JP3663243B2 - Ｆａｓ抗原の免疫学的測定法及び測定用キット - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｆａｓ抗原の免疫学的測定法及び測定用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術、及び発明が解決しようとする課題】
多細胞生物においては個体発生の過程において多くの細胞が細胞死により除去される。この細胞死は、あらかじめ決められたプログラムによって起こっていると推測されている。また、成体においても、一方で細胞分裂により細胞数が増えると、他方で細胞死が起こり、全体の細胞数のバランスを保っていると考えられる。ワイリー（Wyllie）らは、死につつある細胞の形態を電子顕微鏡で観察し、細胞死を形態学的に２種類（即ちネクローシスとアポトーシス）に分類した(Wyllie A.H. et al. Int.Rev.Cytol., 第68巻、251-306頁、1980年）。
【０００３】
ネクローシスの場合には、初期の段階で細胞膜の透過性が増大し、核やミトコンドリアなどの細胞内小器官が膨潤し、やがてライソゾームの破壊が起き、放出した蛋白分解酵素などにより細胞が破壊する。一方、アポトーシスの場合には、ミトコンドリアやライソゾームの構造には大きな変化は認められず、初期の段階で核内で染色体が凝縮し、細胞質も収縮する。同時に核がいくつかの部分に断片化されたり、細胞表面に泡のような構造が生じた後、アポトーティックボディーと呼ばれるミニ細胞に分かれることもある。
【０００４】
外的原因によって起こる、いわば受動的な死は、主としてネクローシスによって起こるのに対し、発生や分化あるいは組織のターンオーバーの過程で見られるあらかじめプログラムされた細胞死は、アポトーシスによって起こると考えられている。
【０００５】
アポトーシスあるいはプログラム細胞死と呼ばれる細胞死の制御に深く関連すると考えられている生体構成細胞表層に存在するタンパクは、Ｆａｓ抗原と呼ばれ、細胞膜の脂質二重層を１回貫通する疎水性ペプチド配列を有し、全体として細胞外領域、膜貫通領域及び細胞内領域の３つの主領域から構成される膜貫通タンパクである。マウス及びヒトＦａｓ抗原のアミノ酸配列、及びアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は既に明らかにされている（Cell、第66巻、233頁−243頁、1991年、イトウナオトら、J. Immunol. 、第148巻、第4号、1274頁−1279頁、1992年、ワタナベ（フクナガ）リエら、J. Biol. Chem. 、第267巻、第15号、10709−10715頁、1992年、エーム（Alexander Oehm）ら、J. Exp. Med. 、第169巻，1747−1756頁、1989年、ヨネハラシンら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第87巻、9620−9624頁、1990年、コバヤシノブユキら、Science、第245巻、301−305頁、1989年、トラウス（Bernhard C. Trauth）ら、J. Immunol. 、第149巻、第10号、3166−3173頁、1992年、ダイン（Jeas Dein）ら、The Lancet. 第335巻、497−500頁、1990年、デバティン（Klaus-Michael Debatin）ら、J. Immunol.、第149巻、第11号、3753−3758頁、1992年、ミヤワキトシオら、Genomics、第14巻、179−180頁、1992年、リヒター（Peter Lichter）ら等参照）。
【０００６】
米原らは、ヒトＦＳ−７細胞の細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を作製し、抗Ｆａｓ抗体を得たが、この抗体はＦａｓ抗原を発現している細胞を殺す活性を示した（J. Exp. Med. 、第169巻、1747−1756頁、1989年）。また、その細胞死は電子顕微鏡による観察からアポトーシスの特徴を示したことからＦａｓ抗原はアポトーシスによる細胞死を媒介すると結論された。これとは別に、トラウス（Trauth）らは、抗Ｆａｓ抗体に良く似た性質を持ち、細胞を殺す活性を示すモノクローナル抗体、ＡＰＯ−１抗体を得た（SCIENCE、第245巻、301−305頁、1989年）。この二つの抗体は、細胞死を誘導するという点で共通なだけではなく、抗原の分布や分子量など極めて良く似ており、同じものであることが明らかにされている。
【０００７】
Ｆａｓ抗原はその構造解析の結果、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターや神経成長因子（ＮＧＦ）に良く似た構造をしていること、外部からのシグナルを受けて細胞死を起こす新しい種類のレセプターであることが明らかにされ、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーを形成する受容体の一つとされている。
【０００８】
最近において、自己免疫の症状を呈するマウス（ＭＲＬ／ｌｐｒマウス）においてＦａｓ遺伝子の異常が認められることや、ＨＩＶ感染者において高いレベルのアポトーシスがリンパ球に起こっていることと、Ｆａｓ抗原が関連していることが示唆されるようになり、Ｆａｓ抗原の発現と自己免疫疾患等の疾患との関係が注目されるようになった。
【０００９】
チェンら（Chengt. J. et al., Science、 第263巻、1759−1762頁、1994年）は、これらＦａｓ抗原の転写の異常と自己免疫疾患の関連を調べるために、自己免疫疾患（リウマチ(Rheumatoid Arthritis；RA)、ＳＬＥ(Systemic Lupus erythematosus)）患者及び健常人から細胞内のｃＤＮＡを取り出し、調べたところ、どちらにもＦａｓ抗原の全長をコードする通常の１１６７ｂｐのｃＤＮＡの他に、１１０４ｂｐの小さなｃＤＮＡが見られることを発見した。さらにこの１１０４ｂｐの小さなｃＤＮＡについて１１６７ｂｐのｃＤＮＡと比較したところ、疎水性の膜貫通部位(ＴＭ、 transmembrane domain) を欠いていることから、この小さなｃＤＮＡ（Ｆａｓ△ＴＭと呼ばれる）は、血液、血清、血漿、尿、唾液及び骨髄等の体液に可溶性のＦａｓ抗原（以下、「可溶性Ｆａｓ抗原」という）をコードしていることが明らかにされた。
【００１０】
チェン(Chengt)らは、マウスを可溶性Ｆａｓ抗原で処理することにより胸腺細胞中のＣＤ４、ＣＤ８単独陽性細胞及びダブルネガティブの細胞が増加し、ダブルポジティブの細胞が減少すること、脾臓細胞の総細胞数が増加すること、さらにＳＬＥ患者においては血清中の可溶性Ｆａｓ抗原の量が健常人に比して２倍程度に増加していること等から、可溶性Ｆａｓ抗原の過剰産生により胸腺や末梢組織でのアポトーシスが阻害され、自己反応性のリンパ球クローンの適切な排除が行われないために、自己免疫疾患の発症が誘引されるとの病因論を展開した。
【００１１】
このことから、血清等の体液中における可溶性Ｆａｓ抗原の量を測定することは、自己免疫疾患等のＦａｓ抗原の動態が関与していると考えられる種々疾患の予知、診断及び治療方針の確立、治療の効果の判定に有用であり、該測定法及び測定用試薬（キット）の確立が熱望されている。
【００１２】
血清等の体液中における可溶性Ｆａｓ抗原を検出、測定する方法としては、ウェスタンブロット法（Western Blot technique、Ｗ．Ｂ．法）、放射免疫測定法（Radioimmunoassay、ＲＩＡ法）、酵素免疫測定法（Enzyme Immunoassay、ＥＩＡ法あるいは Enzyme-linked Immunosorbent Assay、ＥＬＩＳＡ法）等の適用を考えることができる。しかしながら、Ｗ．Ｂ．法では感度が高く特異性が高いものの、定量性に欠け、大量の検体を一時に処理するには不向きである。また、ＲＩＡ法では放射性物質を標識物質として用いることから、管理された施設において資格を有する者にしか扱うことができないという欠点を有している。一般的にＥＩＡ法あるいはＥＬＩＳＡ法は前記のような問題がなく簡便に感度良く測定することが可能であるが、これまでそのような方法を用いた血清等の体液中の可溶性Ｆａｓ抗原の高精度かつ十分な感度を有した簡便な測定法は知られていない。
