JP6728047B2 - 治療方法及び組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、免疫系の調節を必要とする対象における免疫系の調節のための組成物及び方法に関する。本発明は、免疫反応の重要な内因性因子の存在と特性とを特に開示し、この因子の調節に基づく新規の治療的及び診断的方法と組成物とを提供する。本発明は、特に、対象におけるCD4T細胞性免疫反応を刺激又は阻害することに適する組成物及び方法と、ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus、HIV)感染に関連する免疫不全を含む免疫不全をモニタリングする方法及び組成物とを提供する。また、抗レトロウイルス治療後に続くCD4T細胞欠損を診断及び分析する方法及び組成物と、この免疫不全を特に処置することが可能な薬剤を開発する方法とも提供される。
CD4Tリンパ球は、免疫系(細胞性及び体液性の両方の反応)の制御において特に大きな役割を果たし、種々の疾患状態において重要である。
HIV発病に関連した免疫疾患において、すべてのCD4T細胞のうちの0.5%未満が(末梢血において測定されるように)実際に感染しているが、CD4T細胞の大部分は大幅な調節不全を示す。非感染CD4Tリンパ球は段階的にその機能を欠失し、アネルギー性になり、そしてその数は減少してCD4リンパ球減少をもたらす。アネルギー及びリンパ球減少は、HIV感染患者を特徴づける免疫不全の際立った特徴である。これらの減少の背後にある機構は完全には明らかにされていない(参考文献(1))。
免疫活性化や炎症もまたHIV発病において重要な役割をする(参考文献(2)、(3))。CD4アネルギーをもたらす、インターロイキン−2(IL−2)に対する反応性の減少(参考文献(4))と、IL−7/CD4調節ループを破壊することによってCD4リンパ球減少をもたらす機構に加わる(参考文献(5))、インターロイキン−7(IL−7)に対する反応性の低下とを、発明者等は以前に提示した。関連する機構は、ヤヌスキナーゼ(Janus kinase、Jak)/シグナル伝達兼転写活性化因子(Signal Tranducer and Activator of Transcription、STAT)経路における欠損に起因する(参考文献(6)、(7))。同様の結果が他の研究によって得られている(参考文献(8)、(9))。これについて、IL−7受容体(IL−7R)の区画化は、通常のCD4T細胞反応を惹起するために必要とされる(参考文献(10))。IL−7の結合を受けて、IL−7Rの2鎖(IL−7Rα及びγ−c)がまず膜マイクロドメイン(MMD)に駆動される。これらは、脂質ラフトのようにコレステロールとスフィンゴミエリンとに富む細胞区画であるが、非常に重大な量の構造的及び機能的タンパク質も含有する(参考文献(11))。IL−7R複合体は、その網目構造で相互作用する細胞骨格再組織化を誘導する。これら2つの連続する段階は、Jak/STAT経路の惹起に必要とされ得る(参考文献(12))。
本発明者らは、ウイルス血症HIV感染患者(viremic HIV感染患者s、VP)におけるCD4Tリンパ球の不反応性の背後にある機構を調査した。本明細書に記載される実験では、CD4Tリンパ球の慢性活性化が、インターロイキン−7により送達されるものなど特定の生理的シグナルに対する不応性をもたらす、CD4Tリンパ球の活性/分化の異常な状態を引き起こすということが示される。さらに、本発明は、このCD4T細胞活性化の異常な状態の要因であるタンパク質の、ヒト血漿からの特定、単離、及び特性評価について報告する。本発明は、発現するとCD4T細胞の変化と不活性化とを誘導可能であり、阻害すると対象における免疫系を刺激することができる内在性循環タンパク質によって、免疫抑制が媒介されることができるということを初めて開示する。
これらの優れた発見に部分的に基づいて、本発明は、免疫系を調節するための、特に変化した免疫(例として免疫抑制又は病理的な免疫反応)を有する対象における免疫系を調節するための新規の方法、組成物、及び化合物を提供する。本発明は、CD4T細胞を調節することにより免疫障害を処置するための新規の方法をさらに提供する。本発明は、HIV感染と関連する免疫不全症候群などのCD4T細胞障害に関連付けられる免疫不全の処置に特に適する。また、本発明は、異常な活性状態やIL7に対する反応性を特徴づけるための、及び/又はHIV感染患者において損なわれた免疫反応をモニタリングするための、試薬及び方法も提供する。CD4T細胞の反応は、未処置又は抗レトロウイルス薬剤で処置された患者において評価されることが可能であり、処置に対するその反応を条件付けし、CD4T細胞の能力を評価する。
本発明の目的は、GIBsPLA2の(例えば発現)量又はGIBsPLA2活性を調節する化合物に対象を曝露させるステップを含む、対象における免疫反応を調節するための方法に関する。
本発明のさらなる目的は、GIBsPLA2の(例えば発現)量又はGIBsPLA2活性を調節する化合物に対象を曝露させるステップを含む、対象における免疫障害を処置する方法に関する。
本発明のさらなる目的は、対象におけるGIBsPLA2の(例えば発現)量又はGIBsPLA2活性を調節するステップを含む、対象における免疫障害を処置する方法に関する。
本発明の他の目的は、対象における免疫反応を調節するか又は免疫障害を処置する薬剤を製造するための、GIBsPLA2の(例えば発現)量又はGIBsPLA2活性を調節する化合物の使用に関する。
本発明の他の目的は、対象における免疫反応を調節するか又は免疫障害を処置する方法に使用するためのGIBsPLA2モジュレータに関する。
本発明の他の目的は、対象における白血球の調節に使用するためのGIBsPLA2モジュレータに関する。
第1の実施形態において、本発明は対象における免疫反応を誘導又は刺激するために用いられ、前記対象においてGIBsPLA2を阻害することか、又は対象をGIBsPLA2阻害剤に曝露させることを含む。そのような実施形態は、免疫不全の対象又は免疫刺激を必要とする対象(例えば感染性疾患、がんなど)を処置することに特に適する。
このように本発明の特定の目的は、対象においてGIBsPLA2を阻害するか又は対象をGIBsPLA2阻害剤に曝露させるステップを含む、対象における免疫反応を刺激する方法にある。
本発明のさらなる目的は、対象においてGIBsPLA2を阻害するか又は対象をGIBsPLA2阻害剤に曝露させるステップを含む、対象における感染性疾患を処置する方法に関する。
本発明のさらに特定の実施形態は、対象においてGIBsPLA2を阻害するか又は対象をGIBsPLA2阻害剤に曝露させるステップを含む、HIV感染対象におけるAIDSを処置する方法に関する。
特定の実施形態において、対象を阻害剤に曝露させることは対象に阻害剤を投与することを含む。他の実施形態において、対象を阻害剤に曝露させることは、対象にGIBsPLA2に対するワクチンを接種させることを含む。
これに関し、特定の実施形態では、本発明は免疫系の刺激を必要とする対象の免疫系を刺激するための方法に関し、該方法は対象にGIBsPLA2に対するワクチンを接種させるステップを含む。
他の特定の実施形態では、本発明は、ワクチンを接種を必要とする対象のワクチン接種に使用するためのGIBsPLA2抗原に関する。
他の態様では、本発明は、対象における不要又は有害な免疫反応を低減又は抑制するために用いられ、前記対象においてGIBsPLA2を誘発若しくは増加させるか又は対象をGIBsPLA2アゴニスト若しくはアクチベータに曝露させることを含む。そのような実施形態は、異常及び/又は病理的な免疫反応(例えば、自己免疫性疾患、炎症、じんま疹、湿疹、アレルギー、ぜんそくなど)を有する対象を処置することに特に適する。
さらなる態様では、本発明は、CD4T細胞の変化に関連するヒト免疫不全を診断するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、(a)対象からの体液、好ましくは血漿を含む試料を準備するステップと、(b)該試料におけるGIBsPLA2の存在を検出するステップとを含む。本方法の一部の実施形態において、免疫不全はヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染に関連する免疫不全である。一部の実施形態において、本方法は、試料を、GIBsPLA2に特異的な抗体に接触させるステップを含む。本方法の一部の実施形態において、試料におけるGIBsPLA2の存在は、酵素結合免疫吸着法(ELIZA)によって検出される。
他の態様において、本発明では、候補の免疫不全治療剤を特定するための方法が提供される。一部の実施形態において、免疫不全はCD4T細胞の変化と関連する。本方法の一部の実施形態において、CD4T細胞の変化に関連するヒト免疫不全は、ウイルス感染、特にヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染により引き起こされる。一部の実施形態において、本方法は、(a)薬剤の存在下においてCD4Tリンパ球をGIBsPLA2に接触させるステップと、(b)GIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化を測定するステップと、(c)薬剤の存在下におけるGIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化のレベルを、薬剤の非存在下におけるGIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化のレベルと比較するステップとを含む。本方法の一部の実施形態において、薬剤の存在下におけるGIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化のレベルが、薬剤の非存在下におけるGIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化のレベルより低い場合、薬剤は候補の免疫不全治療剤として特定される。本方法の一部の実施形態において、薬剤の存在下におけるGIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化のレベルが、薬剤の非存在下におけるGIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化のレベルよりも低くない場合、薬剤は候補の免疫抑制治療剤として特定される。一部の実施形態において、本方法は、CD4T細胞毎のMMDの数を測定することによってGIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化を測定することを含む。一部の実施形態において、本方法は、CD4T細胞におけるMMDの平均直径を測定することによってGIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化を測定することを含む。一部の実施形態において、本方法は、CD4T細胞のIL−7反応性を測定することによってGIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化を測定することを含む。
他の態様において、本発明は、GIBsPLA2モジュレータと薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態において、GIBsPLA2モジュレータはGIBsPLA2阻害剤であり、より好ましくは抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体、阻害性核酸、ペプチド又は小分子薬剤から選択される。他の特定の実施形態では、GIBsPLA2モジュレータはGIBsPLA2アゴニスト又はアクチベータであり、特にGIBsPLA2タンパク質である。
他の態様において、本発明は、GIBsPLA2抗原(例として免疫原性GIBsPLA2タンパク質若しくはエピトープを含有するそのフラグメント)、薬学的に許容される担体又は賦形剤、並びに任意的にアジュバントを含むワクチン組成物に関する。好ましい実施形態において、GIBsPLA2抗原は、(i)ヒト対象における免疫原性を増大させるか、及び/又は(ii)生物活性を低下させるために扱われるGIBsPLA2タンパク質又はそのフラグメントである。
本発明は任意の哺乳動物に用いられるとよく、ヒト対象における使用に特に適する。また、任意の哺乳動物における免疫反応を増大させるために用いられ得り、免疫抑制対象における強力なCD4T細胞活性を誘導するように特に適応される。
図1において、図1a〜図1eは、VPからのCD4T細胞が、任意の刺激前に、IL−7に影響を受けない多くの大きい膜マイクロドメインによって活性の異常な状態を示すということを提示する。図1aにおいて、膜マイクロドメイン(MMD)は、コレラ毒素サブユニットB(CtxB−AF488)で標識され、STED顕微鏡により解析される。上から下に、HD(healthy donor、健康なドナー)、VPからの精製されたCD4T細胞、及びHDのPHA活性(40μg/ml、30分)T細胞である。各群において、IL−7刺激(2nM、15分)前後の代表のCD4T細胞の上位半分がZ軸スタックイメージシリーズから示される。またCD4Tリンパ球は、IL−7による刺激前に、コレステロールオキシダーゼ(COase、31μM、25分)とスフィンゴミエリナーゼ(SMase、2.7μM、5分)とで処理された。図1b、図1cにおいて、MMDは、精製CD4T細胞の全表面においてカウントされた。平均50細胞が検査された。図1bはIL−7刺激前(HDc:NS)と後(HDc:IL−7)のHD細胞を示し、図1cは、VPのIL−7刺激前(VPc:NS)と後(VPc:IL−7)とのVP細胞、IL−7刺激前(HDc:PHA)と後(HDc:PHA/IL−7)とのPHA活性HD細胞を示す。図1d、図1eにおいて、精製CD4T細胞の表面でMMDサイズが測定された。図1dはIL−7刺激HD細胞(HDc:IL−7)を示し、図1eはIL−7刺激VP細胞(VPc:IL−7)とIL−7刺激PHA予備活性化HD細胞(HDc:IL−7)を示す。 図2において、図2a〜図2eは、VPのCD4T細胞からのIL−7R鎖が、IL−7に影響を受けない界面活性剤不溶性マイクロドメイン(detergent−resistant microdomains、DRM)に包埋されることを示す。精製CD4Tリンパ球は溶解され(0.5%トリトンX−100)、200μlの溶解物が5〜40%のショ糖勾配に負荷された。4℃で16時間の遠心分離(50krpm)後、18画分が収集された(左1番=管上部=5%ショ糖、右18番=管下部=40%ショ糖)。各画分はSDS−PAGE(7%アクリルアミド−ビス)において解析された。免疫ブロットによって、フロチリン、IL−7Rα及びγcが検出された(参考文献(10))。図2aにおいて、フロチリンは、DRMに相当する低密度フラクションとラフト外の高密度のフラクションとを示すためにマーカとして用いられた。図2bのIL−7Rαと図2cのγcとのバンドは、HDの非刺激精製CD4T細胞(HDc:NS)、IL−7刺激HD細胞(HDc:IL−7)、非刺激VP細胞(VPc:NS)、及びPHA活性化HD細胞(HDc:PHA)について示す。 図3において、図3a〜図3cは、IL−7R機能がVPのCD4T細胞の膜マイクロドメインにおいて改変されるということを示す。図3aにおいて、IL−7Rαについての2次元の実効拡散速度Deffが図7において展開されるように測定された。また拡散速度は、COase(31μM、30分)及びSMase(2.7μM、5分)(CO/SM)、Col(10μM、30分)及びCytD(20μM、30分)(CytD/Col)である種々の薬剤の添加後、又はこれらすべての阻害剤(all)の存在下において、測定された。HD(HDc)及びVP(VPc)からのCD4T細胞が調査され、HDのPHA活性化CD4T細胞(HDc:PHA)も調査された。棒は5回の個別の実験からの平均値の標準誤差を示す。さらなる実験データは図8に提示される。図3bにおいて、STAT5のIL−7誘導リン酸化と核移行は、ヤギ抗ウサギAtto642で標識されたウサギのリン酸化STAT5を用いて観察され、パルスSTED顕微鏡によって解析された(0.5μmのスライス)。実験は、HDの精製非刺激CD4T細胞(HDc:NS)、HDのIL−7刺激CD4T細胞(HDc:IL−7)、VPの非刺激CD4T細胞(VPc:NS)、VPのIL−7刺激CD4T細胞(VPc:IL−7)、HDのPHA活性化CD4T細胞(HDc:PHA)、及びIL−7で刺激されたHDのPHA活性化CD4T細胞(HDc:PHA/IL−7)に関する。コルヒチン及びサイトカラシンDの作用が右側のパネルに示される。図3c、図3d、図3eにおいて、IL−7刺激後、細胞質におけるリン酸化STAT5出現と核におけるリン酸化STAT5蓄積との動態が、ImageJソフトウエアを用いて測定された。図3cは、HDのCD4T細胞(黒色線)と、Col及びCytDで処理されたHDのCD4T細胞(灰色線)とを示す。図3dはVPのCD4T細胞を示し、図3eはHDのPHA活性化CD4T細胞を示す。 図4において、図4a〜図4dは、VPからの血漿が、MMD数により測定されるように、HDのCD4T細胞における異常な活性化パターンを誘導することを示す。図4aでは、VP(HDc:VPp)、HIC(HIV−controllers、HIVコントローラ)(HDc:HICp)、又はART(antiretroviral−treated、抗レトロウイルス処置)患者(HDc:ARTp)からの血漿(10%)で処理されたHDのCD4T細胞の代表的イメージが示される。MMDはコレラ毒素(CtxB−AF488)で染色された。各群について、IL−7刺激(2nM、15分)の前(左)と後(右)とにおけるZ軸スタックイメージから、代表的CD4T細胞の上位半分が示される。図4bでは、異なる5人のVP(VPp1〜VPp5)からの血漿(10%)によりCD4T細胞(HDc)の表面に誘導されたMMDが示される。結果は、IL−7刺激の前(白色)と後(灰色)とにおける50細胞の解析から取得された。平均値と四分位数が示される。図4cにおいて、IL−7刺激の後(灰色)と前(白色)とにおける、HD(HDp)、VP(VPp)、HIC(HICp)、及びART患者(ARTp)からの血漿の作用が比較される。図4dにおいて、図4cに記載される血漿から取得された用量(0.01%〜10%)反応が示される。HDcCD4T細胞の表面に誘導されたMMD数が示される。VPの血漿の作用は実線(VP1p)として提示される。 図5において、図5a〜図5dは、VPからの血漿が、HDのCD4Tリンパ球においてIL−7誘導STAT5リン酸化とリン酸化STAT5の核移行とを阻害することを示す。図5aにおいて、IL−7刺激前に、HDの精製CD4T細胞は血漿(10%)で予備インキュベートされた。IL−7誘導リン酸化とリン酸化STAT5の核移行とは、パルスSTED顕微鏡によって観察された(0.5μmのスライス)。対照(HDc:NS)、VP(HDc:VPp)、HIC(HDc:HICp)、及びART患者(HDc:ARTp)の血漿(10%)が調査された。図5bは、異なる5人のVPからの血漿(10%)で予備処理されたHDのIL−7刺激CD4T細胞の細胞質(白色)と核(灰色)において回収されたリン酸化STAT5の解析を示す。図5cは、HDのIL−7刺激CD4T細胞における血漿(10%)予備インキュベートの作用の比較を示す。