WO2009142303A1 - 食細胞の機能評価方法 - Google Patents

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克紀 内藤
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持田製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a novel method for evaluating the function of phagocytic cells and a method for detecting diseases associated with phagocytic phagocytosis.
  • a phagocytic cell is a general term for cells having phagocytic activity.
  • Specialized phagocytic cells such as neutrophils, macrophages, and dendritic cells, whose main role is phagocytosis in vivo, and non-specialized phagocytes that exhibit phagocytic activity depending on the situation (amateur phagocyte) Broadly divided.
  • Non-specialized phagocytic cells include brain microglial cells, liver Kupffer cells, testicular Sertoli cells, and the like.
  • White blood cells are cellular components contained in blood, and are mainly composed of granulocytes (about 60%), lymphocytes (about 25%), and monocytes (about 5%). Granulocytes are further classified into neutrophils, eosinophils, and basophils, but the number of neutrophils is the largest, and about half of leukocytes are neutrophils. Monocytes migrate to each tissue to become macrophages. Leukocytes contain many phagocytic cells and can be easily isolated, so that they are preferably used as phagocytic resources.
  • Phagocytosis goes through a series of steps: recognition of foreign bodies by phagocytes, entrapment of foreign bodies, formation of phagosomes, digestion of foreign bodies in the phagosome, absorption or excretion of digested substances. Phagocytosis is not only caused by foreign substances such as bacteria and fungi, but is also related to the removal of unnecessary self-derived substances such as residues of self-tissues at the site of inflammation and obsolete autologous cells.
  • a phagocytic cell may not only digest the phagocytic substance inside the cell, but may also release active oxygen and proteolytic enzymes to the outside of the cell with phagocytosis. This allows efficient local sterilization and tissue digestion, but on the other hand, excessive phagocytosis may destroy the self tissue.
  • RA rheumatoid arthritis
  • cells that engulfed the autoimmune complex excessively are observed, and proteolytic enzymes released from the RA cells damage the tissue, causing arthritis. It is known to be involved in the progression.
  • Methods for measuring the phagocytic function of phagocytic cells include contacting phagocytic cells with latex particles, and counting latex particles incorporated into the cells by cytometry or microscopy, or phagocytic substances with fluorescent labels (E. coli, zymosan). Phagocytosed by phagocytic cells and the amount taken up into the cells is detected, after phagocytosing viable bacteria, the number of remaining viable bacteria is confirmed by culture, and the activity released upon phagocytosis A method for detecting light emission by oxygen is known.
  • CD14 molecule is a glycoprotein identified as one of differentiation markers expressed on monocyte membranes, and is known to have a function as a receptor for LPS (lipopolysaccharide) (non-patented). Reference 1).
  • LPS lipopolysaccharide
  • CD14 molecules membrane-bound CD14 (mCD14) and soluble CD14 (sCD14) expressed on the cell surface.
  • mCD14 membrane-bound CD14
  • sCD14 soluble CD14
  • SCD14 having a molecular weight of about 55 kDa and about 49 kDa is sepsis (SEPSIS), acquired immune deficiency syndrome (AIDS), acute respiratory distress syndrome (ARDS), systemic lupus erythematosus (SLE), etc. It has been reported to show high levels in patients' blood in many diseases. Therefore, it is considered that these sCD14 are not disease-specific markers (Non-Patent Documents 5 to 6). On the other hand, it has been reported that sCD14-ST (soluble CD14 antigen subtype) exists as a new molecular species of sCD14 whose blood concentration is characteristically increased in septic patients.
  • SEPSIS sepsis
  • AIDS acquired immune deficiency syndrome
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • SCD14-ST is characterized in that it migrates to a molecular weight of 13 ⁇ 2 kDa in SDS-PAGE under non-reducing conditions, and retains the N-terminal part of CD14. Compared with high molecular weight sCD14, it has an amino acid sequence that is largely deleted on the C-terminal side, and unlike high molecular weight sCD14, it does not have LPS binding ability. Moreover, since sCD14-ST shows immunogenicity different from high molecular weight sCD14, both can be distinguished using an antibody. The blood concentration of sCD14-ST specifically increases in septic patients (Patent Document 1).
  • Non-patent Document 7 sCD14-ST is a specific diagnostic marker for sepsis, as compared with a patient with systemic inflammatory response (SIRS), which is difficult to distinguish from sepsis, and shows a high level in the blood of a sepsis patient.
  • a disease associated with a local phagocytic reaction eg, rheumatoid arthritis
  • the degree of phagocytic reaction can be measured by measuring a marker molecule in a sample such as a body fluid, it will be useful for diagnosis of the disease.
  • it is easy to measure the humoral factor in the specimen, but no humoral factor having a phagocytosis-specific stability suitable for measurement has been known so far.
  • SCD14-ST was known to be a disease marker that is elevated in plasma of sepsis patients, but its production mechanism was not clear. Under such circumstances, the present inventors have found that blood sCD14-ST does not increase in endotoxin-induced rabbit sepsis model animals, but increases in rabbit sepsis model animals (CLP (cecal serosa detachment) model) caused by live bacteria infection. It was. From this experimental fact, it was found that the activation of leukocytes by endotoxin alone is insufficient for the production of sCD14-ST, and the phagocytosis process of bacteria by leukocytes is important.
  • CLP rabbit sepsis model animals
  • sCD14-ST in vitro, the relationship between various leukocyte stimulating substances and the amount of sCD14-ST produced was examined in detail. As a result, sCD14-ST was produced only when a substance that causes phagocytic activity on leukocytes was added. It was found that it decreases by adding an inhibitory substance. Furthermore, the inventor found that sCD14-ST in the synovial fluid was increased with the onset of arthritis in rabbit arthritis model animals.
  • sCD14-ST is a liquid factor that is specific for phagocytosis and has stability suitable for measurement.
  • the present invention provides a new method for evaluating the function of phagocytes.
  • (1-1) A method for evaluating the function of phagocytic cells, comprising measuring sCD14-ST produced by phagocytic cells.
  • (1-2) The method according to (1-1) above, wherein the phagocytic function is phagocytic ability.
  • (1-3) The method according to (1-1) or (1-2) above, which comprises a step of bringing a phagocytic substance into contact with a phagocytic cell.
  • (1-4) A method for evaluating the function of phagocytic cells, comprising the following steps: 1) contacting phagocytic cells with phagocytic substances, 2) a step of measuring sCD14-ST produced by phagocytic cells, and 3) a step of comparing the measured value with a standard value to determine the presence and / or extent of phagocytic phagocytic activity.
  • (1-5) The method according to any one of (1-1) to (1-4) above, wherein the phagocytic cells are neutrophils, granulocytes and / or leukocytes.
  • the present invention provides various detection / evaluation methods by evaluating the function of a phagocyte derived from a subject.
  • a method for detecting a disease accompanied by abnormal phagocytic function by evaluating phagocytic function 1) a step of evaluating the function of a phagocyte derived from a subject by the method according to any one of (1-1) to (1-6) above, 2) a step of comparing the evaluated result with a normal value, and 3) a step of determining the presence and / or extent of a disease depending on whether the function of a phagocyte derived from a subject is higher or lower than the normal value
  • a method comprising the steps of:
  • An evaluation method of immune function by evaluating the function of phagocytic cells 1) a step of evaluating the function of a phagocyte derived from a subject by the method according to any one of (1-1) to (1-6) above, 2) a step of comparing the evaluated result with a normal value, and 3) a step
  • the present invention also provides a screening method for a phagocytic function regulating substance.
  • a screening method for a phagocytic function-regulating substance comprising the following steps: 1) A step of bringing a phagocyte into contact with a test substance, 2) a step of measuring sCD14-ST produced by phagocytic cells, and 3) a step of evaluating the effect of the test substance on the phagocytic ability of phagocytic cells.
  • (3-2) The method according to (3-1) above, wherein the phagocytic cell is contacted with the test substance in the presence of a phagocytic substance.
  • (3-3) The method according to any one of (3-1) to (3-2) above, wherein the phagocytic cells are neutrophils, granulocytes and / or leukocytes.
  • the present invention also provides a method for detecting a disease associated with phagocytosis by phagocytic cells.
  • a method for detecting a disease associated with phagocytosis by phagocytic cells comprising the following steps: 1) a step of measuring sCD14-ST contained in a subject-derived specimen (excluding blood), 2) a step of comparing the measured value with a normal value, and 3) a step of determining whether or not the amount of sCD14-ST in the sample is higher than the normal value.
  • (4-2) The method according to (4-1) above, wherein sCD14-ST is measured after adding a phagocytic substance to the specimen.
  • (4-3) The method according to (4-1) or (4-2) above, wherein the disease associated with phagocytosis by phagocytic cells is rheumatoid arthritis and the specimen is joint fluid.
  • (4-4) The method according to (4-1) or (4-2) above, wherein the disease associated with phagocytosis by phagocytic cells is mastitis, and the specimen is milk.
  • (4-5) The method according to any one of (4-1) to (4-4) above, wherein the phagocytic cells are neutrophils, granulocytes and / or leukocytes.
  • the function of phagocytic cells can be specifically and easily measured by measuring sCD14-ST, which is a humoral factor released from phagocytic cells upon phagocytosis.
  • sCD14-ST which is a humoral factor released from phagocytic cells upon phagocytosis.
  • the phagocytosis function-regulating substance can be screened using the measurement system.
  • a disease associated with phagocytosis by phagocytic cells can be specifically and easily detected.
  • the dose-dependent reactivity of recombinant rabbit sCD14-ST in the sCD14-ST measurement system described in Example 3 is shown.
  • the horizontal axis represents the recombinant sCD14-ST concentration (pg / mL), and the vertical axis represents the absorbance.
  • the measurement result of blood sCD14-ST before and after LPS administration in the LPS-loaded rabbit sepsis model described in Example 4 is shown.
  • the vertical axis shows blood sCD14-ST concentration (pg / mL).
  • the measurement result of blood sCD14-ST before and after surgery in the rabbit sepsis model due to live bacterial infection described in Example 4 is shown.
  • the vertical axis shows blood sCD14-ST concentration (pg / mL).
  • the state of sCD14-ST production when rabbit granulocytes described in Example 5 are stimulated with various leukocyte stimulants is shown.
  • the mode of high molecular weight sCD14 production when rabbit granulocytes described in Example 5 are stimulated with various leukocyte stimulants is shown.
  • the effect of a phagocytic inhibitor on sCD14-ST production when rabbit granulocytes described in Example 5 are stimulated with a phagocytic substance is shown.
  • cleaning liquid of a rabbit arthritis model described in Example 6 is shown.
  • Example 7 The state of sCD14-ST production when human granulocytes described in Example 7 are stimulated with various leukocyte stimulants is shown.
  • sCD14-ST (soluble CD14 antigen subtype)
  • the present invention is based on the finding that sCD14-ST is produced in the process of phagocytosing and digesting foreign microorganisms and foreign substances.
  • sCD14-ST is characterized in that it migrates to a molecular weight of 13 ⁇ 2 kDa under SDS-PAGE under non-reducing conditions, and retains the amino acid sequence at the N-terminal part of CD14.
  • sCD14-ST shows an immunogenicity different from that of high molecular weight sCD14.
  • human high molecular weight sCD14 is recognized by 3C10 antibody (ATCC TIB-228), but human sCD14-ST does not bind to 3C10 antibody.
  • Such an antibody is a peptide antibody having a peptide at a specific site of sCD14-ST as an epitope.
  • the specific site is a region between ⁇ 3 and ⁇ 4 in the secondary structure of CD14 (Kim et al., Journal of Biological Chemistry, 280: 11347-11351, 2005.).
  • human CD14 SEQ ID NO: 1
  • rabbit CD14 SEQ ID NO: 2
  • mouse CD14 SEQ ID NO: 3
  • bovine CD14 (SEQ ID NO: 4), the 36th to 77th amino acid sequence corresponds.
  • An antibody is produced using a peptide consisting of a sequence of 8 or more amino acids in the region as a antigen.
  • Preferable examples include a peptide consisting of 16 amino acids 53 to 68 of human CD14 and a peptide consisting of 20 amino acids 40 to 59 of rabbit CD14.
  • the high molecular weight sCD14 has a ⁇ sheet structure or an ⁇ helix structure in the ⁇ 3- ⁇ 4 region (including ⁇ 3- ⁇ 2- ⁇ 3- ⁇ 4), but sCD14-ST is largely lacking on the C-terminal side compared to the high molecular weight sCD14. Since it has the lost sequence, the original three-dimensional structure cannot be maintained in the ⁇ 3- ⁇ 4 region, and the difference in the three-dimensional structure is considered to cause a difference in antibody recognition. It is done.
  • sCD14-ST is characterized by being migrated to a molecular weight of 13 ⁇ 2 kDa in SDS-PAGE under non-reducing conditions, and in addition to retaining the amino acid sequence at the N-terminal part of CD14, it has a specific immunogenicity Can be characterized by.
  • the specific immunogenicity is recognized by an antibody prepared using a peptide consisting of a sequence of 8 or more amino acids in the ⁇ 3- ⁇ 4 region of CD14 as an antigen.
  • sCD14-ST is a factor that specifically increases blood concentration in sepsis due to live bacterial infection or in a sepsis model.
