化担体にヘパリンを固相化し、該固相化担体にsFlt-1を含む可能性がある検体を添加して接触させ、固相化担体上でヘパリンとsFlt-1の複合体を形成させる。さらに、ヒトsFlt-1に対する特異的抗体（抗sFlt-1抗体）を添加して接触させ、固相化担体上のヘパリンとsFlt-1の複合体に抗sFlt-1抗体を結合させ、担体上のヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体のサンドイッチ複合体を検出すればよい。
　検出は、抗sFlt-1抗体をアルカリフォスファターゼ（ALP)やホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP)等の酵素、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、着色ポリスチレン粒子等の有色粒子や金コロイド等のコロイド粒子などで標識しておき、標識物質が発するシグナルを測定することにより行うことができる。酵素を用いる場合、好ましくは高感度での測定を可能にするホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP)を用いる。測定は、標識が酵素による場合、それぞれの酵素に対する基質を添加し、酵素反応を行わせ、発色を吸光度の測定により測定すればよい。標識が蛍光物質の場合は、蛍光検出器を用いて蛍光を測定すればよい。抗体の標識は公知の方法で行うことができる。
　抗sFlt-1抗体は、マウス単クローン抗体に限らず、ラット、ウサギ、ヤギなど、どのような動物で作製した抗体も利用でき、ポリクローナル抗体でもよい。
　また、抗sFlt-1抗体を標識する代りに、抗sFlt-1抗体に結合する二次抗体であって標識した二次抗体を用いてもよい。この場合、固相担体上にヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体と二次抗体のサンドイッチ複合体が形成され、二次抗体の標識物質から発するシグナルを測定すればよい。二次抗体としては、抗sFlt-1抗体に特異的に結合する抗体を用いることができ、抗マウス免疫グロブリン・ヤギ抗体等のsFlt-1抗体の作製に用いた動物の免疫グロブリンに対する抗体を用いればよい。
　二次抗体を用いる場合のELISA法の概略図を図１に、二次抗体を用いない場合のELISA法の概略図を図２に示す。
　抗体は、FabやF(ab’)2のような免疫グロブリン断片、あるいは、組換え体として発現されたscFv、dsFv、diabody、minibody等の組換え抗体であってもよい。本発明において、「抗体」という語は、これらの断片も含む。これらの断片は公知の方法で調製することができる。
　担体上のヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体のサンドイッチ複合体、あるいはヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体（一次抗体）と二次抗体のサンドイッチ複合体を形成させる場合、最初にヘパリンとsFlt-1の複合体を形成させ、洗浄し、その後抗sFlt-1抗体を添加し、ヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体のサンドイッチ複合体を形成させる２ステップの方法、あるいは最初にヘパリンとsFlt-1の複合体を形成させ、洗浄し、その後抗sFlt-1抗体を接触させヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体のサンドイッチ複合体を形成させ、洗浄し、その後二次抗体を添加し、ヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体（一次抗体）と二次抗体のサンドイッチ複合体を形成させる３ステップの方法で行ってもよいし、各試薬を同時に添加し、サンドイッチ複合体を形成する反応を同時に行う１ステップの方法で行ってもよい。
　ヘパリンとsFlt-1との結合反応、および抗原抗体反応は4℃～45℃、好ましくは20℃～40℃、さらに好ましくは25℃～38℃で行うことができ、また、それぞれの結合反応あるいは１ステップで行うときの反応時間は、10分～18時間、より好ましくは10分～３時間、さらに好ましくは30分～２時間程度である。
　上記の方法は、ヘパリンを担体に固相化して行う方法であるが、サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法においては、ヘパリンと特異抗体の位置を逆向きにすることも可能である。すなわち、抗sFlt-1特異抗体を担体に固相化して、試料中のsFlt-1と結合させ、それに対して適切な大きさのヘパリンであって標識したものを結合させてサンドイッチ複合体を形成させて測定することも可能である。