血漿は、HD(HDp)、VP(VPp)、HIC(HICp)、及びART患者(ARTp)からのものである。図5dは、血漿により取得され、HDのIL−7刺激CD4T細胞におけるリン酸化STAT5核移行の阻害により測定される、用量(0.01%〜10%)反応を示す。HDcCD4T細胞の表面に誘導されたMMD数が示される。VPの血漿の作用は実線(VP1p)として提示される。 図6において、図6a〜図6dは、VPの血漿から回収された不応状態誘導因子(Refractory state Inducing Factor、RIF)の分子特徴を示す。図6aは、トリプシン、DNase、RNase、及びPNGaseによるVP血漿の処理を示す。RIF活性は、HDのCD4T細胞におけるMMD数とIL−7誘導核リン酸化STAT5における作用とを測定することによって観察された。図6bにおいて、セファデックスG100カラムにおけるゲル濾過によってRIFの分子量が測定された。HDのCD4T細胞におけるRIF活性は、カラムの種々の画分によって誘導されたMMD数を測定(太線)することによって観察された。また、ウイルス性タンパク質の存在について、各画分はVP血漿からのポリクローナル抗体を用いたドットブロットによってテストされた。HD血漿から取得されたバックグラウンドは減算された。実験は3回繰り返された。図6cにおいて、RIFの分子量はまた、セファデックスG100カラムにおけるゲル濾過後に測定され、IL−7誘導リン酸化STAT5の阻害前により観察された活性がFACSによって測定された。最大IL−7誘導リン酸化STAT5のパーセンテージが記録された。各画分におけるタンパク質量も報告された。実験は2回繰り返された。図6dにおいて、以下のように等電点が測定された。セファデックスG100カラムから溶出されたRIFが陰イオン(モノQ)又は陽イオン(モノS)交換カラムに負荷された。RIF活性はpHステップ緩衝剤によって溶出された。HDのCD4T細胞におけるMMD数がpHに対してプロットされた。 図7において、図7a〜図7cは、HD、VPからの精製CD4T細胞、及びHDのIL−7刺激細胞におけるIL−7シグナロソームの2Dゲル解析を示す。図7aはHDの非刺激(NS)CD4T細胞を示し、図7bはVPのCD4T細胞を示し、図7cはHDのIL−7刺激CD4T細胞を示す。 図8において、図8a〜図8gは、HD、VPからの精製CD4T細胞、及びHDのPHA刺激細胞の表面におけるIL−7Rα拡散速度の解析を示す。図8a及び図8dはHDのCD4T細胞の表面であり、図8b及び図8eはVPのCD4T細胞の表面であり、図8c及び図8fはPHA(1μg/ml)で予備活性化されたHDのCD4T細胞の表面を表す。図8gは、MMD阻害剤又は細胞骨格阻害剤による処理前後の、MMDに包埋されたIL−7Rα拡散機構の概略図である。 図9において、図9a〜図9dは、HDのCD4T細胞におけるRIF活性とIL−7不反応性機構との仮定的モードの概略的表示を示す。RIFは、非機能性の異常MMDを誘導する。故にIL−7シグナロソームは変化され、細胞はVPのCD4T細胞のようにサイトカインに対する不反応性を維持する。HDのRIF誘導CD4T細胞とVPのCD4T細胞における異常な活性化パターンとシグナリング欠損は区別できない。概略図の左部分は、HDにおけるIL−7シグナル伝達機構における異なるステップを示す(参考文献10、12)。図9aでは、静止CD4T細胞において、IL−7認識前に、IL−7R鎖は結合するが、その細胞質内ドメインは離れており、シグナリング分子Jak1及びJak3は相互作用しない。図9bでは、IL−7活性CD4T細胞において、IL−7Rは通常のMMD(直径90nm)において区画化され、シグナロソームは機能的になる。細胞骨格組織化後に、STAT5AとSTAT5BとはIL−7R/Jak1/Jak3複合体と接触してリン酸化され、前述されたように微小管に沿って動作することで核に移動する(参考文献12)。概略図の右側部分は、RIF活性の仮定的機構を示す。提示される活性の機構は、予備データ、及びVPの精製CD4T細胞において特徴づけられた変化とRIF誘導欠損との比較(非公開データ)からもたらされたものである。図9cにおいて、RIFは、数多くの大きい異常MMDを誘導する。IL−7Rは異常MMDに包埋され、機能的シグナロソームを誘導するその能力は変化される。図9dにおいて、HDのRIF処理CD4T細胞はIL−7に対して不反応である。低動態であるが、Jak1及びJak3はSTAT5をリン酸化する。しかし、リン酸化STAT5は細胞骨格と微小管組織がないため核に移動しない。図9a、図9b、図9c、及び図9dのパネルは、CtxB−AF488で標識されたMMDのSTED顕微鏡イメージを示す(CW−STEDからのZスタックの半堆積)。図9bと図9dとのパネルは、ウサギ抗チューブリン/ヤギ抗ウサギAtto642で染色されたチューブリン、マウス抗アクチン/ヤギ抗マウスChr494で染色されたアクチン、及びウサギ抗リン酸化STAT5/ヤギ抗ウサギAtto642で染色されたリン酸化STAT5を示す。パルスSTED顕微鏡は、メタノールで透過処理されたCD4T細胞の0.5μmスライスを示す。IL−7刺激後に、HDのRIF処理CD4Tリンパ球のMMD細胞質領域におけるアクチンは、構造化されたパッドとして集中せず、HDとは異なり、核を包囲する皮層を形成しない。さらに、これらHDのRIF処理CD4T細胞におけるチューブリンは、細胞質と核膜とを橋渡しする重要なロッドであるゆえにSTAT5の核移行に不可欠であると仮定されていた微小管を、VPのCD4T細胞のように、形成しない。欠損の概要について、丸付き番号1、2、3、及び4は、HDのRIF処理T細胞における異常な活性化パターンとIL−7不反応性とに関する種々の欠損ステップを示す。(1)は、2Dゲルによって示されるようなシグナリング複合体の異常なたんぱく質パターンを示す。(2)は、STED顕微鏡によって観察されるような大きいMMD構造などの異常な膜構造を示す。(3)は、拡散動態性とSTED顕微鏡とによって測定される異常な細胞骨格組織化を示す。(4)は、STED顕微鏡によって示されるような異常なシグナリング媒介及びリン酸化STAT5核移行の阻害を示す。 図10では、PLA2sGIBが健康なドナー(HD)のCD4T細胞におけるIL−2誘導PStat5核移行を阻害することが示される。4人の健康なドナーから精製された静止CD4T細胞は、5人のVP(VP63、VP68、VP69、VP74、及びVP75)からと、対照として用いられた3人のHDからとの3%又は1%血漿で、37℃において30分間処理された。言及されたように、これらは、37℃で15分間、2nMのIL−2で刺激された。IL−2刺激前(各項目の左側の点)と後(各項目の右側の点)とに、(a)CD4T細胞全体と(b)CD4+CD25+T細胞とにおいて核PStat5にポジティブである細胞のパーセンテージが、平均と標準偏差とで示される。PStat5の細胞内局在性は、ウサギ抗ヒトPStat5(pY694)に続くロバ抗ウサギIgG−Die light405での非直接的染色後に、レーザ走査共焦点顕微鏡(LSM700、Zeiss社)を用いて観察された。全CD4T細胞は、ヤギ抗ヒトb−チューブリンに続くロバ抗ヤギIgG−AF555で染色された。CD25+CD4T細胞は、マウス抗ヒトCD25に続くロバ抗マウスIgG−AF488で標的化された。 図11では、PLA2sGIBが健康なドナー(HD)のCD4T細胞におけるIL−4誘導PStat6核移行を阻害することが示される。4人の健康なドナーから精製された静止CD4T細胞は、5人のVP(VP63、VP68、VP69、VP74、及びVP75)からと、対照として用いられた3人のHDからとの3%又は1%血漿で、37℃で30分間処理された。言及されたように、これらは37℃で15分間、2nMのIL−4で刺激された。IL−4刺激前(各項目の左側の点)と後(各項目の右側の点)とに、CD4T細胞全体において核PStat6にポジティブである細胞のパーセンテージが、平均と標準偏差とで示される。PStat6の細胞内局在性は、ウサギ抗ヒトPStat6(pY694)に続くヤギ抗ウサギIgG−AF488での非直接的染色後に、レーザ走査共焦点顕微鏡(LSM700、Zeiss社)を用いて観察された。全CD4T細胞は、マウス抗ヒトa−チューブリンに続くヤギ抗マウスIgG−AF647で染色された。 図12は、変異体pPLA2GIB H48Qの不活性性を示す。 図13は、野生型クローン豚PLA2GIBとその変異体H48Qとの活性の比較を示す。Aは、異常な膜マイクロドメイン(aMMD)の誘導、Bはリン酸化STAT5のIL−7誘導核移行(pSTAT5のNT)における作用を示す。 図14は、セファロースビーズとカップリングされたヤギ抗PLA2GIB抗体での、ウイルス血症患者の血漿の処理を示す。緑色はVP68、ピンク色はVP69、青色はVP LJTを示す。処理(室温で30分)後に、血漿はテストされ、 (ア)異常なMMD・細胞を示すCD4T細胞のパーセンテージが、コレラ毒素B(CtxB−AF488)での染色後に測定され、 (イ)pSTAT5の核移行がIL−7刺激後に測定され、ポジティブ核のパーセンテージが計測された。 図15は、aMMD誘導とNTpSTAT5の阻害とにおける抗PLA2GIB抗体の作用を示す。 図16は、可溶性PLA2GIBマウス受容体(sMR)が、健康なドナーからのCD4T細胞のIL−7に対する反応においてヒトPLA2GIB(huPLA2G1B)の活性を阻害することを示し、PStat5の核移行にポジティブである細胞のパーセンテージとして表される。反応の回復は、 100×(%ポジティブ細胞huGIB+sMR−%ポジティブ細胞huGIB)/(%ポジティブ細胞培地−%ポジティブ細胞huGIB) として算出される。 図17において、CD4不反応(CD4−NR)患者の血漿は、HDのCD4T細胞において異常なMMDを誘導することを示し、aは、構造化照明顕微鏡法(Structured Illumination Microscopy、SIM)を用いて取得された、CD4−NR患者の血漿(1%)で処理されたHDのCD4T細胞のイメージを表す。MMDはコレラ毒素B(CtxB−AF488)で染色された。代表的CD4T細胞のZスタックイメージの投影が示される。IL−7刺激(2nM、15分)後に、画像の変化はない(右)。bは、5人のCD4−NR患者(曲線(●)、平均及び標準偏差)からと代表的なウイルス血症患者(曲線(■))からとの血漿で取得された用量反応曲線(0.0001%〜1%)が示される。HDのCD4T細胞表面に誘導された異常なMMDの数が示される。
本発明は、免疫系の調節を必要とする対象の免疫系を調節するための組成物及び方法に関する。本発明は、免疫反応の重要な内因性因子としてのGIBsPLA2の特定を特に開示し、この因子の調節に基づいた新規の治療及び診断の方法と組成物とを提供する。
本発明の仮説は、HIV免疫患者における免疫系の慢性活性が異常であり、99.5%を超える末梢区画からのCD4T細胞が非感染であるという事実にもかかわらず、CD4T細胞を、免疫防御の多くの要素とCD4区画のホメオスタシスとの制御に関わるγ-cサイトカインに不反応となる活性・分化の異常な状態にさせる、ということである。この仮説が本発明者らによって検討され、本発明はこの活性の異常な状態の特性と重要性とを明らかにする。
より具体的には、第1の態様において、この状態の特徴は、1)いずれかの刺激前に、ウイルス血症HIV感染患者(VP)におけるすべてのCD4T細胞がその表面に多くの大きなMMDを保持し、2)これらの異常なMMDがすべての細胞のIL−7Rα及びγ−c鎖を隔離し、3)異常なMMDにおけるこの鎖の隔離が、機能的シグナロソームの形成を誘導する能力を変化させ、4)STAT5リン酸化が低速化且つ低下され、5)リン酸化STAT5核の移行が低下される、というように要約され得るということを本発明は示す。VPのCD4Tリンパ球の表面における既存のMMDのこの異常パターンは、複数の結果があり、HIV感染患者の免疫不全の種々の症状を明らかにする基本的な機構である。IL−7反応性の欠失は、観察されるCD4リンパ球減少を部分的に説明する重要な要因である。アポトーシスへの感受性と低レベルだが連続的なウイルス増殖による破壊とを理由とする、VPにおけるこれらの細胞の継続的な欠失は、IL−7レベルの増加にもかかわらず補われることができない。さらに、異常なMMDは、非機能的状態のすべてのγ−c鎖を隔離するので、このファミリにおけるその他のサイトカインの機能を阻害する。
本発明は、感染対象における免疫系の異常な状態の原因となり、より一般的には種々の病態生理的な条件における免疫反応の大きな変化の原因となる主要な内因性因子の特定をさらに開示する。VPの血漿試料は、健康なドナー(HD)のCD4Tリンパ球の異常な活性化を誘導することができるRIFと称される活性を含むことが実際に示される。RIFは、検査されたVPのすべての血漿試料において見受けられる。この活性の病態生理的重要性は、IL−7/IL−7Rシステムが正常且つ免疫活性が有効であるHIVコントローラ(HIC)患者がこの活性を有しないことによって示された。またRIFは、免疫活性が低下し、IL−7R機能が回復し、及びCD4数が500/mmより多く回復したART患者の血漿においても欠如する(参考文献5)。
つまり、RIFは、特にCD4Tリンパ球の調節を介して、免疫反応を制御する主要な因子を表す。RIFが、VPの精製CD4T細胞においてエクスビボで直接的に観察されたものと区別されないHDのCD4T細胞における活性の異常なパターンを誘導するということは注目すべきである。本発明は、RIFがグループIBからの分泌ホスホリパーゼA2(「PLA2GIB」)であることを示す。本願において開示される結果は、(i)PLA2GIBの過剰発現が強力な免疫不全をもたらすこと、(ii)PLA2GIBの阻害が免疫機能の顕著な増大又は刺激をもたらすことを示す。GIBsPLA2阻害剤は、対象の血漿における免疫細胞の不適切な状態を矯正し、故に哺乳動物における免疫不全又は免疫障害を処置(例えば、予防、矯正)するために用いられることが可能である。また、GIBsPLA2の阻害は、CD4T細胞数と機能とを誘導、促進するか、又はその維持に役立ち、故に患者における効果的な免疫反応の促進に役立つことが可能である。特に、HIV感染患者において、保留されるか又は停止され得るARTは、患者の免疫防御とウイルスとの間で得られる平衡であった。ARTが、近年の研究で提案されたように感染後に非常に早期に与えられ、RIF阻害剤と組み合わせられる場合、免疫系の任意のRIF誘導変化を防止し得る。さらに、ARTにおける現在の一部の不成功を考慮すると、長引くART後の低いCD4数を有する患者は、これらの阻害剤から利益を得られ得る。従って、本発明は、対象におけるGIBsPLA2発現又は活性を調節することによって対象を処置するための方法を提供する。より具体的には、本発明は、免疫反応の調節を必要とする対象における免疫反応を調節するための方法を提供し、該方法は対象におけるGIBsPLA2活性又は発現を調節することを含む。
また、実施例に示されるデータは、対象の血漿におけるRIFの存在がCD4T細胞のHIV誘導発症状態を示すことを提示する。従って、本発明は、なかでも対象の血漿におけるRIFのレベルを検出することによって、対象におけるHIV感染をモニター及び/又は診断する方法を提供する。
さらに、実施例に示されるデータは、対象のT細胞における膜マイクロドメイン(MMD)の数及び/又はサイズが、CD4T細胞のHIV誘導発症状態を示すことを提示する。故に、この開示は、なかでも対象のT細胞における膜マイクロドメイン(MMD)の数及び/又はサイズを測定することによって、対象におけるHIV感染をモニター及び/又は診断する方法をも提供する。
また、実施例に示されるデータは、HIV感染対象におけるCD4T細胞疾患状態の発生及び/又は維持におけるRIFの役割も示す。従って、この開示はまた、薬剤の存在下においてRIF誘導CD4T細胞活性を測定することを含む、候補HIV治療剤を特定するための方法も提供する。一部の実施形態では、該方法は、薬剤の存在下におけるRIF誘導CD4T細胞活性のレベルを、薬剤の非存在下におけるRIF誘導CD4T細胞活性のレベルとの比較を含む。
[定義]
核酸又はタンパク質配列に適用される「配列同一性」という用語は、スミス−ウォーターマンアライメント法(Smith及びWaterman(1981年)、J Mol Biol、147:195−197)、CLUSTALW(Thompson等(1994年)Nucleic Acids Res、22:4673−4680)、又はBLAST2(Altschul等、(1997年)Nucleic Acids Res、25:3389−3402)などの標準化アルゴリズムを用いてアライメントされた少なくとも2つの配列同士の間で一致するヌクレオチド又はアミノ酸残基の定量化(通常はパーセンテージ)に関する。BLAST2は、アライメントを最適化し且つそれらの間のさらに意義深い比較をおこなう目的で、配列のうちの1つに間隙を挿入する、標準化され且つ再現性のある方法で用いられ得る。
本明細書において用いられるように、「処置」又は「処置する」は、処置される個人の自然経過を変化させる取り組みにおける臨床的介入に関し、予防又は治癒目的でおこなわれ得る。処置の望ましい効果は、疾患の発生又は再発生の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接又は非直接的な病的結果の減縮、転移の予防、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び緩解又は予後の改善を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態において、本発明の組成物と方法とは、疾患若しくは障害の発症を遅延させるか、又は疾患若しくは障害の進行を遅らせるために用いられる。
本発明に用いられる「単離」という用語は、その自然環境的成分から除去され、単離又は分離され、少なくとも60%、好ましくは75%、最も好ましくは90%はそれらが自然に関連している他の成分を含まない分子(例として核酸又はアミノ酸)に関する。「単離」ポリペプチド(又はタンパク質)は、例えば、その自然環境の成分から分離され、例として電気泳動(例えばSDS−PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリー電気泳動)又はクロマトグラフィ―(例えばイオン交換若しくは逆相HPLC)移動などによって測定されるときに好ましくは90%又は95%より高い純度に精製されたポリペプチドである。「単離」核酸は、その自然環境の成分から分離されるか、及び/又は異なる構築物(例として、ベクター、発現カセット、組換えホストなど)において構築される核酸分子に関する。
「抗GIBsPLA2抗体をコードする核酸」とは、抗体重鎖及び軽鎖(又はそのフラグメント)をコードする1つ以上の核酸分子に関し、単一のベクター又は個別のベクターのそうした核酸分子や、宿主細胞の1つ以上の位置に存在するそうした核酸分子を含む。
「対象」とは哺乳動物に関する。哺乳動物の例は、ヒト、並びに飼育動物(例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ)、非ヒト霊長動物(サルなど)、ウサギ、及び齧歯動物(例えばマウスやラット)などの限定されない非ヒト動物を含む。
「免疫反応の調節」とは、本発明の文脈内において、免疫細胞、好ましくは白血球(例としてTリンパ球、Bリンパ球、NK、NKT細胞、マクロファージ、樹状細胞)の量又は活性又は比の任意の改変を指す。特定の実施形態において、免疫反応の調節は、Tリンパ球、好ましくはCD4Tリンパ球の量又は活性を調節することを含む。
