WO2019230874A1 - ヒト由来サンプルにおける可溶型ｔｌｒ７の分析 - Google Patents

ヒト由来サンプルにおける可溶型ｔｌｒ７の分析 Download PDF

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WO2019230874A1
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antibody
tlr7
human
present
sample
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健介 三宅
祐輔 村上
祐二 本井
清水　敏之
梅治 大戸
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国立大学法人東京大学
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to a technique for detecting toll-like receptor 7 (TLR7).
  • TLR7 toll-like receptor 7
  • the present invention relates to detection of soluble TLR7, and also relates to screening of substances targeting TLR7, treatment targeting TLR7, and the like.
  • TLRs Toll-like receptors
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • TLR3, TLR7, TLR8 and TLR9 are distributed in the endoplasmic reticulum, which is an intracellular organelle, and recognize nucleic acids derived from bacteria and viruses.
  • TLR7 and TLR8 recognize single-stranded RNA
  • TLR9 recognizes unmethylated single-stranded DNA (CpG-DNA) containing a CpG motif.
  • RNA and DNA are not significantly different from host-derived nucleic acids. If the ligand recognition mechanism by TLR is not strictly controlled, a reaction to self is induced. It falls into an autoimmune disease.
  • the autoimmune reaction by TLR7 is regulated by limiting the location of recognizing nucleic acids to endolysosomes (Non-patent Document 2). Since the nucleic acid outside the cell is constantly degraded rapidly, it does not reach the endolysosome in the cell and is not recognized by TLR7. On the other hand, since microbial nucleic acid is protected by the bacterial cell wall and virus particles, it reaches the endolysosome, where it is released for the first time and is recognized by TLR7.
  • TLR7 has been suggested to be associated with psoriasis and systemic lupus erythematosus (SLE) (Non-Patent Documents 3 to 5).
  • TLR7 is considered a therapeutic target for TLR7-dependent autoimmune diseases such as psoriasis and SLE, and various methods for suppressing the expression and function of TLR7 have been proposed so far. Specifically, methods using oligo DNA having an antagonistic action on TLR7, microRNA that suppresses expression of TLR7, and the like have been tried. However, in general, the safety of nucleic acid drugs is unknown, and if the function of TLR7 is completely suppressed, there is no denying the possibility of causing risks such as infections.
  • TLR7 has been thought to be localized on the endolysosome to limit the autoimmune reaction and isolated from the cell surface, it was thought that antibodies that act only on the cell surface cannot be used.
  • An antibody drug that is considered to be excellent in terms of safety and specificity has also been proposed (Patent Document 1).
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • inflammation is induced by an autoimmune response and is deeply involved in the pathology, but the cause of these diseases is unclear.
  • Steroids with non-specific anti-inflammatory effects are used as therapeutic agents, but their side effects are a major problem in some cases, identifying therapeutic targets and developing more specific treatments This is very important.
  • TLR7 is an RNA sensor localized in endosomes and lysosomes, and is implicated in the pathology of autoimmune diseases, particularly in SLE, which is an autoimmune disease.
  • the knowledge about TLR7 is mainly the knowledge in model mice, and the results showing the involvement of TLR7 in human samples are not yet sufficient.
  • TLR7 is expected as a therapeutic target molecule for collagen diseases including SLE
  • a technique for easily detecting TLR7 has been established. Therefore, a new method for examining the involvement of TLR7 in the pathological condition is required.
  • the present inventors have succeeded in actually obtaining a plurality of monoclonal antibodies against human TLR7 and establishing an analysis method capable of detecting TLR7. Based on this, the present inventors have completed the present invention. It came.
  • the present invention includes, but is not limited to, the following inventions.
  • Human-derived comprising a step of detecting human TLR7 in a sample of a subject using an anti-human TLR7 antibody, and a step of comparing a detection result relating to the sample of the subject with a detection result relating to a sample derived from a healthy person To analyze a body fluid sample.
  • Human TLR7 is detected by enzyme immunoassay and / or immunoprecipitation.
  • human TLR7 is detected in a sample using a plurality of anti-human TLR7 antibodies.
  • a method for evaluating a human effect of a drug targeting human TLR7 which comprises detecting human TLR7 in a human-derived sample using an anti-human TLR7 antibody.
  • TLR7 it becomes possible to easily detect TLR7.
  • soluble TLR7 can be detected, and the present invention can also be applied to screening of substances targeting TLR7, treatment targeting TLR7, and the like.
  • soluble TLR7 in body fluids such as human serum can be measured, and therefore it becomes easy to examine the relationship between changes in soluble TLR7 and pathological conditions in autoimmune diseases.
  • body fluids such as human serum
  • peripheral blood-derived leukocytes were used to examine TLR7 expression and response to TLR7 ligand.
  • these analyzes require fresh blood.
  • the present invention more samples can be analyzed using body fluids, and thus the present invention is extremely useful in analysis, treatment, and research of diseases and pathologies related to TLR7.
  • FIG. 1 shows the results of gene sequence analysis in Experiment 1 (rE3 and LTM3, underline indicates CDR).
  • FIG. 2 is a histogram showing the results of Experiment 2.
  • FIG. 3 is a diagram showing that the epitopes of rE3 and LTM3 are different.
  • FIG. 4 is a standard curve of monkey TLR7 prepared in Experiment 3.
  • FIG. 5 shows the results of detecting soluble TLR7 by immunoprecipitation and Western blotting in Experiment 4.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of Experiment 5 ( ⁇ : average value, *: p ⁇ 0.05; ***: p ⁇ 0.001).
  • an antibody against human TLR7 (also referred to herein as hTLR7) is used.
  • the anti-human TLR7 antibody according to the present invention is not particularly limited as long as it recognizes the extracellular domain of human TLR7. For example, not only the whole antibody but also a functional fragment thereof may be used.
  • TLR has 12 known families for mice and 10 known families for humans.
  • TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, and TLR6 are distributed on the cell surface and recognize bacterial proteins such as lipoproteins, glycolipids such as LPS, and proteins such as flagellin.
  • TLR3, TLR7, TLR8, and TLR9 are distributed in the endoplasmic reticulum, an intracellular organelle, and recognize nucleic acids derived from bacteria and viruses.
  • TLR is a type I membrane protein and has LRR (Leucine-rich-repeat) outside the cell.
  • LRR Leucine-rich-repeat
  • signal transduction is performed by intracellular TIR (Toll / IL-1R homology) domain. Recognizing the ligand, the TLR transmits a signal via the TIR domain into the cell, and finally activates transcription factors such as NF- ⁇ B and IRF (Interferon-Regulatory Factor) family, thereby causing inflammatory cytokines (IL- 6), IL-12, TNF ⁇ , etc.), inflammatory chemokines (RANTES, etc.), and type I interferons (IFN ⁇ , IFN ⁇ ) are induced to produce an appropriate innate immune response locally.
  • NF- ⁇ B and IRF Interferon-Regulatory Factor
  • TLRs immune responses via these TLRs are indispensable for biological defense, and that when a molecule related to the TLR response is deficient, it becomes easy to infect various pathogens. However, for some reason, it has been pointed out that when a substance derived from self becomes an endogenous ligand of TLR, it may cause chronic inflammation.
  • TLR7 is known to be involved in the development of SLE and psoriasis.
  • the anti-TLR7 antibody binds to the cell surface TLR7 and inhibits the TLR7 response of the cell, thereby preventing abnormal immune activation and contributing to the treatment or prevention of the disease.
  • the nucleotide sequence of cDNA of human TLR7 is registered, for example, with GenBank as accession number: NM — 016562, and variants are also known.
  • the amino acid sequence of human TLR7 (variant 2) is set forth in SEQ ID NO: 17.
  • the anti-TLR7 antibody according to the present invention binds to soluble TLR7.
  • Soluble TLR7 is a protein containing at least the extracellular domain of TLR7.
  • one aspect of the anti-TLR7 antibody used in the present invention includes at least one of the following CDRs.
  • Heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • Heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5
  • Light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6
  • Another embodiment of the anti-TLR7 antibody used in the present invention comprises at least one of the following CDRs.
  • Heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • Heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10
  • Heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11
  • Light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12
  • Light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13
  • a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14
  • the anti-TLR7 antibody used in the present invention comprises at least two, at least three, at least four, at least five of the heavy chain CDR1 to light chain CDR1 to light chain CDR1 to (a) to (f) above, or It may be an antibody including all of them.
  • the anti-TLR7 antibody used in the present invention comprises at least two, at least three, at least four, at least five of the heavy chain CDR1 to 3 and the light chain CDR1 to (g) above (g) to (l), or It may be an antibody including all of them.
  • the anti-TLR7 antibody used in the present invention is a deletion of one or two amino acids in the amino acid sequence of at least one of the heavy chain CDR1 to 3 and the light chain CDR1 to (f) above. , May have substitutions or additions.
  • the anti-TLR7 antibody used in the present invention comprises a deletion or substitution of one or two amino acids in at least one of the heavy chain CDRs 1 to 3 and the light chain CDRs 1 to 3 described in (g) to (l) above. Or you may have an addition.
  • amino acid is used in its broadest sense and includes not only natural amino acids but also non-natural amino acids such as amino acid variants and derivatives.
  • amino acids include natural proteogenic L-amino acids; D-amino acids; chemically modified amino acids such as amino acid variants and derivatives; natural non-proteogenic amino acids such as norleucine, ⁇ -alanine, ornithine; Examples include, but are not limited to, chemically synthesized compounds having characteristics known in the art.
  • unnatural amino acids include ⁇ -methyl amino acids (such as ⁇ -methylalanine), D-amino acids, histidine-like amino acids (2-amino-histidine, ⁇ -hydroxy-histidine, homohistidine, ⁇ -fluoromethyl-histidine and ⁇ -methyl-histidine, etc.), amino acids with an extra methylene in the side chain (“homo” amino acids), and amino acids in which the carboxylic acid functional amino acids in the side chain are replaced with sulfonic acid groups (such as cysteic acid)
  • ⁇ -methyl amino acids such as ⁇ -methylalanine
  • D-amino acids histidine-like amino acids (2-amino-histidine, ⁇ -hydroxy-histidine, homohistidine, ⁇ -fluoromethyl-histidine and ⁇ -methyl-histidine, etc.
  • amino acids with an extra methylene in the side chain (“homo” amino acids)
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, etc. indicates that the resulting CDR set retains the antigen recognition function.
  • the position of deletion, substitution, or addition in each CDR may be N-terminal, C-terminal, or intermediate, as long as the resulting set of CDRs retains the antigen recognition function.
  • the anti-TLR7 antibody used in the present invention has the heavy chain CDR1 to 3 and light chain CDR1 to (a) to (f) above as long as the resulting CDR set retains the function as the CDR of the anti-TLR7 antibody.
  • At least one of 3 may consist of an amino acid sequence having 90% or more, 95% or more, or 98% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • the anti-TLR7 antibody used in the present invention has the above-mentioned heavy chain CDR1 to 3 and light chain CDR1 to (g) as long as the resulting CDR set retains the function as the CDR of the anti-TLR7 antibody.
  • At least one of 3 may consist of an amino acid sequence having 90% or more, 95% or more, or 98% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 9 to 14.
  • “having Y% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: X” means that alignment is performed so that the amino acid sequences of two polypeptides match at the maximum.
  • the ratio of the number of common amino acid residues to the total number of amino acids shown in SEQ ID NO: X is Y% or more.
  • the anti-TLR7 antibody used in the present invention may be any of the following. (1) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, (2)
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and / or 8 includes a heavy chain variable region and / or a light chain variable region containing an amino acid sequence having a deletion, substitution or addition of one or several amino acids.
  • an antibody comprising a heavy chain variable region and / or a light chain variable region comprising an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and / or 8, and (4) An antibody that recognizes the same epitope as any one of (1) to (3) above.
  • the anti-TLR7 antibody used in the present invention may be any of the following. (1) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, (2)
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 and / or 16 includes a heavy chain variable region and / or a light chain variable region containing an amino acid sequence having a deletion, substitution or addition of one or several amino acids.
