ES2812542T3 - Composiciones y métodos terapéuticos - Google Patents

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Thierry Rose
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Abstract

Un compuesto para su uso en un método para tratar una inmunodeficiencia de células T CD4 en un sujeto que lo necesita, en el que el compuesto es un inhibidor de la fosfolipasa A2 del grupo IB segregada (PLA2GIB) seleccionada de un anticuerpo anti-PLA2GIB o un receptor de PLA2GIB soluble, en el que la PLA2GIB es una proteína que comprende los restos aminoácidos 23-148 de SEQ ID NO:2, o uno de sus variantes naturales.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos terapéuticos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones y métodos para modular el sistema inmunológico en un sujeto que lo necesita. Más en concreto, la invención describe la existencia y la caracterización de un factor endógeno clave de la respuesta inmunológica y proporciona nuevos métodos y composiciones terapéuticos y de diagnóstico basados en la modulación de este factor. En concreto, la invención proporciona composiciones y métodos adecuados para estimular o inhibir las respuestas inmunológicas mediadas por células T CD4 en un sujeto, así como métodos y composiciones para controlar la inmunodeficiencia, incluyendo la inmunodeficiencia asociada con la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). También se proporcionan métodos y composiciones para diagnosticar y ensayar defectos en las células T CD4 que persisten después de una terapia antirretrovírica, así como métodos para desarrollar fármacos capaces de tratar específicamente esta inmunodeficiencia.
Introducción
Los linfocitos T CD4 desempeñan un papel preeminente en el control del sistema inmunológico (tanto las respuestas celulares como humorales) y son cruciales en diversos trastornos de enfermedad.
Durante la enfermedad inmunológica asociada con la patogénesis del VIH, menos del 0,5% de todas las células T CD4 están realmente infectadas (tal como se mide en la sangre periférica), pero la gran mayoría de las células T CD4 muestran una importante disfunción reguladora. Los linfocitos T CD4 no infectados progresivamente pierden su función, se hacen anérgicos, y su número disminuye dando como resultado una linfopenia de CD4. La anergia y la linfopenia son características de la inmunodeficiencia que caracteriza a los pacientes infectados por VIH. Los mecanismos detrás de estos fenómenos nunca se han terminado de aclarar (1).
La activación inmunológica y la inflamación también desempeñan un papel crucial en la patogénesis del VIH (2, 3). Los inventores han demostrado previamente una disminución en la capacidad de respuesta a la interleuquina-2 (IL-2), que conduce a una anergia de CD4 (4) y una reducción en la capacidad de respuesta a la interleuquina-7 (IL-7) que, mediante la alteración del bucle regulador IL-7/CD4, participa en los mecanismos que conducen a linfopenia de CD4 (5). Los mecanismos implicados se han atribuido a defectos en la vía de la quinasa Janus (Jak)/transductor de señales y activador de la transcripción ("Signal Tranducer and Activator of Transcription", STAT) (6, 7). Otros laboratorios han obtenido resultados similares (8, 9). A este respecto, es necesaria la compartimentalización del receptor de IL-7 (IL-7R) para iniciar las respuestas de células T CD4 normales (10). Tras la unión de IL-7, las dos cadenas del IL-7R (IL-7R alfa y gamma-c) primero son conducidas hacia el interior de microdominios de membrana ('"membrane microdomains", MMD). Estos son compartimentos celulares que, como las balsas lipídicas, son ricos en colesterol y esfingomielina, pero también contienen cantidades muy significativas de proteínas estructurales y funcionales (11). Los complejos de IL-7R inducen una reorganización del citoesqueleto que después interacciona con su red. Estas dos etapas sucesivas son necesarias para el inicio de la vía de Jak/STAT (12).
Los presentes inventores han investigado los mecanismos detrás de la falta de respuesta de los linfocitos T CD4 en pacientes infectados por VIH virémicos (VP). Los experimentos proporcionados en la presente demuestran que la activación crónica de los linfocitos T CD4 los conduce a un estado aberrante de activación/diferenciación que hace que sean refractarios a ciertas señales fisiológicas, tales como las enviadas por la interleuquina-7. Además, la presente invención indica la identificación, el aislamiento y la caracterización, a partir de plasma humano, de la proteína responsable de este estado aberrante de activación de las células T CD4. Por primera vez, por tanto, la invención indica que la inmunosupresión puede ser mediada por una proteína endógena en circulación que, tras su expresión, es capaz de inducir la alteración y la inactivación de las células T CD4 y que, tras su inhibición, puede estimular al sistema inmunológico en un sujeto.
Basándose en parte en estos notables descubrimientos, la invención ahora proporciona nuevos métodos, composiciones y compuestos para modular el sistema inmunológico, en particular para modular el sistema inmunológico en sujetos con inmunidad alterada (por ejemplo, están inmunodeprimidos o presentan reacciones inmunológicas patológicas). La invención proporciona además nuevos métodos para tratar trastornos inmunológicos mediante la modulación de las células T CD4. La invención es particularmente adecuada para tratar inmunodeficiencias conectadas con una alteración de las células T CD4, tal como el síndrome de inmunodeficiencia asociado con una infección por VIH. La invención también proporciona reactivos y métodos para caracterizar el estado de activación aberrante, la reactividad a la IL7 y/o para controlar la inmunorrespuesta alterada en pacientes infectados por VIH. La respuesta de las células T CD4 puede evaluarse en pacientes no tratados o tratados con fármacos antirretrovíricos y calificar su respuesta al tratamiento, y evaluar la competencia de sus células T CD4. Sumario de la invención
Un objeto de la invención se refiere a un compuesto para su uso según se define en las reivindicaciones.
En la solicitud también se describe un método de tratamiento de un trastorno inmunológico en un sujeto, que comprende exponer el sujeto a un compuesto que modula la cantidad (por ejemplo, la expresión) o la actividad de GIBsPLA2.
En la solicitud también se describe el uso de un compuesto que modula la cantidad (por ejemplo, la expresión) o la actividad de GIBsPLA2 para la fabricación de medicamento para modular una respuesta inmunológica o para tratar un trastorno inmunológico en un sujeto.
En la solicitud también se describe un modulador de GIBsPLA2 para su uso en un método para modular una respuesta inmunológica o para tratar un trastorno inmunológico en un sujeto.
La invención es particularmente adecuada para tratar sujetos inmunodeficientes o sujetos que necesitan una inmunidad estimulada (por ejemplo, enfermedades infecciosas, cáncer, etc.).
En la solicitud también se describe un método para estimular una respuesta inmunológica en un sujeto, que comprende inhibir GIBsPLA2 en dicho sujeto o exponer el sujeto a un inhibidor de GIBsPLA2.
En la solicitud también se describe un método para tratar una enfermedad infecciosa en un sujeto, que comprende inhibir GIBsPLA2 en dicho sujeto o exponer el sujeto a un inhibidor de GIBsPLA2.
Una realización más concreta de la invención se refiere a un método para tratar el SIDA en un sujeto infectado por VIH, que comprende inhibir GIBsPLA2 en dicho sujeto o exponer el sujeto a un inhibidor de GIBsPLA2.
En la solicitud también se describe un método para estimular el sistema inmunológico de un sujeto que lo necesita, comprendiendo dicho método la vacunación del sujeto contra GIBsPLA2.
En la solicitud también se describe un antígeno de GIBsPLA2 para su uso para vacunar a un sujeto que lo necesita. En la solicitud también se describen métodos para diagnosticar la inmunodeficiencia humana asociada con una alteración de las células T CD4. En algunas realizaciones, los métodos comprenden (a) proporcionar una muestra que contiene un fluido corporal, preferiblemente plasma procedente de un sujeto, y (b) detectar la presencia de GIBsPLA2 en la muestra. En algunas realizaciones de los métodos, la inmunodeficiencia es una inmunodeficiencia asociada con una infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo específico para GIBsPLA2. En algunas realizaciones de los métodos, la presencia de GIBsPLA2 en la muestra se detecta mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
En otro aspecto, la invención describe métodos para identificar candidatos a agentes terapéuticos para la inmunodeficiencia. En algunas realizaciones, la inmunodeficiencia está asociada con una alteración en las células T CD4. En algunas realizaciones de los métodos, la inmunodeficiencia humana asociada con una alteración en las células T CD4 está provocada por una infección vírica, en particular una infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En algunas realizaciones, los métodos comprenden: (a) poner en contacto linfocitos T CD4 con GIBsPLA2 en presencia de un agente, (b) medir la activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2, y (c) comparar el nivel de activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 en presencia del agente, con el nivel de activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 en ausencia del agente. En algunas realizaciones de los métodos, si el nivel de activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 en presencia del agente es menor que el nivel de activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 en ausencia del agente, entonces el agente se identifica como candidato a agente terapéutico para la inmunodeficiencia. En algunas realizaciones de los métodos, si el nivel de activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 en presencia del agente no es menor que el nivel de activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 en ausencia del agente, entonces el agente se identifica como candidato a agente terapéutico inmunosupresor. En algunas realizaciones, los métodos comprenden medir la activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 mediante la determinación del número de MMD por célula T CD4. En algunas realizaciones, los métodos comprenden medir la activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 mediante la determinación del diámetro promedio de los MMD en células T CD4. En algunas realizaciones, los métodos comprenden medir la activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 mediante la determinación de la capacidad de respuesta a IL-7 de células T CD4.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de GIBsPLA2 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, según se define en las reivindicaciones.