  • human sCD14-ST migrates to a molecular weight of 13 ⁇ 2 kDa in SDS-PAGE under non-reducing conditions, and has the first to eighth amino acid sequences of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 at the N-terminal sequence. 1. It specifically binds to an antibody that binds to a peptide consisting of the 16th amino acid residue at positions 53 to 68 of the amino acid sequence described in 1.
  • an antibody that binds to a peptide consisting of the 17th to 26th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, does not bind to 3C10 antibody, does not bind to MEM-18 antibody, LPS binding ability Any one or more of the following characteristics may be added: absence of sucrose, obtainability from human serum, and specific increase in blood concentration in septic patients.
  • sCD14-ST retains the amino acid sequence at the N-terminal part of CD14, when sCD14-ST is isolated and analyzed for the N-terminal amino acid sequence, it has the same amino acid sequence as the N-terminal part of CD14. Can be confirmed. It suffices that at least the first to eighth amino acid sequences from the N-terminus are identical. For example, in the case of humans, it can be confirmed that the first to eighth sequences of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are held at the N-terminus. 1 to 8 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 for rabbits, 1 to 8 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 for mice, and 1 to 8 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 for bovines. Is held at the N end.
  • the phagocytic cells in the present invention are not particularly limited as long as they are cells derived from mammals and have phagocytic activity, but neutrophils are preferred.
  • white blood cells or granulocytes may be used as a sample containing neutrophils.
  • An isolated cell line having a function of differentiating into granulocytes may be used, and HL-60 is mentioned as an example.
  • mammals include humans, rabbits, mice, rats, monkeys, cows, pigs, sheep, goats, horses, dogs and cats.
  • Phagocytic cells can be prepared from body fluids such as blood, tissue fluid, lymph fluid, joint fluid, milk, cerebrospinal fluid, pus, saliva, tear fluid, mucus, nasal discharge, sputum, urine, ascites, amniotic fluid, semen and the like. It can also be prepared from a washing solution after washing the nasal cavity, bronchi, lungs, skin, abdominal cavity, various organs, joints, bones and the like. In addition, phagocytic cells can be prepared from tissues such as skin, lungs, kidneys and mucous membranes.
  • phagocytic cells When preparing phagocytic cells from a living body, only phagocytic cells may be strictly isolated or used, or a fraction containing phagocytic cells may be prepared and used. For example, leukocytes prepared from blood, granulocytes prepared from blood, granulocytes prepared from an abdominal cavity washing solution, and the like can be used as phagocytic cells used in the method of the present invention.
  • a phagocytic function is a physiological function possessed by a phagocytic cell.
  • phagocytic ability is used as an index of phagocyte activity, and phagocytic function is evaluated.
  • phagocytic cells have various functions such as cytokine production ability and migration ability, but the common function of phagocytic cells is phagocytic ability. Therefore, phagocytic ability is preferably used as an index to determine whether or not phagocytic cells have normal functions as cells.
  • evaluating the phagocytic ability of phagocytic cells leads to evaluating the immune function of phagocytic cells.
  • one of the preferred embodiments of the present invention is a method for measuring the phagocytic ability of neutrophils, granulocytes and / or leukocytes.
  • Another preferred embodiment of the present invention is a method for evaluating immune function by measuring the phagocytic ability of neutrophils, granulocytes and / or leukocytes.
  • the phagocytic function evaluation method of the present invention is characterized by measuring sCD14-ST produced by phagocytic cells.
  • sCD14-ST is useful as a marker for evaluating phagocytic cell function.
  • Phagocytic cells produce sCD14-ST with phagocytic activity. Phagocytosis of phagocytic cells begins with the contact of phagocytic cells with phagocytic substances.
  • the phagocytic substance causes phagocytic activity in phagocytic cells
  • the phagocytic activity here means at least the process of phagocytic substance uptake (phagocytosis) by the phagocytic cell and the process of digesting the incorporated substance in the cell.
  • phagocytic substances that are taken up and digested by phagocytic cells include bacterial bodies such as bacteria and fungi, zymosan, and the like.
  • substances that are not digested even if taken up such as microbeads and latex beads, do not correspond to the phagocytic substances in the present invention.
  • SCD14-ST is measured on a solution containing phagocytes or the supernatant of the solution.
  • the solution here refers to a medium, a cell fraction, a cell assay solution, a physiological saline, a body fluid, and the like.
  • the prepared phagocyte-containing solution or its supernatant can be directly measured to Can evaluate functions.
  • the phagocytic substance When the phagocytic substance is brought into contact with the phagocytic cell, the phagocytic substance may be added to the solution containing the phagocytic cell. Or you may add the solution containing a phagocytic cell to the container by which the phagocytic substance was couple
  • the phagocytic substance zymozan is preferably used from the viewpoint of easy handling.
  • the measurement of sCD14-ST is not particularly limited as long as it can detect sCD14-ST, but it is preferably measured by an immunological measurement system using an antibody that specifically binds to sCD14-ST.
  • the immunological measurement system can be preferably selected from a direct adsorption method, a sandwich method, an aggregation method, a solid phase binding method, a solution reaction method, and the like.
  • a particularly preferred method is the sandwich method (sandwich immunoassay).
  • Sandwich immunoassay is a method of measuring by forming an antibody-antigen-antibody complex using two or more types of antibodies that recognize different sites of the protein to be measured.
  • a known technique can be used for the sandwich immunoassay.
  • For the principle, application, and improvement of the measurement method see, for example, “Super Sensitive Enzyme Immunoassay” written by Eiji Ishikawa, Society of Publishing Press (1993), edited by Nao Matsuhashi et al. "Application to therapeutic drug development", Management Education Publishing (1985), Eiji Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (3rd edition), Medical School (1987).
  • An antibody that specifically binds to sCD14-ST is an antibody that binds to a peptide consisting of a sequence of 8 or more amino acids in the region between ⁇ 3 and ⁇ 4 in the secondary structure of CD14.
  • examples of such antibodies include the S68 antibody described in International Publication WO2005 / 108429, the F1301-9-1 antibody described in Example 1 of the present specification, and the like.
  • sandwich immunoassay another kind of antibody is required, but the specificity is not particularly limited as long as it is an antibody that binds to sCD14-ST.
  • Antibodies that recognize both high molecular weight sCD14 and sCD14-ST can also be used.
  • antibodies examples include the F1106-13-3 antibody and the F1031-8-3 antibody described in International Publication WO2005 / 108429, the F1258-7-2 antibody described in Example 2 of the present specification, and the like. It is done. These antibodies may be polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, and are not particularly limited. When using a sandwich immunoassay, monoclonal antibodies are preferred. Further, it may be a fragment of the monoclonal antibody. The antibody fragment referred to here is one of Fab, Fab ′, and F (ab ′) 2 of the monoclonal antibody.
  • a complex of sCD14-ST and an antibody is formed, and then the presence of sCD14-ST is measured by detecting the formed complex with a label.
  • the label may be peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, oxidase, uricase, or other enzyme, acridinium or a derivative thereof, chemiluminescent material such as aequorin or a variant thereof, FITC, europium (Eu), or samarium (Sm).
  • Fluorescent substances such as lanthanoids, dyes, colloidal gold, colored latex, or isotopes may be used.
  • a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, a colored label, or an isotope When a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, a colored label, or an isotope is used as a label, it can be optically measured by a measuring instrument corresponding to the label.
  • a dye, gold colloid or colored latex is used as a label and measurement is performed with a kit using an immunochromatography method or a flow-through method, the measurement can be performed visually.
  • kits can also be provided in the form of a kit.
  • the kit includes an antibody that specifically binds to sCD14-ST as an essential element, and further includes a component for detecting a complex formed after forming a complex of sCD14-ST and an antibody.
  • insoluble carriers plastic plates, latex particles, etc.
  • labeling enzymes such as peroxidase
  • labeling substances such as gold colloids
  • coloring substances such as tetramethylbenzine (TMB), and the like for increasing detection sensitivity
  • TMB tetramethylbenzine
  • Specific binding substances such as biotin-streptavidin, blocking agents, diluents, washing solutions, standard substances, etc. may be included.
  • sCD14-ST Qualitatively and / or quantitatively measure sCD14-ST in a solution containing phagocytes or in the supernatant of the solution.
  • the measured result is compared with a standard value to determine the presence and / or amount of sCD14-ST.
  • the presence and / or extent of phagocytic activity of phagocytes is determined from the presence and / or amount of sCD14-ST.
  • the standard value can be appropriately determined according to the purpose of measurement. For example, a negative standard value is a measured value of a solution containing no phagocytic cells, a solution before contact with a phagocytic substance, or the supernatant of those solutions.
  • a calibration curve obtained from a measured value of a standard substance of sCD14-ST can be used as a standard value.
  • the phagocytic ability of phagocytes is evaluated by comparing the measured value of the sample with a calibration curve and quantifying sCD14-ST in the sample.
  • the level of phagocytic function in the sample, the degree of activation, and the like can be evaluated.
  • sCD14-ST purified from blood, sCD14-ST produced by phagocytic stimulation of phagocytes, recombinant sCD14-ST, peptide synthesized sCD14-ST, etc. can be used.
  • a method for purifying sCD14-ST and a method for producing a recombinant are described in International Publication No. WO2005 / 108429.
  • phagocytic cells When phagocytic cells are used for regenerative medicine, they can be used as an index for evaluating cell quality.
  • An evaluation step may be included, and the presence and / or degree of the disease is determined based on the step of comparing the evaluation result with a normal value, and whether the function of the phagocyte derived from the subject is higher or lower than the normal value.
  • a process can further be included.
  • the normal value is obtained by measuring the function of a phagocytic cell derived from a subject not suffering from a disease in advance, that is, a normal subject, and taking the average value or range of the measurement result. Standardized values can be used. In comparing the measured value of the sample with the normal value, it is possible to compare the level as it is, but the measured value of the sample is higher than the cut-off value with the average value ⁇ 2SD or ⁇ 3SD of normal subjects as the cut-off value. Or when it is low, it can be judged that there is a dysfunction of phagocytes. The degree of disease progression and / or disease severity can also be evaluated based on the magnitude of the measured value.
  • Diseases with phagocytic dysfunction include, for example, uremia, decreased serum opsonin activity, complement deficiency, congenital phagocytic dysfunction, chronic granulomas, myeloperoxidase deficiency, leukemia, malignant lymphoma, bacterial intracardiac Examples include membrane inflammation, diabetes, and cirrhosis.
  • Chronic granuloma is a congenital phagocytic dysfunction that is deficient in the production of active oxygen in neutrophils and thus repeats severe bacterial and fungal infections.
  • Neutrophils derived from patients with chronic granulomas have phagocytosis (foreign substance uptake) but no digestive function. Therefore, abnormalities cannot be detected by examination using latex bead uptake, but abnormal phagocytic functions can be detected by phagocytic evaluation using sCD14-ST production as an index.
  • the method for evaluating immune function is the same as that for detecting / evaluating diseases associated with phagocytic dysfunction described above.
  • the function of phagocytic cells, particularly phagocytosis is an important biological defense mechanism that works at the earliest stage in the immune response of the living body, and dysfunctional functions of phagocytes lead to abnormal immune functions. What is necessary is just to apply dysfunction of a phagocyte as an immune function.
  • Method for evaluating phagocytic function The step of evaluating the function of phagocytic cells can be included, the step of comparing the evaluated result with the normal value and / or the evaluation result before administration of the drug, and the function of the phagocyte derived from the subject by administration of the drug.
  • the method may further include a step of determining the presence and / or degree of the change.
  • the normal value here is a result of measuring the function of a phagocyte derived from a normal subject, and is as described above.
  • an immunosuppressant, immunostimulant, anticancer agent, etc. is administered, whether the drug is acting effectively by detecting changes in phagocyte function during and / or after drug administration, Alternatively, it is possible to confirm how many side effects are caused by the drug, and it is possible to obtain useful guidelines for drug selection and dosage.
  • the degree of effect of a drug can be evaluated using the degree of change in phagocyte function, that is, the magnitude or smallness of change in the amount of sCD14-ST production. For example, the phagocytic ability of neutrophils in peripheral blood can be compared before and after the administration of G-CSF to evaluate how much normal functioning neutrophils have increased by the administration of G-CSF.
  • phagocytic cells When phagocytic cells are used for regenerative medicine, when the quality of the cells is evaluated, the phagocytic ability of the phagocytic cells used is measured using sCD14-ST production as an index, so that the cells have normal functions and / or Alternatively, cell activity can be assessed.
  • Regenerative medicine here refers to autologous cell transplantation in which autologous leukocytes are cultured and treated outside the body and then returned to the subject, and autologous cell transplantation in which leukocytes from normal donors are transplanted into patients. It is done. After preparing cells for transplantation, the method described in the section of “2. Method for evaluating the function of phagocytes” can be used to test whether the cells have a certain quality.
  • the function of the prepared cells is compared with a reference value, and if the reference value is satisfied, it is determined that the quality is usable.
  • the reference value can be appropriately set according to the purpose of regenerative medicine, but it is usually sufficient to compare with the phagocytic ability of normal phagocytic cells. When it is lower than the reference value, it can be judged that the quality is not suitable for transplantation because the function of the phagocytic cell or the activity of the cell is lost in the preparation process.
