TW201938585A - 阿茲海默氏症之新abeta變體、測定、方法及治療 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及新的abeta免疫原變體，其藉由產生針對阿茲海默氏症患者腦中的寡聚和毒性abeta沈積物的特異性抗體能夠有效治療阿茲海默氏病患者。本發明還涉及測定，所述測定藉由評估和監測對主動免疫療法的滴度應答能夠有效治療阿茲海默氏病患者，並且能夠治療和鑒定阿茲海默氏病患者的特定亞群。

Description

阿茲海默氏症之新abeta變體、測定、方法及治療
本發明涉及新的abeta免疫原變體，其藉由產生針對阿茲海默氏症患者腦中的寡聚和毒性abeta沈積物的特異性抗體能夠有效治療阿茲海默氏症患者。本發明還涉及測定，所述測定藉由評估和監測對主動免疫療法的滴度應答能夠有效治療阿茲海默氏症患者，並且能夠治療和鑒定阿茲海默氏症患者的特定亞群。
類澱粉蛋白β（abeta）指示涉及阿茲海默氏症（AD）的、長度在1-39至1-43個胺基酸之間的肽。abeta的腦和腦血管積累被廣泛接受為AD中的關鍵神經病理學事件。AD的主要特徵實際上是類澱粉斑塊，主要由abeta聚集體以及血管水平的abeta沈積形成，也稱為腦類澱粉血管病，源於β-和γ-分泌酶對類澱粉先質蛋白（APP）進行的蛋白質水解。
多種機制似乎對這些積累的形成負責，其中包括有毒聚集體清除系統的故障或腦水平的細胞防禦系統的故障。定義為“類澱粉蛋白修飾療法”的治療方法，特別是建立於主動和被動免疫的那些，正是基於這些機制的可能的恢復和增強。
已經在臨床試驗中在AD患者中測試了針對abeta的被動免疫療法。經測試的抗體例如阿杜單抗（aducanumab）和巴匹珠單抗（bapineuzumab）結合abeta的N-末端表位，並代表兩種非常不同的治療結果。
阿杜單抗在開始的3-9個胺基酸處結合abeta，但僅在寡聚化和聚集形式的abeta中結合，並且與單體abeta形式沒有或幾乎沒有可檢測的結合。阿杜單抗藉由顯示減少的abeta負載和顯著的有益效果在臨床試驗中示出有希望的效果。通常認為可溶性abeta寡聚體而不是單體或斑塊可能是主要的毒性物質。考慮到abeta斑塊可能是abeta寡聚體的來源，用阿杜單抗治療可能減緩由斑塊釋放abeta寡聚體，並且從而限制它們對神經元的毒性作用。實際上，用阿杜單抗慢性給藥18個月大的Tg2576轉基因小鼠導致腦中神經炎鈣超載的正常化。其他研究已將神經元和小神經膠質細胞中的鈣穩態失衡與abeta寡聚體與代謝型受體的結合聯繫起來。阿杜單抗與可溶性abeta寡聚體的結合可以防止它們與那些受體的相互作用，從而防止膜去極化的不利影響。該功能終點的恢復表明，阿杜單抗治療可以對認知缺陷潛在的神經元網路功能產生有益的效果（Jeff Sevigny等人, 2016, Nature [自然], 第50-56頁）。
巴匹珠單抗以高親和力結合abeta胺基酸1-5和abeta的單、寡聚體兩者和聚集形式。儘管在APOE ε4攜帶者中觀察到生物標誌物的治療差異，但巴匹珠單抗（bapineuzumab）並未改善阿茲海默氏症患者的臨床結果。接受巴匹珠單抗的患者報告了一些安全性發現（Salloway等人, N Engl J Med [新英格蘭醫學期刊] 2014;370:322-33）。
本發明的諸位發明人揭露了在分子的N-末端部分含有另外的胺基酸（例如甲硫胺酸）的新免疫原變體（Met-var24和X-var24），其以不可預見的方式改變了誘導的抗體應答的性質，並且提供了新的功能優點。特別地，這些變體能夠結合阿杜單抗（目前唯一的臨床成功的抗體候選物），與特異性寡聚毒性形式的abeta結合，並且進一步提供了變體可誘導阿杜單抗樣抗體產生的證據。
沒有預見到N-末端甲硫胺酸在抗體應答中起重要作用，因為許多免疫原和疫苗傾向於避免這種“外源”胺基酸，並試圖盡可能地模擬天然型式。
從重組藥物蛋白中去除翻譯起始物N-甲醯基-甲硫胺酸或甲硫胺酸通常對其功能和穩定性至關重要，例如見於人血紅蛋白，白細胞介素-2或生長激素（Busby Jr.等人. 1987, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 262: 8532-8536；Boix等人.1996, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 257: 992-1007；Varshavsky 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. [美國科學院院報] 93: 12142-12149；Adachi等人. 2000. Protein Expr. Purif. [蛋白質表現與純化] 20: 37-44；Endo等人. 2001. Biochemistry [生物化學] 40: 914-919）。
在多肽的N-末端摻入甲硫胺酸殘基在大腸桿菌和其他原核細胞中是翻譯起始訊號的一部分。然而，起始物tRNA攜帶的甲硫胺酸殘基在摻入之前是N-甲醯化的。一旦製成，許多細菌蛋白經受翻譯後修飾反應，所述反應順序除去大腸桿菌中的甲醯基基團和末端甲硫胺酸殘基，使得在大腸桿菌中僅在細胞質中發現的一部分多肽鏈保留其甲硫胺酸。在大腸桿菌的胞質提取物中，僅40%的多肽鏈保留了N-末端甲硫胺酸。反而，約50%在其N-末端展示丙胺酸、絲胺酸或蘇胺酸。一些研究指示，甲硫胺酸去除的延長似乎取決於倒數第二個胺基酸的側鏈長度（Hirel等人, Proc. Natl. Acad. Sci. [美國科學院院報], 第86卷, 第8247-8251頁）。
重要的是在大腸桿菌中表現的外源基因具有較小的去除甲硫胺酸的傾向。由於另外的甲硫胺酸，這些添加了N-末端甲硫胺酸的多肽與原初人序列不同。一種這樣的產品，甲硫胺醯基（人）生長激素已在臨床上使用。然而，由於經修飾的人蛋白具有潛在的免疫原性，已經做出了相當大的努力來生產沒有末端甲硫胺酸，並且可以使用若干種不同的策略的治療產品。
一種策略係採用使用甲硫胺酸作為連接的載體，其可以在重組多肽和細菌載體肽之間特異性切割，產生沒有N-末端甲硫胺酸的終產物。該方法已用於生產胰島素，其中溴化氰用於在甲硫胺酸殘基處切割多肽鏈。
另一種策略可以是使用大腸桿菌蛋白輸出系統的部分來產生rDNA衍生的產物，所述產物不僅不含N-末端甲硫胺酸，而且還被輸出到周質空間。許多細菌分泌的蛋白質被合成為先質蛋白，先質蛋白含有另外的在穿膜期間被切割的疏水性N-末端訊號序列。該系統已用於使用大腸桿菌生產沒有末端甲硫胺酸的人生長激素（Polypeptide Protein Drugs [多肽蛋白質藥物 ], R. Hider和D. Barlow, 艾理斯霍伍德有限公司（Ellis Horwood Ltd）, 1991, 第91-92頁）
另外，已報導有效的策略可以是使用重組甲硫胺酸胺肽酶來還原大腸桿菌產生的多肽的N-末端甲硫胺酸（Liao YD等人, Protein Sci. [蛋白質科學] 2004；13:1802-1810；Shapiro等人. 1988. Anal. Biochem. [分析生物化學] 175: 450-461；Notomista等人. 1999. FEBS Lett. [FEBS快報] 463: 211-215）。也可以使用蛋白質酶，例如藉由在靶標蛋白質前引入蛋白質酶特異性寡肽，然後在體外藉由對應的蛋白質酶除去，例如因子Xa、腸激酶和組織蛋白質酶C（Belagaje等人. 1997. Protein Sci. [蛋白質科學] 6: 1953-1962）。
因此，本發明之目的係提供保留N-末端甲硫胺酸（Met-var24）的免疫原變體。
能夠評估β類澱粉蛋白沈積和效應的常用技術係使用PET和MRI的成像技術。然而，這些技術非常昂貴，尚未被完全驗證並在臨床常規中得到承認，需要高品質的人員和特定儀器，並不指示真正的生物應答，並且因此僅在例外的情況下並伴隨化學物理研究使用。本發明的另一個目的係提供一種體外方法，用於在用Met-var24或X-var24免疫受試者時檢測針對abeta類澱粉蛋白的相關抗體，以提供治療指導並選擇正確的個體用於繼續治療。
諸位發明人已發現新的abeta免疫原構建體，其在AD患者中產生識別寡聚和聚集形式的abeta的抗體。這些免疫原由穿插有破傷風表位P2和P30（SEQ ID NO: 1 ）的3個拷貝的N-末端abeta胺基酸1-12，以及添加到第一個拷貝的abeta（SEQ ID NO: 2 和 3 ）中的額外的N-末端胺基酸（例如甲硫胺酸）構成。實際上，不希望受理論束縛，諸位發明人已經發現向var24的N-末端添加甲硫胺酸（Met-var24）導致免疫原具有誘導針對寡聚和聚集的abeta（例如，abeta的病原形式）的抗體（特別是並且不是“游離N-末端abeta”反應性抗體）的能力，從而提供比沒有甲硫胺酸的var24更有效的AD治療。進一步設想在一些實施方式中，額外的N-末端胺基酸可以是除甲硫胺酸之外的另一種胺基酸（稱為“X”（X-var24）並且在下文中定義）。
本發明的一個目的係用有效量的Met-var24或X-var24治療患有阿茲海默氏症的患者的方法。
本發明的另一方面係藉由用有效量的Met-var24或X-var24進行治療來治療患有阿茲海默氏症的患者之方法，其中所述患者在用Met-var24或X-var24進行早期治療後示出產生如本發明所定義的有益的抗體滴度應答。
本發明還基於阿茲海默氏症患者中的抗體滴度水平的檢測，所述患者已經接受了一種或多種採用Met-var24或X-var24的免疫療法，所述檢測藉由從所述患者獲得血漿樣品並在本發明的免疫測定或放射免疫測定中評估滴度進行。
諸位本發明人還可以藉由在測定（例如ELISA或MSD）中評估滴度來量化Met-var24或X-var24治療的患者的治療應答。藉由本發明之方法，可以由此評估藉由主動免疫產生的抗體的品質，從而能夠有效監測療法並確定何時或誰將獲益於繼續免疫或提供給藥方案。
本發明的一個方面係用於定量來自阿茲海默氏症患者的抗體之體外方法，該方法包括如下步驟
a) 從患者取血漿樣品，
b) 在本發明的免疫測定中分析該血漿樣品。
本發明的另外的方面涉及Met-var24、X-var24、寡聚和/或聚集的abeta或所述abeta的片段在免疫測定中用以確定用Met-var24或X-var24治療的患者的治療應答的用途。
在仍另外的方面，本發明涉及Met-var24、X-var24、寡聚和/或聚集的abeta或所述abeta的片段，用於確定用Met-var24或X-var24治療的阿茲海默氏症患者的治療應答。