【００１３】
また、Ｆａｓ抗原のうち、完全なＦａｓ抗原は疎水性の膜貫通部位をはさんで親水性の細胞内領域と細胞外領域を持ち、可溶性Ｆａｓ抗原は膜貫通領域が欠如しているが、細胞外に分泌されるＦａｓ抗原としてはこのほかに酵素的に切断されて細胞外領域のみを有する分子が存在することも考えられる。この酵素的に切断された分子はＦａｓ抗原の定量性に影響を及ぼさないことが望ましい。
【００１４】
更に、血清等の体液中に含有される可溶性Ｆａｓ抗原を測定（定量）するためには、その測定法の感度あるいは精度の確認や測定値から間接的に可溶性Ｆａｓ抗原の含量を割り出すための検量線の作成のために、標準物質（スタンダード）として精製された可溶性Ｆａｓ抗原を入手する必要がある。ところが、精製された可溶性Ｆａｓ抗原を量産する技術はこれまでのところ確立されていない。
【００１５】
本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、酵素的に切断されたＦａｓ抗原の影響を受けずに感度良くしかも大量の検体を簡便に測定するＦａｓ抗原の免疫学的測定法及び測定用キットを提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段、発明の実施の形態、及び発明の効果】
本発明の第１は、Ｆａｓ抗原の測定法であって、Ｆａｓ抗原の細胞内領域又は細胞外領域のうちの一方と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体に標準物質としての細胞抽出Ｆａｓ抗原を反応せしめた後、前記ａ）にてＦａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体を用いた場合は、Ｆａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を標識化した標識化抗体を反応させ、前記ａ）にてＦａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体を用いた場合は、Ｆａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を標識化した標識化抗体を反応させ、反応生成物の標識量を測定することにより検量線を作製する工程、及び、前記固相化抗体に検体を反応せしめた後、前記標識化抗体を反応させ、反応生成物の標識量を測定し、前記検量線から検体中に含まれるＦａｓ抗原を定量する工程、を含むことを特徴とするものである。
【００１７】
本発明の第２は、抗Ｆａｓ抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体と、
抗Ｆａｓ抗体を標識化した標識化抗体と、標準物質としての細胞抽出Ｆａｓ抗原とを含むＦａｓ抗原の免疫学的測定用キットであって、前記固相化抗体及び標識化抗体のうちいずれか一方は、Ｆａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合する抗Ｆａｓ抗体を用いて作製したものであり、他方は、Ｆａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合する抗Ｆａｓ抗体を用いて作製したものであることを特徴とする。
【００１８】
ここで、固相化抗体としてＦａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を用いる場合には、標識化抗体としてＦａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を用いる。逆に、固相化抗体としてＦａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を用いる場合には、標識化抗体としてＦａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を用いる。
【００１９】
また、固相化抗体に用いる不溶性支持体としては、例えばポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等のプラスチックや、ガラスといった水に不溶性の物質であれば、特に限定されない。この不溶性支持体への担持は単なる物理吸着でもよいし、化学的な結合であってもよい。
【００２０】
本発明において、Ｆａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体は、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列に特異的に反応する抗Ｆａｓ抗体であることが好ましい。また、Ｆａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体は、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列に特異的に反応する抗Ｆａｓ抗体であることが好ましい。また、標準物質としての細胞抽出Ｆａｓ抗原は、ＷＲ１９Ｌ−１２ａ細胞由来のＦａｓ抗原であることが量産する上で好ましい。尚、ＷＲ１９Ｌ−１２ａ細胞の作製法は例えばイトウら（Cell、第66巻、233-243頁、1991年）によって報告されている。また、標識化抗体は、放射性元素を標識物質として標識化した抗Ｆａｓ抗体を用いてもよいがこの場合には有資格者が管理された施設において取り扱う必要があるため、取扱いの容易さを考慮すると、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びビオチンからなる群から選ばれる標識物質で標識された抗Ｆａｓ抗体であることが好ましい。
【００２１】
本発明の免疫学的測定法及び測定用キットでは、固相化抗体及び標識化抗体のうちいずれか一方を細胞内領域と特異的に結合する抗Ｆａｓ抗体を用いて作製し、いずれか他方を細胞外領域と特異的に結合する抗Ｆａｓ抗体を用いて作製する。このため、本発明によれば、完全なＦａｓ抗原（即ち、疎水性の膜貫通部位をはさんで親水性の細胞内領域と細胞外領域を持つＦａｓ抗原）及び可溶性Ｆａｓ抗原（即ち、完全なＦａｓ抗原から膜貫通領域が欠如したもの）を測定することが可能である。尚、Ｆａｓ抗原が酵素的に切断されて細胞外領域のみとなったものは、本発明の測定系により検出されないため、かかる細胞外領域のみとなったものにより定量値が影響を受けることはない。
【００２２】
以上の本発明のＦａｓ抗原の免疫学的測定法及び測定用キットによれば、酵素的に切断されたＦａｓ抗原の影響を受けずに感度良くしかも標準物質を量産できるため大量の検体を簡便に測定できるという効果が得られる。また、検体中のＦａｓ抗原を定量することにより、自己免疫疾患の予知、診断及び治療方針の確立、治療の効果の判定を行うことができるため、有用である。
【００２３】
【実施例】
完全なＦａｓ抗原の構造を摸式的に示せば図１のようになる。ここで、アミノ酸のＮ末端から数えたペプチドの番号１７〜３３、５４〜７２、３２１〜３３５はアミノ酸分析の結果から親水性の領域であって抗原決定基の存在する可能性のある領域である。
【００２４】
発明者らは、完全なＦａｓ抗原（細胞外領域、膜貫通領域、細胞内領域を含むもの）と可溶性Ｆａｓ抗原（完全なＦａｓ抗原から膜貫通領域を欠いたもの）を特異的に測定するために、Ｆａｓ抗原の細胞内領域及び細胞外領域に対する抗体を別々に作製し、これらの抗体を用いていわゆるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定すべきであると考えた。
［実施例１］Ｆａｓ抗原の細胞内領域に対する抗体の作製
［１−１］合成ペプチドの作製