  • an antibody comprising a heavy chain variable region and / or a light chain variable region comprising an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 15 and / or 16, and (4) An antibody that recognizes the same epitope as any one of (1) to (3) above.
  • a heavy chain variable region and / or a light chain variable comprising an amino acid sequence having a deletion, substitution or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: A and / or B
  • the heavy chain variable region consists of a sequence having a deletion, substitution or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: A, and / or the light chain It means that the variable region consists of a sequence having a deletion, substitution or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: B.
  • the number of deletions, substitutions or additions is not particularly limited as long as the resulting antibody comprising the heavy chain variable region and the light chain variable region specifically binds to the antigen.
  • the position of deletion, substitution or addition is not particularly limited as long as the resulting antibody comprising the heavy chain variable region and the light chain variable region specifically binds to the antigen.
  • an antibody comprising a heavy chain variable region and / or a light chain variable region comprising an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: A and / or B
  • the heavy chain variable region has 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: A
  • / or the light chain variable region has 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: B. It means having.
  • the identity is not particularly limited as long as the resulting antibody comprising the heavy chain variable region and the light chain variable region specifically binds to TLR7, but for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95 % Or more and 98% or more.
  • the anti-TLR7 antibody used in the present invention may bind to the region from position 276 to position 313 in the amino acid sequence of human TLR7 represented by SEQ ID NO: 17.
  • the anti-TLR7 antibody used in the present invention may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Further, the anti-TLR7 antibody used in the present invention may be any isotype of IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE.
  • the anti-TLR7 antibody used in the present invention may be a mouse antibody, human CDR-grafted antibody, human chimeric antibody, humanized antibody, or fully human antibody, as long as it binds to the cell surface TLR7. Although there may be, it is not limited to these.
  • the human CDR-grafted antibody is an antibody obtained by replacing the CDR of an antibody of a non-human animal with the CDR of a human antibody.
  • a human chimeric antibody is an antibody comprising a variable region derived from an antibody of a non-human animal and a constant region derived from a human antibody.
  • a humanized antibody refers to a non-human animal antibody in which a part derived from a human antibody is incorporated while leaving a part of a highly safe region.
  • a human chimeric antibody or human CDR It is a concept that includes transplanted antibodies.
  • the “small molecule antibody” means an antibody fragment or an antibody fragment bound with any molecule and recognizing the same epitope as the original antibody.
  • Fab consisting of VL, VH, CL and CH1 regions; F (ab ′) 2 in which two Fabs are linked by a disulfide bond at the hinge region; Fv consisting of VL and VH;
  • scFv which is a single chain antibody linked by a polypeptide linker, sdFv, Diabody, and sc (Fv) 2 are exemplified, but not limited thereto.
  • the production method of the anti-TLR7 antibody used in the present invention is not limited.
  • monoclonal antibodies are isolated from non-human mammals immunized with TLR7 or a fragment thereof and fused with myeloma cells or the like.
  • a hybridoma can be prepared and the antibody produced by the hybridoma can be purified.
  • RE3 and LTM3 described in Examples below are monoclonal antibodies prepared in this manner.
  • Polyclonal antibodies can also be obtained from the serum of animals immunized with TLR7 or a fragment thereof.
  • the TLR7 fragment used for immunization is not particularly limited as long as the obtained antibody binds to cell surface TLR7 and inhibits its function, and examples thereof include a TLR7 fragment containing the amino acid sequence at positions 276 to 313 of SEQ ID NO: 17. .
  • an appropriate host is transformed with an expression vector containing a nucleic acid encoding the anti-TLR7 antibody, and the transformant is cultured under appropriate conditions to produce an antibody.
  • Antibody Y that specifically binds to the same epitope as an antibody X can be prepared after determining the sequence of the epitope as follows.
  • a peptide having a large number of random sequences immobilized on a solid support, arrayed, reacted with antibody X, detected with an enzyme-labeled secondary antibody, and the amino acid sequence of the peptide to which antibody X specifically binds It is possible to determine the epitope on the antigen protein by examining the homology between this amino acid sequence and the amino acid sequence of the antigen protein.
  • the peptides to be immobilized on the solid phase carrier may be used in advance as partial peptides of the antigen protein.
  • an antibody Y that specifically binds to the epitope sequence can be prepared by a person skilled in the art according to a known method.
  • an antibody that specifically binds to the same epitope can be obtained by immobilizing a peptide containing the epitope sequence on a solid phase carrier and detecting the binding between the peptide and various antibodies.
  • variable antibodies those obtained by immunizing an animal with an antigen protein or a partial peptide thereof may be used, or an antibody library or an antibody fragment library prepared by a phage display method may be used. Good.
  • antibody Y that specifically binds to the same epitope can also be obtained by fixing a peptide containing the epitope sequence to a solid phase carrier and repeating panning.
  • Human chimeric antibodies and human CDR-grafted antibodies are prepared by cloning an antibody gene from mRNA of a hybridoma that produces an antibody of a non-human animal and ligating it with a part of the human antibody gene by gene recombination technology. be able to.
  • cDNA is synthesized by reverse transcriptase from the hybridoma mRNA producing a mouse antibody, and the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (LH) are cloned by PCR and sequenced.
  • VH heavy chain variable region
  • LH light chain variable region
  • a 5 ′ primer containing a leader sequence is prepared from the antibody base sequence having a high concordance rate, and PCR is performed from the cDNA to the 3 ′ end of the variable region from the above cDNA using the 5 ′ primer and the variable region 3 ′ primer.
  • the heavy and light chain constant regions of human IgG1 are cloned, and the mouse antibody-derived variable region and the human antibody-derived constant region are ligated by PCR using the OverlappinglHanging method for amplification. To do.
  • the obtained DNA can be inserted into a suitable vector and transformed to obtain a human chimeric antibody.
  • the human antibody variable region having the highest homology with the mouse antibody variable region to be used is selected and cloned, and the CDR base sequence is modified by site-directed mutagenesis using the megaprimer method.
  • the amino acid sequence constituting the framework region cannot be specifically bound to the antigen when humanized, it is possible to convert some amino acids of the framework from human type to rat type.
  • the “CDR consisting of an amino acid sequence having a property” can be prepared using a known method such as a site-directed mutagenesis method, a random mutagenesis method, a chain shuffling method, or a CDR walking method.
  • the Adlib method (Seo, H. et al., Nat. Biotechnol., 6: 731-736, 2002) is used to obtain an antibody-producing strain from the DT40 cell line derived from trichostatin A-treated chicken B cells.
  • a method for producing a human antibody by immunizing a KM mouse which is a mouse antibody gene disrupted and introduced with a human antibody gene (Itoh, K. et al., Jpn. J. Cancer Res., 92: 1313- 1321, 2001; Koide, A. et al., J. Mol. Biol., 284: 1141-1151, 1998), and the like, which can also be applied to the production of the antibody according to the present invention.
  • the anti-TLR7 antibody of the present invention is a low molecular weight antibody
  • it may be expressed by the above method using DNA encoding the low molecular weight antibody, or the full length antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin. May be produced.
  • the antibody used in the present invention may vary in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence / absence of sugar chain, form, etc. depending on the production method and purification method. However, as long as the obtained antibody has a function equivalent to the antibody of the present invention, it is included in the present invention.
  • the antibody of the present invention when expressed in prokaryotic cells such as Escherichia coli, a methionine residue is added to the N-terminus of the original antibody amino acid sequence.
  • the invention also encompasses such antibodies.
  • the antibody may be prepared by a known method.
  • an antibody against human TLR7 can be used to immunize a non-human animal with a target antigen, collect lymph, lymph tissue, blood cell samples or bone marrow-derived cells from the animal after immunization, and use a known method (for example, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, NY (1980)). And myeloma cells are fused to establish a hybridoma and obtain a monoclonal antibody. Specific examples of such a method are described in WO2009 / 48072 (published on April 16, 2009) and WO2010 / 117011 (published on October 14, 2010).
  • the antibodies of the present invention include, in addition to monoclonal antibodies, genetically engineered antibodies that have been artificially modified for the purpose of reducing heteroantigenicity against humans, such as chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, etc. It is. These antibodies can be produced using known methods.
  • chimeric antibody examples include antibodies in which the variable region and the constant region of the antibody are different from each other, for example, a chimeric antibody in which the variable region of a mouse or rat-derived antibody is joined to a human-derived constant region (Proc. Natl. Acad). Sci.U.S.A., 81, 6851-6855, (1984)).
  • Humanized antibodies include antibodies in which only CDRs are incorporated into human-derived antibodies (see Nature (1986) 321, p.522-525), and by CDR grafting, the amino acid residues of some frameworks in addition to the CDR sequences. Examples of the group include an antibody grafted on a human antibody (International Publication WO90 / 07861).
  • the antibody of the present invention includes a human antibody.
  • an anti-TLR7 human antibody means a human antibody having only the gene sequence of an antibody derived from a human chromosome.
  • the anti-TLR7 human antibody can be obtained by a method using a human antibody-producing mouse having a human chromosome fragment containing the heavy and light chain genes of the human antibody. For example, the following can be referred to for this method. Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p.133-143 Kuroiwa, Y. et.al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448 Yoshida, H.
  • eukaryotic cells are transformed with cDNA encoding each of the heavy and light chains of such a human antibody, preferably a vector containing the cDNA, to produce a gene recombinant human monoclonal antibody.
  • This antibody can also be obtained from the culture supernatant by culturing the transformed cells.
  • eukaryotic cells preferably CHO cells
  • mammalian cells such as lymphocytes and myeloma can be used as the host.
  • the anti-TLR7 human antibody can also be obtained by a method for obtaining a human antibody derived from phage display selected from a human antibody library.
  • a method for obtaining a human antibody derived from phage display selected from a human antibody library For example, the following documents can be referred to for this method. Wormstone, IMet.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p.2301-2308 Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p.189-203 Siriwardena, D. et.al., Ophthalmology (2002) 109 (3), 427-431
  • Whether or not a certain anti-TLR7 antibody can be used in the present invention can be appropriately determined by those skilled in the art. For example, by confirming at least one of the following, it is possible to select those used for detection of human TLR7 from the obtained antibodies.
  • (A) Whether the obtained antibody binds to TLR7 on the cell surface (b) Inflammation secreted from immune cells when the immune cells are stimulated with a ligand of TLR7 and contacted with the obtained antibody Whether or not the amount of sex cytokine is suppressed (c) Whether or not the proliferation of B cells is suppressed when the cells are contacted with the obtained antibody while stimulating the B cells with the ligand of TLR7 (d) Whether or not the disease state is improved by administering the antibody obtained to animal models of inflammatory diseases such as
  • the anti-TLR7 antibody according to the present invention is useful for diagnosis and treatment of diseases.
  • diseases in which the anti-TLR7 antibody according to the present invention is particularly useful include various autoimmune diseases.
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis (RA), systemic lupus erythematosus (SLE), scleroderma, polymyositis (PM), Sjogren's syndrome, ANCA-related vasculitis, Behcet's disease, Kawasaki disease, mixed cryo Globulinemia, multiple sclerosis, Guillain-Barre syndrome, myasthenia, type 1 diabetes, Graves' disease, Hashimoto's disease, Addison's disease, IPEX, APS type-II, autoimmune myocarditis, interstitial pneumonia, bronchial asthma , Autoimmune hepatitis, primary biliary cirrhosis, Crohn's disease, ulcerative colitis, psoriasis, atopic
  • the anti-TLR7 antibody according to the present invention contains a pharmaceutically acceptable carrier or additive.
  • carriers and additives include pharmaceutically acceptable organic solvents such as water, saline, phosphate buffer, dextrose, glycerol, ethanol, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, poly Sodium acrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, Examples include, but are not limited to, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose, surfactants, etc. It is not.
  • the anti-human TLR7 antibody according to the present invention is used to detect human TLR7. That is, the present invention relates to a method for detecting human TLR7, which comprises recognizing or detecting human TLR7 in a sample using an anti-human TLR7 antibody.
  • the field of application of the present invention covers a wide range such as clinical, pharmaceutical, food, etc.
  • the analysis result according to the present invention is used as an index for determining the administration of TLR7 antibody as well as analysis on autoimmune diseases involving TLR7. can do.