本發明的諸位發明人首次提供了意圖用於在針對abeta主動免疫後檢測寡聚特異性抗體的產生的靈敏性且具有預測性的方法。本發明還涉及新的abeta分子、Met-var24和X-var24，其為AD患者提供有希望的治療。不希望受理論束縛，諸位發明人已經發現向var24的N-末端添加Met使免疫原獲得誘導針對寡聚和聚集的形式的abeta（例如，特別是病原形式的abeta）的抗體的能力，從而提供比沒有甲硫胺酸的var24構建體更有效的AD治療。實際上，如實例1中示出的，來自用Met-var24免疫的AD患者的血漿具有對寡聚形式的abeta特異的抗體，所述抗體不結合單體abeta並且具有非常接近於BS阿杜單抗的特徵。相反，沒有N-末端殘基（例如包含N-末端abeta殘基1-28或1-12）的構建體具有更接近於BS巴匹珠單抗的特徵，並且更多地針對單體abeta。
在下文以及在申請專利範圍中將描述本發明的實施方式。
I. Var24構建體和製劑
使用var24構建體的主動免疫療法包括穿插有破傷風類毒素表位P30（粗體）和P2（斜體）的abeta1-12的三聚體，如SEQ ID NO: 1 、 2 和3 中示出的。還可以額外地存在N-末端胺基酸；在SEQ ID NO: 2 中，N-末端胺基酸係甲硫胺酸（Met-var24），在SEQ ID NO: 3 中，N-末端胺基酸可以是如下定義的胺基酸（X-var24）。
Var24（SEQ ID NO: 1 ）
DAEFRHDSGYEVFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE DAEFRHDSGYEVQYIKA NSKFIGITEL DAEFRHDSGYEV
Met-var24（SEQ ID NO: 2 ）
MDAEFRHDSGYEVFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE DAEFRHDSGYEVQYIKA NSKFIGITEL DAEFRHDSGYEV
X-var24（SEQ ID NO: 3 ）
XDAEFRHDSGYEVFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE DAEFRHDSGYEVQYIKA NSKFIGITEL DAEFRHDSGYEV
X = 胺基酸，較佳的是天然胺基酸，並且甚至更較佳的是親水殘基，例如Ser（S）、Thr（T）、Asn（N）、和Gln（Q）；脂肪族殘基，例如Gly（G）、Ala（A）、Val（V）、Leu（L）、和Ile（I）；或非極性殘基，例如Cys（C）和Pro（P）。
Met-var24和X-var24可以藉由注射，例如皮下、皮內或肌內注射腸胃外給予。較佳的是，將Met-var24或X-var24給予1、2、3或4次或更多次。
劑量範圍約為每次免疫療法數百微克活性成分，較佳的範圍為從約5 µg至2,000 µg（雖然如此，也考慮了在1-10 mg範圍內的更高的量），例如在從約50 µg至1,000 µg的範圍內，較佳的是在從約100 µg至500 µg的範圍內，並且尤其是在從約200 µg至500 µg的範圍內。用於初始給予和加強注射的合適方案也是可變的，但典型的是初始給予，隨後是後續接種或其他給予。
如果免疫構建體進一步包含佐劑物質，則可以增強Met-var24和X-var24的免疫應答。已知各種實現疫苗佐劑效應的方法。一般原理和方法詳述於“The Theory and Practical Application of Adjuvants [佐劑的理論與實踐應用]”, 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull（編輯）, 約翰威利父子公司（John Wiley & Sons）, ISBN 0 -471-95170-6，並且也詳述於“Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants [疫苗：新一代免疫佐劑]”, 1995, Gregoriadis G等人.（編輯）, Plenum出版社，紐約，ISBN 0-306-45283-9，兩者均藉由引用併入本文。
佐劑的應用包括使用例如氫氧化鋁或磷酸鹽（明礬）的試劑，通常以緩衝鹽水中0.05%至0.1%的溶液使用，與糖的合成聚合物（例如Carbopol®）共混。其他的佐劑可以是AS01（包含MPL、脂質體和QS21）、ISS（包含寡核苷酸）、QS-21 Stimulon®（包含皂苷）、AS02（包含MPL、水包油乳劑和QS-21）、IC31®（包含肽和寡核苷酸）、CAF01（包含脂質體）、dmLT（包含脫毒的蛋白質）、鞭毛蛋白（包含連接至抗原的鞭毛蛋白）、ISCOMATRIX®（包含ISCOM（皂苷 + 膽固醇 + 磷脂）、Matrix-M™（包含ISCOM（皂苷 + 膽固醇 + 磷脂）、MPL-SE（包含MPL和水包油乳劑）PCPP（包含合成聚電解質）、和PLG（包含聚合微粒）。
可注射劑能以常規形式製備，可以是液體溶液或懸浮液；適於在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形式或乳劑。
合適的賦形劑係例如水、鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。此外，必要時，待給予的藥物組成物還可含有少量無毒助劑物質，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、增溶劑和其他此類試劑，例如像乙酸鈉。
賦形劑可包括胺基酸，例如精胺酸、天冬胺酸、甘胺酸、谷胺酸、賴胺酸、和脯胺酸；抗氧化劑，例如抗壞血酸、EDTA、和蘋果酸；蛋白質，例如白蛋白和明膠；糖類/糖，例如醇、蔗糖、海藻糖、乳糖、右旋糖、甘油、山梨糖醇和甘露醇，以及表面活性劑例如Tween。
組成物的腸胃外給予包括靜脈內、皮下和肌內給予。腸胃外給予的製劑包括準備用於注射的無菌溶液、無菌的乾可溶性產品，例如凍乾的粉末（使用前現與溶劑或無菌溶液組合）。溶液可以是水性的或非水性的。
如果靜脈內給予，合適的載體包括生理鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水，以及含有增稠劑和增溶劑（例如葡萄糖、聚乙二醇、和聚丙二醇及其混合物）的溶液。
用於腸胃外製劑的藥學上可接受的載體包括水性運載體、非水性運載體、抗微生物劑、等滲劑、緩衝液、抗氧化劑、局部麻醉劑、懸浮劑和分散劑、乳化劑、螯溶（sequestering）劑或螯合（chelating）劑和其他藥學上可接受的物質。
水性運載體的實例包括氯化鈉注射液、林格氏（Ringers）注射液、等滲右旋糖注射液、無菌水注射液、右旋糖和乳酸林格氏注射液。非水性腸胃外運載體包括植物來源的非揮發油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。必需將抑細菌或抑真菌濃度的抗微生物劑添加至包裝在多劑量容器中的腸胃外製劑中，所述多劑量容器包括酚類或甲酚類、汞、苄醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、羥基氯苯胺和氯化本索寧。等滲劑包括氯化鈉和右旋糖。緩衝液包括磷酸鹽和檸檬酸鹽。抗氧化劑包括硫酸氫鈉。局部麻醉劑包括鹽酸普魯卡因。懸浮劑和分散劑包括羧基甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素和聚乙烯吡咯啶酮。乳化劑包括聚山梨酯80（TWEEN® 80）。金屬離子的螯溶劑或螯合劑包括EDTA。藥物載體還包括用於水混溶性運載體的乙醇、聚乙二醇和丙二醇以及用於pH調節的氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。
調節藥學上活性化合物的濃度，使注射提供有效量以產生希望的藥理學作用。
將單位劑量腸胃外製劑包裝在安瓿、小瓶或帶針頭的注射器中。如本領域已知和實踐的，腸胃外給予的所有製劑必須是無菌的。
設想Met-var24的最終藥物組成物含有基本上純的Met-var24，而沒有N-末端var24的任何其他變體，例如var24或X-var24。在一些實施方式中，var24的N-末端甲硫胺酸變體的90%或更多，例如像N-末端Var24變體（例如var24或X-var24）總量的95%、98%、99%或甚至100%係Met-var24，這些變體可以在大腸桿菌過程和隨後的加工和純化期間製備，得到藥物組成物。
II. 患者治療和監測
本發明涉及藉由用有效量的Met-var24或X-var24治療所述患者來治療患有阿茲海默氏症（AD）的患者之方法。
根據一個實施方式，治療藉由皮下或肌內給藥進行。
根據一個實施方式，本發明涉及患者的亞群，特別是AD患者，其藉由在用Met-var24或X-var24治療時產生高於1.000的滴度來鑒定。所述滴度可以是終點滴度，即免疫後測量的最高滴度（其最大值因受試者而不同，但典型地在開始的大約2-3週內發生）。在某些實施方式中，患者可以是已經接受破傷風毒素早期免疫或包含P2（QYIKA NSKFIGITEL）和/或P30（FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE）的免疫構建體的患者。可替代地，可以在用Met-var24或X-var24治療之前用破傷風毒素或包含P2和/或P30的免疫構建體免疫患者。
根據實施方式，藉由評估來自患者的樣品的誘導滴度或IC50進行用Met-var24或X-var24治療的治療效果的評估。根據一個實施方式，在患者用Met-var24或X-var24治療1、2、3、4或更多次後進行評估。
該評估係根據在包括以下步驟的免疫測定中進行的另外的實施方式
在適當的結合條件下，應用免疫測定中的、從根據本發明的患者獲得的樣品，並測量抗體滴度或IC50。
術語“樣品”係指從受試者分離的組織或流體樣品，包括但不限於例如血漿、血清、脊髓液、全血或任何血液部分。特別地，樣品可以呈從本發明的患者獲得的血液樣品、血漿樣品或血清樣品的形式。較佳的是，樣品係血漿樣品。根據實施方式，樣品可用於確定抗體應答的滴度水平，其中滴度表示為在本文揭露的測定中仍然給出陽性結果的最大稀釋度（在連續稀釋度中）的倒數。ELISA係確定抗體滴度的常用手段。
在一個實施方式中，如果抗體滴度和/或IC50在免疫患者中示出誘導了有益的抗體應答則患者的免疫療法繼續，並且如果滴度和/或IC50在所免疫患者中示出缺乏有益的抗體應答則停止免疫療法。
根據一個實施方式，指示有益的抗體應答的樣品的IC50在約200至約1000 pM的範圍內，並且因此更高的IC50表明無益的抗體應答。可替代地，滴度本身可用於定義有益應答，並且設想滴度高於1.000，例如高於5.000、例如高於10.000、高於20.000、高於30.000、高於40.000、高於50.000或高於80.000指示有益的應答，而低於1.000的滴度指示沒有應答。