En otro aspecto, la invención describe una composición de vacuna que comprende un antígeno de GIBsPLA2 (por ejemplo, una proteína de GIBsPLA2 inmunogénica, o uno de sus fragmentos que contiene un epitopo), un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, un adyuvante. En una realización preferida, el antígeno de GIBsPLA2 es una proteína de GIBsPLA2, o uno de sus fragmentos, tratada para (i) aumentar su inmunogenicidad en sujetos humanos y/o (ii) reducir su actividad biológica.
La invención puede usarse en cualquier mamífero. Resulta particularmente adecuada para su uso en sujetos humanos. Puede emplearse para aumentar la respuesta inmunológica en cualquier mamífero y está particularmente adaptada para inducir una potente actividad de células T CD4 en sujetos inmunodeprimidos.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1a a 1e demuestran que, antes de cualquier estimulación, las células T CD4 procedentes de VP muestran un estado de activación aberrante con muchos microdominios de membrana grandes que no se ven afectados por la IL-7.
(a) Los microdominios de membrana (MMD) se marcan con la subunidad B de la toxina del cólera (CtxB-AF488) y se analizan mediante microscopía STED. De arriba abajo, células T CD4 purificados a partir de HD, VP y células T de HD activadas con PHA (40 pg/ml, 30 min). Para cada grupo, se muestra la mitad superior de una célula T CD4 representativa antes y después de una estimulación con IL-7 (2 nM, 15 min) a partir de series de imágenes de apilamiento en Z. Los linfocitos T CD4 también se trataron con colesterol oxidasa (COasa, 31 pM, 25 min) más esfingomielinasa (SMasa, 2,7 pM, 5 min) antes de la estimulación con IL-7.
(b, c) Se contaron los MMD sobre la superficie completa de las células T CD4 purificadas. Se estudió un promedio de 50 células. (b) Células de HD antes (HDc: NS) y después de una estimulación con IL-7 (HDc: IL-7). (c) Células de VP antes (VPc: NS) y después de una estimulación con IL-7 (VPc: IL-7), células de HD activadas con PHA antes (HDc: PHA) y después de una estimulación con IL-7 (HDc: PHA/IL-7).
(d, e) Se midió el tamaño de MMD en la superficie de células T CD4 purificadas (d) células de HD estimuladas con IL-7 (HDc: IL-7), (e) células de VP estimuladas con IL-7 (VPc: IL-7) y células de HD preactivadas con PHA y estimuladas con IL-7 (HDc: IL-7).
Las figuras 2a a 2c demuestran que las cadenas de IL-7R procedentes de células T CD4 de VP están introducidas en microdominios resistentes a detergentes ("detergent-resistant microdomains", DRM) que no se ven afectados por la IL-7. Se lisaron linfocitos T CD4 purificados (Triton X-100 al 0,5%) y se cargaron 200 pl del lisado en un gradiente de sacarosa al 5-40%. Después de 16 h de centrifugación (50 krpm) a 4 °C, se recogieron 18 fracciones (n.° 1 izquierda = tubo superior = sacarosa al 5%; n.° 18 derecha = tubo inferior = sacarosa al 40%). Cada fracción se analizó con SDS-PAGE (acrilamida-bis al 7%). Se detectaron la flotilina, IL-7R alfa y gamma-c mediante inmunotransferencia (10).
(a) Se usó la flotilina como marcador para indicar las fracciones de baja densidad que se corresponden con DRM y las fracciones de alta densidad fuera de las balsas.
(b) Se muestran las bandas de IL-7Ralfa y (c) gamma-c para células T CD4 de HD no estimuladas purificadas (HDc: NS), células de HD estimuladas con IL-7 (HDc:IL-7), células de VP no estimuladas (VPc:NS), y células de HD activadas con PHA (HDc:PHA).
Las figuras 3a a 3e demuestran que la función de IL-7R está alterada en los microdominios de membrana de células T CD4 de VP.
(a) Se midieron las tasas de difusión eficaz bidimensional Def para IL-7Ralfa como se revela en la figura 7. También se midieron las tasas de difusión después de añadir diversos fármacos: COasa (31 pM, 30 min) más SMasa (2,7 pM, 5 min) (CO/SM), Col (10 pM, 30 min) más CitD (20 pM, 30 min) (CitD/Col), o en presencia de todos estos inhibidores (todos). Se estudiaron células T CD4 procedentes de HD (HDc) y VP (VPc), así como células T CD4 de HD activadas con PHA (HDc: PHA). Las barras indican PEE para 5 experimentos independientes. En la figura 8 se ofrecen más datos experimentales.
(b) Se realizó la fosforilación inducida por IL-7 y la translocación nuclear de STAT5 usando fosfo-STAT5 de conejo marcados con anti-Atto642 de conejo de cabra y se analizaron mediante microscopía de STED pulsada (cortes de 0,5 pm). Los experimentos implicaron a células T CD4 de HD no estimuladas purificadas (HDc: NS), células T CD4 de Hd estimuladas con IL-7 (HDc:IL-7), células T CD4 de VP no estimuladas (VPc:NS), y células T CD4 de VP estimuladas con IL-7 (VPc:IL-7), células T CD4 de HD activadas con PHA (HDc:PHA), y células T CD4 de HD activadas con PHA estimuladas con IL-7 (HDc:PHA/IL-7). En el panel izquierdo se muestran los efectos de la colchicina más citocalasina D.
(c, d, e) Después de la estimulación con IL-7, se midió la cinética de la aparición de fosfo-STAT5 en el citoplasma y la acumulación en el núcleo usando el programa informático ImageJ. (c) Células T CD4 de HD (línea negra) y células T CD4 de HD tratadas con Col más CitD (línea azul), (d) células T CD4 de VP (línea roja) y (e) células T CD4 de HD activadas con PHA (línea verde).
Las figuras 4a a 4d demuestran que el plasma procedente de VP induce un patrón de activación aberrante en células T CD4 de HD, según se mide mediante el número de MMD.
(a) Se muestran imágenes representativas de células T CD4 de HD tratadas con plasma (al 10%) procedente de pacientes VP (HDc: VPp), HIC (HDc: HICp) o ART (HDc: ARTp). Los MMD se tiñeron con la toxina del cólera (CtxB-AF488). Para cada grupo, se muestra la mitad superior de una célula T CD4 representativa procedente de imágenes de apilamiento en Z antes (izquierda) y después de una estimulación con IL-7 (2 nM, 15 min) (derecha).
(b) MMD inducidos en la superficie de células T CD4 (HDc) por plasmas (al 10%) procedentes de 5 VP diferentes (VPp1 a VPp5). Los resultados se obtuvieron del análisis de 50 células antes (blanco) y después (azul) de una estimulación con IL-7. Se muestran los cuartiles y los valores promedio.
(c) Comparación de los efectos de plasmas procedentes de HD (HDp), pacientes VP (VPp), HIC (HICp) y ART (ARTp) después (azul) y antes (blanco) de una estimulación con IL-7.
(d) Dosis (del 0,01% al 10%)-respuesta obtenida con los plasmas descritos en c. Se muestra el número de MMD inducidos en la superficie de células T CD4 HDc. El efecto del plasma de VP se muestra como una línea roja lisa. Las figuras 5a a 5d demuestran que el plasma procedente de VP inhibe la fosforilación de STAT5 inducida por IL-7 y la translocación nuclear de fosfo-STAT5 en linfocitos T CD4 de HD.
(a) Antes de la estimulación con IL-7, las células T CD4 de HD se preincubaron con plasma (al 10%). A la fosforilación inducida por IL-7 y la translocación nuclear de fosfo-STAT5 le siguió una microscopía de STED pulsada (cortes de 0,5 pm). Se estudiaron los siguientes plasmas (al 10%): control (HDc: NS), pacientes VP (HDc: VPp), HIC (HDc: HICp) y ART (HDc: ARTp).