  • the phagocytic function regulating substance can be screened using the method described in the above section “2. That is, the present invention provides a screening method for a phagocytic function-regulating substance, which comprises the following steps. 1) A step of bringing a phagocyte into contact with a test substance, 2) a step of measuring sCD14-ST produced by phagocytic cells, and 3) a step of evaluating the effect of the test substance on the phagocytic ability of phagocytic cells. In the step of 1) contacting the phagocytic cell with the test substance, the phagocytic cell and the test substance may be contacted in the presence of the phagocytic substance.
  • a phagocytic function-regulating substance is a substance that promotes or suppresses phagocytic activity of phagocytic cells.
  • sCD14-ST produced by phagocytic cells is measured by contacting phagocytic cells using wortmannin or cytochalasin D as known test substances, which are known phagocytic function-inhibiting substances.
  • wortmannin or cytochalasin D as known test substances
  • a substance to be examined for phagocytic function regulating activity can be contacted with phagocytic cells as a test substance, and the effect on phagocytic ability can be evaluated using the production amount of sCD14-ST as an index.
  • the present invention also provides a method for detecting a disease associated with phagocytosis by phagocytic cells.
  • the detection method measures sCD14-ST contained in a specimen derived from a subject, compares the measured value with a normal value, and determines whether or not the amount of sCD14-ST in the specimen is higher than the normal value.
  • the subject is not particularly limited as long as it is a mammal, but can be a mammal such as a human, monkey, rat, mouse, rabbit, cow, pig, sheep, goat, horse, dog, or cat.
  • a disease associated with phagocytosis by phagocytic cells is a disease in which phagocytic activity by phagocytic cells occurs in the affected area.
  • it is a disease in which local autoimmune reactions and phagocytosis associated with infection occur.
  • local diseases such as autoimmune disease, rheumatoid arthritis, mastitis, gout, glomerulonephritis, ulcerative colitis, Mediterranean fever, otitis media, rhinitis, pneumonia, tuberculosis, cystitis, amniotic fluid infection, or purulosis
  • diseases associated with systemic infection and sepsis are excluded.
  • Samples include body fluids such as tissue fluid, lymph fluid, joint fluid, milk, cerebrospinal fluid, pus, saliva, tears, mucus, runny nose, sputum, urine, ascites, amniotic fluid, semen, nasal cavity, bronchial, lung, skin
  • body fluids such as tissue fluid, lymph fluid, joint fluid, milk, cerebrospinal fluid, pus, saliva, tears, mucus, runny nose, sputum, urine, ascites, amniotic fluid, semen, nasal cavity, bronchial, lung, skin
  • a washing solution after washing the abdominal cavity, various organs, joints, bones and the like can be used.
  • blood is excluded in the present invention.
  • the measuring method of sCD14-ST is the above-mentioned 2.
  • a normal value use a value that is standardized by, for example, obtaining a result obtained by measuring a specimen from a subject who does not suffer from a disease in advance, that is, a normal subject, and taking an average value or a range of the measurement result. Can do. If the measured value of a sample from a normal subject is almost the same as the background value of the measurement system, standardize the value by setting the average value or range of the background value in the measurement system. It may be used.
  • the background value in the measurement system is a measurement value when a buffer or an assay solution is added to the measurement system instead of a specimen.
  • the level In comparing the measured value of the sample with the normal value, the level can be compared as it is, but when the measured value of the sample is higher than the cutoff value with the average value + 2SD or + 3SD of normal subjects as the cutoff value, It can also be judged as positive. Further, it can be determined that the higher the measured value, the higher the degree of progression of the disease and / or the degree of serious injury of the disease.
  • Specimens may or may not contain phagocytic cells.
  • the degree of phagocytosis in vivo that is, the presence and / or degree of disease can be evaluated. This is one of the reasons that sCD14-ST produced as a result of phagocytic activity of phagocytic cells in vivo is present in the specimen.
  • sCD14-ST produced as a result of phagocytic activity of phagocytic cells in vivo is present in the specimen.
  • diseases associated with inflammation in the joint specifically rheumatoid arthritis, osteoarthritis, periarthritis, etc. Diagnosis is possible. This is one of the reasons that an increase in sCD14-ST concentration in joint fluid or joint washing fluid can be detected.
  • a phagocytic substance may be added to the specimen and the produced sCD14-ST may be measured.
  • a phagocytic substance can be added to milk and sCD14-ST produced can be measured to diagnose mastitis. It is particularly useful for detecting bovine mastitis.
  • Example 1 Preparation of F1301-9-1 Antibody Using Synthetic Peptide as Antigen 1-
  • Peptide as Antigen Sequence of SEQ ID NO: 5 (Sequence from Position 40 to Position 59 of Rabbit CD14 Amino Acid Sequence)
  • cysteine was inserted into the N-terminus and synthesized using a peptide synthesizer ABI433A (Applied Biosystems). Purification by a conventional method gave 2-3 mg as a purified peptide.
  • peptide prepared in 1- (1) is dissolved in distilled water at 10 mg / mL, mixed with an equal amount of 10 mg / mL Image Maleimide Activated Bovine Serum Albumin (BSA) (PIERCE), and reacted at room temperature for 2 hours.
  • BSA Image Maleimide Activated Bovine Serum Albumin
  • the peptide and the carrier protein were bound (referred to as peptide-BSA of SEQ ID NO: 5).
  • peptide-KLH of SEQ ID NO: 5 was diluted with 200 ⁇ L of physiological saline and again administered to the footpad.
  • lymphocytes were separated from the iliac lymph nodes, and the resulting lymphocytes were mixed with Sp2 / O-Ag14 (ATCC CRL-1581), and then using the polyethylene glycol Minami Ando and Takeshi Chiba / work Cell fusion was performed according to the method described in “Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures” (Kodansha). Hybridomas were selected using a HAT medium, and one week later, hybridomas producing the desired antibody were selected by ELISA.
  • the peptide-BSA of SEQ ID NO: 5 was diluted to 10 ⁇ g / mL with 0.076 M phosphate buffer (pH 7.4) (hereinafter referred to as D-PBS), and 50 ⁇ L / well on an immunoplate (Maxisorb, Nunc). Added. After reacting overnight at 4 ° C., it was washed 5 times with ion-exchanged water. 100 ⁇ L of D-PBS (pH 7.4) containing 2% Stabilgurd was added to each well for blocking. Next, the culture supernatant of the hybridoma was added to each well and reacted at 37 ° C. for 1 hour, followed by washing with physiological saline containing 0.05% Tween 20 three times.
  • D-PBS 0.076 M phosphate buffer
  • Peroxidase-labeled anti-rat immunoglobulin antibody was diluted 1000-fold with D-PBS (pH 7.4) containing 10% rabbit serum, and 50 ⁇ L was added to each well. After reacting at 37 ° C. for 1 hour, it was washed three times in the same manner. A TMB solution (BioFX) was added to each well, reacted at room temperature for 10 minutes, and then stopped with a 0.5 M sulfuric acid solution. Absorbance at 450 nm was measured with a plate spectrophotometer (NJ-2100, Nippon Intermed). Cells in wells where an increase in absorbance was observed were selected and cloned by the limiting dilution method. After 11 days, screening was carried out in the same manner to obtain clone F1301-9-1 producing an antibody that reacts with the peptide of SEQ ID NO: 5.
  • Example 3 Production of Rabbit sCD14-ST Measurement System
  • the antibodies described in Examples 1- (4) and 2- (4) were used.
  • a sandwich ELISA system was made.
  • the pepsin-treated antibody was applied to Prosep G (Millipore), and the adsorbed fraction was acid-eluted. Further, this adsorbed fraction was subjected to Superdex 200 (Amersham) to remove uncut antibody, and F (ab ′) 2 of F1258-7-2 was obtained. Purified F (ab ′) 2 was subjected to SDS-PAGE to confirm the purity, and protein quantification was performed using Protein Assay Dye Reagent (BioRad) with bovine serum IgG as a standard.
  • F1258-7-2 F (ab ′) 2 antibody thus obtained was partially reduced using Peroxidase Labeling Kit SH (Dojindo Laboratories), and the cysteine residue present in the hinge part was labeled with Peroxidase to give F1258-7.
  • -2 Fab'-HRP was prepared.
  • F1258-7-2 Fab′-HRP was diluted with 75 mM phosphate buffer (pH 6.4) containing 4% rat serum and 0.05% Tween 20, and 50 ⁇ L was added to each well. After reacting at 25 ° C. for 2 hours, it was washed 5 times in the same manner. Tetramethylbenzidine solution (TMB, BioFX) was added to each well and reacted at room temperature for 15 minutes. The reaction was stopped with a 0.5 M sulfuric acid solution, and the absorbance at 450 nm was measured with a plate spectrophotometer (NJ-2100, Nippon Intermed). Recombinant rabbit sCD14-ST was used as a standard substance.
  • TMB Tetramethylbenzidine solution
  • Example 4 Production examination of sCD14-ST in a rabbit animal model 4-
  • LPS-loaded rabbit sepsis model was New Zealand White (1.8-2.6 kg, Kitayama Labes) LPS (Salmoella Minnesota Re595, Sigma) was administered into the ear vein at a dose of 10 ⁇ g / kg. Blood was collected from the auricular artery (citric acid addition) before LPS administration and 1.5 hours after administration.
  • CLP model live rabbit infection model
  • the rabbit CLP (cecal ligation and puncture) model was prepared by performing surgical operations on New Zealand White species (1.8-2.6 kg, Kitayama Labes). . That is, the animals fasted overnight were anesthetized by administering 0.35 mg / kg of domitol (medetomidine hydrochloride, Meiji Seika) and 5 mg / kg of ketal for animals (ketamine, Sankyo) into the ear vein. After the abdomen was incised and the cecum was brought out of the abdominal cavity, the downstream of the ileocecum was squeezed with a suture, and two incisions were made with an ophthalmic scissors to a width of about 2 cm.
  • domitol medetomidine hydrochloride, Meiji Seika
  • ketal for animals ketamine, Sankyo
  • the cecum was pushed with tweezers and it was confirmed that the contents of the cecum emerged from the puncture hole.
  • the cecum was returned to the abdominal cavity, and the peritoneum and skin were closed with sutures.
  • physiological saline was subcutaneously administered at 50 mL / kg.
  • antisedan atipamezole hydrochloride, Meiji Seika
  • Blood was collected from the auricular artery (citric acid addition) before and 2 hours after the operation for preparing the CLP model.
  • Example 5 Phagocytosis experiment using rabbit peritoneal exudate granulocytes 5- (1) Collection of rabbit peritoneal exudate granulocytes Glycogen was dissolved in physiological saline to a concentration of 0.1%. 150 mL of this was administered intraperitoneally to a New Zealand white rabbit (Kitayama Labes) male, 1.64-1.92 kg. 16 hours after administration, the rabbits were euthanized by excessive anesthesia, and the abdominal cavity was washed with physiological saline to collect granulocytes.
  • Example 5- (2) Production of sCD14-ST by various stimulants Various leukocyte stimulants were added to granulocytes to evaluate the amount of sCD14-ST produced. That is, the rabbit peritoneal exudate granulocytes collected in Example 5- (1) were concentrated in HBSS buffer (GIBCO 14025) (hereinafter referred to as cell assay buffer) containing 2% normal rabbit serum, 2 mM Glutamin, 10 mM HEPES. It suspended so that it might become 1 * 10 ⁇ 7 > Cells / mL, and 100 microliters was added to each well of a 96-well culture plate (Nunclon Surface, Nunc).
  • Example 5- (3) Effects of various inhibitors on sCD14-ST production
  • Example 5- (2) it was suggested that the phagocytic activity of granulocytes was involved in the production of rabbit sCD14-ST. Therefore, the relationship between sCD14-ST production and phagocytosis was examined using various phagocytosis inhibitors. That is, the rabbit peritoneal exudate granulocytes collected in Example 5- (1) were suspended in a cell assay buffer so as to have a cell concentration of 1 ⁇ 10 7 Cells / mL, and a 48-well culture plate (48 Well Cell Culture cluster, 200 ⁇ L was added to each well of Corning.
  • Example 6 Measurement of sCD14-ST in synovial fluid of rabbit arthritis model 6- (1) Preparation of methylated BSA 1 g of BSA (SIGMA) was dissolved in 100 mL of D-PBS (pH 7.4) containing 4% Paraformaldehyde. Then, the pH was adjusted to 8.5 using an alkali, and then reacted at room temperature for 1 hour. Next, 80 mg of sodium borohydride was added and subjected to a reduction reaction at 4 ° C. for 2 hours. Then, the buffer was exchanged with D-PBS (pH 7.4) using an ultra membrane.
  • D-PBS pH 7.4
  • each rabbit blood sample (serum) subjected to the test in Example 6- (3) was diluted with D-PBS (pH 7.4) containing 1% StabilGuard (SurModics), and 100 ⁇ L was added to each well. did. After reacting at room temperature for 1 hour, it was washed 5 times with physiological saline containing 0.05% Tene20.
  • peroxidase-labeled anti-rabbit immunoglobulin antibody (DAKO, P448) was diluted 1000-fold with D-PBS containing 5% goat serum, and 50 ⁇ L was added to each well. After reacting at room temperature for 1 hour, the plate was washed 5 times in the same manner, and TMB solution (BioFX) was added to each well. After 10 minutes of reaction at room temperature, the reaction was stopped with a 0.5 M sulfuric acid solution, and the absorbance at 450 nm was measured with a plate spectrophotometer (Multiscan JX, Dainippon Pharmaceutical).
  • methylated BSA 5 mg
  • 500 ⁇ L of incomplete Freund's adjuvant (DIFCO) were mixed with the antigen-sensitized group for resensitization.