  • the present invention relates to a method for examining a disease involving human TLR7, comprising recognizing or detecting human TLR7 using an anti-human TLR7 antibody.
  • an antibody against human TLR7 or a functional fragment thereof can be used.
  • a method of detecting a target molecule using an antibody or a functional fragment thereof can be performed using a method well known to those skilled in the art, such as an enzyme immunoassay, a radioimmunoassay, a fluorescent immunoassay, a luminescent immunoassay, flow cytometry, Human TLR7 is detected by techniques such as Western blotting, immunoprecipitation, immunoturbidimetry, and immunodiffusion.
  • the functional fragment of an antibody means an antibody fragment whose function is maintained.
  • the functional fragment of an antibody against human TLR7 means an antibody fragment whose function of recognizing human TLR7 is maintained. To do.
  • antibody fragments for example, antibody fragments such as scFv and domain antibodies can be preferably used.
  • the present invention detects human TLR7 by enzyme immunoassay, immunoprecipitation or flow cytometry.
  • an enzyme immunoassay (EIA: Enzyme Immunoassay) represented by an ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) method Is used in a wide range of fields, and is one of the techniques indispensable for various diagnoses and various biological tests.
  • EIA Enzyme Immunoassay
  • ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
  • the measurement principle of the ELISA method is to react an antigen or antibody as a target substance with an antibody or antigen linked with a label enzyme, and detect and / or quantify the target substance from the enzyme activity of the label enzyme. That is, in the ELISA method, highly sensitive detection of a target substance is achieved by amplifying a signal obtained by molecular recognition by an antibody using an enzyme.
  • a labeling enzyme generally used in the ELISA method or the like can be used without limitation.
  • a labeling enzyme peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, galactosidase, and the like can be mentioned as suitable examples, but other enzymes can also be used.
  • the reaction product generated by the reaction catalyzed by the labeling enzyme is generally detected by absorption, fluorescence, or luminescence.
  • the enzyme reaction by the labeling enzyme is electrochemically performed. The detection method has become the mainstream.
  • enzyme immunoassays In general, various methods are known as enzyme immunoassays, but the present invention can be applied to all known enzyme immunoassays. The present invention can also be applied to an immunosensor using an enzyme immunoassay.
  • the enzyme immunoassay refers to a method for detecting and / or quantifying a target substance by utilizing an enzyme reaction and an immune reaction. More specifically, it is a method for detecting and / or quantifying a target substance by performing an antigen-antibody reaction using an antigen or antibody labeled with an enzyme and measuring the enzyme activity to detect the antigen-antibody reaction.
  • a competitive method and a non-competitive method are known for enzyme immunoassay.
  • an antigen or antibody is labeled with a labeling enzyme, and the labeled antigen is allowed to compete with a free antigen in a sample to cause an antigen-antibody reaction with the corresponding antibody or antigen.
  • an antigen-antibody reaction signal is amplified by an enzyme reaction, and detection and / or quantification is performed.
  • an unlabeled antibody capture antibody, first antibody
  • an enzyme-labeled labeled antibody detection antibody, first antibody
  • 2 antibody is bound to the complex of antigen and capture antibody.
  • a substrate is added, an antigen-antibody reaction signal is amplified by an enzyme reaction, and a target substance is detected and / or quantified.
  • the sandwich method is highly specific because it is detected using two different antibodies.
  • a double layer method or the like is known as an enzyme immunoassay, and the present invention can be applied to these measurement methods.
  • the epitope is usually different between the capture antibody and the detection antibody.
  • the method for linking the labeling enzyme and the antibody is not particularly limited, and a chemical technique or a genetic engineering technique may be used.
  • the labeling enzyme may be directly linked to the antibody or indirectly bound.
  • the labeling enzyme When the labeling enzyme is linked to the antibody by a chemical method, it can be linked directly or via a linker or spacer. In addition, the labeling enzyme and the antibody can be linked by utilizing specific bonds such as digoxigenin, avidin, and biotin. In addition, when a labeling enzyme is linked to an antibody by a genetic engineering technique, an enzyme-labeled antibody can be produced as a fusion protein (chimeric protein), for example, using a fusion protein method.
  • a fusion protein chimeric protein
  • the method of linking the labeling enzyme to the antibody is not limited to this, but a known method including a method using a bivalent cross-linking agent can be used. Therefore, for example, an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a thiol group, an imidazole group, a phenyl group, or the like can be used.
  • an isocyanate method, a glutaraldehyde method, a next fluorobenzene method, a benzoquinone method, and the like can be given.
  • an amino group and a carboxyl group are bonded, in addition to a method of converting a carboxyl group into a succinylimide ester, a carbodiimide method, a Woodward reagent method, a periodate oxidation method for crosslinking an amino group and a sugar chain (Nakane method) Is also applicable.
  • a thiol group for example, the carboxyl group on one side is converted into a succinimide imido ester, and cysteine is reacted with this to introduce a thiol group, and a thiol group-reactive divalent crosslinking agent is used. Both can be combined.
  • Other methods using a phenyl group include a diazotization method and an alkylation method.
  • an amino group, a carboxyl group, a thiol group, or the like may be introduced into these. In that case, it may be introduced via a spacer to facilitate binding to the enzyme.
  • the coupling ratio between the antibody and the labeling enzyme is not limited to 1: 1 and can be any ratio.
  • a plurality of labeling enzymes can be linked to the molecular recognition element using the glutaraldehyde method or the periodic acid method (J. Histochemistry and Cytochemistry 22, 1084, 1974).
  • TLR7 that is an antigen can be analyzed by immunoprecipitation.
  • the immunoprecipitation method utilizes the fact that a soluble antigen and antibody specifically react and insolubilize, but the antigen can be detected, separated and purified under relatively mild conditions. For example, a large structure is insolubilized by cross-linking a large number of substrates and antibodies. In general, an antibody is bound to a carrier such as Sepharose beads, but a method using magnetic beads is often performed. Polyclonal antibodies are more susceptible to immunoprecipitation than monoclonal antibodies.
  • a nonspecific antibody (and a carrier when used) may be mixed and a non-specifically adsorbed component may be removed by centrifugation.
  • separation with a magnet is performed instead of centrifugation.
  • TLR7 that is an antibody or an antigen can be immobilized on a substrate.
  • the antibody of the present invention is immobilized on a substrate.
  • any known material can be used as a substrate for immobilizing an antibody or antigen. Therefore, for example, inorganic polymer compounds such as porous glass, silica gel, and hydroxyapatite; and metals such as gold, silver, and platinum can be used as the base material.
  • synthetic polymers such as ethylene-vinyl acetate copolymer, polyvinyl chloride, polyurethane, polyethylene, polystyrene, nylon, polyester and polycarbonate; natural polymers such as starch, gluten, chitin, cellulose and natural rubber; and these Derivatives can be mentioned.
  • synthetic polymers such as ethylene-vinyl acetate copolymer, polyvinyl chloride, polyurethane, polyethylene, polystyrene, nylon, polyester and polycarbonate; natural polymers such as starch, gluten, chitin, cellulose and natural rubber; and these Derivatives can be mentioned.
  • the agarose derivative which has a hydrophobic group, nitrocellulose, those derivatives, etc. can also be mentioned as a base material used for this invention.
  • the material of the substrate can be selected according to the measurement method to be used, and the shape of the substrate is not particularly limited, and depending on the method of use, a microplate, a bead, a film, a sheet , Tube, fiber, stick, etc.
  • the immobilization method is not particularly limited, and any known method can be used.
  • physical adsorption, entrapping immobilization, and immobilization by chemical bonding reaction can be used.
  • physical adsorption include protein adsorption on the surface of a hydrophobic resin.
  • Inclusive fixation is a method of achieving immobilization by enclosing a substance to be immobilized on a support such as a gel or a polymer.
  • the immobilization method based on chemical bonding is a method in which a functional group introduced on the surface of a support is chemically bonded to a functional group of a substance to be immobilized.
  • Examples of the chemical immobilization method include immobilizing an antibody or an antigen on a base material using a silane coupling agent, a plasma polymerization film, or an acid anhydride.
  • a silane coupling agent for example, a silane coupling agent, a plasma polymerization film, or an acid anhydride.
  • the antibody or the like may be immobilized via an acid anhydride group present on the surface of the substrate.
  • an acid anhydride group into other reactive functional groups such as carboxyl group, formyl group, amino group, azide group, isocyanate group, chloroformyl group, epoxy group, etc. present on the surface, through this acid anhydride group
  • Antibodies may be immobilized.
  • the acid anhydride group may be directly introduced on the material surface to be immobilized, or a reactive functional group is introduced. Thereafter, an acid anhydride group may be introduced and immobilized.
  • the acid anhydride group can be introduced by reacting with styrene-maleic anhydride copolymer, ethylene-maleic anhydride copolymer, methyl vinyl ether-maleic anhydride copolymer, etc.
  • An acid anhydride group can also be introduced by graft polymerization with a line or electron beam.
  • a method for introducing a reactive functional group onto the surface of a polymer material for example, when introducing a carboxyl group into an ethylene-vinyl acetate copolymer, saponification of the ethylene-vinyl acetate copolymer is followed by carboxymethylation. Is introduced.
  • the carboxyl group can be derived into an azide group via a hydrazyl group.
  • the carboxyl group can be converted to a chloroformyl group by chlorination with thionyl chloride, acetyl chloride or the like.
  • the saponified ethylene-vinyl acetate copolymer may be aminoacetalized.
  • An epoxy group can be introduced by reacting with epichlorohydrin, diethylene glycol diglycidyl ether or the like.
  • Isocyanate groups can be introduced by reacting with hexamethylene diisocyanate, tolylene diisocyanate and the like.
  • Formyl groups can be introduced by reacting with glutaraldehyde, dialdehyde starch and the like.
  • various samples can be analyzed.
  • a sample from a living body such as blood (whole blood, plasma, serum), lymph, saliva, urine, tissue disease, fetal cells existing in amniotic fluid, and in vitro
  • a part of the dividing egg cell can also be used as a specimen.
  • the sample to be analyzed according to the present invention may be subjected to a treatment such as a pretreatment if necessary.
  • these specimens are concentrated as sediments directly or as necessary by centrifugation, etc., and then subjected to cell destruction treatment by, for example, enzyme treatment, heat treatment, surfactant treatment, ultrasonic treatment, or a combination thereof. Those previously applied can be used.
  • the detection method of the present invention detects soluble TLR7 in a sample derived from human body fluid.
  • the body fluid is, for example, blood (whole blood, plasma, serum), lymph fluid, tissue fluid, body cavity fluid, digestive fluid, saliva or urine, and more preferably plasma or serum.
  • human TLR7 in a sample is detected using a plurality of anti-human TLR7 antibodies as in the sandwich ELISA method.
  • sandwich ELISA for example, the first anti-human TLR7 antibody is immobilized on a solid phase carrier, a sample derived from human body fluid is added, reacted, and then another epitope labeled with an enzyme. A second anti-human TLR7 antibody that recognizes is added and reacted. After washing, the amount of human TLR7 can be determined by reacting with the enzyme substrate, developing color, and measuring the absorbance.
  • anti-human TLR7 antibodies those having different epitopes can be arbitrarily combined as the first antibody and the second antibody.
  • an antibody for example, rE3 that binds within the region of positions 276 to 313 in the amino acid sequence of human TLR7 represented by SEQ ID NO: 17 and another anti-human TLR7 antibody (for example, LTM3) The combination of is mentioned.
  • one aspect of the present invention is a test drug. For example, if the amount of human TLR7 present in the sample is less than a predetermined threshold, it is determined that human TLR7 is suspected of having a disease associated with it.
  • the cut-off value can also be set by statistical analysis using an ROC curve using measured values in samples from healthy persons and diseased persons.
  • the effect of a drug targeting human TLR7 in humans can be evaluated. That is, the anti-human TLR7 antibody according to the present invention is useful as a companion diagnostic agent for a drug targeting human TLR7.
  • the amount of human TLR7 in the subject-derived sample is less than a predetermined threshold, it can be predicted that the medicament has a therapeutic effect in the subject.
