UA120264C2 - Сполука для застосування в способі лікування імунодефіциту сd4-т клітин у суб'єкта - Google Patents

Сполука для застосування в способі лікування імунодефіциту сd4-т клітин у суб'єкта Download PDF

Info

Publication number
UA120264C2
UA120264C2 UAA201608118A UAA201608118A UA120264C2 UA 120264 C2 UA120264 C2 UA 120264C2 UA A201608118 A UAA201608118 A UA A201608118A UA A201608118 A UAA201608118 A UA A201608118A UA 120264 C2 UA120264 C2 UA 120264C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
cells
still
siv5ri
subject
antibodies
Prior art date
Application number
UAA201608118A
Other languages
English (en)
Inventor
Жак Тез
Жак Тэз
Т'єрі Роз
Тьери Роз
Флоранс Бюго
Original Assignee
Енстітю Пастер
Енститю Пастэр
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Енстітю Пастер, Енститю Пастэр filed Critical Енстітю Пастер
Publication of UA120264C2 publication Critical patent/UA120264C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/38—Antigens from snakes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01004—Phospholipase A2 (3.1.1.4)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G01N2333/918—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • G01N2333/92—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

Винахід стосується сполуки для застосування в способі лікування імунодефіциту СD4-Т клітин у суб'єкта, де сполука є інгібітором секретованої фосфоліпази А2 групи ІВ (PLA2GIB) вибрана з анти-PLA2GIB антитіла або розчинного рецептора PLA2GIB, де PLA2GIB є білком, що містить амінокислотні залишки 23-148 з SEQ ID NO: 2 або його природний варіант. Також винахід стосується фармацевтичної композиції, яка містить у формі ін’єкційного розчину або суспензії, інгібуюче антитіло секретованої фосфоліпази А2 групи ІВ (PLA2GIB), та фармацевтично прийнятий носій або наповнювач, придатний для ін’єкційного розчину або суспензії, де PLA2GIB є білком, що містить амінокислотні залишки 23-148 з SEQ ID NO: 2 або його природний варіант, та застосовується в способі лікування імунодефіциту СD4-Т клітин у суб'єкта.

Description

Галузь техніки, до якої відноситься винахід
Даний винахід відноситься до композицій і способів модуляції імунної системи суб'єкта, який цього потребує. Зокрема, у винаході розкрита наявність ключового ендогенного фактора імунної відповіді й дана його характеристика, і пропонуються нові терапевтичні й діагностичні способи й композиції на основі модуляції цього фактора. Зокрема, винахід забезпечує композиції й способи, придатні для стимуляції або інгібування імунної відповіді, опосередкованої СО4 Т- клітинами, у суб'єкта, а також способи й композиції для моніторингу імунодефіциту, включаючи імунодефіцит, пов'язаний з інфекцією вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ). Також пропонуються способи й композиції для діагностики й аналізу дефектів СО4 Т-клітин, що залишилися після антиретровірусної терапії, а також способи розробки лікарських засобів, здатних специфічно лікувати цей імунодефіцит.
Вступ
Ср4 Т-лімфоцити відіграють виняткову роль у контролі імунної системи (як клітинної, так і гуморальної відповіді) і є критичними при різних патологічних станах.
При імунологічному захворюванні, пов'язаному з патогенезом ВІЛ, менше 0,595 СА Т- клітин є дійсно інфікованими (за результатами вимірювання в периферійній крові), але основна більшість СО4 Т-клітин демонструють значну регуляторну дисфункцію. Неїінфіковані СО4 Т- лімфоцити наростаюче втрачають свою функцію, стають анергійними, і їх кількість знижується, приводячи до СО4-лімфопенії. Анергія й лімфопенія є ключовими характеристиками імунодефіциту, характерного для ВІЛ-інфікованих пацієнтів. Механізми, що лежать в основі цього феномена, ніколи не були повністю пояснені (1).
Імунна активація й запалення також відіграють критичну роль у патогенезі ВІЛ (2, 3). Автори винаходу раніше показали, що зниження здатності до відповіді на інтерлейкін-2 (1І/-2), що приводить до СО4 анергії (4), і зниження здатності до відповіді на інтерлейкін-7 (І/-7) при розриві І/-7/204 регуляторної петлі беруть участь у механізмі що призводить до СО4 лімфопенії (5). Задіяні механізми пов'язані з дефектами шляху Янус-кінази/переносника сигналу й активатора транскрипції (ЗТАТ) (6, 7). Подібні результати були отримані іншими лабораторіями (8, 9). У зв'язку із цим, компартменталізація рецептора 1-7 (ІІ -7К) необхідна для ініціації нормальної СО4 Т-клітинної відповіді (10). При зв'язуванні ІІ -7 два ланцюги 1-78 (11-78
Зо альфа й гамма - с) спочатку направляються в мембранні мікродомени (ММД). Існують клітинні компартменти, які, як ліпідні рафти, багаті на холестерин і сфінгомієлін, але вони також містять значні кількості структурних і функціональних білків (11) Комплекси 1Г-7К індукують реорганізацію цитоскелета, який потім взаємодіє з їхніми мережами. Ці два послідовні етапи необхідні для ініціації шляху Чдак/зтТАТ (12).
Автори даного винаходу досліджували механізми, які лежать в основі нездатності до відповіді СО4 Т-лімфоцитів у ВІЛ-інфікованих пацієнтів з віремією (ВП). Проведені експерименти продемонстрували, що хронічна активація СО4 Т-лімфоцитів приводить їх в аберантний стан активації/диференціювання, що робить їх несприйнятливими до певних фізіологічних сигналів, таких як ті, що забезпечує інтерлейкін-7. Далі, даний винахід описує ідентифікацію, виділення із плазми людини й характеристику білка, який відповідає за цей аберантний стан активації СО4 Т-клітин. Таким чином, насамперед, даний винахід демонструє, що імуносупресія може бути опосередкована ендогенним циркулюючим білком, який при експресії здатний до індукції ушкодження й інактивації СО4 Т-клітин, а при інгібуванні може стимулювати імунну систему суб'єкта.
Грунтуючись частково на цих значних спостереженнях, у винаході пропонуються нові способи, композиції й сполуки для модуляції імунної системи, зокрема, для модуляції імунної системи в суб'єктів з порушеним імунітетом (наприклад, із пригніченням імунітету або патологічними імунними реакціями). Винахід також забезпечує нові способи лікування імунних порушень шляхом модуляції СО4 Т-клітин. Зокрема, винахід придатний для лікування імунодефіцитів, пов'язаних з СО4 Т-клітинними порушеннями, такими як синдром імунодефіциту, пов'язаний з ВІЛ-інфекцією. Винахід також забезпечує реагенти й способи для характеристики аберантного стану активації, реактивності на 1ІІ--7 і/або для моніторингу імунної відповіді, порушеної у ВІЛ-інфікованих пацієнтів. Може бути оцінена відповідь СО4 Т-клітин у пацієнтів, які не одержували лікування або у пацієнтів, які одержували лікування антиретровірусними засобами, і кваліфікована їхня відповідь на лікування, і оцінена компетентність їх СО4 Т-клітин.
Виклад сутності винаходу
Об'єкт даного винаходу відноситься до способу модуляції імунної відповіді в суб'єкта, який передбачає застосування для суб'єкта сполуки, яка модулює кількість (наприклад, експресію) 60 або активність СІВ5РІ А2.
Інший об'єкт даного винаходу відноситься до способу лікування імунного порушення в суб'єкта, який передбачає застосування для суб'єкта сполуки, яка модулює кількість (наприклад, експресію) або активність СІВ5РІ А2.
Інший об'єкт даного винаходу відноситься до способу лікування імунного порушення в суб'єкта, який передбачає модуляцію кількості (наприклад, експресії) або активності СІВ5РІ А2 у суб'єкта.
Інший об'єкт винаходу відноситься до застосування сполуки, яка модулює кількість (наприклад, експресію) або активність СІВ5РІ А2, для одержання медикаменту для модуляції імунної відповіді або для лікування імунного порушення в суб'єкта.
Інший об'єкт винаходу відноситься до модулятора СІВ5РІ А2 для застосування в способі модуляції імунної відповіді або лікування імунного порушення в суб'єкта.
Інший об'єкт винаходу відноситься до модулятора СІВ5РІ А2 для застосування з метою модуляції білих кров'яних клітин у суб'єкта.
У першому варіанта здійснення винахід застосовується для індукції або стимуляції імунної відповіді в суб'єкта, і включає інгібування СІВ5РІ А2 у зазначеного суб'єкта, або застосування для суб'єкта інгібітора СІВ5РІ А2. Такий варіант здійснення найкращий для лікування суб'єктів з імунодефіцитом або суб'єкта, який потребує стимуляції імунітету (наприклад, при інфекційних захворюваннях, раку тощо).
Таким чином, об'єкт винаходу відноситься до способу стимуляції імунної відповіді в суб'єкта, який передбачає інгібування СІВ5РІ А2 у зазначеного суб'єкта, або застосування для суб'єкта інгібітора СІВ5РІ А2.
Інший об'єкт винаходу відноситься до способу лікування інфекційного захворювання в суб'єкта, який передбачає інгібування СІВ5РІ А2 у зазначеного суб'єкта, або застосування для суб'єкта інгібітора СІВ5РІ А2.
У більш конкретному варіанті здійснення винахід відноситься до способу лікування СНІДУ у
ВІЛ-інфікованого суб'єкта, який передбачає інгібування СІВ5РІ А2 у зазначеного суб'єкта, або застосування для суб'єкта інгібітора СІВ5РІ А2.
У окремому варіанті здійснення застосування для суб'єкта інгібітора включає введення інгібітора суб'єктові. В іншому варіанті здійснення застосування для суб'єкта інгібітора включає
Зо вакцинацію суб'єкта проти СІВ5РІ А2.
У зв'язку із цим, у окремому варіанті здійснення винахід відноситься до способу стимуляції імунної системи у суб'єкта, який цього потребує, який передбачає вакцинацію суб'єкта проти
СІВ5РІ Аг.
В іншому окремому варіанті здійснення винахід відноситься до СІВ5РІ А2 антигена для застосування з метою вакцинації суб'єкта, який цього потребує.
В іншому аспекті винахід використовується для зниження або супресії небажаної або шкідливої імунної відповіді у суб'єкта, і включає індукцію або підвищення СІВ5РІА2 у зазначеного суб'єкта, або застосування для суб'єкта агоніста або активатора СІВ5РІ А2. Такий варіант здійснення особливо придатний для лікування суб'єктів, які мають аномальну і/або патологічну імунну відповідь (наприклад, аутоїмунних захворювань, запалення, кропивниці, екземи, алергії, астми тощо).
В іншому аспекті винахід забезпечує способи діагностики імунодефіциту людину, пов'язаного з порушенням СО4 Т-клітин. У деяких варіантах здійснення способи передбачають (а) забезпечення зразка, який містить рідину організму, бажано плазму суб'єкта, і (Б) детекцію наявності СІВ5РІА2 у зразку. У деяких варіантах здійснення способів імунодефіцит є імунодефіцитом, пов'язаним з інфекцією вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ) У деяких варіантах здійснення спосіб передбачає забезпечення контакту зразка з антитілом, специфічним до СІВ5РІ А2. У деяких варіантах здійснення способів присутність СІВ5РІ А2 у зразку визначають імуноферментним аналізом ЕГІЗА.
В іншому аспекті винахід забезпечує способи ідентифікації потенційних терапевтичних агентів для імунодефіциту. У деяких варіантах здійснення імунодефіцит пов'язаний з ушкодженням СО4 Т-клітин. У деяких варіантах здійснення способів імунодефіцит людини, пов'язаний з ушкодженням СО4 Т-клітин, спричинений вірусною інфекцією, зокрема, інфекцією вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ). У деяких варіантах здійснення способи передбачають: (а) забезпечення контакту СО4 Т-лімфоцитів з СІВ5РІ А2 у присутності агента; (Б) вимірювання
СІВ5РІ Аг2-індукованої СО4 Т-клітинної активації, і (с) порівняння рівня СІВ5РІ А2г-індукованої
Сбра4 Т-клітинної активації в присутності агента з рівнем СІВ5РІ А2-індукованої СО4 Т-клітинної активації за відсутності агента. У деяких варіантах здійснення способу, якщо рівень СІВ5РІ А2- індукованої СО4 Т-клітинної активації в присутності агента нижче рівня СІВ5РІ А2-індукованої бо Са Т-клітинної активації за відсутності агента, то агент ідентифікують як потенційний агент для лікування імунодефіциту. У деяких варіантах здійснення способів, якщо рівень СІВ5РІ Аг2- індукованої СО4 Т-клітинної активації в присутності агента не нижче рівня СІВ5РІ А2-індукованої
СбОр4 Т-клітинної активації за відсутності агента, то агент ідентифікують як потенційно терапевтичний агент для імуносупресії. У деяких варіантах здійснення способи передбачають вимірювання СІВ5РІ А2-індукованої СО4 Т-клітинної активації шляхом визначення числа ММД на СО4 Т-клітинах. У деяких варіантах здійснення способи передбачають вимірювання
СІВ5РІ Аг-індукованої СО4 Т-клітинної активації шляхом визначення середнього діаметра ММД на СО4 Т-клітинах. У деяких варіантах здійснення способи передбачають вимірювання
СІВ5РІ Аг-індукованої СО4 Т-клітинної активації шляхом визначення здатності СО4 Т-клітин до відповіді на ЇЇ -7.
В іншому аспекті винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить модулятор
СІВ5РІА2 ії фармацевтично придатний носій або допоміжну речовину. У кращому варіанті здійснення модулятор СІВ5Р'І А2 є інгібітором СІВ5РІ А2, краще, обраним з поміж антитіла або його фрагмента або похідного, інгібуючої нуклеїнової кислоти, пептиду або низькомолекулярних ліків. В іншому окремому варіанті здійснення модулятор СІВ5РІ А2 є агоністом або активатором
СІВ5РІ А2, більш конкретно СІВ5РІ А2 білком.
В іншому аспекті винахід відноситься до вакцинної композиції, яка включає СІВ5РІА2 антиген (наприклад, імуногенний (ІВ5РІ А2 білок або його епітоп-вмісний фрагмент), фармацевтично придатний носій або допоміжний засіб, і факультативно, ад'ювант. У кращому варіанті здійснення СІВ5РІ А2 антиген є СІВ5РІА2 білком або його фрагментом, обробленим для (Її) підвищення його імуногенності в людських індивідуумах і/або (ії) зниження його біологічної активності.
Винахід можна застосовувати для будь-якого ссавця. Він особливо придатний при застосування для людських індивідуумів. Його можна застосовувати для підвищення імунної відповіді в будь-якого ссавця, і він особливо придатний для індукції потужної СО4-Т-клітинної активності в суб'єктів з імунодефіцитом.
Короткий опис креслень
Фіг. та-146е демонструють, що перед стимуляцією СО4 Т-клітини від МР демонструють аберантний стан активації з великою кількістю більших мембранних мікродоменів, на які не
Зо впливає 1-7. (а) Мембранні мікродомени (ММД) маркували субодиницею В холерного токсину (СІХхХВ-
АРГ488) і аналізували за допомогою 5ТЕО мікроскопії (мікроскопії зниження індукованої емісії).
Зверху вниз, очищені СО4 Т-клітини від НО, МР, і ФГА-активовані (40 мкг/мл, 30 хвилин) НО Т- клітини. Для кожної групи верхньої половини СО4 Т-клітини прикладу до й після стимуляції 1-7 (2 нм, 15 хв.) показані із серіями зображень зрізів по осі 7. СО4 Т-лімфоцити також обробляли холестериноксидазою (ХОаза, 31 мкМ, 25 хвилин), плюс сфінгомієліназою (СМаза; 2,7 мкМ, 5 хвилин) перед стимуляцією ІЇІ--7. (б, с) ММД підраховували по всій поверхні очищених С04 Т-клітин. У середньому оцінювали 50 клітин. (Б) НО клітини до (НОс: М5) і після стимуляції 1--7 (НОс: 1-7). (с) МР клітини до (МРс:
М5) і після стимуляції І--7 МР (МРе: 1-7), ФГА-активовані НО клітини до (НОс: РНА) і після стимуляції 1--7 (НОс: РНАЛІ- -7). (ад, є) Розмір ММД визначали на поверхні очищених СО4 Т-клітин (4) стимульовані І--7 НО клітини (НОс: 1-7), (е) стимульовані ІЇ-7 МР клітини (МРе: 1-7) ї І/-7-стимульовані ФГА- активовані НО клітини (НОс: 1-7).
Фіг. 2а-2с демонструють, що ланцюги І.-7К з МР СО4 Т-клітин вбудовані в детергент- резистентні мікродомени (ДРМ), на які не впливає 1-7. Очищені СО4 Т-лімфоцити лізували (0,5 9о Тритон Х-100), і 200 мкл лізату завантажували на 5-40 95 градієнт сахарози. Після 16 годин центрифугування (50000 об./хв.) при 42С збирали 18 фракцій (241 зліва - верх пробірки - 595 сахарози; 218 праворуч - дно пробірки - 40 95 сахарози). Кожну фракцію аналізували на
ДСН-ПАГЕ (7 95 акриламід-бісакриламід). Флотілін, І -7/К альфа й гамма-с виявили шляхом імуноблотинга (10). (а) Флотілін використовували як маркер для індикації фракцій з низькою щільністю, що відповідають ДРМ і фракцій з високою щільністю поза рафтами. (Б) Смуги І--7В-альфа й (с) гамма-с показані для очищених не стимульованих НО С04 Т- клітин (НОс: М5), І--7-стимульовані НО клітини (НОс:1ІІ--7), не стимульовані УР клітини (МРС:М5) і
ФГА-активовані НО клітини (НОС:РНА).
Фіг. За-3с демонструють, що функція І--7К ушкоджена в мембранних мікродоменах МР Срі4
Т-клітин. (а) Швидкості двовимірної ефективної дифузії Юег для ІЇ-7Н-альфа були визначені, як бо зображено на Фіг. 7. Швидкості дифузії були також визначені після додавання різних ліків:
Хоази (31 мкМ, 30 хв.) плюс СМази (2,7 мкМ, 5 хв.) (СО/5М), Сої (10 мкМ, 30 хв.) плюс Сую (20
МКМ, 30 хв.) (СУЮ/СоЇї), або в присутності всіх цих інгібіторів (аі). Вивчали СО4 Т-клітини з НО (НОс) і МР (МРС), а також ФГА-активовані НО СО4 Т-клітини (НОс: РНА). Стовпчики вказують
СКО від 5 незалежних експериментів. Додаткові експериментальні дані наведені на Фіг. 8. (5) 1/-7-індуковане фосфорилювання і ядерну транслокацію ТАТО проводили із застосуванням кролячих фосфо-ЗТАТ5, маркованих козячими антитілами проти кролячих
АНоб42, і аналізували за допомогою імпульсної ТЕО мікроскопії (зрізи 0,5 мкМ).
В експериментах використовували очищені не стимульовані НО С04 Т клітини (НОс: М5), 1--7- стимульовані НО С04 Т клітини (НОс: 1-7), не стимульовані МР С04 Т клітини (МРес: М5), 1-7 стимульовані МР С04 Т клітини (МРе:І--7), ФГА-активовані НО СО4 Т-клітини (НОС:РНА) і ФГА- активовані НО СО4 Т-клітини, стимульовані І/-7 (НОс:РНАЛІ-7). Ефекти колхіцину плюс цитохалазину О показані на лівій панелі. (с, а, е) Після стимуляції І/-7 вимірювали кінетику появи фосфо-5ТАТ5 у цитоплазмі, і накопичення в ядрі, із застосуванням програмного забезпечення Ітаде.-. (с) НО 204 Т-клітини (чорна лінія) і НО С04 Т-клітини, оброблені СоЇ плюс СУуЮ (синя лінія), (4) МР СО4 Т-клітини (червона лінія) і (е) ФГА-активовані НО С04 Т-клітини (зелена лінія).
Фіг. 4а-4й4 демонструють, що плазма від УР індукує аберантний характер активації в НО С04
Т-клітинах, за результатами визначення числа ММД. (а) Показані зображення прикладів НО СО4 Т-клітин, оброблених плазмою (10 95) від МР (НОс: МРр), НІС (НОс: НІСр) або АКТ пацієнтів (НОс: АКТр). ММД фарбували холерним токсином (СіхВ-АР488). Для кожної групи показана верхня половина зображень по осі 7 прикладу СО4 Т-клітин до (ліворуч) і після стимуляції ІІ -7 (2 нм, 15 хв.) (праворуч). (Б) ММД, індуковані на поверхні СО4 Т-клітин (НОс) плазмою (10 95) від 5 різних МР (МРр1-
МРр5). Результати були отримані від аналізу 50 клітин до (білі) і після (сині) стимуляції ІЇ--7.
Показані середні значення й квартилі. (с) Порівняння ефектів плазми від НО (НОр), МР (МРр), НІС (НІСр) ї АКТ пацієнтів"АКТр) після (синій) і до (білий) стимуляції ІІ -7. (4) Відповідь залежна від дози (0,01 95-10 95), отримана для плазми, описаної на (с).
Показане число ММД, індукованих на поверхні НОс СО4 Т-клітин. Ефект МР плазми показаний
Зо неперервною червоною лінією.
На фіг. 5а-5а показано, що плазма від УР інгібує І--7-індуковане фосфорилювання 5ТАТ?5 і ядерну транслокацію фосфо-5ТАТ5 в НО С04 Т-лімфоцитах. (а) Перед стимуляцією 1-7 очищені НО СО4 Т-клітини попередньо інкубували із плазмою (10 9). І/-7-індуковане фосфорилювання і ядерну транслокацію фосфо-5ТАТЬ5 досліджували імпульсною 5ТЕО мікроскопією (зрізи 0,5 мкМ). Досліджували наступну плазму: контроль (НОс:
М5), МР (НОс: МР р), НІС (НОс: НІС р) і АКТ пацієнтів (НОс: АКТр). (Б) Аналіз фосфо-5ТАТЬ5 у цитоплазмі (синій) і ядрі (червоний) І -7-стимульованих НО СО4
Т-клітин, попередньо оброблених плазмою від 5 різних УР (10 95). (с) Порівняння ефектів попередньої інкубації із плазмою (10 95) для І-7-стимульованих НО
Сбра4 Т-клітин. Плазму брали від НО (НОр), МР (МР р), НІС (НІСр) і АКТ пацієнтів (АКТр). (4) Залежна від дози відповідь (0,01 95-10 90), отримана із плазмою, за результатами вимірювання інгібування фосфо-ЗТАТ5 ядерної трансллокації в ІІ -7-стимульованих НО С04 Т- клітинах. Ефект УР плазми показаний неперервною червоною лінією.
На Фіг. ба-ба показана молекулярна характеристика фактора, який індукує резистентність (КІЕ), отриманого із плазми МР. (а) Обробка МР плазми трипсином, ДНКазою, РНКазою і ПНГазою. КІР активність досліджували шляхом вимірювання числа ММД і впливу на ІІ -7-індукований ядерний фосфо-
ЗТАТЬ5 в НО С04 Т-клітинах. (б) Молекулярну масу КІЕЄ визначали шляхом гель-фільтрації на колонці із Сефадексом-
С100. КІБЄ активність на НО СО4 Т-клітинах визначали шляхом вимірювання числа ММД, індукованих різними фракціями зі колонки (товста червона крива). Кожну фракцію також тестували на присутність вірусних білків шляхом дот-блотинга із застосуванням поліклональних антитіл з МР. Віднімали тло, отримане з НО плазмою. Експерименти повторювали три рази. (с) Молекулярну масу КІР також визначали після гель-фільтрації на колонці із Сефадексом
С100, ії його активність після інгібування ІІ -7-індукованого фосфо-ЗТАТ5 визначали за допомогою ЕАС5. Реєстрували процентний вміст максимальний ІІ -7-індукованих фосфо-
ЗТАТ»5. Також реєстрували кількість білка в кожній фракції. Експерименти повторювали двічі. (а) Ізоелектричну точку визначали в такий спосіб. КІР, елюйований зі колонки із Сефадексом 0100, завантажували на аніоно- (Мопос)) або катіоно- (Мопо5) обмінну колонку. КІЕ активність елюювали буферами в ступеневому градієнті рН. Будували криву залежності числа ММД на НО
Сбр4 Т-клітинах проти рн.
На Фіг. 7а-7с показаний двомірний аналіз у гелі ІЇ-7 сигналосоми на очищених СО4 Т- клітинах від НО, МР і 1-7 стимульованих НО клітин. (а) Не стимульовані (М5) НО С04 Т-клітини. (5) МР С04 Т-клітини. (с) І-7-стимульовані НО С04 Т-клітини.
На Фіг. ва-8у показаний аналіз швидкості дифузії І.-7А-альфа на поверхні очищених СО4 Т- клітин від НО, МР і ФГА-стимульованих НО клітин. (а, 4) на поверхні НО С04 Т-клітин, (Б, є) на поверхні МР С04 Т-клітин, (с, У на поверхні НО С04 Т-клітин, попередньо активованих ФГА (1 мкг/мл). (4) Схема механізму дифузії І.-7РВ-альфа, вбудованого в ММД, до й після обробки інгібіторами ММД або інгібіторами цитоскелета.
На Фіг. 9а-94 показана схематична вистава гіпотетичного способу дії КІЕ на НО С04 Т- клітинах, і механізм відсутності відповіді на 1-7. КІБ індукує аномальні ММД, які є не функціональними. Таким чином, І/Ї/-7 сигналосома ушкоджується, і клітини залишаються нездатними відповідати на цитокін, як в МР СО4 Т-клітинах. Аберантний спосіб активації й дефекти передачі сигналу в КіР-індукованих НО СО4 Т-клітинах і в МР СО4 Т-клітинах є нерозрізненими. Ліва частина схеми ілюструє різні етапи в механізмах передачі 1-7 сигналу в
НО (10, 12). (а) У Т-клітинах, які споживають СО4, перед розпізнаванням 1/-7, ланцюги 1Ї/-7К є асоційованими, але їх інтрацитоплазматичні домени віддалені, і сигнальні молекули Чак! і Чакз не взаємодіють. (б) В 1-7 активованих СО4 Т-клітинах І/-7К компартменталізований у нормальних
ММД (90 нм у діаметрі), і сигналосома стає функціональною. Після організації цитоскелета
ЗТАТ5А і БТАТ5ЬВ фосфорилюються в контакті з П/-7К/Лдак1/дакз3 комплексами, потім мігрують у ядро шляхом пересування по мікротрубочках, як обговорювалося раніше (12).
Права частина схеми ілюструє гіпотетичний механізм дії КІЄ. Запропонований механізм дії отриманий з попередніх даних і порівняння КіІЕ-індукованих дефектів з порушеннями, що характеризують очищені СО4 Т-клітини від УР (неопубліковані дані). (с) ВІР індукує багато великих аномальних ММД. 1 -7А вбудований в аномальні ММД, ії його здатність до індукції функціональної сигналосоми порушена.
Зо (4) Оброблені КІЕ НО С04 Т-клітини не відповідали на ІЇ-7. Чдак! і хакз фосфорилюють
ЗТАТ5, хоча зі зниженою кінетикою, але фосфо-5ТАТ5 не мігрує в ядро через відсутність організації цитоскелета й мікротрубочок.
На панелях а, Б, с і а показані зображення, отримані при 5ТЕО мікроскопії ММД, маркованих
СіхВ: АР488 (половина стовпчика по 2-осі від СМУ-5ТЕЮВ). На панелях Б і а показаний тибулін, пофарбований кролячими антитілами до тибуліну/козячими антитілами проти кролячого
АНоб42; актин, пофарбований мишачими антитілами до актину/козячими антитілами проти мишачого Спг494, і фосфо-5ТАТ5, пофарбований кролячими антитілами до фосфо-
ЗТАТ5/козячими антитілами до кролячого Айоб42. Імпульсна ЗТЕЮО мікроскопія демонструє 0,5 МКМ зріз СО4 Т-клітин, оброблених метанолом. Після стимуляції ІЇ/-7, актин у ММД цитоплазматичній області КіІР-оброблених НО СО4 Т-лімфоцитів був нездатний концентруватися у вигляді структурованих подушок, і не формував кортекс, який оточує ядро, на відміну від НО. Далі, тибулін у цих КІР-оброблених НО СО4 Т-клітинах, як в МР С04 Т- клітинах, не може формувати мікротрубочки, які, як передбачається, відіграють ключову роль у формуванні моста між цитоплазмою і ядерною мембраною, і таким чином, необхідні для ядерної трансллокації 5ТАТЬ.
Узагальнення дефектів: кружки з номерами 1, 2, З і 4 указують різні дефектні етапи, пов'язані з аберантним режимом активації й нездатністю до відповіді на ІЇ-7 в КІг-оброблених
НО Т-клітинах: (1) аномальний характер білків сигнального комплексу, як описано двовимірними гелями, (2) аномальні мембранні структури, такі як великі ММД, як видно при 5ТЕО мікроскопії, (3) аномальна організація цитоскелета, як визначено за кінетикою дифузії й за допомогою 5ТЕЮО мікроскопії, ії (4) аномальні проміжні переносники сигналів і інгібування ядерної трансллокації фосфо-5ТАТЬ5, як показано 5ТЕО мікроскопією.
Фіг. 10: РІ А250ІВ інгібує індуковану І/-2 ядерну транслокацію Реїа(5 в СО4 Т-клітинах здорових донорів (НО): Спочиваючі СО4 Т-клітини, очищені від 4 здорових донорів, обробляли протягом 30 хвилин при 37 "С з З 95 або 1 95 плазмою від 5 МР (МРб3, МРб8, МРбО9, МР74 і МР 75) і від З НО, які були використані як контроль. Коли це зазначено, їх стимулювали з 2нМ 1-2 протягом 15 хвилин при 37 "С. Процентний вміст клітин, позитивних за ядерним Раїаїб5, із середнім значенням і СКО, показаний у всіх СО4 Т-клітинах (а) і в СО4-С025-Т-клітинах (Б), до (сині точки) і після стимуляції ІЇ/-2 (червоні точки). Внутрішньоклітинну локалізацію Реїйаї5 бо спостерігали із застосуванням лазерної скануючої конфокальної мікроскопії (5М 700, 2еїі55)
після непрямого фарбування кролячими антитілами до людського Реїаї5 (руб94), з подальшою обробкою антитілами віслюка до кролячого ДС з барвником ЮОіє ІН 405. Загальні СО4 Т- клітини фарбували козячими антитілами до людського р-тибуліну, а потім антитілами віслюка до козячого ІдсС-аї555. СО25-004 Т-клітини обробляли мишачими антитілами до людського
СО25, а потім антитілами віслюка до мишачого ІдДО-АЕ488.