  • the solvent which did not add methylated BSA was similarly administered with respect to the solvent control group.
  • blood was collected from the rabbit ear artery and the antibody titer in blood was measured by the ELISA method of Example 6- (2) to confirm that sensitization was established in the antigen-sensitized group.
  • methylated BSA was adjusted to 5 mg / mL with D-PBS (pH 7.4), and 1 mL was administered into the knee joint cavity of the antigen-sensitized group to induce arthritis.
  • Example 7- (2) Production of sCD14-ST by granulocyte phagocytic activity
  • Various leukocyte stimulants were added to granulocytes to evaluate the amount of sCD14-ST produced. That is, the human peripheral blood granulocytes collected in Example 7- (1) were placed in RPMI1640 medium (SIGMA R8758) containing 10% normal human serum, 2 mM Glutamin, 10 mM HEPES, 10 ng / ml G-CSF at a cell concentration of 0.5 ⁇ . It suspended so that it might become 10 ⁇ 7 > Cells / mL.
  • SIGMA R8758 RPMI1640 medium
  • sandwich assay kit comprising an antibody (S68 antibody) that specifically recognizes human sCD14-ST and binds to a peptide consisting of amino acid sequences 53 to 68 of human CD14.
  • another antibody used was a peroxidase-labeled antibody (F1106-13-3) that binds to a peptide consisting of amino acid sequences 17 to 26 of human CD14.
  • F1106-13-3 peroxidase-labeled antibody
  • sCD14-ST was increased in the phagocytic stimulant (E. coli or zymosan) as in Example 5, but not in LPS or microbeads.
  • Example 7- (3) of International Publication WO2005 / 108429 The result is shown in FIG. In the same manner as in Example 5- (3), Wortomannin and Cytochalasin D inhibited the production of sCD14-ST.

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Abstract

　食細胞による貪食活動により特異的に産生され、測定に適した安定性を有する液性因子である、ｓＣＤ１４－ＳＴを測定する、新規かつ簡便な、食細胞の機能評価の方法、および食細胞による貪食が関連する疾患の検出方法を提供する。

Description

食細胞の機能評価方法
　本発明は、食細胞の機能評価のための新規な方法、食細胞による貪食が関連する疾患の検出方法に関する。
　食細胞とは、貪食活性をもつ細胞の総称である。生体内で貪食を主な役割としている、好中球、マクロファージ、樹状細胞のような専門食細胞（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ　ｐｈａｇｏｃｙｔｅ）と、状況に応じて貪食活性を発揮する非専門食細胞（ａｍａｔｅｕｒ　ｐｈａｇｏｃｙｔｅ）に大別される。非専門食細胞には、脳のミクログリア細胞、肝臓のクッパー細胞、精巣のセルトリ細胞などが含まれる。
　白血球とは、血液に含まれる細胞成分であり、主に顆粒球（約６０％）、リンパ球（約２５％）、単球（約５％）より構成される。顆粒球はさらに好中球、好酸球、好塩基球に分類されるが、数としては好中球が最も多く、白血球の約半数は好中球が占める。また、単球は各組織に遊走してマクロファージとなる。白血球は多くの食細胞を含んでおり、単離が容易なため、食細胞のリソースとして好適に用いられている。
　貪食は、細菌・真菌などの微生物の進入に対して最も早期に働く重要な生体防御機構の一つである。貪食は、食細胞による異物の認識、異物のとりこみ、食胞の形成、食胞内での異物の消化、消化した物質の吸収または排出という連続的段階を経る。貪食は、細菌・真菌などの外来の異物に対してのみ起こるものではなく、炎症部位における自己組織の残滓や、老廃した自己細胞といった、自己由来の不要な物質の除去にも関連している。食細胞は、貪食した物質を細胞内で消化するのみでなく、貪食に伴い活性酸素やタンパク質分解酵素を細胞外に放出する場合もある。これにより局所での効率的な殺菌や組織消化が可能となるが、一方で、過剰な貪食反応により、自己組織が破壊されてしまう場合もある。たとえば、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＲＡ）の病変部では、自己免疫複合体を過剰に貪食した細胞（ＲＡ細胞）が認められ、ＲＡ細胞から放出されるタンパク質分解酵素が組織を障害し、関節炎の進行に関与していることが知られている。
　食細胞の貪食機能を測定する方法としては、食細胞をラテックス粒子と接触させ、細胞内に取り込まれたラテックス粒子をサイトメトリーや顕微鏡によりカウントする方法、蛍光標識を施した貪食物質（大腸菌、ザイモザンなど）を食細胞に貪食させ、細胞内に取り込まれた量を検出する方法、生菌を貪食させた後、残った生菌の数を培養により確認する方法、貪食の際に放出される活性酸素による発光を検出する方法などが知られている。
　ＣＤ１４分子は、単球の膜上に発現されている分化マーカーの一つとして同定された糖タンパク質であり、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）のレセプターとしての機能を有することが知られている（非特許文献１）。ＣＤ１４分子には、細胞表面上に発現している膜結合型ＣＤ１４（ｍＣＤ１４）と、可溶型ＣＤ１４（ｓＣＤ１４）の２種類が存在する。ｓＣＤ１４として、約５５ｋＤａ、約４９ｋＤａの分子量を有する分子種の存在が知られており、肝臓からの分泌と、単球の活性化に伴うｍＣＤ１４の酵素による切断によって産生されると考えられている（非特許文献２～４）。
　分子量約５５ｋＤａおよび約４９ｋＤａのｓＣＤ１４（以下「高分子量ｓＣＤ１４」という。）は、敗血症（ＳＥＰＳＩＳ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、急性呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等、多くの疾患における患者の血中で高値を示す事が報告されている。そのため、これらのｓＣＤ１４は疾患特異的なマーカーではないと考えられている（非特許文献５～６）。
　一方、敗血症患者において特徴的に血中濃度が上昇する、新たなｓＣＤ１４の分子種として、ｓＣＤ１４－ＳＴ（可溶性ＣＤ１４抗原サブタイプ）が存在することが報告されている。
　ｓＣＤ１４－ＳＴとは、ｓＣＤ１４のうち、非還元条件下ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて分子量１３±２ｋＤａに泳動されることを特徴とし、ＣＤ１４のＮ端部を保持しているものである。高分子量ｓＣＤ１４と比べると、Ｃ端側が大きく欠失したアミノ酸配列を有しており、高分子量ｓＣＤ１４とは異なりＬＰＳ結合能を有していない。また、ｓＣＤ１４－ＳＴは高分子量ｓＣＤ１４とは異なる免疫原性を示すため、抗体を用いて両者を区別できる。ｓＣＤ１４－ＳＴは敗血症患者において特異的に血中濃度が上昇する（特許文献１）。また、敗血症との判別が難しい、全身性炎症反応（ＳＩＲＳ）を示す患者と比較しても、敗血症患者の血中で高値を示すという報告があり、ｓＣＤ１４－ＳＴは敗血症の特異的な診断マーカーであると考えられている（非特許文献７）。
国際公開ＷＯ２００５／１０８４２９号公報
Ｗｒｉｇｈｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１４３１－１４３３，１９９０年． ＢａｚｉｌおよびＳｔｒｏｍｉｎｇｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４７：１５６７－１５７４，１９９１年． Ｂｕｆｌｅｒら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２５：６０４－６１０，１９９５年． Ｓｕら，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３１：４３５－４４２，１９９９年． Ｈａｙａｓｈｉら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６７：４１７－４２０，１９９９年． Ｌａｗｎら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ　＆　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２０：４８３－４８７，２０００年． Ｙａｅｇａｓｈｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　１１：２３４－２３８，２００５年．
　従来の、食細胞の貪食能の測定方法は、貪食物質の事前の標識作業、貪食後に残った生菌を確認するための培養、検鏡など時間と手間がかかる操作や、サイトメーター、顕微鏡といった専門の装置が必要であり、より簡便な新たな測定方法の開発が望まれていた。貪食に伴い食細胞から放出される液性因子を測定できれば、より簡便かつ定量的な測定法となりうるが、サイトカインは貪食刺激以外の種々の免疫賦活刺激によっても産生されるので、貪食特異的なマーカーには適さない。また、活性酸素も種々の刺激により産生されること、また短時間で消滅してしまうことから、貪食特異的なマーカーには適さず、測定を即時に行わなければならないという制約があった。
　局所での貪食反応が関連している疾患（例、関節リウマチ等）において、体液等の検体中のマーカー分子を測定することにより貪食反応の程度を計測できれば、疾患の診断に役立つ。この場合、検体中の液性因子を測定することが簡便であるが、これまで、貪食特異的、かつ、測定に適した安定性を有する液性因子は知られていなかった。
　ｓＣＤ１４－ＳＴが敗血症患者血漿で上昇する疾患マーカーであることは公知であったが、その産生機序は明らかでなかった。かかる状況下において、本発明者は、エンドトキシン惹起ウサギ敗血症モデル動物では血中ｓＣＤ１４－ＳＴが上昇しないが、生菌感染によるウサギ敗血症モデル動物（ＣＬＰ（盲腸漿膜剥離）モデル）では上昇することを見出した。この実験事実から、ｓＣＤ１４－ＳＴの産生にはエンドトキシンによる白血球の活性化のみでは不十分であり、白血球による細菌の貪食過程が重要であることを知得した。そこで、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて各種の白血球刺激物質とｓＣＤ１４－ＳＴ産生量の関連性を詳細に調べたところ、ｓＣＤ１４－ＳＴは白血球に貪食活動を起こさせる物質を添加した時にのみ産生され、これは貪食を阻害する物質を添加することにより低下することを知見した。さらに発明者は、ウサギ関節炎モデル動物において、関節炎の発症に伴い関節液中のｓＣＤ１４－ＳＴが上昇していることを見出した。
　したがって、ｓＣＤ１４－ＳＴは、貪食反応に特異的であり、かつ、測定に適した安定性を有する液性因子である。
　すなわち、本発明は、食細胞の機能評価の新たな方法を提供する。
　（１－１）食細胞により産生されるｓＣＤ１４－ＳＴを測定することを特徴とする、食細胞の機能評価方法。
　（１－２）食細胞の機能が、貪食能である、上記（１－１）に記載の方法。
　（１－３）食細胞に貪食物質を接触させる工程を含むことを特徴とする、上記（１－１）または（１－２）に記載の方法。
　（１－４）下記の工程を含むことを特徴とする、食細胞の機能評価方法、
　　１）食細胞と貪食物質を接触させる工程、
　　２）食細胞により産生されるｓＣＤ１４－ＳＴを測定する工程、および
　　３）測定値を標準値と比較し、食細胞の貪食活動の有無および／または程度を判定する工程。
　（１－５）食細胞が、好中球、顆粒球および／または白血球である、上記（１－１）乃至（１－４）のいずれかに記載の方法。
　（１－６）食細胞が顆粒球であり、食細胞の機能が貪食能である、上記（１－１）乃至（１－４）のいずれかに記載の方法。
また、本発明は、ｓＣＤ１４－ＳＴを含有する食細胞の機能を評価するためのマーカーである。
　また、本発明は、被験体由来の食細胞の機能を評価することによる、各種の検出・評価方法を提供する。
　（２－１）食細胞の機能を評価することによる食細胞の機能異常を伴う疾患の検出方法であって、
　　１）上記（１－１）乃至（１－６）のいずれかに記載の方法により、被験体由来の食細胞の機能を評価する工程、
　　２）評価した結果を正常値と比較する工程、および
　　３）被験体由来の食細胞の機能が正常値より高値または低値であるかにより疾患の有無および／または程度を判定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
　（２－２）食細胞の機能を評価することによる免疫機能の評価方法であって、
　　１）上記（１－１）乃至（１－６）のいずれかに記載の方法により、被験体由来の食細胞の機能を評価する工程、