本發明還涉及藉由用有效量的Met-var24進行治療來治療患有阿茲海默氏症的患者的方法，其中所述患者在用Met-var24進行早期治療後示出產生滴度應答，該應答包含如上文所揭露的有益的抗體應答。
本發明中術語“阿茲海默氏症”（或縮寫的“AD”）旨在意指在CSF中存在類澱粉蛋白和τ以及神經退行性變化（藉由MR掃描、神經原纖維素（neurofilament light）、神經絲和/或τ的CSF測量來評估）的患者。臨床表現包括失智的輕度症狀（認知和功能惡化），還包括患有失智前（意指患者具有認知障礙但沒有顯著的功能惡化）的患者。可以設想某些患者將沒有可測量的認知障礙跡象，但是在CSF中存在病理性減少的類澱粉蛋白和病理性增加的τ，在腦類澱粉蛋白PET中視需要為陽性（National Institute Aging NIA-AA Research Framework: Towards a Biological Definition of Alzheimer’s Disease [國立研究所老齡化NIA-AA研究框架：阿茲海默氏症的生物學定義], 2017）。
根據一個實施方式，如最新的FDA draft Guidance for Industry: Early AD [FDA工業指南草案：早期AD]所定義的，本發明的AD患者被定義為階段0、1、2和3，並且根據最新的NIA-AA Research Framework for AD[NIA-AA AD研究框架]（2018），僅包括滿足類澱粉蛋白和τ兩者生物標誌物陽性要求的患者。AD階段0、1、2和3的人群與臨床前AD（具有主觀認知損傷）和由於AD的MCI一致，如EMA Guideline [EMA指南]中關於用於治療阿茲海默氏症的藥物的臨床研究中所定義的。
針對類澱粉蛋白abeta的生物標誌物可以是陽性類澱粉蛋白PET掃描物（使用例如PET示蹤物18F -flutemetamol（Palmquist等人, 2015, Neurology [神經病學], 1240-1249），並且CSF生物標誌物可以是類澱粉蛋白-β 1-42和總-τ或磷酸化-τ（Palmquist等人, 2015, Neurology [神經病學], 1240-1249；Olsson等人, 2017 Exp. Rev. of Neurot. [神經病學實驗評論], 第17卷, 第8期, 767-775）。可以使用Clinical Dementia Rating (CDR)-Global score of 0.5 [臨床失智量表（CDR）-全球評分0.5]來評估認知衰退的歷史（Marcel等人, 2011, Am J of Alzheimer’s Disease & Other Dementias [美國阿茲海默氏症和其他失智症雜誌], 26(5) 357-365；O'Bryant等人, 2010, Arch Neurol.[精神病學檔案] 6月；67(6): 746-749）或細微精神狀態檢查（MMSE）高於24（Perneczky等人, 2006, Am J Geriatr Psychiatry [美國老年精神病學雜誌] 14:2, 2月）。
根據一個實施方式，患者接受50 µg、100 µg、250 µg、500 µg或1000 µg Met-var24的劑量。根據另一個實施方式，患者可以接受2個同時劑量的250 µg Met-var24，例如每肩中250 µg Met-var24的一個劑量。使用較高劑量的Met-var24在不同位置免疫的優點係它可以減少局部反應，例如在一些臨床前研究中觀察到的發紅、腫脹和水腫。
重點係設計一種分子，該分子具有利用預先存在的破傷風肽（P2和P30）特異性記憶T細胞庫以增強AD患者的老年人群中的抗體應答的潛力。有充分文件證明外周原始T-細胞群隨年齡增加而減少，而記憶和終末分化T細胞數量增加。Met-var24或X-var24展示破傷風衍生肽P2和P30，因此設計用於原始和記憶T細胞的有效應答。在破傷風疫苗接種的老年人群中，對Met-var24或X-var24的應答可能會增加。在用例如Met-var24進行免疫療法之前，用破傷風或僅P2或P30表位進行加強免疫也可以增強對Met-var24的應答。藉由用例如P30加強，原始T細胞可以被激活，並且由於免疫系統的衰老，這對於具有較低比例的預期應答者的老年人可能是特別有益的。可替代地，可以選擇已經接種破傷風疫苗接種的人作為靶標人群，因為他們對例如 Met-var24的應答可以增強。
Met-var24可以在合適的佐劑中配製，並含有本文揭露的另外的賦形劑或載體。
根據實施方式，患者可以是患有AD的高加索人（Caucasian），並且劑量可以是250 µg Met-var24或更高，例如包含2倍250 µg Met-var24或單劑量的500 µg Met-var24的劑量。在某些實施方式中，患者可以是已經接受破傷風毒素早期疫苗接種或包含P2和/或P30的疫苗的患者。可替代地，可以在用Met-var24治療之前用破傷風毒素或包含P2和/或P30的疫苗接種患者。
患者的治療可以每2週、每4週或每6週進行一次。可替代地，患者的治療可以每¼年，每½年或例如每年進行一次。
在本發明上下文中，“治療”或“進行治療”旨在指示管理並護理患者，用於緩解、阻滯、部分阻滯、除去或延遲疾病的進展的目的。進展可以是疾病的臨床表現或上文提到的一個或多個患者標準。
待治療的患者較佳的是哺乳動物，特別是人類。
在本上下文中，術語化合物的“治療有效量”意指足以緩解、阻滯、部分阻滯、除去、減輕給定疾病的一種或多種症狀或延遲其發作或進展的量。將足以實現以上的量定義為“治療有效量”。用於各目的的有效量將取決於疾病或損傷的嚴重程度以及受試者的體重及一般狀態。將理解的是，可以使用常規實驗，藉由構築值矩陣並測試矩陣中的不同點來實現適當劑量確定，這均在受訓醫師的普通技術內。
III. 抗體
在一些實施方式中，進一步提供本文描述的方法以用於產生寡聚化的abeta的抗體，該方法包括用Met-var24或X-var24免疫動物（例如哺乳動物，包括人類）；以及從動物中分離出與寡聚化的abeta特異性結合的抗體。這種抗體可用於延遲發作或進展或治療阿茲海默氏症，或藉由測量受試者中寡聚化的abeta的水平來診斷阿茲海默氏症。
術語“免疫”係指物質在存在或不存在佐劑下單獨或當與載體連接時在受試者中引起體液和/或細胞應答的能力。
抗體或其抗原結合片段可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，或者可以具有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的免疫球蛋白質恒定和/或可變結構域。在一些實施方式中，抗體係雙特異性或多特異性抗體。在一些實施方式，抗體係重組抗體、多株抗體、單株抗體、人源化抗體或嵌合抗體、或這些的混合物。在一些實施方式中，抗體係人類抗體，例如人單株抗體、多株抗體或單株和多株抗體的混合物。抗原結合片段可包括Fab片段，F(ab')2片段和/或FV片段CDR3。可以針對Met-var24/X-var24產生抗體。藉由用Met-var24/X-var24注射動物（例如兔或山羊或小鼠）可以產生抗體。為了製備多株抗體，可以藉由在合適的選殖運載體中表現相應的DNA序列在細菌中合成Met-var24/X-var24。然後可以純化Met-var24/X-var24，與載體蛋白偶聯並與弗氏佐劑混合（以幫助刺激兔的抗原應答）並注射到兔或其他實驗室動物中。可替代地，可以從表現蛋白質的培養細胞中分離多肽。以每兩週一次的間隔加強注射後，將兔或其他實驗室動物放血並分離血清或血漿。血清或血漿可以在使用前直接使用或純化，例如像藉由親和層析、蛋白質A-交聯瓊脂糖、抗原交聯瓊脂糖、抗小鼠-Ig-交聯瓊脂糖等方法。然後可將血清用於探測在聚丙烯醯胺凝膠上運行的蛋白提取物以鑒定Met-var24/X-var24。可替代地，可以製備Met-var24/X-var24並用於接種動物。為了產生單株Met-var24/X-var24抗體，對小鼠進行多次注射（參見上文），取出小鼠脾並重懸於磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）中。將脾細胞用作淋巴細胞的來源，其中一些產生具有適當特異性的抗體。然後將它們與永久生長的骨髓瘤伴侶細胞融合，並在選擇劑例如HAT的存在下將融合產物鋪到多個組織培養孔中。然後藉由ELISA篩選孔以鑒定含有表現有用抗體的細胞的孔。然後將它們新鮮鋪板。生長一段時間後，再次篩選這些孔以鑒定產生抗體的細胞。進行若干個選殖程序直至超過90%的孔含有對抗體產生呈陽性的單株。從該程序中，建立穩定的殖株系以產生抗體。然後可以使用蛋白質A交聯瓊脂糖、離子交換層析以及這些技術的變化和組合藉由親和層析純化單株抗體（參見例如，美國專利6,998,467）。對於用於人類法療的抗體，它們可能是“人源化的”。抗體的人源化涉及用人類序列替換天然小鼠序列以在治療性抗體被引入人類後降低免疫應答的機會。在一些實施方式中，可以使用人類抗體（例如，從人類抗體文庫中鑒定）。
IV. 測定
本文描述的免疫測定可以處於競爭性測定或非競爭性測定（例如單位點競爭性測定或雙位點競爭性測定）的形式，並且使用標籤，例如酶（例如使用辣根過氧化物酶（HRP）、鹼性磷酸酶（AP）或葡糖氧化酶的ELISA）、放射性同位素（例如放射免疫測定）或螢光報告子。很多參考文獻是可得的，用來在應用以上技術時提供指導（Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays [酶免疫測定的實踐和理論]（愛思唯爾公司（Elsevier）, 阿姆斯特丹, 1985）；Campbell, Monoclonal Antibody Technology [單株抗體技術]（愛思唯爾公司（Elsevier）, 阿姆斯特丹, 1984）；Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications [單株雜交瘤抗體：技術和應用]（CRC出版社, 波卡拉頓, 佛羅里達州, 1982）；和Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques [單株抗體：技術手冊], 第147-1 58頁（CRC出版社公司（CRC Press, Inc.）, 1987）。