Фіг. 11: РІ А250ІВ інгібує 1-4 індуковану ядерну транслокацію Роїіа(б в СО4 Т-клітинах здорових донорів (НО): Спочиваючі СО4 Т-клітини, очищені від 4 здорових донорів, обробляли протягом 30 хвилин при 37 "С з З 95 або 1 95 плазми від 5 МР (МРбБЗ3, МРб8, МРбО9, МР74 і МР 75) і від З НО, які були використані як контроль. Коли це зазначено, їх стимулювали 2 нМ 1-4 протягом 15 хвилин при 37 "С. Показаний процентний вміст клітин, позитивних щодо наявності ядерного Реїаїб, із середнім значенням і СКО, у всіх СО4 Т-клітинах, до (сині точки) і після стимуляції //-2 (червоні точки). Внутрішньоклітинну локалізацію Реаїб спостерігали із застосуванням лазерної скануючої конфокальної мікроскопії (ЗМ 700, 7еї55) після непрямого фарбування кролячими антитілами до людського Роб(іаїб (руУб94), з подальшою обробкою козячими антитілами до кролячого ІдД0-АР488. Загальні СО4 Т-клітини фарбували мишачими антитілами до людського альфа-тибуліну, а потім козячими антитілами до мишачого ІдДс-АЕб647.
Фіг. 12: Відсутність активності мутантної рРІ А2СІВ Н4ів81о.
Фіг. 13: Порівняння активності клонованої свинячої РІ А2 СІВ дикого типу і її мутанта Н4і80).
А: індукція аномальних мембранних мікродоменів (амМД); В: вплив на 1-7 індуковану ядерну транслокацію фосфо5ТАТЬ (МТ рЗТАТ5).
На Фіг. 14 показана обробка плазми від пацієнтів з віремією козячими антитілами до РІ А2
С18, пов'язаними із сефарозними гранулами. Зелений: МРб8; рожевий: МРбО; синій: МР СОТ.
Після обробки (30 хвилин за кімнатної температури) тестували плазму: а) Визначали процентний вміст СО4 Т-клітин, що демонструють аномальні ММД, після фарбування холерним токсином В (СіІхВ-АЕ488);
Б) Визначали ядерну транслокацію ретТАТ5 після стимуляції 1-7, і підраховували процентний вміст позитивних ядер.
Фіг. 15: Вплив анти-РГІ А2 СІВ антитіл на індукцію аММД і інгібування МТ рзТАТ5.
Фіг. 16: Розчинний РІ А2О1В мишачий рецептор (5МЕК) інгібує активність людської РІ А2О1В (пиРГА2О18В) відносно відповіді на І/-7 СО4 Т-клітин від здорових донорів, при вираженні у вигляді процентного вмісту клітин, позитивних щодо ядерної транслокації Редаї5. Відновлення відповіді розраховували як: 100 х (95 позитивних клітин пидіваєт - 96 Позитивних клітин нодів) / (96 Позитивних клітин у культуральному середовищі - 96 Позитивних клітин ниотв)
Фіг. 17 показує, що плазма від пацієнтів з, невідповідаючими СО4 (СО4-МК) індукує аберантні ММД в НО С04 Т-клітинах - (а) Зображення НО С04 Т-клітин, оброблених плазмою (1 до) від СЮО4-МК пацієнта, отримані із застосуванням мікроскопії структурованого висвітлення (ЗІМ)О. ММД фарбували холерним токсином В (СІхХВ-АР488). Показана виступаюча частина зображень по 2-осі СО4 Т-клітин прикладу. Після стимуляції ІЇ/-7 (2 нм, 15 хвилин) не відзначалася зміни зображення (праворуч). (Б) Крива відповіді залежної від дози (0,0001 95 - 1 95), отримана для плазми від 5 СО4-МЕ пацієнтів (синя крива, середнє значення й СКО) і від хворого прикладу з віремією (червона крива). Число аномальних ММД, індукованих на поверхні
НО Са Т-клітин.
Докладний опис винаходу
Даний винахід відноситься до композицій і способів модуляції імунної системи суб'єкта, який цього потребує. Зокрема, винахід розкриває ідентифікацію СІВ5РІ А2 як ключового ендогенного фактора імунної відповіді, і забезпечує нові терапевтичні й діагностичні способи й композиції на основі модуляції цього фактора.
Гіпотезою даного винаходу було те, що хронічна активація імунної системи у ВІЛ- інфікованих хворих є оаномальною й спрямовує СО4 Т-клітини в аберантний стан активації/диференціювання, за якого відсутя відповідь на гамма-с цитокіни, залучені в контроль багатьох аспектів імунного захисту й гомеостазу СО4 компартмента, незважаючи на той факт, що більше 99,5 96 С04 Т-клітин з периферійного компартмента є неінфікованими. Цю гіпотезу оцінювали автори даного винаходу, і даний винахід проливає світло на природу й значимість цього аберантного стану активації.
Зокрема, у першому аспекті даний винахід демонструє, що характеристики цього стану можуть бути узагальнені в такий спосіб: 1) перед будь-якою стимуляцією всі СО4 Т-клітини у
ВІЛ-інфікованих пацієнтів з віремією (МР) мають численні великі ММД на своїй поверхні, 2) ці аномальні ММД секвестують усі клітинні І--7Н-альфа й гамма-с ланцюги, і 3) ця секвестрація бо ланцюгів в аномальних ММД порушує їхньої здатності до індукції утворення функціональної сигналосоми, 4) приводячи до уповільнення й зменшення 5ТАТ5 фосфорилювання та 5) зниження ядерного імпорту фосфо-5ТАТ5. Цей аномальний характер попередньо існуючих
ММД на поверхні МР СО04 Т-лімфоцитів має багато наслідків, і Є основним механізмом, який пояснює різні прояви імунодефіциту у ВІЛ-інфікованих пацієнтів. Втрата відповіді на 1/-7 є важливим чинником, який почасти пояснює наявну СО4 лімфопенію. Стійка втрата цих клітин в
МР, обумовлена їхньою чутливістю до апоптозу і їх руйнуванням за низькорівневої, але постійної вірусної проліферації, не може бути компенсована, незважаючи на підвищені рівні І - 7. Крім того, оскільки аномальні ММД секвестують усі гама ланцюга в не функціональному стані, це блокує функцію інших цитокінів цієї родини.
Даний винахід далі розкриває ідентифікацію ключових ендогенних факторів, що відповідають за цей аномальний стан імунної системи в інфікованих суб'єктів, і в цілому відповідають за інтенсивну модуляцію імунної відповіді при різних патофізіологічних станах.
Було показано, що зразки плазми від УР дійсно містять активність, позначену як КІР, яка здатна до індукції аберантной СО4 Т-лімфоцитів від здорових донорів (НО). КІР був знайдений у всіх досліджених зразках плазми МР. Патофізіологічне значення цієї активності було продемонстровано за її відсутністю в пацієнтів з контрольованим ВІЛ (НІС), у яких система І-- 7ЛІ-7К є нормальною, а імунна активація є сприятливою. КІЕ також відсутня у плазмі АКТ пацієнтів, у яких знижена імунна активація, відновлена функція І -7К і відновлена кількість
С04 » 500/мм3 (5).
Таким чином, КІЕ є основним фактором, який контролює імунну відповідь, зокрема, через модуляцію СО4 Т-лімфоцитів. Важливо, що КІР індукує аберантний характер активації НО СО04
Т-клітин, який не відрізняється від того, який спостерігається безпосередньо ех мімо в очищених
МР С04 Т-клітинах. Винахід далі показує, що КІЕ є секретованою. фосфоліпазою А2 із групи ІВ
СРГА2 СІВ"). Результати, розкриті в даній заявці, демонструють, що (ї) надлишкова експресія
РІА2 СІВ призводить до потужної імуносупресії, і що (ії) інгібування РІ А2 СІВ приводить до значного підвищення стимуляції імунної функції. Інгібітори СІВ5РІ А2 були здатні до корекції неналежного стану імунних клітин у плазмі суб'єктів, і таким чином, можуть бути використані для лікування (наприклад, профілактики, корекції) імунодефіциту або імунних порушень у ссавців.
Інгібування СІВ5РІ А2 може також індукувати, стимулювати або сприяти збереженню кількості й
Зо функцій СО4 Т-клітин, і таким чином, сприяє стимуляції ефективної імунної відповіді в пацієнтів.
Зокрема, у ВІЛ-інфікованих пацієнтів можна зменшити або зупинити АРТ, де може бути досягнута рівновага між імунним захистом пацієнта й вірусом. Якщо АРТ, призначено рано після інфекції, як передбачається недавніми дослідженнями, об'єднати з інгібіторами КІР, це дозволить запобігти будь-якому КІБ-індукованому порушенню імунної системи. Крім того, у контексті деяких сучасних невдач АРТ, пацієнти з низькою кількістю СО4 після тривалої АРТ можуть одержувати користь від цих інгібіторів. Відповідно, винахід забезпечує способи лікування суб'єкта за допомогою модуляції експресії або активності СІВ5РІА2 у суб'єкта.
Зокрема, винахід забезпечує спосіб модуляції імунної відповіді в суб'єкта, який цього потребує, який вклюпередбачає модуляцію модуляції експресії або активності СІВ5РІ А2 у зазначеного суб'єкта.
Дані, забезпечені в прикладах, також демонструють, що присутність КІР у плазмі суб'єкта вказує на ВІЛ-індукований патогенез стану СО4 Т-клітин. Відповідно, даний винахід забезпечує способи моніторингу й/або діагностики ВІЛ-інфекції в суб'єкта шляхом визначення рівня КІР у плазмі суб'єкта, серед іншого.
Дані, забезпечені в прикладах, додатково демонструють, що число й/або розмір мембранних мікродоменів (ММД) на Т-клітинах суб'єкта вказують на ВІЛ-індукований патогенез стану СО4 Т- клітин. Відповідно, цей винахід також забезпечує способи моніторингу й/або діагностики ВІЛ- інфекції в суб'єкта шляхом визначення числа й/або розміру мембранних мікродоменів (ММД) на
Т-клітинах суб'єкта, серед іншого.
Дані, забезпечені в прикладах, також указують на роль КІЕ у створенні й/або збереженні патологічного стану СО4 Т-клітин у ВІЛ-інфікованих суб'єктів. Відповідно, цей винахід також забезпечує способи для ідентифікації потенційного терапевтичного агента для ВІЛ, які включають порівняння КіІЕ-індукованої СО4 Т-клітинної активації в присутності агента з рівнем
ВІЕ-індукованої СО4 Т-клітинної активації за відсутності агента.
Визначення
Термін "їдентичність послідовності", як він застосовується до нуклеїновокислотної або білкової послідовності, відноситься до кількісного вираження (звичайно у відсотках) нуклеотидів або амінокислотних залишків, що збігаються щонайменше у двох послідовностях, вирівняних із застосуванням стандартизованого алгоритму, такого як вирівнювання 5тіййп-У/агепттап (Зтіїй бо апа М/атепап (1981) У Мої Віо! 147:195-197), С ОБТАЇ М (Тнотрзгоп вї аї. (1994) Мисівєїс Асіа5
Вез 22:4673-4680), або ВІ А5Т2 (АїЇї5спиЇ еї аї. (1997) Мисієвїс Асід5 Ке5 25:3389-34021. ВІ А5Т2 можна використовувати стандартизованим і відтворюваним чином для вставки пробілів в одну з послідовностей для оптимізації вирівнювання й для досягнення більш осмисленого порівняння між ними.
В межах даної заявки, "лікування" або "обробка" означають клінічне втручання з метою зміни природнього курсу в індивідуума, який підлягає лікуванню, і можуть проводитися із профілактичною або лікувальною метою. Необхідні ефекти лікування включають профілактику розвитку або рецидиву захворювання, полегшення симптомів, зменшення яких-небудь прямих або непрямих патологічних наслідків захворювання, запобігання утворенню метастазів, зниження швидкості прогресування захворювання, полегшення або ослаблення патологічного стану, і ремісію або поліпшення прогнозу, але не обмежуються ними. У деяких варіантах здійснення композиції й способи запропоновані винаходом застосовують для уповільнення розвитку захворювання або порушення, або для уповільнення прогресування захворювання або порушення.
Термін "ізольований", як він застосовується в даній заявці, відноситься до молекул (наприклад, нуклеїнової кислоти або амінокислоти), які вилучають із компонента з їхнього природного середовища, виділяють або сепарують, і які щонайменше на 60 95 вільні, бажано на 75905 вільні, і найкраще, на 9095 вільні від інших компонентів, з якими вони природно асоційовані. "Ізольований" поліпептид (або білок) є, наприклад, поліпептидом, виділеним із компонента з його природного середовища, і бажано, очищеним до більше ніж 90 95 або 95 95 чистоти, як визначено, наприклад, за допомогою електрофореза (наприклад, ДСН-ПАГЕ, ізоелектрофокусування (ІЕФ), капілярного електрофореза) або хроматографії (наприклад, іонообмінної або оберненно-фазової ВЕРХ). "Ізольована" нуклеїнова кислота означає молекулу нуклеїнової кислоти, відділену від компонента з його природного середовища й/або зібрану у відмінну конструкцію (наприклад, вектор, касету експресії, рекомбінантний хазяїн тощо). "Нуклеїнова кислота, яка кодує анти-СІВ5РІ А2 антитіло" означає одну або кілька молекул нуклеїнових кислот, які кодують важкі й легкі ланцюги антитіла (або його фрагменти), включаючи таку молекулу (молекули) нуклеїнових кислот в одиничному векторі або окремих векторах, і таку молекулу(и) нуклеїнових кислот, які присутні на одному або декількох ділянках
Зо клітини-хазяїна. "Суб'єкт" означає ссавця. Приклади ссавців включають людей і тварин, які не є людьми, таких як, без обмеження, свійські тварини (наприклад, корови, вівці, собаки і коні); примати, які не є людиною (такі, як мавпи); кролики, і гризуни (наприклад, миші й пацюки). "Модуляція імунної відповіді" означає, у контексті даного винаходу, будь-яку модифікацію кількості або активності або співвідношення імунних клітин, бажано білих кров'яних клітин (наприклад, Т-лімфоцитів, В-лімфоцитів, МК, МКТ-клітин, макрофагів, дендритних клітин). У окремому варіанті здійснення модуляція імунної відповіді включає модуляцію кількості або активності Т-лімфоцитів, бажано СО4-Т-лімфоцитів.
Фактор, який індукує резистентний стан клітини (КІР) або фосфоліпаза А2 групи ІВ.
Термін "КІР" застосовується як взаємозамінний з терміном "фосфоліпаза А2 групи ІВ", "СІВ5РІГА2" (або РІА2 СІВ). Фосфоліпаза А2 групи ІВ є секретованим білком, який має молекулярну масу приблизно від 15 кДа й ізоелектричну точку приблизно від 6,5 до 8,0.
У контексті даного винаходу термін "СІВ5РІ А2" або "фосфоліпаза А2 групи ІВ" означає будь-який нативний СІВ5РІ А2 білок від будь-якого хребетного, включаючи ссавців, таких як примати (наприклад, люди) і гризуни (наприклад, миші, пацюки), якщо не зазначене інше.
Термін охоплює "повнорозмірну", непроцесовану СІВ5РІ А2, а також будь-яку форму СІВ5РІ А2, отриману в результаті процесинга усередині або поза клітиною. Термін також охоплює природні варіанти СІВ5РІ А2, наприклад, сплайс-варіанти або алельні варіанти.
Приклад людської амінокислотної послідовності СІВ5РІ А2 показано нижче (5ЕО ІЮ МО: 2).
МКУ СрАМІОТУАААЮБСТЕвВАУНОКЕКМ КОСУ РОЗПИСУ
БтТРУпЕБОоКОоСсатноМсУрсАККІООСКЕІОхРеТИТУ В СсБОЗАТТСЯБКМКЕСЕАЕІ
СМССКМААІСЕБКАРУМКАНКМООТКЕЖСОСЄ
Амінокислоти 1-15 з БЕО ІО МО: 2 (підкреслені) є сигнальною послідовністю, амінокислоти 16-22 з БЕО І МО: 2 (жирним шрифтом) є пропептидною послідовністю. Зрілий білок відповідає амінокислотним залишкам 23-148 з 5ЕО ІО МО: 2, який є прикладом процесованого людського
СІВ5РІ А2 білка.
Природні варіанти включають будь-який білок, який містить послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2, або послідовність із амінокислотних залишків 23-148 з 5ЕО ІЮО МО: 2, з однією або декількома амінокислотними замінами, додаваннями й/або делеціями одного або декількох (правило, 1, 2 або 3) амінокислотних залишків, бажано не більше ніж з 10 окремими амінокислотними замінами, додаваннями й/або делеціями одного або декількох (як правило, 1, 2 або 3) амінокислотних залишків. Типові природні варіанти зберігають біологічну активність 5ЕО ІЮ
МО: 2.
У зв'язку із цим, у деяких варіантах здійснення СІВ5РІ А2 має щонайменше одну активність, обрану з індукції утворення мембранних мікродоменів (ММД) в СО4 Т-клітинах від здорових суб'єктів, або забезпечення в СО4 Т-клітин здорових суб'єктів резистентності до сигналів інтерлейкінів, такий як резистентність до сигналів 1-2 або резистентність до сигналів 1-7.
У деяких варіантах здійснення індукція утворення ММД включає підвищення числа ММД на бра Т-клітинах здорових суб'єктів щонайменше приблизно до 80 на клітину, щонайменше приблизно до 90 на клітину, щонайменше приблизно до 100 на клітину, щонайменше приблизно 15. до 110 на клітину, або щонайменше приблизно до 120 на клітину. У не обмежуючому кращому варіанті здійснення індукція утворення ММД включає підвищення числа ММД на С04 Т-клітинах здорових суб'єктів більше ніж до 100 ММД на клітину.
У деяких варіантах здійснення індукція утворення ММД включає стимуляцію утворення ММД більших, ніж ті, які в інших випадках присутні на СО4 Т-клітинах. У деяких варіантах здійснення індукція утворення великих ММД включає стимуляцію утворення ММД, які мають діаметр щонайменше 100 нм, щонайменше 110 нм, щонайменше 120 нм, щонайменше 130 нм, або щонайменше 140 нм. У не обмежуючому кращому варіанті здійснення індукція утворення великих ММД включає стимуляцію утворення ММД, які мають діаметр більше 120 нм.
У деяких варіантах здійснення забезпечення резистентності СО4 Т-клітин здорових суб'єктів до сигналів інтерлейкіна-7 включає зниження ЗТАТ5А і/або В фосфорилювання в зазначених клітинах щонайменше приблизно на 1095, щонайменше приблизно на 2095, щонайменше приблизно на 3095, або щонайменше приблизно на 4095. У деяких варіантах здійснення забезпечення резистентності СО4 Т-клітин здорових суб'єктів до сигналів інтерлейкіна-7 включає зниження рівня ядерної трансллокації фосфо-5ЗТАТ5А и/або фосфо-5ТАТ5В
Зо щонайменше приблизно на 20 95, щонайменше приблизно на 30 95, щонайменше приблизно на 40 95, або щонайменше приблизно на 50 95.
Активність СІВ5РІ А2 можна вимірювати будь-яким придатним способом, відомим у даній галузі технікию, як це проілюстровано в прикладах, або розробленим пізніше. Активність
СІВ5РІГА?2 можна вимірювати в зразку плазми, наприклад, такому як зразок фракціонованої плазми, із застосуванням, наприклад, аналізів із залученням ліганда, імуноаналізів і/або ферментативних аналізів.
У окремому варіанті здійснення термін СІВ5РІ А2 означає людський білок, зокрема, білок, який включає або має ЗЕО ІЮ МО: 2, або його природний варіант.
СІВ5РІА2 відповідно до даного винаходу може бути ізольованим, очищеним й/або рекомбінантним. У деяких варіантах здійснення винахід може застосовувати замість або на додачу до СІВ5РІ А2 білку, нуклеїнову кислоту, яка кодує СІВ5РІ А2. Нуклеїновою кислотою може бути ДНК або РНК, одно- або дволанцюгова.
Приклад нуклеїновокислотної послідовності, що кодує СІВ5РІ Аг, показано в ЗЕО ІЮ МО: 1 нижче.
АТОАААСТОСтТтОоТеСстТАССТОоТОоСТОСТоАСАСТОВССОоССОоССсВО ОСА
Сас остооосо ОСА ОО СААААТОАТСААСТОССТОАТОССОвовОСАСТОАе соссттТстТтасвААТАСААСААСТАСООССТОСТАСТОТООСТІОССОВОСТСАВОСАСССССО
ТОСБАТСААСТОАСААСТОСТОССАБАСАСАТСАСААСТОСТАССАССАСОоССАЛИАЛОСТ
ЗбАСАССТаТЛААТТТСТОСТООАСААСССОТАСАСССАСАССТАТТСАТАСТОСТОСТСТ
Ост СсААТСАССТОТАССАССЛАААвСАААСАСтТОоТОоАСОВССТТСАТТТОСААСТоСо вІСсаСААСасСтТассАТСТОСТТТТСААААЕСТОСАТАТААСААООСАСАСААСААССТОоВА
ПАССААСААСТАТТоТСАСАСТТОА
Альтернативні молекули нуклеїновой кислоти, яка кодує СІВ5РІ А2, включають будь-який варіант 5ЕО ІЮ МО: 1, який отриманий внаслідок виродженості генетичного коду, а також будь-
яку послідовність, яка гібридизується з ЗЕО ІЮ МО: 1 за жорстких умов, краще, яка має щонайменше 80 95, 85 95, 90 95, 95 95 або більшу ідентичність до послідовності з 5ЕО ІЮ МО: 1 та яка кодує СІВ5РІ А2 білок.
Спосіб одержання СІВ5РІ А2
СІВ5РІА2 можна одержати будь-яким звичайним відомим способом експресії й способом очищення білка. Наприклад, можна застосовувати: (і) спосіб синтезу пептидів; (ії) спосіб їх очищення й ізоляції з живого організму або культивованих клітин; (ії) спосіб їх одержання із застосуванням методик генетичної рекомбінації; та їх комбінації або подібні до них (наприклад, стандартні методики, описані в "Моїесшаг СіІопіпд" (Затргоок, у., Егй5сй, Е. Е., Мапіаїів, Т., Соїй
Зрііпуд Нагог Іарогаїогу Рге55) (1989) ("Молекулярне клонування") і "Сиггепі Ргоїосої5 іп
МоїІесшіаг Віоіоду" (А!йзибреї, ЕЕ. М., допп УМіеу апа 5оп5, Іпс. (1989) ("Сучасні протоколи молекулярної біології |.
У окремому варіанті здійснення винахід відноситься до способу одержання СІВ5РІА2 шляхом експресії кодуючої нуклеїновой кислоти в клітині-хазяїні, і збору або очищення
СІВ5РІА2. У зв'язку із цим, винахід також описує рекомбінантні клітини-хазяїни, які містять нуклеїнову кислоту, яка кодує СІВ5РІ А2. Такі клітини можуть бути прокаріотичними (такими, як бактерії) або еукаріотичними (такими, як дріжджові клітини, клітини комах, рослинні клітини або клітини ссавців). Нуклеїнову кислоту можна помістити під контроль будь-якої придатної регуляторної послідовності, такої як промотор, термінатор тощо. Альтернативно, нуклеїнова кислота може бути вставлена в клітину-хазяїна в ділянку, де експресія керується ендогенним промотором. Методики вставки нуклеїнових кислот у клітини добре відомі в даній галузі техніки.
Модуляція СІВ5РІ А2
Винахід забезпечує нові способи, які передбачають модуляцію СІВ5РІ А2 у суб'єкта, який цього потребує. Термін "модуляція" означає будь-яку модифікацію рівня (наприклад, експресії) або активності СІВ5РІА2 у суб'єкта. Крім того, модуляція означає або підвищення, або зниження рівня або активності СІВ5РІ А2. Бажано, модуляція означає зміну щонайменше на 10 96, 20 96, ЗО Зо, 40 95, 50 90, 60 Ус, 70 95, 80 95 або більше, у порівнянні з не модульованим станом. У результаті, інгібування СІВ5РІ А2 означає зниження щонайменше на 10 95, 20 б,
ЗО бо, 40 90, 50 95, 60 Ус, 70 95, 80 95 або більше рівня або активності СІВ5РІ А2, а також повну
Зо блокаду або супресію рівня або активності СІВ5РІ А2. Напроти, стимуляція СІВ5РІ А2 означає підвищення щонайменше на 10 95, 20 9, ЗО У, 40 90, 50 У, 60 Зо, 70 95, 80 9 або більше рівня або активності СІВ5РІ А2. Залежно від ситуації, модуляція може бути тимчасовою, тривалою або неперервною. Крім того, модуляція активності включає модуляцію кількості зІВ5РІ А2 у суб'єкта, зокрема, у рідинах організму, модуляцію потужності білка (наприклад, шляхом модуляції рівня кофакторів або субстрату в суб'єкта), і модуляцію рівня або активності продуктів деградації, утворених СІВ5РІ А2.
Інгібування СІВ5РІ А2
У окремому варіанті здійснення винахід забезпечує композиції й способи інгібування
СІВ5РІА2 у суб'єкта. Інгібування СІВ5РІ А? може бути досягнуте шляхом застосування інгібіторів СІВ5РІ А2, тобто будь-якої сполуки, яка інгібує експресію або активність СІВ5РІ А2.
Інгібітори СІВ5РІ А2 включають інгібітори експресії, антагоністи, секвестратори, або сполуки, які маскують мішень. Кращі типи інгібіторів СІВ5РІ А2 включають СІВ5РІ А2 ліганди (ковалентні або не ковалентні), анти-сІВ5РІА2 антитіла (та їх фрагменти й похідні), нуклеїнові кислоти, які кодують анти-СІВ5РІ А2 антитіла (або їх фрагменти й похідні), інгібуючі нуклеїнові кислоти, пептиди, або низькомолекулярні ліки, або їх комбінацію(ї). Альтернативно або на додачу, інгібування СІВ5РІ А? може бути досягнуте шляхом вакцинації суб'єкта проти СІВ5РІ А2 антигену, так щоб у суб'єкта, який потрибує інгібуваннія СІВ5РІ А2, вироблялися антитіла.
Антитіла проти СІВ5РІ А2
Специфічними прикладами інгібіторів СІВ5РІ А2 є антитіла, які специфічно зв'язуються з
СІВ5РІ Аг.
Антитіла можуть бути синтетичними, моноклональними, або поліклональними, і можуть бути отримані за допомогою методик, добре відомих у даній галузі техніки. Такі антитіла специфічно зв'язують через антиген-зв'язувальні ділянки антитіла (на відміну від неспецифічного зв'язування). СІВ5РІГА2 поліпептиди, фрагменти, варіанти, гібридні білки і т.д. можна застосовувати в як імуногени при одержанні антитіл, що дають імунну реакцію з ними. Зокрема, поліпептиди, фрагменти, варіанти, гібридні білки тощо, містять антигенні детермінанти або епітопи, які викликають утворення антитіл.
Ці антигенні детермінанти або епітопи можуть бути лінійними або конформаційними (переривчастими). Лінійні епітопи складаються з єдиної секції амінокислот з поліпептиду, у той бо час як конформаційні або переривчасті епітопи складаються з амінокислотних секцій з різними ділянками поліпептидного ланцюга, які тісно зближаються одна з одною при фолдінгу білка
ІС. А. дапемау, г. апа Р. Тгамегв5, Іттипо Віоіоду 3:9 (Сапапа Рибіїєпіпду Іпс., 2па ей. 1996)|.
Оскільки згорнуті білюи мають складні поверхні, доступне число епітопів Є досить великим; однак через конформацію білка й стерических обмежень, число антитіл, які дійсно зв'язуються з епітопами, менше від числа доступних епітопів |С. А. Чхапемау, г. апа Р. Тгамегв5, Іттипо Віоїоду 2:14 (Сапапа Рибіїєпіпу Іпс., 2па ей. 1996)). Епітопи можна ідентифікувати будь-якими способами, відомими в даній галузі техніки. Як поліклональні, так ії моноклональні антитіла можна приготувати за допомогою стандартних методик.
Кращі антитіла відповідно до даного винаходу спрямовані на сСІВ5РІ А2 епітоп, і/або створені шляхом імунізації поліпептидом, який включає СІВ5РІ А2 епітоп, обраний з: зрілого
СІВ5РІА2 білка, фрагмента СІВ5РІА?, який включає щонайменше 8 послідовних амінокислотних послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 2 (або відповідних залишків природного варіанта
ЗЕО ІЮ МО: 2), де зазначений фрагмент включає щонайменше амінокислоту 70, амінокислоту 121, амінокислоту 50, амінокислоту 52, амінокислоту 54, амінокислоту 71, або їх комбінацію.
Кращі антитіла відповідно до даного винаходу зв'язують епітоп, включаючи епітоп між амінокислотними залишками 50-71 з ЗЕО ІО МО: 2 або відповідні залишки із природного варіанта 5ЕО ІО МО: 2.
Термін "антитіло" охоплює поліклональні антитіла, моноклональні антитіла, їх фрагменти, такі як Е(ар)2 і Бар фрагменти, одноланцюгові варіабельні фрагменти (5сЕм5), однодоменні антитіла (МНН або нанотіла), бівалентні фрагменти антитіл (діатіла); а також будь-які рекомбінантні та синтетично отримані партнери зв'язування, людських антитіл або гуманізованих антитіл.
Антитіла визначаються як такі, що специфічно зв'язуються, якщо вони краще зв'язуються з
СІВ5РІ А2 зі значенням Ка, що дорівнює або перевищує приблизно 107 М". Афінності антитіл можна легко визначити із застосуванням звичайних методик, наприклад, таких, як описано
І5саїснага еї аї., Апп. М.У. Асад. зсі., 51:660 (1949)|.
Поліклональні антитіла можна легко одержати з різних джерел, наприклад, від коней, корів, ослів, кіз, овець, собак, курей, кроликів, мишей або пацюків, із застосуванням процедур, добре відомих у даній галузі техніки. У цілому, очищений СІВ5РІ А? або пептид на основі амінокислотної послідовності ЗІВ5РГА2, кон'югований відповідним чином, уводять тварині- акцептору, як правило, за допомогою парентеральной ін'єкції. Імуногенність ЗІВ5РІА2 може бути посилена шляхом застосування ад'юванта, наприклад, повного або неповного ад'юванта
Фрейнда. Після бустерної імунізації збирають невеликі зразки сироватки й тестують реактивність у відношенні ІВ5РІ А2 поліпептиду. Приклади різних аналізів, придатних для такого визначення, включають ті, які описані в ГАпііродієв: А І аброгагогу Мапиаї!", Нагіоум/ апа
І апе (ед5».), Соїй бргіпд Нагбог І арогайогу Ргез5, 1988 ("Антитіла: лабораторне керівництво"); атакож такі процедури, як зустрічний імуноелектрофорез (ЗІЕФ), радіоїмунний аналіз, радіоїмунопреципітація, імуноферментний аналіз (ІФА), дот-блотинг, і сендвіч-аналізи.