　　２）評価した結果を正常値と比較する工程、および
　　３）被験体由来の食細胞の機能が正常値より高値または低値であるかにより免疫機能の程度を判定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
　（２－３）食細胞の機能を評価することによる薬剤の効果の評価方法であって、
　　１）上記（１－１）乃至（１－６）のいずれかに記載の方法により、薬剤投与中および／または薬剤投与後の被験体由来の食細胞の機能を評価する工程、
　　２）評価した結果を正常値および／または薬剤投与前の評価結果と比較する工程、および
　　３）薬剤の投与による被験体由来の食細胞の機能の変化の有無および／または程度を判定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
　（２－４）移植用の食細胞の品質を評価する方法であって、
　　１）上記（１－１）乃至（１－６）のいずれかに記載の方法により、移植用の食細胞の機能を評価する工程、
　　２）評価した結果を基準値と比較する工程、および
　　３）移植用の食細胞の機能が基準値を満たしているかを判定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
　（２－５）食細胞が、好中球、顆粒球および／または白血球である、上記（２－１）乃至（２－４）のいずれかに記載の方法。
　（２－６）食細胞の機能が、貪食能である、上記（２－１）乃至（２－５）のいずれかに記載の方法。
　（２－７）食細胞が顆粒球であり、食細胞の機能が貪食能である、上記（２－１）乃至（２－４）のいずれかに記載の方法。
　また、本発明は、貪食機能調節物質のスクリーニング方法を提供する。
　（３－１）下記の工程を含むことを特徴とする、貪食機能調節物質のスクリーニング方法、
　　１）食細胞と被験物質を接触させる工程、
　　２）食細胞により産生されるｓＣＤ１４－ＳＴを測定する工程、および
　　３）食細胞の貪食能に対する被験物質の効果を評価する工程。
　（３－２）貪食物質の存在下で、食細胞と被験物質を接触させることを特徴とする上記（３－１）に記載の方法。
　（３－３）食細胞が、好中球、顆粒球および／または白血球である、上記（３－１）乃至（３－２）のいずれかに記載の方法。
　また、本発明は、食細胞による貪食が関連する疾患の検出方法を提供する。
　（４－１）下記の工程を含むことを特徴とする、食細胞による貪食が関連する疾患の検出方法、
　　１）被験体由来の検体（血液を除く）に含まれるｓＣＤ１４－ＳＴを測定する工程、
　　２）測定した値を正常値と比較する工程、および
　　３）検体中のｓＣＤ１４－ＳＴの量が正常値より高値であるか否かを判定する工程。
　（４－２）検体に貪食物質を添加後、ｓＣＤ１４－ＳＴを測定することを特徴とする、上記（４－１）に記載の方法。
　（４－３）食細胞による貪食が関連する疾患が関節リウマチであり、検体が関節液である、上記（４－１）または（４－２）に記載の方法。
　（４－４）食細胞による貪食が関連する疾患が乳房炎であり、検体が乳汁である、上記（４－１）または（４－２）に記載の方法。
　（４－５）食細胞が、好中球、顆粒球および／または白血球である、上記（４－１）乃至（４－４）のいずれかに記載の方法。
　本発明によれば、貪食に伴い食細胞から放出される液性因子であるｓＣＤ１４－ＳＴを測定することにより、食細胞の機能を特異的かつ簡便に測定することができる。また、該測定系を用いて貪食機能調節物質のスクリーニングを行うことができる。さらに、食細胞による貪食が関連する疾患を特異的かつ簡便に検出できる。
実施例３に記載のｓＣＤ１４－ＳＴ測定系における、組換え体ウサギｓＣＤ１４－ＳＴの用量依存的な反応性を示す。横軸は組換え体ｓＣＤ１４－ＳＴ濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、縦軸は吸光度を示す。 実施例４に記載のＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおける、ＬＰＳ投与前後の血中ｓＣＤ１４－ＳＴの測定結果を示す。縦軸は血中ｓＣＤ１４－ＳＴ濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。 実施例４に記載の生菌感染によるウサギ敗血症モデルにおける、手術前後の血中ｓＣＤ１４－ＳＴの測定結果を示す。縦軸は血中ｓＣＤ１４－ＳＴ濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。 実施例５に記載の、ウサギ顆粒球を各種白血球刺激剤で刺激した際のｓＣＤ１４－ＳＴ産生の様子を示す。 実施例５に記載の、ウサギ顆粒球を各種白血球刺激剤で刺激した際の高分子量ｓＣＤ１４産生の様子を示す。 実施例５に記載の、ウサギ顆粒球を貪食物質で刺激した際のｓＣＤ１４－ＳＴ産生に対する、貪食阻害剤の効果を示す。 実施例６に記載の、ウサギ関節炎モデルの関節洗浄液中のｓＣＤ１４－ＳＴの測定結果を示す。 実施例７に記載の、ヒト顆粒球を各種白血球刺激剤で刺激した際のｓＣＤ１４－ＳＴ産生の様子を示す。 実施例７に記載の、ヒト顆粒球を貪食物質で刺激した際のｓＣＤ１４－ＳＴ産生に対する、貪食阻害剤の効果を示す。
１．ｓＣＤ１４－ＳＴ（可溶性ＣＤ１４抗原サブタイプ）
　本発明は、食細胞が、外来微生物や異物を貪食し、消化する過程で、ｓＣＤ１４－ＳＴが産生されることを見出したことに基づいている。ｓＣＤ１４－ＳＴは、ｓＣＤ１４のうち、非還元条件下ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて分子量１３±２ｋＤａに泳動されることを特徴とし、ＣＤ１４のＮ端部のアミノ酸配列を保持しているものである。また、ｓＣＤ１４－ＳＴは、高分子量ｓＣＤ１４とは異なる免疫原性を示す。たとえば、ヒト高分子量ｓＣＤ１４は、３Ｃ１０抗体（ＡＴＣＣ　ＴＩＢ－２２８）により認識されるが、ヒトｓＣＤ１４－ＳＴは３Ｃ１０抗体に結合しない。
　一方で、ｓＣＤ１４－ＳＴを特異的に認識し、高分子量ｓＣＤ１４は認識しない抗体も存在する。このような抗体は、ｓＣＤ１４－ＳＴの特定部位のペプチドをエピトープとするペプチド抗体である。特定部位とは、ＣＤ１４の二次構造におけるβ３とβ４の間の領域である（Ｋｉｍら，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８０：１１３４７－１１３５１，２００５年．）。具体的にはヒトＣＤ１４（配列番号１）では３６～７９番目のアミノ酸配列、ウサギＣＤ１４（配列番号２）では３８～８１番目のアミノ酸配列、マウスＣＤ１４（配列番号３）では３６～７９番目のアミノ酸配列、ウシＣＤ１４（配列番号４）では３６～７７番目のアミノ酸配列が該当する。当該領域の中の、連続した８アミノ酸以上の配列からなるペプチドを、抗原として抗体を作製する。ヒトＣＤ１４の５３～６８番目の１６アミノ酸からなるペプチド、ウサギＣＤ１４の４０～５９番目の２０アミノ酸からなるペプチドが好適な例である。高分子量ｓＣＤ１４は、β３～β４の領域（β３－α２－α３－β４を含む）においてβシート構造やαヘリックス構造をとっているが、ｓＣＤ１４－ＳＴは高分子量ｓＣＤ１４に比べてＣ端側が大きく欠失した配列を有しているため、β３～β４の領域において本来の立体構造を維持できず、両者は立体構造的に異なっていることが、抗体の認識性の違いを生じさせていると考えられる。
　したがって、ｓＣＤ１４－ＳＴは、非還元条件下ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて分子量１３±２ｋＤａに泳動されることを特徴とし、ＣＤ１４のＮ端部のアミノ酸配列を保持していることに加え、特定の免疫原性によって特徴づけることができる。特定の免疫原性とは、ＣＤ１４のβ３～β４の領域中の連続した８アミノ酸以上の配列からなるペプチドを抗原として作製した抗体により認識されることである。また、ｓＣＤ１４－ＳＴは、生菌感染による敗血症または敗血症モデルにおいて特異的に血中濃度が上昇する因子である。たとえば、ヒトｓＣＤ１４－ＳＴは、非還元条件下ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて分子量１３±２ｋＤａに泳動され、Ｎ末端配列に配列番号１に記載のアミノ酸配列の１番目～８番目の配列を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列の５３番目～６８番目の１６アミノ酸残基からなるペプチドに結合する抗体に特異的に結合することを特徴とする。さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目～２６番目からなるペプチドに結合する抗体に特異的に結合すること、３Ｃ１０抗体に結合しないこと、ＭＥＭ－１８抗体に結合しないこと、ＬＰＳ結合能を有さないこと、ヒト血清から得られうること、および、敗血症患者において特異的に血中濃度が上昇する因子であること、という特徴のうち任意の一つ以上を付け加えることができる。
　ｓＣＤ１４－ＳＴはＣＤ１４のＮ端部のアミノ酸配列を保持しているので、ｓＣＤ１４－ＳＴを単離しＮ端のアミノ酸配列を解析した場合、ＣＤ１４のＮ端部と同一のアミノ酸配列を有していることが確認できる。少なくともＮ端から１番目～８番目のアミノ酸配列が同一であればよい。たとえば、ヒトであれば配列番号１のアミノ酸配列の１番目～８番目の配列をＮ端に保有していることが確認できる。ウサギであれば配列番号２のアミノ酸配列の１番目～８番目、マウスであれば配列番号３のアミノ酸配列の１番目～８番目、ウシであれば配列番号４のアミノ酸配列の１番目～８番目をＮ端に保有している。
２．食細胞の機能評価方法
　本発明における食細胞は、哺乳類由来の、貪食活性を持つ細胞であれば特に限定されないが、好中球が好適である。調製のしやすさから、好中球を含む試料として、白血球や顆粒球を用いてもよい。顆粒球へ分化する機能を有している単離された細胞株でもよく、例としてＨＬ－６０が挙げられる。哺乳類としては、ヒト、ウサギ、マウス、ラット、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコなどが挙げられる。
　食細胞は、血液、組織液、リンパ液、関節液、乳汁、脳脊髄液、膿、唾液、涙液、粘液、鼻水、痰、尿、腹水、羊水、精液などの体液等から調製することができる。また、鼻腔、気管支、肺、皮膚、腹腔、各種臓器、関節、骨などを洗浄した後の洗浄液から調製することができる。加えて、皮膚、肺、腎、粘膜などの組織からも、食細胞を調製することができる。
　生体から食細胞を調製する場合は、食細胞のみを厳密に単離して用いてもよいし、食細胞を含む画分を調製して用いてもよい。たとえば、血液から調製した白血球、血液から調製した顆粒球、腹腔洗浄液から調製した顆粒球などを、本発明の方法に用いる食細胞として供することができる。
　食細胞の機能とは、食細胞が保有している生理的機能である。本発明では、貪食能を食細胞の活性の指標とし、食細胞の機能を評価する。食細胞は、貪食能以外にも、サイトカイン産生能や遊走能などさまざまな機能を併せ持つが、食細胞に共通な機能は貪食能である。したがって、食細胞が細胞として正常な機能を有しているか否かは、貪食能を指標とすることが好ましい。また食細胞は多くの場合、免疫細胞として生体内で免疫機能を発揮しているので、食細胞の貪食能の評価をすることは、食細胞の免疫機能を評価することに繋がる。
　すなわち、本発明の好ましい態様の一つは、好中球、顆粒球および／または白血球の貪食能の測定方法である。また、本発明の別の好ましい態様の一つは、好中球、顆粒球および／または白血球の貪食能の測定することによる、免疫機能の評価方法である。
　本発明の食細胞の機能評価方法は、食細胞により産生されるｓＣＤ１４－ＳＴを測定することを特徴とする。ｓＣＤ１４－ＳＴは、食細胞の機能を評価するためのマーカーとして有用である。食細胞は、貪食活動に伴いｓＣＤ１４－ＳＴを産生する。食細胞の貪食活動は、食細胞が貪食物質と接触することから始まる。貪食物質は、食細胞に貪食活動を起こさせるものであり、ここでいう貪食活動とは、少なくとも食細胞による貪食物質の取り込み（食作用）、および、取り込んだ物質の細胞内での消化の過程を含むものをいう。食細胞による取り込み・消化が行われる貪食物質の具体例としては、細菌・真菌などの菌体、ザイモザン等が挙げられる。一方で、マイクロビーズ・ラテックスビースのような、取り込まれても消化されない物質は、本発明における貪食物質に該当しない。
　ｓＣＤ１４－ＳＴの測定は、食細胞を含有する溶液、もしくは該溶液の上清に対して行う。ここでいう溶液とは、培地、細胞分画液、細胞アッセイ用溶液、生理食塩液、体液などである。生体から食細胞を調製する過程において、食細胞がすでに内在性の貪食物質に対して貪食活動を行っている場合、調製した食細胞含有溶液またはその上清を直接測定することで、食細胞の機能を評価できる。
　食細胞に貪食物質を接触させる場合は、食細胞を含有する溶液に貪食物質を添加すればよい。あるいは貪食物質が表面に結合された容器に、食細胞を含有する溶液を添加してもよい。貪食物質は、取り扱いの容易性の点で、ザイモザンが好ましく用いられる。
　ｓＣＤ１４－ＳＴの測定は、ｓＣＤ１４－ＳＴを検出できる系であれば特に限定されるものではないが、ｓＣＤ１４－ＳＴに特異的に結合する抗体を用いた免疫学的測定系により測定することが好ましい。免疫学的測定系は、好ましくは、直接吸着法、サンドイッチ法、凝集法、固相結合法または溶液反応法などから選ぶことができる。特に好ましい方法は、サンドイッチ法（サンドイッチ免疫測定法）である。
　サンドイッチ免疫測定法は、測定するタンパク質の異なる部位を認識する２種類以上の抗体を用いて、抗体－抗原－抗体複合体を形成させることにより測定する方法である。サンドイッチ免疫測定法は公知の技術を利用することができる。測定法の原理、応用及び改良法については、たとえば、石川栄治著「超高感度酵素免疫測定法」、学会出版センター（１９９３年）、松橋直ほか編著「免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬・治療薬開発への応用」、経営教育出版（１９８５年）、石川栄治ほか編「酵素免疫測定法」（第３版）、医学書院（１９８７年）に記載されている。