(b) Análisis de fosfo-STAT5 recuperado en el citoplasma (azul) y núcleo (rojo) de células T CD4 de HD estimuladas con IL-7 pretratadas con plasmas procedentes de 5 VP diferentes (al 10%).
(c) Comparación de los efectos de la preincubación del plasma (al 10%) sobre células T CD4 de HD estimuladas con IL-7. El plasma procedía de HD (HDp), pacientes VP (VPp), HIC (HICp) y ART (ARTp)
(d) Dosis (0,01%-0%)-respuesta obtenida con los plasmas, medida mediante la inhibición de la translocación nuclear de fosfo-STAT5 en células T CD4 de HD estimuladas con IL-7. El efecto del plasma de VP se muestra como una línea roja lisa.
Las figuras 6a a 6d muestran la caracterización molecular del factor inductor del estado refractario ("Refractory state Inducing Factor", RIF) recuperado a partir de plasma de VP.
(a) Tratamiento de plasma de VP con tripsina, DNasa, RNasa y PNGasa. Se siguió la actividad RIF midiendo el número de MMD y los efectos sobre fosfo-STAT5 nuclear inducido por IL-7 en células T CD4 de HD.
(b) Se midió el PM de RIF mediante filtración en gel en una columna Sephadex G100. Se siguió la actividad RIF en células T CD4 de HD midiendo el número de MMD inducidos por las diferentes fracciones de la columna (curva roja gruesa). Cada fracción también se ensayó para la presencia de proteínas víricas mediante una transferencia por puntos usando anticuerpos policlonales procedentes de plasma de VP. Se ha restado el fondo obtenido con plasma de HD. Los experimentos se repitieron tres veces.
(c) También se midió el PM de RIF mediante filtración en gel en una columna Sephadex G100, y se siguió su actividad mediante la inhibición de fosfo-STAT5 inducido por IL-7, según se midió mediante FACS. Se registraron los porcentajes del máximo de fosfo-STAT5 inducido por IL-7. También se indica la cantidad de proteína en cada fracción. Los experimentos se repitieron dos veces.
(d) Se midió el punto isoeléctrico como sigue. El RIF eluido de la columna Sephadex G100 se cargó en una columna de intercambio aniónico (MonoQ) o catiónico (MonoS). La actividad de RIF se eluyó mediante tampones con pH graduado. Se representó gráficamente el número de MMD en células T CD4 de HD frente al pH.
Las figuras 7a a 7c muestran un análisis en gel bidimensional del señalosoma de IL-7 en células T CD4 procedentes de HD, VP y células HD estimuladas con IL-7. (a) Células T CD4 de HD no estimuladas ("non-stimulated", NS). (b) Células T CD4 de VP. (c) Células T CD4 de HD estimuladas con IL-7.
Las figuras 8a a muestran un análisis de la tasa de difusión de IL-7Ralfa en la superficie de células T CD4 purificadas procedentes de HD, VP y células HD estimuladas con PHA. (a, d) En la superficie de células T CD4 de HD, (b, e) en la superficie de células T CD4 de VP, (c, f) en la superficie de células T CD4 de HD preactivadas con PHA (1 pg/ml). (g) Esquema del mecanismo de la difusión de IL-7Ralfa introducidas en MMD antes y después de un tratamiento con inhibidores de MMD o inhibidores del citoesqueleto.
Las figuras 9a a 9d muestran una representación esquemática del modo de acción hipotético de RIF sobre células T CD4 de HD y el mecanismo de la falta de respuesta a IL-7. El RIF induce MMD anómalos que no son funcionales. Por tanto, el señalosoma de IL-7 se altera, y las células siguen sin responder a la citoquina, al igual que en las células T CD4 de VP. Los patrones de activación aberrante y los defectos de señalización en células T CD4 de HD inducidas por RIF y en células T CD4 de VP son indistinguibles. La parte izquierda del esquema ilustra las diferentes etapas en los mecanismos de la transducción de señales de IL-7 en HD (10, 12).
(a) En células T CD4 en reposo, antes del reconocimiento de IL-7, las cadenas de IL-7R están asociadas, pero sus dominios intracitoplásmicos están muy separados, y las moléculas de señalización Jak1 y Jak3 no están interactuando.
(b) En células T CD4 activadas con IL-7, el IL-7R se compartimentaliza en MMD normales (90 nm de diámetro) y el señalosoma se hace funcional. Después de la organización del citoesqueleto, STAT5A y STAT5B se fosforilan en contacto con los complejos de IL-7R/Jak1/Jak3, y después migran al núcleo moviéndose a lo largo de los microtúbulos, tal como se ha analizado previamente (12).
La parte derecha del esquema ilustra el mecanismo de acción hipotético de RIF. El mecanismo de acción propuesto se deriva de datos preliminares y la comparación de los defectos inducidos por RIF con las alteraciones caracterizadas en células T CD4 procedentes de VP (datos no publicados).
(c) El RIF induce muchos MMD grandes anómalos. Los IL-7R se introducen en MMD anómalos y se altera su capacidad para inducir un señalosoma funcional.
(d) Las células T CD4 de HD tratadas con RIF no responden a IL-7. Jak1 y Jak3 fosforilan a STAT5, aunque con cinética reducida, pero fosfo-STAT5 no migra al núcleo debido a la falta de organización del citoesqueleto y de los microtúbulos.
Los paneles a, b, c y d muestran imágenes de microscopía de STED de MMD marcados con CtxB: AF488 (la mitad de la pila del apilamiento en Z procedente de CW-STED). Los paneles b y d muestran tubulina teñida con antitubulina de conejo/anti-Atto642 de conejo de cabra, actina teñida con antiactina de ratón/anti-Chr494 de ratón de cabra, y fosfo-STAT5 teñido con anti-fosfo-STAT5 de conejo/anti-Atto642 de conejo de cabra. La microscopía de STED pulsada muestra un corte de 0,5 pm de células T CD4 permeabilizadas con metanol. Después de la estimulación con IL-7, la actina en el área citoplásmica de MMD de linfocitos T CD4 de HD tratados con RIF no se concentra en forma de almohadillas estructuradas y no forma una corteza que rodea al núcleo, a diferencia de lo que sucede en HD. Además, la tubulina en estas células T CD4 de HD tratada con RIF, al igual que en células T CD4 de VP, no forma microtúbulos, sobre los cuales se ha establecido la hipótesis de que son varillas cruciales que forman puentes entre el citoplasma y la membrana nuclear y, por tanto, son fundamentales para la translocación nuclear de STAT5.
Resumen de los defectos: Los números dentro de círculos 1, 2, 3 y 4 indican las diferentes etapas defectuosas relacionadas con el patrón de activación aberrante y la falta de respuesta a IL-7 en células T de HD tratadas con RIF: (1) patrón de proteínas anómalo de complejos de señalización, según se describe mediante geles bidimensionales, (2) estructuras de membrana anómalas, tales como MMD grandes, tal como puede observarse mediante microscopía de STED, (3) organización del citoesqueleto anómala, según se mide mediante cinética de difusión y microscopía de STED, y (4) intermedios de señalización anómalos e inhibición de la translocación nuclear de fosfo-STAT5, tal como se demuestran mediante microscopía de STED.
Figura 10: PLA2sGIB inhibe la translocación nuclear de PStat5 inducida por IL-2 en células T CD4 de donantes sanos ("healthy donors", HD): Células T CD4 en reposo purificadas a partir de 4 donantes sanos se trataron durante 30 minutos a 37 °C con 3% o 1% de plasma procedente de 5 VP (VP63, VP68, VP69, VP74 y VP75) y de 3 HD, usados como control. Cuando se indica, se estimularon con IL-2 2 nM durante 15 minutos a 37 °C. Se muestra el porcentaje de células positivas para PStat5 nuclear, con el promedio y la DE, en células T CD4 completas (a) y en células T CD4+ CD25+ (b), antes (puntos azules) y después de una estimulación con IL-2 (puntos rojos). Se observó la localización intracelular de PStat5 usando microscopía confocal de barrido de láser (LSM 700, Zeiss) después de una tinción indirecta con anti-PStat5 humano de conejo (pY694), seguido de anti-IgG-Die light 405 de conejo de burro. Las células T CD4 totales se tiñeron con anti-b-tubulina humana de cabra, seguido de anti-IgG-AF555 de cabra de burro. Las células T CD4 CD25+ se localizaron con anti-CD25 humana de ratón, seguido de anti-IgG-AF488 de ratón de burro.