ІДив. патенти США МеМое 4,376,110 і 4,486,5301.
Моноклональні антитіла можна легко одержати із застосуванням добре відомих процедур.
ІДив., наприклад, процедури, описані в патентах США МоМо КЕ 32011, 4902614, 4543439 і 4411993; "Мопосіопа! Апіїбодіє5, Нубгідота5: А Мем Оітепвіоп іп Віоіодіса! Апаїузев5", Ріепит
Рге55, Кеппей, МеоКеат, апа Вест)! (ед5.), 1980 ("Моноклональні антитіла, гібридоми: новий аспект біологічних аналізів")|.
Наприклад, тваринам-акцепторам, таким як миші, можна ввести інтраперитонеально щонайменше один раз і краще два рази з інтервалом близько З тижнів ізольований і очищений не омутантний або мутантний ІВ5РІ А? білок або кон'югований СІВ5РІА2 пептид, факультативно в присутності ад'юванта. Мишачі сироватки потім аналізують звичайною методикою дот-блотинга або іммобілізації антитіл (АВС), щоб визначити, яку тварину краще використовувати. Приблизно через два-три тижні, миші одержують внутрішньовенну бустерну ін'єкцію білка або пептиду. Потім мишей забивають, і клітини селезінки зливають із комерційними мієломними клітинами, такими як Ад8.653 (АТСС), дотримуючись установлених протоколів. Коротко, клітини мієломи промивають кілька разів середовищем, і гібридизують з мишачими клітинами селезінки у співвідношенні приблизно три клітини селезінки на одну клітину мієломи. Гібридизующий агент може бути будь-яким придатним агентом, який використовується у даній галузі техніки, наприклад, поліетиленгліколем (ПЕГ). Гібридоми поміщають на пластини, які містять середовище, що забезпечує вибірковий ріст гібридних клітин. Гібридні клітини потім можуть залишати для вирощування приблизно на вісім діб.
Надосадові рідини від отриманих гібридом збирають і додають на планшет, який спочатку бо покривають козячими антитілами до імуноглобулінів миші. Після промивання додають мітку,
таку як маркований СІВ5РІ А? поліпептид, у кожну комірку, а потім інкубують. Потім можна визначити позитивні комірки. Позитивні клони потім вирощують у змішаній культурі, а потім очищають надосадову рідину на колонці із Протеїном А (РПагтасіа).
Моноклональні антитіла відповідно до винаходу можна одержати із застосуванням альтернативних методик, таких як ті, які описані (АШпуд-Меев5 еї аї., "Мопосіопа! Апіроду
Ехргезвіоп І ргагіез: А Варій Айегпаїйме ю Нубргідотав", Зігаїєдієє іп МоїІесшаг Віоіоду 3:1-9 (1990) ("Бібліотеки експресії моноклональних антитіл: швидка альтернатива гібридомам'")|, включеної як посилання. Подібним чином, партнери зв'язування можна сконструювати із застосуванням методик рекомбінантної ДНК для включення різних областей гена, який кодує специфічне зв'язувальне антитіло. Така методика описана, наприклад, в Катіск еї аї.,
Віотесппоіоду, 7:394 (1989)).
Антиген-зв'язувальні фрагменти таких антитіл, які можна одержати шляхом звичайних методик, також охоплюються даним винаходом. Приклади таких фрагментів включають Еаб і
Е(авБ)2 фрагменти, але не обмежуються ними. Також забезпечуються фрагменти й похідні антитіл, отримані методиками генетичної інженерії.
Моноклональні антитіла відповідно до даного винаходу включають химерні антитіла, наприклад, гуманізовані версії мишачих моноклональних антитіл. Такі гуманізовані антитіла можуть бути приготовлені за допомогою відомих методик, і забезпечують переваги зниженої імуногенності при введенні антитіл людині. В одному варіанті здійснення гуманізовані моноклональні антитіла містять варіабельну область мишачого антитіла (або просто його антиген-зв'язувальну ділянку), і константну область, отриману з людського антитіла.
Альтернативно, фрагмент гуманізованого антитіла може містити антиген-зв'язувальну ділянку мишачого моноклонального антитіла й фрагмент варіабельної області (який не містить антиген- зв'язувальну ділянку), отриманий з людського антитіла. Процедури одержання химерних та інших інженерних моноклональних антитіл включають ті, які описані в (Кіесптапп еї а). (Маїиге 332:323, 1988), Гі еї аІ. (РМАЗ 84:3439, 1987), І аїітіск еї а. (Віо/Гесппоіоду 7:934, 1989), і М/іпіег апа Нагті5 «ТІРЗ 14:139, Мау, 1993). Процедури трансгенного одержання антитіл можна знайти в
ОВ 2,272,440, патентах США МоМо5,569,825 і 5,545,8061.
Можна застосовувати антитіла, отримані генно-інженерними способами, такі як химерні й гуманізовані моноклональні антитіла, що включають людські й не людські частини, які можна виготовити із застосуванням стандартним методик рекомбінантної ДНК. Такі химерні й гуманізовані моноклональні антитіла можна одержати шляхом генної інженерії із застосуванням стандартних методик ДНК, відомих у даній галузі техніки, наприклад, із застосуванням способів, описаних в (Кобіпзоп еї аї., Міжнародній публікації Мо УМО 87/02671; АКіга, еї аІ. Європейській патентній заявці 0184187; Тапідиспі, М., Європейській патентній заявці 0171496; Моїтізоп еї аї.,
Європейській патентній заявці 0173494; Мешибегдег еї аІ., РСТ Міжнародній патентній публікації меуУО 86/01533; Саршу еї аІ., Патенті США Ме4,816,567; СаріПу еї аІ., Європейській патентній заявці 0125023; Вецег еї аї., Зсіепсе 240:1041 1043, 1988; Гіи еї аІ., РМАЗ 84:3439 3443, 1987;
Ми еї аї., У. Іттипої. 139:3521 3526, 1987; Бип єї а. РМА5 842214 218, 1987; Мізнітига еї аї.,
Сапс. Ке5. 47:999 1005, 1987; УМоса еї аї., Майшге 314:446 449, 1985; і ЗПпаму еї аї., У. Май). Сапсег
Іпві. 80:1553 1559, 1988); Моїтізоп, 5. І., Зсіеєпсе 229:1202 1207, 1985; ОЇ еї аї., Віотесппіднев 4214, 1986; Муіпієг 0.5. Раї. Мо. 5,225,539; допез єї аї!., Майте 321:552 525, 1986; Метовєуап еї а!І,, Зсіепсе 239:1534, 1988; і ВеїйаПег еї аї., У. Іттипої. 141:4053 4060, 19881.
Щодо синтетичних і напівсинтетичних антитіл, такі терміни охоплюють фрагменти антитіл, антитіл з перемиканням ізотипа, гуманізовані антитіла (наприклад, мишачих-людських, людських-мишачих) гібридів, антитіл із множинною специфічністю, і повністю синтетичних антитіло-подібних молекул, але не обмежуючись вказаними.
Для терапевтичного застосування "людські" моноклональні антитіла, які мають людські константні й варіабельні області, часто є кращими, щоб звести до мінімуму імунні відповіді пацієнта на антитіло. Такі антитіла можуть бути отримані шляхом імунізації трансгенних тварин, які містять гени людських імуноглобулінів. (Див. ЧаКоромії5 еї а. Апп МУ Асай Зсі 764:525-535 (1995)|.
Людські моноклональні антитіла проти СІВ5РІ А2 поліпептидів можна також приготувати шляхом конструювання комбінаторної бібліотеки імуноглобулінів, такої як бібліотека фагового дисплея Раб або бібліотека фагового дисплея 5сЕм, із застосуванням кДНК легких і важких ланцюгів імуноглобулінів, приготовленої із мРНК, вилученої з лімфоцитів суб'єкта. (|Див., наприклад, Мссайепу еї аІ.,, РСТ публікація МО 92/01047; Магкз еї а. (1991) 9. Мої. Віої. 222:581 597; і СгітН5 еї а. (1993) ЕМВО у 12:725-734|. Крім того, комбінаторну бібліотеку варіабельних областей антитіл можна створити шляхом мутації відомого людського антитіла. Наприклад, 60 варіабельну область людського антитіла, яке, як відомо, зв'язується з СІВ5РІ А2, можна піддати мутації, наприклад, із застосуванням довільно змінених мутантних олігонуклеотидів, для генерації бібліотеки мутантних варіабельних областей, які можна потім піддати скринінгу на зв'язування з СІВ5РІ А2. Способи індукції неспецифічного мутагенезу в СОК областях важких і або легких ланцюгів імуноглобулінів, способи схрещування рандомізованих важких і легких ланцюгів з формуванням пар, і способи скринінга можна знайти, наприклад, в (Ваграз еї а!., РСТ публікація УМО 96/07754; Вагбаз еї аї. (1992) Ргос. Маг Асад. Зсі. ОБА 89:4457-44611|.
Бібліотека імуноглобулінів може бути експресована за допомогою популяції фагового дисплея, бажано обраного з нитчатого фага, до утворення бібліотеки дисплея антитіл.
Приклади способів і реагентів, найбільш придатних для застосування при генерації бібліотеки дисплея антитіл, можна знайти, наприклад, в (І адпег єї аІ. 0.5. Раї. Мо. 5,223,409; Кап еї аї.,
РСТ публікація УУО 92/18619; Бомег еї аІ., РСТ публікація УУО 91/17271; Уміпієг еї аї!.,, РСТ публікація МУО 92/20791; МагКіапа еї аіІ.,, РСТ публікація УМО 92/15679; Вгейіпд еї аї.,, РСТ публікація МО 93/01288; Мссайпепу еї аІ,, РСТ публікація УУО 92/01047; Саїтага еї аіІ.,, РСТ публікація УМО 92/09690; Іадпег еї аіЇ.,, РСТ публікація УМО 90/02809; ЕРиси5 еї аї. (1991)
Віо/ТесппоЇоду 9:1370-1372; Нау вї а. (1992) Нит Апіїройа Нургідотаз 3:81 85; Ниве евї аї. (1989)
Зсіепсе 246:1275-1281; Стів еї аї. (1993) вирга; Наужіпз еї аї. (1992) У Мої Віо! 226:889-896;
Сіасквоп єї аї. (1991) Майте 352:624-628; Стат еї а). (1992) РМАБ5 89:3576-3580; Сатаай еї аї. (1991) Віо/Тесппоіоду 9:1373-1377; Ноодепроот еї а. (1991) Мис Асій Нез 19:4133-4137; і Ваграз еї аІ. (1991) РМАБб 88:7978-7982|. Як тільки на поверхні фагів (наприклад, нитчатого фага) експонуються сполуки, проводять скринінг бібліотеки антитіл для ідентифікації й виділення тих з поміж них, які експресують антитіла, що зв'язують СІВ5РІ А2 поліпептид. У кращому варіанті здійснення первинний скринінг бібліотеки включає пенінг із іммобілізованим СІВ5РІ А2 поліпептидом, і вибір тих з поміж них, які експресують антитіла, що зв'язують іммобілізований
СІВ5РІ А2 поліпептид.
У окремому варіанті здійснення винахід відноситься до композиції, яка містить анти-
СІВ5РІА2 антитіло (або його фрагмент або похідне), і фармацевтично придатну допоміжну речовину.
Існуючі моноклональні антитіла до фосфоліпази А2-СІВ включають Мар СН-7 (І ароте),
МАВ5БО18 (І ароте), ЕРНА5Б186 (Сепеїех); І 5-С138332 (І Шезрап) або САВТ-17153МН (Сгеаїїме
Біотап). Приклади поліклональних антитіл включають, наприклад, МІСЗ від Сепеїех. Як зазначено вище, кращі антитіла до СІВ5РІ А2, відповідно до даного винаходу, зв'язують зрілий
СІВ5РІ А2, ще краще, епітоп, який міститься в домені з ІВ5РІ А2, який включає амінокислоту, обрану з поміж амінокислоти 70, амінокислоти 121, амінокислоти 50, амінокислоти 52, амінокислоти 54, амінокислоти 71 або їх комбінацій. Кращі антитіла відповідно до даного винаходу зв'язують епітоп, який містить амінокислотні залишки 50-71 з 5ЕО ІЮ МО: 2, або відповідні залишки із природного варіанта 5ЕО ІЮ МО: 2.
В альтернативному варіанті здійснення винахід відноситься до композиції, яка містить нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло до СІВ5РІА?2 (або його фрагмент або похідне) і фармацевтично придатну допоміжну речовину, та до її застосування.
Інгібуючі нуклеїнові кислоти
В альтернативному варіанті здійснення інгібітор СІВ5РІА?2 є інгібуючою нуклеїновою кислотою, тобто будь-якою молекулою нуклеїнової кислоти, яка інгібує експресію гена або білка
СІВ5РІ А2. Кращі інгібуючі нуклеїнові кислоти включають антизначеннєві нуклеїнові кислоти, малу інтерферуючу РНК (міРНК), малу шпилькову РНК (мшРНК), мікроРНК, аптамери або рибозими. У окремому варіанті здійснення інгібуюча нуклеїнова кислота є малою інтерферуючою РНК, яка запобігає трансляції МРНК СІВ5РІА2. В іншому окремому варіанті здійснення інгібуюча нуклеїнова кислота є антизначеннєвим олігонуклеотидом, який запобігає трансляції МРНК СІВ5РІА2. В іншому окремому варіанті здійснення інгібуюча нуклеїнова кислота є малою шпильковою РНК, яка запобігає трансляції мРНК СІВ5РІ А2. міРНК містить значеннєву послідовність нуклеїнових кислот і антизначеннєву послідовність нуклеїнових кислот того полінуклеотида, що в даному випадку цікавить. міРНК конструюють так, щоб єдиний транскрипт (дволанцюгова РНК) мав значеннєву й комплементарну антизначеннєву послідовність із цільового гена. Нуклеотидна послідовність міРНК може бути сконструйована із застосуванням комп'ютерної програми дизайну міРНК, доступної, наприклад, на сайті Атбіоп в
Інтернеті.
У деяких варіантах здійснення довжина антизначеннєвого олігонуклеотида або міРнНК становить 10 нуклеотидів або менше. У деяких варіантах здійснення довжина антизначеннєвих олігонуклеотидів і міРНК дорівнює довжині природного транскрипта. У деяких варіантах здійснення антизначеннєві олігонуклеотиди й міРНК містять 18-30. У деяких варіантах 60 здійснення антизначеннєві олігонуклеотиди й міРНК містять менше 25 нуклеотидів у довжину.
Бажано молекула інгібуючої нуклеїнової кислоти містить домен, який має нуклеотидну послідовність, повністю комплементарну до області гена або РНК СІВ5РІ А2. Такий домен містить, як правило від 4 до 20 нуклеотидів, забезпечуючи специфічну гібридизацію й оптимальне інгібування транскрипції гена або трансляції РНК. Послідовність інгібуючих нуклеїнових кислот може бути отримана безпосередньо з послідовності гена, яка кодує
СІВ5РІ А2, такого як 5ЕО ІЮО МО: 1. Альтернативно або на додачу, інгібуючі нуклеїнові кислоти можуть гібридізуваться з регуляторним елементом у гені або РНК СІВ5РІА2, таким як промотор, ділянка сплайсинга тощо, і запобігати ефективній регуляції.
Специфічні приклади інгібуючих молекул нуклеїнової кислоти відповідно до даного винаходу включають ізольовані молекули одноланцюгової нуклеїновой кислоти, які складаються із 10-50 послідовних нуклеотидів з ЗЕО ІЮ МО: 1. Специфічними прикладами інгібуючих молекул нуклеїнової кислоти відповідно до даного винаходу є антизначеннєві нуклеїнові кислоти, які складаються із наступної нуклеотидної послідовності або повністю комплементарного до неї ланцюги:
АТтОСАААСПТОСТТеТОоСтТАб Б5БЕО тп МО: 3) пр;АсСОсЗсАТСАСС Ї8БО ТО МО: 4)
ТТССОСААААТОСАтТСВА ФББО 10 0 5, госоооБАСТсАсССС БО ТО МО: б) тТАСсосстТОоСстТвСсТОоТОосстТт (50 Іо ЩО: 7
САСАСАТСАСААСТОСТАСВАСС (БО І МО: Я
АСССТАСАССТАТТСАТАСТСОТ БО ІТ МО: 9)
АТСАССТОТАсСсАССА (БО І МО; 19)
АССТССАТАТААСААСОСА 5 І0 МО: 11
СААЛОААСТАТТОоТОсАСсАС БО ІС МО: ІІ
Пептидні й нивзкКкомалекулярні ліки
В альтернативному варіанті здійснення інгібітор СІВ5РІА?2 є опептидними або низькомолекулярними ліками, що інгібують активність СІВ5РІА2. Пептидні або низькомолекулярні ліки, як правило, є молекулою, що вибірково зв'язується з СІВ5РІ А2, або субстратом СІВ5РІА2, або кофактором СІВ5РІ А2, або продуктом деградації або метаболітом шляху СІВ5РІ А2.
Пептиди бажано містять від З до 20 амінокислотних залишків, а їх послідовність може бути ідентична до домену СІВ5РІА2 (пептиду-принаді) або до домену субстрату, кофактора, продукту деградації або метаболіту СІВ5РІ А2. Бажано пептиди відповідно до даного винаходу містять від 4 до 30 послідовних амінокислотних залишків з ЗЕО ІЮ МО: 2 (або відповідної послідовності із природного варіанта 5ЕО ІО МО: 2). Найкращі пептиди відповідно до даного винаходу містять від 5 до 25 послідовних амінокислотних залишків з 5ЕО ІЮО МО: 2 (або відповідної послідовності із природного варіанта 5ЕБЕО ІЮ МО: 2), і додатково містять щонайменше один з поміж наступних амінокислотних залишків з ЗЕО ІЮ МО: 2 (або відповідної послідовності із природного варіанта 5ЕБО ІЮО МО: 2): амінокислоту 70, амінокислоту 121, амінокислоту 50, амінокислоту 52, амінокислоту 54, амінокислоту 71 або їх комбінацію.
Специфічними прикладами пептидів відповідно до даного винаходу є пептиди із менше ніж 25 амінокислот, що містять кожну з наступних послідовностей:
мус (БО чІ0 МО: 13
СЕС С5ЕО 10 МО: за чиІссуссьсово (БО ІС МО: 15)
ЕГЕхМиМЖОосУСстососТРУИ «БО Її МО: 16;
ОотТНоМ 5ЕО ІФ МО: 17) сотЯОМс (БЕ ТО МО: 18)
ЕСЕАРІСМС (БЕ Ір МО: 191 римаАвіІ БО 16 МО: 20
РЯМААІСЕБЗКАРУМКАНКМІ. (8БО ІП МО: 51)
Пептиди відповідно до даного винаходу можуть включати пептидні, не пептидні й/або модифіковані пептидні зв'язки. У окремому варіанті здійснення пептиди включають щонайменше один пептидоміметичний зв'язок, обраний з поміж інтеркаляції метиленової (-СНег-) або фосфатної (-РОг-) групи, вторинного аміну (-МН-) або кисню (-0-), альфа-азапептидів, альфа-алкілпептидів, М-алкілпептидів, фосфонамідатів, депсипептидів, гідроксиметиленів, гідроксиетиленів, дигідроксиетиленів, гідроксиетиламінів, ретро-інверсо-пептидів, метиленокси, цетометилену, складних ефірів, фосфінатів, фосфінів, або фосфонамідів. Крім того, пептиди можуть містити захищений М- і/або С-кінець, наприклад, шляхом ацилювання й/або амідування й/або етерифікації.
Пептиди відповідно до даного винаходу можуть бути отримані із застосуванням методик, відомих у даній галузі техніки, таких як хімічний, біологічний і/або генетичний синтез.
Кожний із цих пептидів в ізольованій формі представляє конкретний об'єкт даного винаходу.
Бажано низькомолекулярні ліки є вуглеводневими сполуками, які вибірково зв'язуються з
СІВ5РІ Аг.
Низькомолекулярні ліки й пептиди бажано одержують за допомогою способу, який передбачає: (ї) забезпечення контакту тестованої сполуки з СІВ5РІ А2 або її фрагментом, (Ії) вибір тестованої сполуки, яка зв'язується з СІВ5РІ А2 або її зазначеним фрагментом, і (іїї) вибір сполуки з пункту (ії), яка інгібує активність СІВ5РІА2. Такий спосіб представляє конкретний об'єкт даного винаходу.
Низькомолекулярні ліки й пептиди також бажано одержують за допомогою способу, який передбачає: (ї) забезпечення контакту тестованої сполуки із субстратом, кофактором, або продуктом деградації СІВ5Р'І А2 або її фрагментом, (ії) вибір тестованої сполуки, яка зв'язується із зазначеним субстратом, кофактором, або продуктом деградації СІВ5РІ А2, або її фрагментом, і (її) вибір сполуки з пункту (ії), яка інгібує активність СІВ5РІ А2. Такий спосіб представляє конкретний об'єкт даного винаходу.
Розчинні рецептори СІВ5РІ А2
В альтернативному варіанті здійснення інгібітор СІВ5РІ А2 є розчинною формою рецептора
Зо СІВ5РІА2. Такі сполуки, які є розчинними рецепторами, здатні зв'язувати СІВ5РІ А2, таким чином, інгібуючи його активність, діючи як принада або маскуючий агент.
У специфічному варіанті здійснення такі інгібітори є розчинною формою людського або мишачого рецептора СІВ5РІ А2, або його фрагмента, що зв'язує СІВ5РІ А2.
Амінокислотні послідовності мишачих і людських розчинних рецепторів представлені в ЗЕО
ІЮ МО: 22 і 23, відповідно. Таким чином, термін "розчинний рецептор" охоплює будь-який
СІВ5РІ А2г-зв'язувальний поліпептид, який включає всю послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 22 і 23 або її фрагмент.
СІВ5РІ А2-зв'язувальний фрагмент означає будь-який фрагмент такого поліпептиду, який специфічно зв'язує РІА2ОІВ, що бажано включає щонайменше 5 його послідовних амінокислотних залишків, краще щонайменше 8, 10 або 12. Специфічне зв'язування молекули рецептора вказує, що молекула рецептора зв'язується з РІ А2ОІВ з більш високою афінністю (наприклад, щонайменше 5-разовою), ніж з РІ А2-ПА або ПО. Фрагмент, як визначено вище, бажано включає менше 50 амінокислотних залишків.
Прикладами СІВ5РІ А2-зв'язувальних поліпептидів є, без обмеження, поліпептиди, які включають щонайменше одну з наступних амінокислотних послідовностей:
ї1БІхЕСЛеТІУВГВИКСМЕКМІТОРІЛЖБУОУАНОКТУУАВВКУІНКИ 15ЕО ІС
Мсі яд
МЕКОТМЗНІСУОЕМІТВ (ЗЕО Ж МО: 25)
ОСБЕТОРХУІСККУОМНІСНЕІУВКІВВО 16 КО 26) оекУусУкВрМТУУАвКОІТнНККАУТВосБІСВІВБО ТЛ МО: 7 їЕБУБМеБОБІТРОВРЕМЕННССТОЕУУЧА БО ТО МО: 29)
ЗзКЕВСАКІТВНІВВУВЕКЛВчУКИ БО 10 КИ: и
ЗІСВІВЕКОУЕР.РККЕОЖУСТрАРШСЕОМА БО І МО: 30)
АЕНОАвБІТУГоВЕРантниТсІиттомот (БО 20 МО: 1 50 ІП МО: 22-26 отримані з поспідавності людеькога разчикного вецептора РІА?СІВ, у той час як ББО ІРР МО: 27-31 отримані з лослірдовності мишачого розчинного репептова
РІАгОІВ.
Вакцинація
В альтернативному (або кумулятивному) варіанті здійснення інгібування СІВ5РІА2 у суб'єкта досягають шляхом вакцинації (або імунізації) суб'єкта СІВ5РІА?2 антигеном. У результаті такої вакцинації або імунізації суб'єкт виробляє антитіла (або клітини), які інгібують
СІВ5РІ А2. Зокрема, ін'єкція(і) СІВ5РГІ А2 антигену (наприклад, імуногенного СІВ5РІ А2, власне позбавленого біологічної активності) забезпечує генерацію антитіл у суб'єкта, який отримує лікування. Ці антитіла будуть захищати проти надлишкової експресії СІВ5РІ А2, і можуть застосовуватися як імунотерапія або вакцинопрофілактика.
Таким чином, завданням даного винаходу є спосіб вакцинації суб'єкта, який передбачає застосування для суб'єкта СІВ5РІ А2 антигену.
Іншим завданням винаходу є СІВ5РІГА?2 антиген для застосування з метою вакцинації суб'єкта, який цього потребує.
У окремому варіанті здійснення СІВ5РІ А2 антиген, який використовується для вакцинації, є інактивованою імуногенною молекулою, яка індукує імунну відповідь проти СІВ5РІ А2 у суб'єкта.
Інактивація може бути досягнута, наприклад, шляхом хімічної або фізичної зміни сІВ5РІ А2, або шляхом мутації або урізаним білком, або тим та іншим; а імуногенність може бути досягнута в результаті інактивації й/"або шляхом додаткової кон'югації білка з придатним носієм або гаптеном, таким як КІН, НЗА, полілізин, вірусний анатоксин, або тому подібне, і/або шляхом полімеризації, або тому подібного. Таким чином, антиген може бути хімічно або фізично модифікованим, наприклад, для поліпшення його імуногенності.
У кращому варіанті здійснення СІВ5РІ А2 антиген відповідно до даного винаходу включає
СІВ5РІ А2 або його епітоп-вмісний фрагмент або мімотоп.
У окремому варіанті здійснення СІВ5РГІ А2 антиген містить повнорозмірний СІВ5РІ А2 білок.
В іншому окремому варіанті здійснення СІВ5РІ А2 антиген містить білок, який включає ЗЕО ІЮ
МО: 2, або послідовність, яка має щонайменше 90 95 ідентичність із «ЕО ІЮО МО: 2.
В альтернативному варіанті здійснення СІВ5РІГА2 антиген містить фрагмент СІВ5РІ А2 білка, який включає щонайменше б послідовних амінокислотних залишків, та який містить
Зо імуногенний епітоп або його мімотоп. У кращому варіанті здійснення СІВ5РІ А2 антиген включає щонайменше 6-20 амінокислотних залишків. Бажано пептиди відповідно до даного винаходу містять від 4 до 30 послідовних амінокислотних залишків з ЗЕО ІЮ МО: 2 (або відповідної послідовності із природного варіанта БЕО ІО МО: 2). Найкращі пептиди, відповідно до даного винаходу, включають від 5 до 25 послідовних амінокислотних залишків з ЗЕО ІЮ МО: 2 (або відповідної послідовності із природного варіанта 5ЕО ІО МО: 2), і крім того, містять щонайменше один з наступних амінокислотних залишків з БЕО ІЮ МО: 2 (або відповідної послідовності із природного варіанта 5ЕО ІЮО МО: 2): амінокислоту 70 амінокислоту 121, амінокислоту 50, амінокислоту 52, амінокислоту 54, амінокислоту 71, або їх комбінацію. Специфічними прикладами пептидів відповідно до даного винаходу є пептиди з менш ніж 50 амінокислот, які містять будь-які з поміж наступних послідовностей:
вихо сСХ І5БО І0 ОМС: 13; стос ІББО 10 МО: 181 чимтосСссісовО (559 10 МО: 15)
КнЕХУММУсесУсооосоВОоТеУ (БО БО МО: 15)
ОТНоМ (ЗЕО ІВ МО: І
СОТНОМС СаО Тр МО: 18
ЕСЕАРІСМС (КО ІБ МО; 151 ремалі (БО ТО МО: 20
РЕМААТІСЕЗКАРУМЕАНЕМІ (ББО ТО МО: 21.
СІВ5РІА2 антиген може перебувати в різних формах, таких як вільна форма, полімеризованний, хімічно або фізично модифікований і/або зчеплений (тобто зв'язаний) з молекулою - носієм. Зчеплення з носієм може підвищувати імуногенність і (додатково) пригнічувати біологічну активність СІВ5РІ А2 поліпептиду. У зв'язку із цим, молекула-носій може бути будь-якою молекулою-носієм або білком, який зазвичай застосовується в імунології, наприклад, таким як КІН (гемоцианін лімфи равлика), овальбумін, бичачий сироватковий альбумін (В5А), вірусний або бактеріальний анатоксин, такий як правцевий анатоксин, дифтерійний токсин, В-субодиниця холерного токсину, їх мутанти, такі як дифтерійний токсин
СЕМ 197, везикулярний білок зовнішньої мембрани, молекула полілізину, або вірусоподобна частка (МІ Р). У кращому варіанті здійснення носієм є КІН або СКМ197 або МІ Р.
Зчеплення СІВ5РІА2 з носієм можна виконувати за допомогою ковалентної хімії, із застосуванням зв'язувальних хімічних груп або реакцій, наприклад, таких як глутаральдегід, біотин тощо. Бажано, кон'югат або СІВ5РІ А2 білок або фрагмент або мімотоп піддають обробці формальдегідом для повної інактивації СІВ5Р'І А2.
У окремому варіанті здійснення СІВ5РІ А2 антиген включає повнорозмірний СІВ5РІ А2 білок, факультативно зчеплений з білком-носієм. У кращому варіанті здійснення СІВ5РІ А2 антиген включає білок, що містить ЗЕО ІЮО МО: 2, або послідовність, яка має щонайменше 90 95 ідентичність із ФЕО ІЮ МО: 2, пов'язану з білком-носієм.
В іншому окремому варіанті здійснення СІВ5РІ А2 антиген містить імуногенний пептид або мімотоп з (СІВ5РІА2, факультативно зчеплений з білком-носієм. У ще кращому варіанті здійснення СІВ5РІ А2 антиген містить поліпептид довжиною щонайменше 10 амінокислот, який містить щонайменше один з поміж наступних амінокислотних залишків з «ЕО ІЮО МО: 2 (або з відповідної послідовності природного варіанта 5ЕО ІЮ МО: 2): амінокислоту 70, амінокислоту 121, амінокислоту 50, амінокислоту 52, амінокислоту 54, амінокислоту 71, або їх комбінацію, факультативно зчеплену з молекулою-носієм.