Ｆａｓ抗原の細胞内領域に対する抗体としては、抗Ｆａｓポリクローナル抗体を用いることとした。即ち、発明者らは伊藤、米原らの文献（Cell、第66巻、233-243頁、 1991年）に発表されているヒトＦａｓ抗原のアミノ酸配列を基にＦａｓ抗原の疎水マッピングを行い、細胞内領域にあるＣ末端のアミノ酸３２１〜３３５番目の親水性領域（配列表の配列番号１参照）を選択し、合成ぺプチドを作製した。合成ペプチドは全自動合成装置を用いてＦｍｏｃ法を用いた固相法により作製した（合成法の詳細は秀潤社刊、細胞工学別冊「抗ペプチド抗体実験プロトコール」参照）。実際の合成ペプチドには、この合成ペプチドを高分子担体に結合させる際に有利なように、Ｎ末端側にヒトＦａｓとは無関係なシステイン残基を一つ付加した（下式参照）。
【００２５】
【化１】
【００２６】
［１−２］合成ペプチドと高分子担体との結合
実施例１−１で作製した合成ペプチド（上式参照）はアミノ酸１６個と比較的小さく、このような低分子化合物（ハプテンと呼ぶ）の場合にはそのままでは抗原性が弱く抗体ができにくいため、免疫の際には抗原性を高めるために高分子担体に結合させる必要がある。このような高分子担体としてはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）等が用いられるが、ここではＫＬＨを用いた。
【００２７】
ＫＬＨとの結合法としては、一般的にはグルタルアルデヒド法、カルボジイミド法、ジアゾ縮合法、マレイミドベンゾイルオキシサクシニミド（ＭＢＳ）法などがあるが、ＭＢＳ法以外は非特異的な結合であるため合成ペプチドが化学的に修飾されてしまう可能性がある。ＭＢＳ法はＫＬＨと合成ペプチドが持つシステイン残基の間をＭＢＳで架橋して結合させる方法であり、この方法によれば合成ペプチドの化学的修飾が避けられ、高い質のペプチド抗体を作製することが可能とされている。このため、ここではＭＢＳ法により実施例１−１で作製した合成ペプチドと高分子担体とを結合させた（結合の具体的な方法は前出の「抗ペプチド抗体実験プロトコール」48〜52頁参照）。
［１−３］免疫
実施例１−２で得た結合体（合成ペプチドとＫＬＨとの結合体）を用いて、ウサギ（日本白色メス ３．５ｋｇ）に対し、１回／週で１０箇所ほど皮下免疫を行い、５回免疫後に耳下静脈より少量の採血を行い、血清を分離しＥＬＩＳＡ法により抗体価をチェックした。即ち、１／１００Ｍ生理的リン酸化緩衝食塩液（ＰＢＳ）にＫＬＨと結合しない合成ペプチドを溶解して０．１ｍｇ／ｍｌの溶液を調製し、この溶液をヌンク社製９６穴マイクロプレート「マキシソープ」に１００μｌ添加し、室温（２０〜２５℃）で３時間放置した後、液を吸引除去し、５％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ３０μｌを加えて約１８時間４℃に静置し、カップの未反応部分をブロックした。ブロッキング液を除きＰＢＳ３００μｌで３回洗浄した後、ＰＢＳで希釈した抗血清の系列を作製し、この溶液１００μｌを各カップに加えて室温（２０〜２５℃）で１時間静置した後反応液を除きＰＢＳ３０μｌで４回洗浄した。次に、希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（（株）医学生物学研究所 製）１００μｌを加え室温（２０〜２５℃）で１時間静置反応させた後、再度同様に洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンと過酸化水素の溶液１００μｌを発色基質として加え、一定時間反応させた後１．５Ｍリン酸を添加して反応を停止し、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定結果を図２のグラフに示す。この図２から明らかなように、得られた抗血清は十分な抗体価を示すものである。このように十分な抗体価を示したウサギについては耳下静脈より７０ｍｌの採血を行い、約３０ｍｌの抗血清を得た。
［１−４］合成ペプチドに対する特異抗体の調製
実施例１−３で得た抗血清には目的とする抗体以外の血清成分や他の抗体が含まれている。測定系の感度を上げるためには実施例１−１の合成ペプチドと反応する抗体のみを不溶性支持体に結合させることが好ましいことから、アフィニティークロマトグラフィーにより特異抗体の採取を行った。即ち、マグネチックスターラーを用い、ウサギ血清に５０％飽和となるように硫酸アンモニウムの粉末を徐々に加え、析出した分画を遠心分離によって上清と分け、最少量のＰＢＳに溶解した後、十分量のＰＢＳを用いて透析し、硫酸アンモニウムを除いた。これを合成ペプチドを結合させたセファロース４Ｂゲルにアプライし、十分量のＰＢＳで洗浄した後、ゲルに結合した免疫グロブリンを０．１７Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ２．３を用いて溶出した。溶出した合成ペプチド特異抗体は抗体活性の低下を回避するため速やかに１／１０量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９．０を加えて中和した。以上の方法によりウサギ血清１ｍｌあたり０．５ｍｇの合成ペプチド特異抗体（即ち、Ｆａｓ抗原の細胞内領域に対する抗体）を得た。
【００２８】
尚、合成ペプチド結合セファロース４Ｂの作製はファルマシア社の操作指示書に従った。即ち、ファルマシア社より購入したＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ６ｇを１ｍＭ ＨＣｌ６００ｍｌに加えて１５分間静置してゲルを膨潤させた後、ガラスフィルタを用いて１ｍＭ ＨＣｌを除去し、さらに１ｍＭ ＨＣｌ６００ｍｌを用いて同様にゲルを洗浄した。洗浄したゲルは３０ｍｌの０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 、ｐＨ８．３（カップリングバッファ）３０ｍｌに懸濁した。一方、合成ペプチド２０μｍｏｌを２０ｍｌのカップリングバッファに溶解し、上記のゲル懸濁液と混合して室温で１時間ゆるやかに攪拌した後ガラスフィルタを用いて２００ｍｌのカップリングバッファで洗浄し、余分なペプチドを除いた。余分な活性基をブロックするために、さらに０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ 酢酸バッファｐＨ４．０と、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファｐＨ８．０各１００ｍｌで３回交互に洗浄した。
［実施例２］Ｆａｓ抗原の細胞外領域に対する抗体の作製
Ｆａｓ抗原の細胞外領域に対する抗体としては、クローンＶＢ３（（株）医学生物学研究所 製）を用いて抗Ｆａｓモノクローナル抗体を調製することとした。このクローンＶＢ３はヒトＦａｓ分子上のアミノ酸のＮ末端から数えて１２６〜１３５番目（細胞外領域）にあり、そのアミノ酸配列は配列表の配列番号２の通りである。
【００２９】
抗Ｆａｓモノクローナル抗体は次のようにして得た。即ち、クローンＶＢ３（２×１０8 個）を無血清ＡＳＦ１０４培地（味の素社（製））中、３７℃で５日間培養し、得られた培養上清をオメガセル（フィルトロン社（製））で超遠心した。遠心上清を回収し、ヒドロキシルアパタイトカラム（アサヒ光学社（製））に供した。ＦＰＬＣシステム（ファルマシアファインケミカル社（製））を用いて、リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４、１０〜４００ｍＭ）で溶出させた。溶出画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、９５％以上の純度で精製された抗Ｆａｓモノクローナル抗体を得た（ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（J. Exp. Med.）第１６９巻、第１７４７〜１７５６頁（１９８９年）における報告を参照）。
［実施例３］固相化抗体の作製
実施例１−４で得た合成ペプチド特異抗体を０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．０で５μｌ／ｍｌの濃度に調製し、ヌンク社製９６穴マイクロプレート「マキシソープ」の各ウエルに１０μｌずつ加え、４℃で２０時間静置反応させた。抗体溶液を捨て、１％ＢＳＡ、５％ショ糖を含むＰＢＳを各ウエル２００μｌずつ加え、室温（２０〜２５℃）で２時間静置してブロッキングを行った。ブロッキング液を捨て、プレートを風乾し、固相化抗体を得た。この固相化抗体は乾燥剤と共に密封して保存した。