大規模診斷（MSD）已經開發了電化學發光檢測技術，可用作傳統ELISA的可替代方法。MSD測定使用SULFO-TAG標記代替過氧化物酶，並且使用具有碳電極的、被整合到每個孔的底部的微孔板而不是聚苯乙烯微孔板。SULFO-TAG標記在每個孔中的電極處開始的電化學刺激時發光，並測量訊號。二級（或檢測）抗體可以用SULFO-TAG酯或SULFO-TAG標記的抗物種抗體直接標記，例如，如果檢測抗體在小鼠中產生並且假設檢測抗體在與捕獲（或初級）抗體不同的物種中產生，則所述抗物種抗體為抗小鼠抗體。
MSD平台為檢測和定量複雜基質中的蛋白質和蛋白質複合物提供了顯著的優點。這些包括高靈敏度和寬動態範圍，允許在廣泛的濃度範圍內測量蛋白質或蛋白質複合物的水平（典型地覆蓋3.5至5個對數的蛋白質濃度），從而消除了重新測試樣品的需求，節省了時間和試劑兩者。穩健且可重複的儀器和小樣品要求 - 典型地僅為25 µL。
在一個實施方式中，免疫測定可以呈ELISA或MSD的形式，該ELISA或MSD塗覆有寡聚和/或聚集的abeta、或這些abeta種類的片段、或Met-var24、或X-var24，在最終添加標記的抗-IgG抗體之前向其添加樣品並孵育。較佳的是使用Met-var24用於塗覆。讀數可以是滴度或計算的IC50，如實例中示出的。
本發明還涉及用於定量來自阿茲海默氏症患者的抗體之體外方法，該方法包括以下步驟
c) 從患者取樣品，
d) 在免疫測定中分析該樣品。
根據實施方式，免疫測定包括在免疫測定中將寡聚和/或聚集的abeta、或所述abeta種類的片段、或Met-var24或X-var-24吸附至固相（例如板）中第一步驟。較佳的是Met-var24在吸附至固相的第一步驟中使用。
根據本發明的實施方式，樣品取自已經用Met-var24治療1、2、3、4次或更多次的患者。
該數據可用於計算IC50，並且IC50在約200至約1000 pM的範圍內指示針對患者腦中abeta的陽性滴度。可替代地，滴度本身可用於定義有益應答，並且設想滴度高於1.000，例如高於5.000、高於10.000、高於20.000、高於30.000、高於40.000、高於50.000或高於80.000指示有益的應答，而低於1.000的滴度指示沒有應答。
本發明中術語“滴度”係指定義為稀釋因子的終點滴度，其中來自用Met-var24或X-var24治療的個體的血漿樣品中的特異性訊號降低至平均背景 + 3倍標準差的水平（有時在圖中用帶點畫線的切割線指示）。特異性訊號被定義為來自接受治療的個體血漿樣品的目的抗體的訊號減去來自同一患者在治療之前（免疫前水平）的血漿的訊號。
本文還提供了用於定量來自患者的寡聚化的abeta的體外方法。這種測定可用於診斷或預測阿茲海默氏症。該方法包括以下步驟：從患者取樣品，在適當的結合條件下將樣品應用於包含本文描述的寡聚化的abeta（例如Met-var24）的免疫測定；並且測量患者樣品中抗體與寡聚化的abeta（例如Met-var24）的結合水平。
在一些實施方式中，在本文描述的任何測定中，可以將結合水平（例如，測量的抗體或寡聚化的abeta的水平）與對照進行比較。在一些實施方式中，對照係來自未患阿茲海默氏症的受試者的樣品。在一些實施方式中，對照係來自受試者人群的平均水平。在一些實施方式中，受試者人群未患阿茲海默氏症。在一些實施方式中，對照係在較早時間點來自患者（例如，未接受Met-var24治療的相同患者，或正經歷Met-var24治療的相同患者）的樣品。
在一個具體的實施方式中，本發明的體外測定包括1、2、3、4、5個或所有以下步驟
a. 用Met-var24塗覆板（ELISA或MSD板），
b. 視需要，封阻板，
c. 視需要，將板洗滌1、2、3、4或5次，
d. 添加與來自患者的樣品（例如上文描述的血漿樣品）一起預孵育的Met-var24，該患者接受Met-var24治療，以產生具有不同濃度的Met-var24的一系列患者樣品，
e. 視需要，將板洗滌1、2、3、4或5次，
f. 添加硫標記的抗人IgG，
g. 在約30分鐘至約80分鐘之間孵育板，
h. 視需要，將板洗滌1、2、3、4或5次
i. 視需要，添加讀數緩衝液
j. 獲得結果，例如由例如MSD讀板器的讀板器
V. 套組
本發明還涉及包含本發明的免疫測定的套組（kit），並且根據實施方式，還涉及用於治療阿茲海默氏症的藥物，例如Met-var24或抗-abeta抗體像阿杜單抗。
根據一個實施方式，該套組包含具有寡聚和/或聚集的abeta，或所述abeta、或Var24、Met-var24或X-var-24的片段的免疫測定。較佳的是使用Met-var24。
根據一個實施方式，免疫測定係ELISA或MSD。
在一個實施方式中，套組可用於藉由測量Met-var24治療的患者的滴度或IC50來監測AD患者的治療應答。
根據一個實施方式，患者用Met-var24治療1、2、3、4或更多次。
根據一個實施方式，指示有益的抗體應答的IC50在約200至約1000 pM或更高的範圍內，並且因此滴度更高表明無益的抗體應答。可替代地，滴度本身可用於定義有益應答，並且設想滴度高於1.000，例如高於5.000、高於10.000、高於20.000、高於30.000、高於40.000、高於50.000或高於80.000指示有益的應答，而低於1.000的滴度指示沒有應答。
本發明中的術語“寡聚abeta”旨在定義一種形式的abeta，其中至少兩個，例如像3、4、5或更多個abeta 1-39至1-43分子係相關的。
本發明中的術語“聚集的abeta”旨在定義聚集的abeta 1-39至1-43分子，其可以使用約10.000 g（例如16,000 g）的低離心力30 min從合成或生物樣品中分離（Mok和Hawlet, 2006, Methods in Enzymology [酶學方法], 第413卷, 199-217）。還設想了這些的合成變體。
本發明中的術語“abeta片段”係指具有大於4個胺基酸的大小的abeta 1-43分子的肽。
本發明中使用的術語“適當的結合條件”旨在意指在反映生理條件的條件下（例如，pH 7.4的磷酸鹽緩衝溶液，含有1 mg/ml BSA或20 mM Tris、150 mM NaCl、1 mg/ml BSA）的抗體-抗原相互作用。
本發明的另外的實施方式
治療方法（實施方式 “E ”）
E1.（實施方式1）.一種用有效量的Met-var24或X-var24治療有需要的患者的方法，例如患有阿茲海默氏症的患者，例如在高加索人人群中患有阿茲海默氏症的患者。
E2.根據E1所述之方法，其中用Met-var24治療該患者。
E3.根據E1-E2所述之方法，其中藉由評估誘導的終點或最大滴度或IC50來進行治療的治療應答的評估。
E4.根據E3所述之方法，其中在該患者已經治療1、2、3、4或更多次之後進行治療應答的評估。
E5.根據E4所述之方法，其中所述評估在包括以下步驟的免疫測定中進行
a. 在適當的結合條件下，將免疫測定中的、從根據E1或E2的患者獲得的樣品用寡聚和/或聚集的abeta、或所述abeta、X-var24或Met-var24的片段塗覆，
b. 測量抗體滴度或IC50。
E6.根據E3-E5所述之方法，其中如果滴度和/或IC50示出在所免疫患者中獲得有益的抗體應答，則繼續對該患者進行免疫療法。
E7.根據E3-E5所述之方法，其中如果滴度和/或IC50示出在所免疫患者中沒有獲得有益的抗體應答，則停止對該患者進行免疫療法。
E8.根據E4或E5所述之方法，其中該免疫測定係ELISA或MSD測定。
E9.根據E4或E5所述之方法，其中滴度高於1.000指示有益的抗體應答。
E10.根據E4或E5所述之方法，其中IC50在約200至約1000 pM的範圍內指示有益的抗體應答。
E11.根據前述實施方式中任一項所述之方法，其中該患者接受50 µg、100 µg、250 µg、500 µg或1000 µg Met-var24的劑量，或接受2個同時劑量的250 µg Met-var24的劑量方案。該方法可以包括如下實施方式，其中該患者在接受所述有效量的Met-var24之前已經接受過破傷風類毒素疫苗，或者其中該患者在接受所述有效量的Met-var24之前已經接受了包含來自破傷風類毒素的P2和/或P30的疫苗（或免疫構建體）。
E12.根據前述實施方式中任一項所述之方法，其中每2週、每4週或每6週進行一次治療。可替代地，可以大約每¼年，每½年或例如每年給予一次治療。
E12'.一種治療患有阿茲海默氏症的患者的方法，該方法藉由用有效量的Met-var24或X-var24進行治療，其中所述患者在用Met-var24或X-var24進行早期治療後示出產生包含根據E 1-10的抗體的滴度應答，所述阿茲海默氏症患者可以是高加索人
E13 Met-var24或X-var24，用於治療患者，例如患有阿茲海默氏症的患者，例如在高加索人人群中。
E13' Met-var24或x-var24，用於根據E13所述使用，其中該使用進一步如E2-E12中所定義的。
E14 Met-var 24，用於製造藥物。
E14' 根據E14所述之Met-var24，其中該使用進一步如E1-E12中所定義的。
E15.Met-var24或X-var24，用於製造在用於治療患有阿茲海默氏症患者，例如高加索人AD患者的方法中使用的藥物。
E16.根據E15所述之Met-var24或X-var24，其中藉由皮下或肌內給藥進行治療。
E17.根據E15所述之Met-var24或X-var24，其中藉由評估誘導的滴度或IC50來進行治療的治療應答的評估。
E18.根據E17所述之Met-var24或X-var24，其中在患者已經治療1、2、3、4或更多次之後進行治療應答的評估。
E19.根據E17所述之Met-var24或X-var24，其中所述評估在包括以下步驟的免疫測定中進行
在適當的結合條件下，將免疫測定中的、從根據E15的患者獲得的樣品用寡聚和/或聚集的abeta、或所述abeta、X-var24或Met-var24的片段塗覆，
測量抗體滴度或IC50。
E20.根據E17-E19所述之Met-var24或X-var24，其中如果滴度和/或IC50示出在所免疫患者中獲得有益的抗體應答，則繼續對該患者進行免疫療法。
E21.根據E17-E19所述之Met-var24或X-var24，其中如果滴度和/或IC50示出在所免疫患者中沒有獲得有益的抗體應答，則停止對該患者進行免疫療法。
E22.根據E17-E21所述之Met-var24或X-var24，其中該免疫測定係ELISA或MSD測定。
E23.根據E17-E22所述之Met-var24或X-var24，其中滴度高於1.000指示有益的抗體應答。
E24.根據E17-E21所述之Met-var24或X-var24，其中IC50在約200至約1000 pM的範圍內指示有益的抗體應答。