Імуногенність СІВ5РІ А? антигену можна тестувати різними способами, такими як за допомогою імунізації тварини, що не є людиною, якій пересаджували людські імунні клітини, з
Зо подальшою перевіркою присутності антитіл, або за допомогою сендвіч-ІФА із застосуванням людських або гуманізованих антитіл. Відсутність біологічної активності можна підтвердити за допомогою кожного з аналізів активності, описаного в заявці. У кращому варіанті здійснення
СІВ5РІ А? антиген має менше 20 95, бажано менше 15 95, 10 95, 5 95 або навіть 1 95 активності
СІВ5РІ А2 білка дикого типу в методі (ї) індукції утворення мембранних мікродоменів ММД в
Са Т-клітинах або (ії) в індукції резистентності СО4 Т-клітин до сигналів ІІ -2 або резистентності до сигналів ІІ -7.
У окремому варіанті здійснення винахід відноситься до інактивованого та імуногенного
СІВ5РІ Аг.
В іншому окремому варіанті здійснення винахід відноситься до СІВ5РІ А2 білку або його фрагменту або мімотопу, кон'югованому з молекулою-носієм, бажано КІ Н.
В іншому аспекті винахід відноситься до вакцини, яка містить СІВ5РІ А2 антиген, придатну допоміжну речовину і факультативно, придатний ад'ювант.
Такі молекули й кон'югати й вакцини є потужними агентами для застосування з метою імунізації суб'єктів, із забезпеченням тривалого інгібування СІВ5РІА2. При повторенні такі методи можна застосовувати для індукції постійного інгібування СІВ5РІ А2.
Інший об'єкт даного винаходу відноситься до способу індукції вироблення антитіл, які нейтралізують активність ендогенного ІВ5РІ А2 у суб'єкта, який цього потребує, де спосіб передбачає застосування в зазначеного суб'єкта терапевтично ефективної кількості СІВ5РІ А2 антигену або вакцини.
Застосування антигену або вакцини відповідно до даного винаходу можна здійснювати будь-яким придатним шляхом, таким як за допомогою ін'єкції, бажано внутрішнм'язової, підшкірної, трансдермальної, внутрішньовенної або внутрішньоартеріальноїї або шляхом інтраназального, перорального, мукозального або ректального застосування.
СІВ5РІА2 антиген або вакцину можна застосовувати для лікування будь-якого захворювання, пов'язаного з надмірним продукуванням СІВ5РІ Аг. Зокрема, даний винахід відноситься до способу лікування захворювання, пов'язаного з надлишковою продукцією
СІВ5РІА2 у суб'єкта, який цього потребує, який передбачає застосування для суб'єкта терапевтично ефективної кількості СІВ5РІ А? антигену або вакцинної композиції, яка містить
СІВ5РІ А2 антиген.
Агоністи або активатори СІВ5РІ А2
Термін "агоніст" СІВ5РІА2 у контексті даного винаходу позначає будь-яку речовину, яка проявляє, або опосредковує, або здійснює посилюючу регуляцію активності СІВ5РІ А2, таку як, без обмеження, пептид, поліпептид, рекомбінантний білок, кон'югат, природний або штучний ліганд, продукт деградації, гомолог, нуклеїнова кислота, ДНК, РНК, аптамер тощо, або їх комбінацію. Термін "агоніст" охоплює як повні, так і часткові агоністи. Окремим прикладом агоніста СІВ5РІ А2 є СІВ5РІ А2 білок або нуклеїнова кислота, яка кодує СІВ5РІ А2 білок.
У окремому варіанті здійснення винахід відноситься до способів інгібування імунної відповіді в суб'єкта, які передбачають застосування для суб'єкта сІВ5РІА2 білка або нуклеїнової кислоти, що кодує СІВ5РІ А2 білок.
Композиції
Винахід також відноситься до композицій, що включають СІВ5РІ А2 модулятор або антиген, як описано в даній заявці, як активний інгредієнт і бажано фармацевтично придатний носій. "Фармацевтична композиція" означає композицію із сполуки запропонованої даним винаходом (активний інгредієнт) і середовища, як правило, прийнятого в даній галузі техніки для доставки біологічно активних сполук суб'єктові, який цього потребує. Такий носій включає всі фармацевтично придатні носії, розріджувачі середовища або основи. Може
Зо застосовуватися звичайна фармацевтична практика для забезпечення придатних комбінацій або композицій для суб'єкта, наприклад, у лікарській формі.
Сполуки або композиції запропоновані даним винаходом можуть бути представлені у формі мазі, пасти, рідких розчинів, суспензій, таблеток, желатинових капсул, капсул, супозиторіїв, порошків, крапель для носа, або аерозолю, бажано у формі розчину або суспензії для ін'єкцій.
Для ін'єкцій сполуки, як правило, фасують у формі рідких суспензій, які можна вводити, наприклад, за допомогою шприца або шляхом перфузії. У зв'язку із цим сполуки звичайно розчиняють в сольових, фізіологічних, ізотонічних або буферних розчинах, придатних для фармацевтичного застосування і відомих фахівцеві в даній галузі техніки. Таким чином, композиції можуть містити один або кілька агентів або допоміжних речовин, обраних з поміж диспергуючих засобів, солюбілізаторів, стабілізаторів, консервантів тощо. Агентами або допоміжними речовинами, які можна застосовувати в рідких й/або призначених для ін'єкцій рецептурах, є, зокрема, метилцелюлоза, гідроксиметилцелюлоза, карбоксиметилцелюлоза, полісорбат 80, манітол, желатин, лактоза, рослинні олії, аравійська камедь тощо. Носій може також бути обраний, наприклад, з поміж метил-бета-циклодекстрину, полімеру акрилової кислоти (такого, як карбопол), суміші поліетиленгліколю й пропіленгліколю, моноетаноламіну й гідроксиметилцелюлози.
Композиції, як правило, містять ефективну кількість сполуки запропонованої даним винаходом, наприклад, кількість, яка є ефективною для модуляції СІВ5РІ А2. Як правило, композиції відповідно до даного винаходу містять приблизно від 1 мкг до 1000 мг СІВ5РІ А2 модулятора, таку кількість, як 0,001-0,01; 0,01-0,1; 0,05-100; 0,05-10; 0,05-5; 0,05-1; 0,1-100; 0,1- 1,0; 0,1-5; 1,0-10; 5-10; 10-20; 20-50 ії 50-100 мг, наприклад, від 0,05 до 100 мг, бажано від 0,05 до 5 мг, наприклад, 0,055 0,150,25 0,3; 0,4; 0,5; 1; 2; 3; 4 або 5 мг. Дозування може регулювати фахівець у даній галузі техніки залежно від модулятора й захворювання.
Композиції запропоновані даним винаходом можуть додатково включати одну або кілька додаткових активних сполук, для одночасного або послідовного застосування.
Винахід також відноситься до способу приготування фармацевтичної композиції, який передбачає змішування модулятора СІВ5РІ Аг, як описано вище, і фармацевтично придатної допоміжної речовини, і одержання композиції в будь-якій придатній формі або контейнері (шприці, ампулі, флаконі, пляшці, пакеті тощо).
Винахід також відноситься до набору, який включає: (ї) композицію, яка містить модулятор
СІВ5РІ А2, як описано вище, (ії) щонайменше один контейнер, і факультативно (її) письмові інструкції із застосування набору.
Захворювання
Сполуки й композиції запропоновані даним винаходом можна застосовувати для лікування будь-якого захворювання, пов'язаного з неадекватною (наприклад, дефектною або невідповідною) імунною відповіддю, зокрема, неадекватною активністю СО4 Т-клітин, а також будь-якого захворювання, де підвищений імунітет може полегшити стан суб'єкта. Ці захворювання іноді позначаються як "імунні розлади" у даній заявці Вони включають імунодефицитні стани (наприклад, спричинені вірусною інфекцією, патогенною інфекцією, раком тощо), аутоїмунні захворювання, трансплантацію, діабет, запальні захворювання, онкологічні захворювання, алергію, астму, псоріаз, кропивницю, екзему тощо.
Імунодефіцити й пов'язані з ними захворювання
У першому аспекті винахід засновано на інгібуванні СІВ5РІ А2 у суб'єкта, з підвищенням або відновленням імунної активності, зокрема, активності, опосередкованої СО4-Т-клітинами.
Таким чином, у окремому варіанті здійснення винахід спрямований на способи стимуляції імунної відповіді суб'єкта, який цього потребує, які передбачають інгібування СІВ5РІ А2 у зазначеного суб'єкта.
У окремому варіанті здійснення винахід спрямований на способи модуляції білих кров'яних клітин у суб'єкта, який цього потребує, які передбачають інгібування СІВ5РІ А2 у зазначеного суб'єкта.
Прикладами захворювань, при яких можуть бути корисними інгібітори СІВ5РІ А2, є всі захворювання з імунодефіцитом, такі як ВІЛ-опосередкований імунодефіцит. У зв'язку із цим, У окремому варіанті здійснення винахід спрямований на способи лікування імунодефіциту або пов'язаного з ним порушення у суб'єкта, який цього потребує, які передбачають інгібування
СІВ5РІ А2 у зазначеного суб'єкта.
В іншому окремому варіанті здійснення винахід спрямований на інгібітор СІВ5РІ А2 для застосування його з метою лікування імунодефіциту або пов'язаного з ним порушення у суб'єкта, який цього потребує.
Зо Імунодефіцити й пов'язані з ними порушення означають будь-який стан або патологію, що характеризуються й/або спричинені зниженням імунної функції або відповіді в суб'єкта.
Імунодефіцити можуть бути спричинені, наприклад, вірусною інфекцією (наприклад, ВІЛ, гепатитом В тощо), бактеріальною інфекцією, раком, або іншими патологічними станами. Таким чином, термін "порушення, пов'язані з імунодефіцитом" позначають будь-яке захворювання, спричинене або пов'язане з імунодефіцитом. Винахід особливо придатний для лікування імунодефіцитів, пов'язаних з СО4 Т-клітинами, і пов'язаних з ними захворювань. Дана заявка дійсно демонструє, що біологічні ефекти СІВ5РІ А2 задіяні при СО4 Т-клітинному патологічному стані. Відповідно, блокада активності СІВ5РІ А2 у суб'єктів з порушенням відповіді на цитокіни, спричиненим імунодефіцитом, як часто спостерігається в пацієнтів, інфікованих ВІЛ, має терапевтичний вплив.
Відповідно, у окремому варіанті здійснення винахід відноситься до способів лікування ВІЛ інфекції в суб'єкта шляхом інгібування СІВ5РІ А2 у суб'єкта, бажано, шляхом застосування до суб'єкта СІВ5РІА2 інгібітора або вакцини. У деяких варіантах здійснення суб'єкт є ВІЛ- інфікованим пацієнтом на ранній стадії захворювання, і способи призводять до підвищення ймовірності того, що пацієнт зможе контролювати ВІЛ. У деяких варіантах здійснення суб'єкт є пацієнтом з низьким відновленням імунітету після антиретровірусного лікування, і/або з важкою ідіопатичною СО4 Т-лімфопенією (ІСІ). Винахід також відноситься до способу підвищення СО4-
Т-клітинної активності у ВІЛ-інфікованого суб'єкта шляхом інгібування СІВ5РІ А2 у суб'єкта, бажано, шляхом застосування до суб'єкта СІВ5РІ А? інгібітора або вакцини.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до способів лікування гострого й/або хронічного запалення й процесу в результаті запальних реакцій у суб'єкта, шляхом уведення
СІВ5РІ А2 суб'єктові, безпосередньо або разом із протизапальними ліками.
Винахід також забезпечує способи лікування рака шляхом підвищення імунної відповіді в суб'єкта, які передбачають інгібування СІВ5РІА2 у суб'єкта, бажано, шляхом застосування
СІВ5РІ А2 інгібітора або вакцини в суб'єкта. Винахід також забезпечує способи лікування імунодефіциту, пов'язаного з СО4 Т-клітинами, асоційованого з раком у суб'єкта, шляхом інгібування СІВ5РІ А2 у суб'єкта, бажано, шляхом застосування до суб'єкта СІВ5РІ А2 інгібітора або вакцини.
Патологічна імунна відповідь і пов'язані з ним захворювання
Винахід можна застосовувати для лікування будь-якого захворювання, пов'язаного з неадекватною (наприклад, патологічною або невідповідною) імунною відповіддю або з небажаною (гіпер)активністю або (гіпер)активацією імунної системи, зокрема, з неадекватною активністю СО4 Т-клітин. Ці захворювання включають, наприклад, аутоїмунні захворювання, трансплантацію, діабет, алергію, астму, псоріаз, кропивницю, екзему тощо.
Таким чином, в іншому аспекті винахід заснований на активації або індукції ІВ5РІ А2 у суб'єкта, з інгібуванням імунної активності, зокрема, активності, опосередкованої СО4-Т- клітинами.
Таким чином, у окремому варіанті здійснення винахід спрямований на способи інгібування імунної відповіді суб'єкта, який цього потребує, які передбачають індукцію або активацію
СІВ5РІ А2 у зазначеного суб'єкта.
У окремому варіанті здійснення винахід спрямований на способи інгібування білих кров'яних клітин у суб'єкта, який цього потребує, які передбачають інгібування СІВ5РІ А2 у зазначеного суб'єкта.
В іншому окремому варіанті здійснення винахід спрямований на способи лікування розладу, спричиненого небажаною імунною відповіддю суб'єкта, який цього потребує, які передбачають індукцію або активацію СІВ5РІ А2 у зазначеного суб'єкта.
Індукція або активація СІВ5РІ А? у суб'єкта бажано включає застосування до суб'єкта агоніста СІВ5РІ А2, наприклад, СІВ5РІ А2 білка або його функціонального фрагмента.
В іншому окремому варіанті здійснення винахід спрямований на СІВ5РІ А2 агоніст або активатор для застосування при лікуванні порушення, спричиненого небажаною імунною відповіддю, у суб'єкта, який цього потребує.
Прикладами захворювань, при яких можуть застосовуватися СІВ5РІА2 агоністи, є аутоїмунні порушення, рак, вірусні захворювання, бактеріальні інфекції тощо.
У окремому варіанті здійснення винаходу спрямований на способи лікування аутоїмунного порушення суб'єкта, який цього потребує, які передбачають стимуляцію або індукцію СІВ5РІ А2 у зазначеного суб'єкта.
В іншому окремому варіанті здійснення винахід спрямований на сполуки або композицію запропоновану даним винаходом для застосування при лікуванні аутоїмунного порушення
Зо суб'єкта, який цього потребує.
У окремому варіанті здійснення винахід спрямований на способи лікування рака у суб'єкта, який цього потребує, які передбачають стимуляцію або індукцію СІВ5РІ А? у зазначеного суб'єкта.
В іншому окремому варіанті здійснення винахід спрямований на сполуки або композицію запропоновану винаходом для застосування при лікуванні раку у суб'єкта, який цього потребує.
Інший окремий варіант здійснення винаходу відноситься до способу лікування (наприклад, зниження або профілактики або інгібування) відторгнення трансплантата, для лікування хвороби трансплантат проти хазяїна в суб'єкта, якому проведена трансплантація, який передбачає стимуляцію або індукцію СІВ5РІ А2 у зазначеного суб'єкта. Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб підвищення толерантності до аллогенного трансплантату в суб'єкта, який передбачає стимуляцію або індукцію СІВ5РІ А2 у зазначеного суб'єкта.
Протимікробна активність
Дана заявка також забезпечує, в іншому аспекті, спосіб знищення мікроорганізмів із застосуванням СІВ5РІ А2. Шляхом прямого впливу на мембрани, СІВ5РІ А?2 може руйнувати або вбивати бактерії, віруси з оболонкою, паразитів тощо.
При гострих інфекціях або інших інфекціях, СІВ5РІГА2 можна застосовувати окремо або разом з антибіотиками, противірусними, антиретровірусними й протипаразитарними препаратами. У випадку мікробів, резистентних до відомих протимікробних ліків, ІВ5РІ А2 може представляти альтернативну терапію. Її можна застосовувати в дуже короткочасному лікуванні, наприклад, при дуже небезпечних і гострих клінічних ситуаціях.
Специфічні приклади захворювань, при яких може бути корисним лікування сІВ5РІ А2 відповідно до винаходу, є всі клінічні ситуації з гіперактивністю імунної системи або хронічним запаленням, такі як розсіяний склероз, міастенія гравіс; аутоїмунні нейропатії, такі як синдром
Гійєна-Барре; аутоїмунний увеїт, увеїт, аутоїмунна гемолітична анемія, перніційна анемія, аутоїмунна тромбоцитопенія, скроневий артериїт, антифосфоліпідний синдром; васкуліти, такі як гранулематоз Вегенера; хвороба Бехчета, атеросклероз, псоріаз, герпетиформний дерматит, вульгарний пемфігус, вітиліго, грибоподібний мікоз, алергійний контактний дерматит, атопічний дерматит, червоний плоский лишай, гострий ліхеноїдний і варіоліформний парапсоріаз, екзема, хвороба Крона, виразковий коліт, первинний біліарний цироз, аутоїмунний гепатит, цукровий 60 діабет 1 типу, хвороба Адісона, базедова хвороба, тиреоїдит Хашимото, аутоїмунний оофорит і орхит, аутоімунний тиреоїдит, ревматоїдний артрит, системний червоний вовчак, склеродермія, поліміозит, дерматоміозит; спондилоартропатії, такі як анкілозуючий спондиліт, або синдром
Шегрена.
Тривалість, дозування й частота застосування сполук або композицій запропонованих даним винаходом можуть бути адаптовані відповідно до суб'єкта й захворювання. Лікування може проводитися окремо або в комбінації з іншими активними інгредієнтами, одночасно, окремо або послідовно.
Сполуки або композиції запропоновані даним винаходом можна застосовувати різними шляхами або способами, такими як, без обмеження, системне введення, внутрішнм'язове, внутрішньовенне, інтраперитонеальне, шкірне, підшкірне, дермальне, трансдермальне, інтратекальне, окулярне (наприклад, корнеальне), або ректальне, або шляхом місцевого застосування в області запалення і бажано шляхом внутрішнм'язового або внутрішньовенного введення.
Типовий режим включає одиничне або повторне застосування ефективної кількості модулятора СІВ5РІА2 протягом періоду від одного до декількох днів, до одного року, і включаючи період від одного тижня приблизно до шести місяців. Необхідно розуміти, що дозування фармацевтичної сполуки або композиції запропонованої даним винаходом, яка застосовується іп мімо, буде залежати від віку, стану здоров'я, статі і маси тіла реципієнта (суб'єкта), виду супутнього лікування, якщо воно проводиться, частоти лікування, і природи необхідного фармацевтичного ефекту. Діапазони ефективних доз, запропоновані в даній заявці, не призначені для обмеження й представлення кращих діапазонів доз. Однак найкраще дозування повинне бути адаптованим до певного суб'єкта, як зрозуміло й може бути визначено будь-яким фахівцем у даній галузі техніки (див., наприклад, Вегкоугеї еї аї., ед5., "Те Мегск
Мапиаї, 161" еайіоп", МегскК апа Со., Капм/ау, М.., 1992 ("Керівництво МегсК, 16-е видання");
Сооадтапвіпа., ед5., сосатап і Сітап'5 "Тпе рпагтасоїодіса! Вахі5 ої Тпегарешціїс5, 107" еййоп",
Регдатоп Ргез5, Іпс., ЕІт5тога, М.У., (2001) ("Фармакологічна основа терапевтичних засобів").
Діагностика
Винахід також забезпечує способи детекції імунного дефекту в суб'єкта на основі детекції присутності або кількості, або відсутності СІВ5РІА?2 у зразку від суб'єкта. Спосіб запропонований даним винаходом можна здійснювати із застосуванням різних технологій або платформ детекції, відомих як такі в даній галузі техніки, таких як, без обмеження, аналіз із застосуванням захоплення, сендвіч-аналіз, конкурентний аналіз, радіоїмунний аналіз; ферментативні мітки із субстратами, які генерують пофарбовані, флуоресцентні, хемілюмінесцентні або електрохімічно активні продукти; флуоресценція, флуоресцентна поляризація, хемілюмінесценція, оптичний і колориметричний аналіз, електрохемілюмінесценція, флуоресценція з розрізненням у часі, поверхневий плазмонний резонанс, аналіз із застосуванням загасаючої хвилі, аналіз на багатокоміркових планшетах (ІФА), індивідуальний аналіз, багатоканальний аналіз, багатоканальний аналіз на латексному намисті, багатоканальний аналіз на мікроматриці (плоскій поверхні), аналіз на скляних пластинах або аналіз на основі смужок.
У окремому варіанті здійснення спосіб передбачає визначення присутності або кількості, або відсутності поліморфізму СІВ5РІ А? гена, РНК або білка. Наші результати показали, що
СІВ5РІ А2 має високий поліморфізм і що це корелює з фізіологічним статусом суб'єкта. Таким чином, винахід включає: (ї|) визначення присутності, кількості або відсутності конкретної поліморфної ізоформи СІВ5РІ А2, і/або (ії) визначення загального рівня поліморфізму СІВ5РІ А2 у суб'єкта, де зазначені дані корелюють із фізіологічним статусом суб'єкта. Зокрема, специфічні ізоформи можуть бути характеристикою схильності, присутності або розвитку в суб'єкта захворювання, яке описане вище. Таке визначення можна також використовувати в персоналізованій медицині, для регуляції лікування.
Способи моніторингу й/або діагностики імунодефіциту, пов'язаного з дефектами СО4 Т- клітин, які передбачають детекцію СІВ5РІ А2
Способи моніторингу й/або діагностики імунодефіциту, пов'язаного з дефектами СО4 Т- клітин, зокрема, інфекції вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ) у суб'єкта, забезпечуються в даній заявці. У деяких варіантах здійснення способи передбачають (а) забезпечення зразка, який містить рідину організму, бажано плазму від суб'єкта, і (Б) детекцію рівня СІВ5РІ А2 у зразку вище граничного. Присутність СІВ5РГ А2 у зразку можна виявити будь-яким способом, відомим у даній галузі техніки, наприклад, способом, який передбачає ферментативний аналіз, аналіз із захопленням ліганда, і/або імунсоаналіз.
У деяких варіантах здійснення спосіб передбачає одержання зразка, який запропонованої 60 даним винаходом включає плазму, від суб'єкта, і визначення того, чи проявляє плазма щонайменше одну активність, обрану з поміж індукції утворення аномальних мембранних мікродоменів (ММД) в СО4 Т-клітинах від здорових суб'єктів та індукції резистентності СО4 Т- клітин від здорових суб'єктів до сигналів інтерлейкіна-7 (1-7). Якщо плазма суб'єкта проявляє таку активність, то суб'єкт у деяких варіантах здійснення визначається як такий, що має пов'язаний з СО4 Т-клітинами імунодефіцит, який часто спостерігається у ВІЛ-інфікованих пацієнтів, але не тільки в них. Якщо фракція плазми не проявляє такої активності, то суб'єкт у деяких варіантах здійснення визначається як такий, що має низьку схильність до імунодефіциту, пов'язаного з порушенням СО Т-клітин у цитокін-регульованому гомеостазі.
У деяких варіантах здійснення суб'єкт визначається як такий, що має ВІЛ-інфекцію. Напроти, якщо білкова фракція не проявляє такої активності, то суб'єкт у деяких варіантах здійснення визначається як такий, що не має імунодефіциту, пов'язаного з дефектами СО4 Т-клітин, як розкрито в даній заявці. У деяких варіантах здійснення суб'єкт визначається як такий, що не має
ВІЛ-інфекції.
У деяких варіантах здійснення способи передбачають забезпечення контакту зразка, що містить рідину організму, бажано плазму, від суб'єкта, з антитілами, специфічними до
СІВ5РІА2, і визначення присутності або відсутності імунної реакції. У деяких варіантах здійснення присутність або відсутність імунної реакції визначають за допомогою способу, який передбачає імуноферментний аналіз (ІФА). Наявність імунної реакції між антитілом, специфічним до СІВ5РГ А2 і зразком указує на присутність СІВ5РГА2 у зразку, що у свою чергу вказує, що суб'єкт має імунодефіцит, пов'язаний з дефектами СО4 Т-клітин. У деяких варіантах здійснення визначається, що суб'єкт має ВІЛ-інфекцію. Напроти, відсутність імунної реакції між антитілом, специфічним до СІВ5РІА2, і зразком указує, що суб'єкт не має імунодефіциту, пов'язаного з дефектами СО4 Т-клітин, як розкрито в даній заявці. У деяких варіантах здійснення визначається, що суб'єкт не має ВІЛ інфекції.
У деяких варіантах здійснення аналіз на присутність СІВ5РІ А2 у зразку є якісним. У деяких варіантах здійснення аналіз на присутність СІВ5РІ А2 у зразку є кількісним.
У деяких варіантах здійснення спосіб передбачає порівняння результатів аналізу з результатами схожого аналізу контрольного зразка, що містить плазму суб'єкта, у якого немає імунодефіциту, пов'язаного з дефектами СО4 Т-клітин. У деяких варіантах здійснення способи
Зо передбачають порівняння результатів аналізу з результатами подібного аналізу зразка, що містить плазму того ж самого суб'єкта, зібрану раніше.
Способи моніторингу й/або діагностики імунодефіциту, пов'язаного зі зміною СО4 Т-клітин, які передбачають характеристику мембранних мікродоменів на СО4 Т-клітинах
Дані в прикладах демонструють, що у ВІЛ-інфікованих пацієнтів відзначається утворення характерних мембранних мікродоменів (ММД) на поверхні СО4 Т-клітин, хоча дуже мало клітин дійсно інфіковані ВІЛ. Відповідно, даний винахід також забезпечує способи діагностики імунодефіциту, пов'язаного зі зміною СО4 Т-клітин, наприклад, такою як імунодефіцит, спричинений інфекцією вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ) у суб'єкта. У деяких варіантах здійснення способи передбачають: (а) виділення СО4 Т-лімфоцитів у суб'єкта, і (б) вимірювання числа й/або розміру мембранних мікродоменів (ММД) на Т-клітинах. У деяких варіантах здійснення способи додатково включають щонайменше одне з поміж (с) вимірювання кількості фосфо-51;3АТ5 у Т-клітинах, і (а) визначення частки імпорту в ядро фосфо-5ТАТ5 у Т-клітинах. У деяких варіантах здійснення число й/або розмір ММД на Т-клітинах вимірюванняюють за відсутності інтерлейкіна. У деяких варіантах здійснення число й/або розмір ММД на Т-клітинах вимірюванняюють за відсутності ІІ -2. У деяких варіантах здійснення число й/або розмір ММД на
Т-клітинах вимірюванняюють за відсутності І/-7. У деяких варіантах здійснення число й/або розмір ММД на Т-клітинах вимірюванняюють у присутності субпорогового рівня інтерлейкіна.
У деяких варіантах здійснення, якщо число ММД на Т-клітинах, виділених у суб'єкта, перебуває щонайменше на граничному рівні, це вказує, що суб'єкт має імунодефіцит, пов'язаний зі зміною СО4 Т-клітин. У деяких варіантах здійснення це вказує, що суб'єкт має ВІЛ інфекцію. У деяких варіантах здійснення, якщо число ММД на Т-клітинах, виділених у суб'єкта, не сягає щонайменше граничного рівня, це вказує, що суб'єкт не має імунодефіциту, пов'язаного зі зміною СО4 Т-клітин, як розкрито в даній заявці. У деяких варіантах здійснення це означає, що суб'єкт не має порушень відповіді СО4 Т-клітин на сигнали цитокінів. У деяких варіантах здійснення це означає, що суб'єкт не має порушення відповіді СО4 Т-клітин на інтерлейкін-7. У деяких варіантах здійснення це вказує, що суб'єкт не має ВІЛ інфекції. У деяких варіантах здійснення граничний рівень становить щонайменше приблизно 80 на клітину, щонайменше приблизно 90 на клітину, щонайменше приблизно 100 на клітину, щонайменше приблизно 110 на клітину, або щонайменше приблизно 120 на клітину. У не обмежуючому бо кращому варіанті здійснення граничний рівень становить приблизно 100 на клітину. У деяких варіантах здійснення, якщо ММД на Т-клітинах, виділених у суб'єкта, мають діаметр щонайменше граничного рівня, це вказує, що суб'єкт має ВІЛ-інфекцію. У деяких варіантах здійснення, якщо ММД на Т-клітинах, виділених у суб'єкта, не мають діаметра щонайменше граничного рівня, це вказує, що суб'єкт не має порушення відповіді до інтерлейкін-7, і в більш широкому сенсі на цитокіни. У деяких варіантах здійснення це вказує, що суб'єкт не має ВІЛ- інфекцію. У деяких варіантах здійснення граничним рівнем є діаметр щонайменше 100 нм, щонайменше 110 нм, щонайменше 120 нм, щонайменше 130 нм, або щонайменше 140 нм. У не обмежуючому кращому варіанті здійснення граничним рівнем є діаметр щонайменше 120 нм.
Оскільки КІЄ може міняти здатність СО4 Т-клітин до відповіді на ІЇ/-7 шляхом агрегації мембранних рецепторів в аномально великі ММД, можуть зазнати зміни відповіді на інші гамма- с і цитокіни, а також КІР може бути пов'язаний з іншими патологіями, при яких залучена змінена відповідь СА Т-клітин.
Способи ідентифікації потенційних терапевтичних агентів
Даний винахід також пропонує способи ідентифікації потенційного терапевтичного агента, які передбачають: (а) забезпечення контакту СО4 Т-лімфоцитів з СІВ5РІ А2 у присутності агента, і (Б) вимірювання СІВ5РІ А2-індукованої активації СО4 Т-клітин. У деяких варіантах здійснення способи передбачають (с) порівняння рівня СІВ5РІ А2-індукованої активації СО4 Т- клітин у присутності агента з рівнем СІВ5РІ А2-індукованої активації СО4 Т-клітин за відсутності агента. У деяких варіантах здійснення, якщо рівень СІВ5РІ А2-індукованої активації СО4 Т- клітин у присутності агента нижчий від рівня СІВ5РІ А2-індукованої активації СО4 Т-клітин за відсутності агента, то агент ідентифікують як потенційний агент для лікування імунодефіциту. У деяких варіантах здійснення агент ідентифікують як потенційний агент для лікування ВІЛ. У деяких варіантах здійснення, якщо рівень СІВ5РІ А2-індукованої активації СО4 Т-клітин у присутності агента вищий від рівня СІВ5РІ А2г-індукованої активації СО4 Т-клітин за відсутності агента, то агент ідентифікують як потенційний імуносупресивний терапевтичний агент.
У деяких варіантах здійснення вимірювання СІВ5РІ А2-індукованої активації СО4 Т-клітин включає визначення числа ММД на СО Т-клітину.
У деяких варіантах здійснення вимірювання СІВ5РІ А2-індукованої активації СО4 Т-клітин включає визначення середнього діаметра ММД на С04 Т-клітинах.