[不応状態誘導因子(RIF)又はホスホリパーゼA2グループIB]
RIFという用語はホスホリパーゼA2グループIB、GIBsPLA2(又はPLA2GIB)と相互交換可能に用いられる。ホスホリパーゼA2グループIBは、約15kDaの分子量と約6.5〜約8.0の等電点とを有する分泌タンパク質である。
本発明の文脈内において、「GIBsPLA2」又は「ホスホリパーゼA2グループIB」という用語は、示されない限り、霊長動物(例えばヒト)及び齧歯動物(例えばマウスやラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物ソースからの任意のネイティブGIBsPLA2タンパク質を指す。該用語は、「全長」の未処理GIBsPLA2と、細胞の内側又は外側の処理からもたらされるGIBsPLA2の任意の形態とを含む。該用語は、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体などの、GIBsPLA2の自然に発生した変異体も含む。
例示のヒトGIBsPLA2のアミノ酸配列が以下に示される(配列番号2)。
MKLLVLAVLL TVAAADSGIS PRAVWQFRKM IKCVIPGSDP FLEYNNYGCY CGLGGSGTPVDELDKCCQTH DNCYDQAKKL DSCKFLLDNP YTHTYSYSCS GSAITCSSKN KECEAFICNC DRNAAICFSKAPYNKAHKNL DTKKYCQS
配列番号2のアミノ酸1〜15はシグナル配列であり、配列番号2のアミノ酸16〜22はプロペプチド配列である。成熟タンパク質は配列番号2のアミノ酸残基23〜148に相当し、これは例示的な処理ヒトGIBsPLA2タンパク質である。
天然発生変異体は、1つ以上のアミノ酸置換、付加、及び/又は、1若しくは複数(通常1、2、若しくは3)のアミノ酸残基の削除を伴い、好ましくは10以下の異なるアミノ酸置換、付加、及び/又は、1若しくは複数(通常1、2、若しくは3)のアミノ酸残基の削除を伴う、配列番号2の配列、又は配列番号2のアミノ酸残基23〜148の配列を包含する任意のタンパク質を含む。典型として、天然発生変異体は、配列番号2の生物活性を保持する。
これについて、一部の実施形態では、GIBsPLA2は、健康な対象のCD4T細胞における膜マイクロドメイン(MMD)の形成を誘導すること、又は、健康な対象のCD4T細胞を、IL−2シグナリングへの不応若しくはIL−7シグナリングへの不応などインターロイキンシグナリングに不応にさせること、から選択された少なくとも1つの活性を有する。
一部の実施形態では、MMD形成の誘導は、健康な対象のCD4T細胞におけるMMDの数を、細胞毎に少なくとも約80、細胞毎に少なくとも約90、細胞毎に少なくとも約100、細胞毎に少なくとも約110、又は細胞毎に少なくとも約120、に増加させることを含む。非限定的な好ましい実施形態において、MMD形成の誘導は、健康な対象のCD4T細胞におけるMMDの数を、細胞毎に100を超えるMMDへと増加させることを含む。
一部の実施形態では、MMD形成の誘導は、CD4T細胞に存在するものより大きいMMDの形成を促進することを含む。一部の実施形態において、より大きいMMD形成の誘導は、少なくとも100nm、少なくとも直径110nm、少なくとも直径120nm、少なくとも直径130nm、又は少なくとも直径140nmの直径を有するMMDの形成を促進することを含む。非限定的な好ましい実施形態では、より大きいMMD形成の誘導は、120nmより大きい直径を有するMMDの形成を促進することを含む。
一部の実施形態において、健康な対象のCD4T細胞をインターロイキン−7シグナリングに不応にさせることは、前記細胞において、STAT5A及び/又はBリン酸化を、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、又は少なくとも約40%、低減させることを含む。一部の実施形態において、健康な対象のCD4T細胞をインターロイキン−7シグナリングに不応にさせることは、リン酸化STAT5A及び/又はリン酸化STAT5Bの核移行の割合を、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、又は少なくとも約50%、低下させることを含む。
GIBsPLA2活性は、実施例に例示されるか又は後に開発されるような、当該技術分野において既知である任意の適切な方法によって測定されるとよい。GIBsPLA2活性は、例えばリガンド採用アッセイ、免疫アッセイ、及び/又は酵素アッセイを用いて、例えば分画された血漿試料などの血漿試料において測定されるとよい。
特定の実施形態において、GIBsPLA2という用語は、ヒトタンパク質、特に、配列番号2を含むか若しくは配列番号2を有するタンパク質、又はそれらの自然に発生した変異体を指す。
本開示におけるGIBsPLA2は単離、精製、及び/又は組換えされ得る。所定の実施形態において、本発明では、GIBsPLA2タンパク質の代わり又はGIBsPLA2タンパク質に加えて、GIBsPLA2をコードする核酸が用いられるとよい。核酸は、一本鎖又は二本鎖であるDNA又はRNAであるとよい。
GIBsPLA2をコードする例示的核酸配列は、以下の配列番号1において示される。
ATGAAACTCCTTGTGCTAGCTGTGCTGCTCACAGTGGCCGCCGCCGACAGCGGCATCAGC
CCTCGGGCCGTGTGGCAGTTCCGCAAAATGATCAAGTGCGTGATCCCGGGGAGTGACCCC
TTCTTGGAATACAACAACTACGGCTGCTACTGTGGCTTGGGGGGCTCAGGCACCCCCGTG
GATGAACTGGACAAGTGCTGCCAGACACATGACAACTGCTACGACCAGGCCAAGAAGCTG
GACAGCTGTAAATTTCTGCTGGACAACCCGTACACCCACACCTATTCATACTCGTGCTCT
GGCTCGGCAATCACCTGTAGCAGCAAAAACAAAGAGTGTGAGGCCTTCATTTGCAACTGC
GACCGCAACGCTGCCATCTGCTTTTCAAAAGCTCCATATAACAAGGCACACAAGAACCTG
GACACCAAGAAGTATTGTCAGAGTTGA
GIBsPLA2をコードする代替的な核酸分子は、遺伝子コードの縮重からもたらされる配列番号1の任意の変異形と、厳しい条件のもとで配列番号1とハイブリダイズする任意の配列、より好ましくは配列番号1に対する少なくとも80%、85%、90%、95%又はそれより多い配列同一性を有し、GIBsPLA2タンパク質をコードする任意の配列とを含む。
[GIBsPLA2の産生方法]
GIBsPLA2は、従来から知られる任意のタンパク質発現方法及び精製方法により産生されることが可能である。例として、(i)ペプチド合成方法、(ii)生体若しくは培養細胞から精製及び単離する方法、又は(iii)遺伝子組換え技術を用いる生産方法、並びにそれらの組合せなど(例として、分子クローニング((Molecular Cloning)、Sambrook,J.、Fritsch,E.F.、Maniatis,T.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年)や分子生物学における最新プロトコル((Current Protocols in Molecular Biology)Ausubel,F.M.、John Wiley and Sons, Inc.、1989年)に記載されている標準的な技術)が挙げられる。
特定の実施形態において、本発明は、宿主細胞においてコードする核酸を発現し、GIBsPLA2を収集又は精製することによってGIBsPLA2を産生する方法に関する。これに関して、本発明は、GIBsPLA2をコードする核酸を含む組換え宿主細胞も記載する。そうした細胞は、原核性(細菌など)又は真核性(酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、若しくは哺乳動物細胞)であってよい。核酸は、プロモータ、ターミネータ等の任意の適切な調節配列の制御下に置かれるとよい。代替的に、核酸は、発現が内在性プロモータによって駆動される位置において宿主細胞に挿入されるとよい。細胞に核酸を挿入する技術は当該技術において既知である。
[GIBsPLA2調節]
本発明は、GIBsPLA2の調節を必要とする対象におけるGIBsPLA2の調節を含む新規の方法を提供する。「調節」という用語は、対象におけるGIBsPLA2の(例えば発現)レベル又は活性の任意の調節を指す。また、調節は、GIBsPLA2レベル又は活性の増加又は減少を指す。調節は、非調節状態と比較して、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%若しくはそれより多い変化をより好ましくは指す。結果として、GIBsPLA2の阻害とは、GIBsPLA2レベル又は活性を少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%又はそれより多く低減することと、GIBsPLA2レベル又は活性を完全に阻害又は抑制することとを指す。反対に、GIBsPLA2の刺激とは、GIBsPLA2レベル又は活性を少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%若しくはそれより多く増加させることを指す。状況に応じて、調節は一過性、持続性、又は永続的であり得る。また、活性の調節とは、対象、特に体液におけるGIBsPLA2の量を調節すること、(例として対象における補助因子又は基質のレベルを調節することによる)タンパク質の効力の調節、及びGIBsPLA2により産生される分解産生物のレベル又は活性を調節することを含む。
〔GIBsPLA2阻害〕
特定の実施形態において、本発明は、対象においてGIBsPLA2を阻害するための組成物及び方法を提示する。GIBsPLA2の阻害は、GIBsPLA2阻害剤、即ちGIBsPLA2の発現又は活性を阻害する任意の化合物の使用によってなされるとよい。GIBsPLA2阻害剤は、発現阻害剤、拮抗剤、隔離剤(sequestrator)又は標的マスキング化合物を含む。GIBsPLA2阻害剤の好ましいタイプは、GIBsPLA2リガンド(共有又は非共有結合)、抗GIBsPLA2抗体(並びにそのフラグメント及び誘導体)、抗GIBsPLA2抗体をコードする核酸(並びにそのフラグメント及び誘導体)、阻害性核酸、ペプチド、若しくは小分子薬剤、又はその組合せを含む。代替的又は追加的に、GIBsPLA2阻害は、GIBsPLA2抗原に対するワクチンを対象に接種させることでおこなわれ、抗体がPLA2−GIB阻害を必要とする対象により産生されることができる。
〔GIBsPLA2に対する抗体〕
GIBsPLA2阻害剤の具体的な例は、GIBsPLA2に特異的に結合する抗体である。
抗体は、合成、モノクローナル、又はポリクローナルであり得り、当該分野において既知の技術で作製されることができる。そのような抗体は、(非特異的結合と異なり)抗体の抗原結合部位を介して特異的に結合する。GIBsPLA2ポリペプチド、フラグメント、変異体、融合タンパク質等は、それらに免疫反応的である抗体の産生に免疫原として用いられることができる。より具体的には、ポリペプチド、フラグメント、変異体、融合タンパク質等は、抗体の形成を誘発する抗原決定基又はエピトープを含む。
これらの抗原決定基又はエピトープは線状又は立体構造状(不連続状)のいずれかであり得る。線状エピトープはポリペプチドのアミノ酸の単一の部分からなる一方で、立体構造状又は不連続状エピトープは、タンパク質の折りたたみによって接近されるポリペプチド鎖の種々の領域からのアミノ酸部分からなる(C.A.Janeway,Jr.及びP.Travers、免疫生物学(Immuno Biology)3:9(Garland Publishing Inc.、2nd ed.、1996年)。折りたたまれたタンパク質は複雑な表面を有するので、利用可能なエピトープの数は相当多い。しかしながら、タンパク質の立体構造と立体障害とのため、実際にエピトープと結合する抗体の数は、利用可能なエピトープの数より少ない(C.A.Janeway,Jr.及びP.Travers、免疫生物学(Immuno Biology)2:14(Garland Publishing Inc.、2nd ed.、1996年)。エピトープは当該技術分野において既知の方法のいずれでも特定可能である。ポリクローナルとモノクローナルの両抗体は従来の技術によって調製可能である。
本発明の好ましい抗体は、GIBsPLA2エピトープを標的とし、及び/又は、成熟GIBsPLA2タンパク質と、配列番号2の少なくとも8つの連続的アミノ酸残基(又は配列番号2の自然変異体の対応する残基)を含むGIBsPLA2のフラグメントとから選択されるGIBsPLA2エピトープを含むポリぺプチドで免疫化することで生成され、前記フラグメントは、少なくともアミノ酸70、アミノ酸121、アミノ酸50、アミノ酸52、アミノ酸54、アミノ酸71、又はそれらの組合せを含む。本発明の好ましい抗体は、配列番号2のアミノ酸残基50〜71の間か、又は配列番号2の自然変異体の対応する残基の間に含まれるエピトープに結合する。
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、そのフラグメント(F(ab’)2及びFabフラグメント、一本鎖可変フラグメント(scFvs)、単一ドメイン抗体フラグメント(VHH又はナノボディ)、2価抗体フラグメント(ダイアボディ))、並びに組換え的及び合成的に産生された任意の結合パートナー、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含むことを意味する。
抗体は、好ましくは約10−1以上のKaでGIBsPLA2と結合する場合に、特異的に結合すると定義される。抗体の親和性は、例えばScatchard等(Ann.N.Y.Acad.Sci.、51:660(1949年))によって記載されるものなどの従来の技術を用いて容易に測定されることができる。
ポリクローナル抗体は、例えばウマ、ウシ、ロバ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、又はラットなどの種々のソースから、当該技術分野において既知である手法を用いて容易に生成可能である。通常、精製GIBsPLA2、又は適切に複合化されるGIBsPLA2のアミノ酸配列に基づくペプチドは、典型として非経口注入により宿主動物に投与される。GIBsPLA2の免疫原性は、例えばフロイント完全又は不完全アジュバントであるアジュバントの使用により向上可能である。追加免疫に続き、血清の小試料がGIBsPLA2ポリペプチドに対する反応性のため収集及びテストされる。そうした測定に有用である種々のアッセイの例は、抗体:研究室マニュアル(Antibodies:A Laboratory Manual、Harlow及びLane(eds.)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988年)に記載されるものや、向流免疫電気泳動法(CIEP)、放射免疫アッセイ、放射免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ドットブロットアッセイ、サンドイッチアッセイなどの手法を含む。米国特許第4,376,110号及び4,486,530号が参照される。
モノクローナル抗体は、既知の手法を用いて容易に調製可能である。例として、米国特許第RE32,011号、4,902,614号、4,543,439号、及び4,411,993号や、モノクローナル抗体、ハイブリドーマ:生物学的分析の新しい次元(Monoclonal antibodies、Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses、Plenum Press、Kennett、McKeam、及びBechtol(eds.)1980年)に記載の手法が参照される。
例として、マウスなどの宿主動物は、単離及び精製された野生型若しくは変異型GIBsPLA2タンパク質又は複合GIBsPLA2ペプチドを、少なくとも1回、好ましくは約3週の間隔で少なくとも2回、腹腔内に、任意的にアジュバントの存在下で、注射されることが可能である。そして、マウスの血清は、どの動物が融合に適するかを決定するために、従来のドットブロット技術又は抗体キャプチャ(ABC)によって分析される。約2〜3週後に、マウスにはタンパク質又はペプチドの静脈内追加がおこなわれる。マウスは後に犠牲となり、定められた手順後に脾臓細胞がAg8.653(ATCC)などの市販で入手可能な骨髄腫細胞と融合される。短時間で、骨髄腫細胞は、培地内で数回洗浄され、1つの骨髄腫細胞に対して約3つの脾臓細胞の割合でマウス脾臓細胞と融合される。融合剤は、例えばポリエチレングリコール(PEG)などの当該技術分野において用いられる任意の適切な薬剤であり得る。融合物は、融合細胞の選択的成長を可能にする培地を含むプレートに配置される。そして、融合細胞は約8日間成長させられる。結果としてのハイブリドーマからの上清が収集されて、ヤギ抗マウスIgでまず被覆されたプレートに添加される。洗浄の後、標識されたGIBsPLA2ポリペプチドなど、標識が各ウェルに添加され、その後インキュベーションされる。続いて陽性ウェルが検出される。バルク培地において陽性クローンが成長可能であり、続いて上清がタンパク質Aカラム(Pharmacia社)で精製される。
開示のモノクローナル抗体は、Alting−Mees等(「モノクローナル抗体発現ライブラリ:ハイブリドーマの高速な代替物(Monoclonal Antibody Expression Libraries:A Rapid Alternative to Hybridomas)」、Strategies in Molecular Biology 3:1−9(1990年))によって記載されるものなどの代替的技術を用いて産生でき、該文献は参照により本願明細書に組み込まれる。同様に、結合パートナーは、特定の結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み込むために、組換えDNA技術を用いて構築可能である。こうした技術は、Larrick等のバイオテクノロジー(Biotechnology)7:394(1989年)に記載される。
また、従来技術によって産生可能なそのような抗体の抗原結合フラグメントも本発明に包含される。そうしたフラグメントの例は、Fab及びF(ab‘)2フラグメントを含むがこれらに限定されない。遺伝子工学技術によって産生される抗体フラグメント及び誘導体も提示される。
本開示のモノクローナル抗体は、例えばヒト化型のマウスモノクローナル抗体であるキメラ抗体を含む。そうしたヒト化抗体は、既知の技術により調製可能であり、抗体がヒトに投与されるときに免疫原性を低下するという有利性がある。一実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体の可変領域(又は単にその抗原結合部位)と、ヒト抗体由来の定常領域とを含む。代替的に、ヒト化抗体フラグメントは、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位とヒト抗体由来の(抗原結合部位のない)可変領域フラグメントとを含むことが可能である。キメラ及びさらに操作されたモノクローナル抗体の産生の手法は、Riechmann等(Nature 332:323、1988年)、Liu等(PNAS 84:3439、1987年)、Larrick等(Bio/Technology 7:934、1989年)、並びにWinter及びHarris(TIPS 14:139、1993年5月)に記載されるものを含む。遺伝子導入で抗体を生成するための手法は、英国特許第2,272,440号、米国特許第5,569,825号及び米国特許第5,545,806号に見受けられる。