Figura 11: PLA2sGIB inhibe la translocación nuclear de PStat6 inducida por IL-4 en células T CD4 de donantes sanos (HD): Células T CD4 en reposo purificadas a partir de 4 donantes sanos se trataron durante 30 minutos a 37 °C con 3% o 1% de plasma procedente de 5 VP (VP63, VP68, VP69, VP74 y VP75) y de 3 HD, usados como control. Cuando se indica, se estimularon con IL-4 2 nM durante 15 minutos a 37 °C. Se muestra el porcentaje de células positivas para PStat6 nuclear, con el promedio y la DE, en células T CD4 completas, antes (puntos azules) y después de una estimulación con IL-2 (puntos rojos). Se observó la localización intracelular de PStat6 usando microscopía confocal de barrido de láser (LSM 700, Zeiss) después de una tinción indirecta con anti-PStat6 humano de conejo (pY694), seguido de anti-IgG-AF488 de conejo de cabra. Las células T CD4 totales se tiñeron con anti-atubulina humana de ratón, seguido de anti-IgG-AF647 de ratón de cabra.
Figura 12: Ausencia de actividad de pPLA2GIB H48Q mutante.
Figura 13: Comparación de la actividad de PLA2 GIB porcino clonado de tipo salvaje y de su mutante H48Q. A: Inducción de microdominios de membrana anómalos ("abnormal Membrane Microdomains", aMMD); B: Efecto de la translocación nuclear inducida por IL-7 de fosfo-STAT5 (NT de pSTAT5).
La figura 14 muestra el tratamiento de plasma procedente de pacientes virémicos con anticuerpos anti-PLA2 GIB de cabra acoplados con esferas de Sepharose. Verde: VP68; rosa: VP69; azul: VP LJT. Después de un tratamiento (30 min a temperatura ambiente), los plasmas se ensayaron:
a. Se midió el porcentaje de células T CD4 que muestran MMD anómalos/célula después de una tinción con la toxina B del cólera (CtxB-AF488).
b. Se midió la translocación nuclear de pSTAT5 después de una estimulación con IL-7 y se contó el porcentaje de núcleos positivos.
Figura 15: Efecto de los anticuerpos anti-PLA2 GIB sobre la inducción de aMMD y la inhibición de NT pSTAT5. Figura 16: El receptor de PLA2G1B soluble de ratón (sMR) inhibe la actividad de PLA2G1B humano (huPLA2GlB) sobre la respuesta a IL-7 de células T CD4 procedentes de donantes sanos, expresado como el porcentaje de células positivas a la translocación nuclear de PStat5. El restablecimiento de la respuesta se calcula como:
100 x (% de células positivashuGIB+sMR - % de células positivashuGIB)/(% de células positivasmedio de cultivo - % de células positivashuGIB)
La figura 17 demuestra que el plasma procedente de pacientes que no responden a CD4 (CD4-NR) induce MMD aberrantes en células T CD4 de HD. (a) Imágenes de células T CD4 de HD tratadas con plasma (al 1%) procedente de un paciente CD4-NR obtenidas usando microscopía de iluminación estructurada ("Structured Illumination Microscopy", SIM). Los MMD se tiñeron con toxina B del cólera (CtxB-AF488). Se muestra una proyección de imágenes de apilamientos en Z de una célula T CD4 representativa. Después de la estimulación con IL-7 (2 nM, 15 min) no se produjo ninguna modificación de la imagen (derecha), (b) Curva de dosis-respuesta (del 0,0001% al 1%) obtenida con plasmas procedentes de 5 pacientes CD4-NR (curva azul, promedio y DE) y de un paciente virémico representativo (curva roja). El número de MMD anómalos inducidos en la superficie de células T CD4 de HD.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a composiciones y métodos para modular el sistema inmunológico en un sujeto que lo necesita. Más en concreto, la invención describe la identificación de GIBsPLA2 como factor endógeno clave de la respuesta inmunológica y proporciona nuevos métodos y composiciones terapéuticos y de diagnóstico basados en la modulación de este factor.
Una hipótesis de la presente invención es que la activación crónica del sistema inmunológico en pacientes infectados por VIH es anómala y conduce a las células T CD4 a un estado aberrante de activación/diferenciación que no responde a las citoquinas gamma-c implicadas en el control de muchos aspectos de las defensas inmunológicas y la homeostasis del compartimento de CD4, a pesar del hecho de que más del 99,5% de las células T CD4 procedentes del compartimento periférico no están infectadas. Esta hipótesis fue evaluada por los inventores, y la presente invención aclara la naturaleza y la importancia de este estado de activación aberrante.
De modo más específico, en un primer aspecto, la presente invención demuestra que las características de este estado pueden resumirse como sigue: 1) antes de cualquier estimulación, todas las células T CD4 en pacientes infectados por VIH virémicos (VP) poseen numerosos m Md grandes sobre su superficie, 2) estos MMD anómalos secuestran todas las cadenas IL-7Ralfa y gamma-c de las células, y 3) este secuestro de las cadenas en MMD anómalos altera su capacidad para inducir la formación de un señalosoma funcional, 4) esto conduce a un frenado y una reducción de la fosforilación de STAT5, y 5) una reducción de la importación nuclear de fosfo-STAT5. Este patrón anómalo de MMD preexistentes sobre la superficie de linfocitos T CD4 de VP tiene múltiples consecuencias y es un mecanismo básico que explica las diversas manifestaciones de la inmunodeficiencia en pacientes infectados por VIH. La pérdida de respuesta a IL-7 es un factor importante que explica parcialmente la linfopenia de CD4 observada. La pérdida persistente de estas células en VP (debido a su sensibilidad a la apoptosis y su destrucción por la proliferación a bajo nivel, pero continua, de virus) no puede compensarse a pesar de los mayores niveles de IL-7. Además, puesto que los MMD anómalos secuestran todas las cadenas gamma-c en un estado no funcional, esto bloquea la función de las otras citoquinas en esta familia.
La presente invención describe además la identificación del factor endógeno clave responsable de este estado anómalo del sistema inmunológico en sujetos infectados y, más en general, responsable de una drástica modulación de la respuesta inmunológica en diversos trastornos patofisiológicos. En efecto, las muestras de plasma procedentes de VP demostraron contener una actividad (denominada RIF) que es capaz de inducir una activación aberrante de linfocitos T CD4 de donantes sanos (HD). Se encontró RIF en todas las muestras de plasma de los VP examinados. La importancia patofisiológica de esta actividad se demuestran por su ausencia en pacientes controladores de VIH ("HIV Controller", HIC), en los que el sistema IL-7/IL-7R es normal y la activación inmunológica es beneficiosa. El RIF también está ausente del plasma de pacientes ART que tienen disminuida su activación inmunológica, una función de IL-7R restablecida y unos recuentos de CD4 recuperados > 500 / mm3 (5).
Por tanto, RIF representa un factor importante que controla la respuesta inmunológica, en particular a través de la modulación de los linfocitos T CD4. Resulta notable que RIF induce un patrón de activación aberrante en células T CD4 de HD que es indistinguible del observado directamente ex vivo en células T CD4 de VP purificadas. La invención también demuestra que RIF es la fosfolipasa A2 segregada del grupo I B ("PLA2 GIB"). Los resultados descritos en esta solicitud demuestran que (i) la sobreexpresión de PLA2 GIB conduce a una potente inmunosupresión, y que (ii) la inhibición de PLA2 GIB conduce a un notable aumento o estimulación de la función inmunológica. Los inhibidores de GIBsPLA2 fueron capaces de corregir el estado inapropiado de las células inmunológicas en plasma procedente de sujetos y, por tanto, pueden usarse para tratar (por ejemplo, prevenir, corregir) la inmunodeficiencia o los trastornos inmunológicos en mamíferos. La inhibición de GIBsPLA2 también puede inducir, estimular o ayudar a mantener los recuentos y la función de células T CD4 y, con ello, ayudar a estimular respuestas inmunológicas eficaces en pacientes. En particular, en pacientes infectados por VIH, puede no administrarse ART, o puede suspenderse, cuando se alcanza un equilibrio entre las defensas inmunológicas del paciente y el virus. Si existe ART, administrado en momentos muy tempranos después de la infección, tal como sugieren estudios recientes, y se combina con inhibidores de RIF, esto podría evitar cualquier alteración inducida por RIF del sistema inmunológico. Además, en el contexto de algunos fracasos actuales de ART, los pacientes con bajos recuentos de CD4 después de ART prolongada pueden beneficiarse de estos inhibidores. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para tratar un sujeto mediante la modulación de la expresión o actividad de GIBsPLA2 en el sujeto. Más en concreto, la invención proporciona un método para modular una respuesta inmunológica en un sujeto que lo necesita, que comprende modular la actividad o la expresión de GIBsPLA2 en dicho sujeto.
Los datos proporcionados en los ejemplos también demuestran que la presencia de RIF en el plasma de un sujeto indica el estado de patogénesis inducido por VIH de las células T CD4. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para controlar y/o diagnosticar una infección por VIH en un sujeto mediante la detección del nivel de RIF en el plasma del sujeto, entre otras cuestiones.