Зо У деяких варіантах здійснення вимірювання СІВ5РГІАг-індукованої активації СО4 Т-клітин включає визначення здатності СО4 Т-клітин до відповіді на 1-7 при аналізі 5ТАТ5 фосфорилювання й/або імпорту в ядро.
Як застосовується в даній заявці, "агент" може бути будь-якою хімічною речовиною, який розцінюється як потенційний терапевтичний засіб. У деяких варіантах здійснення агент є органічною молекулою. У деяких варіантах здійснення агент містить від 2 до 100 вуглецевих атомів, таку кількість, як від 2 до 50 вуглецевих атомів, від 5 до 50 вуглецевих атомів, або від 10 до 50 вуглецевих атомів. У деяких варіантах здійснення агент є пептидом, білком, глікопротеїном, або ліпопротеїном. У деяких варіантах здійснення агент є антитілом.
У деяких варіантах здійснення для агента не було раніше визначено, що він має біологічну активність, що дозволяє застосовувати його як терапевтичний агент для лікування імунодефіциту, такого як той, який часто асоціюється з ВІЛ-інфекцією. У деяких варіантах здійснення для агента раніше було визначено, що він має біологічну активність, що дозволяє застосовувати його як терапевтичний агент для лікування імунодефіциту, такого як той, який часто асоціюється з ВІЛ-інфекцією.
Як застосовується в даній заявці, "потенційний агент для лікування імунодефіциту" або "потенційний агент для лікування ВІЛ" є агентом, який пригнічують здатність КІЕ до активації
Ср4і Т-клітин щонайменше в одному аналізі. Відповідно до даних, наведених у даній заявці, здатність агента до пригнічення здатності ЗІВ5РІ А2 до активації СО4 Т-клітин щонайменше в одному аналізі є придатним способом ідентифікації агентів, які, імовірно, є терапевтично придатними для лікування імунодефіцитів, включаючи імунодефіцити, асоційовані з ВІЛ- інфекцією. Відповідно, це також є придатним способом ідентифікації агентів, які, імовірно, є терапевтично придатними для лікування ВІЛ-інфекції. Звичайно, як і з усіма терапевтичними молекулами, необхідна додаткова характеристика. Однак це не знижує корисних властивостей потенційних агентів для лікування ВІЛ запропонованих даним винаходом.
Додаткові аспекти й переваги винаходу розкриті в наступному розділі, присвяченому експериментам; їх потрібно розглядати як ілюстративні.
Приклади 1. Матеріали й методи 1.1. Пацієнти
МР, включені в дослідження, були ВІЛ-позитивними протягом більш ніж одного року. Вони не одержували будь-яких антиретровірусних ліків і мали вірусне навантаження » 10,000 РНК копій/мл із числом СО4 » 200/мкл на час відбору крові (дослідження АМАК5 ЕРЗЗ і ЕР2О).
Усі зразки крові від МР збирали в Лікарняному центрі Гонесса. Кров від НО була надана
Французькою службою крові (Сепіге МесКег-Сарапеї, Париж). Зразки плазми від АКТ пацієнтів брали в індивідуумів, що одержують лікування протягом щонайменше одного року. Їхнє вірусне навантаження було нижчим від межі виявлення, протягом щонайменьше 6 місяців, а кількість ср4 становила більше 500/мкл на час відбору крові. Зразки плазми від НІС пацієнтів брали у індивідуумів з вірусним навантаженням, нижчим від межі виявлення, протягом щонайменьше 10 років. Зразки плазми збирали в Інфекційному центрі МесКег-Равзієиг. 1.2. Аналіз мембранних мікродоменів (ММД), швидкості дифузії рецепторів і клітинної компартменталізації фосфо-5ТАТЬ5 в очищених СОА4 Т-лімфоцитах. сра4 Т-клітини очищали шляхом негативної селекції, як уже описано (10), потім активували 2 нм рекомбінантного глікозильованого людського 1-7 (Су йегіз) або 40 мкг ФГА (Зідта).
Конфокальна й 5ТЕО мікроскопія, використана для вивчення мікродоменів клітинної поверхні (ММД) ї розподілу фосфо-5ТАТ5 у клітинному компартменті, уже описані (10, 12). ЕС5 аналіз дифузії білків на поверхні живих клітин також описаний (10, 12). 1.3. Приготування й аналіз детергент-резистентних мікродоменів (ДРМ)
Приготування із Тритоном-Х100 лізатів СО4 Т-лімфоцитів від НО або УР, з подальшим центрифугуванням на градієнтах сахарози й вестерн-блот аналізом зібраних фракцій уже описано (12). Моноклональні антитіла, специфічні до флотиліну, П/-7Н-альфа і гамма-с, використовували для детекції відповідних смуг при вестерн-блотингу (12). 1.4. Характеристика КІЕ із плазми УР 1.4.1. Біоаналізи
Індукцію ММД здійснювали в такий спосіб: МР плазму (5 або 10 95) спочатку інкубували (20 хвилин) у середовищі з очищеними НО С04 м-клітинами. Клітини потім поміщали на покриті полілізином скляні слайди на 10 хвилин, потім активували протягом 15 хвилин 1-7 (2 НМ), або не активували для контролю (М5), потім фіксували РЕА (РЕА, 1,5 95, 15 хвилин при 37 "С, потім 15 хвилин за кімнатної температури), урівноважували протягом 1 години на РВЗ/5МЕ 5 95 перед
Зо фарбуванням холерним токсином В (СІХВ-АБ488). ММД підраховували за допомогою ЗТЕО мікроскопії.
Аналіз інгібування фосфорилювання 5ТАТ і трансллокації в ядро проводили в такий спосіб:
МР плазму (5 або 10 95) спочатку інкубували з очищеними НО СО4 м-клітинами (20 хвилин) перед стимуляцією 1-7 (2 НМ, 15 хвилин). Потім клітини поміщали на покриті полілізином скляні слайди на 10 хвилин, потім активували протягом 15 хвилин 1-7 (2 нМ) або не активували для контролю (М5), потім фіксували РЕА (РЕА, 1,5 95, 15 хвилин при 37 "С, потім 15 хвилин за кімнатної температури), і проводили пермеабілізацію метанолом (90 95 при -20 "С). Клітини врівноважували протягом двох годин на РВБЗ/5МЕ 595, потім фарбували фосфо-5ТАТ5 кролячими антитілами до 5ТАТ5, міченими козячими антитілами до кролячих АйЦоба42 і аналізували за допомогою ЕАС5З або ЗТЕО мікроскопії. 1.4.2. Обробка ферментами
Вплив ферментативного розщеплення на активність КІЄ оцінювали шляхом обробки УР плазми, фільтрованої на мембрані 30 кДа. Сполуки плазми з молекулярною масою менше 10 кКДа використовували як негативний контроль. Аналізували ефекти свинячого трипсину (1 Од/мл протягом 30 хвилин при 37 "С, з подальшим РМ5Е інгібуванням і обміном буфера на мембранних центрифужних фільтрах МійПіроге 5 кДа), або ДНКази І (1 Од/мл протягом 30 хвилин при 37 "С) або РНКази (1 Од/мл протягом 30 хвилин при 37 "С) або пептид М-гліканази (1 Од/мл протягом 30 хвилин при 37 "С). Усі препарати аналізували за кінцевої концентрації 10 95. 1.4.3. Визначення молекулярної маси або очищення КІР
Гельпроникаючу хроматографію проводили шляхом завантаження 1,6 мл плазми на 85 мл колонці із Сефадексом О-100, попередньо врівноваженим карбонатом амонію (0,1 М) або ФБР, потім збирали фракції елюата по 0,8 мл. Колонку калібрували із застосуванням набору білків (СЕ-НеайНсаге). Концентрацію білка вимірювалио методуом Бредфорда. УР плазму попередньо фільтрували на мембрані 100 кДа, і тестували загальну МР плазму й одержували ідентичні результати. Збирали фракції 13-17 кДа, які містили напівочищений РІР. 1.4.4. Визначення ізоелектричної точки
Аніоно- або катіонообмінну хроматографію проводили на 1 мл колонках МопоО0 або Мопо5 (СЕ-Неанйсаге) з елюцією послідовними етапами зі зміною рН (буфери карбонату амонію/ацетату амонію). Вимірювали рН кожної елюйованої фракції, і потім доводили рН до 7,4 перед аналізом біологічних ефектів. Активність КІЕ вимірювали у відповідних фракціях негайно після елюції. 1.4.5. МС аналіз
Зразки від гель-фільтрації (5100) ліофілізували, потім ресуспендували, збирали й піддавали протеолізу свинячим трипсином, відповідно до способів, відомих в даній галузі техніки. Пептиди після протеолізу розділяли на 12 фракцій за допомогою хроматографії на С18 колонці, елююючи ацетатом амонію. 12 фракцій, розділених на С18, елюювали у оберненій фазі (з ацетонітрилом) і прямо вводили шляхом електророзпилеювання в Огрігар Меїо5 (ТПнепто зсіепійіс) для МС аналізу із вторинною Аг-фрагментацією, потім проводили МС/МС для 10 піків з найбільш високою інтенсивністю на МС сканування.
Використовували стандартні програми Мабзсої і Х-Тапдет. Для кожного білка з піднаборів бази даних, розраховували З критерії: - І-індекс: Розрахунки теоретичної специфічності кожного з пептидів після розщеплення трипсином окремого білка в базі даних МехіРгої, збагаченого зрілими білками з розщепленням сигнальної послідовності (число унікальних пептидів/білок): число специфічних пептидів для всіх людських послідовностей (аїЇ), послідовності з М-кінцевим сигнальним пептидом (з5ес) на білок; - Розрахунки теоретичної частоти пептидів, сумісних з піками із усіх серій МС сканування (піки, що збігаються з теоретичними пептидами/білок); - Розрахунки теоретичного охоплення білкової послідовності з пептидами, що збігаються з піками.
Для кожного білка визначали р-індекс за результатами із усіх трьох індексів.
Приклад 1. Аберантна активація СО4 Т-лімфоцитів від МР за результатами аналізу наявності аномальних мембранних мікродоменів (ММД)
Цей приклад описує дослідження нових молекулярних і клітинних параметрів, які Пояснюють деякі аномальні відповіді, що спостерігаються в СО4 Т-лімфоцитах від пацієнтів із хронічної ВІЛ- інфекцією. Хронічну активацію імунної системи звичайно визначають шляхом оцінки надлишкової експресії молекул клітинної поверхні, таких як СО38, НІГА-ОК і СО25, які вважаються головними маркерами дисфункції СО4 (15). Однак, незважаючи на багато спроб, ці дані залишаються неясними, і фенотип СО4 Т-клітин не дозволяє безпосередньо пояснити їхні імунні дефекти.
ЗТЕО мікроскопію й маркування холерним токсином В (СІХВ-АЕ488) використовували для детекції наявності ММД (12). Було встановлено, що перед будь-якою стимуляцією поверхня ср4 Т-лімфоцитів, виділених від УР, несла набагато більше ММД, ніж в спочиваючих СА Т- лімфоцитів, виділених в НО (Фіг. 1а). | найбільш важливо, що всі СО4 Т-клітини від МР показали підвищене число ММД. Цей аномальний характер не був наслідком стимуляції ІЇ-7 в МР плазмі, оскільки середня концентрація 1-7 у цій плазмі (0,4 пМ) склала тільки 100 Ка від 1--7А (13, 14).
Коли очищені СО4 Т-клітини від НО стимулювали 1-7, спостерігалася велика кількість ММД.
Напроти, на характер ММД на СО4 Т-клітинах від МР не виявляв впливу 1-7 (Фіг. Та). Ця аномальна активація разом з відсутністю будь-якої відповіді на ІЇ-7 може бути імітована нефізіологічним стимулом, таким як фітогемаглютинін (ФГА) (Фіг. 1а).
Потім підраховували ці різні аномальні ММД. Спостерігалося близько 150-200 ММД на СОр4
Т-клітину від МР, як для ФГА-стимульованих НО СО4 Т-клітин (Фіг. 1с). Знову, отримані результати показали, що всі СО4 Т-клітини від МР експресували ММД, включаючи всі основні субпопуляції СО4А (Фіг. 1с). 1-7 не викликав підвищення числа ММД в УР. Напроти, число ММД на НО С04 Т-клітинах зростало від фонового приблизно 10 ММДі/клітину до 300 після стимуляції
І-7. Також проводили вивчення розміру ММД (Фіг. 14 ії Те). Це показує, що ММД на С04 Т- клітинах від УР і на ФГА-стимульованих НО СО4-клітинах були набагато більше (250 нм), ніж на
НО С04 Т-клітинах, стимульованих 1І--7 (90 нм).
Приклад 2. Усі І/-7К альфа й гамма-с ланцюги є секвестованими в аномальних детергент- резистентних мембранних мікродоменах (ДРМ), виділених з МР С04 Т-клітин.
Спочиваючі НО С04 Т-клітини аналізували, щоб підтвердити, що ІЇ-7К альфа й гамма-с ланцюги розташовані у фракціях високої щільності поза ММД. Коли ці НО СО4 Т-клітини стимулювали 1-7, ці два ланцюги розташовувалися у фракціях низької щільності, що відповідають детергент-резистентним ММД або ДРМ, що містять усі білки, секвестовані в ММД (Фіг. 2).
Коли дослідження повторювали на СО4 Т-клітинах, виділених від УР, характер був іншим (Фіг. 2). Раніше від будь-якої стимуляції всі І -7К альфа й гамма-с ланцюги були вже секвестовані в ДРМ; нічого не розташовувалося у фракціях високої щільності, які відповідають бо вільним рецепторам поза ММД. Далі, попередня стимуляція СО4 Т-клітин 1-7 перед одержанням ДРМ не впливає на цей характер (дані не показані). Знову, попередня стимуляція
НО С04 Т-клітин нефізіологічним ФГА відтворює цей патологічний стан. Це підтверджують дані на Фіг. 1 і демонструють, що СО4 Т-клітини в УР є предметом аберантной активації до будь-якої стимуляції. Крім того, ці аномальні ММД містять усі ланцюги ІІ -7К (Фіг. 2).
Приклад 3. Двомірний аналіз у гелі І/-7 сигналосоми в очищених СО4 Т-клітинах з НО, МР і
І -7-стимульованих НО клітин. Характеристика аберантного стану активації за допомогою характеру білка, отриманого після імунопреципитації.
Двовимірний електрофорез використовували для демонстрації того, що склад 1-7 сигналосоми в УР був аномальним і відрізнявся від того, який спостерігається в спочиваючих й
І -7-активованих СО4 Т-клітинах (Фіг. 7а, 75 і 7с).
Білки піддавали імунопреципітації з антитілами до І/-7В-альфа (мишачими моноклональними антитілами 40131, К2О буєіет), іммобілізованими на протеїн б-сефарозе 40 з лізату очищених СО4 Т-клітин, і розділяли за допомогою двовимірного ПАГЕ (ЕФ на смужках гелю при рН 3-10 з подальшим ДСН-електрофорезом в 12 95 акриламідному-бісакриламідному гелі). Відображені значення рН і молекулярної маси (кДа). Гелі фарбували з Зурго-Вибру.
Показані гелі є прикладами 8 М5/І--7 пар, отриманих від НО, і З гелю від МР. (Фіг. а) Не стимульовані (М5) НО С04 Т-клітини. (Фіг. 75) МР С04 Т-клітини. Більше плям спостерігалося у двовимірних гелях, пофарбованих
Зурго Рибу, зі зразками від МУР, ніж від НО. Крім того, ми спостерігали, що загальні плями були більш інтенсивними, коли 2 ЮО-гелі були отримані з УР екстрактами. (Фіг. 7с). І-7-стимульовані НО С04 Т-клітини. Характер в НО С04 Т-клітинах, стимульованих
І/-7, відрізняється від того, що спостерігалося в МР СО4 Т-клітинах. Це також підтримує припущення про те, що аберантна активація, яка спостерігається в МР, не є наслідком стимуляції І--7, яка може відбуватися в органах з високим рівнем ІІ--7, наприклад, в органах, які продукують І--7.
На основі цього аналізу можна зробити висновок, що ланцюги І--7Е в МР С0р4 Т-клітинах не є частиною аномальних ММД, але також що вони взаємодіють із білюоовими комплексами, які відрізняються від тих, які перебувають у нормальній ІІ--7 сигналосомі.
Приклад 4. Швидкість дифузії ІІ-7А-альфа на поверхні очищених СО4 Т-клітин з НО, МР і
Зо ФГА-стимульованих НО клітин. ІЇ-7В-альфа в МР С04 Т-клітинах вбудований у багаті ліпідами аномальні ММД, таким чином, обмежуючи швидкості їх дифузії й запобігаючи будь-яким взаємодіям із цитоскелетом, і таким чином, будь-якій здатності до передачі сигналів.
Двомірну дифузію І/-7АК-альфа з фарбуванням моноклональними антитілами АЕ 1-7В- альфа вимірювали за допомогою ЕС5 на поверхні живих СО4 Т-клітин. Результати показані на
Фіг. 8. Час дифузії тО (в 10-3 с) вимірювали за відсутності ІЇ/-7 (О, автокореляція) або в присутності ІІ -7-біотин- ЗАЕ633 (Ф, взаємна кореляція), как описано (10, 12). Ці значення часу будували навпроти площі поверхні клітини Фо? (в 103 нм"), яка переривається конфокальним об'ємом. Показані криві дифузії з попередньою обробкою інгібіторами ММД (ХоОаза 1 мкг/мл плюс СМаза 0,1 мкг/мл протягом 30 хвилин) або інгібіторами циоскелета (ЦитО 10 мкМ плюс Кіл 10 мкМ протягом 30 хвилин), або без неї.
Стовпчики вказують СКО від 5 незалежних експериментів. Тангенси кута нахилу лінійної регресії дають ефективні швидкості дифузії Оек, а у-інтерсепти екстраполюють час утримання то, як ми описували раніше (12). Оек показані на гістограмі на Фіг. За. (Фіг. ва, ва) на поверхні НО С04 Т-клітин, (Фіг. 80, ве) на поверхні МР СОА4 Т клітин, (Фіг. 83, 81) на поверхні НО С04 Т-клітин, попередньо активованих ФГА (1 мкг/мл). (Фіг. 89) Схема механізму дифузії І-7В-альфа, вбудованого в ММД, до й після обробки інгібіторами ММД або інгібіторами цитоскелета. ММД зазначені дисками, рецептори - паличками, цитоскелет показаний у вигляді мережі. Швидкості дифузії (швидка, повільна, дуже повільна) зазначені для спрощення інтерпретації даних. Ця схема ілюструє результати, також зазначені на Фіг. За.
Приклад 5. Ланцюги І/-7К, секвестовані в аномальних ММД МР СО4 Т-клітинах, є не функціональними.
Швидкості дифузії ІІ -7К вимірювали на поверхні СО4 Т-клітин, як описано раніше (10, 12), ї як докладно викладено в Прикладі 4. Було видно, що перед будь-якою стимуляцією ці швидкості дифузії були в три рази нижчими на УР, ніж на НО СО4 Т-клітинах (Фіг. За). Це додатково демонструє, що ланцюги ІІ-7В-альфа вбудовані в аномальні ММД на поверхні цих СО4 Т-клітин (Фіг. За). Обробка ХОазою плюс СМазою вивільняє рецептор з обмежуючих його ММД, і таким чином, підвищує його швидкість дифузії (Фіг. За). Напроти, обробка цитохалазином О (Су) бо плюс колхіцином (СОЇ), які дезорганізують цитоскелет, не впливає на швидкість дифузії ланцюгів
І--7К на МР С04 Т-клітин (Фіг. За). Оскільки організація цитоскелета абсолютно необхідна для передачі сигналу, ця відсутність будь-якої функціонального або структурного зв'язку між 1-7 В- альфа й цитоскелетною мережею дозволяє припустити, що передача сигналу не може відбуватися, коли комплекси ІЇ-7К секвестовані в аномальних ММД, як у випадку МР С04 Т- клітин.
Потім використовували імпульсну 5ТЕО мікроскопію для вивчення фосфорилювання З5ТАТЬ (фосфо-5ТАТ5) і поділу фосфо-5ТАТЬ5 у цитоплазмі і ядрі НО і МР С04 Т-клітин. Фіг. 36 показує
ЗТЕО зображення розподілу фосфо-ЗТАТ5 до й через 15 хвилин після стимуляції ІЇ/-7. Ми відзначили, що фосфо- ЗТАТ5 акумулювалися в ядрі НО СО4 Т-клітин, і цей феномен інгібувався дезорганізацією цитоскелета. Напроти, не відзначалося трансллокації фосфо-5ТАТЬ у ядро в МР С04 Т-клітинах або в попередньо стимульованих ФГА НО С04 Т-клітинах (Фіг. ЗБ).
Потім вивчали кінетику появи фосфо-5ТАТ5 у цитоплазмі і ядрі протягом однієї години (Фіг. Зс, За, Зе). Це показує, що фосфо-5ТАТ5 в МР С04 Т-клітинах накопичується головним чином у цитоплазмі, і не мігрує в ядро (Фіг. За), як у ФГА-стимульованих НО СО4 Т-клітинах (Фіг. Зе). Це особливо зрозуміло, коли результати порівнювали з тими, які були отримані через п'ять хвилин після стимуляції І/-7 НО С04 Т-клітин, де 50 96 фосфо-5ТАТ5 перебувало в ядрі (Фіг. Зс).
Приклад 6. Плазма від УР індукує аномальні ММД на поверхні очищених НО СО Т-клітин.
Потім вивчали джерело аберантної активації МР СО4 Т-клітин. Той факт, що всі СО4 Т- клітини були залучені, і що нефізіологічний сигнал, такий як ФГА, імітував результати, привів до дослідження плазми МР. Очищені НО С04 Т-клітини інкубували з 10 95 плазмою МР протягом
ЗО хвилин, і підраховували ММД на поверхні СО4 Т-клітин, як визначалося по маркуванню холерним токсином В (СІХхВ-АЕ488). На Фіг. 4 показані отримані зображення. Плазма УР окремо індукувала велике число ММД на НО С04 Т-клітинах. Додавання ІІ -7 не впливало на розмір або число цих ММД (Фіг. 4а). Ці результати показані для плазми від п'яти різних УР (Фіг. 460), і були підтверджені із застосуванням великої кількості зразків плазми від МР (215). Експерименти також повторювали із застосуванням СО4 Т-клітин від різних НО (25). Як контроль використовували зразки плазми від індивідуумів з контрольованою ВІЛ-інфекцією (НІС) і пацієнтів, що одержують антиретровірусну терапію (АКТ), на очищених НО СО4 Т-клітинах.
Зо Жоден з них не індукував ММД і не інгібував ІІ -7-індукцію ММД (Фіг. 4с).
Це додатково підтверджували шляхом тестування великої кількості розведень різних зразків плазми (Фіг. 44). МР плазма до розведення 0,1 95 викликала утворення ММД, розсіяних по клітинній поверхні. МР плазма, розведена в 50-100 раз, мала 50 95 від максимальної активності.
Жоден зі зразків плазми від НІС або АКТ пацієнтів не індукував ММД у якому-небудь розведенні.
Приклад 7. Плазма від УР інгібує І--7-індуковану транслокацію фосфо- 5ТАТ5 у ядро.
Функцію 1Ї-7К в НО СО04 Т-клітинах, оброблених МР плазмою, тестували після фосфорилювання й трансллокації в ядро З5ТАТ5. Як видне на фіг. Ба, попередня інкубація НО
Сбра4 Т-клітин з МР плазмою (10 95 концентрація) інгібувала ІІ -7-індуковане фосфорилювання й транслокацію в ядро 5ТАТЬ. На Фіг. 505 показані результати, отримані для п'яти зразків плазми
МР. Усі вони при розведенні 10 95 інгібували транслокацію фосфо-5ТАТ5 у ядро. Ці результати були підтверджені із плазмою від різних МР (» 15) і з різними джерелами НО С04 Т-клітин (»5).
Ефект плазми, отриманої від НІС ії АКТ пацієнтів, також тестували шляхом попередньої інкубації з очищеними НО С04 Т-клітинами (Фіг. 5а й 5с). Знову, тільки УР плазма була здатна інгібувати І -7-індуковану транслокацію фосфо-ЗТАТ5 у ядро. Також було визначено (Фіг. 59), що УР плазма була активна до розведення 0,1 95, і напівмаксимальна активність була отримана при 100-разовому розведенні, таким чином, корелюючи зі здатністю до індукції аномальних
ММД (Фіг. 44).
Також тестували ефект плазми, отриманої від пацієнтів, що одержують антиретровірусну терапію, але, що не відповідають (СО4-МК) на лікування (низька кількість вірусної РНК ї низька кількість СО4 Т-клітин), шляхом її попередньої інкубації з очищеними НО СО4 Т-клітинами.
Знову, тільки СЮО4-МК плазма була здатна до інгібування ІІ -7-індукованої трансллокації фосфо-
ЗТАТ»5 у ядро. Також було визначено, що СО4-МК плазма була активна до розведення 0,1 95, і напівмаксимальна активність була отримана при 100-разовому розведенні, що корелювало зі здатністю до індукції аномальних ММД, як спостерігалося з УР.
Приклад 8. Молекулярна характеристика фактора, який індукує резистентний стан.
Досліджували хімічну природу КІР. Проведені дослідження показали (Фіг. ба), що КІЕ є білком, оскільки його активність руйнувалася трипсином. Обробка пептид-М-гліканазою (ПНГазой) не виявляла впливу, що вказувало, що для КІЕ активності не було потрібно М- бо глікозилювання.
Потім визначали молекулярну масу КІЕ за допомогою гельпроникаючої хроматографії на
Сефадексі (5-100. Вимірювали індукцію ММД (Фіг. бБ) та інгібування І1І-7-індукованої трансллокації фосфо-ЗТАТ5 у ядро (Фіг. бс) для всіх фракцій, елюйованих зі колонки. Два приклади профілів елюції наведені на Фіг. 6. Обидва показують, що КІР є єдиним чинником з молекулярною масою від 10 до 15 кДа.
На Фіг. ба показані щільності вірусних пептидів або білків, визначені за допомогою методики дот-блот у кожній з 100 фракцій, зібраних зі колонки із Сефадексом 100. Вимірювання повторювали три рази з різними поліклональними антитілами зі зразків МР плазми, які характеризуються високою активністю відносно вірусних білків. Для кожного експерименту сигнали, отримані зі зразками плазми НО, віднімали із цих значень. Картина, показана на Фіг. бр, демонструє, що не виявляється вірусних білків або фрагментів у фракції, що містить КІГ активність, у той час як дот-блот аналіз показав наявність вірусних білків за більш високої молекулярної маси (від 190 до 32 кДа).
Активні, збагачені фракції 10-15 кДа зі колонки із Сефадексом 5100 використовували для одержання ізоелектричної точки КІЕ шляхом сорбції на аніоно- (Мопос)) або катіонообменних (Мопо5) колонках з подальшою елюцією у градієнті рН (підвищення рН на Мопо5 або зниження рН на Мопоо)) (Фіг. 64). ММД-індукуючу активність різних рН фракцій потім вимірювали після доведення рН до 7,4. У цілому, від 25 до 3095 від вихідної активності виділялося у двох фракціях, результати відповідали ізоелектричної точці 6,5-8,0.
Таким чином, КІЕ є секретованим білком з молекулярною масою близько 15 кДа, і ріІ близько 7,5-8,0, що містять дисульфідний місток. Слідючи вищевказаним структурним і функціональним характеристикам, була безпосередньо встановлена ідентичність КІР. Зокрема, із усіх 36853 відомих людських білків тільки 62 мають чотири вищевказані характеристики КІР.
Напівочищений матеріал, отриманий від трьох пацієнтів з віремією і трьох НО, аналізували за допомогою мас-спектрометрії із застосуванням стандартної програми Мазсої. Отримані білки розташовували відповідно до р-шкали, описаної в Матеріалах і методах. Результати, показані в таблиці 1, прямо вказують, що КІР є СІВ5РІ А2.
Таблиця 1 і 5 р шкала ооменюдо ою) мм 5 0,10 специфічна молекула 7 0,05 рецептор сигнальної послідовності,
Зо Таким чином, білок, знайдений у плазмі пацієнтів з віремією, є секретованою формою
СІВ5РІ А2. Зрілий білок містить 125 амінокислот (М.м. 14138), має рі 7,95 і 7 дисульфідних містків. Із застосуванням комерційного свинячого СІВ5РІ А2, ми змогли підтвердити іп міго, що цей білок індукує аномальні ММД, які блокують транслокацію 1-7 рОТАТ5 у ядро в плазмі пацієнтів з віремією, додатково підтверджуючи, що КІР є СІВ5РГІ А2, зокрема, її секретованою формою. Амінокислотна послідовність людського СІВ5РІ А2 наведена як 5ЕО ІЮ МО: 2.
Приклад 9. РІ А2501ІВ індукує нездатність до відповіді (анергію) СО4 Т-лімфоцитів.
Приклад 7 показує, що РІ А250бІВ, за допомогою індукції ММД, індукує блокаду 1І--7- індукованої трансллокації фосфо-5ТАТЬ5 у ядро (МТ рЗТАТ5). У результаті СО4 Т-лімфоцити не відповідають на 1-7, і незважаючи на високий рівень цього цитокіна в плазмі ВІЛ-інфікованих пацієнтів, їх число знижується, приводячи до СО4 лімфопенії, яка є ключовою характеристикою
ВІЛ-інфікованих пацієнтів.
Таким чином, ми досліджували можливість того, що РІ А250ІВ також бере участь в індукції анергії, іншої характеристики СО4 лімфоцитів від ВІЛ-інфекції.
Біоаналіз
Індукція ММД
МР плазму, яка містить РІГ А25ОІВ, спочатку інкубували (20 хвилин) у середовищі з очищеними НО С04 Т-клітинами. Клітини потім поміщали на покриті полілізином скляні слайди ще на 10 хвилин. Потім їх фіксували параформальдегідом (РЕА, 1,5 95, 15 хвилин при 37 С, потім 15 хвилин за кімнатної температури) перед фарбуванням холерним токсином В (СІХВ-
АР488); ММД підраховували за допомогою СМУ-5ТЕЮ мікроскопії (мікроскопії на основі пригнічення спонтанного випромінення з неперервною генерацією імпульсів).
Інгібування ЗТАТ фосфорилювання й трансллокації в ядро:
МР плазму, яка містить РІ А250ІВ, спочатку інкубували з очищеними НО СО04 Т-клітинами (20 хвилин) перед стимуляцією ІЇ/-7 (2 нМ, 15 хвилин). Потім клітини поміщали на покриті полілізином скляні слайди перед фіксацією РЕА (1,5 95) і пермеабілізацією метанолом (90 95, при -20 С). Потім рТАТ5 фарбували за допомогою кролячих антитіл до ЗТАТ5, мічених козячими антитілами до кролячих імуноглобулінів АйКоб42, і аналізували за допомогою ГАС5 (флуоресцентного сортування клітин) або імпульсної ЗТЕО мікроскопії.