［実施例４］標識化抗体の作製
実施例２で得た抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体（クローンＶＢ３）の精製ＩｇＧ １ｍｇあたり０．０５６Ｕのフィシンを添加し、３７℃で８時間反応させた後、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡＣＡ４４を用いてゲルろ過し、Ｆ（ａｂ）'2分画を得た。このＦ（ａｂ）'2分画にマレイミド法によりペルオキシダーゼを標識し、ペルオキシダーゼ標識化抗体とした。尚、標識は医学書院刊、石川栄治著「酵素免疫測定法 第３版」に従って行った。
［実施例５］ 細胞抽出Ｆａｓ抗原（スタンダード）の作製
Ｆａｓスタンダードとしては、ヒトＦａｓ ｃＤＮＡを導入して形質転換させ、ヒトＦａｓをその細胞表面に発現している細胞ＷＲ１９Ｌ−１２ａ（米原ら、Cell、第66巻、233-243頁、1991年）から調製したＦａｓ分子を用いることとした。
【００３０】
即ち、ヒトＦａｓ抗原をコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＦ５８をＸｈｏＩで消化して得たヒトＦａｓ抗原ｃＤＮＡを含有するフラグメントを、発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（Nucleic acid research, 第18巻、5322頁、1990年）に、ＢｓｔＸＩアダプターを用いて導入し、発現プラスミドｐＥＦＦ５８を得た。ＶｓｐＩで消化した２５μｇ／ｍｌのｐＥＦＦ５８フラグメントとＥｃｏＲＩで消化した２．５μｇ／ｍｌのｐＭＡｎｅｏ（クローンテック社製）フラグメントを用いて、１×１０7 個（０．８ｍｌ）のマウスＴリンパ腫ＷＲ１９Ｌ細胞（ATCC TIB52）をエレクトロポレーションにより共形質転換した。該細胞を抗生物質Ｇ４１８含有培地中で培養して、Ｇ４１８耐性クローンを選別した。得られたＧ４１８耐性クローンをフローサイトメータ及び限外希釈法で分析することによりヒトＦａｓ抗原過剰発現形質転換細胞ＷＲ１９Ｌ−１２ａをクローン化した。
【００３１】
ＷＲ１９Ｌ−１２ａ細胞は１０％ ＦＣＳ， ４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭ倍地で培養し、集めた細胞５×１０7 個に対して１ｍｌのＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ノニデットＰ−４０，０．５％デオキシコール酸、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０ ）を加え超音波破砕機により粉砕した。粉砕後の液を超遠心（４℃、×５００００ｇ、３０分）し、その上清中に可溶化されたＦａｓをスタンダードとした。
［実施例６］血清中のＦａｓ抗原の測定
被検血清を１０％の正常ウサギ血清を含むＰＢＳで５倍希釈しマイクロプレート（実施例３の固相化抗体）に１００μｌずつ添加した。スタンダードは同じバッファーで２ｎｇ／ｍｌの濃度から倍数希釈して調製し、同じく１００μｌを添加した。
【００３２】
そして室温（２０〜２５℃）で１時間緩やかに振盪しながら反応させた後、０．１％ ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを各ウエルに３０μｌ加え洗浄した。洗浄は５回行った。洗浄液を除いた後、実施例４で得たペルオキシダーゼ標識化抗体を１％ＢＳＡ、０．７９％ＮａＣｌ、０．１％パラヒドロキシフェニル酢酸（p-Hydroxyphenyl acetic acid ）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファｐＨ７．２で１μｇ／ｍｌに希釈し、これを各ウエルに１００μｌずつ添加し、室温（２０〜２５℃）で１時間緩やかに振盪しながら反応させ再度同様に洗浄した。洗浄液を除き、１．６ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン２塩酸塩、２０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１．２５％ポリエチレングリコール４０００を含む１０ｍＭクエン酸ナトリウム溶液と、１０ｍＭの過酸化水素を含む１０ｍＭクエン酸溶液を等量混合し、この液１００μｌずつを加えて室温（２０〜２５℃）で３０分間緩やかに振盪しながら反応させた後、１．５Ｎリン酸１００μｌを加えて反応を停止し、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。検体中のＦａｓ濃度はスタンダードの濃度と吸光度より作成したスタンダードカーブ（図３のグラフ参照）を用いて読み取った。
【００３３】
この系を用いて検体を測定した結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
上記表１から明らかなように、ＲＡ患者血清、ＲＡ患者随液、ＳＬＥ患者血清においてＦａｓ抗原の測定値が健常者と比して顕著に高いことが分かる。従って、本実施例の試薬を用い、本実施例の測定法を実施すれば、臨床現場でも容易に可溶性Ｆａｓ抗原の濃度を測定でき、ＳＬＥ等の自己免疫疾患の患者の発見が迅速にできる。
【００３６】
【配列表】
【００３７】
【００３８】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｆａｓ抗原の構造の摸式図である。
【図２】 実施例１の［１−３］における抗血清の抗体価を表すグラフである。
【図３】 血清中のＦａｓ抗原を測定するためのスタンダードのグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｆａｓ抗原の免疫学的測定法及び測定用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術、及び発明が解決しようとする課題】
多細胞生物においては個体発生の過程において多くの細胞が細胞死により除去される。この細胞死は、あらかじめ決められたプログラムによって起こっていると推測されている。また、成体においても、一方で細胞分裂により細胞数が増えると、他方で細胞死が起こり、全体の細胞数のバランスを保っていると考えられる。ワイリー（Wyllie）らは、死につつある細胞の形態を電子顕微鏡で観察し、細胞死を形態学的に２種類（即ちネクローシスとアポトーシス）に分類した(Wyllie A.H. et al. Int.Rev.Cytol., 第68巻、251-306頁、1980年）。
【０００３】
ネクローシスの場合には、初期の段階で細胞膜の透過性が増大し、核やミトコンドリアなどの細胞内小器官が膨潤し、やがてライソゾームの破壊が起き、放出した蛋白分解酵素などにより細胞が破壊する。一方、アポトーシスの場合には、ミトコンドリアやライソゾームの構造には大きな変化は認められず、初期の段階で核内で染色体が凝縮し、細胞質も収縮する。同時に核がいくつかの部分に断片化されたり、細胞表面に泡のような構造が生じた後、アポトーティックボディーと呼ばれるミニ細胞に分かれることもある。
【０００４】
外的原因によって起こる、いわば受動的な死は、主としてネクローシスによって起こるのに対し、発生や分化あるいは組織のターンオーバーの過程で見られるあらかじめプログラムされた細胞死は、アポトーシスによって起こると考えられている。
【０００５】