標準的な組換えDNA技術を用いて作製され得る、ヒト部分と非ヒト部分との両方を含むキメラ及びヒト化モノクローナル抗体など、遺伝子操作法によって産生される抗体が使用可能である。そうしたキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、例として、Robinson等、国際公開第87/02671号;Akira等、欧州特許出願第0184187号;Taniguchi,M.、欧州特許出願第0171496号;Morrison等、欧州特許出願第0173494号;Neuberger等、国際公開第86/01533号、Cabilly等、米国特許第4,816,567号;Cabilly等、欧州特許出願第0125023号;Better等、Science 240:1041 1043、1988年;Liu等、PNAS 84:3439 3443、1987年;Liu等、J.Immunol. 139:3521 3526、1987年;Sun等、PNAS 84:214 218、1987年;Nishimura等、Canc.Res. 47:999 1005、1987年;Wood等、Nature 314:446 449、1985年;Shaw等、J.Natl. Cancer Inst. 80:1553 1559、1988年;Morrison,S.L.、Science 229:1202 1207、1985年;Oi等、BioTechniques 4:214、1986年;Winter、米国特許第5,225,539;Jones等、Nature 321:552 525、1986年;Verhoeyan等、Science 239:1534、1988年;及びBeidler等、J.Immunol. 141:4053 4060、1988年に記載される方法など、当該技術分野において既知である標準的なDNA技術を用いる遺伝子操作によって産生可能である。
合成及び準合成抗体について、そのような用語は、抗体フラグメント、アイソタイプスイッチ抗体、ヒト化抗体(例えばマウス−ヒト、ヒト−マウス)、ハイブリッド、複数の特異性を備えた抗体、及び完全に合成の抗体様分子を含むことが意図されるが、これらに限定されない。
治療的適用では、抗体に対する患者の免疫反応を最小限化するために、ヒト定常領域及び可変領域を有する「ヒト」モノクローナル抗体が多くは好まれる。そうした抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む遺伝子導入動物を免疫化することで作製可能である。Jakobovits等、Ann NY Acad Sci 764:525−535(1995年)が参照される。
GIBsPLA2ポリペプチドに対するヒトモノクローナル抗体は、対象のリンパ球由来のmRNAから調製された免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のcDNAを用いて、Fabファージディスプレイライブラリ又はscFvファージディスプレイライブラリなどのコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリを構築することでも調製され得る。例としてMcCafferty等、国際公開第92/01047号;Marks等、(1991年)J.Mol.Biol.222:581 597;及びGriffths等、(1993年)EMBO J 12:725 734が参照される。さらに、抗体の可変領域のコンビナトリアルライブラリは、既知のヒト抗体を変異することで作製可能である。例として、GIBsPLA2を結合することで既知のヒト抗体の可変領域は、GIBsPLA2に結合するためにスクリーニングされ得る変異可変領域のライブラリを作製するために、例えば無作為に変化させた変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、変異可能である。免疫グロブリン重鎖及び/又は軽鎖のCDR領域内に無作為の変異誘発を誘導する方法、ペアリングを形成するために無作為化された重鎖及び軽鎖を交差する方法、及びスクリーニング方法は、例として、Barbas等、国際公開第96/07754号;Barbas等、(1992年)Proc. Nat’l Acad. Sci.米国 89:4457 4461に見受けられる。
免疫グロブリンライブラリは、抗体ディスプレイライブラリを形成するため、好ましくは繊維状ファージ由来の、ディスプレイパッケージの個体群によって発現可能である。抗体ディスプレイライブラリの作製の使用に特に適する方法と試薬との例は、Ladner等、米国特許第5,223,409号;Kang等、国際公開第92/18619号;Dower等、国際公開第91/17271号;Winter等、国際公開第92/20791号;Markland等、国際公開第92/15679号;Breitling等、国際公開第93/01288号;McCafferty等、国際公開第92/01047号;Garrard等、国際公開第92/09690号;Ladner等、国際公開第90/02809号;Fuchs等、(1991年)Bio/Technology 9:1370 1372;Hay等、(1992年)Hum Antibod Hybridomas 3:81 85;Huse等、(1989年)Science 246:1275 1281;Griffths等、(1993年)supra;Hawkins等、(1992年)J Mol Biol 226:889 896;Clackson等、(1991年)Nature 352:624 628;Gram等、(1992年)PNAS 89:3576 3580;Garrad等、(1991年)Bio/Technology 9:1373 1377;Hoogenboom等、(1991年)Nuc Acid Res 19:4133 4137;及びBarbas等、(1991年)PNAS 88:7978 7982に見受けられる。ディスプレイパッケージ(例として繊維状ファージ)の表面にディスプレイされると、抗体ライブラリは、GIBsPLA2ポリペプチドを結合する抗体を発現するパッケージを特定及び単離するためにスクリーニングされる。好ましい実施形態において、ライブラリの1次スクリーニングは、固定化GIBsPLA2ポリペプチドでパンニングすることに関連し、固定化GIBsPLA2ポリペプチドに結合する抗体を発現するディスプレイパッケージが選択される。
特定の実施形態において、本発明は、抗GIBsPLA2抗体(又はそのフラグメント若しくは誘導体)と薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物に関する。
現存する抗ホスホリパーゼA2−GIBモノクローナル抗体は、Mab CH−7(Labom)、MAB5018(Labom)、EPR5186(Genetex社)、LS−C138332(Lifespan社)、又はCABT−17153MH(creative biomart社)を含む。ポリクローナル抗体の例は、例えばGeneTex社のN1C3を含む。上述のように、本発明の好ましい抗GIBsPLA2抗体は、成熟GIBsPLA2に結合し、さらにより好ましくは、アミノ酸70、アミノ酸121、アミノ酸50、アミノ酸52、アミノ酸54、アミノ酸71、又はそれらの組合せから選択されるアミノ酸を含むGIBsPLA2ドメインに含まれるエピトープに結合する。本発明の好ましい抗体は、配列番号2のアミノ酸残基50〜71の間か、又は配列番号2の自然変異体の対応する残基の間に含まれるエピトープに結合する。
代替的な実施形態において、本発明は、抗GIBsPLA2抗体(又はそのフラグメント若しくは誘導体)をコードする核酸と薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物に関し、該組成物を使用する。
(阻害性核酸)
代替的実施形態において、GIBsPLA2阻害剤は阻害性核酸、即ちGIBsPLA2遺伝子又はタンパク質発現を阻害する任意の核酸分子である。好ましい阻害性核酸は、アンチセンス核酸、短鎖干渉RNA(short interfering RNA、siRNA)、小ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA、アプタマー、又はリボザイムを含む。特定の実施形態において、阻害性核酸は、GIBsPLA2mRNAの翻訳を抑止する低分子干渉RNA(small interfering RNA)である。他の特定の実施形態では、阻害性核酸は、GIBsPLA2mRNAの翻訳を抑止するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の特定の実施形態では、阻害性核酸は、GIBsPLA2mRNAの翻訳を抑止する小ヘアピンRNAである。
siRNAは、関心のポリヌクレオチドのセンス核酸配列とアンチセンス核酸配列とを含む。siRNAは、単一の転写(二本鎖RNA)が標的遺伝子からのセンス配列と相補的アンチセンス配列との両方を有するように構成される。siRNAのヌクレオチド配列は、例えばインターネット上のAmbionウェブサイトにおいて利用可能なsiRNA設計コンピュータプログラムを用いて設計されるとよい。
一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はsiRNAの長さは、10ヌクレオチド以下である。一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びsiRNAの長さは、自然に発生した転写と同様の長さである。一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びsiRNAは、18〜30のヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びsiRNAは、25ヌクレオチド未満の長さである。
好ましい阻害性核酸分子は、GIBsPLA2遺伝子又はRNAの領域と完全に相補するヌクレオチド配列を有するドメインを含む。そうしたドメインは4〜20のヌクレオチドを通常含み、特異的なハイブリダイゼーション及び遺伝子転写又はRNA翻訳の最適な阻害を可能にする。阻害性核酸の配列は、配列番号1など、GIBsPLA2をコードする遺伝子の配列に直接的に由来するとよい。代替的又は追加的に、阻害性核酸は、プロモータ、スプライス部位などの、GIBsPLA2遺伝子又はRNAの調節エレメントにハイブリダイズし、その有効な調節を抑止するとよい。
本発明の阻害性核酸分子の具体的な例は、配列番号1の10〜50の連続したヌクレオチドからなる単離一本鎖核酸分子を含む。本発明の阻害性核酸分子の具体的な例は、以下のヌクレオチド配列又はその完全に相補的な鎖からなるアンチセンス核酸である。
ATGAAACTCCTTGTGCTAG(配列番号:3)
ACAGCGGCATCAGC(配列番号:4)
TTCCGCAAAATGATCAA(配列番号:5)
CCCGGGGAGTGACCCC(配列番号:6)
TACGGCTGCTACTGTGGCTT(配列番号:7)
GACACATGACAACTGCTACGACC(配列番号:8)
ACCCACACCTATTCATACTCGT(配列番号:9)
ATCACCTGTAGCAGCA(配列番号:10)
AGCTCCATATAACAAGGCA(配列番号:11)
CAAGAAGTATTGTCAGAG(配列番号:12)
(ペプチドと小分子薬剤)
代替的な実施形態において、GIBsPLA2阻害剤は、GIBsPLA2活性を阻害するペプチド又は小分子薬剤である。ペプチド又は小分子薬剤は、通常、GIBsPLA2、又はGIBsPLA2の基質、又はGIBsPLA2の補助因子、又はGIBsPLA2経路の分解物若しくは代謝物に選択的に結合する分子である。
ペプチドは、3〜20のアミノ酸残基を好ましくは含み、それらの配列はGIBsPLA2のドメイン(ベイトペプチド)又はGIBsPLA2基質、補助因子、分解物若しくは代謝物のドメインと同一であるとよい。本発明の好ましいペプチドは、配列番号2の4〜30の連続したアミノ酸残基(又は配列番号2の自然変異体の対応する配列)を含む。本発明の最も好ましいペプチドは、配列番号2の5〜25の連続したアミノ酸残基(又は配列番号2の自然変異体の対応する配列)を含み、配列番号2のアミノ酸残基(又は配列番号2の自然変異体の対応する配列)である、アミノ酸70、アミノ酸121、アミノ酸50、アミノ酸52、アミノ酸54、アミノ酸71、又はそれらの組合せ、のうちの少なくとも1つをさらに含む。本発明のペプチドの具体的にな例は、以下の配列のいずれか1つを含む、25未満のアミノ酸のペプチドである。
NNYGCY(配列番号:13)
CYCGLG(配列番号:14)
YNNYGCYCGLGGSG(配列番号:15)
FLEYNNYGCYCGLGGSGTPV(配列番号:16)
QTHDN(配列番号:17)
CQTHDNC(配列番号:18)
ECEAFICNC(配列番号:19)
DRNAAI(配列番号:20)
DRNAAICFSKAPYNKAHKNL(配列番号:21)
本発明のペプチドは、ペプチド、非ペプチド、及び修飾ペプチド結合を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、メチレン(−CH−)若しくはホスフェート(−PO−)基、二級アミン(−NH−)若しくは酸素(−O−)の挿入、α−アザペプチド、α−アルキルペプチド、N−アルキルペプチド、ホスホンアミデート、デプシペプチド、ヒドロキシメチレン、ヒドロキシエチレン、ジヒドロキシエチレン、ヒドロキシエチルアミン、レトロ-インベルソペプチド、メチレンオキシ、セトメチレン、エステル、ホスフィナート、ホスフィニック、又はホスホンアミドから選択された少なくとも1つのペプチド模倣結合を含む。また、ペプチドは、例えばアシル化、及び/又はアミド化、及び/又はエステル化によって、保護N末端及び/又はC末端機能を含み得る。
本発明のペプチドは、化学、生物学、及び/又は遺伝子合成など、当該技術分野においてそれ自体既知である技術によって産生されるとよい。
単離された形態のこれらのペプチドのそれぞれは、本発明の特定の目的に相当する。
好ましい小分子薬剤は、GIBsPLA2に選択的に結合する炭化水素化合物である。
小分子薬剤とペプチドとは、(i)テスト化合物をGIBsPLA2又はそのフラグメントと接触させるステップと、(ii)GIBsPLA2又はそのフラグメントに結合するテスト化合物を選択するステップと、(iii)GIBsPLA2の活性を阻害する(ii)の化合物を選択するステップとを含む方法によって、好ましくは取得可能である。そうした方法は本発明の特定の目的に相当する。
また、小分子薬剤とペプチドとは、(i)テスト化合物をGIBsPLA2基質、補助因子、若しくは分解物、又はそのフラグメントと接触させるステップと、(ii)前述のGIBsPLA2基質、補助因子、若しくは分解物、又はそのフラグメントに結合するテスト化合物を選択するステップと、(iii)GIBsPLA2の活性を阻害する(ii)の化合物を選択するステップとを含む方法によっても取得可能である。そうした方法は本発明の特定の目的に相当する。
(GIBsPLA2可溶性受容体)
代替的な実施形態において、GIBsPLA2阻害剤はGIBsPLA2受容体の可溶性形態である。そうした可溶性受容体化合物はGIBsPLA2に結合可能であり、故に、ベイト又はマスキング剤として作用することによってその活性を阻害する。
そのような阻害剤の具体的な実施形態は、ヒト若しくはマウスGIBsPLA2受容体又はそれらのGIBsPLA2結合フラグメントの可溶性形態である。
マウスとヒトとの可溶性受容体のアミノ酸配列は、配列番号22と配列番号23とにおいてそれぞれ示される。可溶性受容体という用語は、配列番号22又は配列番号23の配列のすべて又はフラグメントを含む、任意のGIBsPLA2結合ポリペプチドを包含する。
GIBsPLA2結合フラグメントは、好ましくは、PLA2GIBに特異的に結合する少なくとも5つの連続したアミノ酸残基、さらに好ましくは、PLA2GIBに特異的に結合する少なくとも8、10、又は12の連続したアミノ酸残基を含むそうしたポリペプチドの任意のフラグメントを指す。受容体分子の特異的結合は、受容体分子が、PLA2−IIA又はIIDよりも高い親和性(例えば少なくとも5倍)でPLA2GIBに結合するということを示す。上述で規定されたようなフラグメントは、最も好ましくは、50未満のアミノ酸残基を含む。
GIBsPLA2結合ポリペプチドの例は、以下のアミノ酸配列のうちの少なくとも1つを含むポリペプチドであるが、これは非限定的である。
LSLYECDSTLVSLRWRCNRKMITGPLQYSVQVAHDNTVVASRKYIHKW(配列番号:24)
WEKDLNSHICYQFNLLS(配列番号:25)
DCESTLPYICKKYLNHIDHEIVEK(配列番号:26)
QYKVQVKSDNTVVARKQIHRWIAYTSSGGDICE(配列番号:27)
LSYLNWSQEITPGPFVEHHCGTLEVVSA(配列番号:28)
SRFEQAFITSLISSVAEKDSYFW(配列番号:29)
WICRIPRDVRPKFPDWYQYDAPWLFYQNA(配列番号:30)
AFHQAFLTVLLSRLGHTHWIGLSTTDNGQT(配列番号:31)
配列番号24〜26はヒト可溶性PLA2GIB受容体の配列に由来する一方で、配列番号27〜31はマウス可溶性PLA2GIB受容体の配列に由来する。
(ワクチン接種)
代替的(又は追加的)実施形態において、対象におけるGIBsPLA2の阻害は、対象にGIBsPLA2抗原でワクチン接種(又は免疫化)することで得られる。そうしたワクチン接種又は免疫化の結果として、対象はGIBsPLA2を阻害する抗体(又は細胞)を産生する。特に、GIBsPLA2抗原(例えば実質的に生物活性のない免疫原性GIBsPLA2)の注射により、処置される対象に抗体が作製されることができる。これらの抗体はGIBsPLA2発現過剰に対して防御し、免疫治療又はワクチン予防と共に用いられることができる。
このように、本発明の目的は、対象にGIBsPLA2抗原を投与することを含む対象にワクチン接種する方法にある。
本発明のさらなる目的は、ワクチン接種を必要とする対象のワクチン接種に使用するためのGIBsPLA2抗原に関する。
特定の実施形態では、ワクチン接種に用いられるGIBsPLA2抗原は、対象においてGIBsPLA2に対する免疫反応を誘導する不活性化免疫原性分子である。不活性化は、例えばGIBsPLA2を化学的若しくは物理的に改変するか、又はタンパク質を変異若しくは切断するか、又はその両方によって得られ得り、免疫原性は、不活性化によりもたらされるか、及び/又は、タンパク質をKLH、HSA、ポリリジン、又はウイルスアナトキシン等の適切な担体若しくはハプテンとさらに結合するか、及び/又は重合化などによって得られ得る。抗原は、例えばその免疫原性を向上するために、化学的又は物理的に修飾されるとよい。