Результати
На Фіг. 10а показано, що після впливу РІГ А2ОІВ (плазми від пацієнтів з віремією), СО4 лімфоцити від здорових донорів (НО) стають нездатними до відповіді на ІІ -2, як визначалося за інгібуванням ІІ--2-індукованої МТ рЗТАТ5. Це інгібування було повним з З 95 плазмою, і було суттєво вираженим з 1 95 плазмою (р«е0,0001).
Потім ми вивчали відповідь СО4-С025-Т-лімфоцитів на РІ А2ОІВ. Результати представлені на Фіг. 100. Як показано, у той час як 100 95 здорових клітин відповідало на 1-2 за допомогою
МТ роТАТ5, РІ А2 СІВ (1 95 плазма пацієнтів з віремією) повністю інгібувала цей механізм трансдукції сигналу. Оскільки СО4-00257 клітини представляють менше 5 95 від усіх СЮО4 Т- клітин, вони не можуть суттєво впливати на дані, представлені на Фіг. 1ба.
І/-7 ї 1-2 є членами у-с родини цитокінів. Щоб підтвердити, що нездатність до даної відповіді може бути пов'язана з у-с, ми тестували їхню відповідь на ІІ -4. Відповідь на 1-4 ми
Зо вимірювали за індукованою 1-4 трансллокацією в ядро Роїаїб (Фіг. 11). Наші результати ясно показали, що відповідь на ЇЇ -4 інгібується РІ А2 СІВ (повністю з З 95 плазмою та значною мірою з 1 95 плазмою).
Таким чином, ці результати показали, що механізми передачі сигналу, індуковані цитокінами сімейства ус, змінюються за допомогою РІГА2 СІВ. Це повністю узгоджується з нашими спостереженнями про те, що гамма-ланцюг рецептора повністю секвестований в аммМдД, що спонтанно перебувають на поверхні СО4 лімфоцитів від ВІЛ-пацієнтів (дані не показані).
Приклад 10. Активність рекомбінантних форм РІ А2 СІВ
У цьому прикладі тестували активність різних очищених форм РІГА2 СІВ білків, для додаткового підтвердження впливу цього білка в очищеній формі на імунну систему, і для додаткового підтвердження його специфічності.
Ферментативний аналіз
Аналіз проводили на наборі для аналізу Еп7 Спеск РІ А2 від І їе Тесппоїодіез (геї: Е102147).
Цей аналіз забезпечує неперервний швидкий моніторинг активності ферментів РІ А2 у режимі реального часу. РІГА2 активність визначали за підвищенням інтенсивності при одній довжині хвилі 515 нм. РІГ А2 виявляли за змінами співвідношення інтенсивності випромінювання при 515/517 нм при збудженні при 460 нм. Питому активність виражали у вигляді кількості флуоресцентного субстрату (Од.) за секунду й на мкг ферменту в розчині.
Результати
Результати наведено в таблиці 2 нижче.
Таблиця 2
Активність рекомбінантних РІ А2 СІВ білків.
Вихідна Підсумкова 2, Питома . ; | Кількість . (мг/мл) (мкг/мл) (Од./мкг/с)
Очищений зі свинячої теле в | ов | осв | тона
Рекомбінантний свинячий (в Е.соїї) (в Е.соїї) в Е.соїЇ) (в Е.соїї)
Результати показали, що рекомбінантний людський РІ А2 СІВ, отриманий в Е. сої, має потужну ферментативну активність. Далі, результати також показали, що рекомбінантний свинячий РІГА2ОІВ, отриманий в ЕЕ. сої, має питому активність, подібну до активності рекомбінантного людського РІ А2ОІВ. Напроти, рекомбінантні РГА2ОПА і РІГА2ОПО не є активними, а РГА2ОХ має дуже обмежену активність.
Таким чином, рекомбінантний РІ А2 СІВ є потужним активним агентом для застосування в даному винаході.
Приклад 11. Вплив РІ А2 СІВ на СО4 лімфоцити включає його ферментативну активність.
У цьому прикладі ми досліджували, чи дійсно вплив РІ А2 СІВ на СО4 лімфоцити включає (наприклад, є наслідком) ферментативну (наприклад, каталітичну) активність РІ А2 СІВ. Така ферментативна активність може модифікувати мембранну структуру, приводячи до утворення множинних аММД на поверхні СО4 лімфоцитів.
У цих експериментах ми тестували мутант РІ А2 СІВ, де критичний гистидін у положенні 48 був заміщений глутаміном (мутант Н4і80). Із застосуванням ферментативного аналізу, описаного в прикладі 10, ми порівняли ферментативну активність рекомбінантного свинячого
РГА2 СІВ, отриманого в Е. сої, з активністю мутантної Н4і80), також отриманої в Е. соїї. Кожний білок використовували в кількості 200 мкМ. Як показано на Фіг. 12, мутант повністю втратив ферментативну активність, що вказує на критичну роль гистидіну в положенні 48 в РІ А2 СІВ.
Потім ми порівнювали активність не-мутантного свинячого РІ А2 СІВ з активністю мутанта Н4іВО у біоаналізі. Результати, представлені на Фіг. 13, демонструють, що мутант втратив здатність не-мутантного РІ А2 СІВ до індукції аммМдД, або до зниження або скасування ІІ-7-індукованої транслокації реТАТ»5 у ядро (МТ реТАТ5).
Ці результати, таким чином, демонструють, що ферментативна активність залучена в патогенетичні ефекти РІ 2 СІВ у відношенні СО4 лімфоцитів.
Приклад 12. Антитіла до РІ 2 СІВ відновлюють активність СО4 Т-клітин у плазмі пацієнтів з
ВІЛ віремією.
Цей приклад показує, що в плазмі пацієнтів з віремією СІВ5РІА2 трансформує С04
Зо лімфоцити від НО в "хворі" лімфоцити, порівнянні з тими, які характерні для крові ВІЛ- інфікованих пацієнтів. Крім того, цей приклад показує, що антитіла до СІВ5РІ А2 ефективно пригнічують патогенну активність.
У першій серії експериментів плазму обробляли сефарозними гранулами, покритими або козячими антитілами, спрямованими проти людської СІВ5РІА2, або двома контрольними козячими антитілами, спрямованими проти не відповідних антигенів. На Фіг. 14а ясно видно, що антитіла до СІВ5РІГА2 повністю скасовують або видаляють активність плазми, яка стає нездатною до індукції аномальних ММД в С04 лімфоцитах від НО. Контрольні антитіла | і ІІ не проявляють впливу. Ці експерименти повторювали три рази для кожної плазми, і вивчали три різні зразки плазми від пацієнтів з віремією.
Фіг. 146 демонструє ідентичні результати. Тут плазму обробляли, як зазначено вище, але аналізували із застосуванням другого біоаналіза. Плазма, оброблена сефарозними гранулами,
Зо покритими анти-СІВ5РІА2 антитілами, більше не інгібувала ІІ-7-індуковану транслокацію роТАТ5 у ядро. Контрольні козячі антитіла І і ІЇ не впливали на здатність плазми від хворих з віремією до інгібування ІІ--7-індукованої трансллокації рРЗ2ТАТ»5 у ядро.
У другій серії експериментів ми тестували ефекти нейтралізуючих кролячих антитіл, спеціально спрямованих проти людських СІВ5РІА2, -ЗПА і -СІІО. Ці антитіла інкубували із плазмою й клітинами під час біоаналізів. Отримані результати показали, що анти-СІВ5РІ А2 антитіла нейтралізують ефекти віремічної плазми, як визначено за індукцією аномальних ММД і за інгібуванням 1І-7-індукованої трансллокації Р2ТАТ5 у ядро. Слід зазначити, що антитіла, спрямовані проти секретованої РІ А2-ОІІА або секретованої РІ А2-ОІІЮ, двох фосфоліпаз, тісно пов'язаних з СІВ5РГІ А2, не проявляли впливу в цьому аналізі.
Ці результати демонструють, що анти-СІВ5РІ А? антитіла можуть обертати й запобігати імуносупресивний ефект віремічної плазми. Ці результати демонструють, що анти-сІВ5РІ Аг антитіла можуть запобігати імунодефіциту, і повторно стимулювати імунну відповідь у імунодефицитних суб'єктів.
Крім того, ці результати демонструють, що відповідь є специфічною. СІВ5РІА2 є єдиним еффектором, залученим у досліджуваний патогенний ефект, який характеризує плазму пацієнтів з віремією.
Приклад 13. Анти-РІ А2ОІВ антитіла інгібують вплив РІ А2 СІВ на С04 клітини.
Клоновану й очищену людську РГА2О1В використовували для імунізації кроликів. Готовили імуноглобулінові фракції з відповідних сироваток. Їхню здатність до інгібування ферментативної активності РГА2О1В вимірювали на радіоактивно мічених мембранах БЕ. соїї. Активні імуноглобулінові фракції додавали в біоаналіз, що включає СО4 лімфоцити, очищені із крові здорових донорів. Потім клоновані й очищені секретовані РІ А2 (СІВ, СПА, СПО ії СХ) додавали в культури. Як контроль використовували імуноглобулінові фракції, приготовлені від кроликів, імунізованих різними секретованими РІ Аг.
Фіг. 15 показує, що різні концентрації поліклонального антитіла інгібують індукцію 98ММД (Фіг. 15а) і блокують І--7-індуковану МТ реоТАТЬ5 (Фіг. 155). Ця активність може бути отримана з 1 мкг/мл до 100 мкг/мл Ід, що містить анти-РГА2 СІВ антитіла. Ця активність є повністю специфічною, оскільки антитіла, спрямовані проти РГА2 СА, РГА2ОНПО або РІ А2ОХ, не
Зо показали ефекту в біоаналізі (Фіг. 15а й 155).
Таким чином, ці результати додатково демонструють, що інгібування РГА2ОІВ можна використовувати для лікування імунодефіцитів і для відновлення СОА4 активності.
Приклад 14. Розчинний рецептор РІ А2ОСІВ інгібує ефекти РІ А2 СІВ щодо СО4 Т-клітин.
Для додаткової демонстрації того, що інгібітори РІ А2ОІВ можуть проявляти терапевтичний ефект, ми тестували розчинну форму рецептора РІ А2ОІВ.
У перших серіях експерименту ми використовували розчинний мишачий рецептор, специфічний до РГА2 СІВ, який має наступну амінокислотну послідовність (ЗЕО ІЮО МО: 22):
мис Мо о ме БчІНССІАСПІТНІСОБеЗТ ЕКО ТКТСІ аск
ЗУГТОЕМСКОРКЕНМІЖкКи М Зоо рЕМУССВОССІ МІ АсЕСВЬКОЖЕСОВТІ15
ІКИНСоВЕмЕ Бог ТЕМОУК зоштУутАВКОТНВиИТАУТВЕХСВН ЕВ КОМАН пмесУКРЕСОКЕСНАЯННОСІВЕНООКЕНІТИСАтТТВКУвЕОБЕМОКСРОВТОМКУвСпАТЯОВ хавеЕтСсокМі БОМ сАнаВсСІМОосоАІТОтАрЕОБЕВтІВКНІЕКУУКВУМІ ІМ воБКАСМОояВОоТРеаІМиВОКІТРОРЕЧИННСОТ ЧУВ ААДЕБАЛСЕБТГРХУІчСКеО
МУТАОСІГЕКОБЕКУНАТНОСЛЕОМКТРЕМЕКСяІКОККЕСНКЕЗОСАСЯВСИВМО ЗУ ТМОМАВІ, вЕуУвКрМаІТВрЕМАЗЕТИТСТОВМКІРУВКЕИВООСВВМІ ТММ СУ В вЕБппсвекКУКрСсКоЕВгУскКАСПОУРАПЕСЕССРАСМЕМЕСОВЕСУКІпТУ ВВА шхусБРАСОТІТБАЕвОовЕІТВЬІЗЕМАЕКОБУЕМТАБОрОМЕТОБУТИКТУСОАБЕУСУТ тикЕвОво5нвссосСУУУВОосВОЗООовАвиКОосВоЕКАМсКТрУКівКА ТЕО КЕКИВЕв СУ
МОчЕБАТОІАБСЕКУЄНОЕКУТМКВЗМВЕАЕАГСЕСЕСАНрАБЕАНІ ЕСЕ
МЯТОЕВОЕМІСЕМЯЕМРІМАСОМАМЕООВРУУВВЕТ КАТЕ МСАУХКАККТІЛЕВЕМ сАБКНЕМІСКІРЕПИМЕРККРОНИОХ АРМ ЕТОМАКУИТНВАЕМАТКККУСОМі МАО,
ТтІхБАОБОЕКІНВКІКСЬТКУсУКЮТИОВЕЕССАКООТОокМОМоВеЕУ ТОМИ У о сЕкКисУктакІТОгвиСсТтЕМСВУВвевиІСсКВУКІУТЕКЕКРеЕТОвОТОВКОВ МУК,
УГТтЕКоЕВЕКТИТОАОВЕсУАКОоТВІКаКОЕОАКІ ТММ КОТ ТКУ СО МКМНЕК
МУМОКРІЧУЗМИЗРЗОТІКІРЗУМТТЕЕОКБІРІСАІМО5МРУЕНЕТОККУ КОС ОКЕВУ о
ЕЧМСЕКМООТЬЕННУМУВОСТЗАТРЕТЕУОМЕТУКІІВОММТМУААСКВСЕМНКАЕТАБІРО
АРКОАЕГСТУБЕБКООЯТНКІСПЕТТОМСОоТЕОМВ ответ АКООСАКАВТМ аземнатАСЕВЕГОСАІСвУУТЕТКАвЕНРОТСВЕТОУВИІКЕКОМСтВтЕТУГОоОВЕЕИА
НЕКСКБЕСВМІІАІСОААЕМОКООЕКОВЕсВВУОМУМ МАО ЕТО
МСА КРОМОНОКРНРСУМІ КІРЕСІМНЕТРСЕВАКОКІСКМЕБАСІРАУТАОРЕХСІ ВНІ
УРМУТУТІТІІТІчІАТСІЕМІСЕМТУКОКЗО1ЕОВІТОоЗКОБУУРТЕМЕВРТАНІСЕМІБІВНВ
ЕМТИСБЕУВрАВАТЕЯКАОНКОСКРІСТА ВЕ
Інгібітор тестували в біоаналізі описаному в прикладі 9, при концентрації 100 нм.
Результати представлені на Фіг. 16. Вони демонструють, що рекомбінантний розчинний рецептор РГА2 можна використовувати як потужний антагоніст, і що така молекула також здатна суттєво блокувати негативний ефект РІ А250ІВ у відношенні МТ роТАТ5 (Фіг. 16).
Подібні результати можна одержати в додаткових серіях експериментів із застосуванням
РІ А 2-СІВ-зв'язувальних поліпептидів, що включають послідовність зЗЕО ІЮ МО: 25 або 28.
Приклад 15. Надлишкова експресія СІВ5РГ А2 індукує імунодефіцит.
Раніше було показано, що високоактивна антиретровірусна терапія (ВААРТ), що знижує вірусне навантаження, також індукує підвищення числа СО4 у більшості пацієнтів. Однак у деяк пацієнт, незважаючи на т факт, що ВІЛ става, що невиявляемим, число СО4 не Ми раніше вивчали цю клінічну ситуацію, і показали, що в цих пацієнтів, позначуваних як пацієнти без відповіді СО4 (СО4-МЕ), відзначаються сильні й стійкі дефекти популяції СО4 Т-лімфоцитів.
Фіг. 17 показує, що плазма СО4-МК пацієнтів містить більше активності РГА2 ОІВ, ніж плазма пацієнтів з віремією, узята як контролю. Це спочатку визначали по індукції аномальних
ММД на клітинах. Ці дані також були підтверджені шляхом вимірювання здатності до інгібування
І -7-індукованої трансллокації Раеїаї5 у ядро.
Узяті разом, ці результати демонструють, що плазма СО4-МК пацієнтів містить у сотні раз більше активності РІ А2 СІВ, ніж плазма від пацієнтів з віремією.
Обговорення
Наші результати демонструють, що РІ А2 СІВ індукує імуносупресію, подібну до тієї, яка характеризує СО4 Т-клітини від пацієнтів з віремією, включаючи нездатність до відповіді на 1-2 (анергію) ії 1-7 (центральний механізм, що приводить до СО4 лімфопенії). Таким чином, експресія СІВ5РІГА?2 при ВІЛ-інфекції відіграє центральну роль у патофізіології імунного захворювання, яке характеризує цих пацієнтів. Ці дефекти специфічні для типу клітин, оскільки
СО8 Т-лімфоцити від ВІЛ-пацієнтів не проявляють аномальних ММД і продовжують відповідати на 1-7 (дані не показані). Цей вид дії РГА2 СІВ, імовірно, є наслідком її ферментативної активності. При уражені мембрани СО4 лімфоцита, вона модифікує плинність мембрани й імовірно, забезпечує формування аномальних і дуже великих ММД.
Запальні реакції відіграють важливу роль при ВІЛ-інфекції. Однак їх точна роль у патогенезі
ВІЛ ще не встановлена. З урахуванням наших даних можна припустити, що ВІЛ-інфекція індукує дуже своєрідний тип запалення, який включає СІВ5РІ А2. Далі, можна припустити, що після індукції РГА2 ІВ її секреція уникає нормальних регуляторних процесів, таким чином, приводячи до хронічної продукції й до імунних порушень, які є прямим наслідком дисфункції
Сбра4 Т-лімфоцитів. Як побічні наслідки дисфункції СО4 Т-лімфоцитів, можуть також спостерігатися інші дефекти. Наприклад, зниження продукування інтерферону-гама призводить до зниження функцій моноцитів/макрофагів і природніх кілерів.
Кореляція між виходом активності РІГ А2 СІВ у плазмі й характеристиками різних груп пацієнтів також є дуже інформативною. Пацієнти, що "контролюють ВІЛ" є вкрай рідкісними, вони зберігають вірусне навантаження, яке є нижчим від межі виявлення, та майже нормальне число СО4 протягом багатьох років. Наші результати показали, що вони не експресують активність РГА?2 СІВ у плазмі. Напроти, у більшості пацієнтів цей фермент експресується й представляє негативну сторону запалення, що приводить до імунного захворювання. Усе разом це ясно показує, що РІ А2 СІВ є критичним параметром у патофізіології ВІЛ-інфекції.
Зниження вірусного навантаження при ВААРТ супроводжується відновленням імунітету, включаючи підвищення числа СО4. Під час цього лікування активність РГА2 СІВ у плазмі
Зо пацієнтів зникає. Таким чином, вважається, що ВААРТ знижує запальні реакції, що додатково дозволяє припустити, що РГА2 СІВ є частиною цих запальних процесів. Більш важливо, ми описали випадок СЮО4-МЕ пацієнтів, у яких залишається дуже низька кількість СО4, у той час як
ВААРТ контролює їх вірусне навантаження. Надлишкова продукція РІ А2 СІВ, виявлена в цих індивідуумів, може пояснювати стійкість імунного порушення, яке характеризує їхній клінічний статус. Таким чином, після ВААРТ відзначається виражена кореляція між зниженням продукції
РІГ А2 СІВ, що приводить до відновлення імунітету, або стійкою надлишковою продукцією, що приводить до необоротності імунного захворювання.
Терапевтичне значення й корисність цього відкриття є величезними. Інгібування РІ А2 СІВ дійсно можна застосовувати для запобігання або лікування імунного захворювання ВІЛ- інфікованих хворих, а також, у більш широкому сенсі, індивідуумів, які страждають на імунодефіцит. При ранньому застосуванні при інфекції інгібітори РГА2 СІВ приводять до досягнення контрольованого статусу ВІЛ у пацієнтів. При більш пізньому застосуванні, окремо або в комбінації/чергуванні з ВААРТ, вони прискорюють відновлення функцій СО4 Т-лімфоцитів, і шляхом посилення захисту хазяїна, інгібітори РІ А2 СІВ приводять до рівноваги між вірусом і імунною системою, як при багатьох інших хронічних вірусних інфекціях. Таким чином, інгібітори
РІГА2 СІВ представляють дуже потужні агенти для застосування, окремо або в комбінації, для лікування порушень, пов'язаних з аномальною імунною відповіддю або активністю. Вони можуть також сприяти економії ВААРТ і можуть також дозволяти переривати цю терапію, яка, як відомо, пов'язана з важкими побічними ефектами.
Далі, оскільки відсутність експресії СІВ5РІА2 (як у мишей з відповідним нокаутним геном) добре переноситься, тимчасова або постійна супресія СІВ5РІ А2 із застосуванням інгібіторів або за допомогою вакцинації є потужною й надійною імунотерапією імунних захворювань, зокрема, хворих на ВІЛ.
Список цитованої літератури (1) Сго55тап 7, Меївег/-5спеПегзпеїт М, боиза АЕ, Місіогіпо ВММ, Раці МЕ (2002) С04-Т-сеї! дерієїйоп іп НІМ іптесіїоп: аге ме сіозег їо ипдегеїапаїпд Пе саизе? Маї Меса 8(4):319-323 (2) Саїанато М, еї аї. (2008) НІМ іп'есійоп-аззосіаїед іттипе асіїмайоп оссиг5 Бу їмо аівііпсі рашучауз ІНаї айтегепіану анесі СО4 апа СО8 Т сеїї5. РМА5 105(50):19851-19856. (3) Аптайп КА, еї аїЇ. (2012) НІМ віашев, ригдеп ої сотогрій аізєазе апа Біота!/Кег5 ої 60 іпїаттаїййоп, анетей соадиіайоп, апа топосуїе асіїмайоп. Сіїп Іптес бів 55(1)126-36.
(4) Оамійд 0, єї а. (1998) Неашаїогу дувіипсейоп ої Ше ІпіепеийкКіп-2 гтесеріог дигіпу Нім-іптесіп апа їНе ітрасі ої іріє сотбіпайоп Іегару. РМАБ5 95:11348-11353. (5) СоїІе УН, єї аї. (2006) Ведшиіаюгу аузішпсійп ої Ше іпіепециКіп-7 гесеріог іп СоПепа СО8
Іутрпосуїев5 їот НІМ-іптесієй райепів-еПесів Годі апіікеїгомікаї Іпегару. УНАсдцніттипеОеїїсзупаг42(3):277-285. (б) КгужогиспкКот, Раздцієї М, Теле У (2003). Ниптаїйттиподейсієпсуміги5-
ТепмеІореаіусоргоївіпзапдапіі-Садапііроаіезіппівйіпіепеийкій- гіпдиседіаск/5іаївідпаійїпдіппитапса4Тутрпосуїєв. Сіїпісаї апа Ехрегітепіа! Іттипоіоду 131(3):422-427. (7) І апаїгев І, еї аї. (2011) НІМ іп'єсійоп репитз 1-7 відпаїпуд аї Ше 5іер ої 5ТАТ5 писієаг геіосаїїгайоп. АІЮО5 25(15):1443-1453. (8) Мгапікоміс А, Стаулеу АМ, Раїеу А, Апдеї ОВ (2011) 1-7 дДерепаєпі ЗТАТ-5 асіїмайоп апа
СО8-т сеї! ргоїїГегайоп аге ітраїгеа іп НІМ іпТесіоп. у І ейКос Віо! 89(4):499-506. (9) Вепоїї А, єї аї. (2009) Іпмегзе аззосіайоп ої гергеззог агоулий Гасіог іпдерепаєпі-1 мйп СО8
Т сеї! іптепецкіп (1()-7 кесеріог ГаіІрна| ехргезвзіоп апа ІПтйеа відпа! іапздисегв апа асіїмайог5 ої іапвсетіріоп 5ідпаїйпуд іп гезропзе 0 І/-7 атопд Ідатта|-спаіп суїюКіпез5 іп НІМ раїйєпів. АІЮ5 23(11):1341-7. (10) Розе Т, еї аї. (2010) ІпепеиКіпе-7 сотрапітепійі2ев5 їв гесеріог 5ідпаїпу сотріех ї0 іпйаге С04 Т Іутрпосуїе гезропзе. У Віої Снет 285(20):14898-14908. (11) Шпомоой 0, бітоп5 К (2010) Гірій гай аз а тетрбгапе-огдапігіпу рііпсіріє. Зсіепсе
З27(5961):46-50. (12) Татаїтії В, еї а. (2013) Метбгапе тістодотаїйнз апа суїо5зКеІеюп огдапізайоп 5Ппаре апа геашаїе Ше ІІ -7-гесеріог зідпаїозоте іп питап С04 Т-сеїІ5. У Віої Снет. (13) Вед 5, вї аї. (2004) НІМ іптесііоп: рге-підніу асіїме апіігеїгоміга! Іегару 1-7 ріазта ІємеїЇв5 сотеїае м/йй опа їет СО сеї! сошпі іпстеазе айег ігеаїтепі. АІЮ5 18(3):563-5. (14) Возе Т, І атройце О, Раїег С, ОєНгаївзу УЕ, СоїІе УН (2009) Ідепійісайоп апа Біоснетісаї спагасієгігайоп ої питап ріахта 5оЇШшріє І/-7А: Іюмег сопсепігайопв іп НІМ-1 іпТесієйд раїепів. /
Іттипої! 182(12):7389-97. (15) Зайсе 0, ЕІріт С, Аррау М (2013) Мопіюгіпд сеїЇШіаг іттипе таке": іп НІМ іптесіоп: тот асіїмайоп юю ехпаийвійоп. Си Оріп НІМ АІО5 8:125-1391. (16) Мошпез 5А, евї аї. (2003) НІМ-1 мігетіа ргемепів їйе езіавріїзптенпі ої іпіепецйКіп-2 ргодисіпа
Нім-зресіїїс тетогу СО4А-Т сеї епадомей м/йй ргоїїТегаїїме сарасіїу. У Ехр Меа 198:1909-1922. (17) 5ії5КуЇ О, Тпее У, Китаг А, КгужогиспКо М (2008) Оівгиріїоп ої Ше датта с суюкКіпе пеїмогк іп Т сеї дигіпу НІМ іп'єсійоп. СуюкКіпе 43(1):1-14. (18) Райккшй 5, Раптідіапі А, Рапйжша 5 (2012) Тне гоЇє ої іпіепПейКіп-21 іп НІМ іптесійоп.