　すなわち、本発明は、ヘパリンと抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んだサンドイッチ複合体を形成させて検体中のsFlt-1を測定する方法であって、担体に固相化したヘパリンまたは抗sFlt-1抗体に検体を接触させ、該担体上にヘパリンまたは抗sFlt-1抗体と検体中のsFlt-1との複合体を形成させ、該複合体の存在を標識した抗sFlt-1抗体もしくは抗sFlt-1抗体とそれに結合する標識した抗イムノグロブリン抗体、または標識したヘパリンを用いて検出することを含む、検体中のsFlt-1を測定する方法である。
　ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化する担体としては、合成樹脂、合成繊維または天然物由来の繊維等により形成された膜状形成物または立体形成物が挙げられ、具体的にはELISA用マイクロタイタープレート、スライドガラス、ニトロセルロース膜、セルロース膜、セファロース膜、セルロースビーズやセファロースビーズなどの樹脂ビーズ、磁性化ビーズ等種々のものを用いることができる。また、ヘパリンを結合させた市販の樹脂ビーズを用いることもでき、例えば、セファロースビーズにヘパリンを結合した市販のヘパリンビーズ（Heparin Sepharose 6 Fast Flow, 17-0998-01, GE Healthcare）を用いることができる。また、ヘパリンを溶出しないように固定化したゲルや繊維膜を用いてもよい。本発明において、担体として、ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化した樹脂ビーズ等を用い、該樹脂ビーズをELISA用マイクロタイタープレートのウエルに添加して測定する方法もELISAという。ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体の担体への結合は、物理的吸着、官能基を利用した共有結合等、公知の方法で行うことができる。固相化量は、特に限定されないが担体が96ウェルマイクロタイタープレートの場合、1ウエル当たり数ngから数十μgが望ましい。固相化は固相化すべきヘパリンまたは抗sFlt-1抗体の溶液を担体と接触させることにより行うことができる。例えば、マイクロタイタープレートを用いる場合、ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体の溶液をマイクロタイタープレートのウエルに分注し一定時間置くことにより固相化することができる。ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化した後は、アッセイ中の非特異的結合を防ぐためにウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、卵白アルブミン等を含んだブロッキング溶液を用いてブロッキングを行うのが好ましい。
　ヘパリンは、化学的にはグリコサミノグリカンの一種であり、D-グルクロン酸あるいはL-イズロン酸とグルコサミンが1,4結合により重合し二糖の繰り返し単位を形成している高分子物質である。ヘパリンに限らず、ヘパリンに類似した構造を有しsFlt-1に結合する化合物すべてを利用することができる。ヘパリンに類似した構造を有しsFlt-1に結合する化合物として、例えば、ムコ多糖の多糖硫酸化エステルが挙げられ、代表的な物質として、ヘパラン硫酸が挙げられる。sFlt-1はヒトに限らず、マウスにおいてもi13型sFlt-1が血管内皮細胞や胎盤栄養層細胞などから発現し、ヘパリンと結合することが示されている。従って、本発明をマウスsFlt-1測定系にも応用することができる。また、哺乳類、鳥類、両生類のsFlt-1と結合するヘパリンまたはヘパリンと類似構造を有する物質を用いることによりヒトやマウスを含む哺乳類、鳥類、両性類のsFlt-1の測定にも応用することができる。ヘパリンやヘパリンと類似構造を有する物質の由来は限定されず、例えば、ウシやブタの腸粘膜由来のものを用いることができる。
　妊娠高血圧症候群の胎盤では、sFlt-1の短いアイソフォームであるe15a sFlt-1タンパク質およびi13 sFlt-1タンパク質が産生され、これらのタンパク質は、妊娠高血圧症候群の血液中に、正常妊婦の２倍以上、３倍以上、例えば、２～５倍、３～５倍、あるいは５～10倍の濃度で含まれる。本発明の方法において、e15a sFlt-1タンパク質およびi13 sFlt-1タンパク質を区別する必要はなく、どちらを測定してもよい。そのため、抗sFlt-1抗体はe15a sFlt-1タンパク質およびi13 sFlt-1タンパク質の両方に結合するものを用いればよい。本発明において、sFlt-1と言う場合、e15a sFlt-1タンパク質およびi13 sFlt-1タンパク質も含む。