Los datos proporcionados en los ejemplos demuestran además que el número y/o el tamaño de los microdominios de membrana (MMD) en las células T de un sujeto indican el estado de patogénesis inducido por VIH de las células T CD4. Por consiguiente, esta descripción proporciona además métodos para controlar y/o diagnosticar una infección por VIH en un sujeto mediante la medición del número y/o tamaño de los microdominios de membrana (MMD) en las células T del sujeto, entre otras cuestiones.
Los datos proporcionados en los ejemplos también indican un papel del RIF en la creación y/o el mantenimiento del estado de enfermedad de células T CD4 en sujetos infectados por VIH. Por consiguiente, esta descripción proporciona además métodos para identificar un candidato a agente terapéutico para el VIH que incluyen medir la activación de células T CD4 inducida por RIF en presencia de un agente. En algunas realizaciones, los métodos comprenden comparar el nivel de activación de células T CD4 inducida por RIF en presencia del agente con el nivel de activación de células T CD4 inducida por RIF en ausencia del agente.
Definiciones
La expresión "identidad de secuencia", aplicada a secuencias de ácidos nucleicos o proteínas, se refiere a la cuantificación (normalmente, porcentaje) de correspondencias de nucleótidos o restos aminoácidos entre al menos dos secuencias alineadas usando un algoritmo estandarizado, tal como el alineamiento Smith-Waterman (Smith y Waterman (1981), J. Mol. Biol., 147:195-197), CLUSTALW (Thompson et al. (1994), Nucleic Acids Res., 22:4673-4680), o BLAST2 (Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). Puede emplearse BLAST2 de una manera estandarizada y reproducible para insertar huecos en una de las secuencias para optimizar el alineamiento y para lograr una comparación más significativa entre ellas.
Tal como se emplea en la presente, "tratamiento" o "tratar" se refiere a una intervención clínica para intentar alterar el desarrollo natural del individuo que se está tratando, y este puede realizarse con fines preventivos o curativos. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a evitar la aparición o la recurrencia de una enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevenir la metástasis, disminuir la velocidad de avance de la enfermedad, mejorar o paliar el estado de enfermedad, y la remisión o una mejor prognosis. En algunas realizaciones, las composiciones y los métodos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o un trastorno o para frenar el avance de una enfermedad o un trastorno.
El término "aislado", tal como se emplea en la presente, se refiere a moléculas (por ejemplo, ácidos nucleicos o aminoácidos) que se retiran de un componente de su entorno natural, se aíslan o se separan, y que están al menos 60% exentas, preferiblemente 75% exentas y lo más preferiblemente 90% exentas de otros componentes con los que están asociados en la naturaleza. Un polipéptido (o proteína) "aislado" es, por ejemplo, un polipéptido separado de un componente de su entorno natural y, preferiblemente, purificado hasta más del 90% o 95% de pureza según se determina, por ejemplo, mediante migración electroforética (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico ("isoelectric focusing", IEF), electroforesis capilar) o cromatográfica (por ejemplo, HPLC de fase inversa o de intercambio iónico). Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico separada de un componente de entorno natural y/o ensamblada en una construcción diferente (por ejemplo, un vector, módulo de expresión, hospedante recombinante, etc.).
Un "ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-GIBsPLA2" se refiere a una o más moléculas de ácidos nucleicos que codifican cadenas pesadas y ligeras (o sus fragmentos), incluyendo dichas una o más moléculas de ácidos nucleicos en un único vector o en vectores distintos y dichas una o más moléculas de ácidos nucleicos presentes en una o más localizaciones en una célula hospedante.
Un "sujeto" se refiere a un mamífero. Los ejemplos de mamíferos incluyen seres humanos y animales no humanos, tales como, sin limitación, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates no humanos (tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas).
La 'modulación de una respuesta inmunológica" indica, dentro del contexto de la invención, cualquier modificación de la cantidad o la actividad o la proporción de células inmunológicas, preferiblemente leucocitos (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, NK, células NKT, macrófagos, células dendríticas). En una realización particular, la modulación de una respuesta inmunológica incluye la modulación de la cantidad o la actividad de linfocitos T, preferiblemente linfocitos T CD4.
Factor inductor del estado refractario (RIF) o fosfolipasa A2 del grupo IB
El término RIF se usa de modo intercambiable con fosfolipasa A2 del grupo IB, GIBsPLA2 (o PLA2 GIB). La fosfolipasa A2 del grupo IB es una proteína segregada que tiene un PM de aproximadamente 15 kDa y un punto isoeléctrico de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,0.
Dentro del contexto de la presente invención, el término "GIBsPLA2" o la expresión "fosfolipasa A2 del grupo IB" indica cualquier proteína de GIBsPLA2 nativa procedente de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos, tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique lo contrario. El término incluye GIBsPLA2 no procesada "de longitud completa", así como cualquier forma de GIBsPLA2 que surge del procesamiento dentro o fuera de una célula. El término también incluye los variantes naturales de GIBsPLA2, por ejemplo, variantes de corte y empalme o variantes alélicos.
A continuación, se muestra la secuencia de aminoácidos de un ejemplo de GIBsPLA2 humana (SEQ ID NO:2).
MKLLVLAVLL TVAAADSGIS PRAVWQFRKM IKCVIPGSDP FLEYNNYGCY
CGLGGSGTPV DELDKCCQTH DNCYDQAKKL DSCKFLLDNP YTHTYSYSCS
GSAITCSSKN KECEAFICNC DRNAAICFSK APYNKAHKNL DTKKYCQS
Los aminoácidos 1 a 15 de SEQ ID NO:2 (subrayados) son una secuencia señal, y los aminoácidos 16 a 22 de SEQ ID NO:2 (en negrita) son una secuencia de propéptido. La proteína madura se corresponde con los restos aminoácidos 23-148 de SEQ ID NO:2, que es un ejemplo de proteína de GIBsPLA2 humana procesada.
Los variantes naturales incluyen cualquier proteína que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2, o la secuencia de los restos aminoácidos 23-148 de SEQ ID NO:2, con una o más de sustituciones, adiciones y/o deleciones de uno o varios restos aminoácidos (generalmente, 1, 2 o 3), preferiblemente no más de 10 sustituciones, adiciones y/o deleciones diferentes de uno o varios (generalmente, 1, 2 o 3) restos aminoácidos. Los variantes naturales típicos conservan una actividad biológica de SEQ ID NO:2.
A este respecto, en algunas realizaciones, GIBsPLA2 presenta al menos una actividad seleccionada de la inducción de la formación de microdominios de membrana (MMD) en células T CD4 procedentes de sujetos sanos, o hacer que las células T CD4 de sujetos sanos sean refractarias a la señalización de interleuquinas, tales como refractarias a la señalización de IL-2 o refractarias a la señalización de IL-7.
En algunas realizaciones, la inducción de la formación de MMD comprende aumentar el número de MMD en células T CD4 de sujetos sanos hasta al menos aproximadamente 80 por célula, al menos aproximadamente 90 por célula, al menos aproximadamente 100 por célula, al menos aproximadamente 110 por célula, o al menos aproximadamente 120 por célula. En una realización preferida no limitante, la inducción de la formación de MMD comprende aumentar el número de MMD en células T CD4 de sujetos sanos hasta más de 100 MMD por célula.
En algunas realizaciones, la inducción de la formación de MMD comprende estimular la formación de MMD más grandes que los que estarían presentes de otro modo sobre las células T CD4. En algunas realizaciones, la inducción de la formación de MMD más grandes comprende estimular la formación de MMD que tienen un diámetro de al menos 100 nm, al menos 110 nm, al menos 120 nm, al menos 130 nm, o al menos 140 nm. En una realización preferida no limitante, la inducción de la formación de MMD más grandes comprende estimular la formación de MMD con un diámetro mayor que 120 nm.
En algunas realizaciones, hacer que las células T CD4 de sujetos sanos sean refractarias a la señalización de interleuquina-7 comprende una reducción de la fosforilación de STAT5A y/o B en dichas células en al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, o al menos aproximadamente 40%. En algunas realizaciones, hacer que las células T CD4 de sujetos sanos sean refractarias a la señalización de interleuquina-7 comprende reducir la tasa de translocación nuclear de fosfo-STAT5A y/o fosfo-STAT5B en al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, o al menos aproximadamente 50%.
La actividad GIBsPLA2 puede medirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, tal como se ilustra en los ejemplos o desarrollado después. La actividad GIBsPLA2 puede medirse en una muestra de plasma, tal como, por ejemplo, una muestra de plasma fraccionada, usando, por ejemplo, ensayos de reclutamiento de ligandos, inmunoensayos y/o ensayos enzimáticos.