E25 根據E15-E24所述之Met-var24或X-var24，其中該患者接受50 µg、100 µg、250 µg、500 µg或1000 µg Met-var24的劑量，或接受2個同時劑量的250 µg Met-var24的劑量方案。
E27.根據E15-E26所述之Met-var24或X-var24，其中每2週、每4週或每6週進行一次治療。
E28 Met-var24或X-var24，用於製造用於在藉由用有效量的Met-var24治療患有阿茲海默氏症的患者（例如高加索人AD患者）的方法中使用的藥物，其中所述患者在用Met-var24進行早期治療後示出產生滴度應答，該應答包含根據E15-E23所述的抗體。
E29 Met-var24或X-var24，用於製造用於在根據E28的治療患者的方法中使用的藥物，其中該患者在接受所述有效量的Met-var24之前已經接受過破傷風類毒素疫苗，或者其中該患者在接受所述有效量的Met-var24之前已經接受了包含來自破傷風類毒素的P2和/或P30的疫苗。
E30.一種在患者中誘導對寡聚化的abeta的免疫應答之方法，該方法包括給予有效量的Met-var24或X-var24。
E31.一種延遲患者中阿茲海默氏症的進展之方法，該方法包括給予有效量的Met-var24或X-var24。
組成物（實施方式 “F ”）
F1.一種多肽，其包含SEQ ID NO: 2的序列。
F2.一種疫苗構建體，其包含免疫原性有效量的F1多肽和佐劑，其中該免疫原性有效量的多肽誘導針對寡聚化的abeta的抗體的產生。
F3.一種核酸，其編碼根據F1的免疫原性多肽。
測定方法（實施方式 “B ”）
B1.一種用於定量來自患者的抗體之體外方法，該方法包括以下步驟：
a) 從患者取樣品，
b) 在免疫測定中分析該樣品。
B2.根據B1所述之方法，其中該患者患有或懷疑患有AD。
B3.根據B1所述之方法，其中該免疫測定包括在該免疫測定中將寡聚和/或聚集的abeta、或所述abeta的片段、Met-var24或X-var24吸附至固相，例如板的第一步驟。較佳的是使用Met-var24。
B4.根據B1和B3所述之方法，其中該免疫測定係ELISA或MSD。
B5.根據B1所述之方法，其中該樣品取自已經用Met-var24治療1、2、3、4次或更多次的患者。
B6.根據B1-B5所述之方法，其中使用獲得的數據來計算IC50。
B7 根據B6所述之方法，其中滴度的IC50在約200至約1000 pM的範圍內指示針對患者腦中abeta的陽性滴度。
B8 根據B1-B5所述之方法，其中在樣品中確定滴度。
B9 根據B8所述之方法，其中滴度高於1.000指示針對患者腦中的abeta有益的抗體應答。
B10.一種套組，用於測量樣品中的滴度或IC50。
B11.根據B11所述之套組，其中該套組用於診斷AD。
B12.根據B11所述之套組，其包含寡聚和/或聚集的abeta，或所述abeta的片段、Met-var24或X-var24。較佳的是使用Met-var24。
B13.根據B10所述之套組，其中該免疫測定係ELISA或MSD。
抗體（實施方式 “A ”）
A1.一種產生寡聚化的abeta抗體之方法，該方法包括：
用Met-var24免疫動物；以及
從該動物中分離出與寡聚化的abeta特異性結合的抗體。
A2.根據A1所述之方法，其中該抗體係從免疫動物的血清中分離的多株抗體，例如哺乳動物（包括人類）。
A3.根據A1所述之方法，其中該抗體係單株抗體，並且藉由從該動物獲得細胞並產生雜交瘤來分離抗體。
A4.根據A3所述之方法，其中藉由從免疫動物獲得脾細胞並將該脾細胞與骨髓瘤細胞融合來產生雜交瘤。
A5.抗體或抗體片段，根據A1-A4所述製備。
A6.根據A5所述之抗體或抗體片段，其中該抗體係單株抗體或多株抗體。
A7.根據A5所述之抗體或抗體片段，其中該抗體係全長抗體。
A8.根據A5所述之抗體或抗體片段，其中該抗體片段選自由以下各項組成之群組：Fv片段（例如單鏈Fv和二硫化物鍵合的Fv）；Fab樣片段，例如Fab片段、Fab'片段和F(ab)2 片段；和結構域抗體，例如單VH 可變結構域或VL 可變結構域。
A9.根據A5-A8所述之抗體或抗體片段，其中該抗體選自由以下各項組成之群組：IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型的抗體。
A10.根據A5-A9所述之抗體或抗體片段，其中該抗體係人類或人源化的。
A11.一種藉由用有效量的A1-A10中任一項所述的抗體治療患有阿茲海默氏症（AD）的患者來延遲所述患者的發病或進展或治療所述患者之方法。
A12.根據A11所述之方法，其中藉由皮下或肌內給藥進行治療。
A13.根據A11或A12所述之方法，其中每2週、每4週、每6週、每7週、或每8週進行一次治療。可替代地，可以大約每¼年，每½年或例如每年給予一次治療
A11.根據A1-A10中任一項所述之抗體延遲患有阿茲海默氏症（AD）的患者的發作病或進展或治療所述患者的用途，所述用途藉由給予根據A1-A10中任一項所述的有效量的抗體來實現。
A12.根據A11所述之用途，其中該治療藉由皮下或肌內給藥進行。
A13.根據A11或A12所述之用途，其中每2週、每4週、每6週、每7週、或每8週進行一次治療。
A14.一種用於定量來自患者的寡聚化的abeta之體外方法，該方法包括以下步驟
a) 從患者取樣品，
b) 在適當的結合條件下，將樣品應用於包含根據A1-A10中任一項所述的抗體的免疫測定；以及
c) 測量寡聚化的abeta與該抗體的結合水平。
A15.根據A14所述之方法，其中該患者患有AD。
A16.根據A14或A15所述之方法，其中該免疫測定係ELISA。
A17.根據A14-A16所述之方法，其進一步包括用該抗體治療該患者。
實例 1
將11名AD患者在0、4、12和24週的時間用250 µg Met-var24進行治療。在給藥後4週收集血漿樣品，並使用Met-var24塗覆的MSD板分析抗體結合（滴度）。將來自陽性應答者的血漿合併並稀釋10,000倍，然後將其在溶液中與漸增量的Met-var24或1-12 abeta三聚體構建體（由N-末端abeta 1-12胺基酸的3個重複構成，每個胺基酸被8-mer的甘胺酸殘基分離）孵育以競爭結合固定的Met-var24，以驗證特異性並在溶液中測量合併的AD血漿樣品中抗-abeta抗體與Met-var24和abeta 1-12三聚體的結合。平行分析BS阿杜單抗（4 ng/ml）。將來自AD患者的BS阿杜單抗和合併的血漿樣品與濃度漸增的abeta構建體（例如Met-var24、Var24、abeta 1-12三聚體或N-末端abeta 1-28殘基）肽在22°C下孵育60分鐘，並且隨後分析塗覆有100 ng/ml Met-var24的MSD板中的游離抗體。使用硫標記的抗人IgG（1 : 1500，MSD目錄號# R32AJ）檢測板結合的抗體。由於相同的IC50值範圍，與Met-var24結合的合併的AD血漿似乎是有效的並且與BS阿杜單抗與Met-var24的結合係可比較的（表 I ）。表I示出了來自多次測試的代表性值
[表I]
# 當親和力為 1 µM 或更低時，無結合
Met-var24與BS阿杜單抗的強結合指示Met-var24展示對阿杜單抗有效的abeta表位（胺基酸3-9），並且因此指示Met-var24表位模擬在AD過程中形成的呈現天然寡聚以及聚集的abeta的表位呈遞。
總之，來自AD患者的Met-var24免疫的血漿誘導了有效結合Met-var24並具有與BS阿杜單抗相容的結合特徵的抗體。
圖 1 示出了如在塗覆有Met-var24的板中測試的，BS阿杜單抗與Var24和Met-var24結合的說明性實驗。Var24競爭BS阿杜單抗結合的效率低於Met-var24，如由IC50增加 ＞ 70倍指示。
巴匹珠單抗以高親和力結合單、寡聚物和聚集形式的abeta，並且對abeta 1-5具有特異性，並且對abeta的N-末端Asp（D）具有特異性。儘管在APOE ε4攜帶者中觀察到生物標誌物的治療差異，但巴匹珠單抗並未改善阿茲海默氏症患者的臨床結果。巴匹珠單抗未能在第3階段達到主要終點（Salloway等人, N Engl J Med [新英格蘭醫學期刊] 2014；370: 322-33）。
分別使用塗覆有Met-var24和abeta的N-末端胺基酸1-28（abeta 1-28）的MSD板分析Met-var24以及abeta 1-28與阿杜單抗（BS阿杜單抗）和巴匹珠單抗（BS巴匹珠單抗）的生物類似藥抗體的結合。MSD板分別用100 ng/ml Met-var24和500 ng/ml abeta 1-28塗覆（pH 11，硼酸/氫氧化鈉/氯化鉀，FLUKA 33650-1L-R）。在這些條件下，BS阿杜單抗但不是BS巴匹珠單抗在塗覆有Met-var24的MSD板中有效結合。相反，BS巴匹珠單抗而非BS阿杜單抗在塗覆有abeta 1-28的板中有效結合（表 I ）。
在用abeta 1-28塗覆的板中測試BS巴匹珠單抗與Met-var24的液相結合（抑制測定）。Met-var24弱抑制板中與abeta 1-28的結合，如500 nM的IC50指示的。相比之下，BS巴匹珠單抗示出與Var24和abeta 1-12三聚體（abeta N-末端1-12個胺基酸的三聚體，每個用8-mer柔性接頭使用甘胺酸分離）結合，在這些條件下IC50值約為10-40 nM（表 I 和圖 2 ）。
Met-var24與巴匹珠單抗的結合示出高IC50值，與巴匹珠單抗和abeta的高親和力相互作用所需的游離N-末端abeta（Asp-1）的封阻一致。均具有游離N-末端Asp-1的Var24以及abeta 1-12（如上描述）示出相反的有力結合，如IC50值約10 nM指示的。
在圖 3 中，來自AD免疫血漿（實心方格）和BS阿杜單抗（空心方格）與Met-var24塗覆的板結合的結合分析之一的數據。隨著Met-var24濃度的增加（在下方由x軸指示）將BS阿杜單抗和AD免疫血漿分別孵育60 min。AD免疫血漿係來自接受4個250 µg劑量的患者的合併樣品。Y軸示出了結合作為濃度漸增的Met-var24的函數。數據點代表重複的平均值。如由亞納莫耳IC50值指示的，BS阿杜單抗和AD免疫血漿兩者均示出Met-var24的有效結合。
因此，總體而言，這支持Met-var24誘導識別寡聚/聚集但不是單體的，具有與阿杜單抗相似的結合效力的abeta的抗體。