СуїюкКіпе 23(4-5):173-80. (19) Міпоеті В, евї а!. (2012) НІМ СопігоПегз таїпіаїп а роршіайоп ої піднпіу ейісіепі ТНІ1 енесоог іп сопігаві іо раїепів Ігєаїеа іп Пе опо їегт. Міо! 86(19):10661-10674. (20) БЗапаієї МО, Юоцек ОС (2012) Місторіа! ігапвіосайоп іп НІМ іп'єсіоп: саийзев, сопзедпепсез апа ігеаїтепі орропипіевз. Маї Нем Містобіо! 10(9):655-66.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«ІМК ЖНОСтТІТЮ ПАСТЕВ «120» ТЕРАПЕВТИЧНІ СПОСОБИ Й КОМПОЗИЦІЇ «М» вія «М: 1 «і» Патентована версія 3.3 «сеаОбв «віз 4У «23йз ДНЕ «їз щтучна «КИ» «ТЯ» о ЕДНК, яка кодує МОІВВРІ АХ «НЕ збсззвастсс стат оастазс сосасСтосЕс всзаїеєса сезеєсоасва сосках що сстсевнєса тост ссосзазате зІсазазотескя тбатсссЗоб паасшасссє хо чистсоозає асаасвасєта соостцстас тосоустсо спочстсвоо свсссссото 1 затсозастод зсаавтссто ссаззасасаї засавстасе зсозссадос сазоааоста о застспозсва ссасскогао сзосазалас завозоїтЧко зоазчессжжсат стусзастос ЗБ зассесвасоа стоссаїста стіцїсзава зсіссатаєа асзазоасвся сввозассто Як звсастсазов зосаєтоссв зво ЗА
Сак ШИШКУ «ас» ВТ (протеаза зворотної троанскриптази) «Аїд» ЩштТечна «ах «екїв Ноїв «ММ»
Мет був сем вед Уві бер аа Уа! вен оіев Тег о Уаї йата аа аа аз
Її 5 1 15
Зег бі їі Зег РКО Ага дія Ууді їго бій РБе дго був меж Її Бу го й З
Суз узі Її вго бів Зекояхрорго РВЕ цеб 01 ту ха аз ТУБ 01 їЗ 4 Я су Тук Суз біт бен Бі бБіу бвг обі Тк овго УЗ АБО Бін фен АВЕ 5 БО ув Су Су бій тТвгомі5 дов дай Су ТУуг дробів аі18 уз т ве 55 в 75 ща ав Бак осв ву Ре івц о івц во аха Ре о Тук тве Мі ТакотТук ща 85 Зо З5
Туг зак сух баг біу Заг аа 16 Тк Суб бег бек ії уз дай рух ІВ що 105 10
Суб біб Аів вне жі сСуз Али о Суз вхо АБО ази аіВ Аа тів Сух вва 315 1 125
Заг іу аїа вго тує дя мух від Ні бух АБ беш ар о ТВе Гуз Су 130 135 М тУг Сух біп Баг 145 «80 3 «835 ІЗ кої» ДНЕ хі» ВЕгУчНА «Ей» «Ейй» Їнгійуюча молекула неклеїнової кислати «Я: ахдазаєтсс ссасосєва 15 «10: 4 «Мі» 4 «їз ДНК хвії» Штучна «ех «паї» хнгійуюча яолакула нуклеїнової кислоти «МА» Я згафсоовсак сес ча «Ме 5 «Ії» 19 «еїс» дик «Вї3» Шбжучна «ее «ййї» їнгібуУуюча молекула нуклеївово! кислоти «В» 5 скссозсаваз хозїсаа 17 «а» В «Ві» 16 «ій» ДНК «а» щтУЧчНА «ай» «иаі» їнгібуюча молекула нуклеїнової кислети «М» Б сени сасесе 15 «ах «її» 2 «айс ДНК «кан є «вах каві» їнгібуюча Мопехула неклеїновноОї кислате «З таспостасї засто ех
Зб
«Ох В «із 23 «175 ДНК «853 штучна «ТО «рЕЗ» Їнгібуюча молекула нуУуклеїнової кислете «00» 5 засасвтовс вастостаєо асе З «Ні» З кеїїз ве «кеїй» ДНК «иї3» шШтТУНнИА «акОх «ВИЗ» жІнгібуюча молекуЯ нуклеїнової кислети «ВЗ всссасвкст аКЕСВКАсСс Є Як кої 1 «її» 16 «ії ДНК «215» штучна «БМ» «22їз Їнгібуючав молекула нуклеїнової нислети «400» о вхсасстота освося М «й» І «вія З «їв ДЕК «Її» штучна «ей «ийїв їнгібйУуючад молекула нуклеїнової кислоти «а» ТЕ зпстссатах авсаводса 15 «а» 15 «їх «иїсх ДНК «гі3» штучна «230» «223» ІнгібуУуюча молекула нуклеїнової кисяшти с 13 садова нї коісвови її «810х 1 «ії» б «ейши ЕТ «В» штучна ка «823» їмуноганнмй пептид «Кіз 13 аБи Ази ТУР ТУ Су Тут 1 5 «1 14 кеї» В «із РТ «аа3» штучна «вах «й23» їмуногенний пептид «а» Я
Сув ту сСух Фіу ей оту ї 5 «ех 5 «еїїх 15 «й1йх ВАТ «13» тучна «ему» «Таї» їмуногенняй пептид «Низ 15
Ту" авт аша Тжг біу Ст5 Тук оСух Бі Сер сію бу Бек оіу і 5 М «ій» 15 «Вії» о «ій» РТ «ії» штучна «ис «теї» Їмуногенний вептид «М 16
РМе цем обім туго АЗп АХА туго бі сухо туго суб біх Бе 1 бу Бек ї ? 30 15 бі ТР овго Уа й «ій «вії» 5
С НИ
«81їз ШтучМа «ве» «Ві» ЇмУмногенний пептид «НІ: 17 біп твг о нів АБО дя і 5 «тій 18
«Мі» 7 «ії» РЕ «313» штучна хе» «вейї» ІмуногЕНнНний пептид «В» 15
Суя зіп Тигоніх азр ах" Су 1 5 «ій» 19 «її» З «ВАй2 ВЕТ «йїї» штУЧНВ «ав» «Кей» ївМуУуНнОгОННМЯ пептид «ке 1 сія сСу5 пін АТ вве їїв Се ах Сує 1 х «ій» 8 «М» в «кві ВНТ «іх штуУЧчНЕ «Ей» «ей» їЇмуногенний пептид «НН» о ав ака Ах Ах АЇа тів ії З «8105 1 «11» о «17» АТ «15» Втучна «ФО» «МИЇ» їмучногенний пептид «Низ 83 а5ро Ага ав АВ АТЯ Ті бух РЕ Заг рух діа вго ТУБ дав тує дів ї 5 10 15
МІ уз АБА кави зо «М 2 кві» 1447 «Ії» штучна кед х «їз Бозчинний пецептор єНнюЮх 8 мес чаї зЗіп Тгтробев Аза мех цеу Біп бео ев їгробей біп Біб бен
Я 5 о 15
Мен іви івц біу її нія бів біу 3їв аа зів Азрогем так онія т18 ме Ко за бів бін вго Баг сви бін тгр о аКго аАБробу5 бі Їіє Бе 316 З1І6 бів ї5 «о 45
Зекобіцч Бак обац СУ ТМигоСуУу5 ЇЇ біп дів бім БУ Баг Уві кеу тТве 30 Ко що ін сін Аз о Єж5 ГУ Фів Бго аа бів ні Мек ев Терору Тероуді 55 та Те 5
Зеб 50 Аа Ні цей РЕ л5п Уві бі бік 5ег бі сСу5 йви б) ву що З5 «ха ів Бас аів Мев сій біп вкО се беж о веу ТУуг біб Су5 а бек цю ць К
ТВг о вец їі его оїеь аго Тгроніз Ст Аз оаго МУ мех бів бі бі пев 150 125
Вго бен бій тТУК бу УВІ бій Ууаі фу баг ар овяМТ тн Уві Уді дів їз 135 ї4о зго гу іп їїе нії ага тТго їі АВ ТУР ТК жав зак бі біт 5 їЇів Су БІ Ні го Зак ага дв ви Ту ТИг оба бу біУ 5 АТа 155 7 175
Міз Зі Ме Бго Сух ді вве вго вБе бій вне уз бі Мі ТтТкронів
МО ї55 о ніх Аза Су їів ака зів біУ Біп о гуУу5 515 Мі сво сем отгв Су ід ох 200 205
ТнНЕ ТнкгобБак Ак о тТУг Біб біз ар Бін бея ТгробіУу Рв осСУу5 ге ах 210 215 еВ
Бго ТвгоЗеє мет бує Уа Ре сту АФ АТа те о ткробів ака вай бі, ще 250 КК о
Бак баг дк бів бух тук бій Бе Ай 1і8у рей ошак бек їви бек Те
Я о 55
АвпоБім" Аа нія бак хек Су5 без меж бі бі бі» Аа ве беи щег 250 «55 вт їв ата ар обім ар осів Зіц йо вна дів ака ру міх вец бек уз ча! Уа сж5 бін Уві тго ї1е біж зец дяб бій ен Аз о Зів же аа
Зі ттвр ої Тгробек аз обі тВговБРО еу Зак о Тук ен дхй ТгроЗет 305 330 315 зга бів б'ю її Твковко біу Рго Бе хв) бі нів ніз Су о1у твговеу 525 їз 35 бів Уа? чаї 5ег Аз Аїя Тгроаго хаг ако АЗв оСу5 бій Бек оте ву 340 345 50
Бгто Тук їі Суз бух го АЮ о веи АВМ оНія Так олії іп бі Сів Ге 55 ЗО 3655 бів ух йо бер тет їжа Тує Ні Аїв ТвВе Мія Се Аза бро Аз Тео 370 175 БІВ
Те о вгОо вве АЗп АгУ фу Су ТуБ рух зви і рух Ар АБО буз баг 385 Б 35 ща тТгв сви Бі дів сей МНі5 5ег Су ців бек аки й: Баг Уві іец мех
А 15 ар УВІ АЇш бак іов дід йіш Уаі сін ББе о іво Уві Бек сво ївц Ако 420 вах ЗО ав бій ази іа бак бів тик тео їТе біу зіву бак 5Зег дша ГУ ІТ 535 450 чу го жаі хек ве біз тгоробек Зак обіу бЗег Зак Уа? 118 РВЕ ТВК АХп 45о 455 БО їго о тУуговго рез 5іц во акЯ Зі Без ко вай ага агЯ бій бан Су» ча 43 Б що
Уа! Заг аїн сі бЗію вк Ах о БіУ Агро трі же Уа! рух Ер Су іх ча Бе ч9 бін ага без Рба Те" Хі СУ5 мух су Аїв зЗіу Ззіп жа! ргоО аа Азо що 505 М
Фів іп Бег Зі Сук вго із біу Тгробічц ага нія біу го рве Сех 5 52о 25
ТУг су Хі аю тйР оУаї вс о АКко Баг РВЕ 616 бів йаїва Бек Зак обі о БІ 54В
ТУР Тув сСув бек Рго Аіа їви о реу Твг оЗів Твк бек ага вне бів Бій 545 55 555 ЗБ аїа вне їі тТБгоЗ-а" ев її Хек оБеєб уві аїа ЗіЧ уз АЗрожат тут 65 БУ З75 вне Тк ї18 із сво бів азо бій ап Аза те Бі За о тТуК ТйгоТко
ЗИ 545 У бук тигоді віУу бій АгО біо РГО Уа Бій Туг ТВе тує тгроави тТве з щЮ 5 дка біп вБго 5ае Аз оАгО бі б1у Сув Уві Уаї Уві Аг сту бБ1у Зак
Іо Бо ож «в"обеь ші ага тв обі УЗІ БУ5 Ар сСуУх бак Аяв вне іж5 Аза Ммеє
БВ БІО 535 шо заг офем Се із ТвгоБго Уві бух їі5 їгр Бі Куб ТК Обі ев бе за 5 Бо БУ зій аг тквоРго ББе мі ко Суб ТУ меє дю тка обі бег аід тег
Б Ко вто сі ем діа Заг Су вне іт мві вне нія бат бін фмБ5 заї фе меж
БУ БНО вх
Муз аги Бег тТго аго Зі Аїд бів аів Ве Сух бі Бін вне бі АТ
БО пов 7 м
Мі кеш вата бег РНе діз віх Зі бів сін Бім де не Ууді да БіШ
ТО то ме ТО іви ви Ні баг бух Бе Аа тТРО ТНг обБіп Зів ага бБіп ввае тгвоТіє
Те КІ 735
Бі не а5п о аго аго дей Рга бер одяй аїа Зіу Заг Ткроаїа тТеКрозає 540 тах 5 ар віх Бек рго Уві Уаї Заг бек РМе їв абр дян аїв ТУуг ВВЕ бів 755 га 85 сїв а5о Аа ге ах Су АЇа ув) туго оцту ав ай бух ТВгосву свв га 75 ТО вго Заг оазп сСуз аіав Заг овуз Ні Фіш То тів Св АгРОо їТе РгОо Аго та Кен 795 ОО зр омаї дк го жо Бе вго Азротго ту Вій о тТуг вар діа вго ге ізи вне тук бій азп вія бів ТУБ ву Ве нія тТвг о нії вго вія ої щ5О ей 30 що к45 тат її тує 5вг о атїа бів бів біп бій вБе 316 Ні бег вуз Ті бух вх БО
Біж їм тВг ому Тук обі таї бує тгр оте її біу без бів біб бі» ща ТО т ВО сік вата ага азни дій їів біп тгрозвкК аз біу бек овРО уд! жі вве вх 890 БВ сіп ап тгр о азоа вБу Зі Ага бів біз акго Уві аБо о зег ціп Ага ух
КО 5 ЗІ вто Суб ма! вве її Заг Заг їїе твкобїУу во о ткробіу ТР обу хв
ЗЕ Зх
Сух заг уаі РКО сви вкго Зег їі Суб бух ага ув! ру сіє Терожа!
З1 335 30 тТіе бій був йіш ву рео вБго ТНгодів го бі тве Сех Ве бух Фіу
Зах 955 У с їТгвізи ТУг вив дзп туго їж5 Суб Ве вац мі ТК ОїЇ1іе вго ух ау 55 ЗуО 55 зго вата Зі ви і5 Тйг отТтТо о Твг обі вів Бі Зі Ре о сСж5 Уві Аза ко за5 м ів ві зіу ТВгоіебв Уві! яве ха їж5 бак обі ву 516 обіп Аа не тів тк ме дп бац вБве о сіу дій тт о тТвРодяв Уа! тРО ТТ Фі
Мо 015 їй іво сіп о бег твг Аза нія бів р у5 Твору Аза бі У» врО ре 1055 1010 1015 чаї Тут бег Ап о тгробег вго бек дв їі її вазп їЇ318 бро бе 1340 Що 150
Тег овал тної біб ве сів їз ні ЇЇ РгОо бен Суб АТа ву 155 з 19855
Мет Заг о Баг АЗИ РгОо дя" о вйе Ві Ве тТвК обі цуб ТРО о тТУг пе що 1025 05
Вер азр о Суз зіу же бів біж туго бі вве уві Суб БР зу ех їо85 МК 1095 іп Аа так осяв офіц ні5 Ні5 Уві ай уд! Зекоа5рд тТвгоЗег діа
Мк 105 Ло
Їіе бка Бак Твкобем Біц Туг бік азпоАка тТВг отТує бух ів 18 155 1-0 3155 го біу дзвоМеж тнготгротук віз діва бі бух его сСуз вго Мет
Те 1135 1140 нНіз Ага дів бі) бецс аа бег їТе еко ав АТВ РН ні біп діа 1145 1159 1155
Вп во тТвгомаї ем о фви о бег АгО ем обі Міз тео ні ТвроЇЇе 1150 М1Е5 їла
Фіу ів дек Тве ТВг дб вх Б1у біп Тве Ре дяро ТКробег Ар 1175 що 85 бі ТР ув 5ав о Бко Ве о тТве ТУук ТРооїуз йхробіц йід Бек ад тнЕ ів Бі ар оСує дія РБе АЇв Аяв оТвК дк бі Ага ТК нів 05 ї810 1515
Бек ТВ" АЇВ Сух Оу его о івн о Бів бу АТ Хв о Ста із Уві 1228 ня 123
УВК Твг б твг о фух АТа вне бів ніх го біу меш Суб его ши
Мк35 1240 1245 ти бак о Уа РгО ТР Ї18 ре РН ух пі вхй Суб Тук Жак Ре
Ти5О 1255 1250
Зае тТвг Уа! Се Азробег о агу бег Ве Зіш а5р о йїва ні зі вне 1565 1270 1275
Сує іч Зяг Зі біу бег Аза бец оїву дів ті Аг АЗВ дів дів 1х5о 1985 ї29а
Сів аяи Бек вва зем оїво бів бів гео бец Ай ББе оту бак бек 1295 ів 1305 ча! бій Меї Узі Тер оуец аби АЇва Біб сне йхро Ав о АБИ Акп гу 1315 1338
ТвКорен о Ака Тго Ра джр осі тв овга твакоФіш бів Бек Аа тр 1325 1338 1355 пі ем о Ака фух Вго Ар ОМеї Аронія сеу фе Бгб нів Вга о сСух ї34О 1345 1356 чаї Ві бе Ага жі вто бі) пі тів Тео ні Ре ТБК оБга су 1355 1560 1365 бі АЗр у Куб пік Бе ІТ Сух уз мех сій Аза біу Тів вво 1370 1375 1356 дів Уа! Тйгоаїа Біп во Біб офуз зіу йец Бег Мія бек оїїв Уві 1385 іо їі355
Бгто жа! ТвК Уа? тТвгоцен тв» їен сіє ІЗ Аїд гео бі Її вне
Вк 1505 1 мет ви Су РВЕ Тео тів Тео буз зів Суб 5еб дев біє РБе ія 1515 1520 1425 мчріен тТвкоЄТу бак ага бік бек Тек Тук о Вго Твго ін деп вне 1430 1415 1450
Зек Тео АЇїа ні феу сів біз Аа ї1е ів Х15 б5еб яв іен ої 1445 ке 1455 їух Ах о ТВе Ав азр бів бі) УВІ Аго АБО Аїа вго аїа тк обів 1450 1455 157 ее об Ага пі НІ бух Бі ага о бко їі Сух Хі его рго 1475 ї8о 485 «ех ві «її Хе «й10з ВТ «Аз штучна ке» кае3» резчкнниМм вВецентов «а є меї бе мем Бек РгОо Бек їво век іец зем мем зе мем віх «Ту Аїд ї 5 їв А іа ЗУ Сув аїа бі Бі уві Аза аїз аїв Бенц тк овгОо 51 Ага ваш 20 ї5 З іви біб Терробів ар зу ЗІу Те РМе Узі їі бій бегб біб бек огеи ї5 «о 45 мУй руб Су ЖіЄ біп Ата біу ух бек ші гей ТР оїви біу аг так
За 55 бо біу 5вг іже бій АіЗ дк Куб нів меж цец тгробух тео уді баг дай
Б та 75 до
Ні бі ев РЕ Аза хів Б1у су бек обі Суб зіву сі ізу Я5п рве 85 о 5
Бек Аїа Ре ові бів вго век хег із Тек біб Суз Ав обає ТВгоїви
ЗО Мо Мо
Уа! Бек їеч АгО Тер ага Суз АБ Ага Був Мей їв твк дію его ів 120 125 пій Тут Бак Уві піп Уа? А1а нія АБродЕв ТНг Оу УВІ Аза бак ага їх 5 1-0 іт Тут Жів ні Су5 тро зів ак тує бі бЗвг обі біу Бі Ар їв 15 і50 155 Її
Куб бін Тк вв нія фух Азроїец нія ТВрРОЇ16 рух Б1у хв тик нів 155 ї7О 175 сіу мех БгРо Су Межї Бе Бго вве сій тук азй ні бів тво нія ві
КО 185 1
Зій Суб Тк ага бів зі арго 01 аАБроавросви бен о тТго Сух Аа те мщюЮ 205
Те Баг о агу туго бів Ага зр обів сує тгросіж вве Суб вро АБ ОВгОо 210 2і5 ки
ТвВг о Яак аїа бід Уві бік бух Ар твк Іф тер обБіц ух Зв те АВ се5 о 235 4 зЗзек нія їі СУз Тек Зі Ре Аа Бе: осец бег зЗегоівц 5ве тер Заг на ХО 5 зі аіа ні Бер зек Суз іп меж іп бі біу ТБ осев обев бек Же еЕ ве а
ТВге дев бін так обі» бін длй о вма Хі ага біб нія Мет Зевк Зак і еа
Тьг Уві сти Узі тТероУзі бі без аха бій без азо Фіз аАзр Аа Ві 2 «95 щюЮ
Ттрозіп тТгоробЗег Акробіу ТВгб о РгОо Мер Аа Тег о Бец Аяа ТКроБек о Бго
КІ Зо 31З зо
Зіч Уа! Аза Бе фі) вБго рив Уві бі) аз нія Суз бі Те оОвВе заг 325 30 155 заг вне мет Бко Бег Аа тт ага Бек аго аво сх Бі Зег о тйг бе 340 145 350 го туБ їі Суб бУ5 уз Туб вес ази ні лів азвронії бів Те ха 355 350 355 ів се Ар Аїв тКО іт Тек оТуУук аїд тт ні Су5 бі рро бі тео
ЗУ 5 їй вЕп орто тТуг А5п о агОо ажа Су» тує їук сво біп іув БР БТ Ух тВе 185 зо за5 я тТтр нія 015 дів сей Ага его Сух бій аій бр аз бег Аїа веб Х1В 405 СЕ З15 аз бів Твг Бек ів дів Бі уві 5іц Бе іву Уді ТнНгофївБ обец бі чо щих 43
АВ обів Язи аіз бек обі Тег ОТго Хі бі сво баб баг дав рух Хв 855 Б а го чаї бек вне «іц тгробег Аяй АЗр Зак Заг оуві її вбе так дав зп 455 50
Тев Ні Твк орев бін вко ніх Ів Ре вРо дей Аа Бег бів рев сСуз чаї баг аїа біз бін его біц біу Ні Тероіуз ма? ув А5п Су» ФВ 455 Б ах
Бін Ага ев вве тТУг ЖтТо Сеа гі їх Аїа Сі нів Уа? Мей дек о а5е 50 За 5 із бій баг обі Сух бій біз біж Тгро обід Зі ТвВт о Сух бі ра СУБ 5 ва ах
Тук бу Те Ар отвге Уа) рен аг хек вп яр ост аїв ев Зак б1у 53 5 5
Туг Тук Сух вго Рго лів івб тд! тТпт жів ТАБ АВ Ага РЕ бів бів 55 550 555 ее
Аїа вне Її ТВрР обег осец тів баг бек УЗ! Уа! суб Мет уз Ар Зег з65 57 575
Туг вйе Тгр Ії лій із бій ар дій лай або твК обіу бів Туг ТР
Ттв вуз Ро Уаї біу Зій туз вго бів Вго Уа бій Ту ТАБ оМі тро з во ЩЕ амі Тк ні Бій Бго дго туго чав о біу бі Суз уз! Аїд Меї ака су 510 Іх вай
Агу нів вго ем біу ага тго Січ УЗ! ст Кі Суб Ага нів Ре ух
Бе 53О БІВ о аів Меї хек ен Сук іуз сіб вра уза! Бі Аа бів сів куб дів ту пе зо БЕ
Ту» Бін бів аге творог Бе нії Бе су Тек єв Аз ТР обБів б5ег ой в УК бі Рго сія рен АТй Заг Суб ве бух Уа! вбео нія дек обій вує У
КО їх
Мец мет кує дга так о тгРОо ака бі) АЇв піч Аїд Ра Сух б Я ВІ РНе
Б 595 НК піу аа МНі5 цей Аз его овве афа нія їТе сіб бів сій Аха Рве ув! 75 тій 71 Та
Ап бів бен ев Ні Бго уз Ре аа Тго Твгобін біб Аго біп вне
Тих ЕЕ 735
Ттр ї16є бі РНе ай уз ага АБ Рго рен азй діа біу бБег Тгр Зі то т 750
Ттгробег ахр го Тк орго уді уді Звг баг ве ів азр Ап тТВготуг 755 т то вве бі бів АзЗроАТа аго АБИ Су аїв Удаі ТУК бух Бго Ап обує ТНе ге ТУ Тк
Кен без го ев НІ Сух сіу баг офух Ага бі Ттр їі сСух гже Ха
ТЕ ЕН 95 Воо
Рго деп ар УВІ фу вка іух ЇЇ вро ре то тує бів ТК дар о УДІ ах 10 ЩІ го Тгрівн Ре Туг Зі ахю АЇВ вів Тег огївь ве мі Те РАВ АТА 82О 25 Зо зегофів Тгообву ази Ре сі Ре узі Суб беб Ткрофец нів заг дер) 535 ща КА5 ін сем о тНк тів ніх 5ег Ав ніх біз сіб біб вБе 31 Ні заго гух я5О ЩІ БО
Їїе бух Аїа цен Зег гу Туг ціх АЇв бек Тер Тер їв бу без бів 05 я ТЕ що бій бій Ага аа Аха авроЄїи фе агу тгроага дер бів так о рго уд 535 що 555
Хі Тут бів АЗп оТго Ах ТК обі го ЗІЗ Аге Твг уві Ах Аха Бій
ЗО щх о бак біп зго Суз сФіу Ре Хв Зак обзаг Сів ТВгоБіу цем Ткбобіу баг яко 25 іш біз сСж5 Зак ма! бат мат го Зак їі Су гу АГРО мух Буш Уд! 50 з35 що
Тго сен Ї18 бія фу Гуз цу азр оте Рг фу Фій ні біх тТвгосСуз 245 Ба ЗУ Зо го вуз бі Тгробец Тук Бе Аза ТУг уз Су ев сей фев АБа То
ЗБ ат 75
Бго бу АВ го Зак Бак ТРО вує ди ТР тТвк о ніз віз бів нія ре
ЗО 385 59
Су АтТа бів біб біу Сі Те оїев жа) Аїва хів біб заг о Біц Узі Бі
КА 100 1095 сіп авіа ве Хі твкомеї Азп о бев ква бі Фів те о ївРе Баг оУді цио 1015 ка
ТР же Бі ви бій Аа дво АБ оту бів тТБеотТРВ ей ази біу м ЩО 035 уз Рго Уві маї Тут бек азп о тк о5ег вко вве Ар о тт Хе Ада 1540 ії1345 1050
Хі вго Бек оніз аби тег отаг о бів ді бій же Мі бів Ко бе 1055 1055 1265 же 18 ї8го ін Зак 5вб дяй вго али вче о нія РНе тТве сі гуз ма 1075 мо
Тго о ТуУук Ве Зі Абе Сух бі суб Зі бі Туг бі Бе уді Суз
МІ Ми цих сій вуз Мей бій АзороТвгобЗего бі Ніз Біу Уа! Аа тТвг Бек Аво цю 15 іо
Мек ТУуг о Вго Мет Рго азп ТВ о іви біб ТУук біж дп Ако ТВготбСує
Тл 115О 1125 тя їЇТїе їі Аяп Аа Ази мех ЖВг о Тгротже АЇа АТа тів бух Тве о 1135 13445
Сух веб щеї ніх зт Аїд Бій бе од) Бек тів тк о Азо бів тТук щя5 ї150 1155
Ні бів бег РНа рао Твг Ві Бі ібн дкп Ага Бей о бБіу Туг від
ТІВ ща 117 нів тк о їі бік бе ве отвк о тТве Ах оавиа біу бе Ак РВа дев 150 11855 тер оБЕє Авробіх ТКБг обу Звек о бек вне ТвВговВе Ткро бу аБрбів
ТЕО 1135 120 зів як 5Зег сеш без біу а5о сСув чаї вне діа вЗро его Аза бів 1205 1210 1235 ага тро нії Зег Те Атяа бух або бек вна цей бій бБіу АїВа хе
Ме їй 15 суУ5 Ні уві ко бго біб Таб о ага бій беб бів нії го біб гео 1235 124 1245 «у Бег бій тТвВгобає ів вко то Іі ву5 ВНОЇ Був аг Аа Сув 1250 ї253 їм
Туг вуБ вве аг Тнг Уа! фев о азроЗеє меє ек Бе біб АВ від 1565 1279 1295 ніз 5іц вве сСжх У фу Бін бі 5вк оди Бен оївО Твг ОЇ і у5 1280 їі1285 1290 дер Біш АВ бі а5п Аа рве фец іо бі бім ів ве ала вне 12595 МО іх
Фіу жек зег жаї бій мех Ууш! тгробеу дхй АТа бій вве дхр бу 1щмо пив їх
Ап ожак р ув 1555 «ій» 8 «іі «В «еще РЕТ «АЛ» т УчНна «ее «23» Інпійуючий пептид «а» а
Ше баг оївц тУк біц Сук йвробек ТНгГоіви Уа) бебоією ака ТР Агу 1 5 ів ї5
Суб Аєп Ага ру Меє Хі їВт Фі ко бец сій Тек обег о уві бів ув? 2 25 За зі нія Ар ах Твг оУуді Уа? АїЯ бек Ага вух Тук Її Ні5 губ тТРр ї5 48 чї «10» 5 «1ї» 17 «їй» ЕТ «Ай штучна «їз» ХнгзбуУуючий пептид «МН їх
ТР Ш КуУ5 Аз о їви вами бек нія їЇв Се Туб бів Ра дбай ев іву 1 З 18 15 каг «0 6 «гіїх й «їй ВЕ «віїхм ЩтТуУЧчЧНА «ВЕ е «Ей» ЖнгібйуУуЮчЧИЙ пептид
«МЮх 6 аз су вій Бег ТВг Ома) га ТУв І16 Сух мух Ух ТУР Бе дев нія і 5 вк 15 її аз оніЗ біцч Ті Уві Є уз 28 «2105 57 «ФЇїх 33 «ох вит «її» штучНА «екйх «ва» їнгібуючий пептид «й» и бів тУк рух маї бій ма: ув бег дзроахи Твк УВІ УДО? Аїд АКО ух 1 З і їз
Зі їз нів ага тер о ї16 аїа тує Те ОБ? бат о біу Зі Ав ОТ Су то 5 30 ців «М» 98 «кій» штучна «аа «3» Їнгібуючний пептид «Не й іец бек Тук сеу ах Тер Яег бів біб Їїіе тТВе о вке бі ве ве ма
Ї 5 в) 15
Зіз Ні ні Суз біу Тк оіву іч Уаї Уві Заг аа о 35 кі» 8 «212» вт «ех «Я» Гнгабуючий певитид «Й» У бег ага рве сів бій АТя Ве 318 так бог оїєц Хе б5ег бек УЗ! яїЗ і 5 їв 15
Пі мух Ав обаК Тек Ре Тео ко «вій» ЕТ каАїЖ» штучна ее «ва» ЖХнгібУючий пептид
Ттр тів Сб Аго жі вБго Ага аброха! аго Рго їу5 вне вго 852 Тр ї 5 10 їх
Туг ій Тук Ар Аїд РгО Терен вве Тук бій Язи Аа 2 25 «ій З «еїЗ» штучна
Я
«хакі» Їнгібуючий пептид «Хе 31 лів ве ніх біп АРа Ре цем те оУді беч їеву Бек аку Мей біу нів і 5 10 15
Те нії Тео бів біУу ву баг о ТВе о Тйге дар аа бік іп твг га я. Ко 28 ж КЕ

Claims (13)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Сполука для застосування в способі лікування імунодефіциту СО4-Т клітин у суб'єкта, де сполука є інгібітором секретованої фосфоліпази А2 групи ІВ (РГА2СОІВ), вибрана з анти- РІГА2СІВ антитіла або розчинного рецептора РІ А2ОІВ, яка відрізняється тим, що РІ А2ОІВ є білком, що містить амінокислотні залишки 23-148 з ЗЕО ІЮ МО: 2 або його природний варіант.
2. Сполука для застосування за п. 1, яка відрізняється тим, що антитіло РІ А2ОІВ вибрано з- анти-РГА2ОІВ поліклональних антитіл, анти-РІ А2ОІВ моноклональних антитіл, їх фрагментів, вибраних з-поміж Е(аб)2 і Раб фрагментів, одноланцюгових варіабельних фрагментів (5СЕм5), однодоменних антитіл (УНН або нанотіл), двовалентних фрагментів антитіл (діатіл).
3. Сполука для застосування за п. 2, яка відрізняється тим, що є моноклональним антитілом.
4. Сполука для застосування за п. 2 або п. 3, яка відрізняється тим, що антитіло є людським або гуманізованим.
5. Сполука для застосування за будь-яким з пп. 1-4, яка відрізняється тим, що призначена для лікування імунодефіциту, викликаного вірусною або бактеріальною інфекцією.
6. Сполука для застосування за будь-яким з пп. 1-4, яка відрізняється тим, що призначена для лікування імунодефіциту, викликаного раку.
7. Сполука для застосування за будь-яким з пп. 1-5, яка відрізняється тим, що її застосовують в лікуванні СНІД у ВІЛ-інфікованого суб'єкта.
8. Сполука для застосування за п. 7, яка відрізняється тим, що вона використовується для пригнічення або зворотного розвитку ВІЛ-опосередкованого імунодефіциту.
9. Сполука для застосування за кожним з попередніх пунктів, яка відрізняється тим, що сполуку вводять за допомогою ін'єкції, бажано внутрішньом'язової, підшкірної, трансдермальної, внутрішньовенної або внутрішньоартеріальноїї за допомогою назального, перорального, мукозального, ректального введення або шляхом інгаляції.
10. Фармацевтична композиція, яка містить у формі ін'єкційного розчину або суспензії (Її) інгібуюче антитіло секретованої фосфоліпази А2 групи ІВ (РІ А2ОІВ), вибране з анти-РІ А2ОІВ поліклональних антитіл, анти-РІ А2ОІВ моноклональних антитіл, їх фрагментів, вибраних з- поміж (ар)2 і Бар фрагментів, одноланцюгових варіабельних фрагментів (5СЕм5), однодоменних антитіл (МНН або нанотіл), двовалентних фрагментів антитіл (діатіл), та (ії) фармацевтично прийнятий носій або наповнювач, придатний для ін'єкційного розчину або суспензії, яка відрізняється тим, що РІ А2ОІВ є білком, що містить амінокислотні залишки 23- 148 з ЗЕО ІО МО: 2 або його природний варіант.
11. Фармацевтична композиція за п. 10, яка відрізняється тим, що антитіло є моноклональним антитілом.
12. Фармацевтична композиція за п. 10 або п. 11, яка відрізняється тим, що антитіло є людським або гуманізованим.