En una realización particular, el término GIBsPLA2 indica una proteína humana, en particular una proteína que comprende SEQ ID NO:2, o uno de sus variantes naturales.
La GIBsPLA2 según esta descripción puede estar aislada, purificada y/o ser recombinante. En ciertas realizaciones, la invención puede usar, en lugar de una proteína de GIBsPLA2 o además de esta, un ácido nucleico que codifica GIBsPLA2. El ácido nucleico puede ser ADN o ARN, monocatenario o bicatenario.
Un ejemplo de secuencia de ácido nucleico que codifica GIBsPLA2 se muestra en SEQ ID NO:1, a continuación. ATGAAACTCCTTGTGCTAGCTGTGCTGCTCACAGTGGCCGCCGCCGACAGCGGCATCAGC CCTCGGGCCGTGTGGCAGTTCCGCAAAATGATCAAGTGCGTGATCCCGGGGAGTGACCCC TTCTTGGAATACAACAACTACGGCTGCTACTGTGGCTTGGGGGGCTCAGGCACCCCCGTG GATGAACTGGACAAGTGCTGCCAGACACATGACAACTGCTACGACCAGGCCAAGAAGCTG GACAGCTGTAAATTTCTGCTGGACAACCCGTACACCCACACCTATTCATACTCGTGCTCT GGCTCGGCAATCACCTGTAGCAGCAAAAACAAAGAGTGTGAGGCCTTCATTTGCAACTGC
GACCGCAACGCTGCCATCTGCTTTTCAAAAGCTCCATATAACAAGGCACACAAGAACCTG GACACCAAGAAGTATTGTCAGAGTTGA
Otras moléculas de ácidos nucleicos que codifican una GIBsPLA2 incluyen cualquier variante de SEQ ID NO:1 que surge de la degeneración del código genético, así como cualquier secuencia que se hibrida con SEQ ID NO:1 bajo condiciones rigurosas, más preferiblemente que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1, y que codifica una proteína de GIBsPLA2.
Método de producción de GIBsPLA2
La GIBsPLA2 puede producirse mediante cualquier método de expresión de proteínas y método de purificación conocidos convencionalmente. Por ejemplo: (i) un método para sintetizar péptidos; (ii) un método para purificarlos y aislarlos a partir del cuerpo vivo o de células cultivadas; o (iii) un método para producirlos con el uso de técnicas de recombinación genética; y sus combinaciones y similares (por ejemplo, las técnicas convencionales descritas, por ejemplo, en Molecular Cloning (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1989), y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M., John Wiley and Sons, Inc. (1989)).
En una realización particular, la invención se refiere a un método para producir GIBsPLA2 mediante la expresión de un ácido nucleico codificador en una célula hospedante, y la recolección o purificación de la GIBsPLA2. A este respecto, la invención también describe células hospedantes recombinantes que comprenden un ácido nucleico que codifica una GIBsPLA2. Estas células pueden ser procariotas (tales como bacterias) o eucariotas (tales como células de levadura, células de insecto, células vegetales o células de mamífero). El ácido nucleico puede colocarse bajo el control de cualquier secuencia reguladora adecuada, tal como un promotor, un terminador y similares. Como alternativa, el ácido nucleico puede insertarse en la célula hospedante en una localización en la que la expresión es dirigida por un promotor endógeno. Las técnicas para insertar ácidos nucleicos en células son muy conocidas en la técnica.
Modulación de GIBsPLA2
La invención proporciona nuevos métodos que comprenden la modulación de GIBsPLA2 en un sujeto que lo necesita. El término "modulación" indica cualquier modificación del nivel (por ejemplo, expresión) o actividad de GIBsPLA2 en un sujeto. Además, la modulación indica un aumento o una disminución de la actividad o nivel GIBsPLA2. Más preferiblemente, la modulación indica un cambio en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más, comparado con una situación no modulada. Como resultado, la inhibición de GIBsPLA2 indica reducir en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más la actividad o el nivel de GIBsPLA2, así como bloquear o suprimir completamente la actividad o el nivel de GIBsPLA2. A la inversa, la estimulación de GIBsPLA2 indica aumentar en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más la actividad o el nivel de GIBsPLA2. Dependiendo de la situación, la modulación puede ser transitoria, sostenida o permanente. Además, la modulación de la actividad incluye modular la cantidad de GIBsPLA2 en el sujeto, en particular en fluidos corporales, modular la potencia de la proteína (por ejemplo, mediante la modulación del nivel de cofactores o del sustrato en el sujeto), y modular la actividad o el nivel de los productos de degradación producidos por GIBsPLA2.
Inhibición de GIBsPLA2
En una realización particular, la invención proporciona composiciones y métodos para inhibir GIBsPLA2 en un sujeto. La inhibición de GIBsPLA2 puede obtenerse mediante el uso de inhibidores de GIBsPLA2, es decir, cualquier compuesto que inhiba la expresión o la actividad de GIBsPLA2. Los inhibidores de GIBsPLA2 incluyen inhibidores de la expresión, antagonistas, secuestradores, o compuestos que enmascaran la diana. Los tipos de inhibidores de GIBsPLA2 preferidos incluyen ligandos de GIBsPLA2 (covalentes o no covalentes), anticuerpos anti-GIBsPLA2 (y sus fragmentos y derivados), ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-GIBsPLA2 (o sus fragmentos y derivados), ácidos nucleicos inhibidores, péptidos, o fármacos pequeños, o sus combinaciones. Como alternativa, o además, la inhibición de GIBsPLA2 puede obtenerse vacunando un sujeto contra un antígeno de GIBsPLA2, de modo que son producidos anticuerpos por el sujeto que necesita una inhibición de PLA2-GIB.
Anticuerpos contra GIBsPLA2
Los ejemplos específicos de inhibidores GIBsPLA2 son anticuerpos que se unen específicamente a GIBsPLA2. Los anticuerpos pueden ser sintéticos, monoclonales o policlonales, y pueden prepararse mediante técnicas muy conocidas en la técnica. Estos anticuerpos se unen específicamente a través de sitios de unión al antígeno del anticuerpo (en oposición a la unión no específica). Los polipéptidos, fragmentos, variantes, proteínas de fusión, etc., de GIBsPLA2 pueden emplearse como inmunógenos en la producción de anticuerpos que inmunorreaccionan con ellos. De modo más específico, los polipéptidos, fragmentos, variantes, proteínas de fusión, etc., contienen determinantes antigénico o epitopos que suscitan la formación de anticuerpos.
Estos determinantes antigénicos o epitopos puede ser lineales o conformacionales (discontinuos). Los epitopos lineales están compuestos de una única sección de aminoácidos del polipéptido, mientras que los epitopos conformacionales o discontinuos están compuestos de secciones de aminoácidos procedentes de diferentes regiones de la cadena del polipéptido que se aproximan tras el plegamiento de la proteína (C. A. Janeway, Jr. y P. Travers, Immuno Biology, 3:9 (Garland Publishing Inc., 2a ed., 1996)). Debido a que las proteínas plegadas tienen superficies complejas, el número de epitopos disponibles es bastante numeroso; sin embargo, debido a la conformación de la proteína y a impedimentos estéricos, el número de anticuerpos que realmente se unen a los epitopos es menor que el número de epitopos disponibles (C. A. Janeway, Jr. y P. Travers, Immuno Biology 2:14 (Garland Publishing Inc., 2a ed., 1996)). Los epitopos pueden identificarse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Pueden prepararse anticuerpos policlonales y monoclonales mediante técnicas convencionales.
Los anticuerpos preferidos de la invención se dirigen a un epitopo de GIBsPLA2 y/o se han generado mediante inmunización con un polipéptido que comprende un epitopo de GIBsPLA2 seleccionado de: la proteína de GIBsPLA2 madura, un fragmento de GIBsPLA2 que comprende al menos 8 restos aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:2 (o los correspondientes restos de un variante natural de SEQ ID NO:2), y dicho fragmento comprende al menos el aminoácido 70, el aminoácido 121, el aminoácido 50, el aminoácido 52, el aminoácido 54, el aminoácido 71, o una de sus combinaciones. Los anticuerpos de la invención preferidos se unen a un epitopo comprendido entre los restos aminoácidos 50-71 de SEQ ID NO:2 o los correspondientes restos de un variante natural de SEQ ID NO:2. El término "anticuerpos" pretende incluir anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, sus fragmentos, tales como fragmentos F(ab')2 y Fab, fragmentos variables monocatenarios (scFv), fragmentos de anticuerpos de dominio único (VHH o nanocuerpos), fragmentos de anticuerpos bivalentes (diacuerpos), así como cualquier compañero de unión producido de modo recombinante y sintético, anticuerpos humanos o anticuerpos humanizados.