　本発明で測定するsFlt-1は、ヒトsFlt-1に限定されず、ヒトを含む哺乳類、鳥類、両性類のsFlt-1も含む。
　sFlt-1は身体の多くの組織で発現していることから、本発明において、検体は、血清、血漿、全血のみならず、胸水、腹水、脳髄液、唾液、尿など、ほぼ全ての体液を含む。ただし、血液の抗凝固剤としてヘパリンを用いて調製した血漿は、ヘパリン除去後に使用可能となる。
　添加する検体および各試薬の量は数μL～数百μLである。検体は数倍から十数倍に希釈して用いてもよい。
　被験体から採取した検体中のsFlt-1を測定することにより被験体が妊娠高血圧症候群に罹患しているか否かを評価することができ、あるいは評価するための補助的データを得ることができる。すなわち、被験体から採取した検体中のsFlt-1濃度が健常者に比較して高い場合、該被験体は妊娠高血圧症候群に罹患していると評価することができる。
　また、あらかじめ健常人の検体中のsFlt-1を測定しておき、該測定値に基づいてsFlt-1の濃度測定値についてカットオフ値(閾値）を定めておいてもよい。該カットオフ値を基準とし、被験体から採取した検体中のsFlt-1濃度がカットオフ値以上か、またはカットオフ値を超えた場合に、該被験体は妊娠高血圧症候群に罹患していると評価することができる。
　本発明のヘパリンと抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んだサンドイッチ複合体を形成させて検体中のsFlt-1を測定する方法で測定した場合、正常分娩例では血清中のsFlt-1濃度は、12ng/ml程度 (+/- 約7ng/ml)であり、妊娠高血圧症候群症例では平均値56ng/ml程度 (+/- 約33ng/ml)であり、正常分娩例の約4.7倍である。さらに、妊娠37週６日以前に分娩となった前期発症例（いわゆる重症例）では平均値が約70ng/mlであり、正常分娩例の約5.8倍である。さらに、妊娠38週0日以後に出産となった後期発症例ではsFlt-1平均値は約24ng/mlで、正常分娩例の約２倍程度である。
　従って、例えば、血清中のsFlt-1濃度のカットオフ値として、12ng/ml×２～５の値と設定することができる。このカットオフ値は、好ましくは本発明のヘパリンと抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んだサンドイッチ複合体を形成させて検体中のsFlt-1を測定する方法で測定したときの値である。
　また、本発明は、妊娠高血圧症候群を検出するための補助的データを取得する方法も含む。
　本発明は、検体中のsFlt-1を測定するためのキットを包含し、該キットは少なくともヘパリンまたはヘパリンと構造類似性を有する物質を固相化した担体を含み、さらに、標識した抗sFlt-1抗体または抗sFlt-1抗体と該抗sFlt-1抗体に結合する標識した二次抗体を含む。あるいは、該キットは抗sFlt-1抗体を固相化した担体を含み、さらに標識したヘパリンまたはヘパリンと構造類似性を有する物質を含む。
　以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
＜実施例１＞
[ヘパリンビーズと特異抗体を用いたsFlt-1 ELISAアッセイ]
　本発明における新規ELISA測定法が効果を発揮するかどうかを確認するために、アルカリフォスファターゼ標識二次抗体を用いて以下のようなアッセイを試みた。
　ヘパリンビーズ（GE Healthcare）と抗sFlt-1特異抗体（KM1750, Kanno S. et al. Oncogene 19, 2138-46, 2000）によるサンドイッチELISA法により、ヒトe15a型sFlt-１産生ヒト293細胞株の培養上清の測定を行った。定量化されたヒト7N-Flt-1（遺伝子発現ベクターを用いた昆虫細胞株の培養から得られたもので、ヒトFlt-1受容体タンパク質の細胞外領域のうち１～７番目までの７個の免疫グロブリンドメインを含むペプチド. Cell, 151:384-399, 2012.）を対照タンパクとした。
（１）反応溶液の作製