　ｓＣＤ１４－ＳＴに特異的に結合する抗体は、ＣＤ１４の二次構造におけるβ３とβ４の間の領域中の、連続した８アミノ酸以上の配列からなるペプチドに結合する抗体である。このような抗体の例は、国際公開ＷＯ２００５／１０８４２９号公報に記載のＳ６８抗体、本明細書実施例１に記載のＦ１３０１－９－１抗体などが挙げられる。サンドイッチ免疫測定法を用いる場合は、更にもう一種の抗体が必要であるが、ｓＣＤ１４－ＳＴに結合する抗体であれば特に特異性は問わない。高分子量ｓＣＤ１４とｓＣＤ１４－ＳＴの両方を認識する抗体を用いることもできる。このような抗体の例は、国際公開ＷＯ２００５／１０８４２９号公報に記載のＦ１１０６－１３－３抗体やＦ１０３１－８－３抗体、本明細書実施例２に記載のＦ１２５８－７－２抗体などが挙げられる。これらの抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、特に限定されない。サンドイッチ免疫測定法を用いる場合には、モノクローナル抗体が好ましい。また、該モノクローナル抗体の断片であってもよい。ここでいう抗体の断片とは、該モノクローナル抗体のＦａｂ、Ｆａｂ´、またはＦ（ａｂ´）２のいずれかである。
　免疫学的な測定系では、ｓＣＤ１４－ＳＴと抗体の複合体を形成させた後、形成された複合体を標識により検出することで、ｓＣＤ１４－ＳＴの存在を測定する。標識は、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、オキシダーゼ、もしくはウリカーゼ等の酵素、アクリジニウムもしくはその誘導体、エクオリンもしくはその改変体等の化学発光物質、ＦＩＴＣ、ユウロピウム（Ｅｕ）、もしくはサマリウム（Ｓｍ）等のランタノイド等の蛍光物質、色素、金コロイド、着色ラテックス、またはアイソトープを用いればよい。化学発光物質、蛍光物質、着色標識、またはアイソトープを標識として用いる場合は、その標識に応じた測定機器により光学的に測定できる。色素、金コロイドまたは着色ラテックスを標識として用いて、イムノクロマト法またはフロースルー法を利用したキットにて測定する場合は、目視により測定可能である。
　免疫学的な測定系は、キットの形態で提供することも可能である。キットはｓＣＤ１４－ＳＴに特異的に結合する抗体を必須要素とし、その他、ｓＣＤ１４－ＳＴと抗体の複合体を形成させた後、形成された複合体を標識により検出するための構成要素を含む。たとえば、抗体を固相化させた不溶性担体（プラスチックプレート、ラテックス粒子など）、ペルオキシダーゼ等の標識酵素、金コロイド等の標識物質、テトラメチルベンジン（ＴＭＢ）等の発色物質、検出感度を上げるためのビオチン－ストレプトアビジン等の特異結合物質、ブロッキング剤、希釈液、洗浄液、標準物質などを含んでよい。
　食細胞を含有する溶液、もしくは該溶液の上清中のｓＣＤ１４－ＳＴを定性的および／または定量的に測定する。測定した結果を、標準値と比較し、ｓＣＤ１４－ＳＴの存在の有無および／または量を判断する。ｓＣＤ１４－ＳＴの存在の有無および／または量から、食細胞の貪食活動の有無および／または程度を判定する。標準値は、測定する目的により適宜定めうるが、たとえば、食細胞を含有しない溶液、貪食物質を接触させる前の溶液、またはそれらの溶液の上清の測定値を、陰性標準値とする。検体の測定値が、陰性標準値より高いかどうかを判定し、食細胞の貪食能を評価する。また、標準値として、ｓＣＤ１４－ＳＴの標準物質の測定値から求めた検量線を用いることもできる。検体の測定値を、検量線と比較し、検体中のｓＣＤ１４－ＳＴを定量することで、食細胞の貪食能を評価する。アッセイに供した食細胞の数および／または単位時間あたりのｓＣＤ１４－ＳＴ産生量の標準値を指標とし、検体中の食細胞の機能の高低、活性化の度合い等を評価することができる。ｓＣＤ１４－ＳＴの標準物質は、血液から精製したｓＣＤ１４－ＳＴ、食細胞の貪食刺激により産生されたｓＣＤ１４－ＳＴを精製したもの、組換え体ｓＣＤ１４－ＳＴ、ペプチド合成したｓＣＤ１４－ＳＴなどを用いうる。ｓＣＤ１４－ＳＴの精製法、組換え体の製造法は、国際公開ＷＯ２００５／１０８４２９号公報に記載されている。
３．被験体由来の食細胞の機能を評価することによる、各種の検出・評価方法
　前記の「２．食細胞の機能評価方法」の項に説明した方法を用いて、被験体由来の食細胞の機能を評価することにより、以下の検出・評価が可能となる。
　Ａ）被験体が食細胞の機能異常を伴う疾患に罹患しているかどうか、疾患の進行度、および／または疾患の重傷度を検出・評価できる。
　Ｂ）被験体の免疫機能の低下、亢進などの変化もしくは異常の有無および／または程度を検出・評価できる。
　Ｃ）薬剤投与中および／または薬剤投与後の被験体由来の食細胞の機能を評価することで、薬剤の効果を検出・評価できる。
　Ｄ）食細胞を再生医療に用いるにあたって、細胞の品質評価の指標とすることができる。
　食細胞の機能異常を伴う疾患の検出・評価を行う場合は、少なくとも、前記の「２．食細胞の機能評価方法」の項に説明した方法を用いて、被験体由来の食細胞の機能を評価する工程を含めばよく、評価した結果を正常値と比較する工程、および被験体由来の食細胞の機能が正常値より高値または低値であるかにより疾患の有無および／または程度を判定する工程を更に含むことができる。
　ここで、正常値とは、予め疾患に罹患していない被験体、すなわち正常な被験体由来の食細胞の機能を測定した結果を求めておき、その測定結果の平均値もしくは範囲をとる等により標準化した値を用いることができる。検体の測定値と正常値を比較するにあたっては、そのまま高低を比較するのみでもよいが、正常被験体の平均値±２ＳＤまたは±３ＳＤをカットオフ値として、カットオフ値より検体の測定値が高いもしくは低い場合、食細胞の機能異常があると判断できる。また測定値の大きさ・小ささの程度により疾患の進行度、および／または疾患の重症度を評価することもできる。
　食細胞の機能異常を伴う疾患としては、たとえば尿毒症、血清オプソニン活性低下、補体欠損症、先天性貪食能不全症、慢性肉芽腫、ミエロペルオキシダーゼ欠損症、白血病、悪性リンパ腫、細菌性心内膜炎、糖尿病、肝硬変などが挙げられる。たとえば慢性肉芽腫は、好中球の活性酸素の産生に欠陥を有し、そのために重篤な細菌や真菌感染を繰り返す先天性の食細胞機能異常症である。慢性肉芽腫患者由来の好中球は、食作用（異物取り込み）は有するが、消化機能を有さない。したがって、ラテックスビーズ取り込みによる検査では異常を検出できないが、ｓＣＤ１４－ＳＴ産生を指標とした貪食能評価であれば、食細胞機能異常を検出することが可能である。
　免疫機能の評価方法を行う場合は、前述の食細胞の機能異常を伴う疾患の検出・評価を行う場合に準ずる。食細胞の機能、特に貪食は、生体の免疫応答において最も早期に働く重要な生体防御機構であり、食細胞の機能異常はすなわち免疫機能の異常へとつながる。食細胞の機能異常を免疫機能と読み替えて適用すればよい。
　薬剤の効果の検出・評価を行う場合は、少なくとも、薬剤投与中および／または薬剤投与後の被験体由来の食細胞について、前記の「２．食細胞の機能評価方法」の項に説明した方法を用いて、食細胞の機能を評価する工程を含めばよく、評価した結果を正常値および／または薬剤投与前の評価結果と比較する工程、および薬剤の投与による被験体由来の食細胞の機能の変化の有無および／または程度を判定する工程を更に含むことができる。ここでいう正常値とは、正常な被験体由来の食細胞の機能を測定した結果のことであり、上述に説明したとおりである。
　免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗がん剤などを投与した場合に、薬剤投与中および／または薬剤投与後の食細胞の機能の変化を検出することにより、薬剤が有効に作用しているか、あるいは薬剤による副作用がどの程度発生しているかを確認することができ、薬剤選択や投与量に対する有用な指針を得ることが可能となる。また、食細胞の機能の変化の程度、すなわちｓＣＤ１４－ＳＴ産生量の変化の大きさ・小ささを指標に、薬剤の効果の程度を評価することもできる。たとえば、Ｇ－ＣＳＦを投与する前後で、末梢血中の好中球の貪食能を比較し、Ｇ－ＣＳＦ投与により正常な機能の好中球がどの程度増加したかを評価することができる。
　食細胞を再生医療に用いるにあたって、細胞の品質評価を行う場合は、用いる食細胞の貪食能をｓＣＤ１４－ＳＴ産生を指標に測定することにより、細胞として正常な機能を有しているか、および／または、細胞の活性を評価することができる。ここでいう再生医療とは、自己由来の白血球などを体外で培養・処理した後、本人へ戻す自家細胞移植、および、正常人ドナー由来の白血球などを患者へ移植する他家細胞移植などが挙げられる。移植用の細胞を調製した後、その細胞が一定の品質を保有しているかを検査するために、「２．食細胞の機能評価方法」の項に説明した方法を用いることができる。調製した細胞の機能を基準値と比較し、基準値を満たしていれば、使用可能な品質であると判断する。基準値は、再生医療の目的に応じて適宜設定できるが、通常は、正常な食細胞の貪食能と比較すればよい。基準値より低い場合は、調製の過程で食細胞の機能または細胞の活性が失われたため、移植に適した品質でないと判断できる。
４．貪食機能調節物質のスクリーニング方法
　前記の「２．食細胞の機能評価方法」の項に説明した方法を用いて、貪食機能調節物質のスクリーニングを行うことができる。すなわち、本発明は、下記の工程を含むことを特徴とする、貪食機能調節物質のスクリーニング方法を提供する。
　１）食細胞と被験物質を接触させる工程、
　２）食細胞により産生されるｓＣＤ１４－ＳＴを測定する工程、および
　３）食細胞の貪食能に対する被験物質の効果を評価する工程。
　なお、１）食細胞と被験物質を接触させる工程に際して、貪食物質の存在下で、食細胞と被験物質を接触させてもよい。
　貪食機能調節物質とは、食細胞の貪食活動を促進もしくは抑制する物質のことである。たとえば、既知の貪食機能抑制物質である、ワートマニン（Ｗｏｒｔｏｍａｎｉｎ）やサイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）を被験物質として食細胞に接触させ、食細胞により産生されるｓＣＤ１４－ＳＴを測定すると、被験物質の添加によりｓＣＤ１４－ＳＴの産生量は減少し、貪食抑制効果が確認できる。これと同様にして、貪食機能調節活性を調べたい物質を被験物質として食細胞に接触させ、ｓＣＤ１４－ＳＴの産生量を指標に貪食能に対する効果を評価することができる。
５．貪食が関連する疾患の検出方法
　本発明は、また、食細胞による貪食が関連する疾患の検出方法を提供する。該検出方法は、被験体由来の検体に含まれるｓＣＤ１４－ＳＴを測定し、その測定した値を正常値と比較し、該検体中のｓＣＤ１４－ＳＴの量が正常値より高値であるか否かを判定して、被験体が食細胞による貪食が関連する疾患に罹患しているかどうか、疾患の進行度、および／または疾患の重傷度を検出できる。
　被験体としては、哺乳類であれば特に限定されるものではないが、ヒト、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、またはネコなどの哺乳類を対象とできる。
　食細胞による貪食が関連する疾患とは、患部において食細胞による貪食活動が生じている疾患のことである。特に、局所における自己免疫反応や感染に伴う貪食が生じている疾患である。たとえば、自己免疫疾患、関節リウマチ、乳房炎、痛風、糸球体腎炎、潰瘍性大腸炎、地中海熱、中耳炎、鼻炎、肺炎、結核、膀胱炎、羊水感染症、または膿精液症等の局所的な疾患が例として挙げられる。ただし、本発明においては、全身性の感染を伴う疾患、敗血症は除く。
　検体としては、組織液、リンパ液、関節液、乳汁、脳脊髄液、膿、唾液、涙液、粘液、鼻水、痰、尿、腹水、羊水、精液などの体液、また、鼻腔、気管支、肺、皮膚、腹腔、各種臓器、関節、骨などを洗浄した後の洗浄液を用いうる。ただし、本発明においては、血液は除く。
　ｓＣＤ１４－ＳＴの測定方法は、前述の２．食細胞の機能評価方法に記載の方法に準ずる。
　正常値としては、予め疾患に罹患していない被験体、すなわち正常な被験体由来の検体を測定した結果を求めておき、その測定結果の平均値もしくは範囲をとる等により標準化した値を用いることができる。正常な被験体由来の検体の測定値が、測定系のバックグラウンドの値とほぼ同等になるような場合は、測定系におけるバックグラウンドの値の平均値もしくは範囲を設定する等により標準化した値を用いてもよい。測定系におけるバックグラウンドの値とは、検体ではなくバッファーやアッセイ溶液などを測定系に添加した場合の測定値である。検体の測定値と正常値を比較するにあたっては、そのまま高低を比較することができるが、正常被験体の平均値＋２ＳＤまたは＋３ＳＤをカットオフ値として、カットオフ値より検体の測定値が高い場合、陽性と判断することもできる。また、測定値が大きいほど、疾患の進行度、および／または疾患の重傷度が高いと判断することができる。
　検体中には、食細胞が含まれていても含まれていなくてもよい。検体中のｓＣＤ１４－ＳＴを直接測定して、生体内での貪食の程度、すなわち疾患の有無および／または程度を評価できる。これは、生体内において食細胞が貪食活動を行った結果産生されたｓＣＤ１４－ＳＴが検体中に存在することが理由の一つである。たとえば、関節炎モデル動物において、関節液または関節洗浄液中のｓＣＤ１４－ＳＴを測定することで、関節での炎症を伴う疾患、具体的には、関節リウマチ、変形性関節症、肩関節周囲炎などの診断ができる。これは、関節液または関節洗浄液中のｓＣＤ１４－ＳＴ濃度上昇が検出可能であることが理由の一つである。
　一方、検体とする体液や組織洗浄液中の食細胞の有無および／または量を検出して疾患の有無および／または程度を評価することも可能である。この場合、検体に貪食物質を添加し、産生されたｓＣＤ１４－ＳＴを測定すればよい。たとえば、乳汁に貪食物質を添加し、産生されたｓＣＤ１４－ＳＴを測定して、乳房炎の診断をすることができる。特にウシ乳房炎の検出に有用である。
　以上、好適な実施の形態を挙げて説明したが、本発明は、上記実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者によって各種変更及び修正が可能であることは言うまでもない。
（実施例１）合成ペプチドを抗原としたＦ１３０１－９－１抗体の作製
１－（１）抗原とするペプチドの調製
　配列番号５に記載の配列（ウサギＣＤ１４アミノ酸配列の４０位から５９位の配列に該当）からなるペプチドを、Ｎ末端でＳＨ基を介してキャリア蛋白質と結合させるため、Ｎ末端にシステインを挿入してペプチド合成機ＡＢＩ４３３Ａ（アプライドバイオシステムズ）を用いて合成した。定法により精製し、精製ペプチドとして２～３ｍｇを得た。
１－（２）合成ペプチドを用いたペプチドキャリアタンパクの調製
　１－（１）で調製したペプチドを蒸留水で１０ｍｇ／ｍＬに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのＩｍｊｅｃｔ　Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）（ＰＩＥＲＣＥ）と等量混合し室温で２時間反応することで、ペプチドとキャリア蛋白質を結合した（以下、配列番号５のペプチド－ＫＬＨと記す）。また１－（１）で調製したペプチドを蒸留水で１０ｍｇ／ｍＬに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのＩｍｊｅｃｔ　Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）（ＰＩＥＲＣＥ）と等量混合し室温で２時間反応することで、ペプチドとキャリア蛋白質を結合した（配列番号５のペプチド－ＢＳＡと記す）。