Los anticuerpos se definen como de unión específica preferiblemente si se unen a GIBsPLA2 con una Ka mayor o igual a aproximadamente 107 M-1. Las afinidades de los anticuerpos pueden determinarse con facilidad usando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas en Scatchard et al., Ann. NYAcad. Sci., 51:660 (1949).
Los anticuerpos policlonales pueden generarse con facilidad a partir de una diversidad de fuentes, por ejemplo, caballos, vacas, burros, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones o ratas, usando procedimientos muy conocidos en la técnica. En general, la GIBsPLA2 purificada o un péptido basado en la secuencia de aminoácidos de GIBsPLA2 que está conjugado de modo apropiado se administra al animal hospedante generalmente a través de una inyección parenteral. La inmunogenicidad de GIBsPLA2 puede potenciarse mediante el uso de un adyuvante, por ejemplo, adyuvante completo o incompleto de Freund. Después de administrar inmunizaciones de refuerzo, se recogen pequeñas muestras de suero y se ensayan para la reactividad con el polipéptido de GIBsPLA2. Los ejemplos de diversos ensayos útiles para dicha determinación incluyen los descritos en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; así como procedimientos, tales como la inmunoelectroforesis a contracorriente ("countercurrent immuno-electrophoresis", CIEP), radioinmunoensayos, radioinmunoprecipitación, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), ensayos de transferencia por puntos y ensayos de sándwich. Véanse las patentes de EE. UU. n.os 4.376.110 y 4.486.530.
Pueden prepararse con facilidad anticuerpos monoclonales usando procedimientos muy conocidos. Véanse, por ejemplo, los procedimientos descritos en las patentes de EE. UU. n.os Re 32.011,4.902.614, 4.543.439, y 4.411.993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKeam y Bechtol (eds.), 1980.
Por ejemplo, los animales hospedantes, tales como ratones, pueden ser inyectados por vía intraperitoneal al menos una vez, y preferiblemente al menos dos veces a intervalos de aproximadamente 3 semanas, con una proteína de GIBsPLA2 mutante o de tipo salvaje aislada y purificada o un péptido de GIBsPLA2 conjugado, opcionalmente en presencia de un adyuvante. Después se ensayan los sueros de los ratones mediante una técnica de transferencia por puntos o de captura de anticuerpos (ABC) convencional para determinar el animal que es el mejor para fusionar. Aproximadamente dos a tres semanas más tarde, los ratones reciben un refuerzo intravenoso de proteína o péptido. Después los ratones se sacrifican, y las células del bazo se fusionan con células de mieloma disponibles en el mercado, tales como Ag8.653 (ATCC), siguiendo protocolos establecidos. Brevemente, las células de mieloma se lavan varias veces en medio y se fusionan con células de bazo de ratón a una proporción de aproximadamente tres células de bazo a una célula de mieloma. El agente de fusión puede ser cualquier agente adecuado que se emplea en la técnica, por ejemplo, polietilenglicol (PEG). La fusión se cultiva en placas que contienen un medio que permita el crecimiento selectivo de las células fusionadas. Después se deja que las células fusionadas crezcan durante aproximadamente ocho días. Se recogen los sobrenadantes de los hibridomas resultantes y se añaden a una placa que se ha revestido en primer lugar con anti-Ig de ratón de cabra. Después de unos lavados, se añade un marcador, tal como un polipéptido de GIBsPLA2 marcado, a cada pocillo, seguido de una incubación. Posteriormente pueden detectarse los pocillos positivos. Los clones positivos pueden cultivarse en un cultivo en masa y después los sobrenadantes se purifican en una columna de proteína A (Pharmacia).
Los anticuerpos monoclonales de la descripción pueden producirse usando técnicas alternativas, tales como las descritas en Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology, 3:1-9 (1990). De modo similar, pueden construirse compañeros de unión usando técnicas de ADN recombinante para incorporar las regiones variables de un gen que codifica un anticuerpo de unión específica. Esta técnica se describe en Larrick et al., Biotechnology, 7:394 (1989).
Los fragmentos de unión al antígeno de dichos anticuerpos, que pueden producirse mediante técnicas convencionales, también se incluyen en la presente invención. Los ejemplos de dichos fragmentos incluyen, pero no se limitan a fragmentos Fab y F(ab')2. También se proporcionan fragmentos de anticuerpos y derivados producidos mediante técnicas de ingeniería genética.
Los anticuerpos monoclonales de la presente descripción incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales murinos. Estos anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante técnicas conocidas y ofrecen la ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos se administran a seres humanos. En una realización, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo murino (o solo su sitio de unión al antígeno) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Como alternativa, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de región variable (que carece del sitio de unión al antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales quiméricos y posteriormente modificados incluyen los descritos en Riechmann et al. (Nature, 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS, 84:3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology, 7:934, 1989), y Winter y Harris (TIPS, 14:139, mayo de 1993). Pueden encontrarse procedimientos para generar anticuerpos de modo transgénico en el documento GB 2.272.440, y las patentes de EE. UU. n os 5.569.825 y 5.545.806.
Pueden usarse anticuerpos producidos mediante métodos de ingeniería genética, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden porciones humanas y no humanas, que pueden prepararse empleando técnicas de ADN recombinante convencionales. Estos anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse mediante ingeniería genética utilizando técnicas de ADN convencionales conocidas en la técnica, por ejemplo, usando los métodos descritos en Robinson et al., publicación internacional n.° WO 87/02671; Akira, et al., solicitud de patente europea 0184187; Taniguchi, M., solicitud de patente europea 0171496; Morrison et al., solicitud de patente europea 0173494; Neuberger et al., publicación internacional PCT n.° WO 86/01533; Cabilly et al., patente de EE. UU. n.° 4.816.567; Cabilly et al., solicitud de patente europea 0125023; Better et al., Science, 240:1041-1043, 1988; Liu et al., PNAS, 84:3439-3443, 1987; Liu et al., J. Immunol., 139:3521 3526, 1987; Sun et al., PNAS, 84:214 218, 1987; Nishimura et al., Canc. Res., 47:999-1005, 1987; Wood et al., Nature, 314:446-449, 1985; y Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst., 80:1553-1559, 1988); Morrison, S. L., Science, 229:1202-1207, 1985; Oi et al., BioTechniques, 4:214, 1986; Winter, patente de EE. UU. n.° 5.225.539; Jones et al., Nature, 321:552-525, 1986; Verhoeyan et al., Science, 239:1534, 1988; y Beidler et al., J. Immunol., 141:4053-4060, 1988.
En conexión con los anticuerpos sintéticos y semisintéticos, estas expresiones pretenden cubrir, pero no se limitan a fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de isotipo cambiado, anticuerpos humanizados (por ejemplo, ratón-humano, humano-ratón), híbridos, anticuerpos que tienen varias especificidades, y moléculas similares a anticuerpos totalmente sintéticas.
Para aplicaciones terapéuticas, a menudo se prefieren los anticuerpos monoclonales "humanos" que tienen regiones constantes y variables, para minimizar la respuesta inmunológica de un paciente frente al anticuerpo. Estos anticuerpos pueden generarse inmunizando animales transgénicos que contienen genes de inmunoglobulina humanos. Véase, Jakobovits et al., Ann. NY Acad. Sci., 764:525-535 (1995).
También pueden prepararse anticuerpos monoclonales humanos contra polipéptidos de GIBsPLA2 construyendo un banco de inmunoglobulinas combinatorio, tal como un banco de presentación de fagos de Fab o un banco de presentación de fagos de scFv, usando ADNc de cadenas pesadas y cadenas ligeras de inmunoglobulinas preparadas a partir de un ARNm derivado de los linfocitos de un sujeto. Véase, por ejemplo, McCafferty et al., publicación PCT WO 92/01047; Marks et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581-597; y Griffths et al. (1993), EMBO J., 12:725-734. Además, puede generarse un banco combinatorio de regiones variables de anticuerpos mutando un anticuerpo humano conocido. Por ejemplo, puede mutarse una región variable de un anticuerpo humano conocido por unirse a GIBsPLA2, por ejemplo, usando oligonucleótidos mutagenizados alterados aleatoriamente, para generar un banco de regiones variables mutadas que después puede seleccionarse para la unión a GIBsPLA2. Pueden encontrarse métodos para inducir una mutagénesis aleatoria dentro de las regiones CDR de cadenas pesadas y/o ligeras de inmunoglobulina, métodos para cruzar cadenas pesadas y ligeras aleatorizadas para formar parejas, y métodos de selección, por ejemplo, en Barbas et al., publicación PCT WO 96/07754; Barbas et al. (1992), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 89:4457-4461.