　1mlの溶液中に、(a)0、20または50ngの対照7N-Flt-1タンパク質(100μl生理的食塩水中)、または、sFlt-1試料（ヒトe15a sFlt-１産生293細胞株の培養上清（CM)100μl）、(b)ウシ胎児血清100μl、(c)ヘパリンビーズ25μl、(d)抗ヒトsFlt-1マウス単クローン特異抗体KM1750約75ng、(e)アルカリフォスファターゼ標識の抗マウス免疫グロブリン・ヤギ抗体(KURABO ZT6550)約0.3μl、(f)スキムミルク（雪印-北海道）約100μg、(g)0.1% Tween-20添加生理的食塩水775μlを含む反応溶液を作製した。(a)については、293細胞親株の培養上清や、培地のみ、あるいは、対照7N-Flt-1タンパクとsFlt-1試料を共に加えたものも測定した。
（２）反応溶液の撹拌と遠心による洗浄
　この反応溶液を1.5mlエッペンドルフチューブに入れてふたを閉じ、３～４時間、4℃において緩やかに回転させ、撹拌した。撹拌後、毎分300回転、7～8秒の低速・短時間遠心（２回）によりヘパリンビーズ結合体を沈殿させた。上清を十分に除去した後、洗浄の目的で1mlの0.1% Tween-20を含む生理的食塩水を加え、ふたを閉じ、4℃において緩やかに回転させ、５分間、撹拌した。撹拌後、毎分300回転、7～8秒の低速・短時間遠心（２回）によりヘパリンビーズ結合体を沈殿させ、上清を十分除去した。
（３）アルカリフォスファターゼ反応液による測定
　洗浄したヘパリンビーズ結合体（sFlt-1タンパク質、一次抗体、二次抗体、これら三者が結合していると予想されるもの、約15μl）に、アルカリフォスファターゼ測定試薬 (BCIP-NBT, Nacalai tesque社)を含むアルカリ溶液(pH 8.8) 0.2mlを加え、撹拌した後に96穴プレートに移して反応を観察した。約20～30分後、対照の7N Flt-1タンパク質を含む反応液が青色に変化したことを確認して、プレートリーダーを用いて595nmで計測した。
（４）結果
　結果を図３に写真で示す。全て、同一試料を２回（今回は、１と２、３と４、５と６、７と８、９と１０、１１と１２、１３と１４、１５と１６、１７と１８は同じ内容の試料）測定した。対照の7N Flt-1無添加の反応液（No.１、２）はアルカリフォスファターゼ反応による発色は認められず黄色であるが、7N Flt-1を20ng(No.３、４)、50ng(No.５、６)加えたものではアルカリフォスファターゼ反応により青色となっている。293細胞親株の培養上清(293 CM)(No.７、８)は、ほぼ黄色であり、大きな変化は認められないが、e15a sFlt-1 cDNAを発現させた293細胞株の培養上清（e15a CM)(No.１１、１２)では、青色への変化が認められる。
　また、293細胞親株の培養上清に対照7N Flt-1タンパク質を20ng添加した試料(No.９、１０)では、No.３、４に近い青色反応が得られたことから、培養上清中に非特異的に反応を抑える物質は含まれていないことが理解できる。
　図４に各測定における測定値を示す。
　図４中の、[測定値]にプレートリーダーで測定した数値を示した。[平均値]は、１と２、３と４、５と６、７と８、９と１０、１１と１２、１３と１４、１５と１６の平均値を示した。さらに、[平均値-208]は、sFlt-1を添加していないバックグラウンドのNo.1とNo.2の平均値208を差し引いた値である。図５に示すように、反応液中のsFlt-1量は、20ng以下の場合により良い定量性が期待される。
＜実施例２＞
[ヘパリンビーズと市販の特異抗体を用いたsFlt-1 ELISAアッセイ]
　本発明における新規ELISA測定法が通常市販されている抗sFlt-1抗体によって効果を発揮するかどうかを確認するために、以下のようなアッセイを試みた。
　方法は実施例１と基本的に同じであるが、一次抗体である抗sFlt-1抗体として、実施例１で用いた抗ヒトsFlt-1マウス単クローン抗体KM1750と、それの代わりとして、市販の抗ヒトsFlt-1マウス単クローン抗体(PK-AB704-64426, PromoKine社)の両者を比較した。予備実験から市販抗体は抗体力価がKM1750よりも２分の１程度と考えられたため、抗体量としては２倍量を用いた。その結果を図６に示した。対照として7N Flt-1 20ng、試料としてe15a発現293細胞株の培養上清100μlを測定した。
　図６において結果を写真で示す。[A]の１から８までは実施例１と同じ抗ヒトsFlt-1マウス単クローン抗体KM1750を、[B]の9から16までは市販の抗ヒトsFlt-1マウス単クローン抗体を使用して測定した。対照の7N Flt-1は、No.１、２、３、９、１０、１１では0ngの量を用い、No.４、５、６、１２、１３、１４では20ngの量を用いた。No.７、８、１５、１６では、e15a発現293細胞株の培養上清100μl量を測定した。青色の程度には差があるが、２種類の抗sFlt-1抗体を利用しても7N Flt-1 20ngで弱めの青色反応が認められた（No.４、５、６、１２、１３、１４）。一方、e15a発現293細胞株の培養上清で強い青色反応が認められた(No.７、８、１５、１６)。