好ましい実施形態において、本発明のGIBsPLA2抗原は、GIBsPLA2又はそのエピトープ含有フラグメント又はミモトープを含む。
特定の実施形態において、GIBsPLA2抗原は完全長GIBsPLA2タンパク質を含む。さらなる特定の実施形態において、GIBsPLA2抗原は、配列番号2、又は配列番号2と少なくとも90%の同一性を有する配列をを含むタンパク質を包含する。
代替的な実施形態において、GIBsPLA2抗原は、少なくとも6つの連続したアミノ酸残基を含み、免疫原性エピトープ又はそのミモトープを含有するGIBsPLA2を含む。好ましい実施形態において、GIBsPLA2抗原は少なくとも6〜20のアミノ酸残基を含む。本発明の好ましいペプチドは、配列番号2の4〜30の連続したアミノ酸残基(又は配列番号2の自然変異体の対応する配列)を含む。本発明の最も好ましいペプチドは、配列番号2の5〜25の連続したアミノ酸残基(又は配列番号2の自然変異体の対応する配列)を含み、配列番号2のアミノ酸残基(又は配列番号2の自然変異体の対応する配列)であるアミノ酸70、アミノ酸121、アミノ酸50、アミノ酸52、アミノ酸54、アミノ酸71、又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つをさらに含む。本発明のペプチドの具体例は、下記の配列のいずれか1つを含む、50未満のアミノ酸のペプチドである。
NNYGCY(配列番号:13)
CYCGLG(配列番号:14)
YNNYGCYCGLGGSG(配列番号:15)
FLEYNNYGCYCGLGGSGTPV(配列番号:16)
QTHDN(配列番号:17)
CQTHDNC(配列番号:18)
ECEAFICNC(配列番号:19)
DRNAAI(配列番号:20)
DRNAAICFSKAPYNKAHKNL(配列番号:21)
GIBsPLA2抗原は、遊離形態である、重合化される、化学的若しくは物理的に修飾されるか、及び/又は担体分子とカップリング(即ち連結)されるなど、種々の形態であってよい。担体とのカップリングは免疫原性を増大し、(さらに、)GIBsPLA2ポリペプチドの生物活性を抑制し得る。これについて、担体分子は、免疫学において従来より用いられる任意の担体分子又はタンパク質であってよく、例としてKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン(BSA)、ウイルス若しくは細菌アナトキシン(破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドB、コレラ毒素など)、それらの突然変異体(ジフテリアトキシンCRM197など)、外膜小胞タンパク質、ポリリジン分子、又はウイルス様粒子(VLP)などが挙げられる。好ましい実施形態において、担体はKLH又はCRM197又はVLPである。
GIBsPLA2の担体へのカップリングは、例えばグルタルアルデヒド、ビオチンなど連結化学基又は反応を用いて共有結合化学によっておこなわれるとよい。好ましくは、複合体又はGIBsPLA2タンパク質又はフラグメント又はミモトープは、GIBsPLA2の不活性化を完全にする目的で、ホルムアルデヒドで処理される。
特定の実施形態において、GIBsPLA2抗原は、任意的に担体タンパク質とカップリングされた完全長GIBsPLA2タンパク質を含む。好ましい実施形態において、GIBsPLA2抗原は、担体タンパク質とカップリングされた、配列番号2、又は配列番号2と少なくとも90%の同一性を有する配列を含むタンパク質を包含する。
他の特定の実施形態において、GIBsPLA2抗原は、任意的に担体タンパク質とカップリングされた、GIBsPLA2の免疫原性ペプチド又はミモトープを含む。さらに好ましい実施形態において、GIBsPLA2抗原は、配列番号2のアミノ酸残基(又は配列番号2の自然変異体の対応する配列)であるアミノ酸70、アミノ酸121、アミノ酸50、アミノ酸52、アミノ酸54、アミノ酸71、又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つを含む、少なくとも10個のアミノ酸の長さの、任意的に担体分子とカップリングされたポリペプチドを含有する。
GIBsPLA2抗原の免疫原性は、ヒト免疫細胞でグラフト化された非ヒト動物の免疫化と、続く抗体の存在の検証、又はヒト若しくはヒト化抗体を用いるサンドイッチELISAとによってなど、種々の方法でテストされ得る。生物活性の欠如は、本願に記載されるいずれかの活性テストによって検証されるとよい。好ましい実施形態において、GIBsPLA2抗原は、(i)CD4T細胞における膜マイクロドメイン(MMD)の形成を誘導するインビトロの方法において又は(ii)CD4T細胞をIL−2シグナリングに不応若しくはIL−7シグナリングに不応にさせることにおいて、野生型GIBsPLA2タンパク質、20%未満、より好ましくは15%、10%、5%、又はさらに1%未満の活性を有する。
特定の実施形態において、本発明は不活性化及び免疫原性のGIBsPLA2に関する。
さらなる特定の実施形態において、本発明は、好ましくはKLHである担体分子と結合された、GIBsPLA2タンパク質又はそのフラグメント若しくはミモトープに関する。
さらなる態様において、本発明は、GIBsPLA2抗原、適切な賦形剤、及び任意的に適切なアジュバントを含むワクチンに関する
そのような分子と複合体とワクチンとは、対象の免疫化に用いるための強力な薬剤に相当し、継続的にGIBsPLA2を阻害する。そうした方法は、反復によって、永続的にGIBsPLA2を阻害するために用いられることができる。
本発明のさらなる目的は、対象における内因性GIBsPLA2の活性を無効化する抗体の産生を誘導するための方法に関し、該方法は、前記対象に治療有効量のGIBsPLA2抗原又はワクチンを投与することを含む。
本発明の抗原又はワクチンの投与は、好ましくは筋肉内、皮下、経皮、静脈内又は動脈内注射や、経鼻、経口、経粘膜、又は経直腸投与によってなど、任意の適切な経路でおこなわれるとよい。
GIBsPLA2抗原又はワクチンは、GIBsPLA2の過剰産生に関連する任意の疾患を処置するために用いられるとよい。さらに具体的に、この発明は、対象におけるGIBsPLA2の過剰産生に関連する疾患を処置するための方法に関し、該方法は、治療有効量のGIBsPLA2抗原又はGIBsPLA2抗原を含有するワクチン組成物を対象に投与することを含む。
〔GIBsPLA2アゴニスト又はアクチベータ〕
GIBsPLA2「アゴニスト」という用語は、本発明の文脈内において、非限定的な、ペプチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、複合体、天然若しくは人工リガンド、分解物、ホモログ、核酸、DNA、RNA、アプタマー等、又はそれらの組合せなど、GIBsPLA2活性を有するか又は媒介するか又は増加させる任意の物質を包含する。「アゴニスト」という用語は、完全アゴニスト及び部分的なアゴニストの両方を包含する。GIBsPLA2アゴニストの特定の例は、GIBsPLA2タンパク質又はGIBsPLA2タンパク質をコードする核酸である。
特定の実施形態において、本発明は、対象における免疫反応を阻害するための方法に関し、該方法は、GIBsPLA2タンパク質又はGIBsPLA2タンパク質をコードする核酸を対象に投与することを含む。
[組成物]
また、本発明は、有効成分として本明細書に記載されるようなGIBsPLA2モジュレータ又は抗原と、好ましくは薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。
「医薬組成物」とは、本発明の化合物の製剤(有効成分)、及び生物学的に活性である化合物を対象に送達するために当該技術分野において通常許容される媒体に関する。そうした担体は、すべての薬学的に許容される担体、希釈剤、媒体、又はサポートを含む。従来からの医薬実務は、適切な製剤又は組成物を対象に提供するために、例えば単位剤形において、用いられるとよい。
本発明の化合物又は組成物は、軟膏剤、ゲル剤、泥膏剤、液剤、懸濁剤、錠剤、ゼラチンカプセル剤、カプセル剤、坐剤、散剤、点鼻剤、又はエアロゾールの剤形で製剤化され、好ましくは注射可能な液剤又は懸濁剤の剤形で製剤化されるとよい。注射では、化合物は、例えばシリンジ又はかん流適用によって注入され得る液体懸濁剤の剤形で通常パッケージ化される。これについて、化合物は、通常、医薬的使用に適合し且つ当業者に既知である生理食塩水、生理溶液、等張溶液、又は緩衝溶液に溶解される。このように、組成物は、分散剤、可溶化剤、安定剤、保存剤などから選択される1つ以上の薬剤又は賦形剤を含有し得る。液体製剤及び/又は注射可能な製剤に用いられ得る薬剤又は賦形剤は、特に、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリソルベート80、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、植物油、アカシア等である。また、担体も、例えばメチル−β−シクロデキストリン、アクリル酸のポリマー(カーボポール(登録商標)等)、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの混合物、モノエタノールアミン、並びにヒドロキシメチルセルロースから選択可能である。
組成物は、例としてGIBsPLA2の調節に有効である量など、本発明の化合物の有効量を通常含む。一般に、本発明による組成物は、約1μg〜1000mgのGIBsPLA2モジュレータを含み、これは0.001〜0.01、0.01〜0.1、0.05〜100、0.05〜10、0.05〜5、0.05〜1、0.1〜100、0.1〜1.0、0.1〜5、1.0〜10、5〜10、10〜20、20〜50、及び50〜100mgなどであり、例として0.05〜100mg、好ましくは0.05〜5mg、例えば0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4又は5mgである。用量はモジュレータや疾患次第で当業者により調整されるとよい。
本発明の組成物は、共に又は連続的に使用するための、1つ以上の追加的活性化合物をさらに含むことができる。
本発明は、医薬組成物を調製するための方法にも関し、該方法は、前述されたようなGIBsPLA2モジュレータと薬学的に許容される賦形剤と混合するステップと、組成物を任意の適切な剤形又は容器(シリンジ、アンプル、フラスコ、ボトル、パウチ等)に製剤化するステップとを含む。
本発明は、(i)前述されたようなGIBsPLA2モジュレータを含有する組成物と、(ii)少なくとも1つの容器と、任意的に(iii)キットを使用するための文書による指示と、を含むキットにも関する。
[疾患]
本発明の化合物と組成物とは、不適切な(例えば不全の又は不適当な)免疫反応に関する、特に不適切なCD4T細胞活性に関する任意の疾患、並びに免疫の増加が対象の状態を改善し得る任意の疾患を処置するために用いられるとよい。これらの疾患は、本願において「免疫障害」として時に言及される。これは、(例えばウイルス感染、病原菌感染、がんなどにより起こる)免疫不全状態、自己免疫疾患、移植、糖尿病、炎症性疾患、がん、アレルギー、ぜんそく、乾癬、じんま疹、及び湿疹などを含む。
〔免疫不全と関連障害〕
第1の態様において、本発明は、対象におけるGIBsPLA2の阻害に基づき、免疫活性、特にCD4T細胞媒介活性を増大又は回復させる。
特定の実施形態において、本発明は、対象における免疫反応を刺激するための方法に関し、該方法は前記対象におけるGIBsPLA2を阻害することを含む。
特定の実施形態において、本発明は、対象における白血球を調節するための方法に関し、該方法は前記対象におけるGIBsPLA2を阻害することを含む。
GIBsPLA2阻害剤から利益を得られる疾患の例は、HIV性免疫不全など免疫不全があるすべての疾患である。これについて、特定の実施形態において、本発明は、対象における免疫不全又は関連障害を処置するための方法に関し、該方法前記対象におけるGIBsPLA2を阻害することを含む。
他の特定の実施形態では、本発明は、対象における免疫不全又は関連障害の処置に用いるためのGIBsPLA2阻害剤に関する。
免疫不全及び関連疾患とは、対象における免疫機能若しくは免疫反応の低下に特徴づけられるか、及び又はそれによって引き起こされる任意の状態又は病態を指す。免疫不全は、例としてウイルス感染(例えばHIV、B型肝炎など)、細菌感染、がん、又は他の病的状態によって引き起こされ得る。故に、「免疫不全関連障害」という用語は、免疫不全により引き起こされるか又は免疫不全に関連する任意の疾患を指す。本発明は、CD4T細胞に関する免疫不全及び関連疾患を処置することに特に適する。本願は、事実、GIBsPLA2の生物学的作用がCD4T細胞疾患の状態に関連することを示す。従って、GIBsPLA2の活性を阻害することは、HIV感染患者にしばしば見受けられるような免疫不全を引き起こすサイトカインに対する反応が改変された対象において治療的な有利性がある。
従って、特定の実施形態において、本発明は、対象におけるGIBsPLA2を阻害することによって、好ましくは対象にGIBsPLA2阻害剤又はワクチンを投与することによって、対象におけるHIV感染を処置する方法に関する。一部の実施形態において、対象は早期HIV患者であり、該方法は患者がHIVコントローラであるという可能性を増大させる。一部の実施形態において、対象は、抗レトロウイルス処置後の低免疫再生患者、及び/又は重度の突発性CD4Tリンパ球減少(ICL)を有する患者である。また、本発明は、対象におけるGIBsPLA2を阻害することによって、好ましくは対象にGIBsPLA2阻害剤又はワクチンを投与することによって、HIV感染対象におけるCD4T細胞活性を増大させるための方法にも関する。
他の実施形態において、本発明は、直接的に又は抗炎症剤に関連してGIBsPLA2を対象に注射することによって、対象における急性及び/又は慢性の炎症と炎症反応に由来するプロセスとを処置する方法に関する。
また、本発明は、対象における免疫反応を増大させることによってがんを処置するための方法を提供し、該方法は好ましくは対象にGIBsPLA2阻害剤又はワクチンを投与することによって対象におけるGIBsPLA2を阻害することを含む。本発明はまた、好ましくは対象にGIBsPLA2阻害剤又はワクチンを投与することにより、対象におけるGIBsPLA2を阻害することによって、対象におけるがんに関連したCD4T細胞連結免疫不全を処置する方法を提供する。
〔病理的な免疫反応及び関連疾患〕
本発明は、不適切な(例えば病理的又は不適当な)免疫反応か、又は免疫系の望ましくない(過剰)活性若しくは(過剰)活性化、特に不適切なCD4T細胞活性に関する任意の疾患を処置するために用いられ得る。これらの疾患は、例として自己免疫疾患、移植、糖尿病、アレルギー、ぜんそく、乾癬、じんま疹、及び湿疹などを含む。
さらなる態様では、本発明は、対象におけるGIBsPLA2の活性化又は誘導に基づき、免疫活性、特にCD4T細胞媒介活性を阻害する。
特定の実施形態において、本発明は、対象における免疫反応を阻害するための方法に関し、該方法は前記対象におけるGIBsPLA2を誘導するか又は活性化することを含む。
特定の実施形態において、本発明は、対象における白血球を阻害するための方法に関し、該方法は前記対象におけるGIBsPLA2を阻害することを含む。
他の特定の実施形態において、本発明は、対象における望ましくない免疫反応により引き起こされる障害を処置するための方法に関し、該方法は前記対象におけるGIBsPLA2を誘導又は活性化することを含む。
対象においてGIBsPLA2を誘導又は活性化することは、例えばGIBsPLA2タンパク質又はその機能的フラグメントなどのGIBsPLA2アゴニストを対象に投与することを好ましくは含む。
他の特定の実施形態において、本発明は、対象における望ましくない免疫反応によって引き起こされる障害の処置に使用するためのGIBsPLA2アゴニスト又はアクチベータに関する。
GIBsPLA2アゴニストから利益を得られる疾患の例として、自己免疫疾患、がん、ウイルス性疾患、細菌感染などが挙げられる。
特定の実施形態において、本発明は、対象における自己免疫疾患を処置するための方法に関し、該方法は前記対象におけるGIBsPLA2を刺激又は誘導することを含む。
他の特定の実施形態において、本発明は、対象における自己免疫疾患の処置において使用するための本発明の化合物又は組成物に関する。
特定の実施形態において、本発明は、対象におけるがんを処置するための方法に関し、該方法は前記対象のGIBsPLA2を刺激又は誘導することを含む。
他の特定の実施形態において、本発明は、対象におけるがんの処置に使用するための本発明の化合物又は組成物に関する。
本発明の他の特定の実施形態は、移植を受けた対象における移植片拒絶の処置(例えば低減若しくは予防若しくは阻止)、又は移植片対宿主疾患の処置のための方法に関し、該方法は前記対象におけるGIBsPLA2を刺激又は誘導することを含む。本発明のさらなる目的は、対象における同種移植耐性を向上させる方法であり、該方法は前記対象においてGIBsPLA2を刺激又は誘導することを含む。
〔抗微生物活性〕
また、本願は、さらなる態様において、GIBsPLA2を用いて微生物を死滅させるための方法も提供する。膜に直接的に作用することによって、GIBsPLA2は細菌、エンベロープウイルス、寄生虫などを破壊するか又は死滅させることができる。
急性感染又は感染において、GIBsPLA2は、単独で、又は抗生物質、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、及び抗寄生虫剤に関連して使用されるとよい。既知の抗微生物剤に耐性のある微生物の場合、GIBsPLA2は代替的治療に相当し得る。例えば顕著に危機的で急性である臨床的状態において、非常に短期間の治療に用いられることが可能である。
本発明のGIBsPLA2による処置から利益を得られる疾患の具体的な例は、免疫系の過剰活性を伴うすべての臨床的状態か、又は、多発性硬化症、重症筋無力症、ギランバレーなどの自己免疫ニューロパチー、自己免疫ぶどう膜炎、ぶどう膜炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少、側頭動脈炎、抗リン脂質抗体症候群、ウェゲナー肉芽腫症などの血管炎、ベーチェット病、アテローム性動脈硬化、乾癬、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、菌状息肉腫、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、扁平苔癬、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、湿疹、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫肝炎、1型糖尿病、アジソン病、グレーブス病、橋本病、自己免疫性卵巣炎及び精巣炎、自己免疫性甲状腺炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、強直性脊椎炎などの脊椎関節症、シェーグレン症候群などの慢性炎症である。
本発明の化合物又は組成物を投与する期間、用量、及び頻度は、対象と疾患とによって適応されるとよい。処置は、単独で用いられるか、又は、共に、若しくは個別に、若しくは連続的に、他の活性成分と組み合わせて用いられるとよい。