  • the setting of the predetermined threshold is as described above.
  • examples of the drug targeting human TLR7 include drugs for various autoimmune diseases.
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis (RA), systemic lupus erythematosus (SLE), scleroderma, polymyositis (PM), Sjogren's syndrome, ANCA-related vasculitis, Behcet's disease, Kawasaki disease, mixed cryo Globulinemia, multiple sclerosis, Guillain-Barre syndrome, myasthenia, type 1 diabetes, Graves' disease, Hashimoto's disease, Addison's disease, IPEX, APS type-II, autoimmune myocarditis, interstitial pneumonia, bronchial asthma , Autoimmune hepatitis, primary biliary cirrhosis, Crohn's disease, ulcerative colitis, psoriasis, atopic dermatitis, hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, polyarthritis type of idiopathic juvenile arthritis, etc. .
  • the anti-human TLR7 antibody according to the
  • the present invention provides a measurement kit for human TLR7, which is a target substance.
  • the target substance measurement kit of the present invention comprises an anti-human TLR7 antibody.
  • the measurement kit of the present invention may further include a substrate on which the antibody is immobilized, a standard solution, a sensitizer, a buffer, instructions for use, a package, and the like.
  • Experiment 1 Acquisition of anti-hTLR7 antibody (1) Vector construction and establishment of hTLR7 expressing cells In retrovirus vector (pMXs) with 6 Flag-His tags added to the C-terminal side of the gene, In Fusion enzyme (Takara Bio) The hTLR7 gene (full length, gene encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17) was incorporated. This retroviral vector was introduced into a packaging cell line (derived from Plat-E, HEK293 cells) using a transfection reagent (Fugene 6, Roche). After 24 hours, the culture supernatant was collected and used as a virus suspension.
  • pMXs retrovirus vector
  • Fusion enzyme Takara Bio
  • This retroviral vector was introduced into a packaging cell line (derived from Plat-E, HEK293 cells) using a transfection reagent (Fugene 6, Roche). After 24 hours, the culture supernatant was collected and used as a virus suspension.
  • This virus suspension was mixed with a liposome transfection reagent (DOTAP, Roche), added to the target cells, and centrifuged at 2000 rpm for 1 hour.
  • Retrovirus vectors and packaging cell lines were provided by Professor Toshio Kitamura of the Institute of Medical Science, the University of Tokyo.
  • HVJ-E cell fusion kit (Ishihara Sangyo). From the day after the cell fusion operation, the cells were cultured in a HAT-containing culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in order to select hybridomas.
  • HAT-containing culture solution a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine
  • HRP substrate horseradish peroxidase substrate
  • 1N sulfuric acid was added to stop the reaction.
  • Soluble TLR7 was measured for a sample obtained from the plasma of a healthy person or a patient with SLE (systemic lupus erythematosus), and the soluble TLR7 was quantified based on the standard curve.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • soluble TLR7 could be actually quantified by sandwich ELISA using a plurality of antibodies having different antigenic determinants.
  • hTLR7 was detected by Western blotting.
  • the following antibodies were used for detection of hTLR7.
  • Primary antibody Rabbit Anti-TLR7 monoclonal antibody (CST)
  • Secondary antibody Anti-Rabbit IgG (H + L) antibody-HRP (Thermo Fisher Scientific)
  • H + L Anti-Rabbit IgG (H + L) antibody-HRP (Thermo Fisher Scientific)
  • a chromogenic substrate was added to evaluate the molecular weight of the detected band. The results are shown in FIG. 5, and since a band of about 130 kDa was detected, it was judged to be a full-length type of hTLR7.
  • Experiment 5 Detection of soluble TLR7 by ELISA Using the ELISA system established in Experiment 3, serum or plasma derived from human peripheral blood was analyzed to examine its relevance to disease. Specifically, patients with systemic lupus erythematosus (SLE), dermatomyositis (DM), polymyositis (PM), systemic scleroderma (SSc), mixed connective tissue disease (MCTD) and healthy individuals (Healthy) TLR7 was quantified in the serum or plasma derived from peripheral blood collected from.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • DM dermatomyositis
  • PM polymyositis
  • SSc systemic scleroderma
  • MCTD mixed connective tissue disease
  • Healthy individuals Healthy
  • soluble TLR7 is useful as a marker indicating the pathology of autoimmune disease, and by detecting TLR7 according to the present invention when administering an antibody against TLR7, diagnosis of autoimmune disease is possible. It can be usefully applied to treatment.

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Abstract

本発明の課題は、ヒトＴＬＲ７の検出技術を提供することである。　抗ヒトＴＬＲ７抗体を用いてＥＬＩＳＡ法などによってサンプル中のヒトＴＬＲ７を検出することができる。本発明によれば、ヒトＴＬＲ７を自己免疫疾患の病態を示すマーカーとして使用することができる。

Description

ヒト由来サンプルにおける可溶型ＴＬＲ７の分析
　本発明は、トール様受容体７（toll-like receptor 7：ＴＬＲ７）を検出する技術に関する。特に本発明は、可溶型ＴＬＲ７の検出に関しており、ＴＬＲ７を標的とした物質のスクリーニング、ＴＬＲ７を標的とした治療などにも関する。
　トール様受容体（ＴＬＲ）は病原体センサーの一つのファミリーを形成しており、病原体成分に応答して活性化シグナルを誘導し、感染防御反応を誘導する。ＴＬＲは感染防御に重要であるばかりでなく、自己免疫疾患などの病態における炎症誘導にも関わっている。例えば、非特許文献１には、血清中のＴＬＲを非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の患者における放射性肺炎の指標として用いることが提案されている。
　約１０種類のＴＬＲのうちＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９は、細胞内小器官である小胞体に分布し、細菌やウイルス由来の核酸を認識する。ＴＬＲ７とＴＬＲ８は１本鎖ＲＮＡを認識し、ＴＬＲ９はＣｐＧモチーフを含む非メチル化１本鎖ＤＮＡ（ＣｐＧ－ＤＮＡ）を認識する。
　しかし、ウイルス特有の２本鎖ＲＮＡとは異なり、一本鎖ＲＮＡやＤＮＡは宿主由来の核酸と大きな違いはなく、ＴＬＲによるリガンド認識機構が厳密に制御されなければ、自己に対する反応を惹起し、自己免疫疾患に陥ってしまう。
　この点、ＴＬＲ７による自己免疫反応は、核酸を認識する場所をエンドリソソームに限定することによって調節されている（非特許文献２）。定常時、細胞外にある自己の核酸は急速に分解されるため、細胞内のエンドリソソームには到達せず、ＴＬＲ７には認識されない。一方、微生物核酸は細菌の細胞壁やウイルス粒子に保護されているのでエンドリソソームに到達し、そこで初めて放出され、ＴＬＲ７に認識される。
　これに対し、抗微生物ペプチドや自己抗体との相互作用によって自己の核酸が分解に耐性を有するようになり、エンドリソソームに到達できるようになると、ＴＬＲ７依存性自己免疫反応が引き起こされる。実際、ＴＬＲ７については、乾癬や全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus：ＳＬＥ）との関連が示唆されている（非特許文献３～５）。
　したがって、ＴＬＲ７は、乾癬やＳＬＥなどのＴＬＲ７依存性自己免疫疾患の治療標的と考えられ、これまでにＴＬＲ７の発現や機能を抑制する様々な方法が提案されている。具体的には、ＴＬＲ７に対して拮抗作用を持つオリゴＤＮＡや、ＴＬＲ７の発現を抑制するマイクロＲＮＡなどを用いた方法が試みられてきた。しかしながら、一般に核酸医薬の安全性は未知数であり、また、ＴＬＲ７の機能を完全に抑制すると、感染症などの危険性を招く可能性も否定できない。
　ＴＬＲ７は、自己免疫反応を制限するためにエンドリソソームに局在し、細胞表面からは隔絶されていると考えられてきたため、細胞表面にのみ作用する抗体は使用できないとの考えもあったが、安全性及び特異性の面で優れるとされる抗体医薬も提案されている（特許文献１）。
国際公開ＷＯ２０１４／１７４７０４
Int. J. Clin. Exp. Pathol., 711:8087-8095 (2014) Barton, G.et al. d Medzhitov, R. Nat Immunol 7, pp. 49-56 (2006) Lande, R. et al. Nature 449, pp. 564-569 (2007) Christensen, S. R. et al. Immunity 25, pp. 417-428 (2006) Ehlers, M. et al. J Exp Med 203, pp. 553-561 (2006)
　全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）や関連する自己免疫疾患では、自己免疫応答による炎症が誘導されており、病態に深く関与しているとされるが、これらの疾患の原因は不明な点が多い。治療薬としては、非特異的な抗炎症作用を有するステロイドが用いられているが、その副作用は症例によっては大きな問題となっており、治療標的を同定し、より特異的な治療法を開発することが重要である。
　ＴＬＲ７は、エンドソームやライソソームに局在するＲＮＡセンサーであり、自己免疫疾患の病態に関与すること、特に、自己免疫疾患であるＳＬＥにおいてその関与が示唆されている。しかしながら、ＴＬＲ７に関する知見は、主にモデルマウスにおける知見であり、ヒトのサンプルにおいてＴＬＲ７の関与を示す結果はまだ充分ではない。