　図７に測定値を示す。図７中の[測定値]にプレートリーダーで測定した数値を示した。[平均値]は、１～３、４～６、７と８、９～１１、１２～１４、および１５と１６の平均値を示した。さらに、上半分の[平均値-228] 0、170、435は、sFlt-1を添加していないバックグラウンドのNo.１～３の平均値228を、[平均値] 228、398および663から差し引いた値である。下半分の[平均値-210] 0、78、364は、sFlt-1を添加していないバックグラウンドのNo.９～１１の平均値210を、[平均値]210、288および574から差し引いた値である。e15a発現293細胞株の培養上清100μl中のsFlt-1の量は、２種類の抗体の間で[435/170 x 20]=51ng、[364/78 x 20]=93ngの値となっている。平均すると72ng/0.1ml (720ng/ml)である。以上から、市販の一次抗体（抗sFlt-1抗体）も十分に利用可能であることが明らかとなった。
＜実施例３＞
（１）反応方法
　測定感度を上げるために、実施例１、２で用いたアルカリフォスファターゼ標識二次抗体の代わりに、HRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識二次抗体（ab6789, Abcam社）を用いて測定を行った。sFlt-1量としては、反応チューブ当たり、0、0.1、0.3、1ngを用い、各々について３回の反応を行った。反応液の容量は実施例１、２と同じであるが、一次抗体KM1750 150ng/チューブ、HRP標識二次抗体は約200ng/チューブを用いた。実施例１、２と同様の反応と洗浄の後、HRP測定液(A+B液、R＆D Systems社)200μlを加え、撹拌の後に96穴プレートに移し、約20分間反応の後、595nmで測定した。
（２）結果
　図８に、結果を写真で示す。同一のsFlt-1量を含む試料を３回（１～３、0ng；４～６、0.1ng; ７～９、0.3ng; １０～１２、1 ng）測定した。7N Flt-1無添加の反応液（No.１、２、３）は弱い青色であるが、7N Flt-1量の増加に従って、より強い青色となっている。
（３）測定値
　図９に各測定における測定値を示し、図１０にグラフを示す。7N Flt-1が各々0、0.1、0.3および1ngの測定値の平均は、それぞれ303、386、552および807であり、0ngの平均値を差し引いた値は0.1ngで83であり、0.3ngで249であり、1ngで504となり、ある程度、定量的に増加した。このHRP標識二次抗体を用いることにより、実施例１および２で用いたアルカリフォスファターゼ標識二次抗体法（7N Flt-1 10-50ngを測定）に比較して、約１００倍に感度を上げることが出来た。
＜実施例４＞
[臨床検体の測定]
（１）方法
　本測定法が実際に臨床の患者血清中のsFlt-1を測定できるか、検討した。共同研究契約・倫理委員会承認、同意書作成のもとで某大学病院産婦人科より供与された、正常分娩例５症例、妊娠高血圧症候群症例１３例の血清を測定した。１測定には、血清20μl, 50μl,あるいは100μlを用いた。また、反応液１ml中のヒト血清とウシ血清の合計量を100μlに合わせた。すなわち、ヒト血清20μlの場合はウシ血清を80μl, ヒト血清50μlの場合はウシ血清を50μl, ヒト血清100μlの場合はウシ血清を0μlとした。反応時間は4℃,3時間（測定-1）、あるいは、室温（約25℃）, 30分（測定-2）、として測定した。
（２）結果
　図１１に、妊娠高血圧症候群患者の血清中 sFlt-1の測定-1（反応温度４℃, 反応時間３時間）の例の結果を写真で示す。左のレーンでは、標準のsFlt-1（0ng, 0.3ng, 1ng, 3ng）を測定した。右のレーンでは、妊娠高血圧症候群症例aの分娩前、および、分娩５日後、また、妊娠高血圧症候群症例bの分娩前、および、分娩５日後のsFlt-1を測定した。血清は20μlを用いた。両症例ともに分娩前には血清sFlt-1値が100ng/ml程度の高い値を示したのに対し、分娩５日後でsFlt-1の血清中濃度は速やかに低下することが示された。
　図１２に、妊娠高血圧症候群患者の血清中 sFlt-1の測定-2（反応温度室温（約25℃）,反応時間、約３０分）の例の結果を写真で示す。左のレーンでは、標準のsFlt-1（0ng, 0.3ng, 1ng, 3ng）を測定した。右のレーンでは、妊娠高血圧症候群症例c（分娩２日前と分娩直後）および d（分娩直後と分娩前）の血清を測定した。反応温度４℃、反応時間３時間の例（図１１）と比較すると標準のsFlt-1の青色反応は若干低いが、測定法は標準と試料の反応の相対的な比較であり、測定に全く支障はなかった。