使用Met-var24的本發明的測定在檢測針對寡聚/聚集的abeta（像阿杜單抗）的臨床相關抗體方面也是特別好的。使用分別塗覆有Met-var24和abeta 1-12三聚體肽的板（上文描述的）進行用50 µg和250 µg劑量進行3次免疫後的合併的AD免疫血漿的滴度分析。將合併的血漿樣品連續稀釋300 - 1,000,000倍並與Met-var24和abeta 1-12三聚體肽一起孵育。藉由硫標記的抗人IgG（MSD）檢測結合的抗體。在塗覆有abeta 1-12-三聚體的板中，僅在接受3 x 250 µg Met-var24的患者中檢測到終點滴度（滴度為約1 : 10,000），然而在給藥50 µg的患者的血漿中未檢測到抗體。相反，當使用Met-var24塗覆的板時，在接受50 µg（滴度1 : 3,000）以及250 µg（1 : 30,000）的患者中測量滴度。因此，與常規塗覆的板相比，使用Met-var24塗覆的板更好地分析Met-var24的免疫原性。
BS阿杜單抗的重鏈（HC）
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGTKKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCARDRGIGARRGPYYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
BS阿杜單抗的輕鏈（LC）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
BS巴匹珠單抗的輕鏈（LC）
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
BS巴匹珠單抗的重鏈（HC）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAGSGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
實例 2
測定設置 A
該測定係使用Met-Var24塗覆的本發明的MSD測定方法的示例。該方法可以例如用作“效力測定”以鑒定阿杜單抗樣抗體的可能誘導。
設備
等同設備可以替代下表中列出的設備。
試劑
所有市售試劑根據製造商的說明儲存、製備和使用。如果需要，本節列出了由儲備溶液製備緩衝液和試劑。只要比率保持恒定，就可以根據需要調整體積。等同試劑可以代替下表中列出的那些
結合緩衝液 ：PBS pH 7.4，具有0.1% BSA（級分V）
如下製備結合緩衝液：
添加1 g BSA至900 ml PBS中。如果需要，將pH調節至pH 7.4。QS體積至1升。
在2°C-8°C儲存1個月。
塗覆緩衝液 ：碳酸鹽緩衝液pH 9.5 ± 0.3
如下製備碳酸鹽碳酸氫鹽緩衝液：
將一個膠囊中的內容物全部倒入50 mL去離子水中並溶解。如果需要，調節pH。QS體積至100 ml。
在2°C-8°C儲存長達1個月
封阻緩衝液 ：3% BSA（級分V），在PBS中0.1% NP40，pH7.4
如下製備封阻緩衝液：
添加30 g BSA至900 ml PBS中。添加1.42 ml的NP40（NP40係在水中70%的溶液）。如果需要，將pH調節至pH 7.4。QS體積至1升。
在2°C-8°C儲存長達1個月
洗滌緩衝液 ：0.1 % BSA（級分V），在PBS中0.1 % NP40，pH 7.4
如下製備洗滌緩衝液：
添加1 g BSA至900 ml PBS中。添加1.42 ml的NP40（NP40係在水中70%的溶液）。如果需要，將pH調節至pH 7.4。QS體積至1升。
在2°C-8°C儲存長達1個月
程序
1.1. 板塗覆 - 第1天
1. 必需在塗覆板之前立即製備含有Met-var24的塗覆緩衝液。
2. 添加25 µL塗覆緩衝液/孔到所需的所有孔中。
3. 用板密封器覆蓋板，在2°C-8°C下孵育16小時。可替代地，可以在室溫（RT）下將板塗覆2-3小時（hr）。
1.2. 測定準備 - 第2天
1. 從2°C-8°C儲存中移出塗覆的板，並在使用前在室溫下平衡至少30分鐘。
2. 從2°C-8°C儲存中移出結合緩衝液。等分所需的結合緩衝液體積，將儲備液瓶放回2°C-8°C儲存。
3. 從2°C-8°C儲存中移出一瓶洗滌緩衝液。等分所需量並允許其溫熱至室溫至少30分鐘。將儲備液瓶放回冰箱。
4. 傾析塗覆溶液並藉由使用乾淨的毛巾將板倒置來除去殘留的緩衝液。
5. 每次洗滌使用150 µL/孔，用洗滌緩衝液洗滌板3次。
6. 使用乾淨的毛巾將板倒置來除去殘留的緩衝液。
1.3. 封阻 - 第2天
1. 藉由向每個孔中添加150 µL的封阻緩衝液來封阻孔。
2. 用板密封器覆蓋板，並在室溫下放置60 ± 10分鐘。
3. 封阻完成後，使用乾淨的毛巾將板倒置來除去殘留的緩衝液。
4. 每次洗滌使用150 µL/孔，用洗滌緩衝液洗滌板3次。使用乾淨的毛巾將板倒置來除去殘留的緩衝液。
1.4. Met-Var24樣品與抗體的預孵育
1. 在成梯度的濃度的Met-var24（肽範圍：0.1、1、10、100和1000 nM）存在下，在室溫下預孵育生物樣品（例如來自患者或例如BS阿杜單抗或BS巴匹珠單抗的樣品）60分鐘。
2. 一式兩份添加25 µL/孔的樣品製劑。
3. 用板密封器覆蓋板，並在室溫下孵育60分鐘 ± 10分鐘。
1.5. 添加硫標記的 抗體
1. 在孵育結束前大約5分鐘，使用結合緩衝液作為稀釋劑，將硫標記的抗體製備成1 : 1500的稀釋物。
2. 樣品孵育結束後，藉由使用乾淨的毛巾將板倒置，移除殘留樣品。
3. 每次洗滌使用150 µL/孔，用洗滌緩衝液洗滌板3次。使用乾淨的毛巾將板倒置來除去殘留的緩衝液。
4. 添加25 µL硫標記的工作液/孔到所需的所有孔中。
5. 用板密封器覆蓋板，並在室溫下孵育60分鐘 ± 10分鐘。
1.6. 板發展和讀數
1. 在硫標記的孵育後，從孔中除去溶液。
2. 每次洗滌使用150 µL/孔，用洗滌緩衝液洗滌板3次。使用乾淨的毛巾將板倒置來除去殘留的緩衝液。
3. 添加150 µL讀數緩衝液/孔到所需的所有孔中。
4. 使用適當的取向將板置入MSD sector 600讀數器的抽屜中。
5. 根據製造商的說明對板讀數。
測定設置 B
根據本發明的另一個實施方式，可以如下揭露的設置測定。
化學品、捕獲和檢測材料


試劑的製備
用於製備試劑的體積足以用於1個板（緩衝液除外）。
ECLIA系統
洗滌器


程序


實例 3 對 Met-var24 免疫的體液免疫應答的表徵
Tg2576小鼠中的抗體應答
該研究分析了在從5至16月齡時用100 µg Met-var24每月一次免疫的Tg2576小鼠中的abeta特異性抗體應答的誘導。使用基於Aβ1-40的固定的捕獲ELISA分析Met-var24誘導的abeta特異性抗體的發生。
在2次免疫後可檢測到abeta特異性抗體（圖5，小圖A），並且在第3次免疫後達到平台期，隨後在第4次免疫後略微下降。在對照小鼠的血清或Met-var24治療的動物的免疫前血清中未檢測到抗-abeta抗體。
在Tg2576小鼠中用Met-var24免疫產生主要為IgG2a和IgG2b同種型的抗體（圖5，小圖B），僅有少量水平的IgM。此外，Met-var24誘導的抗體的Ig亞型組成在重複免疫期間保持不變（圖5，小圖D）。
實例 4 用 Met-var24 免疫後在 Tg2576 小鼠中的斑塊進展
在Tg2576小鼠中分析Met-var24對abeta斑塊進展的影響。在每月一次給予11次免疫後，在17月齡時處死Tg2576小鼠並分析abeta斑塊負載。對小神經膠質細胞檢測採用抗MHC II染色的半腦，和對星形膠質細胞檢測採用抗神經膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）染色的半腦，進行圖像分析。
如圖6中示出的，用Met-var24免疫減少了6E10陽性的數量（（6E10係可商購的抗體，結合β類澱粉蛋白的胺基酸殘基1-16）圖6A和硫磺素S（ThS）-陽性Aβ斑塊（ThS與富β片層結構結合，（圖6B））。此外，與僅用佐劑免疫的對照Tg2576小鼠相比，Met-var24免疫的小鼠示出顯著更低的小神經膠質細胞和星形膠質細胞活化。重要的是，腦類澱粉血管病（CAA）和微出血在Met-var24免疫動物和對照動物之間沒有顯著差異（圖7）。
總之，用Met-var24免疫的Tg2576小鼠示出較低的abeta斑塊負載，較少的小神經膠質細胞和星形膠質細胞活化，並且與對照相比沒有微出血的增加。
Met-var24 誘導的抗體 與人類 Abeta 斑塊的結合
研究目的係研究Met-var24誘導的抗體是否也識別生理和病理相關的abeta。將人AD腦切片用作生理學abeta的來源，以驗證Met-var24誘導的抗體與疾病相關的abeta斑塊的結合。使用來自Met-var24免疫的Jucker（APPPS1-21）小鼠和食蟹猴的血漿中的抗體。
將來自兩名AD患者的石蠟包埋的腦切片與來自Met-var24免疫的Jucker（APPPS1-21）小鼠的血漿樣品一起孵育。在皮質腦切片上孵育之前藉由將Jucker（APPPS1-21）小鼠血漿與濃度漸增的Met-var24（0-1000 nM）和N-末端abeta胺基酸1-28（abeta 1-28）（0-1000 nM）預孵育來證明針對abeta的斑塊結合抗體的特異性。在皮質腦切片上孵育之前，將來自Met-var24免疫的食蟹猴的血漿以1:200稀釋。
來自Met-var24免疫的Jucker（APPP1-21）小鼠的血漿樣品能夠檢測abeta斑塊，如圖8中示出的。藉由分別用1000 nM abeta 1-28（圖8A）或10 nM Met-var24（圖8B）預孵育血漿，完全消除了與abeta斑塊結合的抗體。觀察到的結合效力對應於Met-var24與Met-var24誘導的抗體的觀察到的結合效力。來自免疫的食蟹猴的血漿也證明與皮質AD斑塊的結合（圖9）。
總之，來自免疫動物的Met-var24誘導抗體的斑塊染色能力支持Met-var24可以引發識別病理相關形式的abeta的免疫應答。
來自Met-var24免疫動物的血漿示出了病理性abeta的結合，其藉由與10 nM Met-var24和1000 nM abeta1-28預孵育而被抑制。
在Met-var24免疫之前用P2/P30肽初免的Jucker（APPPS1-21）小鼠接受4次重複免疫，從8週齡起每4週一次。合併（N=10）來自出血4（第4次免疫後2週）的血漿並以1:2000稀釋染色的AD皮質斑塊和血管abeta，而免疫前血漿則不稀釋。
實例 5 破傷風肽特異性記憶 T 細胞對 Met-var24 誘導的免疫應答的影響