本発明の化合物又は組成物は、非限定的に、全身性注入、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮膚、皮下、真皮、経真皮、髄腔内、眼球(例えば角膜)、若しくは直腸方法によって、又は炎症部位への局所投与によって、そして好ましくは、筋肉内又は静脈内注射によってなど、の種々の方法又は経路において投与されるとよい。
典型的な投与計画は、1日又は数日の期間、1年までの期間、並びに1週〜約6か月の間を含む期間にわたる、有効量のGIBsPLA2モジュレータの一回の投与又は反復的な投与を包含する。インビボにおいて投与される本発明の医薬化合物又は組成物の用量は、レシピエント(対象)の年齢、健康状態、性別、及び体重、もしあるなら併用される処置の種類、処置の頻度、並びに所望の薬学的作用の特性次第であることが理解される。本明細書において提示される有効用量の範囲は、限定することを意図せず、好ましい用量範囲に相当する。しかしながら、最も好ましい用量は、当業者によって理解且つ決定されるように、個々の対象に適合される(例としてBerkowet等、eds.、The Merck Manual、16th edition、Merck and Co.、Rahway、N.J.、1992年;Goodmanetna.、eds.、グッドマン・ギルマン薬理書(Goodman and Cilman’s The pharmacological Basis of Therapeutics)、10th edition、Pergamon Press Inc.、Elmsford、N.Y.(2001年)を参照)。
[診断]
また、本発明は、対象からの試料におけるGIBsPLA2の存在又は量又は欠如の検出に基づいて、対象における免疫不全を検出するための方法を提供する。本発明の方法は、非限定的に、捕捉アッセイ、サンドイッチアッセイ、拮抗アッセイ、放射免疫アッセイ、色素、蛍光、化学発光、若しくは電気化学的に活性の産生物を生成する基質での酵素標識、蛍光法、蛍光偏光法、化学発光法、光学及び比色分析、電気化学発光法、時間分解蛍光法、表面プラズモン共鳴法、エバネッセント波、マルチウェルプレート(ELISA)、個別アッセイ、多重アッセイ、ラテックスビーズ−多重アッセイ、マイクロアレイ(層状面)−多重アッセイ、ガラス、プレートによるアッセイ、又はストリップによるアッセイなど、当該技術分野においてそれ自体既知である種々の検出技術又はプラットフォームを用いておこなわれるとよい。
特定の実施形態において、方法は、GIBsPLA2遺伝子、RNA,又はタンパク質における多型性の存在又は量又は欠如を測定することを含む。本結果では、GIBsPLA2は高い多型性があること、そしてこれは対象の生理的状態に相関することが示される。このように、本発明は、(i)GIBsPLA2の特定の多型アイソフォームの存在又は量又は欠如の測定すること、及び/又は(ii)対象におけるGIBsPLA2の多型性の総比率を測定することを含み、そのデータは対象の生理的状態と相関される。特に、特定のアイソフォームは、対象における上述のような障害の素因、存在、又は発症の特徴であり得る。そうした測定は、処置を調整するために個別化医療においても用いられ得る。
〔GIBsPLA2の検出を含む、CD4T細胞欠損に関連した免疫不全をモニタリング及び/又は診断する方法〕
本開示により、特に対象のヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染における、CD4T細胞欠損に関連する免疫不全をモニタリング及び/又は診断する方法が提示される。一部の実施形態において、該方法は、(a)対象からの体液、好ましくは血漿を含む試料を準備するステップと、(b)試料においてしきい値を超えるGIBsPLA2のレベルを検出するステップとを含む。試料におけるGIBsPLA2の存在は、当該技術において既知の任意の方法によって、例として酵素アッセイ、リガンド捕捉アッセイ、及び/又は免疫アッセイを含む方法によって、検出されるとよい。
一部の実施形態において、該方法は、対象の血漿を含む試料を取得するステップと、健康な対象のCD4T細胞において異常な膜マイクロドメイン(MMD)の形成を誘導すること及び健康な対象のCD4T細胞をインターロイキン−7(IL−7)シグナリングに不応性にすることから選択される少なくとも1つの活性を血漿が有するかどうかを測定するステップとを含む。対象の血漿がそうした活性を含有する場合、対象は、一部の実施形態において、HIV感染患者だけではないがHIV感染患者において多く見受けられるようなCD4T細胞連結免疫不全を有すると測定される。血漿フラクションがそうした活性を含有しない場合、対象は、一部の実施形態において、サイトカイン調節ホメオスタシスに対するCD4T細胞の変化に関連した免疫不全に対して低暴露であると測定される。
一部の実施形態において、対象がHIV感染を有することが測定される。一方で、タンパク質フラクションがそうした活性を含まない場合、対象は、一部の実施形態において、本明細書に開示されるようなCD4T細胞欠損に関連する免疫不全を有しないと測定される。一部の実施形態において、対象は、HIV感染を有しないと測定される。
一部の実施形態において、該方法は、対象の体液、好ましくは血漿を含む試料を、GIBsPLA2に特異的な抗体に接触させるステップと、免疫学的反応の有無を測定するステップとを含む。一部の実施形態において、免疫学的反応の有無は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を含む方法によって測定される。GIBsPLA2に特異的な抗体と試料との免疫学的反応の存在は、試料におけるGIBsPLA2の存在を示し、つまり対象がCD4T細胞欠損に関連する免疫不全を有することを示す。一部の実施形態において、対象はHIV感染を有すると測定される。一方で、GIBsPLA2に特異的な抗体と試料との免疫学的反応の欠如は、本明細書に開示されるようなCD4T細胞欠損に関連する免疫不全を対象が有しないことを示す。一部の実施形態において、対象はHIV感染を有しないと測定される。
一部の実施形態において、試料におけるGIBsPLA2検出のためのアッセイは定性的である。一部の実施形態において、試料におけるGIBsPLA2検出のためのアッセイは定量的である。
一部の実施形態において、該方法は、アッセイの結果を、CD4T細胞欠損に関連した免疫不全を有しない対象の血漿を含む対照試料の類似のアッセイの結果と比較することを含む。一部の実施形態において、該方法は、アッセイの結果を、前もって採取された同一の対象の血漿を含む試料の類似のアッセイの結果と比較することを含む。
〔CD4T細胞における膜マイクロドメインの特性評価を含む、CD4T細胞の変化に関連した免疫不全をモニタリング及び/又は診断する方法〕
実施例のデータは、HIVに実際に感染した細胞はほとんどなくても、HIV感染患者がCD4T細胞の表面に特徴的な膜マイクロドメイン(MMD)の形成を示す、ということを表す。故に、本開示ではまた、例えば対象におけるヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染により引き起こされる免疫不全など、CD4T細胞の変化に関連した免疫不全を診断するための方法も提供される。一部の実施形態において、該方法は、(a)CD4Tリンパ球を対象から単離するステップと、(b)T細胞における膜マイクロドメイン(MMD)の数及び/又はサイズを測定するステップとを含む。一部の実施形態において、該方法は、さらに、(c)T細胞におけるリン酸化STAT5量を測定するステップと、(d)T細胞におけるリン酸化STAT5の核移行量を分析するステップとのうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態において、T細胞におけるMMDの数及び/又はサイズはインターロイキンの非存在下で測定される。一部の実施形態において、T細胞におけるMMDの数及び/又はサイズはIL−2の非存在下で測定される。一部の実施形態において、T細胞におけるMMDの数及び/又はサイズはIL−7の非存在下で測定される。一部の実施形態において、T細胞におけるMMDの数及び/又はサイズはしきい値以下レベルのインターロイキンの存在下で測定される。
一部の実施形態において、対象から単離されたT細胞におけるMMDの数が少なくともしきい値である場合、対象はCD4T細胞の変化に関連した免疫不全を有することを示す。一部の実施形態において、これは対象がHIV感染を有することを示す。一部の実施形態において、対象から単離されたT細胞におけるMMDの数が少なくともしきい値でない場合、対象は、本明細書に開示されるようなCD4T細胞の変化に関連した免疫不全を有しないことを示す。一部の実施形態において、これは、対象がサイトカインシグナリングに対するCD4T細胞反応の傷害を有しないことを意味する。一部の実施形態において、これは、対象がインターロイキン−7に対するCD4T細胞反応の傷害を有しないことを意味する。一部の実施形態において、対象はHIV感染を有しないことが示される。一部の実施形態において、しきい値は、細胞毎に少なくとも約80、細胞毎に少なくとも約90、細胞毎に少なくとも約100、細胞毎に少なくとも約110、又は細胞毎に少なくとも約120である。非限定的な好ましい実施形態において、しきい値は細胞毎に約100である。一部の実施形態において、対象から単離されたT細胞におけるMMDが少なくともしきい値の直径を有する場合、対象はHIV感染を有することが示される。一部の実施形態において、対象から単離されたT細胞におけるMMDが少なくともしきい値の直径を有しない場合、対象は、インターロイキン−7、さらに広くはサイトカインに対する傷害反応を有しないことが示される。一部の実施形態において、これは、対象がHIV感染を有しないことを示す。一部の実施形態において、しきい値は、少なくとも100nm、少なくとも110nm、少なくとも120nm、少なくとも130nm、又は少なくとも140nmの直径である。非限定的な好ましい実施形態では、しきい値は少なくとも約120nmの直径である。
RIFは、異常に大きいMMDにおける膜受容体を凝集することによってIL−7に対するCD4T細胞の反応性を変化させ得るので、他のγ−cやサイトカインへの反応も影響を受け、RIFはCD4T細胞反応変化に関する他の病態にも関連し得る。
[候補治療剤を特定する方法]
本発明は、候補治療剤を特定するための方法も提供し、該方法は、(a)薬剤の存在下でCD4Tリンパ球をGIBsPLA2に接触させるステップと、(b)
GIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化を測定するステップとを含む。一部の実施形態において、該方法は、(c)薬剤の存在下におけるGIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化のレベルを、薬剤の非存在下におけるGIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化のレベルと比較するステップを含む。一部の実施形態において、薬剤の存在下におけるGIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化のレベルが薬剤の非存在下におけるGIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化のレベルより低い場合、薬剤は候補の免疫不全治療剤として特定される。一部の実施形態において、薬剤は候補のHIV治療剤として特定される。一部の実施形態において、薬剤の存在下におけるGIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化のレベルが薬剤の非存在下におけるGIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化のレベルより高い場合、薬剤は候補の免疫抑制治療剤として特定される。
一部の実施形態において、GIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化の測定は、CD4T細胞毎のMMD数を測定することを含む。
一部の実施形態において、GIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化の測定は、CD4T細胞におけるMMDの平均直径を測定することを含む。
一部の実施形態において、GIBsPLA2誘導CD4T細胞活性化の測定は、STAT5リン酸化及び/又は核移行によって分析されるCD4T細胞のIL−7反応性を測定することを含む。
本明細書において用いられるように、「薬剤」とは、可能性のある治療法として評価される任意の化学成分であってよい。一部の実施形態において、薬剤は有機分子である。一部の実施形態において、薬剤は、2〜50の炭素原子、5〜50の炭素原子、又は10〜50の炭素原子などの2〜100の炭素原子を含む。一部の実施形態において、薬剤はペプチド、タンパク質、糖タンパク質、又はリポタンパク質である。一部の実施形態において、薬剤は抗体である。
一部の実施形態において、薬剤は、多くはHIV感染に関連するような免疫不全の処置用の治療剤としての有用性を示唆する生物活性を有することが事前に測定されない。一部の実施形態において、薬剤は、多くはHIV感染に関連するような免疫不全の処置用の治療剤としての有用性を示唆する生物活性を有することが事前に測定される。
本明細書に示されるように、「候補の免疫不全治療剤」又は「候補のHIV治療剤」は、少なくとも1つのアッセイにおいてCD4T細胞を活性化するためにRIFの能力を阻害する薬剤である。本発明において報告されるデータによると、少なくとも1つのアッセイにおいてCD4T細胞を活性化するためにGIBsPLA2の能力を阻害する薬剤の能力は、HIV感染に関連した免疫不全を含む免疫不全の処置に治療的に有用であり得る薬剤を特定するために有効なものである。従って、これはHIV感染の処置に治療的に有用であり得る薬剤を特定するためにも有効である。当然のこととして、すべての治療的分子において、さらなる特性評価が必要とされる、しかしながら、このことは本開示の候補HIV治療剤の有用性を減じることはない。
本発明のさらなる態様と有利性とは、例示として考慮される以下の実験の項において開示される。
<1.材料と方法>
[1.1.患者]
調査に参加したVPは、1年を超えてHIV陽性である。VPは、いずれの抗レトロウイルス薬剤も摂取したことはなく、血液採取時に、CD4数>200/μlでありウイルス負荷>10,000RNAコピー/mlを有していた(ANRSのEP33及びEP20の研究)。VPからのすべての血液試料は、ゴネス病院(the Centre Hospitalier de Gonesse)で取得された。HDの血液は、仏国血液機構(Etablissement Francais du Sang、Centre Necker−Cabanel、Paris)により提供された。ART患者からの血漿試料は、少なくとも1年間処置を受けている個人から取得された。彼らのウイルス負荷は少なくとも6か月間検出されず、血液採取時にはCD4数>500/μlであった。HIC患者からの血漿試料は、感染後10年でウイルス負荷が検出不可能な個人から取得された。血漿試料はネッカー・パスツール感染病センタ―で採取された。
[1.2.精製CD4Tリンパ球における膜マイクロドメイン(MMD)、受容体拡散速度、及びリン酸化STAT5細胞区画化の解析]
CD4T細胞を、既に記述されたように負の選択によって精製し(参考文献10)、2nMのグリコシル化組換えヒトIL−7(Cytheris社)又は40μgPHA(Sigma社)で活性化した。細胞表面マクロドメイン(MMD)とリン酸化STAT5細胞区画分布とを研究するために用いられた共焦点及びSTED顕微鏡は既出である(参考文献10、12)。生細胞表面でのタンパク質拡散のFCS解析も記載された(参考文献10、12)。
[1.3.界面活性剤不溶性マイクロドメイン(DRM)の調製及び解析]
HD又はVPからのCD4Tリンパ球のトリトンX100溶解物の調製、続くショ糖勾配を介した遠心分離、及び収集された画分のウエスタンブロット分析は既出である(参考文献12)。ウエスタンブロットによって対応するバンドを検出するために、フロチリン、IL−7Rα及びγcに特異的なmAbを用いた(参考文献12)。
[1.4.VP血漿のRIFの特性評価]
〔1.4.1.バイオアッセイ〕
MMD誘導アッセイは以下のとおりである。VP血漿(5%又は10%)をHDの精製CD4T細胞と共に培地においてまずインキュベートした(20分)。そして細胞をポリリジン被膜ガラススライドに10分間配置して、IL−7(2nM)によって15分活性化するか、又は対照(NS)用に活性化しない。そしてPFAで固定し(PFA、1.5%、37℃で15分、続いて室温で15分)、PBS/SVF5%内で1時間平衡化した後、コレラ毒素B(CtxB−AF488)で染色した。MMDをSTED顕微鏡でカウントした。
STATリン酸化と核移行との阻害のアッセイは以下のとおりである。VP血漿(5%又は10%)を、IL−7による刺激(2nM、15分)前に、HDの精製CD4T細胞と共にまずインキュベートした(20分)。そして細胞を、ポリリジン被膜ガラススライドに10分間配置して、IL−7(2nM)によって15分活性化するか、又は対照(NS)用に活性化しない。そしてPFAで固定し(PFA、1.5%、37℃で15分、続いて室温で15分)、メタノール(90%、−20℃)によって透過処理をおこなった。細胞をPBS/SVF5%内で1時間平衡化し、リン酸化STAT5をヤギ抗ウサギAtto642で標識されたウサギ抗STAT5によって染色し、FACS又はSTED顕微鏡によって解析した。
〔1.4.2.酵素処理〕
RIF活性における酵素消化の作用を、30kDa膜で濾過されたVP血漿を処理することで評価した。10kDaより低い分子量を有する血漿化合物を負の対照として用いた。ブタトリプシン(1U/ml、37℃で30分間、続いてPMSF阻害と、ミリポアの5kDa遠心式メンブレンフィルタでバッファ交換)、又はDNAseI(1U/ml、37℃で30分間)、又はRNAse(1U/ml、37℃で30分間)、又はペプチドN−グリカナーゼ(1U/ml、37℃で30分間)の作用をテストした。すべての調製物を10%の最終濃度で解析した。
〔1.4.3.分子量測定又はRIF精製〕
サイズ排除クロマトグラフィは、1.6mlの血漿を、炭酸アンモニウム(0.1M)又はPBSで予備平衡化した85mlセファデックスG100カラムに負荷し、溶出液の0.8ml画分を収集することによっておこなわれた。カラムをタンパク質セット(GE−Healthcare社)を用いてキャリブレートした。タンパク質濃度をブラッドフォード法で測定した。100kDaメンブレンで事前に濾過されたVP血漿とVPの総血漿とをテストし、同一の結果を得た。準精製RIFを含む13〜17kDaの画分を収集した。
〔1.4.4.等電点測定〕
陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィを、モノQ又はモノSの1mlカラム(GE−Healthcare社)において、連続的なpHステップによる溶出(炭酸アンモニウム/酢酸アンモニウム緩衝剤)でおこなわれた。各溶出画分のpHを測定し、生物学的作用のテスト前にこれらをpH7.4に調整した。溶出後直ちに対応する画分においてRIF活性を測定した。
〔1.4.5.MS解析〕