　正常分娩例５症例、妊娠高血圧症候群症例１３例の血清の測定の結果、sFlt-1 濃度（ng/ml血清）は、正常分娩例では平均値12程度 (+/- 約7)、妊娠高血圧症候群症例では平均値56程度 (+/- 約33)となり、本疾患では正常分娩例に比べて約4.7倍の高い値を示した。さらに、妊娠37週６日以前に分娩となった前期発症例（いわゆる重症例の９例）では平均値が約70となり、正常分娩例の約5.8倍であった。一方、妊娠38週0日以後に出産となった後期発症例（４例）ではsFlt-1平均値は約24で、正常分娩例の約２倍程度に留まった。本測定から得られた結果、すなわち、妊娠高血圧症候群患者の血清中sFlt-1の平均が正常分娩症例の2倍～5倍程度となることは、これまでの報告（J. Clin. Invest. 111, 649-658, 2003.; J. Clin. Endocrinol. Metab. 88, 2348-2351, 2003.; およびN. Engl. J. Med. 350, 672-683, 2004.）に添うものであり、この新規sFlt-1測定法が臨床検査に十分に利用できることを示している。
　本発明のsFlt-1測定法は、安価で手技的にも容易で、時間も短縮可能な、臨床的に使い易いsFlt-1スクリーニング法を提供することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (13)

  1. 　ヘパリンと抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んだサンドイッチ複合体を形成させて検体中のsFlt-1を測定する方法であって、担体に固相化したヘパリンまたは抗sFlt-1抗体に検体を接触させ、該担体上にヘパリンまたは抗sFlt-1抗体と検体中のsFlt-1との複合体を形成させ、該複合体の存在を標識した抗sFlt-1抗体もしくは抗sFlt-1抗体とそれに結合する標識した抗イムノグロブリン抗体、または標識したヘパリンを用いて検出することを含む、検体中のsFlt-1を測定する方法。
  2. 　ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化する担体が、合成樹脂、合成繊維または天然物由来の繊維により形成された膜状形成物または立体形成物である、請求項１記載のsFlt-1を測定する方法。
  3. 　ELISA法またはイムノクロマト法である、請求項１または２に記載のsFlt-1を測定する方法。
  4. 　ヘパリンを結合したビーズを用いる、請求項１～３のいずれか１項に記載のsFlt-1を測定する方法。
  5. 　ヘパリンの代りに、ヘパリンと構造類似性を有し、ヒトを含む哺乳類、鳥類、両生類のsFlt-1と結合する物質を用いる、請求項１～４のいずれか１項に記載のsFlt-1を測定する方法。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の方法で、被験体から採取した検体中のsFlt-1を測定し、検体中のsFlt-1濃度が健常者に比較して高い場合、該被験体は妊娠高血圧症候群に罹患していると評価する、妊娠高血圧症候群の検出方法。
  7. 　少なくともヘパリンもしくは抗sFlt-1抗体を固相化した担体、ならびに標識した抗sFlt-1抗体もしくはヘパリンを含む、検体中のsFlt-１を測定するためのキット。
  8. 　少なくともヘパリンを固相化した担体、抗sFlt-1抗体および該抗sFlt-1抗体に結合する標識した二次抗体を含む、検体中のsFlt-１を測定するためのキット。
  9. 　ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化する担体が、合成樹脂、合成繊維または天然物由来の繊維により形成された膜状形成物または立体形成物である、請求項７または８に記載の検体中のsFlt-１を測定するためのキット。
  10. 　ELISA法キットまたはイムノクロマト法キットである、請求項７～９のいずれか１項に記載のsFlt-1を測定するためのキット。
  11. 　ヘパリンを結合したビーズを用いる、請求項７～１０のいずれか１項に記載のsFlt-1を測定するためのキット。
  12. 　ヘパリンの代りに、ヘパリンと構造類似性を有し、ヒトを含む哺乳類、鳥類、両生類のsFlt-1と結合する物質を用いる、請求項７～１１のいずれか１項に記載のsFlt-1を測定するためのキット。
  13. 　妊娠高血圧症候群を検出するための、請求項７～１２のいずれか１項に記載のsFlt-1を測定するためのキット。
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