　このように、ＳＬＥモデルマウスに関する研究において病態におけるＴＬＲ７の関与が示唆されたため、ＳＬＥを含む膠原病などの治療標的分子としてＴＬＲ７が期待されているものの、ＴＬＲ７を簡便に検出する技術が確立されておらず、ＴＬＲ７の病態への関与を調べられる新たな手法が必要とされていた。特にヒトにおいては、ＳＬＥなどの自己免疫疾患にＴＬＲ７が関与しているかどうか検討しようにも、マウスと比較して解析に使える手法が限定されており、ＴＬＲ７と病態との関連を解析することが困難であった。
　上記課題について鋭意検討したところ、本発明者らは、ヒトＴＬＲ７に対するモノクローナル抗体を実際に複数得るとともに、ＴＬＲ７を検出できる分析法を確立することに成功し、これに基づいて本発明を完成させるに至った。
　本発明は、これに限定されるものではないが、以下の発明を包含する。
（１）　抗ヒトＴＬＲ７抗体を用いて被験者のサンプル中のヒトＴＬＲ７を検出する工程と、被験者のサンプルに関する検出結果を、健常人由来のサンプルに関する検出結果と比較する工程と、を含む、ヒト由来の体液サンプルを分析する方法。
（２）　酵素免疫アッセイおよび／または免疫沈降によってヒトＴＬＲ７を検出する、（１）に記載の方法。
（３）　複数の抗ヒトＴＬＲ７抗体を用いてサンプル中のヒトＴＬＲ７を検出する、（１）または（２）に記載の方法。
（４）　前記サンプルが、ヒトの体液由来のサンプルである、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）　前記サンプルが、ヒトの血漿および／または血清を含む、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）　被験者が、自己免疫疾患の患者または自己免疫疾患が疑われる者である、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）　ヒトＴＬＲ７を標的とする医薬のヒトにおける効果を評価する方法であって、抗ヒトＴＬＲ７抗体を用いてヒト由来のサンプル中のヒトＴＬＲ７を検出することを含む、上記方法。
（８）　ヒトＴＬＲ７を標的とする医薬が自己免疫疾患に対する医薬である、（７）に記載の方法。
（９）　ヒトＴＬＲ７を標的とする医薬がＳＬＥに対する医薬である、（７）または（８）に記載の方法。
（１０）　抗ヒトＴＬＲ７抗体を含んでなる、自己免疫疾患を検査するための薬剤。
（１１）　ヒト由来の体液サンプルを分析するための、（１０）に記載の薬剤。
（１２）　自己免疫疾患がＳＬＥである、（１０）または（１１）に記載の薬剤。
　本発明によれば、ＴＬＲ７を簡便に検出することが可能になる。特に本発明によれば、可溶型ＴＬＲ７の検出が可能であり、本発明は、ＴＬＲ７を標的とした物質のスクリーニング、ＴＬＲ７を標的とした治療などにも適用できる。
　本発明によれば、ヒトの血清をはじめとする体液中の可溶型ＴＬＲ７を測定することができるため、自己免疫疾患における可溶型ＴＬＲ７の変動と病態との関連を調べることが容易となる。従来、ヒトのサンプルを用いた解析としては、末梢血由来の白血球を用いて、ＴＬＲ７の発現、ＴＬＲ７リガンドに対する応答を調べることが知られていたが、これらの解析は新鮮血を必要とするものであり、サンプルの入手が容易ではなかった。本発明によれば、体液を用いてより多くのサンプル解析が可能となるため、ＴＬＲ７が関連する疾患や病態の分析や治療、研究において本発明は極めて有用である。
図１は、実験１における遺伝子配列の解析結果である（ｒＥ３およびＬＴＭ３、下線はＣＤＲを示す）。 図２は、実験２の結果を示すヒストグラムである。 図３は、ｒＥ３およびＬＴＭ３のエピトープが異なることを示す図である。 図４は、実験３で作成したサルＴＬＲ７の標準曲線である。 図５は、実験４の免疫沈降とウエスタンブロッティング法で可溶型ＴＬＲ７を検出した結果を示す図である。 図６は、実験５の結果を示すグラフである（－：平均値、＊: p＜0.05；＊＊＊: p＜0.001）。
　本発明においては、ヒトＴＬＲ７（本明細書中、ｈＴＬＲ７とも称する）に対する抗体を使用する。本発明に係る抗ヒトＴＬＲ７抗体は、ヒトＴＬＲ７の細胞外ドメインを認識するものであれば特に限定されず、例えば、抗体全体のみならず、その機能的断片であってもよい。
　ＴＬＲはマウスでは１２種類、ヒトでは１０種類のファミリーが知られている。ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６は細胞表面に分布し、細菌膜成分であるリポタンパク質、ＬＰＳなどの糖脂質、フラジェリンなどのタンパク質を認識する。ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９は細胞内小器官である小胞体に分布し、細菌やウイルス由来の核酸を認識する。
　ＴＬＲはＩ型の膜タンパク質で細胞外にＬＲＲ（Leucine rich repeat）を有する。病原体成分を認識すると、細胞内のＴＩＲ（Toll/IL-1R homology）ドメインによりシグナル伝達を行う。リガンドを認識したＴＬＲはＴＩＲドメインを介したシグナルを細胞内へ伝えることにより、最終的にＮＦ－κＢやＩＲＦ（Interferon-Regulatory Factor）ファミリーなどの転写因子を活性化させ、炎症性サイトカイン（ＩＬ－６やＩＬ－１２、ＴＮＦαなど）や炎症性ケモカイン（ＲＡＮＴＥＳなど）、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮαやＩＦＮβ）の産生を誘導し、局所において適切な自然免疫応答を引き起こす。これらのＴＬＲを介した免疫応答は生体防御において必要不可欠であり、ＴＬＲ応答に関連する分子が欠損すると、様々な病原体に感染し易くなることが報告されている。しかし、何らかの原因で、自己に由来する物質がＴＬＲの内因性リガンドとなると、慢性的な炎症を引き起こす可能性が指摘されている。
　実際、ＴＬＲ７は、ＳＬＥや乾癬の発症に関与することが知られている。抗ＴＬＲ７抗体は、細胞表面ＴＬＲ７に結合し、当該細胞のＴＬＲ７応答を阻害することにより、免疫の異常な活性化を防いで疾患の治療又は予防に寄与する。
　ヒトＴＬＲ７のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＭ＿０１６５６２として登録されており、バリアントも知られている。ヒトＴＬＲ７（バリアント２）のアミノ酸配列は、配列番号１７に記載されている。本発明に係る抗ＴＬＲ７抗体は、可溶型ＴＬＲ７に結合する。可溶型ＴＬＲ７は、少なくともＴＬＲ７の細胞外ドメインを含むタンパク質である。
　また、本発明に用いられる抗ＴＬＲ７抗体の一態様は、以下のＣＤＲのうち少なくとも１つを含む。
(a) 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２
(c) 配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
(d) 配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１
(e) 配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２
(f) 配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
　本発明に用いられる抗ＴＬＲ７抗体の別の態様は、以下のＣＤＲのうち少なくとも１つを含む。
(g) 配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１
(h) 配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２
(i) 配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
(j) 配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１
(k) 配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２
(l) 配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
　本発明に用いられる抗ＴＬＲ７抗体は、上記(a)～(f)の重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３のうち、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又はすべてを含む抗体であってもよい。本発明に用いられる抗ＴＬＲ７抗体は、上記(g)～(l)の重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３のうち、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又はすべてを含む抗体であってもよい。
　また、本発明に用いられる抗ＴＬＲ７抗体は、上記(a)～(f)の重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３の少なくとも１つが、そのアミノ酸配列において、１又は２のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するものであってもよい。本発明に用いられる抗ＴＬＲ７抗体は、上記(g)～(l)の重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３の少なくとも１つが、そのアミノ酸配列において、１又は２のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するものであってもよい。
　本明細書において用語「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。アミノ酸の例としては、天然タンパク原性Ｌ－アミノ酸；Ｄ－アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β－アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられるがこれらに限定されない。非天然アミノ酸の例としては、α－メチルアミノ酸（α－メチルアラニンなど）、Ｄ－アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２－アミノ－ヒスチジン、β－ヒドロキシ－ヒスチジン、ホモヒスチジン、α－フルオロメチル－ヒスチジン及びα－メチル－ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられるがこれらに限定されない。
　本明細書において、「１又は２のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する」という場合、欠失、置換等されるアミノ酸の個数は、結果として得られるＣＤＲのセットが抗原認識機能を保持する限り特に限定されない。各ＣＤＲにおける欠失、置換又は付加の位置は、結果として得られるＣＤＲのセットが抗原認識機能を保持する限り、N末端でも、C末端でも、その中間であってもよい。
　本発明に用いられる抗ＴＬＲ７抗体は、結果として得られるＣＤＲのセットが抗ＴＬＲ７抗体のＣＤＲとしての機能を保持する限り、上記(a)～(f)の重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３の少なくとも１つが、配列番号１～６に示されるアミノ酸配列と９０％以上、９５％以上または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。本発明に用いられる抗ＴＬＲ７抗体は、結果として得られるＣＤＲのセットが抗ＴＬＲ７抗体のＣＤＲとしての機能を保持する限り、上記(g)～(l)の重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３の少なくとも１つが、配列番号９～１４に示されるアミノ酸配列と９０％以上、９５％以上、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　本明細書において、「配列番号Ｘに示すアミノ酸配列に対してＹ％以上の同一性を有する」とは、２つのポリペプチドのアミノ酸配列の一致が最大になるように整列（アライメント）させたときに、共通するアミノ酸残基数の、配列番号Ｘに示す全アミノ酸数に対する割合がＹ％以上であることを意味する。
　本発明に用いられる抗ＴＬＲ７抗体は、以下のいずれかであってもよい。
(1) 配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
(2) 配列番号７及び／又は８で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む抗体、
(3) 配列番号７及び／又は８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む抗体、及び
(4) 上記(1)から(3)のいずれかの抗体と同じエピトープを認識する抗体。
　また別の態様において、本発明に用いられる抗ＴＬＲ７抗体は、以下のいずれかであってもよい。
(1) 配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
(2) 配列番号１５及び／又は１６で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む抗体、
(3) 配列番号１５及び／又は１６で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む抗体、及び
(4) 上記(1)から(3)のいずれかの抗体と同じエピトープを認識する抗体。
　本明細書において、「配列番号Ａ及び／又はＢで表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む抗体」という場合、重鎖可変領域が、配列番号Ａで表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する配列からなること、及び／又は、軽鎖可変領域が、配列番号Ｂで表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する配列からなることを意味する。欠失、置換又は付加する個数は、結果として得られる重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む抗体が、抗原に特異的に結合する限り特に限定されず、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個とすることができる。欠失、置換又は付加する位置も、結果として得られる重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む抗体が、抗原に特異的に結合する限り特に限定されない。
　本明細書において、「配列番号Ａ及び／又はＢで表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む抗体」という場合、重鎖可変領域が配列番号Ａで表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有すること、及び／又は、軽鎖可変領域が配列番号Ｂで表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有することを意味する。同一性は、結果として得られる重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む抗体が、ＴＬＲ７に特異的に結合する限り特に限定されないが、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上とすることができる。