アポトーシスあるいはプログラム細胞死と呼ばれる細胞死の制御に深く関連すると考えられている生体構成細胞表層に存在するタンパクは、Ｆａｓ抗原と呼ばれ、細胞膜の脂質二重層を１回貫通する疎水性ペプチド配列を有し、全体として細胞外領域、膜貫通領域及び細胞内領域の３つの主領域から構成される膜貫通タンパクである。マウス及びヒトＦａｓ抗原のアミノ酸配列、及びアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は既に明らかにされている（Cell、第66巻、233頁−243頁、1991年、イトウナオトら、J. Immunol. 、第148巻、第4号、1274頁−1279頁、1992年、ワタナベ（フクナガ）リエら、J. Biol. Chem. 、第267巻、第15号、10709−10715頁、1992年、エーム（Alexander Oehm）ら、J. Exp. Med. 、第169巻，1747−1756頁、1989年、ヨネハラシンら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第87巻、9620−9624頁、1990年、コバヤシノブユキら、Science、第245巻、301−305頁、1989年、トラウス（Bernhard C. Trauth）ら、J. Immunol. 、第149巻、第10号、3166−3173頁、1992年、ダイン（Jeas Dein）ら、The Lancet. 第335巻、497−500頁、1990年、デバティン（Klaus-Michael Debatin）ら、J. Immunol.、第149巻、第11号、3753−3758頁、1992年、ミヤワキトシオら、Genomics、第14巻、179−180頁、1992年、リヒター（Peter Lichter）ら等参照）。
【０００６】
米原らは、ヒトＦＳ−７細胞の細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を作製し、抗Ｆａｓ抗体を得たが、この抗体はＦａｓ抗原を発現している細胞を殺す活性を示した（J. Exp. Med. 、第169巻、1747−1756頁、1989年）。また、その細胞死は電子顕微鏡による観察からアポトーシスの特徴を示したことからＦａｓ抗原はアポトーシスによる細胞死を媒介すると結論された。これとは別に、トラウス（Trauth）らは、抗Ｆａｓ抗体に良く似た性質を持ち、細胞を殺す活性を示すモノクローナル抗体、ＡＰＯ−１抗体を得た（SCIENCE、第245巻、301−305頁、1989年）。この二つの抗体は、細胞死を誘導するという点で共通なだけではなく、抗原の分布や分子量など極めて良く似ており、同じものであることが明らかにされている。
【０００７】
Ｆａｓ抗原はその構造解析の結果、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターや神経成長因子（ＮＧＦ）に良く似た構造をしていること、外部からのシグナルを受けて細胞死を起こす新しい種類のレセプターであることが明らかにされ、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーを形成する受容体の一つとされている。
【０００８】
最近において、自己免疫の症状を呈するマウス（ＭＲＬ／ｌｐｒマウス）においてＦａｓ遺伝子の異常が認められることや、ＨＩＶ感染者において高いレベルのアポトーシスがリンパ球に起こっていることと、Ｆａｓ抗原が関連していることが示唆されるようになり、Ｆａｓ抗原の発現と自己免疫疾患等の疾患との関係が注目されるようになった。
【０００９】
チェンら（Chengt. J. et al., Science、 第263巻、1759−1762頁、1994年）は、これらＦａｓ抗原の転写の異常と自己免疫疾患の関連を調べるために、自己免疫疾患（リウマチ(Rheumatoid Arthritis；RA)、ＳＬＥ(Systemic Lupus erythematosus)）患者及び健常人から細胞内のｃＤＮＡを取り出し、調べたところ、どちらにもＦａｓ抗原の全長をコードする通常の１１６７ｂｐのｃＤＮＡの他に、１１０４ｂｐの小さなｃＤＮＡが見られることを発見した。さらにこの１１０４ｂｐの小さなｃＤＮＡについて１１６７ｂｐのｃＤＮＡと比較したところ、疎水性の膜貫通部位(ＴＭ、 transmembrane domain) を欠いていることから、この小さなｃＤＮＡ（Ｆａｓ△ＴＭと呼ばれる）は、血液、血清、血漿、尿、唾液及び骨髄等の体液に可溶性のＦａｓ抗原（以下、「可溶性Ｆａｓ抗原」という）をコードしていることが明らかにされた。
【００１０】
チェン(Chengt)らは、マウスを可溶性Ｆａｓ抗原で処理することにより胸腺細胞中のＣＤ４、ＣＤ８単独陽性細胞及びダブルネガティブの細胞が増加し、ダブルポジティブの細胞が減少すること、脾臓細胞の総細胞数が増加すること、さらにＳＬＥ患者においては血清中の可溶性Ｆａｓ抗原の量が健常人に比して２倍程度に増加していること等から、可溶性Ｆａｓ抗原の過剰産生により胸腺や末梢組織でのアポトーシスが阻害され、自己反応性のリンパ球クローンの適切な排除が行われないために、自己免疫疾患の発症が誘引されるとの病因論を展開した。
【００１１】
このことから、血清等の体液中における可溶性Ｆａｓ抗原の量を測定することは、自己免疫疾患等のＦａｓ抗原の動態が関与していると考えられる種々疾患の予知、診断及び治療方針の確立、治療の効果の判定に有用であり、該測定法及び測定用試薬（キット）の確立が熱望されている。
【００１２】
血清等の体液中における可溶性Ｆａｓ抗原を検出、測定する方法としては、ウェスタンブロット法（Western Blot technique、Ｗ．Ｂ．法）、放射免疫測定法（Radioimmunoassay、ＲＩＡ法）、酵素免疫測定法（Enzyme Immunoassay、ＥＩＡ法あるいは Enzyme-linked Immunosorbent Assay、ＥＬＩＳＡ法）等の適用を考えることができる。しかしながら、Ｗ．Ｂ．法では感度が高く特異性が高いものの、定量性に欠け、大量の検体を一時に処理するには不向きである。また、ＲＩＡ法では放射性物質を標識物質として用いることから、管理された施設において資格を有する者にしか扱うことができないという欠点を有している。一般的にＥＩＡ法あるいはＥＬＩＳＡ法は前記のような問題がなく簡便に感度良く測定することが可能であるが、これまでそのような方法を用いた血清等の体液中の可溶性Ｆａｓ抗原の高精度かつ十分な感度を有した簡便な測定法は知られていない。
【００１３】
また、Ｆａｓ抗原のうち、完全なＦａｓ抗原は疎水性の膜貫通部位をはさんで親水性の細胞内領域と細胞外領域を持ち、可溶性Ｆａｓ抗原は膜貫通領域が欠如しているが、細胞外に分泌されるＦａｓ抗原としてはこのほかに酵素的に切断されて細胞外領域のみを有する分子が存在することも考えられる。この酵素的に切断された分子はＦａｓ抗原の定量性に影響を及ぼさないことが望ましい。
【００１４】
更に、血清等の体液中に含有される可溶性Ｆａｓ抗原を測定（定量）するためには、その測定法の感度あるいは精度の確認や測定値から間接的に可溶性Ｆａｓ抗原の含量を割り出すための検量線の作成のために、標準物質（スタンダード）として精製された可溶性Ｆａｓ抗原を入手する必要がある。ところが、精製された可溶性Ｆａｓ抗原を量産する技術はこれまでのところ確立されていない。
【００１５】
本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、酵素的に切断されたＦａｓ抗原の影響を受けずに感度良くしかも大量の検体を簡便に測定するＦａｓ抗原の免疫学的測定法及び測定用キットを提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段、発明の実施の形態、及び発明の効果】
本発明の第１は、Ｆａｓ抗原の測定法であって、Ｆａｓ抗原の細胞内領域又は細胞外領域のうちの一方と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体に標準物質としての細胞抽出Ｆａｓ抗原を反応せしめた後、前記ａ）にてＦａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体を用いた場合は、Ｆａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を標識化した標識化抗体を反応させ、前記ａ）にてＦａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体を用いた場合は、Ｆａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を標識化した標識化抗体を反応させ、反応生成物の標識量を測定することにより検量線を作製する工程、及び、前記固相化抗体に検体を反応せしめた後、前記標識化抗体を反応させ、反応生成物の標識量を測定し、前記検量線から検体中に含まれるＦａｓ抗原を定量する工程、を含むことを特徴とするものである。