在具有與Tg2576相同的H-2基因型的6-8週齡B6SJL小鼠中解決了破傷風肽特異性記憶T細胞的存在的影響。在該實驗中使用這些非轉基因小鼠來解決記憶T細胞的誘導和6個月後給予Met-var24免疫後T細胞應答的動力學。
用每月給予P30/Quil-A（50 µg/小鼠）或僅Quil-A的3個劑量免疫兩組B6SJL小鼠，並且隨後在6個月的無治療期後分析T記憶細胞對P30的特異性。在一次單一Met-var24（100 µg）注射之前和之後，藉由ELISPOT測定分析來自每組的10隻小鼠的記憶T細胞應答。從脾細胞中純化CD4+ T細胞，並使用P30和Met-var24肽在體外刺激後測量應答。藉由流式細胞術驗證分離的CD4+ T細胞的純度。分析Met-var24治療的小鼠和對照小鼠中的細胞和體液免疫應答兩者。
用來自P30免疫的B6SJL小鼠但不是來自對照脾細胞的脾細胞的P30肽體外再刺激誘導顯著的IFNγ應答，指示存在應答P30的T細胞。從初免的脾細胞中耗竭CD4+ T細胞完全消除了產生IFNγ的細胞的檢測。此外，富集來自具有CD4+ T細胞的未免疫小鼠的脾細胞，從P30免疫的小鼠脾細胞的純化恢復了P30刺激。這些觀察結果表明，在用P30肽免疫後6個月存在對衍生自破傷風的P30表位具有特異性的記憶T細胞群。
隨後研究了P30記憶T細胞群對Met-var24誘導的abeta特異性抗體的影響。發現用Met-var24一次單一免疫後P30預免疫小鼠中的abeta特異性抗體應答比未初免小鼠15的抗體應答高15倍。該觀察結果與報導的在用P30肽初免後具有P30特異性免疫記憶的11個月齡Tg2576小鼠的單一Met-var24免疫後增強的abeta特異性抗體應答的觀察結果相關，初免遵循與上文針對B6SJL小鼠描述的類似的程序。
實例 6 對人外周血單核細胞（ PBMC ）中 Met-var24 、 P2 和 P30 肽的應答
研究的目的係使用人PBMC體外刺激描述Met-var24，以及破傷風肽P2和P30的人類免疫原性潛力。從52名年輕（平均年齡：31歲）和21名老年（平均年齡：70歲）健康人類供體收集PBMC，該供體具有典型的高加索人II類HLA同種異型頻率分佈。將Met-var24、P2、P30和破傷風蛋白的免疫原性測量為PBMC的增殖。刺激指數（SI）描述了相對於未刺激的PBMC，抗原刺激的PBMC中的增殖程度（藉由摻入胸苷測量）。隨後使用允許差異細胞群分析的流式細胞術研究T細胞活化。
大多數年輕健康的高加索人供體對Met-var24、P2和P30具有顯著的T細胞應答。Met-var24具有顯著的免疫原性，如在所測試的52個年輕供體中的69%中SI值高於2所定義的（圖10 A和C-D）。這些應答者展現出通常高的SI值，範圍從2.0至68.2（中位數 = 4.7）。相比之下，P2和P30在63%和60%的測試的供體中誘導顯著的免疫應答。
Met-var24還在測試的38%的老年供體中誘導了顯著的免疫應答（21個供體中的8個（圖10 B））。這些應答者展現出通常高的SI值，範圍從2.1至5.8。P2和P30在38%和19%的測試的供體中誘導免疫應答（分別為21個供體中的8個和21個供體中的4個）。
實例 7 輕度 AD 患者中的人類首次（ FIH ）研究
研究設計和患者處置
目前正在進行且尚未最終確定的FIH研究由A和B兩部分組成，每個部分包括Met-var24的4次免疫。在A部分中，患者參與的持續時間為48週，包括24週的治療期和24週的隨訪期。在治療期間，所有患者在第0、4、12和24週接受Met-var24免疫。
B部分由長達9個月的磨合期組成（直到A部分的安全性數據得到評估），隨後是長達36週的治療期和12週的隨訪期。在B部分，患者每12週接受一次Met-var24免疫。群組4中的患者參與研究的部分A（4次免疫），然而群組1至3中的患者在部分A和部分B中共接受8次免疫。
部分A和B中的患者目前接受以下劑量的Met-var24：
• 群組1：Met-var24 部分A：5 µg，部分B：50 µg，10個患者
• 群組2：Met-var24 部分A和B：50 µg，10個患者
• 群組3：Met-var24 部分A和B：250 µg，15個患者
• 群組4：Met-var24 部分A：2 x 250 µg，15
總共有48名年齡在60至82歲之間的患者參加了4次給藥。35名患者中有34名完成了部分A（1名患者撤出），並且28名患者繼續進入該研究的部分B。
參加群組3（250 µg Met-var24）的3名患者目前仍在進行部分B。此外，群組4（2 x 250 µg Met-var24）仍在進行中；15名計畫患者中有13名已參加，並接受了多達3次Met-var24免疫。
抗體滴度
主要目的之一係檢查人類中用Met-var24多次免疫後abeta特異性抗體應答的時程和量級。
使用兩種評估abeta特異性抗體的方法獲得的來自群組1至3（僅部分A）的抗體數據表明，與5和50 µg較低劑量的Met-var24相比，在250-µg群組中具有更多數量的應答者的劑量應答關係。滴度應答者被定義為任何患者，在免疫後在任何時間點對其採樣，具有高於如本發明描述的測定切點的滴度。
基於來自兩個測定的結果，群組1至3（僅部分A）中的抗體滴度應答者的數量總結於下表。


[表II] 群組1至3 - 部分A中的抗體滴度應答者
無
[圖1]示出了如在用Met-var24塗覆的板中測試的，生物類似藥（Biosimilar）（BS）阿杜單抗與Var24和Met-var24結合的說明性實驗。Var24競爭BS阿杜單抗結合的效率低於Met-var24，如由IC50增加 ＞ 70倍指示。
[圖2]示出了在用abeta 1-28（abeta的N-末端胺基酸1-28）塗覆的板中用BS巴匹珠單抗進行的抑制測定。使用Var24和abeta 1-12的abeta三聚體構建體（由N-末端abeta 1-12胺基酸的三聚體構成，每個經由8-mer的甘胺酸殘基連接）的抑制強於Met-var24。
[圖3]示出了 i) 來自用Met-var24（實心方格）治療的患者的AD免疫血漿和 ii) 塗覆有Met-var24的板中的BS阿杜單抗（空心方格）的結合分析的數據。隨著Met-var24濃度的增加（在下方由x軸指示）將BS阿杜單抗和AD免疫血漿分別孵育60 min。AD免疫血漿係來自接受4x250 ug劑量的患者的合併的樣品。Y軸示出了結合作為濃度漸增的Met-var24的函數。數據點代表重複的平均值。如由亞納莫耳IC50值指示的，BS阿杜單抗和AD免疫血漿兩者均示出Met-var24的有效結合。
[圖4]：示出了在抑制測定中使用來自Met-var24免疫的患者的AD血漿的分析，所述抑制測定係在用Met-var24塗覆的板中使用Met-var24和abeta 1-12三聚體（如以上圖2中描述的）進行。雖然與Met-var24相比，abeta 1-12三聚體構建體的程度較低，但Met-var24塗覆的板中AD免疫血漿的結合受到抑制，證實Met-var24的N-末端abeta特異性誘導了抗體。
[圖5] Tg2576小鼠中的Met-var24抗abeta抗體。使用基於abeta 1-40的固定的捕獲ELISA分析抗體濃度。(A) 用強佐劑CFA/IFA或Quil-A配製的Met-var24在給予免疫的個體小鼠的血清中出現抗abeta抗體的動力學。每次免疫後28天取血。數據包告為平均值 (B)。免疫小鼠的合併的血清中的抗體的同種型。(C) 在用Quil A中配製的Met-var24 免疫5至11次後，合併的小鼠血清中的抗abeta抗體水平。(D) 合併的血清中抗abeta應答的IgG同種型分佈。誤差條指示小圖A的個體動物，以及小圖B、C、和D的來自3種不同ELISA的合併的血清的平均值 ± SD。條分別代表免疫和對照小鼠中n = 20和n = 15的平均值 ± SD。
[圖6] Met-var24免疫減少Abeta負載
早期免疫的15至17個月大的Tg2576小鼠腦中6E10免疫反應性和彌漫性abeta斑塊 (A) 和 (B) ThS陽性abeta斑塊（*** P ＜ 0.001，在免疫和對照小鼠中分別為n = 20和n = 18）。列出了用6E10和ThS染色的免疫和對照小鼠半腦的代表性之圖像。放大倍數為4倍，比例尺 = 200 µm。
[圖7]Met-var24 減少神經膠質活化和星形細胞增生而不增加腦類澱粉血管病
用Met-var24免疫可減少15至17個月大的TG2576小鼠腦中的神經膠質活化 (A) 和星形細胞增生 (B)。與對照小鼠相比，免疫小鼠中用抗MHC II (A) 和抗GFAP (B) 抗體染色的半腦的圖像分析分別顯示顯著更少的小神經膠質活化和星形細胞增生（*** P ＜ 0.001）。原始放大倍數為4倍，比例尺 = 200 μm。加框腦區域使用更高的原始放大倍數（10倍，比例尺 = 200µm）詳細呈現。
[圖8]AD 皮質中斑塊和血管 Abeta 的免疫染色
A：使用來自Met-var24免疫的Jucker（APPPS1-21）小鼠的血漿免疫染色斑塊和血管abeta，單獨或使用N-末端abeta 1-28胺基酸（abeta 1-28構建體）與濃度漸增的abeta構建體（0-1000 nM）預孵育。箭頭指示斑塊染色，並且箭頭頭部指示血管abeta。
B：使用來自用Met-var24免疫的Jucker（APPPS1-21）小鼠的血漿免疫染色斑塊和血管abeta，單獨或與濃度漸增的Met-var24（0-1000 nM）預孵育。
[圖9]Met-var24 誘導的抗體的結合特徵
在溶液中獲得的，Met-var24和abeta1-28構建體競爭來自免疫的Tg2576小鼠、Jucker（APPPS1-21）小鼠和食蟹猴的血漿中的抗體的觀察到的IC50值的總結。包括與人AD皮質abeta斑塊的相對抗體結合。
[圖10]Met-var24 、 P2 、和 P30 對來自健康供體的人 PBMC 中 CD3+CD4+ 增殖的影響。 繪圖示出了在年輕 (A) 和年老 (B) 供體中用Met-var24和破傷風類毒素（TT）體外刺激後刺激指數（SI）之間的關係。與年輕供體中的破傷風肽P2和P30相比，用Met-var24再刺激後的SI示出於圖C和D中。Y軸的刺激指數在圖A和B中在0-40範圍內，否則刺激指數在0-20範圍內。








































































































































































































































































































































































































































































































