13. Фармацевтична композиція для застосування в способі лікування імунодефіциту СО4-Т клітин у суб'єкта, яка містить (ї) інгібуюче антитіло секретованої фосфоліпази А2 групи ІВ (РГА2ОІВ), вибране з анти-РІ А2ОІВ поліклональних антитіл, анти-РІГ А2ОІВ моноклональних антитіл, їх фрагментів, вибраних з-поміж Е(абБ)2 і Бар фрагментів, одноланцюгових варіабельних фрагментів (5сЕм5), однодоменних антитіл (МНН або нанотіл), двовалентних фрагментів антитіл (діатіл), та (її) фармацевтично прийнятий носій або наповнювач, яка відрізняється тим, що РІ А2СІВ є білком, що містить амінокислотні залишки 23-148 з БЕО І МО: 2 або його природний варіант. во мембовни мікюоломени пММД; До кожне мака г НН . 1-2 Що У о ОЗ ОКУ п с . о сг а ОО п о В с НН ах дж ех УК Хе МУ ОХ М с кВА о у ЕЕ Со ПЕ ВВ ЦК ше ення шо ши лока г Е . - с ОС и КВ МК с с 5 с НК НН ню я НН долаю МК улахклюлклий МКК п ку и Тир МИ КА «КВ ВЕ Б В НОЮ с її. с в ов З п НО МВ с пе а о я с Ж КО ії я ни ще. ей х ї ще ОН і в - е я ЕК т нрмев КУ хв з нн коза Я їз вх ча 15 1 о се я ще А Ще ШИН іі ВИ я ши сш З 13 я ще о Не ох чнело ММ на квітнику число М на сатин» Ех: | Са ї З КОФЕ 0 се МК В 5 й М. ЗІ В і З : ев | ї Гай ;
ЖК. З й З з АХ ; КО ще БЕСЕНКО то 18 ВОЗ ММА сно роза ММД їн Фіг 1 що кт 385 р еддчания мою МО РМЕЬ онов нон нов ЗОМ лІМ нКях в ее КО зок за діквво пік МК КОХ ТАК ооо КВ КВ Око Я КОМОКЕ ох КОН ев Хе я ще ОК Ве КУ о. ОХ ОК. СОКО КОМ УНК ТОК ТАЛАН ОКО АКиК УК КО ДОА ЗК СЕ МВ ОКА пон В ВАК и Сех ЯН М УЖ мет вань БО по ння кое дю КЕ КК ЗО Км лен уКовеь и х я МКУ носі ОКА Мои ов о ВО ОА ОК ЛНАМ АН АЖААКА КК ПАН КІВ ДОК КИ КАК А АКА КАК КК ПЕТ КК, ТЕМУ НОВ ООН заш Ан У КВ. о З ВО ВИНИ шк їх и СЕК Ку таки во і що е МУ я нм сеть поли с їв сен У ПКТ МЕЖ УК, МУК ПАС : що и Оу ЯЗ ее Ух СОМ ОО ЕС ОЗ ЕЙ сх шо. М не оо и вон ІЗ: і, В КО ЕВ Нео ХВО М ВО а МО КС Ме МЕ Я КОН М ЕФ КК ТАКЕ ЗА КОН М Ку ОК ще х Ме ХК пн ни о й й ЗНА БО коки Б ОККО К М кі БО ЖКХ ЯКЕ нки леву сфрюсвожи се ГУ СЕННЯ ЗООКя ОК доповн ОКА ХО Мн ток КК НН поза о пон Бе сн, КО ОО Мах ще о У НЯ НН Ми ОК УК БО ння пен я ож АКЗМАСНЯ КОКО о Я пах САНУ ПЕКИ МКУ Вес ие ня Уа КК Хм МД оце ПІДЕ м о ркак МАХ ІЗ М нин дл» Му КН яв Н о аНекК нОЕ К ее, Гоа Х КК ЗЕ МОН Ж Вс НН Ов МКК КК СУЯ ОВ ах ще ЗХ о ОК ОО о ОМВК ! тА ОА Во Ох Ки пе КУ ; ТК УК оси КК В х 3 ОКІСО М СУХУ х З Кен і і КОКОН ОМ 0. Зх Моск Ос ЩО У в АВ МК вн Фіг 2
І. г
І: сг Я Як ще З - й зсніе фу а З я : ше Ше й ж В щ Б вжи ше с. "М В й кх В я щи шк ши шен Еш щи. КЗ з Бе ше ВАК в 2 НЕ ЗК ВК ЗА ЩЕ у ях Б 5 дж і І мо Ж Я Я КЗ КУ Я ТА С. о їв фосронтАТЬ й чена ох шен 0 Мбовья » се і ООН ее Несе БОНН ЕЕ ПІ ера пан шин кг я о І МБ ВЕ У КК ЗІ Її Дфщ((/ с пове КО Ох пр Не и Б ЗБ, Км ни НИ ее Кок жо хз рок качан ЯКИХ ОК Мов Уве в Ко А ПОН. ОМ ї Б ее ШИК в «Є її рен Пере КЕ «ЖЕК ї 5: ОК її їі пе ШК М. я Я КРИКИ, що с . І КН й Ф ЩфДї Он о КОВО ва ВШ сої о ше ех що Су о сне Вей і ГАНОК ЗК ооо оососотове оо ОО ко НМ то ех о у в пен с ТЕ шо в о п. шо о не і. о ех ях КК КН КК М ТО о с нн 6. Ж 4; о АНЯ НЕ КО я я ж х реак і: ВК я е нен: й " в УМОВ ому ВКя зК ; носно ноьї З НЕеТНАЛЬТ . КЕ КОН КЕ г М ав о дя» тек Мая кн: В в їз вія Й рою й Бк -- ШИ. Ї в вн ттижЕ. Че ен в дух у я Ка л5 Ж о пеня ве ж ОБ яв ок и их а ХВ час ки оо ЗК Я сДяМ) чвоїхвни (хат Фіг З
ТЕ МА клина й Мид щи кт й ся. в З 3 - п М МО сне не че нОжаем В но Бе Ат ша Ж зві Я ЗІ ИН пі га вок аж жк ж НЕ В и В й х ща я МК УНН Мк З в. ша | | ШЕ Касове соя в аа фу храни феніснн інв СТО фваюювввювох суднові ни ШЕ ее Ко ч т. ще Ко тю ЗК Ка КК ще У о «й Кк ех ; ех се й и во Б 0000 и, ИН ке Ох Ж Кох ЕХ ОК авиш Е і . х ОН У с КХ ве жо Я вік 5 ай п ОО у ВЕК АК ТК МО КО ЩЕ ; 0000 ше Б г НЕННЯ й ЕЕ Я зр ! і Кк в Кз 33 ЗК ВТ хе: ЗХ ї нів ще с ТІ З Не Кот КЕ КВ Є пок У й 000 000 ше сх, КС о КЗ ОО ОО . З є що : с я но КОТ УМ, АХ УМ Б Де І М ше 000000 а ведете 0 2 че Шо ех і тк дей 0 З п о фон, НН мі шу фон НВ ОО а Ши ; у вк 0000000 ВН СКМ КВ У ЕК З А пиазме, Зо І З
Фіг. 4 осно ТАТИ ВоейнВТАТЕ й жі оповев В НОЮ ШИ в С ЩЕ я шк зве пен й НН НН ї шо хе ше З ; й ре З А В ОХ що а я ЩЕ няття Еш су Ванавя ОК то ВН снннсеня о ни ній онко оди " я К ся в В, є. шини: ен І ом КК, ях ЕКОН , ов, о сво паакічнну жо и КК К А З Ще: ие ше Ех о З 5 ре ОБ повно доля ні ЯН о дстіоя нс ТЕ | ще о Дн ШЕ 9 моні й 0000 НИМ как 000 ШК Ше 3000000 ШИ в б інтен ПАК 5 Ж пеня т ЕЕ ання скік з ; з нен чик У сонет не 000 и Ши 0000 ШИН Не 5. п ГИНЕ яке БЮві ПУ п СЕ зрдфенннюнниунянн СД КК У С ОО : 000000 ИН. ле КК Ще ліг яях Ко, Ве и ее, влазма, Зо Фіг о І, з з В 2 фен пи а ; 2 о ванни нн, ; : Кі З І ск: ни Кк я ШЕ - я |! ВАМ м й се ке ВН ши в'я а ще чеьь В Увр: профітль гельвільтрації: (Сефедане ОО ще : Х ї -ах 5 о ММА диня ЗО бебі ие не вм ван «В в ж г в ча: с А отр профіль гельсофільтрації ібефадеко ВТО ЩЕ на їі се жі і НЕ 305 ж, ї ї а жа чн чай и ва ШЕ Додетечккжжкекн ретккккчккржттткржнкнн й г за о в ві їе ми вав а ув: профіль івнообмінної хроматогаї З Я я як вніонообмінної Мопосі БО ! «ів» катієнесмінної ро) ек вві Ко в Ку 4 5 я 7 З а ра епюції фіг. 6
Б СМ Теклітини льснвані НЕ В і т не кни Я ВК У не ше в па й шн деде о. с нн НН х : о 0 ЗЕ Ж УКВ С Тх с хх г. те еще С ; о с - ее ХО З КУ МИСИКВ ее . БО 5 с о с АЖ КК КОЮ М п . у МК о ЖЕ ОКУ ша о ще КАХ о МЕ ОО . :- ще п Я о ії КМ хи УК УЖЕ с і п хо КН ЕК СА 5 : о З ЗО дяки УК УСУе хх п о я У ТВ ат х
! о. М ВО ВО в ще п Ж КЕ ШК кожуха КО ТІК п в ОК вх ке : МАХ дух ОМ КЯ ТЕРНУ ЗБ г : КВ г ОХ о с т 5 ; З : ОА СЕУ ОК с ЕВ КУ ВК З : й Ж КВК і шк г тест йтини просх МОХ Я Ух ц тя пла У УЖ де у в щі " ем ВХ се їх ! є Ж ТА як Ме КК М Є ще в ла НЕТ ОС КО КИШ ж а . о ОК В Кая ХУ Я я СОМОКЕКе ДОКИ ЗВО ТАМ ах ножу ТО ол Б ще. же кір КО ах жМКХ ЖК й. о ; КЕ ОО ее ДЕКО : - що КОКО МО МАЙ ох он з Ме ЗМОВ УКЕ ЗО ою ся Ух Ом КОЛЕ хх и Се ох ТЕО ОО Ж п ще ОО БК Не ООН МКУ Ту еоЯ кх ЕІ пок еВ ООН Не 5 и У ЗК на ОВО И З ДВК МЖК УУУХ Я шої СУКНА ЗО Ся ЗО ОХ АК З ТІК У ОХ ті Ме и У люд Ту т з м УКХ Ом ща СЕ 5. Ва шо НЕ 5 с: Пе ПК а У
00. а Б п. ТАЖ КУ па ее пої КВ м хо п п жо: і . т, СК жу МОН ге ето 5 кн па з п я 5 с ви ин, х Тк ин УК Я ЗК ЕВ З я їй ки : -- 2) у но (щкя ще см дек не пн не пов ОУН ОК ой о ЗМК о ЗКУ КК ОТО о ВОК ОМ ОН ЗКУ ОКО ХХ КННК о. 0 п п о с с . вок МКК ХУ КА МИ с о. . ВК ее ОО а . п КО, ЗБК ОВО ЗООЯ КО о. с с с ! УКХ ХК А М То Х о їо гій о. ХХ ОК Хе ОК ЇХ , З КЕ ММ ее пе що її: ХК а МЕ они Ва ев ; с МО ОКХ ПІК КМе КЕ МКК З с . ЖЖ Тем ск АТАК ВК ОО т о ТАМ Ех 5 ЗХ ХХ ВОМ ТЕО шен шк 7 ФІГ,
нпе усе ше с вна с В Б ме ве що оЖбена є НТ ше в'я яеф ТОВ ММК. Ж дуже ТВ к винбвори ММА не ек іннйтори ЯМД с: в ЕН Бе світа В Я «Б ен м: Я Ж ше в що і ке М ТУ «кі я зхе ук Зв Щ. о, ЖЕ КЕ й й КЗ хх З ме т со і Ех Б Є нодянн ЗКУВІУМКЕ сяк й Ка мин ши Її и ие км редьки ви в ов ж З я в в» 3 з в з -й оч мини й я же я ск Я З іееві вий в и НИ п що ЧК зни) тар КОМ ВА й е і ях дв ; ИЙ ме Як ж ї і Ей Ж ет ее 7 "я БА ЖЕ не ПУНИТОВИ оди с в о п НЕК НеХНеКИ Й: цитенУеннху РН З ддусеканть МЕ ВИТОКУ кеш ЯН й м Бе чу Е. В сх ЗІЦЬНАХХ х В ЕЙ Са при ше и ве екон 5 5 я я Жищкоха СМ ее М че В Щи нс Шен я м и В Й ша г: Ба ок ай МК ж 5 о МНН о нен о І Ес зе ША: - щш що і Ко їй Ж г Ж ее нний ОМ З ве сич з «2 уж353 дин З ек Не гук «ой ДИВ вет й СЕ НЕ пі ние ко о ОМ ов о по інн З ВІ п ЗВиЛяХ пек лОКх покемо Е Не сок 2 и с ж 5 і о. м Й х І дулю пень ловіть повільно ї Н оч и СЯ ве ГУ і мих КОМ, оо КОКО, У і дом дивна клав пак : хо влбнове ММА ета «кода «5 ! ун У я ь «В. ! Н ще вико . повітьно Рава : СНО ря со ОУ В, ПО ь ях Н Н ж ну і; Е 7 ; і шавоко веди пінвдхо ї - З нак: З ; ї й зів ла не УРЕ НІВ ї пана а а а З ; ! зе з ; і ! КУМ Е З ЕЯ ї фїчаахоманяа «В давню ж ї ! о Позначення ЦНЬ сфе я Е В пІазматнння МЖК вда пр Е ЕК І СЕК цитосжелаху ВАД, НЕ ї нн нн - і поток КО С С СТ осонні
Фіг. 8 Го
Ря дня Які пт Е 8 Пов озепуююмих 00000 Вир іннУкований Псврантннй 0 ; орли З я ЗВ Х: ви КОТИ Ху ЕЕХ ! ок характер ДК в недуУкомих І, хабактас активі ни Сі ткана ! Зо Бд мсутя ви кує ОМ КК Й і НО СО тТклітинах поз с я ЗО ЗК ЛОККА е, ЗМІ ка дмдк от ї оон ОЦ Ще ЖЕ зво ше ЩО . х й ї5 бан: ЗОБУ УВУ ОККО КО ШК МОУ БАК. чех дак З о. п: Ї ух ви КЕ З вує сени ни по Ос шо ще ук Км фу а да ВМ ХМ МИХ ХУ 7 вне х ще Ук кВ ; З МО п ККУ цихоклекиа п У о о 1 На м: ЧК І ПН айв о. М 4 ше а БО ще шо з г зони І Я з З : «й, в Ге р З з ББб'ї» т шш ще В. ши оду. є ай Ть щ веж вк й і ех КН їч
; б. аз « Що в ? з Н З Є. сх вл и ун у? ко ла я і Е і овдяня сх ноу КВ Ве пшона «ЕК лох зн вве есу Как ВК еконо де Ох З данина см аа сн кни ЛШ ШИН ен ши І ГО споєссе Ве ХХ хх й й зок НК З з с ен -- ка кох "Я нн ! иа ве шо. відсутність структурування ї са ах ж. КК З х З чуми тих дея ОМ и КАТЯ Н характе зктУиВаці ТЯ Ех я КО що о. . цитоскелату та пигналосоми ха мЕу ех МІНТМНЯХ МОМ ОО і ї і анНЕСОЯ Т-кпітннах с | ес Е З х с и т «днк Ффи хюо фа же ю вхфх і Е киева ме а ВШовдн Ж ів щи чн ве Ух і М а в чи кі і ран Кох МЕМ М Уа КО ЖЕ КА М Я і шви НЕ ВО: : Її. НК в са " і зоіжек МУЕНЕ ен о в НН ен В КЕ в я Мене СИ ри п НХ і ек и я С о ОВ шк, ОК і МКК ТКУ ММТСНИ КІ ї ТК УК МАХ СКУ ТК ня Кк Я і Не п ІВ ж А Кс МКК ду Й Н І ЗЕ КВ НН В інв ав ДІЯ Ж ОД, Н ї ЗК Я х т НОХ ЗОНУ ВО їв В і ц : 7 ВЕ СУ Я Ж і х ях й Н : ве ви йетик ше х Ов. с ї го в и КУ Й З Б Е нн Й ОН У ОН З с же ; : Шин 000000 тА А МД Е : Кая и й : і о ШЕ ї Й те а зосмо зе г г а Е І - ВОНО МК щу х ше чужу ох, доня Я йо СУК с Що ві Її є ке гу ВО ов ВЕ г яке со че в ; : Що Би о ав Й НВ В и ее ве : із ше ща «се 5. ЗБОлІЕ нч к ЕІ же аю000е в» ь ес ен М во о НА НН. Жов. вен є й а й ше Ера и я х о М ЖК нн МИ х ох МВ ваша й, УКВ снів мине ЕЗРИ В А КО Ан сн ЕЙ СКАЖУ КАК КЮЮКЮ Ж тп Алан ЕВ ВИ
ФГ.
во УСІ СЯ Т-клітини Ж о о х дк. КЕ щя ЧЕ м ще Як в. в «оло Рол | же мав Ж ВИТЬ ак ЖЕ у Н : : хі ! ; : ЗВ і «ре «ардре : дю а : ма А МВ й-я Ма 3 му кВ ще зору ЯжрНЮ тб рув в. СІМС ТУкпітини ко МО ; ж ОО -- «фе Тк. сн ж ' СЕ: Ве Яку ВО - нище і. 4 і в В В З ! ве | нав, ях ма -2 Ма ле ма ог ма по МС 00 зьено збенО о вУР
Фіг. 10
Ка Ж як Я К; Ж Е Кз Е. : во Га шень яе і Н і а «вах Я : х каві СИХ пщцик з Я в едлнНИ ! І в ще : і. ТАЖ ; і з Я "Ж ж о ; Бодя : Е
Ж. : : Е ? в Ще ще: кої Ма Че ма Не ма й. ма це Ма жа Ен Уа зеоче З во КЕ сні аск Ж фіг 11
З і. пи о нн пан пон ринви я І ! шо М ЕРОМНВ ї ЕК " пи пон вай ма мова од вм ЗК ссшва кості ш- КОЮ 1 ШКО й щу Ї ОК Ой же І ЕОМ с охмНнИЙ й : Хо Зк з НЕК ще СУ с ее «Кфежужеіжкикюкнк ек Ко В жажежлк жк ско т В М зенкюнит и 500 Ей с КМ що каже ню кв сюк не КВ с ДБК зянннчння су Е Кк Й що Х Во и. з ще МОЮ . НН З ЗрОРІА В ще І З : го сн КЗ КУ Е у Ох я я КЕЙ ж г. -Е чХ МО Р З З З ТОК Мей КУ ше ше З дума о анна нн й КОМ МКМ 0 6 АЕН Ще: нин М о о а В що зо що зе оо Часісею) Фіг 12 Ж те бо
А ЗО вия І: яв ї й в М 5 сонній ПИ НА и и сежи 2 фоснккккннннкккнй т ІК: кі Шк й зо щ : нич ж з З я з х м ша НН НН хе М й Щі вх ча «й -Е щи
Фіг. 13
З фунти ен зві френннненнноня В, КЕ: «ка Ф з т. сеВрсек Ж З кіше ПО ЖИ Р 5 зе зе Зх К р що щк Ж 5 г дя киш НИ й о є в. и ГЕ роя для А я М і Ку Ж. ік ще Н Б Як ях ж. а й яка ЕЕ ШИ ак З о че ж нишиаши х ; З з і 5 й ЕЕ ие ШИЄ КЕ НК с Ше НК Я Фе «М СОС х ці КУ ро Я
«ВАМ 000 000обеМю
С. х 5 з ї Й й Ж К Б й Кк Ж Ж а з з ши » Е суй м: кіфое У мене зни и х «кї ж М як Й са ні се Є г: жк х І й Кв Е | Алея Во іо жа "ге г» г КК а НИ ША Є Ку я ти «У «г КК ях й М се: я Є с за За Злі дом пев вла, І » лЮдІ СЕК За? рення фоном фокюююююююкої як ВКМ г Го щі! Е. змі б в жк чех ВВ шо з ; КеЕУ Шк се 7 В ся ж т Е ж з х ж к.е ж я ка м ще х КУ Щи ж ро х Ж 5 чан нини не Ж в нн нин пн зн ння нини вини п Ж й в я щі а й щі а У що я К ще Ь жк Що Ех: є : ше ши ши и ше ши и М МК с шо в с а В а: ке и Ка Кк НИ ? в «я С СУ Кк з я ро
ВУРСАЖОТВ Тент денне. пи ОН РТВ ан нанні Хуннтуральне середови з І з вно пив орви звів зав ши ше Травспокація у ядно фоофкняТАТУ Сб позитивних Клін в со алнин від НОВО МЕ Са тесвумни Щд НОНХУ а МЕД «т ще її з ж к НО шк КО КТК., В ТОМ вої Б ця й ВЗ 3 " ї ко КИ зва Еехажах їж зро мий ними т чо ізо сан ПлаВМЯ Що ПЕТЯ В СО КЛУТИНЯВХ, (НО НЕ: ВДОВОЮ» що е Поза пВцеНнУВ З Брю БУ ж. ; ! Е : Бк Е х З че Ж щі х х ве ге. Й КЕ вх ШЕ план І І ї м в щаВІ вовм До ния
Фіг. 17
UAA201608118A 2013-12-23 2014-12-22 Сполука для застосування в способі лікування імунодефіциту сd4-т клітин у суб'єкта UA120264C2 (uk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361920137P 2013-12-23 2013-12-23
US201462017457P 2014-06-26 2014-06-26
EP14174599.2A EP2960252A1 (en) 2014-06-26 2014-06-26 Phospholipase for treatment of immunosuppression
PCT/EP2014/078969 WO2015097140A1 (en) 2013-12-23 2014-12-22 Therapeutic methods and compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA120264C2 true UA120264C2 (uk) 2019-11-11

Family

ID=50981429

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201608118A UA120264C2 (uk) 2013-12-23 2014-12-22 Сполука для застосування в способі лікування імунодефіциту сd4-т клітин у суб'єкта

Country Status (15)

Country Link
US (2) US11365264B2 (uk)
EP (3) EP2960252A1 (uk)
JP (2) JP6728047B2 (uk)
KR (1) KR20160106085A (uk)
CN (1) CN105980408B (uk)
AU (1) AU2014372657B9 (uk)
BR (1) BR112016014876A2 (uk)
CA (1) CA2934445A1 (uk)
EA (1) EA201691314A1 (uk)
ES (1) ES2812542T3 (uk)
IL (2) IL246280B (uk)
MX (1) MX2016008516A (uk)
SG (1) SG11201604970XA (uk)
UA (1) UA120264C2 (uk)
WO (1) WO2015097140A1 (uk)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017037041A1 (en) 2015-08-31 2017-03-09 Diaccurate Use of indole compounds to stimulate the immune system
JP2018531945A (ja) 2015-10-09 2018-11-01 ディアキュレートＤｉａｃｃｕｒａｔｅ 免疫系を刺激するためのペプチドの使用
EP3530282A1 (en) * 2018-02-27 2019-08-28 Diaccurate Therapeutic methods
EP3533459A1 (en) * 2018-03-02 2019-09-04 Diaccurate Anti-pla2-gib antibodies and the uses thereof
EP3533460A1 (en) * 2018-03-02 2019-09-04 Diaccurate Therapeutic anti-spla2-gib antibodies and the uses thereof
EP3693063A1 (en) 2019-02-06 2020-08-12 Diaccurate Methods and compositions for treating cancer
EP3786180A1 (en) 2019-08-27 2021-03-03 Diaccurate Antibodies and the uses thereof
EP3858357A1 (en) 2020-01-28 2021-08-04 Diaccurate Use of azole compounds to stimulate the immune system and as inhibitors for s-pla2gib
WO2021214039A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Diaccurate Spla2hgib-binding molecules and uses thereof
WO2021239666A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 Diaccurate Therapeutic methods
EP4067376A1 (en) 2021-03-30 2022-10-05 Diaccurate Anti-pla2g1b monoclonal antibodies and uses thereof
EP4115900A1 (en) 2021-07-05 2023-01-11 Diaccurate Novel antigens and vaccines

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US32011A (en) 1861-04-09 Coffee-pot
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4486530A (en) 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4411993A (en) 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
USRE32011E (en) 1981-12-14 1985-10-22 Scripps Clinic And Research Foundation Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies
US4543439A (en) 1982-12-13 1985-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4902614A (en) 1984-12-03 1990-02-20 Teijin Limited Monoclonal antibody to human protein C
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
AU606320B2 (en) 1985-11-01 1991-02-07 International Genetic Engineering, Inc. Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
ATE134874T1 (de) * 1987-08-27 1996-03-15 Lilly Co Eli Synoviale phospholipasen
EP1997891A1 (en) 1988-09-02 2008-12-03 Dyax Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
ATE185601T1 (de) 1990-07-10 1999-10-15 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DE69133476T2 (de) 1990-08-29 2006-01-05 GenPharm International, Inc., Palo Alto Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DK1820858T3 (da) 1991-03-01 2009-11-02 Dyax Corp Kimært protein omfatende mikroprotein med to eller flere disulfidbindinger og udförelsesformer deraf
WO1992018619A1 (en) 1991-04-10 1992-10-29 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
US5972901A (en) * 1994-03-23 1999-10-26 Case Western Reserve University Serpin enzyme complex receptor--mediated gene transfer
WO2002012562A2 (en) * 2000-08-04 2002-02-14 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the pla2g1b gene
CN1531422A (zh) * 2000-10-20 2004-09-22 治疗局部缺血的基因转移配方及方法
KR20040085185A (ko) * 2002-02-14 2004-10-07 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체함유 용액제제
AUPS282602A0 (en) * 2002-06-07 2002-06-27 Garvan Institute Of Medical Research Method of inhibiting cell proliferation
WO2004002296A2 (en) * 2002-06-27 2004-01-08 Sequenom, Inc. Therapeutic methods for reducing fat deposition and treating associated conditions
US20050239077A1 (en) * 2002-06-27 2005-10-27 Adam Gail I R Diagnosing predisposition to fat deposition and associated conditions
US20040033228A1 (en) * 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
US20050058649A1 (en) * 2002-12-02 2005-03-17 Landes Gregory M. Antibodies directed to phospholipase A2 and uses thereof
CA2539065C (en) * 2003-09-22 2015-06-02 Biospecific Gmbh & Co. Kg Compounds for neutralising the effects of secreted pla2 iia
AU2006311765A1 (en) * 2005-11-03 2007-05-18 Ilypsa, Inc. Phospholipase inhibitors, including multi-valent phospholipase inhibitors, and use thereof, including as lumen-localized phospholipase inhibitors
US7390786B2 (en) * 2005-12-21 2008-06-24 Wyeth Protein formulations with reduced viscosity and uses thereof
US20090042825A1 (en) * 2007-08-06 2009-02-12 Majed Matar Composition, method of preparation & application of concentrated formulations of condensed nucleic acids with a cationic lipopolymer
US9657109B2 (en) * 2012-11-02 2017-05-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Compositions and methods for the treatment of systemic inflammatory response syndromes
US20140283157A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Diadexus, Inc. Lipoprotein-associated phospholipase a2 antibody compositions and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
IL246280A0 (en) 2016-07-31
CN105980408A (zh) 2016-09-28
JP2017503791A (ja) 2017-02-02
EP2960252A1 (en) 2015-12-30
EP3087100B1 (en) 2020-05-06
CN105980408B (zh) 2021-01-15
BR112016014876A2 (pt) 2018-01-23
AU2014372657B9 (en) 2019-12-19
EP3722321A1 (en) 2020-10-14
MX2016008516A (es) 2016-10-26
AU2014372657B2 (en) 2019-12-05
US20160311926A1 (en) 2016-10-27
KR20160106085A (ko) 2016-09-09
SG11201604970XA (en) 2016-07-28
EP3087100A1 (en) 2016-11-02
IL246280B (en) 2021-10-31
US11365264B2 (en) 2022-06-21
CA2934445A1 (en) 2015-07-02
US20230038788A1 (en) 2023-02-09
JP2020169198A (ja) 2020-10-15
JP6728047B2 (ja) 2020-07-22
EA201691314A1 (ru) 2016-11-30
IL286759A (en) 2021-10-31
WO2015097140A1 (en) 2015-07-02
AU2014372657A1 (en) 2016-07-07
ES2812542T3 (es) 2021-03-17
NZ721311A (en) 2020-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA120264C2 (uk) Сполука для застосування в способі лікування імунодефіциту сd4-т клітин у суб'єкта
US20210095012A1 (en) Anti-semaphorin 3a antibody and treatment of alzheimer's disease and inflammatory immune diseases using same
UA76936C2 (en) Human monoclonal antibody binding the antigen-4 of cytotoxic t-lymphocyte (ctla-4), nucleic acid, cell line, method of obtaining transgenic mammal, method to increase producing il-2 or ifn-? in the t-cells of a patient, method to treat and pharmaceutical composition used in treatment of cancer, inflammation or autoimmune disease, including the antibody
JP2009515827A (ja) 治療薬
CN103370076A (zh) 治疗毛发脱落疾病的方法
AU2008202992A1 (en) Antibody against enzyme specifically cleaving von villebrand factor and assay system using the same
EP1838737A2 (en) Binding proteins specific for human matriptase
CN106046158A (zh) 针对人前列腺素e2 受体ep4 的抗体
KR20100023869A (ko) 페리오스틴의 Ｅｘｏｎ-17 부위에 의해 코드되는 펩티드에 대한 항체를 함유하는 암 치료제
US20150291691A1 (en) Methods for cancer management targeting co-029
EP3656794A1 (en) Composition and methods for detecting cancer
JP5686600B2 (ja) 新規モノクローナル抗体とその用途
US20200024347A1 (en) Or10h1 antigen binding proteins and uses thereof
JPWO2012157589A1 (ja) 細胞接着阻害剤、細胞増殖阻害剤、並びに癌の検査方法および検査用キット
CN103957937B (zh) 用于治疗阿尔茨海默病的化合物
JP7181523B2 (ja) 糖鎖をエピトープとして特異的に認識する新規抗体及びその用途
CN111751545A (zh) 一种筛选pd-l1/pd-1检测点抑制剂的方法
JP2007525172A (ja) ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のハイブリドーマ不要のエクスビボ産生法ならびに不死化細胞集団の作製法
AU2012203101B2 (en) Antibody against enzyme specifically cleaving von villebrand factor and assay system using the same
Hurst CNS endothelium expression of ADAM-17 and its role in multiple sclerosis pathogenesis
Ports Laterally associated proteins modulate α6 integrin cleavage, a permissive process utilized during cancer metastasis
Mathews ADAM10 exacerbation of allergic disease is potentially explained by its role in CD23 exosomal sorting
NZ714716B2 (en) Therapeutic methods and compositions
WO2008004406A1 (fr) Agent pour moduler une dégranulation des mastocytes