【００１７】
本発明の第２は、抗Ｆａｓ抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体と、
抗Ｆａｓ抗体を標識化した標識化抗体と、標準物質としての細胞抽出Ｆａｓ抗原とを含むＦａｓ抗原の免疫学的測定用キットであって、前記固相化抗体及び標識化抗体のうちいずれか一方は、Ｆａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合する抗Ｆａｓ抗体を用いて作製したものであり、他方は、Ｆａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合する抗Ｆａｓ抗体を用いて作製したものであることを特徴とする。
【００１８】
ここで、固相化抗体としてＦａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を用いる場合には、標識化抗体としてＦａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を用いる。逆に、固相化抗体としてＦａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を用いる場合には、標識化抗体としてＦａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を用いる。
【００１９】
また、固相化抗体に用いる不溶性支持体としては、例えばポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等のプラスチックや、ガラスといった水に不溶性の物質であれば、特に限定されない。この不溶性支持体への担持は単なる物理吸着でもよいし、化学的な結合であってもよい。
【００２０】
本発明において、Ｆａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体は、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列に特異的に反応する抗Ｆａｓ抗体であることが好ましい。また、Ｆａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体は、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列に特異的に反応する抗Ｆａｓ抗体であることが好ましい。また、標準物質としての細胞抽出Ｆａｓ抗原は、ＷＲ１９Ｌ−１２ａ細胞由来のＦａｓ抗原であることが量産する上で好ましい。尚、ＷＲ１９Ｌ−１２ａ細胞の作製法は例えばイトウら（Cell、第66巻、233-243頁、1991年）によって報告されている。また、標識化抗体は、放射性元素を標識物質として標識化した抗Ｆａｓ抗体を用いてもよいがこの場合には有資格者が管理された施設において取り扱う必要があるため、取扱いの容易さを考慮すると、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びビオチンからなる群から選ばれる標識物質で標識された抗Ｆａｓ抗体であることが好ましい。
【００２１】
本発明の免疫学的測定法及び測定用キットでは、固相化抗体及び標識化抗体のうちいずれか一方を細胞内領域と特異的に結合する抗Ｆａｓ抗体を用いて作製し、いずれか他方を細胞外領域と特異的に結合する抗Ｆａｓ抗体を用いて作製する。このため、本発明によれば、完全なＦａｓ抗原（即ち、疎水性の膜貫通部位をはさんで親水性の細胞内領域と細胞外領域を持つＦａｓ抗原）及び可溶性Ｆａｓ抗原（即ち、完全なＦａｓ抗原から膜貫通領域が欠如したもの）を測定することが可能である。尚、Ｆａｓ抗原が酵素的に切断されて細胞外領域のみとなったものは、本発明の測定系により検出されないため、かかる細胞外領域のみとなったものにより定量値が影響を受けることはない。
【００２２】
以上の本発明のＦａｓ抗原の免疫学的測定法及び測定用キットによれば、酵素的に切断されたＦａｓ抗原の影響を受けずに感度良くしかも標準物質を量産できるため大量の検体を簡便に測定できるという効果が得られる。また、検体中のＦａｓ抗原を定量することにより、自己免疫疾患の予知、診断及び治療方針の確立、治療の効果の判定を行うことができるため、有用である。
【００２３】
【実施例】
完全なＦａｓ抗原の構造を摸式的に示せば図１のようになる。ここで、アミノ酸のＮ末端から数えたペプチドの番号１７〜３３、５４〜７２、３２１〜３３５はアミノ酸分析の結果から親水性の領域であって抗原決定基の存在する可能性のある領域である。
【００２４】
発明者らは、完全なＦａｓ抗原（細胞外領域、膜貫通領域、細胞内領域を含むもの）と可溶性Ｆａｓ抗原（完全なＦａｓ抗原から膜貫通領域を欠いたもの）を特異的に測定するために、Ｆａｓ抗原の細胞内領域及び細胞外領域に対する抗体を別々に作製し、これらの抗体を用いていわゆるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定すべきであると考えた。
［実施例１］Ｆａｓ抗原の細胞内領域に対する抗体の作製
［１−１］合成ペプチドの作製
Ｆａｓ抗原の細胞内領域に対する抗体としては、抗Ｆａｓポリクローナル抗体を用いることとした。即ち、発明者らは伊藤、米原らの文献（Cell、第66巻、233-243頁、 1991年）に発表されているヒトＦａｓ抗原のアミノ酸配列を基にＦａｓ抗原の疎水マッピングを行い、細胞内領域にあるＣ末端のアミノ酸３２１〜３３５番目の親水性領域（配列表の配列番号１参照）を選択し、合成ぺプチドを作製した。合成ペプチドは全自動合成装置を用いてＦｍｏｃ法を用いた固相法により作製した（合成法の詳細は秀潤社刊、細胞工学別冊「抗ペプチド抗体実験プロトコール」参照）。実際の合成ペプチドには、この合成ペプチドを高分子担体に結合させる際に有利なように、Ｎ末端側にヒトＦａｓとは無関係なシステイン残基を一つ付加した（下式参照）。
【００２５】
【化１】
［１−２］合成ペプチドと高分子担体との結合
実施例１−１で作製した合成ペプチド（上式参照）はアミノ酸１６個と比較的小さく、このような低分子化合物（ハプテンと呼ぶ）の場合にはそのままでは抗原性が弱く抗体ができにくいため、免疫の際には抗原性を高めるために高分子担体に結合させる必要がある。このような高分子担体としてはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）等が用いられるが、ここではＫＬＨを用いた。
【００２７】
ＫＬＨとの結合法としては、一般的にはグルタルアルデヒド法、カルボジイミド法、ジアゾ縮合法、マレイミドベンゾイルオキシサクシニミド（ＭＢＳ）法などがあるが、ＭＢＳ法以外は非特異的な結合であるため合成ペプチドが化学的に修飾されてしまう可能性がある。ＭＢＳ法はＫＬＨと合成ペプチドが持つシステイン残基の間をＭＢＳで架橋して結合させる方法であり、この方法によれば合成ペプチドの化学的修飾が避けられ、高い質のペプチド抗体を作製することが可能とされている。このため、ここではＭＢＳ法により実施例１−１で作製した合成ペプチドと高分子担体とを結合させた（結合の具体的な方法は前出の「抗ペプチド抗体実験プロトコール」48〜52頁参照）。
［１−３］免疫