　本発明に用いられる抗ＴＬＲ７抗体は、配列番号１７で示されるヒトＴＬＲ７のアミノ酸配列のうち、２７６位～３１３位の領域内に結合するものとしてもよい。
　本発明に用いられる抗ＴＬＲ７抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、本発明に用いられる抗ＴＬＲ７抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥのいずれのアイソタイプであってもよい。
　本発明に用いられる抗ＴＬＲ７抗体は、細胞表面ＴＬＲ７にそれぞれ結合する限り、マウス抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体であってもよく、低分子抗体であってもよいが、これらに限定されない。
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＣＤＲを、ヒト抗体のＣＤＲで置換した抗体である。ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体に由来する可変領域と、ヒト抗体に由来する定常領域からなる抗体である。また、ヒト化抗体とは、ヒト以外の動物の抗体において、安全性の高い一部の領域を残して、ヒトの抗体に由来する部分を組み込んだものをいい、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体を含む概念である。
　本明細書において「低分子抗体」とは、抗体の断片又は抗体の断片に任意の分子を結合させたものであって、もとの抗体と同一のエピトープを認識するものを意味する。具体的には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１領域からなるＦａｂ；２つのＦａｂがヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されているＦ（ａｂ’）２；ＶＬ及びＶＨからなるＦｖ；ＶＬ及びＶＨを人工のポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体であるｓｃＦｖのほか、ｓｄＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃ（Ｆｖ）２が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明で用いられる抗ＴＬＲ７抗体の作製方法は限定されないが、例えば、モノクローナル抗体は、ＴＬＲ７又はその断片で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。後述の実施例に記載のｒＥ３およびＬＴＭ３はそのようにして作製されたモノクローナル抗体である。また、ポリクローナル抗体は、ＴＬＲ７又はその断片で免疫した動物の血清から得ることができる。免疫に用いるＴＬＲ７の断片は、得られる抗体が細胞表面ＴＬＲ７に結合してその機能を阻害する限り特に限定されないが、例えば、配列番号１７の２７６位～３１３位アミノ酸配列を含むＴＬＲ７断片が挙げられる。
　特定のアミノ酸配列を有する抗ＴＬＲ７抗体を作製する場合は、例えば、抗ＴＬＲ７抗体をコードする核酸を含む発現ベクターで適当な宿主を形質転換し、この形質転換体を適当な条件で培養して抗体を発現させ、公知の方法に従って単離精製することによって、抗ＴＬＲ７抗体を作製することができる。単離精製方法としては、例えば、プロテインＡ等を用いたアフィニティカラム、その他のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析が挙げられ、これらを適宜組み合わせることができる。
　また、「ある抗体Ｘと同一のエピトープに特異的に結合する抗体Ｙ」は、次のようにエピトープの配列を決定してから作製することができる。
　例えば、多数のランダムな配列のペプチドを固相担体に固定してアレイ化し、抗体Ｘと反応させ、酵素標識２次抗体で結合を検出して、抗体Ｘが特異的に結合するペプチドのアミノ酸配列を調べ、このアミノ酸配列と抗原タンパク質のアミノ酸配列の相同性を検索することによって、抗原タンパク質上のエピトープを決定することが可能である。固相担体に固定するペプチドを、予め、抗原タンパク質の部分ペプチド群としてもよい。
　また、抗原タンパク質の種々の部分ペプチドの存在下で、抗体Ｘと抗原タンパク質との結合をＥＬＩＳＡ法で検出し、競合活性の有無を調べることによっても、抗原タンパク質上のエピトープを決定することが可能である。
　エピトープの配列を決定することができれば、これに特異的に結合する抗体Ｙは、公知の方法にしたがって当業者が作製することができる。例えば、エピトープ配列を含むペプチドを固相担体に固定し、当該ペプチドと種々の抗体の結合を検出することにより、同エピトープに特異的に結合する抗体を得ることができる。
　ここで、「種々の抗体」としては、動物を抗原タンパク質又はその部分ペプチドで免疫することによって得たものを用いてもよいし、ファージディスプレイ法によって作製した抗体ライブラリ又は抗体フラグメントライブラリを用いてもよい。ファージディスプレイ法によるライブラリを用いる場合、エピトープ配列を含むペプチドを固相担体に固定しパニングを繰り返すことによって、同エピトープに特異的に結合する抗体Ｙを得ることもできる。
　また、ヒトキメラ抗体及びヒトＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体を産生するハイブリドーマのｍＲＮＡから抗体遺伝子をクローン化し、これをヒト抗体遺伝子の一部と遺伝子組換え技術で連結することによって作製することができる。
　例えば、ヒト型キメラ抗体の場合、マウス抗体を産生するハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＬＨ）をＰＣＲでクローニングして配列を解析する。次に、一致率の高い抗体塩基配列から、リーダー配列を含む５’プライマーを作製し、５’プライマーと可変部３’プライマーによって上記ｃＤＮＡから、シグナル配列から可変領域の３’末端までをＰＣＲでクローニングする。一方で、ヒトＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖の定常領域をクローニングし、重鎖と軽鎖それぞれについて、マウス抗体由来可変領域と、ヒト抗体由来定常領域とをＰＣＲによるOverlapping Hanging法で連結し、増幅する。得られたＤＮＡを適当なベクターに挿入し、これを形質転換して、ヒト型キメラ抗体を得ることができる。
　ＣＤＲ移植抗体の場合、使用するマウス抗体可変部と最も相同性の高いヒト抗体可変部を選択してクローン化し、メガプライマー法を用いた部位選択的突然変異導入により、ＣＤＲの塩基配列を改変する。なお、フレームワーク領域を構成するアミノ酸配列をヒト化すると抗原との特異的な結合ができなくなる場合には、フレームワークの一部のアミノ酸をヒト型からラット型に変換してもよい。
　「配列番号Ｘに示されるアミノ酸配列において１又は２個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列からなるＣＤＲ」や、「配列番号Ｘに示されるアミノ酸配列に対してＹ％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＣＤＲ」は、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、チェーンシャフリング法、ＣＤＲウォーキング法などの公知の方法を用いて作製され得る。
　これらの方法により、ファージディスプレイ法によってＣＤＲに種々の変異を有する抗体又は抗体断片をファージ表面に提示させ、抗原を使用してスクリーニングすることにより、より親和性が成熟したＣＤＲを得られることが当業者によく知られている（例えば、Wu et al., PNAS, 95:6037-6042(1998); Schier, R. et al., J. Mol. Bio. 263:551-567(1996); Schier, R. et al., J. Mol. Biol. 255:28-43(1996); Yang, W.P. et al., J. Mol. Biol., 254:392-403(1995)。）。本発明は、このような方法で成熟させたＣＤＲを含む抗体も包含する。
　その他の抗体の製造方法として、トリコスタチンＡ処理ニワトリＢ細胞由来ＤＴ４０細胞株から抗体産生株を取得するAdlib法（Seo, H. et al., Nat. Biotechnol., 6:731-736, 2002）、マウス抗体遺伝子が破壊されヒト抗体遺伝子が導入されたマウスであるＫＭマウスを免疫してヒト抗体を作製する方法（Itoh, K. et al., Jpn. J. Cancer Res., 92:1313-1321, 2001；Koide, A. et al., J. Mol. Biol., 284:1141-1151, 1998）等があり、これらも本発明に係る抗体の産生に応用することができる。
　本発明の抗ＴＬＲ７抗体が低分子抗体である場合、当該低分子抗体をコードするＤＮＡを用いて上記方法で発現させてもよいし、また、全長の抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理して作製してもよい。
　本発明で用いられる抗体は、作製方法や精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、本発明の抗体と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明の抗体を、大腸菌等の原核細胞で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加される。本発明は、かかる抗体も包含する。
　本発明において、抗体は公知の方法によって準備すればよい。例えば、ヒトＴＬＲ７に対する抗体は、非ヒト動物を目的抗原で免疫し、免疫成立後の動物からリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５－４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５－３６７，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることができる。このような方法の具体的な例は、ＷＯ２００９／４８０７２（２００９年４月１６日公開）及びＷＯ２０１０／１１７０１１（２０１０年１０月１４日公開）に記載されている。
　本発明の抗体には、モノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体なども含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
　キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１－６８５５，（１９８４）参照）。
　ヒト化抗体としては、ＣＤＲのみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２－５２５参照）、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際公開ＷＯ９０／０７８６１号）などを挙げることができる。
　好ましい態様において本発明の抗体としては、ヒト抗体を挙げることができる。例えば、抗ＴＬＲ７ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗ＴＬＲ７ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法によって取得することができる。この方法については、例えば、下記を参照することができる。
Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p.133-143
Kuroiwa, Y. et.al., Nucl.Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448
Yoshida, H. et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol.10, p.69-73 (Kitagawa,Y., Matsuda,T. and Iijima,S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999
Tomizuka, K. et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727
　このようなヒト抗体産生マウスは、具体的には、内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりにヒト人工染色体（Human Artificial Chromosome：ＨＡＣ）ベクターやマウス人工染色体（Mouse Artificial Chromosome：ＭＡＣ）ベクターなどのベクターを介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子組み換え動物を、ノックアウト動物及びトランスジェニック動物の作製、及びこれらの動物同士を掛け合わせることにより作り出すことができる。
　また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞を用いることができる。
　また、抗ＴＬＲ７ヒト抗体は、ヒト抗体ライブラリより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法により取得することもできる。この方法に関しては、例えば、下記の文献などを参照できる。
Wormstone, I.M.et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002) 43(7), p.2301-2308
Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1(2), p.189-203
Siriwardena, D. et.al., Ophthalmology (2002) 109(3), 427-431
　ある抗ＴＬＲ７抗体を、本発明に用いることができるか否かは、当業者が適宜決定することができる。例えば、下記の少なくとも１つを確認することにより、得られた抗体から、ヒトＴＬＲ７の検出に用いられるものを選択することが可能である。
（ａ）得られた抗体が細胞表面のＴＬＲ７に結合するか否か
（ｂ）免疫細胞をＴＬＲ７のリガンドによって刺激しつつ、得られた抗体と接触させたときに、免疫細胞から分泌される炎症性サイトカイン量が抑制されるか否か
（ｃ）Ｂ細胞をＴＬＲ７のリガンドによって刺激しつつ、得られた抗体と接触させたときに、Ｂ細胞の増殖が抑制されるか否か
（ｄ）マウスなどの炎症性疾患モデル動物に得られた抗体を投与することによって、病態が改善されるか否か
　本発明に係る抗ＴＬＲ７抗体は、疾患の診断や治療に有用である。本発明に係る抗ＴＬＲ７抗体が特に有用な疾患としては、各種の自己免疫疾患が挙げられる。自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、多発性筋炎（ＰＭ）、シェーグレン症候群、ＡＮＣＡ関連性血管炎、ベーチェット病、川崎病、混合性クリオグロブリン血症、多発性硬化症、ギランバレー症候群、筋無力症、１型糖尿病、バセドウ病、橋本病、アジソン病、ＩＰＥＸ、ＡＰＳ type-II、自己免疫性心筋炎、間質性肺炎、気管支喘息、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、アトピー性皮膚炎、溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、特発性若年性関節炎の多関節炎型などが挙げられる。中でも、本発明に係る抗ＴＬＲ７抗体は、その発症の機序にＴＬＲ７応答が関与することが報告されているＳＬＥや乾癬に有用と考えられる。