１－（３）合成ペプチドを抗原としたハイブリドーマクローン作製
　１－（１）で調製したペプチドに対するモノクローナル抗体を作製するため、配列番号５のペプチド－ＫＬＨを用いてラットを免疫した。すなわち、配列番号５のペプチド－ＫＬＨ各１００μｇを１００μＬの生理食塩水で希釈した後、１００μＬのフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合した。これをＷｉｓｔａｒ　ｒａｔ（日本エスエルシー）メス８週令のフットパッド内に各１００μＬずつ投与した。１１日後、配列番号５のペプチド－ＫＬＨ　１００μｇを２００μＬの生理食塩水で希釈し、再度フットパッドに投与した。さらに３日後、腸骨リンパ節よりリンパ球を分離し、得られたリンパ球をＳｐ２／Ｏ－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１５８１）と混合した後、ポリエチレングリコールを用いて安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」（講談社）に記載の方法にしたがって細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後、目的の抗体を産生しているハイブリドーマをＥＬＩＳＡ法にて選定した。すなわち、０．０７６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下Ｄ－ＰＢＳと記載）で配列番号５のペプチド－ＢＳＡを１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、Ｎｕｎｃ）に５０μＬ／ウエルで添加した。４℃で一晩反応後、イオン交換水で５回洗浄した。２％Ｓｔａｂｉｌｇｕｒｄを含むＤ－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を各ウエルに１００μＬ添加してブロッキングした。次にハイブリドーマの培養上清を各ウエルに添加して３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を１０％ウサギ血清を含むＤ－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０００倍に希釈し、各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に３回洗浄した。ＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦＸ）を各ウエルに添加し、室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。プレート分光光度計（ＮＪ－２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の上昇が認められたウエルの細胞を選択し、限界希釈法によりクローニングを行った。１１日後、同様にスクリーニングを行い、配列番号５のペプチドと反応する抗体を産生するクローンＦ１３０１－９－１を得た。
１－（４）ハイブリドーマ培養上清からの抗体精製
　１－（３）で得たクローンＦ１３０１－９－１をＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）にて３Ｌスケールで培養した。この培養上清を０．４５μｍのフィルターに供して細胞を取り除いた後に、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇカラムに供した。次いで、吸着画分を酸溶出し、直ちに１/１０倍量の１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加する事により中和した。溶出液を限外膜にて生理食塩水にバッファー交換し、精製抗体とした。
（実施例２）合成ペプチドを抗原としたＦ１２５８－７－２抗体の作製
２－（１）抗原とするペプチドの調製
　配列番号６に記載の配列（ウサギＣＤ１４アミノ酸配列の１位から３０位の配列に該当）からなるペプチドを、Ｎ末端でＳＨ基を介してキャリア蛋白質と結合するため、Ｎ末端にシステインを挿入してペプチド合成機ＡＢＩ４３３Ａ（アプライドバイオシステムズ）を用いて合成した。定法により精製し、精製ペプチドとして２～３ｍｇを得た。
２－（２）合成ペプチドを用いたペプチドキャリアタンパクの調製
　１－（２）記載の方法に準じて、配列番号６のペプチド－ＫＬＨおよび配列番号６のペプチド－ＢＳＡを調製した。
２－（３）合成ペプチドを抗原としたハイブリドーマクローンの作製
　１－（３）記載の方法に準じて、２－（２）で調製した配列番号６のペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するクローンＦ１２５８－７－２を得た。
２－（４）ハイブリドーマ培養上清からの抗体精製
　１－（４）記載の方法に準じて、２－（３）で調製した配列番号６のペプチドに対するハイブリドーマクローンの培養上清からモノクローナル抗体精製した。
（実施例３）ウサギｓＣＤ１４－ＳＴ測定系の作製
　ウサギｓＣＤ１４－ＳＴを特異的に検出可能な系を作製するため、実施例１－（４）、２－（４）に記載の抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ系を作製した。
３－（１）Ｆ１２５８－７－２のＦａｂ´－ＨＲＰの作製
　Ｆ１２５８－７－２抗体のＦ（ａｂ´）２を作製するために、実施例２－（４）で得た精製Ｆ１２５８－７－２抗体をＰｅｐｓｉｎで処理した。すなわち、精製Ｆ１２５８－７－２抗体を２Ｍ尿素を含む１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．４）にバッファー交換した後、Ｐｅｐｓｉｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を抗体：酵素＝３０：１（重量比）となるように添加し、３７℃で６時間反応した。反応終了時には１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して、ｐＨを中性付近に戻した。次にＦ（ａｂ´）２の精製を行った。すなわち、Ｆｃ部位とＰｅｐｓｉｎを取り除く目的で、Ｐｅｐｓｉｎ処理した抗体をＰｒｏｓｅｐ　Ｇ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に供し、吸着画分を酸溶出した。さらにこの吸着画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に供することで未切断の抗体を取り除き、Ｆ１２５８－７－２のＦ（ａｂ´）２を得た。精製したＦ（ａｂ´）２はＳＤＳ－ＰＡＧＥに供して純度を確認し、ウシ血清ＩｇＧを標準品としたＰｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｄｙｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ（バイオラッド）を用いてタンパク定量した。続いて得られたＦ１２５８－７－２　Ｆ（ａｂ´）２抗体をＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ　ＳＨ（同仁化学）を用いて部分還元し、ヒンジ部分に存在するシステイン残基をＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識することによりＦ１２５８－７－２　Ｆａｂ´－ＨＲＰを作製した。
３－（２）ウサギｓＣＤ１４－ＳＴサンドイッチＥＬＩＳＡ系の作製
　固相抗体として実施例１－（４）で得たＦ１３０１－９－１抗体を、標識抗体として実施例３－（１）で作製したＦ１２５８－７－２　Ｆａｂ´－ＨＲＰ抗体を使用する２ステップサンドイッチＥＬＩＳＡ系を作製した。すなわちＦ１３０１－９－１抗体をＤ－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、Ｎｕｎｃ）の各ウエルに５０μＬ添加した。４℃で一晩反応した後、イオン交換水で５回洗浄した。５％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ）と０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤ－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を各ウエルに２００μＬ添加しブロッキングした。次に５％の正常ウサギ血清（ウサギＣＤ１４アフィニティー抗体カラムを用いて可溶型ＣＤ１４抗原を除去した血清）、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）を希釈液として検体を希釈調製し、ウエル当たり５０μＬ添加し、２５℃で３時間反応した。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄した。４％ラット血清、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む７５ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．４）でＦ１２５８－７－２　Ｆａｂ´－ＨＲＰを希釈し、各ウエルに５０μＬ添加した。２５℃で２時間反応した後、同様に５回洗浄した。テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦＸ）を各ウエルに添加し、室温で１５分間反応した。０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ－２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　標準物質としては、組換え体ウサギｓＣＤ１４－ＳＴを用いた。組換え体ウサギｓＣＤ１４－ＳＴの作製は、国際公開ＷＯ２００５／１０８４２９号公報に記載の方法に準じて行った。すなわち、ウサギＣＤ１４の６６番目のアミノ酸配列の後にトロンビン切断サイトを導入したプラスミドを作製し、ＣＯＳ細胞を用いて培養上清中に一過性に発現させた。培養上清中のｓＣＤ１４を精製した後、トロンビンで切断し、ゲル濾過クロマトグラフィーにて組換え体ウサギｓＣＤ１４－ＳＴを精製した。
　作製したサンドイッチＥＬＩＳＡ系は、図１に示すように組換え体ｓＣＤ１４－ＳＴを用量依存的に検出した。
（実施例４）ウサギ動物モデルでのｓＣＤ１４－ＳＴの産生検討
４－（１）ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルの作製
　ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルは、ニュージーランドホワイト種（１．８－２．６ｋｇ、北山ラベス）にＬＰＳ（Ｓａｌｍｏｅｌｌａ　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ　Ｒｅ５９５、シグマ）を１０μｇ／ｋｇの用量で耳静脈内投与することにより作製した。ＬＰＳ投与前および投与１．５時間後に耳介動脈より採血（クエン酸加血）した。
４－（２）ウサギ生菌感染モデル（ＣＬＰモデル）の作製
　ウサギＣＬＰ（ｃｅｃａｌ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｎｃｔｕｒｅ）モデルは、ニュージーランドホワイト種（１．８－２．６ｋｇ、北山ラベス）に外科的手術を行い作製した。すなわち、一晩絶食した動物をドミトール（塩酸メデトミジン、明治製菓）の０．３５ｍｇ／ｋｇおよび動物用ケタラール（ケタミン、三共）の５ｍｇ／ｋｇを耳静脈内投与して全身麻酔した。腹部を切開して盲腸を腹腔外に出した後、回盲部の下流を縫合糸で絞やくし、眼科バサミにより約２ｃｍの幅で２箇所切開した。盲腸をピンセットで押し穿刺孔から盲腸内容物が出ることを確認した後に盲腸を腹腔内に戻し、腹膜および皮膚を縫合糸で閉じた。閉腹後、生理食塩水を５０ｍＬ／ｋｇで皮下投与し。また、アンチセダン（塩酸アチパメゾール、明治製菓）を０．３５ｍｇ／ｋｇで耳静脈内投与して手術終了とした。ＣＬＰモデル作製の手術前および手術２時間後に耳介動脈より採血（クエン酸加血）した。
４－（３）ウサギ敗血症モデルにおける血中ｓＣＤ１４－ＳＴの測定
　実施例４－（１）と４－（２）で採取した血液から遠心にて血漿を調製し、実施例３－（２）記載の方法に準じてｓＣＤ１４－ＳＴを測定した。結果を図２および図３に示す。ＬＰＳ負荷敗血症モデルでは血中ｓＣＤ１４－ＳＴの上昇が認められなかった（図２）。一方、生菌感染による敗血症モデルにおいては血中ｓＣＤ１４－ＳＴの上昇が見られた（図３）。また、生菌感染による敗血症モデルにおける血中ｓＣＤ１４－ＳＴの上昇は、手術（感染）後２時間で検出可能であり、ＩＬ－６やｄ－ｄｉｍｅｒなどの他のマーカーに比べ、感染の早期に検出が可能なマーカーであることが確認された。これらのことから、ｓＣＤ１４－ＳＴ産生はエンドトキシンによる白血球の活性化のみでは不十分であり、感染に対する最も早い免疫応答である白血球による細菌の貪食活動が必要であると考えられた。
（実施例５）ウサギ腹腔滲出顆粒球を用いた貪食実験
５－（１）ウサギ腹腔滲出顆粒球の採取
　グリコーゲンを生理食塩水で０．１％となるように溶解した。これをニュージーランド白色ウサギ（北山ラベス）オス１．６４－１．９２ｋｇの腹腔内に１５０ｍＬ投与した。投与１６時間後に過剰麻酔にてウサギを安楽殺した後に、生理食塩水にて腹腔内を洗浄して顆粒球を採取した。
５－（２）各種刺激剤によるｓＣＤ１４－ＳＴの産生