実施例１−２で得た結合体（合成ペプチドとＫＬＨとの結合体）を用いて、ウサギ（日本白色メス ３．５ｋｇ）に対し、１回／週で１０箇所ほど皮下免疫を行い、５回免疫後に耳下静脈より少量の採血を行い、血清を分離しＥＬＩＳＡ法により抗体価をチェックした。即ち、１／１００Ｍ生理的リン酸化緩衝食塩液（ＰＢＳ）にＫＬＨと結合しない合成ペプチドを溶解して０．１ｍｇ／ｍｌの溶液を調製し、この溶液をヌンク社製９６穴マイクロプレート「マキシソープ」に１００μｌ添加し、室温（２０〜２５℃）で３時間放置した後、液を吸引除去し、５％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ３０μｌを加えて約１８時間４℃に静置し、カップの未反応部分をブロックした。ブロッキング液を除きＰＢＳ３００μｌで３回洗浄した後、ＰＢＳで希釈した抗血清の系列を作製し、この溶液１００μｌを各カップに加えて室温（２０〜２５℃）で１時間静置した後反応液を除きＰＢＳ３０μｌで４回洗浄した。次に、希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（（株）医学生物学研究所 製）１００μｌを加え室温（２０〜２５℃）で１時間静置反応させた後、再度同様に洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンと過酸化水素の溶液１００μｌを発色基質として加え、一定時間反応させた後１．５Ｍリン酸を添加して反応を停止し、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定結果を図２のグラフに示す。この図２から明らかなように、得られた抗血清は十分な抗体価を示すものである。このように十分な抗体価を示したウサギについては耳下静脈より７０ｍｌの採血を行い、約３０ｍｌの抗血清を得た。
［１−４］合成ペプチドに対する特異抗体の調製
実施例１−３で得た抗血清には目的とする抗体以外の血清成分や他の抗体が含まれている。測定系の感度を上げるためには実施例１−１の合成ペプチドと反応する抗体のみを不溶性支持体に結合させることが好ましいことから、アフィニティークロマトグラフィーにより特異抗体の採取を行った。即ち、マグネチックスターラーを用い、ウサギ血清に５０％飽和となるように硫酸アンモニウムの粉末を徐々に加え、析出した分画を遠心分離によって上清と分け、最少量のＰＢＳに溶解した後、十分量のＰＢＳを用いて透析し、硫酸アンモニウムを除いた。これを合成ペプチドを結合させたセファロース４Ｂゲルにアプライし、十分量のＰＢＳで洗浄した後、ゲルに結合した免疫グロブリンを０．１７Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ２．３を用いて溶出した。溶出した合成ペプチド特異抗体は抗体活性の低下を回避するため速やかに１／１０量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９．０を加えて中和した。以上の方法によりウサギ血清１ｍｌあたり０．５ｍｇの合成ペプチド特異抗体（即ち、Ｆａｓ抗原の細胞内領域に対する抗体）を得た。
【００２８】
尚、合成ペプチド結合セファロース４Ｂの作製はファルマシア社の操作指示書に従った。即ち、ファルマシア社より購入したＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ６ｇを１ｍＭ ＨＣｌ６００ｍｌに加えて１５分間静置してゲルを膨潤させた後、ガラスフィルタを用いて１ｍＭ ＨＣｌを除去し、さらに１ｍＭ ＨＣｌ６００ｍｌを用いて同様にゲルを洗浄した。洗浄したゲルは３０ｍｌの０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 、ｐＨ８．３（カップリングバッファ）３０ｍｌに懸濁した。一方、合成ペプチド２０μｍｏｌを２０ｍｌのカップリングバッファに溶解し、上記のゲル懸濁液と混合して室温で１時間ゆるやかに攪拌した後ガラスフィルタを用いて２００ｍｌのカップリングバッファで洗浄し、余分なペプチドを除いた。余分な活性基をブロックするために、さらに０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ 酢酸バッファｐＨ４．０と、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファｐＨ８．０各１００ｍｌで３回交互に洗浄した。
［実施例２］Ｆａｓ抗原の細胞外領域に対する抗体の作製
Ｆａｓ抗原の細胞外領域に対する抗体としては、クローンＶＢ３（（株）医学生物学研究所 製）を用いて抗Ｆａｓモノクローナル抗体を調製することとした。このクローンＶＢ３はヒトＦａｓ分子上のアミノ酸のＮ末端から数えて１２６〜１３５番目（細胞外領域）にあり、そのアミノ酸配列は配列表の配列番号２の通りである。
【００２９】
抗Ｆａｓモノクローナル抗体は次のようにして得た。即ち、クローンＶＢ３（２×１０8 個）を無血清ＡＳＦ１０４培地（味の素社（製））中、３７℃で５日間培養し、得られた培養上清をオメガセル（フィルトロン社（製））で超遠心した。遠心上清を回収し、ヒドロキシルアパタイトカラム（アサヒ光学社（製））に供した。ＦＰＬＣシステム（ファルマシアファインケミカル社（製））を用いて、リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４、１０〜４００ｍＭ）で溶出させた。溶出画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、９５％以上の純度で精製された抗Ｆａｓモノクローナル抗体を得た（ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（J. Exp. Med.）第１６９巻、第１７４７〜１７５６頁（１９８９年）における報告を参照）。
［実施例３］固相化抗体の作製
実施例１−４で得た合成ペプチド特異抗体を０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．０で５μｌ／ｍｌの濃度に調製し、ヌンク社製９６穴マイクロプレート「マキシソープ」の各ウエルに１０μｌずつ加え、４℃で２０時間静置反応させた。抗体溶液を捨て、１％ＢＳＡ、５％ショ糖を含むＰＢＳを各ウエル２００μｌずつ加え、室温（２０〜２５℃）で２時間静置してブロッキングを行った。ブロッキング液を捨て、プレートを風乾し、固相化抗体を得た。この固相化抗体は乾燥剤と共に密封して保存した。
［実施例４］標識化抗体の作製
実施例２で得た抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体（クローンＶＢ３）の精製ＩｇＧ １ｍｇあたり０．０５６Ｕのフィシンを添加し、３７℃で８時間反応させた後、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡＣＡ４４を用いてゲルろ過し、Ｆ（ａｂ）'2分画を得た。このＦ（ａｂ）'2分画にマレイミド法によりペルオキシダーゼを標識し、ペルオキシダーゼ標識化抗体とした。尚、標識は医学書院刊、石川栄治著「酵素免疫測定法 第３版」に従って行った。
［実施例５］ 細胞抽出Ｆａｓ抗原（スタンダード）の作製
Ｆａｓスタンダードとしては、ヒトＦａｓ ｃＤＮＡを導入して形質転換させ、ヒトＦａｓをその細胞表面に発現している細胞ＷＲ１９Ｌ−１２ａ（米原ら、Cell、第66巻、233-243頁、1991年）から調製したＦａｓ分子を用いることとした。
【００３０】
即ち、ヒトＦａｓ抗原をコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＦ５８をＸｈｏＩで消化して得たヒトＦａｓ抗原ｃＤＮＡを含有するフラグメントを、発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（Nucleic acid research, 第18巻、5322頁、1990年）に、ＢｓｔＸＩアダプターを用いて導入し、発現プラスミドｐＥＦＦ５８を得た。ＶｓｐＩで消化した２５μｇ／ｍｌのｐＥＦＦ５８フラグメントとＥｃｏＲＩで消化した２．５μｇ／ｍｌのｐＭＡｎｅｏ（クローンテック社製）フラグメントを用いて、１×１０7 個（０．８ｍｌ）のマウスＴリンパ腫ＷＲ１９Ｌ細胞（ATCC TIB52）をエレクトロポレーションにより共形質転換した。該細胞を抗生物質Ｇ４１８含有培地中で培養して、Ｇ４１８耐性クローンを選別した。得られたＧ４１８耐性クローンをフローサイトメータ及び限外希釈法で分析することによりヒトＦａｓ抗原過剰発現形質転換細胞ＷＲ１９Ｌ−１２ａをクローン化した。
【００３１】