ゲル濾過(G100)からの試料を、当該技術においてそれ自体既知である方法によって、凍結乾燥し、そして再懸濁、貯留、及びブタトリプシンでタンパク質分解をおこなった。その後タンパク質分解性ペプチドを、酢酸アンモニウムにおいて溶出されるC18カラムを介したクロマトグラフィにより12画分に分離した。12画分は、逆相で溶出されるC18を介して分離され(アセトニトリル)、そして、2次的ArフラグメンテーションでのMS解析、またMSスキャン毎の10の高強度ピークのMS/MSのため、オービトラップVelos(Thermo Scientific社)にエレクトロスプレーで直接的に注入された。
スタンダードマスコット(Standard Mascot)とXタンデム(X−Tandem)プログラムとを用いた。データベースサブセットの各タンパク質について、
・iスコア:シグナルペプチドが切断された成熟タンパク質を充実化したネクストプロット(NextProt)データベースにおいて、単一のタンパク質のトリプシン消化からのすべてのペプチドの理論的特異性の算出(固有のペプチド・タンパク質の数)、ヒト配列全体(すべて)の特定のペプチドの数、タンパク質毎のN末端シグナルペプチド(sec)配列、
・すべてのMSスキャンシリーズのピークに一致するペプチドの理論上の出現の算出(理論上のペプチド一致ピーク/タンパク質)、
・ピーク一致ペプチドでのタンパク質配列の理論上の被覆度の算出、
の3基準を算出した。
各タンパク質について、3つすべてのスコアの算出結果として、pスコアを決定した。
[実施例1:異常な膜マイクロドメイン(MMD)の存在から測定される、VPのCD4Tリンパ球の異常な活性化]
本実施例では、慢性のHIV感染患者のCD4Tリンパ球において見受けられる異常な反応の一部を明らかにする新規の分子及び細胞パラメータの研究について記載される。免疫の慢性的活性化は、通常、CD4機能不全の主要なマーカとして考えられるCD38、HLA−DR、及びCD25などの細胞表面分子の過剰発現を評価することによって測定される(参考文献15)。しかしながら、多くの努力にもかかわらずこれらのデータには不明瞭性が残り、CD4T細胞の表現型がその免疫不全を直接的に明らかにすることはできない。
STED顕微鏡とコレラ毒素B(CtxB−AF488)での標識を、MMDの存在を検出するために使用した(参考文献12)。任意の刺激の前に、VPから精製されたCD4Tリンパ球の表面は、HDから精製された静止CD4Tリンパ球よりもはるかに多くのMMDを含有することが分かった(図1a)。最も重要なことには、VPのすべてのCD4T細胞はMMD数の増加を示した。この異常パターンは、VP血漿におけるIL−7刺激の結果ではなく、これは血漿の平均IL−7濃度(0.4pM)は単にIL−7RのKdの100倍であったためである(参考文献13、14)。HDからの精製CD4T細胞をIL−7により刺激したとき、多数のMMDが観察された。一方で、VPからのCD4T細胞のMMDパターンはIL−7には影響されなかった(図1a)。IL−7に対するいずれの反応もないことと結びついたこの異常な活性化は、フィトヘマグルチニン(PHA)などの非生理的刺激により再現可能である(図1a)。
これらの種々の異常なMMDをカウントした。HDのPHA刺激CD4T細胞のように、VPのCD4T細胞毎に約150〜200MMDが観察された(図1c)。ここでもまた取得結果は、VPからのすべてのCD4T細胞が、すべての主要なCD4サブ集団を含み、MMDを発現したことを示した(図1c)。VPにおいて、IL−7はMMD数を増加させなかった。一方で、HDのCD4T細胞におけるMMD数は、IL−7刺激後に、約10MMD/細胞のバックグラウンドレベルから300MMD/細胞に増加した。MMDサイズの調査もおこなわれた(図1dと図1e)。これは、VPのCD4T細胞とHDのPHA刺激CD4T細胞とにおけるMMDが、HDのIL−7刺激CD4T細胞からのもの(90nm)よりもはるかに大きかった(250nm)ということを示した。
[実施例2:すべてのIL−7Rα及びγ-c鎖は、VPのCD4T細胞から単離されたCD異常な界面活性剤不溶性膜マイクロドメイン(DRM)において隔離される]
HDの静止CD4T細胞が解析され、IL−7Rα及びγ-c鎖がMMD外部の高密度フラクションに配置されることを検証した。HDのこれらのCD4T細胞をIL−7によって刺激すると、これらの2鎖は、MMDにおいて隔離されたすべてのタンパク質を含む界面活性剤不溶性MMD又はDRMに相当する低密度フラクションに配置される(図2)。
この調査を、VPから精製されたCD4T細胞で繰り返すと、パターンは異なった(図2)。任意の刺激の前に、すべてのIL−7Rα及びγ-c鎖は既にDRMに隔離され、MMD外部の遊離受容体に相当する高密度フラクションに配置されるものはなかった。さらに、DRM調製前の、IL−7によるCD4T細胞の予備刺激は、このパターンに影響を与えなかった(データは示されない)。ここでもまた、非生理的PHAによるHDのCD4T細胞の予備刺激は、この病理的状態を再現した。これは図1のデータを裏付け、VPにおけるCD4T細胞が任意の刺激前に異常な活性化を受けていることを示す。さらに、これらの異常なMMDはすべてのIL−7R鎖を含む(図2)。
[実施例3:HD、VPからの精製CD4T細胞及びHDのIL−7刺激細胞におけるIL−7シグナロソームの2Dゲル解析。免疫沈降後に回収されたタンパク質パターンによる活性化の異常な状態の特性評価。]
2D電気泳動を使用し、VPにおけるIL−7シグナロソームの構成は異常であり、HDの静止及びIL−7活性化CD4T細胞のものとは異なることを示した(図7a、7b、及び7c)。
タンパク質を、抗IL−7Rα(マウスmAb 40131、R&D System社)で免疫沈降化した。精製CD4T細胞溶解物からプロテインG−セファロース4Gに固定し、そして2D−PAGEにおいて分離した(pH3〜10のゲルストリップにおけるIEF、続いて12%アクリルアミドビスを含むSDSゲル)。pH及び分子量(kDa)スケールが示される。ゲルはシプロルビー(Sypro−Ruby)で染色された。示されるゲルは、HDから取得された8つのNS/IL−7ペアと、VPからの3つのゲルとに相当する。
図7aは、HDの非刺激(non−stimulated、NS)CD4T細胞を示す。
図7bは、VPのCD4T細胞を示す。HDからよりもVPから調製されたシプロルビー染色2Dゲルにおいて、さらに点が観察された。加えて、2DゲルがVP抽出物と共に調製されるとき、共通の点がより強調されることが観察された。
図7cは、HDのIL−7刺激CD4T細胞を示す。IL−7により刺激されたHDのCD4T細胞におけるパターンは、VPのCD4T細胞のものと異なる。これは、VPに見られる異常な活性化が、例えばIL−7産生臓器など高レベルのIL−7を有する臓器において起こり得るIL−7刺激の結果ではないという提案をさらに後押しする。
この解析から、VPのCD4T細胞のIL−7R鎖は異常なMMDの一部であるだけでなく、通常のIL−7のシグナロソームにおいて見受けられるものとは異なるタンパク質複合体と相互作用するということが結論付けられ得る。
[実施例4:HD、VPからの精製CD4T細胞及びHDのPHA刺激細胞の表面におけるIL−7Rαの拡散速度。VPのCD4T細胞におけるIL−7Rαは脂質豊富な異常MMDに包埋され、その拡散速度が制限され、細胞骨格とのいずれの相互作用、つまりシグナルを伝達するいずれの能力も不可能にする]
AF488−抗−IL−7Rα mAbで染色されたIL−7Rαの2次元的拡散を、CD4T生細胞の表面においてFCSによって測定した。結果を図8に示す。(10−3秒における)拡散時間τDを、記述されるように(参考文献10、12)、IL−7の非存在下で(○、自己相関)又はIL−7−ビオチン−SAF633の存在下で(●、相互相関)、測定した。そしてこれらの時間を、共焦点領域によって捕捉された(10nmにおける)細胞表面領域ω に対してプロットした。拡散プロットは、MMD阻害剤(COase 1μg/mlとSMase 0.1μg/ml、30分間)又は細胞骨格阻害剤(CytD 20μMとCol 10μM、30分間)による予備処理有り又はなしで示される。
バーは5つの独立した実験からの平均値の標準誤差を示す。前述されるように(参考文献12)、線形回帰のスロープは実効拡散速度Deffを示し、y切片は閉じ込め時間τ0を外挿する。Deffは図3aの棒グラフに示される。
図8aと図8dとはHDのCD4T細胞の表面である。
図8bと図8eとはVPのCD4T細胞の表面である。
図8cと図8fとは。PHAで(1μg/ml)予備活性化されたHDのCD4T細胞の表面である。
図8gは、MMD阻害剤又は細胞骨格阻害剤による処理前及び処理後の、MMDに包埋されたIL−7Rα拡散の構造の図式を示す。MMDはディスクによって表され、受容体はロッドによって表され、細胞骨格はネットとして示される。拡散速度(速い、遅い、非常に遅い)はデータ理解を容易にするために示される。この図式は、図3aにおいても示される結果を提示する。
[実施例5:VPのCD4T細胞の異常なMMDに隔離されたIL−7R鎖は機能しない]
IL−7Rα拡散速度を、以前に記述され(参考文献10、12)、実施例4に詳細に記載されるように、CD4T細胞の表面において測定した。任意の刺激の前に、これらの拡散速度は、HDのCD4T細胞よりもVPにおいて3倍遅いことが見受けられた(図3a)。これは、IL−7Rα鎖がこれらのCD4T細胞の表面で異常なMMDに包埋されることをさらに示す(図3a)。COaseとSMaseとの処理はMMDの制約から受容体を開放し、故にその拡散速度を増加させた(図3a)。一方で、細胞骨格を非組織化するサイトカラシンD(Cyt D)及びコルヒチン(Col)での処理は、VPのCD4T細胞におけるIL−7Rα鎖の拡散速度に影響を与えなかった(図3a)。細胞骨格の組織化は、シグナル伝達に絶対的に必要であるので、このIL−7Rαと細胞骨格網目構造との間にいずれの機能的又は構造的関与もないことにより、VPのCD4T細胞の場合のように、IL−7R複合体が異常MMDに隔離されるときにシグナリングがおこなわれることができないということが示唆される。
パルスSTED顕微鏡は、HD及びVPのCD4T細胞の細胞質と核とにおけるSTAT5リン酸化(リン酸化STAT5)とリン酸化STAT5配置とを調査するために使用された。図3bは、15分のIL−7刺激の前と後とのリン酸化STAT5分布のSTEDイメージを示す。リン酸化STAT5はHDのCD4T細胞の核に蓄積し、この現象は細胞骨格の非組織化によって阻害されることが分かった。一方で、VPのCD4T細胞において、又はHDのPHA予備刺激CD4T細胞において、核へのリン酸化STAT5移行は起こらなかった(図3b)。
そして、細胞質と核におけるリン酸化STAT5出現の動態を1時間観察した(図3c、図3d、図3e)。これは、HDのPHA刺激CD4T細胞のように(図3e)、VPのCD4T細胞におけるリン酸化STAT5が細胞質に主に蓄積し、核には移動しないことを示した(図3d)。この結果が、50%のリン酸化STAT5が核において見受けられる、HDのCD4T細胞のIL−7刺激後5分で取得される結果(図3c)と比較されるときに、これは特に明白であった。
[実施例6:VPの血漿は、HDの精製CD4T細胞の表面において異常なMMDを誘導する]
VPのCD4T細胞の異常な活性化の起源を調査した。すべてのCD4T細胞が関与し、PHAなどの非生理的信号が結果を再現するという事実から、VP血漿の調査へと導かれた。HDの精製CD4T細胞をVPの10%血漿と共に30分間インキュベートし、CD4T細胞表面においてカウントされるMMDを、標識コレラ毒素B(CtxB−AF488)により検出した。図4aは取得されたイメージを示す。単独のVP血漿は、HDのCD4T細胞に多数のMMDを誘導した。IL−7の添加により、これらMMDのサイズ又は数は影響を受けなかった(図4a)。これらの結果は、異なる5人のVPからの血漿について示し(図4b)、これらVPからのさらに多くの血漿試料(>15)を用いて検証された。また、異なるHD(>5)からのCD4T細胞を用いてこれらの実験を繰り返した。対照は、HDの精製CD4T細胞においてHIVコントローラ(HIC)と抗レトロウイルス処置(ART)患者からの血漿試料をテストすることからなる。これらのいずれもMMDを誘導しないか又はMMDのIL−7誘導を阻害しなかった(図4c)。
これは、種々の血漿の数多くの希釈物をテストすることによってさらに検証がおこなわれた(図4d)。0.1%希釈まで低減されたVPの血漿は細胞表面にわたって散らばるMMD形成をもたらした。50〜100倍希釈のVP血漿は、50%の最大活性をもたらす。HIC又はART患者からの血漿試料はいずれの希釈でもMMDを誘導しなかった。
[実施例7:VP血漿はIL−7誘導リン酸化STAT5核移行を阻害する]
VP血漿で処理されたHDのCD4T細胞におけるIL−7Rの機能を、STAT5リン酸化と核移行とを観察することによってテストした。図5aに見受けられるように、HDのCD4T細胞をVP血漿(10%)で予備インキュベートすることで、IL−7誘導STAT5リン酸化及びその核移行が阻害された。図5bは5つのVP血漿試料から取得された結果を示す。10%希釈のすべてでリン酸化STAT5の核移行が阻害された。これらの結果は、異なるVPからの血漿(>15)、及び様々なソースのHDのCD4T細胞(>5)で確認された。
また、HIC及びART患者由来の血漿の作用も、HDの精製CD4T細胞と共に予備インキュベーションすることによってテストした(図5a及び図5c)。ここでも、VP血漿のみがリン酸化STAT5のIL−7誘導核移行を阻害することができた。また、VPの血漿は0.1%希釈まで活性であることが測定され(図5d)、最大活性の半分が50〜100倍希釈で取得され、異常MMDを誘導する能力と相関する(図4d)。
また、ART処置患者であるがその処置に無反応である(ウイルス性RNAの低カウント及びCD4T細胞の低カウント)(CD4−NR)患者由来の血漿の作用も、これらをHDの精製CD4T細胞で予備インキュベーションすることによってテストした。ここでも、CD4−NR血漿のみがリン酸化STAT5のIL−7誘導核移行を阻害することができた。また、CD4−NR血漿は0.1%希釈まで活性であることが測定され、最大活性の半分が50〜100倍希釈で取得され、VPで観察されるような異常MMDを誘導する能力と相関する。
[実施例8:不応状態誘導因子(Refractory state Inducing Factor)の分子特性評価]
RIFの化学的特性を検証した。おこなわれた研究では(図6a)、その活性がトリプシンによって破壊されたことからRIFはタンパク質であることが示された。ペプチドN−グリカナーゼ(PNGase)での処理は効果がなく、N−グリコシル化はRIF活性に必要とされないことがうかがえる。
RIFの分子量は、セファデックスG100におけるサイズ排除クロマトグラフィによって測定された。MMDの誘導(図6b)とIL−7誘導リン酸化STAT5核移行の阻害(図6c)とを、カラムから溶出されたすべての画分について測定した。2つの代表的なカラムプロファイルが図6に示される。その2つは、RIFが10〜15kDaの分子量を有する単独の因子であることを示す。
図6bは、セファデックスG100カラムから収集された100画分のそれぞれにおいてドットブロットによって測定されたウイルス性ペプチド又はタンパク質の密度を示す。測定は、ウイルス性タンパク質に対する高活性により特徴づけられるVP血漿試料からの異なるポリクローナル抗体で3回繰り返された。各実験について、HDの血漿より取得されたシグナルを値から減算した。図6bに示されるパターンは、ウイルス性タンパク質又はフラグメントがRIF活性を含む画分において検出されない一方で、ドットブロット分析は、より高い分子量(190〜32kDa)でウイルス性タンパク質を検出できたことを示す。
セファデックスG100カラムからの、10〜15kDa、活性であり、富化された画分を、陰イオン(モノQ)又は陽イオン(モノS)交換カラムにおける保持と、続くpH溶出(モノSではpH増加又はモノQではpH減少)とによって、RIFの等電点を捕捉するために用いた(図6d)。そして、種々のpH画分のMMD誘導活性は、そのpHを7.4に調整した後に測定された。全体で、25〜30%の初期活性が2つの画分において回収され、結果は6.5〜8.0の等電点と一致する。
従って、RIFは、約15kDaの分子量で、pI約7.5〜8.0の、ジスルフィド架橋を含む分泌タンパク質である。上述の構造及び機能的特徴に続き、RIF同一性が直接的に取得された。特に、36853の既知のヒトタンパク質すべての中で、62のみが上述の4つのRIFの特性を有した。3人のウイルス血症患者と3人のHDとから調製された準精製物質を、質量分析とスタンダードマスコット(Standard Mascot)プログラムとを用いて解析した。回収されたタンパク質を、材料と方法の項に記載されたpスコアに従って順位づけした。以下の表1に提示された結果は、RIFがGIBsPLA2であること明白且つ直接的に示す。
このように、ウイルス血症患者の血漿に見受けられるタンパク質はGIBsPLA2の分泌形態である。成熟タンパク質は、125aa(MW14138)、PI7.95、及び7つのジスルフィド架橋を有する。このタンパク質が、ウイルス血症患者の血漿においてIL−7pSTAT5核移行を阻害する異常MDMを誘導することを、市販の精製ブタGIBsPLA2を用いてインビトロで検証することができ、RIFがGIBsPLA2である、より具体的にはその分泌形態であるということがさらに確認されることができた。ヒトGIBsPLA2のアミノ酸配列は配列番号2として提供される。
[実施例9:PLA2sGIBはCD4リンパ球の不反応性(アネルギー)を誘導する]
実施例7は、PLA2sGIBがaMMDの誘導を介してリン酸化STAT5のIL−7誘導核移行(NT pSTAT5)の遮断を誘導することを示す。つまり、CD4Tリンパ球はIL−7に反応せず、HIV患者の血漿におけるこのサイトカインのレベルの高さにも関わらずその数は減少し、HIV感染患者の顕著な特徴であるCD4リンパ球減少をもたらす。
本明細書において、PLA2sGIBが、慢性的HIV感染患者のCD4リンパ球の他の特徴であるアネルギーの誘導にも関与するという可能性が調査された。
〔バイオアッセイ〕
MMD誘導
PLA2sGIBを含有するVP血漿をHDの精製CD4T細胞と共に培地でまずインキュベートした(20分)。細胞を、さらに10分間、ポリリジン被膜のガラススライドに配置し、そしてパラホルムアルデヒド(PFA、1.5%、37℃で15分、続いて室温で15分)で固定し、コレラ毒素B(CtxB−AF488)によって染色した。MMDをCW−STED顕微鏡でカウントした。
STATリン酸化及び核移行の阻害
PLA2sGIBを含有するVPの血漿を、IL−7による刺激(2nM、15分)の前に、HDの精製CD4T細胞と共にまずインキュベートした(20分)。細胞を、ポリリジン被膜のガラススライドに配置し、その後PFA(1.5%)による固定、メタノール(90%、−20℃)による透過処理をおこなった。pSTAT5をヤギ抗ウサギAtto642で標識されたウサギ抗STAT5によって染色し、FACS又はパルスSTED顕微鏡によって解析した。
〔結果〕
図10は、健康なドナー(HD)からのCD4リンパ球は、PLA2sGIB(ウイルス血症患者の血漿)への曝露後、IL−2誘導NTpSTAT5の阻害によって測定されるように、IL−2に反応不可能になることを示す。
阻害は3%血漿で全体的であり、1%血漿で非常に有意である(p<0.0001)。