　本発明に係る抗ＴＬＲ７抗体は、一つの態様において、薬学的に許容できる担体や添加物を含む。担体及び添加物の例として、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
　抗ヒトＴＬＲ７抗体を用いた分析
　一つの態様において、本発明に係る抗ヒトＴＬＲ７抗体は、ヒトＴＬＲ７を検出するために使用される。すなわち、本発明は、抗ヒトＴＬＲ７抗体を用いてサンプル中のヒトＴＬＲ７を認識または検出することを含む、ヒトＴＬＲ７の検出方法に関する。本発明の利用分野は、臨床、医薬品、食品など広範囲に渡り、例えば、ＴＬＲ７が関与する自己免疫疾患に関する分析はもちろん、ＴＬＲ７抗体の投与を決定する際の指標などとして本発明による分析結果を利用することができる。
　一つの態様において本発明は、抗ヒトＴＬＲ７抗体を用いてヒトＴＬＲ７を認識又は検出することを含む、ヒトＴＬＲ７が関与する疾患の検査方法に関する。
　上記認識又は検出は、ヒトＴＬＲ７に対する抗体又はその機能的断片を用いることができる。抗体又はその機能的断片を用いて目的分子を検出する方法は、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば、酵素免疫アッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫比濁法、免疫拡散法などの手法によってヒトＴＬＲ７が検出される。
　ここで、抗体の機能的断片とは、その機能が維持された抗体断片を意味し、例えば、ヒトＴＬＲ７に対する抗体の機能性断片とは、ヒトＴＬＲ７を認識する機能が維持された抗体断片を意味する。抗体断片としては、例えば、ｓｃＦｖおよびドメイン抗体などの抗体フラグメントなどを好適に使用することができる。
　好ましい態様において、本発明では酵素免疫アッセイ、免疫沈降またはフローサイトメトリーによってヒトＴＬＲ７を検出する。
　現在、抗体・抗原間の親和性を利用して標的物質を検出および／または定量する方法として、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ：エライザ）法に代表される酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ：エンザイムイムノアッセイ）が幅広い分野で利用されており、各種診断や種々の生物学的検査になくてはならない技法の１つとなっている。また、酵素免疫アッセイを応用したバイオセンサーであるイムノセンサーも開発され、広く利用されている。
　ＥＬＩＳＡ法の測定原理は、標的物質である抗原または抗体を、標識酵素を連結した抗体または抗原と反応させ、その標識酵素の酵素活性から標的物質を検出および／または定量するものである。すなわち、ＥＬＩＳＡ法においては、抗体による分子認識により得られた信号を、酵素を利用して増幅することによって、標的物質の高感度な検出を達成している。
　本発明においては、ＥＬＩＳＡ法などに一般に用いられる標識酵素を制限なく使用することができる。標識酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼおよびガラクトシダーゼなどを好適な例として挙げることができるが、他の酵素を用いることも可能である。ＥＬＩＳＡ法などにおいては、標識酵素が触媒する反応によって生じる反応生成物を、吸光、蛍光、発光によって検出する方法が一般的であり、また、イムノセンサーの場合、標識酵素による酵素反応を電気化学的に検出する方法が主流となっている。その他の酵素反応の検出法としては、標識酵素であるアルカリフォスファターゼ等の反応により不溶性生成物を生成させ、その沈殿物を水晶振動子などのピエゾ素子を利用して検出する方法などが知られている。
　一般に酵素免疫アッセイとして種々の方法が知られているが、本発明は、公知のあらゆる酵素免疫アッセイに対して応用することが可能である。また、本発明は、酵素免疫アッセイを応用したイムノセンサーに応用することも可能である。
　本発明において、酵素免疫アッセイとは、酵素反応と免疫反応とを利用することにより、標的物質を検出および／または定量する方法をいう。より具体的には、酵素で標識した抗原または抗体を用いて抗原抗体反応を行い、酵素活性を測定することにより抗原抗体反応を検出して、標的物質を検出および／または定量する方法である。また、一般に、酵素免疫アッセイには、競合法と非競合法（例えば、サンドイッチ法）が知られている。競合法は、抗原または抗体を標識酵素で標識し、標識した抗原を試料中の遊離抗原と競合させて、対応する抗体または抗原と抗原抗体反応を行わせる。その後、基質を添加して、酵素反応によって抗原抗体反応の信号を増幅し、検出および／または定量を行う。一方、非競合法として一般的なサンドイッチ法では、非標識抗体（捕獲抗体、第１抗体）を試料中の標的物質（抗原）と結合させ、ついで、酵素標識した標識化抗体（検出抗体、第２抗体）を、抗原と捕獲抗体との複合体に結合させる。その後、基質を添加して、酵素反応によって抗原抗体反応の信号を増幅し、標的物質の検出および／または定量を行うものである。特に、サンドイッチ法は、異なる二つの抗体を用いて検出するため、特異性が高い。その他にも、酵素免疫アッセイとして、ダブルレイヤー法等が知られており、本発明をこれらの測定法に応用することができる。また、サンドイッチ法を始めとする方法では、通常、捕獲抗体と検出抗体とではそれぞれエピトープが異なる。
　標識酵素と抗体を連結する方法は、特に制限されず、化学的手法を用いてもよいし、遺伝子工学的手法を用いてもよい。また、標識酵素を抗体に直接連結してもよいし、間接的に結合させてもよい。
　化学的手法により標識酵素を抗体に連結する場合、直接連結することもできるし、リンカーやスペーサーを介して連結させることもできる。また、ジゴキシゲニン、アビジン、ビオチンなどの特異的結合を利用して、標識酵素と抗体を連結することができる。また、遺伝子工学的手法により標識酵素を抗体に連結する場合、融合タンパク質法を利用して、例えば、融合タンパク質（キメラタンパク質）として酵素標識された抗体を作製することもできる。
　具体的には、標識酵素の抗体への連結は、これに限定されるものではないが、二価架橋剤を使用する方法を始めとする公知の方法を利用することができる。したがって、例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェニル基などを利用することができる。アミノ基相互間を連結する場合、例えば、イソシアネート法、グルタルアルデヒド法、次フルオロベンゼン法、ベンゾキノン法などを挙げることができる。また、アミノ基とカルボキシル基とを結合する場合、カルボキシル基をサクシニルイミドエステル化する方法の他、カルボジイミド法、ウッドワード試薬法、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）も適用できる。さらに、チオール基を利用する場合には、例えば、一方の側のカルボキシル基をサクシニルイミドエステル化して、これにシステインを反応させてチオール基を導入し、チオール基反応性二価架橋剤を用いて双方を結合させることができる。その他、フェニル基を利用する方法としてはジアゾ化法、アルキル化法などがある。
　なお、抗体に酵素と結合させるための適当な官能基がない場合には、これらにアミノ基、カルボキシル基或いはチオール基等を導入してもよい。その際にはスペーサーを介して導入し、酵素と結合し易くしてもよい。
　また、抗体と標識酵素との連結比は１：１には限定されず、任意の比率とすることができる。例えば、グルタルアルデビド法や過ヨウ素酸法（Ｊ．　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２，　１０８４，　１９７４）を利用して、分子認識素子に複数の標識酵素を連結することができる。
　本発明の好ましい態様において、免疫沈降法によって抗原であるＴＬＲ７を分析することができる。免疫沈降法では、可溶性の抗原と抗体が特異的に反応して不溶化することを利用するが、比較的穏和な条件で抗原を検出・分離・精製することができる。例えば、基質と抗体を多数架橋させることによって、大きな構造体として不溶化させる。一般に、セファロースビーズなどの担体に抗体を結合させるが、磁気ビーズを使用する方法もよく行われる。
モノクローナル抗体よりもポリクローナル抗体の方が免疫沈降を行いやすい。
　免疫沈降法においては、サンプルに特異性のない抗体（使用する場合は担体も）を混ぜ、遠心分離によって非特異的に吸着する成分を取り除いてもよい。磁気ビーズを用いる場合は、遠心分離の代わりに磁石による分離を行う。
　本発明の１つの態様において、抗体や抗原であるＴＬＲ７を基材に固定化することができる。例えば、本発明をＥＬＩＳＡ法に適用する場合などでは、本発明の抗体が基材に固定化される。本発明において抗体や抗原を固定化する基材としては、公知のあらゆる材料を使用することができる。したがって、例えば、多孔性ガラス、シリカゲル、ヒドロキシアパタイトなどの無機高分子化合物；および、金、銀、白金などの金属；が基材として利用可能である。さらに、エチレン－酢酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネートなどの合成高分子；デンプン、グルテン、キチン、セルロース、天然ゴムなどの天然高分子；およびこれらの誘導体を挙げることができる。また、疎水基を有するアガロース誘導体、ニトロセルロース、およびそれらの誘導体なども、本発明に使用する基材として挙げることができる。特に、本発明においては、使用する測定方法に応じて基材の材質を選択することができ、基材の形状は、特に限定されず、使用方法に応じて、マイクロプレート、ビーズ、フイルム、シート、チューブ、繊維、スティック等の形状とすることができる。
　本発明において、抗原または抗体を基材に固定化する場合、固定化の方法は、特に限定されず、公知のあらゆる方法を使用することができる。例えば、物理吸着、包括固定、そして化学的な結合反応による固定化を利用することができる。物理吸着としては、疎水性樹脂表面へのタンパク質の吸着を挙げることができる。包括固定は、ゲルやポリマー等の支持体に固定化すべき物質を包括させることによって固定化を達成する方法である。また、化学的な結合に基づく固定化方法は、支持体表面に導入された官能基を、固定化すべき物質の官能基と化学的に結合させる方法である。
　化学的な固定化方法としては、例えば、シランカップリング剤、プラズマ重合膜、酸無水物を利用して、抗体または抗原を基材へ固定化することを挙げることができる。例えば、酸無水物を介した共有結合によって、抗体または抗原を基材上に固定化する場合、基材表面に存在する酸無水物基を介して抗体などを固定化してもよいし、基材表面に存在するカルボキシル基、ホルミル基、アミノ基、アジド基、イソシアネート基、クロロホルミル基、エポキシ基等の他の反応性官能基に酸無水物基を導入した後、この酸無水物基を介して抗体などを固定化してもよい。また、酸無水物基、反応性官能基のいずれも高分子材料表面に無い場合には材料表面に直接酸無水物基を導入して固定化してもよいし、あるいは反応性官能基を導入した後、酸無水物基を導入して固定化してもよい。酸無水物基はスチレン－無水マレイン酸共重合体、エチレン－無水マレイン酸共重合体、メチルビニルエーテル－無水マレイン酸共重合体などと反応させることにより導入できる他、例えばポリウレタンに無水マレイン酸をγ線や電子線によりグラフト重合させ酸無水物基を導入することもできる。
　高分子材料表面に反応性官能基を導入する方法としては、例えばエチレン－酢酸ビニル共重合体にカルボキシル基を導入する場合は、エチレン－酢酸ビニル共重合体をケン化した後、カルボキシメチル化することにより導入される。また、カルボキシル基はヒドラジル基を経てアジド基に誘導することができる。さらに、カルボキシル基は塩化チオニル、塩化アセチルなどによりクロル化することによりクロロホルミル基に変えることもできる。
　エチレン－酢酸ビニル共重合体にアミノ基を導入するには、ケン化したエチレン－酢酸ビニル共重合体をアミノアセタール化すればよい。エポキシ基を導入するには、エピクロルヒドリン、ジエチレングリコールジグリシジルエーテルなどと反応させることにより導入できる。イソシアネート基はヘキサメチレンジイソシアナート、トリレンジイソシアナートなどと反応させることにより導入できる。ホルミル基はグルタルアルデヒド、ジアルデヒドデンプンなどと反応させることにより導入できる。
　また、本発明においては、種々の試料を分析することができる。本発明において、血液（全血、血漿、血清）、リンパ液、唾液、尿、組織病片などの生体からの試料を分析することが好ましく、羊水中に存在する胎児の細胞や、試験管内での分裂卵細胞の一部を検体とすることもできる。本発明により分析する試料は、必要に応じて、前処理などの処理を施してもよいことは言うまでもない。例えば、これらの検体は直接、又は必要に応じて遠心分離操作等により沈渣として濃縮した後、例えば、酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、超音波処理、あるいはこれらの組み合わせ等による細胞破壊処理を予め施したものを使用することができる。好ましい態様において、本発明の検出方法は、ヒトの体液由来のサンプル中の可溶型ＴＬＲ７を検出する。体液は、例えば、血液（全血、血漿、血清）、リンパ液、組織液、体腔液、消化液、唾液、または尿などであり、より好ましくは血漿または血清である。
　一態様において、本発明の検出方法では、サンドイッチＥＬＩＳＡ法のように、複数の抗ヒトＴＬＲ７抗体を用いてサンプル中のヒトＴＬＲ７を検出する。サンドイッチＥＬＩＳＡ法によってヒトＴＬＲ７を検出する場合、例えば固相担体に第１の抗ヒトＴＬＲ７抗体を固定し、ヒトの体液由来のサンプルを添加し、反応させた後、さらに酵素で標識した別のエピトープを認識する第２の抗ヒトＴＬＲ７抗体を添加して反応させる。洗浄後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定することにより、ヒトＴＬＲ７量を求めることができる。第１抗体および第２抗体としては、本発明に係る抗ヒトＴＬＲ７抗体のうち、それぞれエピトープの異なるものを任意に組み合わせることができる。そのような組み合わせとしては、例えば、配列番号１７で示されるヒトＴＬＲ７のアミノ酸配列のうち、２７６位～３１３位の領域内に結合する抗体（例えばｒＥ３）とその他の抗ヒトＴＬＲ７抗体（例えばＬＴＭ３）の組み合わせが挙げられる。
　以上のようにしてサンプル中に存在するヒトＴＬＲ７を検出および定量することにより、ヒトＴＬＲ７が関連する疾患の検査を行うことができる。すなわち、本発明の一つの態様は検査用の薬剤である。例えば、サンプル中に存在するヒトＴＬＲ７の量が所定の閾値よりも少ない場合に、ヒトＴＬＲ７が関連する疾患に罹患している疑いがあると判断される。健常人および疾病罹患者由来のサンプルにおける測定値を用いたＲＯＣ曲線を用いた統計的解析によりカットオフ値を設定することもできる。