Claims (56)

  1. 一種治療患有阿茲海默氏症（AD）的患者之方法，該方法藉由用有效量的Met-var24或X-var24對所述患者進行治療。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該患者係高加索人。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中藉由皮下給藥或肌內給藥進行該治療。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該患者在接受所述有效量的Met-var24或X-var24之前已經接受過破傷風類毒素疫苗。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該患者在接受所述有效量的Met-var24或X-var24之前已經接受了包含來自破傷風類毒素的P2和/或P30的疫苗。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中藉由評估誘導的滴度或IC50來進行治療的治療應答的評估。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中在該患者已經治療1、2、3、4或更多次之後進行治療應答的評估。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中所述評估在包括以下步驟的免疫測定中進行 c. 在適當的結合條件下，將免疫測定中的、從如申請專利範圍1所述的患者獲得的樣品用Met-var24塗覆， d. 測量抗體滴度或IC50。
  9. 如申請專利範圍第6或8項所述之方法，其中如果滴度和/或IC50示出在所免疫患者中獲得有益的抗體應答，則繼續對該患者進行免疫療法。
  10. 如申請專利範圍第6或8項所述之方法，其中如果滴度和/或IC50示出在所免疫患者中沒有獲得有益的抗體應答，則停止對該患者進行免疫療法。
  11. 如申請專利範圍第6或8項所述之方法，其中該免疫測定係ELISA或MSD測定。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中滴度高於1.000指示有益的抗體應答。
  13. 如申請專利範圍第6-12項所述之方法，其中IC50在約200至約1000 pM的範圍內指示有益的抗體應答。
  14. 如前述申請專利範圍中任一項所述之方法，其中該患者接受50 µg、100 µg、250 µg、500 µg或1000 µg Met-var24或X-var24的劑量。
  15. 如前述申請專利範圍中任一項所述之方法，其中該患者接受2個同時劑量的250 µg Met-var24或X-var24的劑量方案。
  16. 如前述申請專利範圍中任一項所述之方法，其中每2週、每4週或每6週進行一次治療。
  17. 一種治療患有阿茲海默氏症的患者的方法，該方法用有效量的Met-var24或X-var24進行治療，其中所述患者在如申請專利範圍第1-13項所述之用Met-var24或X-var24進行早期治療後，示出產生滴度應答。
  18. Met-var24或X-var24，用於治療阿茲海默氏症。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之Met-var24或X-var24，其中藉由皮下給藥或肌內給藥進行該治療。
  20. 如申請專利範圍第18或19項所述之Met-var24或X-var24，其中藉由評估誘導的滴度或IC50進行治療的治療應答的評估。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之Met-var24或X-var24，其中在該患者已經治療1、2、3、4或更多次之後進行治療應答的評估。
  22. 如申請專利範圍第20或21項所述之Met-var24或X-var24，其中該治療應答在包括以下步驟的免疫測定中進行評估 a. 在適當的結合條件下，將免疫測定中的、從阿茲海默氏症患者獲得的樣品用Met-var24塗覆， b. 測量抗體滴度或IC50。
  23. 如申請專利範圍第20-22項所述之Met-var24或X-var24，其中如果滴度和/或IC50示出在所免疫患者中獲得有益的抗體應答，則繼續對該患者進行免疫療法。
  24. 如申請專利範圍第23項所述之Met-var24或X-var24，其中如果滴度和/或IC50示出在所免疫患者中沒有獲得有益的抗體應答，則停止對該患者進行免疫療法。
  25. 如申請專利範圍第22-24項所述之Met-var24或X-var24，其中該免疫測定係ELISA或MSD測定。
  26. 如申請專利範圍第23項所述之Met-var24或X-var24，其中滴度高於1.000指示有益的抗體應答。
  27. 如申請專利範圍第23項所述之Met-var24或X-var24，其中IC50在約200至約1000 pM的範圍內指示有益的抗體應答。
  28. 如申請專利範圍第18項所述之Met-var24或X-var24，其中該患者接受50 µg、100 µg、250 µg、500 µg或1000 µg的Met-var24或X-var24的劑量。
  29. 如申請專利範圍第28項所述之Met-var24或X-var24，其中每2週、每4週或每6週進行一次治療。
  30. 如申請專利範圍第18-29項所述之Met-var24或X-var24，其中該患者係高加索人。
  31. 如申請專利範圍第18-29項所述之Met-var24或X-var24，其中該患者在接受所述有效量的Met-var24或X-var24之前已經接受過破傷風類毒素疫苗。
  32. 如申請專利範圍第18-29項所述之Met-var24或X-var24，其中該患者在接受所述有效量的Met-var24或X-var24之前已經接受了包含來自破傷風類毒素的P2和/或P30的疫苗。
  33. 如申請專利範圍第18-29項所述之Met-var24或X-var24，其中該患者接受2個同時劑量的250 µg Met-var24或X-var24的劑量方案。
  34. 一種Met-var24或X-var24，分別由SEQ ID NO:2或3所定義。
  35. 如申請專利範圍第34項中所定義的Met-var24，其處於藥物組成物中，所述藥物組成物包含純度為90%，例如95%、98%或100%的Met-var24作為僅有的免疫原性肽。
  36. 一種用於定量來自阿茲海默氏症患者的抗體之體外方法，該方法包括以下步驟 c) 從患者取樣品， d) 在免疫測定中分析該樣品。
  37. 如申請專利範圍第36項所述之方法，其中該免疫測定包括在該免疫測定中將Met-var24吸附至固相，例如板的第一步驟。
  38. 如申請專利範圍第36和37項所述之方法，其中該免疫測定係ELISA或MSD。
  39. 如申請專利範圍第36和37項所述之方法，其中該樣品取自已經用Met-var24或X-var24治療1、2、3、4次或更多次的患者。
  40. 如申請專利範圍第36項所述之方法，其中使用獲得的數據來計算IC50。
  41. 如申請專利範圍第40項所述之方法，其中滴度的IC50在約200至約1000 pM的範圍內指示針對患者腦中的abeta有益的抗體應答。
  42. 如申請專利範圍第36項所述之方法，其中在樣品中確定該滴度。
  43. 如申請專利範圍第42項所述之方法，其中滴度高於1.000指示針對患者腦中的abeta有益的抗體應答。
  44. 一種Met-var24在免疫測定中用於確定用Met-var24或X-var24治療的患者的治療應答之用途。
  45. 一種Met-var24 ，用於確定用Met-var24或X-var24治療的阿茲海默氏症患者的治療應答。
  46. 如申請專利範圍第45項所述之Met-Var24或如申請專利範圍44所述的用途，其中該治療應答在包括以下步驟的免疫測定中進行評估 a. 在適當的結合條件下，將免疫測定中的、從阿茲海默氏症患者獲得的樣品用Met-var24塗覆， b. 測量抗體滴度或IC50。
  47. 如申請專利範圍第45項所述之Met-Var24或如申請專利範圍44所述的用途，其中如果滴度和/或IC50示出在所免疫患者中獲得有益的抗體應答，則繼續對該患者進行免疫療法。
  48. 如申請專利範圍第45項所述之Met-Var24或如申請專利範圍44所述的用途，其中如果滴度和/或IC50示出在所免疫患者中沒有獲得有益的抗體應答，則停止對該患者進行免疫療法。
  49. 如申請專利範圍第46項所述之Met-Var24，其中該免疫測定係ELISA或MSD測定。
  50. 如申請專利範圍第47項所述之Met-Var24，其中滴度高於1.000指示有益的抗體應答。
  51. 如申請專利範圍第47項所述之Met-Var24，其中IC50在約200至約1000 pM的範圍內，每個值分別指示有益的抗體應答。
  52. 如申請專利範圍第45項所述之Met-Var24或如申請專利範圍44所述之用途，其中該患者接受50 µg、100 µg、250 µg、500 µg或1000 µg Met-var24或X-var24的劑量。
  53. 如申請專利範圍第45項所述之Met-Var24或如申請專利範圍44所述的用途，其中每2週、每4週或每6週進行一次治療。
  54. 如SEQ ID NO: 1 、SEQ ID NO: 2 或 SEQ ID NO: 3 中描述的構建體，用於在免疫測定中使用。
  55. 如申請專利範圍第54項所述之構建體，其中該免疫測定係MSD或ELISA。
  56. 如申請專利範圍第54或55項所述之構建體，其中將Met-var24在免疫測定中在適當的結合條件下鋪板。
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