さらに、PLA2sGIBに対するCD4CD25T調節性リンパ球の反応が調査された。結果は図10bに示される。示されるように、100%の健康な細胞がNTpSTAT5によってIL−2に反応する一方で、PLA2sGIB(ウイルス血症患者の1%血漿)はこのシグナル伝達機構を完全に阻害した。CD4CD25細胞は全CD4細胞の5%未満に相当するので、図10aに示されるデータに有意な影響を与えることはできない。
IL−7とIL−2とは、γcサイトカインファミリのメンバーである。このサイトカインに対する不反応性がγcに関与し得ることを確かめるため、IL−4に対する反応をテストした。pSTAT6のIL−4誘導NTを観察することでIL−4反応を測定した(図11)。結果は、IL−4反応がPLA2sGIBによって(3%血漿で完全に、1%血漿で大幅に)阻害されることを明白に示す。
従って、これらの結果は、γcファミリーのサイトカインによって誘導されるシグナリング機構がPLA2sGIBによって改変されることを示す。これは、HIV患者からのCD4リンパ球表面に自然に見受けられるaMMDにγc受容体鎖が完全に隔離されるという本願の発見と完全に合致する。
[実施例10:PLA2sGIBの組換え形態の活性]
本実施例において、種々の精製形態のPLA2sGIBタンパク質の活性をテストして、免疫系における、精製形態のこのタンパク質の作用をさらに検証し、その特異性をさらに検証した。
〔酵素アッセイ〕
アッセイは、Life Technologies社のEnz Check PLA2アッセイキット(番号:E102147)を用いておこなわれた。このアッセイでは、PLA2酵素活性の連続的且つ迅速なリアルタイムモニタリングが提供される。PLA2活性は、515nmの単一波の強度増大によって観察される。PLA2は、460nmの励起による515/575nmでの放出強度比における変化によって検出される。特定の活性は、秒毎、及び溶液における酵素のμg毎に取得される蛍光基質量(U)において表される。
〔結果〕
結果は以下の表2に示される。表2は組換えPLA2sGIBタンパク質の活性を示す。
結果は、大腸菌において産生された組換えヒトPLA2GIBが強力な酵素活性を示すことを表す。さらにまた結果は、大腸菌において産生された組換えブタPLA2GIBが組換えヒトPLA2GIBのものと類似する特定の活性を有することも示す。一方で、組換えPLA2GIIAとPLA2GIIDとは活性でなく、PLA2GXは非常に限定的な活性を有する。
このように、組換えPLA2GIBは、本発明において用いられる強力な活性剤に相当する。
[実施例11:CD4リンパ球におけるPLA2sGIBの作用はその酵素活性に関連する]
この実施例において、CD4リンパ球におけるPLA2sGIBの活性がPLA2sGIBの酵素(例えば触媒)活性に関連するか(例えばその結果であるか)を調査した。そうした酵素活性は、CD4リンパ球表面において複数のaMMDの形成をもたらす膜構造を改変し得る。
これらの実験において、48位における重要なヒスチジンがグルタミンに置換されたPLA2sGIBの突然変異体(突然変異体H48Q)をテストした。実施例10に記載の酵素テストを用いて、大腸菌において産生された組換えブタPLA2GIBの酵素活性を、これも大腸菌において産生された突然変異体H48Qの活性と比較した。各タンパク質を200μMで用いた。図12に示されるように、突然変異体はその酵素活性のすべてを失い、PLA2GIBにおける48位のヒスチジンの重要な役割を表す。
そしてバイオアッセイにおいて、野生型ブタPLA2GIBの活性をその突然変異体H48Qと比較した。図13に示される結果は、aMMDを誘導するか又はpSTAT5のIL−7誘導核移行(NTpSTAT5)を低減若しくは抑制するwtPLA2GIBの能力を突然変異体が失ったことを示す。
これらの結果は、酵素活性がCD4リンパ球におけるPL2GIBの病原的作用に関わることを示す。
[実施例12:抗GIBsPLA2抗体はHIVウイルス血症患者の血漿におけるCD4T細胞活性を回復する]
この実施例は、ウイルス血症患者の血漿において、GIBsPLA2がHDからのCD4リンパ球を、HIV感染患者の血液に特徴づけられるものに相当する「病気の」リンパ球に変えるということを提示する。この実施例は、抗GIBsPLA2抗体が病原性活性を有効に抑制することをさらに示す。
最初の一群の実験において、血漿を、ヒトGIBsPLA2に対するヤギ抗体か又は非関連抗原に対する2つの対照ヤギ抗体のいずれかで被覆されたセファロースビーズによって処理した。図14(a)は、抗GIBsPLA2抗体が血漿の活性を完全に排除又は除去し、HDからのCD4リンパ球における異常なMMDの誘導を不可能にしたことを明らかに示す。対照Iと対照IIとの抗体は作用を有しなかった。これらの実験を各血漿について3回繰返し、ウイルス血症患者からの3つの異なる血漿を調査した。
図14(b)は同じ結果を示す。ここでは血漿を上述のように処理したが、第2のバイオアッセイを用いて解析した。抗GIBsPLA2抗体で被覆されたセファロースビーズで処理された血漿は、IL−7誘導pSTAT5核移行を阻害しない。対照Iと対照IIのヤギ抗体は、IL−7誘導pSTAT5核移行を阻害するウイルス血症患者からの血漿の能力に影響を与えなかった。
第2の一群の実験において、特にヒトGIBsPLA2、PLA2GIIA、及びPLA2GIIDに対するウサギ中和抗体の作用をテストした。これらの抗体を、バイオアッセイ時に、血漿及び細胞と共にインキュベートした。取得結果は、異常MMDの誘導とIL−7誘導pSTAT5核移行の阻害とによって測定されるウイルス血症性血漿の作用を抗GIBsPLA2抗体が中和するということを示す。GIBsPLA2と密接に関連する2つのホスホリパーゼである分泌PLA2−GIIA又は分泌PLA2−GIIDに対する抗体が、このテストにおいて作用を有しないということは注目に値する。
これらの結果は、抗GIBsPLA2抗体がウイルス血症性血漿の免疫抑制作用を回復及び防止可能であるということを示す。また、これらの結果は、抗GIBsPLA2抗体が免疫不全を防止し、免疫不完全である対象の免疫反応を再刺激することができることを示す。
さらに、これらの結果は反応が特異的であることを示す。GIBsPLA2は検証された病原的作用に関連する唯一のエフェクターであり、ウイルス血症患者の血漿を特徴づける。
[実施例13:抗PLA2GIB抗体はCD4細胞におけるPLA2GIB作用を阻害する]
クローン化及び精製されたヒトPLA2GIBを、ウサギを免疫化するために用いた。対応する血清の免疫グロブリンフラクションを調製した。PLA2GIBの酵素活性を阻害するそれらの能力を放射性標識大腸菌膜において測定した。活性免疫グロブリンフラクションを、健康なドナーの血液から精製されたCD4リンパ球を含むバイオアッセイに加えた。そして、クローン化及び精製された分泌PLA2(GIB、GIIA、GIID、及びGX)を続いて培養物に添加した。対照として、種々の分泌PLA2で免疫化されたウサギから調製された免疫グロブリンフラクションが用いられた。
図15は、異なる濃度のポリクローナル抗体がaMMDの誘導を阻害し(図15a)、IL−7誘導NTpSTAT5を遮断する(図15b)ことを示す。この活性は、抗PLA2GIB抗体を含有する、1μg/ml〜100μg/mlの免疫グロブリンから取得可能である。PLA2GIIA、PLA2GIID、又はPLA2GXに対する抗体はバイオアッセイにおいて作用を示さなかったため、この活性は完全に特異的である(図15a及び図15b)。
これらの結果は、PLA2GIBの阻害が、免疫不全を処置し且つCD4活性を回復するために用いられ得ることをさらに示す。
[実施例14:可溶性PLA2GIB受容体はCD4T細胞におけるPLA2GIB作用を阻害する]
PLA2GIBの阻害剤が治療効果を提供可能であることをさらに提示するため、PLA2GIB受容体の可溶性形態をテストした。
最初の一群の実験において、以下のアミノ酸配列(配列番号22)を有するPLA2GIBに特異的な可溶性マウス受容体を用いた。
MVQWLAMLQLLWLQQLLLLGIHQGIAQDLTHIQEPSLEWRDKGIFIIQSESLKTCIQAGK
SVLTLENCKQPNEHMLWKWVSDDHLFNVGGSGCLGLNISALEQPLKLYECDSTLISLRWH
CDRKMIEGPLQYKVQVKSDNTVVARKQIHRWIAYTSSGGDICEHPSRDLYTLKGNAHGMP
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SSRICYQFNLLSSLSWNQAHSSCLMQGGALLSIADEDEEDFIRKHLSKVVKEVWIGLNQL
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NHTAQGILEKDSWKYHATHCDPDWTPFNRKCYKLKKDRKSWLGALHSCQSNDSVLMDVAS
LAEVEFLVSLLRDENASETWIGLSSNKIPVSFEWSSGSSVIFTNWYPLEPRILPNRRQLC
VSAEESDGRWKVKDCKERLFYICKKAGQVPADEQSGCPAGWERHGRFCYKIDTVLRSFEE
ASSGYYCSPALLTITSRFEQAFITSLISSVAEKDSYFWIALQDQNNTGEYTWKTVGQREP
VQYTYWNTRQPSNRGGCVVVRGGSSLGRWEVKDCSDFKAMSLCKTPVKIWEKTELEERWP
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LLHSKFNWTQERQFWIGFNRRNPLNAGSWAWSDGSPVVSSFLDNAYFEEDAKNCAVYKAN
KTLLPSNCASKHEWICRIPRDVRPKFPDWYQYDAPWLFYQNAEYLFHTHPAEWATFEFVC
GWLRSDFLTIYSAQEQEFIHSKIKGLTKYGVKWWIGLEEGGARDQIQWSNGSPVIFQNWD
KGREERVDSQRKRCVFISSITGLWGTENCSVPLPSICKRVKIWVIEKEKPPTQPGTCPKG
WLYFNYKCFLVTIPKDPRELKTWTGAQEFCVAKGGTLVSIKSELEQAFITMNLFGQTTNV
WIGLQSTNHEKWVNGKPLVYSNWSPSDIINIPSYNTTEFQKHIPLCALMSSNPNFHFTGK
WYFDDCGKEGYGFVCEKMQDTLEHHVNVSDTSAIPSTLEYGNRTYKIIRGNMTWYAAGKS
CRMHRAELASIPDAFHQAFLTVLLSRLGHTHWIGLSTTDNGQTFDWSDGTKSPFTYWKDE
ESAFLGDCAFADTNGRWHSTACESFLQGAICHVVTETKAFEHPGLCSETSVPWIKFKGNC
YSFSTVLDSRSFEDAHEFCKSEGSNLLAIRDAAENSFLLEELLAFGSSVQMVWLNAQFDN
NNKTLRWFDGTPTEQSNWGLRKPDMDHLKPHPCVVLRIPEGIWHFTPCEDKKGFICKMEA
GIPAVTAQPEKGLSHSIVPVTVTLTLIIALGIFMLCFWIYKQKSDIFQRLTGSRGSYYPT
LNFSTAHLEENILISDLEKNTNDEEVRDAPATESKRGHKGRPICISP
阻害剤を、100nMの濃度で、実施例9に記載のバイオアッセイにおいてテストした。結果を図16に示す。これらの結果は、組換えPLA2可溶性受容体が強力なアンタゴニストとして用いられることができることと、そうした分子がpSTAT5のNTにおけるPLA2sGIBの負の作用を有意に遮断可能であることとを示す(図16)。
類似の結果が、配列番号25又は配列番号28の配列を含むPLA2GIB結合ポリペプチドを用いるさらなる実験一式において取得されることができる。
[実施例15:GIBsPLA2の過剰発現は免疫学的不全を誘導する]
ウイルス負荷を低下させる高活性の抗レトロウイルス治療(HAART)も大部分の患者においてCD4T細胞数の増加をもたらすことが以前に示されている。しかしながら、一部の患者においては、HIVが検出不可能になるにも関わらず、CD4T細胞数は増加しない。この臨床的状態を以前に研究し、CD4無反応者(CD4 Non Responder、CD4−NR)と称されるこれらの患者におけるCD4Tリンパ球個体群の強力且つ持続的な欠陥の発見を示した。
図17は、CD4−NR患者の血漿が、対照としてのウイルス血症患者の血漿よりもPLA2GIB活性を含むということを示す。これは、細胞毎の異常なMMDの誘導によってまず測定された。これらのデータはまた、IL−7誘導pSTAT5核移行を阻害する能力を測定することによっても確認された。
全体として、結果は、CD4−NR患者の血漿がウイルス血症患者からの血漿よりも100倍のPLA2GIB活性を含むことを示す。
〔検討〕
結果において、PLA2GIBは、IL−2(アネルギー)やIL−7(CD4リンパ球減少の中心機構)に反応できないことを含む、ウイルス血症患者からのCD4T細胞を特徴づける免疫抑制と類似の免疫抑制を誘導することが示される。それゆえ、HIV感染時のGIBsPLA2の発現は、これらの患者を特徴づける免疫疾患の病態生理における中心の役割を果たす。これらの欠陥は、HIV患者からのCD8Tリンパ球が異常なMMDを示さず、IL−7に反応し続けることから(図示せず)、細胞型特異的である。PLA2GIBの作用モードは、おそらくは酵素活性の結果である。CD4リンパ球の膜を攻撃することによって、その流動性を改変し、異常且つ非常に大きいMMDをおそらくは形成させる。
炎症反応はHIV感染時に重要な役割を果たす。しかしながら、HIV発病におけるその正確な役割は解明されるべきものとして残る。これらのデータを考慮すると、HIV感染がGIBsPLA2を含む極めて特有のタイプの炎症を誘導すると仮定可能である。さらに、PLA2GIB誘導後に、その分泌が通常の調節過程へと逃げて、慢性的な産生と、CD4Tリンパ球機能不全の直接的な結果である免疫障害とをもたらすと推定することができる。CD4Tリンパ球機能不全の非直接的な結果として、他の欠陥も観察される。例として、インターフェロンγ産生の減少は、単球・マクロファージとナチュラルキラーとの機能を低下させる。
血漿PLA2GIB活性の回復と種々の群の患者の特性との間の相関関係も非常に参考になる。「HIVコントローラ」は、検出不可能なウイルス負荷と準正常のCD4T細胞数を数年にわたって維持する非常に希な患者である。本結果は、HIVコントローラがその血漿においてPLA2GIB活性を発現しないことを示す。一方で、大部分の患者において、この酵素は発現され、免疫疾患をもたらす炎症の負の面を表す。全体として、PLA2GIBがHIV感染の病態生理における非常に重要なパラメータであることを明らかにされる。
HAARTのウイルス負荷の減少は、CD4数の増加を含む免疫回復により理解される。この処置の時、PLA2GIB活性は患者の血漿において消滅する。HAARTは炎症反応を低下させると考えられることから、PLA2GIBはこれらの炎症過程の一部であるということがさらに示唆される。さらに重要なことに、本明細書においては、HAARTがウイルス負荷をコントロールするものの非常に低いCD4数であるCD4−NR患者の場合が記載される。こうした人々に見受けられるPLA2GIBの過剰発現は、この臨床状態を特徴づける免疫疾患の持続性を明らかにし得る。故に、HAART後に、免疫回復をもたらすPLA2GIB産生の低下と免疫疾患の不可逆性をもたらす持続的なその過剰発現との強力な相関関係が存在する。
本発見の治療的結果と利用とは甚大なものである。PLA2GIBの阻害は、HIV患者、そしてより一般的には免疫抑制対象の免疫疾患の防止と治癒とに実際に使用され得る。PLA2GIB阻害剤は、感染の早期に適用されると、患者をHIVコントローラの状態に導く。より遅くに、単独、又はHAARTと併せて若しくはHAARTに替えての少なくとも一方で適用すると、PLA2GIB阻害剤はCD4Tリンパ球機能の回復を速め、宿主防御を促進することで、他の多くのウイルス性慢性感染のようにウイルスと免疫系との均衡状態をもたらす。故に、PLA2GIB阻害剤は、異常な免疫反応又は活性に関連する疾患の処置に単独又は併用で使用される非常に強力な薬剤である。またPLA2GIB阻害剤は、HAARTをおこなわないようにでき、深刻である有害な影響で知られるその処置を中断させ得る。
さらに、(対応する遺伝子のノックアウトマウスにおけるような)GIBsPLA2発現の欠如は耐性良好であることから、阻害剤を用いるか又はワクチン接種を介したGIBsPLA2の一時的又は永続的な抑制は、免疫疾患、特にHIV患者の強力且つ効果的な免疫療法である。
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Claims (11)

  1. 免疫不全の対象を治療するために用いる薬物を製造するためのGIBsPLA2阻害剤の使用であって、
    前記GIBsPLA2阻害剤は、(i)抗GIBsPLA2抗体、(ii)GIBsPLA2の遺伝子配列に基づく阻害性核酸分子、又は(iii)可溶性GIBsPLA2受容体から選択される、使用。
  2. 前記抗GIBsPLA2抗体は、(i)抗GIBsPLA2ポリクローナル抗体、(ii)抗GIBsPLA2モノクローナル抗体、(iii)F(ab’)2及びFabフラグメント、一本鎖可変フラグメント(scFvs)、及び単一ドメイン抗体フラグメント(VHH又はナノボディ)から選択される(i)又は(ii)の抗体のフラグメント、又は(iV)2価抗体フラグメント(ダイアボディ)から選択される、請求項1に記載の使用。
  3. 前記抗GIBsPLA2抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項1又は2に記載の使用。
  4. 前記GIBsPLA2遺伝子配列に基づく阻害性核酸分子は、アンチセンス核酸又は短鎖干渉RNA(siRNA)である、請求項1に記載の使用。
  5. 免疫不全は、ウイルス又は細菌の感染により引き起こされる免疫不全である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の使用。
  6. 前記対象はウイルス感染性疾患を有する、請求項5に記載の使用。
  7. 前記薬物は、HIV感染対象におけるAIDSの処置に使用するための薬物である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用。
  8. 前記薬物は、HIV性免疫不全を抑制又は回復するための薬物である、請求項7に記載の使用。
  9. 前記対象はがんである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の使用。
  10. 前記阻害剤は、筋肉内、皮下、経皮、静脈内若しくは動脈内注射による投与、経鼻、経口、経粘膜、経直腸投与、又は吸入により投与される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の使用。
  11. (i)抗GIBsPLA2抗体、(ii)GIBsPLA2の遺伝子配列に基づく阻害性核酸分子、又は(iii)可溶性GIBsPLA2受容体から選択されるGIBsPLA2阻害剤と、注射可能な液剤又は懸濁剤に適する薬学的に許容される担体又は賦形剤とを注射可能な液剤又は懸濁剤の形態で含む、免疫不全を治療するために用いられる医薬組成物。
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