　また、サンプル中に存在するヒトＴＬＲ７を検出および定量することにより、ヒトＴＬＲ７を標的とする医薬のヒトにおける効果を評価することができる。すなわち、本発明に係る抗ヒトＴＬＲ７抗体は、ヒトＴＬＲ７を標的とする医薬のためのコンパニオン診断薬として有用である。この場合、被験者由来のサンプルにおけるヒトＴＬＲ７の量が所定の閾値よりも少ない場合に、当該被験者において当該医薬は治療効果を有すると予測することができる。この所定の閾値の設定については、上述のとおりである。ここでヒトＴＬＲ７を標的とする医薬としては、各種の自己免疫疾患に対する医薬が挙げられる。自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、多発性筋炎（ＰＭ）、シェーグレン症候群、ＡＮＣＡ関連性血管炎、ベーチェット病、川崎病、混合性クリオグロブリン血症、多発性硬化症、ギランバレー症候群、筋無力症、１型糖尿病、バセドウ病、橋本病、アジソン病、ＩＰＥＸ、ＡＰＳ type-II、自己免疫性心筋炎、間質性肺炎、気管支喘息、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、アトピー性皮膚炎、溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、特発性若年性関節炎の多関節炎型などが挙げられる。中でも、本発明に係る抗ヒトＴＬＲ７抗体は、その発症の機序に抗ＴＬＲ７抗体が関与することが報告されているＳＬＥや乾癬に対する医薬のヒトにおける効果の評価に有用と考えられる。
　本発明は、１つの態様において、標的物質であるヒトＴＬＲ７の測定キットを提供する。本発明の標的物質の測定キットは、ある態様において、抗ヒトＴＬＲ７抗体を含んでなる。本発明の測定キットは、さらに、抗体が固定化される基材、標準溶液、増感剤、バッファー、使用説明書、パッケージなどを含んでもよい。
　具体的な実験例を挙げつつ本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は下記の実験例に限定されるものではない。なお、本明細書において、特に記載しない限り、濃度などは重量基準であり、数値範囲はその端点を含むものとして記載される。
　実験１：抗ｈＴＬＲ７抗体の取得
　（１）ベクター構築とｈＴＬＲ７発現細胞の樹立
　遺伝子のＣ末端側にFlag-Hisタグを６つ付加したレトロウイルスベクター（pMXs）に、In Fusion酵素（タカラバイオ）を用いてｈＴＬＲ７遺伝子（全長、配列番号１７で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子）を組み込んだ。このレトロウイルスベクターを、パッケージング細胞株（Plat-E、HEK293細胞由来）にトランスフェクション試薬（Fugene 6、Roche）を用いて遺伝子導入した。２４時間後、培養上清を回収し、ウイルス懸濁液とした。このウイルス懸濁液をリポソームトランスフェクション試薬（ＤＯＴＡＰ、Roche）と混和して目的細胞に加え、２０００ｒｐｍで１時間、遠心処理を行った。なお、レトロウイルスベクターとパッケージング細胞株は、東京大学医科学研究所の北村俊雄教授より分与していただいた。
　（２）免疫
（ＬＴＭ３）　ＴＬＲ９欠損マウス（バックグラウンド：BALB/c）に、アジュバント（Titer MAX Gold、CYT）と混合した抗原（hTLR7-Flag-His×6/hUnc93B1-HA×2強制発現Ba/F3細胞株）を１週間ごとに合計３回、足底部、尾根部、腹腔内に投与した。４回目は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で懸濁した抗原を腹腔内に投与した。最終免疫日から５日目にマウスから脾臓を摘出して、ハイブリドーマの作製に用いた。
（ｒＥ３）　野生型ラット（バックグラウンド：Wister）に、アジュバント（Titer MAX Gold、CYT）と混合した抗原（hTLR7-Flag-His×6/hUnc93B1-HA×2強制発現Ba/F3細胞株）を１週間ごとに合計３回、足底部、尾根部、腹腔内に投与した。４回目は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で懸濁した抗原を腹腔内に投与した。最終免疫日から５日目にラットから脾臓を摘出して、ハイブリドーマの作製に用いた。
　（３）ハイブリドーマの作製
　免疫後の脾臓細胞とSp2/Oマウスミエローマ細胞株を混合し、ＨＶＪ－Ｅ細胞融合キット（石原産業）を用いて細胞融合を行った。細胞融合操作の翌日から、ハイブリドーマを選択するために、ＨＡＴ含有培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含有する培養液）で培養した。
　（４）ハイブリドーマのスクリーニング試験
　顕微鏡下でコロニーを形成しているハイブリドーマから培養上清を採取し、スクリーニングに用いた。サポニン０．１％溶液を用いて細胞膜透過処理を行った後、hTLR7-Flag-His×6/hUnc93B1-HA×2強制発現Ba/F3細胞株と何も発現させていないBa/F3細胞を、培養上清でそれぞれ染色し、フローサイトメトリーで解析して抗ｈＴＬＲ７抗体を産生するハイブリドーマを選別した。
　（５）抗体可変領域遺伝子配列の決定
　各抗体のハイブリドーマについて、遺伝子配列を解析した（Genescript社にて実施）。結果を図２に示す。
　実験２：フローサイトメトリーによるモノクローナル抗体の特異性評価
　ｈＴＬＲ７-Flag-His×6/hUnc93B1-HA×2、サルＴＬＲ７、マウスＴＬＲ７を強制発現したBa/F3細胞株を、サポニン０．１％溶液を用いて細胞膜透過処理を行い、ｒＥ３およびＬＴＭ３で染色した。各抗体の結合評価は、フローサイトメトリーで解析して、未発現細胞の染色とヒストグラムを比較した。その結果、ｒＥ３およびＬＴＭ３は、ヒトＴＬＲ７だけでなくサルＴＬＲ７にも交差活性を示したが、マウスＴＬＲ７には交差活性を示さなかった（図２）。
　実験３：ＥＬＩＳＡ系の確立
　ｒＥ３およびＬＴＭ３は、お互いのエピトープが異なっているため（図３）、これらのモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を行った。具体的には、ＬＴＭ３抗体を捕獲抗体、ビオチン化ｒＥ３抗体（ｒＥ３－ｂｉｏ）を検出抗体とし、直接検出法により抗原を検出した。
　（１）プレートの準備
　ＰＢＳで希釈したＬＴＭ３（１０μｇ／ｍｌ）を、９６穴プレートに播種し、４℃で一晩静置した。ＰＢＳ（０．０５重量％のTweenを含有）で３回洗浄後、ブロッキング試薬（Blocking One、ナカライテスク）を４倍希釈したものでブロッキングを行った。
　（２）検体の準備
　検体には、健常人から採取したサンプル（血清：７検体、血漿：９検体）を用いた。ブロッキング試薬（Blocking One、ナカライテスク）を１０倍希釈した液（以下、希釈液とする）に、最終濃度が０．１％になるように界面活性剤（Triton-X100）を添加した。この希釈液を用いて、５μｌの検体を１０倍に希釈した。また、濃度既知のサルＴＬＲ７蛋白質（細胞外ドメイン、ｍａｃａｃａ ＴＬＲ７）を８ｎｇ／ｍｌから０．０３１２５ｎｇ／ｍｌまで２倍ずつ希釈液で段階希釈を行って、標準曲線作成用の検体を調製した。なお、サルＴＬＲ７蛋白質は、東京大学薬学部の清水敏之博士よりご供与いただいた。
　（３）　ｈＴＬＲ７の検出
　プレートを３回洗浄後、ビオチン化したｒＥ３抗体１μｇ／ｍｌを添加した。室温で２時間、静置した。３回、洗浄後、アビジン・ＨＲＰ複合体を添加し、室温で３０分静置した。
　３回洗浄後、ＨＲＰ基質（西洋ワサビペルオキシダーゼ基質）を加えて１５分間反応させた。次いで、１Ｎ硫酸を添加して反応を停止させた。
　次いで、４５０ｎｍの波長の吸光度を測定し、５７０ｎｍ波長の吸光度を適宜除いた。サルＴＬＲ７についての標準曲線を図４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（４）標準曲線を用いた定量
　健常人またはＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）患者の血漿から得られたサンプルに関して可溶型ＴＬＲ７を測定し、標準曲線に基づいて可溶型ＴＬＲ７を定量したところ、結果は以下の通りであった。
・健常人：３２４６ｐｇ／ｍｌ
・ＳＬＥ患者：２７３ｐｇ／ｍｌ
　このように、抗原決定基の異なる複数の抗体を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡによって可溶型ＴＬＲ７を実際に定量することができた。
　実験４：免疫沈降とウエスタンブロッティング法による可溶型ＴＬＲ７の検出
　ヒト血清または血漿５００μｌを、界面活性剤（Triton-X100、最終濃度：１％）５００μｌで処理した。続いて、担体（NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow、ＧＥヘルスケア）に担持させたｒＥ３を用いて免疫沈降した。
　次いで、これらの検体をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分子量で分離し、ウエスタンブロッティングにてｈＴＬＲ７を検出した。ｈＴＬＲ７の検出には、下記の抗体を使用した。
・１次抗体：Rabbit Anti-TLR7 monoclonal antibody（ＣＳＴ）
・２次抗体：Anti-Rabbit IgG (H＋L) antibody-HRP（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
　発色基質を加えて、検出されたバンドの分子量を評価した。結果を図５に示すが、およそ１３０ｋＤａのバンドを検出したので、ｈＴＬＲ７の全長型と判断した。
　実験５：ＥＬＩＳＡによる可溶型ＴＬＲ７の検出
　実験３で確立したＥＬＩＳＡ系を用いて、ヒトの末梢血由来の血清または血漿を分析し、疾患との関連性を調べた。具体的には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、多発性筋炎（ＰＭ）、全身性強皮症（ＳＳｃ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）の患者および健常人（Ｈｅａｌｔｈｙ）から採取した末梢血由来の血清または血漿について、ＴＬＲ７を定量した。
　分析結果を図６に示すが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および皮膚筋炎（ＤＭ）の患者由来のサンプルについては、健常人由来のサンプルとは明確な有意差が見られた（＊＊＊）。また、多発性筋炎（ＰＭ）、全身性強皮症（ＳＳｃ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）の患者由来のサンプルについても、健常人由来のサンプルと有意差が見られた（＊）。例えば、全身性エリテマトーデスの患者群の結果からＲＯＣ曲線を描き、健常人由来のサンプルの結果と比較してYouden indexが最大となる濃度を求めたところ１３２７ｐｇ／ｍｌだった。例えば、この数値を閾値として設定してサンプルの分析をすることが可能である。
　この結果は、可溶型ＴＬＲ７が自己免疫疾患の病態を示すマーカーとして有用であることを示すものであり、ＴＬＲ７に対する抗体を投与するにあたって本発明によってＴＬＲ７を検出することで、自己免疫疾患の診断や治療に有用に応用できるものである。
　抗ヒトＴＬＲ７抗体を樹立し、可溶型ＴＬＲ７を検出し得るアッセイ系を構築した。ヒト血清を解析した結果、可溶型ＴＬＲ７が血清中に検出されるという結果を得た。さらに、健常人と自己免疫疾患の患者由来の血清で可溶型ＴＬＲ７の量に有意差があることが判明した。この検出系により得られる結果は、ＴＬＲ７が病態に関与する疾患において、病態の状態を示す指標として有用であると考えられる。

Claims (9)

  1. 　抗ヒトＴＬＲ７抗体を用いて被験者のサンプル中のヒトＴＬＲ７を検出する工程と、
    　被験者のサンプルに関する検出結果を、健常人由来のサンプルに関する検出結果と比較する工程と、
    を含む、ヒト由来の体液サンプルを分析する方法。
  2. 　酵素免疫アッセイおよび／または免疫沈降によってヒトＴＬＲ７を検出する、請求項１に記載の方法。
  3. 　複数の抗ヒトＴＬＲ７抗体を用いてサンプル中のヒトＴＬＲ７を検出する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記サンプルが、ヒトの体液由来のサンプルである、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記サンプルが、ヒトの血漿および／または血清を含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　被験者が、自己免疫疾患の患者または自己免疫疾患が疑われる者である、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　ＴＬＲ７が活性化してなる自己免疫疾患を検査するための薬剤であって、抗ヒトＴＬＲ７抗体を含む上記薬剤。
  8. 　ヒト由来の体液サンプルを分析するための、請求項７に記載の薬剤。
  9. 　自己免疫疾患がＳＬＥである、請求項７または８に記載の薬剤。
     
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005224240A (ja) * 2004-01-13 2005-08-25 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ノックアウト非ヒト動物から樹立された不死化細胞株
JP2008195666A (ja) * 2007-02-14 2008-08-28 Japan Science & Technology Agency ２−６シアリル６−スルホ糖鎖に対する抗体
JP2010525797A (ja) * 2007-04-27 2010-07-29 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ マクロファージ−コロニー刺激因子（ｍ−ｃｓｆ）による樹状細胞発生の誘導
JP2011529967A (ja) * 2008-08-04 2011-12-15 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＴｏｌｌ様受容体７発現の調節
WO2014174704A1 (ja) * 2013-04-22 2014-10-30 国立大学法人東京大学 炎症性疾患の予防又は治療剤
JP2016534022A (ja) * 2013-07-30 2016-11-04 Ｓｂｉバイオテック株式会社 抗ホスホリパーゼｄ４抗体を含む医薬

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005224240A (ja) * 2004-01-13 2005-08-25 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ノックアウト非ヒト動物から樹立された不死化細胞株
JP2008195666A (ja) * 2007-02-14 2008-08-28 Japan Science & Technology Agency ２−６シアリル６−スルホ糖鎖に対する抗体
JP2010525797A (ja) * 2007-04-27 2010-07-29 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ マクロファージ−コロニー刺激因子（ｍ−ｃｓｆ）による樹状細胞発生の誘導
JP2011529967A (ja) * 2008-08-04 2011-12-15 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＴｏｌｌ様受容体７発現の調節
WO2014174704A1 (ja) * 2013-04-22 2014-10-30 国立大学法人東京大学 炎症性疾患の予防又は治療剤
JP2016534022A (ja) * 2013-07-30 2016-11-04 Ｓｂｉバイオテック株式会社 抗ホスホリパーゼｄ４抗体を含む医薬

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