ＷＲ１９Ｌ−１２ａ細胞は１０％ ＦＣＳ， ４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭ倍地で培養し、集めた細胞５×１０7 個に対して１ｍｌのＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ノニデットＰ−４０，０．５％デオキシコール酸、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０ ）を加え超音波破砕機により粉砕した。粉砕後の液を超遠心（４℃、×５００００ｇ、３０分）し、その上清中に可溶化されたＦａｓをスタンダードとした。
［実施例６］血清中のＦａｓ抗原の測定
被検血清を１０％の正常ウサギ血清を含むＰＢＳで５倍希釈しマイクロプレート（実施例３の固相化抗体）に１００μｌずつ添加した。スタンダードは同じバッファーで２ｎｇ／ｍｌの濃度から倍数希釈して調製し、同じく１００μｌを添加した。
【００３２】
そして室温（２０〜２５℃）で１時間緩やかに振盪しながら反応させた後、０．１％ ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを各ウエルに３０μｌ加え洗浄した。洗浄は５回行った。洗浄液を除いた後、実施例４で得たペルオキシダーゼ標識化抗体を１％ＢＳＡ、０．７９％ＮａＣｌ、０．１％パラヒドロキシフェニル酢酸（p-Hydroxyphenyl acetic acid ）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファｐＨ７．２で１μｇ／ｍｌに希釈し、これを各ウエルに１００μｌずつ添加し、室温（２０〜２５℃）で１時間緩やかに振盪しながら反応させ再度同様に洗浄した。洗浄液を除き、１．６ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン２塩酸塩、２０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１．２５％ポリエチレングリコール４０００を含む１０ｍＭクエン酸ナトリウム溶液と、１０ｍＭの過酸化水素を含む１０ｍＭクエン酸溶液を等量混合し、この液１００μｌずつを加えて室温（２０〜２５℃）で３０分間緩やかに振盪しながら反応させた後、１．５Ｎリン酸１００μｌを加えて反応を停止し、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。検体中のＦａｓ濃度はスタンダードの濃度と吸光度より作成したスタンダードカーブ（図３のグラフ参照）を用いて読み取った。
【００３３】
この系を用いて検体を測定した結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
上記表１から明らかなように、ＲＡ患者血清、ＲＡ患者随液、ＳＬＥ患者血清においてＦａｓ抗原の測定値が健常者と比して顕著に高いことが分かる。従って、本実施例の試薬を用い、本実施例の測定法を実施すれば、臨床現場でも容易に可溶性Ｆａｓ抗原の濃度を測定でき、ＳＬＥ等の自己免疫疾患の患者の発見が迅速にできる。
【００３６】
【配列表】
【００３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｆａｓ抗原の構造の摸式図である。
【図２】 実施例１の［１−３］における抗血清の抗体価を表すグラフである。
【図３】 血清中のＦａｓ抗原を測定するためのスタンダードのグラフである。
Claims (10)
- 下記ａ）〜ｃ）及びｄ）〜ｆ）の工程を含むことを特徴とするＦａｓ抗原の免疫学的測定法。
ａ）Ｆａｓ抗原の細胞内領域又は細胞外領域のうちの一方と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体に標準物質としての細胞抽出Ｆａｓ抗原を反応せしめた後、
ｂ）前記ａ）にてＦａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体を用いた場合は、Ｆａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を標識化した標識化抗体を反応させ、
前記ａ）にてＦａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体を用いた場合は、Ｆａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体を標識化した標識化抗体を反応させ、
ｃ）反応生成物の標識量を測定することにより検量線を作製する工程、及び
ｄ）前記固相化抗体に検体を反応せしめた後、
ｅ）前記標識化抗体を反応させ、
ｆ）反応生成物の標識量を測定し、
前記検量線から検体中に含まれるＦａｓ抗原を定量する工程。 - Ｆａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体が、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列に特異的に反応する抗Ｆａｓ抗体である請求項１記載のＦａｓ抗原の免疫学的測定法。
- Ｆａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体が、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列に特異的に反応する抗Ｆａｓ抗体である請求項１又は２記載のＦａｓ抗原の免疫学的測定法。
- 前記標準物質としての細胞抽出Ｆａｓ抗原が、ＷＲ１９Ｌ−１２ａ細胞由来のＦａｓ抗原である請求項１〜３のいずれかに記載のＦａｓ抗原の免疫学的測定法。
- 前記標識化抗体が、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びビオチンからなる群から選ばれる標識物質で標識された抗Ｆａｓ抗体である請求項１〜４のいずれかに記載のＦａｓ抗原の免疫学的測定法。
- 抗Ｆａｓ抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体と、
抗Ｆａｓ抗体を標識化した標識化抗体と、
標準物質としての細胞抽出Ｆａｓ抗原とを含むＦａｓ抗原の免疫学的測定用キットであって、
前記固相化抗体及び標識化抗体のうちいずれか一方は、Ｆａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合する抗Ｆａｓ抗体を用いて作製したものであり、他方は、Ｆａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合する抗Ｆａｓ抗体を用いて作製したものであることを特徴とするＦａｓ抗原の免疫学的測定用キット。 - Ｆａｓ抗原の細胞内領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体が、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列に特異的に反応する抗Ｆａｓ抗体である請求項６記載のＦａｓ抗原の免疫学的測定用キット。
- Ｆａｓ抗原の細胞外領域と特異的に結合可能な抗Ｆａｓ抗体が、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列に特異的に反応する抗Ｆａｓ抗体である請求項６又は７記載のＦａｓ抗原の免疫学的測定用キット。
- 前記標準物質としての細胞抽出Ｆａｓ抗原が、ＷＲ１９Ｌ−１２ａ細胞由来のＦａｓ抗原である請求項６〜８のいずれかに記載のＦａｓ抗原の免疫学的測定用キット。
- 前記標識化抗体が、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びビオチンからなる群から選ばれる標識物質で標識された抗Ｆａｓ抗体である請求項６〜９のいずれかに記載のＦａｓ抗原の免疫学的測定用キット。
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| JP32568095A JP3663243B2 (ja) | 1995-12-14 | 1995-12-14 | Ｆａｓ抗原の免疫学的測定法及び測定用キット |
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