　顆粒球に各種白血球刺激剤を添加してｓＣＤ１４－ＳＴの産生量を評価した。すなわち実施例５－（１）で採取したウサギ腹腔滲出顆粒球を２％正常ウサギ血清、２ｍＭ　Ｇｌｕｔａｍｉｎ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳバッファー（ＧＩＢＣＯ　１４０２５）（以下、細胞アッセイバッファーと記す。）中に細胞濃度１×１０７Ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、９６穴培養プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ　Ｓｕｒｆａｃｅ、Ｎｕｎｃ）の各ウェルに１００μＬ添加した。次いで各種刺激剤を細胞アッセイバッファーにて目的濃度の３倍に調製し、各ウェルに５０μＬ添加した。３７℃で２時間インキュベーションした後に遠心にて上清を採取し、実施例３－（２）の測定系でｓＣＤ１４－ＳＴを測定した。結果を図４に示す。白血球による貪食・消化が起こる刺激剤（大腸菌菌体またはザイモザン）ではｓＣＤ１４－ＳＴの上昇が認められた。一方、ＬＰＳ、ＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ　ｍｙｒｉｓｔａｔｅ　ａｃｅｔａｔｅ）、ｆＭＬＰ（ｆｏｒｍｙｌ　ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ　ｌｅｕｃｙｌ　ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）等の貪食が起こらない刺激剤ではｓＣＤ１４－ＳＴの上昇は認められなかった。また、貪食はおこるが消化はされないマイクロビーズでもｓＣＤ１４－ＳＴの上昇は認められなかった。さらに、高分子量ｓＣＤ１４測定用のキット（Ｒ＆Ｄ）を用いて高分子量ｓＣＤ１４の産生を測定したところ、図５に示す様に、ＬＰＳやＰＭＡによる刺激で高分子量ｓＣＤ１４の産生上昇が認められた。この事は、ｓＣＤ１４－ＳＴと高分子量ｓＣＤ１４は産生機序が異なることを示している。
５－（３）各種阻害剤のｓＣＤ１４－ＳＴ産生に対する作用
　実施例５－（２）においてウサギｓＣＤ１４－ＳＴの産生に顆粒球の貪食活動が関わっていることが示唆された。そこで各種貪食阻害剤を用いてｓＣＤ１４－ＳＴの産生と貪食の関係を検討した。すなわち、実施例５－（１）で採取したウサギ腹腔滲出顆粒球を細胞アッセイバッファー中に細胞濃度１×１０７Ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、４８穴培養プレート（４８　Ｗｅｌｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルに２００μＬ添加した。次いで各種阻害剤を細胞アッセイバッファーにて目的濃度の３倍に調製したものを各ウェルに１００μＬ添加した。３７℃で３０分間反応した後に大腸菌を顆粒球の２０倍量となるように添加した（大腸菌は１コロニー形成ユニットを１個として添加する）。３７℃で２時間インキュベーションした後、遠心にて上清を採取し、実施例３－（２）の測定系を用いてｓＣＤ１４－ＳＴを測定した。結果を図６に示す。貪食におけるメンブレントラフィックを阻害するＰＩ３キナーゼ阻害剤Ｗｏｒｔｏｍａｎｉｎと、細胞骨格を変性させることにより貪食を阻害するアクチンの脱重合剤Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　ＤによりウサギｓＣＤ１４－ＳＴの産生が阻害された。
（実施例６）ウサギ関節炎モデルの関節液中のｓＣＤ１４－ＳＴの測定
６－（１）メチル化ＢＳＡの調製
　ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）１ｇを４％　Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅを含むＤ－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１００ｍＬに溶解し、アルカリを用いてｐＨを８．５に調整した後、室温で１時間反応した。次いで水素化ホウ素ナトリウムを８０ｍｇ添加し、４℃で２時間還元反応した後、限外膜を用いてＤ－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。
６－（２）ＥＬＩＳＡによる免疫反応確認
　抗原に対する免疫反応の確認をＥＬＩＳＡ法にて行った。すなわちメチル化ＢＳＡをＤ－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）に５０μＬ／ウェルで添加した。３７℃で１時間反応後、イオン交換水で５回洗浄し、５％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ）を含むＤ－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を各ウエルに１００μＬ添加してブロッキングした。次に実施例６－（３）の試験に供した各ウサギの血液サンプル（血清）を、１％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ）を含むＤ－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて希釈し、各Ｗｅｌｌに１００μＬ添加した。室温で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄した。次にペルオキシダーゼ標識抗ウサギイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ、Ｐ４４８）を５％ヤギ血清含有Ｄ－ＰＢＳで１０００倍に希釈し各ウエルに５０μＬ添加した。室温で１時間反応後、同様に５回洗浄しＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦＸ）を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（マルチスキャンＪＸ、大日本製薬）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
６－（３）ウサギ関節炎モデルにおけるｓＣＤ１４－ＳＴの測定
　実施例６－（１）で調製したメチル化ＢＳＡ５００μＬ（５ｍｇ）とフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）５００μＬを混合し、これをニュージーランド白色ウサギ（北山ラベス）オス１０－１１週齢の背部皮下、後肢足底部、大腿部筋肉内に投与した（以下、抗原感作群と記す）。また、同時に同じ数のウサギに対してメチル化ＢＳＡを加えていない溶媒投与した（以下、溶媒対照群と記す）。２週間後、抗原感作群に対してメチル化ＢＳＡ５００μＬ（５ｍｇ）と不完全フロインドアジュバント（ＤＩＦＣＯ）５００μＬを混合し、再感作した。なお、溶媒対照群に対してはメチル化ＢＳＡを加えていない溶媒を同じように投与した。さらに１週間後ウサギ耳動脈より採血し、実施例６－（２）のＥＬＩＳＡ法にて血中抗体価を測定して、抗原感作群において感作が成立していることを確認した。次いでメチル化ＢＳＡをＤ－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて５ｍｇ／ｍＬに調製し、１ｍＬを抗原感作群の膝関節腔内に投与して関節炎を惹起した。また同時に溶媒対照群に対してはＤ－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を膝関節腔内に１ｍＬ投与した。惹起４日後と１０日後に両群の膝関節腔内洗浄液を採取してｓＣＤ１４－ＳＴの測定、塗沫による血球画分の分析を行った。また同時に耳介動脈より採血（クエン酸加血）し血中のｓＣＤ１４－ＳＴを測定した。塗沫検体において、抗原感作群には多くの顆粒球の集積が認められた。また、膝関節腔内洗浄液を実施例３－（２）に記載のｓＣＤ１４－ＳＴ測定系に供したところ、図７に示す様に抗原感作群では、抗原感作後４日後および１０日後においてｓＣＤ１４－ＳＴの上昇が認められた。なお、１０日後においても高値を示していたことは、関節炎に伴う自己組織への過剰な免疫反応による貪食活動によりｓＣＤ１４－ＳＴが産生されたことを示している。一方、両群において血中ｓＣＤ１４－ＳＴの上昇は認められなかった。
（実施例７）ヒト由来食細胞の貪食活動に伴うｓＣＤ１４－ＳＴ産生
７－（１）ヒト末梢血顆粒球の調製
　正常人より採取した末梢血より、比重ｄ＝１．０７７とｄ＝１．１１９の二層を使った比重遠心法にて顆粒球画分を調製した。
７－（２）顆粒球の貪食活動によるｓＣＤ１４－ＳＴの産生
　顆粒球に各種白血球刺激剤を添加してｓＣＤ１４－ＳＴの産生量を評価した。すなわち実施例７－（１）で採取したヒト末梢血顆粒球を１０％正常ヒト血清、２ｍＭ　Ｇｌｕｔａｍｉｎ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１０ｎｇ／ｍｌＧ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ　Ｒ８７５８）中に細胞濃度０．５×１０７Ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。これを９６穴培養プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ　Ｓｕｒｆａｃｅ、Ｎｕｎｃ）の各ウェルに１００μＬで添加し、５％二酸化炭素存在下で３７℃で一晩インキュベーションした。次いで各種刺激剤を１０％正常ヒト血清、２ｍＭ　Ｇｌｕｔａｍｉｎ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳバッファーにて１．５倍濃度に調製し、各ウェルに２００μＬで添加した。３７℃で２時間インキュベーションした後に、遠心にて上清を採取し、ヒトｓＣＤ１４－ＳＴを測定した。ヒトｓＣＤ１４－ＳＴの測定には、国際公開ＷＯ２００５／１０８４２９号公報の実施例７－（３）に記載の測定キットを用いた。すなわち、ヒトｓＣＤ１４－ＳＴを特異的に認識する、ヒトＣＤ１４の５３～６８番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（Ｓ６８抗体）を含むサンドイッチ測定キットである。サンドイッチ測定系とするため、もう一種の抗体として、ヒトＣＤ１４の１７～２６番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（Ｆ１１０６－１３－３）をペルオキシダーゼ標識したものを使用した。図８に示す様に、実施例５と同様に貪食刺激剤（大腸菌菌体またはザイモザン）でｓＣＤ１４－ＳＴの上昇が認められたがＬＰＳやマイクロビーズでは認められなかった。
７－（３）貪食阻害剤のｓＣＤ１４－ＳＴ産生に対する作用
　ヒト顆粒球によるｓＣＤ１４－ＳＴの産生に対する貪食阻害剤の作用を検討した。すなわち実施例７－（２）と同様にヒト末梢血顆粒球を９６穴培養プレートで一晩インキュベーションした。次いで各種貪食阻害剤を１０％正常ヒト血清、２ｍＭ　Ｇｌｕｔａｍｉｎ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳバッファーにて３倍濃度に調製し、各ウェルに１００μＬで添加した。３７℃で１時間インキュベーションした後、大腸菌を顆粒球の３０倍量となるように添加した（大腸菌は１コロニー形成ユニットを１個として添加する）。３７℃で２時間インキュベーションした後に遠心にて上清を採取し、国際公開ＷＯ２００５／１０８４２９号公報の実施例７－（３）に記載の測定キットを用いてヒトｓＣＤ１４－ＳＴを測定した。その結果、図９に示す。実施例５－（３）と同様にＷｏｒｔｏｍａｎｉｎ、Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　ＤはｓＣＤ１４－ＳＴの産生を阻害した。
７－（４）ＨＬ－６０細胞を用いた貪食実験
　ＨＬ－６０細胞をＤＭＳＯ存在下で培養し顆粒球へと分化させ、実施例７－（２）と同様の実験に供した。実施例７－（２）と同様にザイモザンまたは大腸菌添加でｓＣＤ１４－ＳＴの産生が認められた。
　なお、上述の実施例は本発明の好適な実施の一例ではあるが、その範囲を限定するものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。

Claims (11)

  1. 　下記の工程を含むことを特徴とする、食細胞の機能評価方法、
    　１）食細胞と貪食物質を接触させる工程、
    　２）食細胞により産生されるｓＣＤ１４－ＳＴを測定する工程、および
    　３）検体の測定値を標準値と比較し、食細胞の貪食活動の有無および／または程度を判定する工程。
  2. 　食細胞の機能を評価することによる食細胞の機能異常を伴う疾患の検出方法であって、
    　１）請求項１に記載の方法により、被験体由来の食細胞の機能を評価する工程、
    　２）評価した結果を正常値と比較する工程、および
    　３）被験体由来の食細胞の機能が正常値より高値または低値であるかにより疾患の有無および／または程度を判定する工程、
    を含むことを特徴とする方法。
  3. 　食細胞の機能を評価することによる免疫機能の評価方法であって、
    　１）請求項１に記載の方法により、被験体由来の食細胞の機能を評価する工程、
    　２）評価した結果を正常値と比較する工程、および
    　３）被験体由来の食細胞の機能が正常値より高値または低値であるかにより免疫機能の程度を判定する工程、
    を含むことを特徴とする方法。
  4. 　食細胞の機能を評価することによる薬剤の効果の評価方法であって、
    　１）請求項１に記載の方法により、薬剤投与中および／または薬剤投与後の被験体由来の食細胞の機能を評価する工程、
    　２）評価した結果を正常値および／または薬剤投与前の評価結果と比較する工程、および
    　３）薬剤の投与による被験体由来の食細胞の機能の変化の有無および／または程度を判定する工程、
    を含むことを特徴とする方法。
  5. 　下記の工程を含むことを特徴とする、貪食機能調節物質のスクリーニング方法、
    　１）食細胞と被験物質を接触させる工程、
    　２）食細胞により産生されるｓＣＤ１４－ＳＴを測定する工程、および
    　３）食細胞の貪食能に対する被験物質の効果を評価する工程。
  6. 　貪食物質の存在下で、食細胞と被験物質を接触させることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. 　下記の工程を含むことを特徴とする、食細胞による貪食が関連する疾患の検出方法、
    　１）被験体由来の検体（血液を除く）に含まれるｓＣＤ１４－ＳＴを測定する工程、
    　２）測定した値を正常値と比較する工程、および
    　３）検体中のｓＣＤ１４－ＳＴの量が正常値より高値であるか否かを判定する工程。
  8. 　検体に貪食物質を添加後、ｓＣＤ１４－ＳＴを測定することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  9. 　食細胞による貪食が関連する疾患が関節リウマチであり、検体が関節液である、請求項７または８に記載の方法。
  10. 　食細胞による貪食が関連する疾患が乳房炎であり、検体が乳汁である、請求項７または８に記載の方法。
  11. 　ｓＣＤ１４－ＳＴを含有する食細胞の機能を評価するためのマーカー。
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