Un banco de inmunoglobulina puede ser expresado por una población de paquetes de presentación, preferiblemente derivados de fagos filamentosos, para formar un banco de presentación de anticuerpos. Pueden encontrarse ejemplos de métodos y reactivos particularmente adecuados para su uso en la generación de bancos de presentación de anticuerpos, por ejemplo, en Ladner et al., patente de EE. UU. n.° 5.223.409; Kang et al., publicación PCT WO 92/18619; Dower et al., publicación PCT WO 91/17271; Winter et al., publicación PCT WO 92/20791; Markland et al., publicación PCT w O 92/15679; Breitling et al., publicación PCT w O 93/01288; McCafferty et al., publicación PCT w O 92/01047; Garrard et al., publicación PCT w O 92/09690; Ladner et al., publicación PCT WO 90/02809; Fuchs et al. (1991), Bio/Technology, 9:1370-1372; Hay et al. (1992), Hum. Antibod. Hybridomas, 3:81-85; Huse et al. (1989), Science, 246:1275-1281; Griffths et al. (1993), supra; Hawkins et al. (1992), J. Mol. Biol., 226:889-896; Clackson et al. (1991), Nature, 352:624-628; Gram et al. (1992), PNAS, 89:3576-3580; Garrad et al. (1991), Bio/Technology, 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991), Nuc. Acid Res., 19:4133-4137; y Barbas et al. (1991), PNAS, 88:7978-7982. Tras haber sido presentado sobre la superficie de un paquete de presentación (por ejemplo, un fago filamentoso), el banco de anticuerpos se selecciona para identificar y aislar los paquetes que expresan un anticuerpo que se une a un polipéptido de GIBsPLA2. En una realización preferida, la selección principal del banco implica una inmunoadsorción con un polipéptido de GIBsPLA2 inmovilizado, y se seleccionan los paquetes de presentación que expresan anticuerpos que se unen al polipéptido de GIBsPLA2 inmovilizado.
En una realización particular, la invención se refiere a una composición que comprende un anticuerpo anti-GIBsPLA2 (o uno de sus fragmentos o derivados) y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los anticuerpos monoclonales anti-fosfolipasa A2-GIB existentes incluyen Mab CH-7 (Labome), MAB5018 (Labome), EPR5186 (Genetex); LS-C138332 (Lifespan) o CABT-17153MH (Creative Biomart). Los ejemplos de anticuerpos policlonales incluyen, por ejemplo, N1C3, de GeneTex. Tal como se indicó anteriormente, los anticuerpos anti-GIBsPLA2 de la invención preferidos se unen a GIBsPLA2 madura, aún más preferiblemente a un epitopo comprendido en un dominio de GIBsPLA2 que comprende un aminoácido seleccionado del aminoácido 70, aminoácido 121, aminoácido 50, aminoácido 52, aminoácido 54, aminoácido 71, o sus combinaciones. Los anticuerpos de la invención preferidos se unen a un epitopo comprendido entre los restos aminoácidos 50-71 de SEQ ID NO:2 o los correspondientes restos de un variante natural de SEQ ID NO:2.
En una realización alternativa, la invención se refiere y usa una composición que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-GIBsPLA2 (o uno de sus fragmentos o derivados) y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Ácidos nucleicos inhibidores
La invención también describe ácidos nucleicos inhibidores, es decir, moléculas de ácidos nucleicos que inhiben el gen o la expresión de proteínas de GIBsPLA2. Los ejemplos de ácidos nucleicos inhibidores incluyen ácidos nucleicos antisentido, ARN de interferencia cortos (ARNic), ARN de horquilla pequeños (ARNhp), microARN, aptámeros o ribozimas. En una realización particular, el ácido nucleico inhibidor es un ARN de interferencia pequeño que evita la traducción del ARNm de GIBsPLA2. En otra realización particular, el ácido nucleico inhibidor es un oligonucleótido antisentido que evita la traducción del ARNm de GIBsPLA2. En otra realización particular, el ácido nucleico inhibidor es un ARN de horquilla pequeño que evita la traducción del ARNm de GIBsPLA2.
El ARNip comprende una secuencia de ácido nucleico sentido y una secuencia de ácido nucleico antisentido del polinucleótido de interés. Los ARNip se construyen de tal modo que un único transcrito (ARN bicatenario) tiene la secuencia sentido y antisentido complementaria del gen diana. La secuencia de nucleótidos de los ARNip puede diseñarse usando un programa informático de diseño de ARNip disponible, por ejemplo, en el sitio web de Ambion en la red mundial.
En algunas realizaciones, la longitud del oligonucleótido antisentido o ARNip es menor o igual a 10 nucleótidos. En algunas realizaciones, la longitud del oligonucleótido antisentido o ARNip es tan extensa como el transcrito natural. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido y ARNip tienen 18-30 nucleótidos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido y ARNip tienen una longitud menor que 25 nucleótidos.
Las moléculas de ácidos nucleicos inhibidores ilustrativas comprenden un dominio que tiene una secuencia de nucleótidos que es perfectamente complementaria con una región de un gen o ARN de GIBsPLA2. Este dominio contiene generalmente de 4 a 20 nucleótidos, que permite una hibridación específica y una inhibición óptima de la transcripción del gen o la traducción del ARN. La secuencia de los ácidos nucleicos inhibidores puede derivarse directamente de la secuencia de un gen que codifica GIBsPLA2, tal como SEQ ID NO:1. Como alternativa, o además, los ácidos nucleicos inhibidores pueden hibridarse con un elemento regulador en un gen o ARN de GIBsPLA2, tal como un promotor, un sitio de corte y empalme, y evitar su regulación eficaz.
Los ejemplos específicos de moléculas de ácidos nucleicos inhibidores descritas en la presente invención incluyen moléculas de ácidos nucleicos monocatenarios aisladas que consisten en 10 a 50 nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO:1. Los ejemplos específicos de moléculas de ácidos nucleicos inhibidores son ácidos nucleicos antisentido que consisten en la siguiente secuencia de nucleótidos, o su hebra perfectamente complementaria:
ATGAAACTCCTTGTGCTAG (SEQ ID NO: 3)
ACAGCGGCATCAGC (SEQ ID NO: 4)
TTCCGCAAAATGATCAA (SEQ ID NO: 5)
CCCGGGGAGTGACCCC (SEQ ID NO: 6)
TACGGCTGCTACTGTGGCTT (SEQ ID NO: 7)
GACACATGACAACTGCTACGACC (SEQ ID NO: 8)
ACCCACACCTATTCATACTCGT (SEQ ID NO: 9)
ATCACCTGTAGCAGCA (SEQ ID NO: 10)
AGCTCCATATAACAAGGCA (SEQ ID NO: 11)
CAAGAAGTATTGTCAGAG (SEQ ID NO: 12)
Péptidos y fármacos pequeños
La invención también describe un péptido o un fármaco pequeño que inhibe la actividad de GIBsPLA2. El péptido o el fármaco pequeño generalmente es una molécula que se une selectivamente a GIBsPLA2, o a un sustrato de GIBsPLA2, o a un cofactor de GIBsPLA2, o a un producto de degradación o metabolito de la vía de GIBsPLA2.
Los péptidos preferiblemente contienen de 3 a 20 restos aminoácidos, y su secuencia puede ser idéntica a un dominio de GIBsPLA2 (péptido de cebo) o a un dominio de un sustrato de GIBsPLA2, cofactor, producto de degradación o metabolito. Los ejemplos de péptidos contienen de 4 a 30 restos aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:2 (o de una correspondiente secuencia de un variante natural de SEQ ID NO:2). Los péptidos más concretos comprenden de 5 a 25 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:2 (o de una correspondiente secuencia de un variante natural de SEQ ID NO:2), y comprenden además al menos uno de los siguientes restos aminoácidos de SEQ ID NO:2 (o de una correspondiente secuencia de un variante natural de SEQ ID NO:2): aminoácido 70, aminoácido 121, aminoácido 50, aminoácido 52, aminoácido 54, aminoácido 71, o sus combinaciones. Los ejemplos específicos de péptidos son péptidos con menos de 25 aminoácidos que comprenden cualquiera de las siguientes secuencias:
NNYGCY (SEQ ID NO: 13)
CYCGLG (SEQ ID NO: 14)
YNNYGCYCGLGGSG (SEQ ID NO: 15)
FLEYNNYGCYCGLGGSGTPV (SEQ ID NO: 16)
QTHDN (SEQ ID NO: 17)
CQTHDNC (SEQ ID NO: 18)
ECEAFICNC (SEQ ID NO: 19)
DRNAAI (SEQ ID NO: 20)
DRNAAICFSKAPYNKAHKNL (SEQ ID NO: 21)
Los péptidos pueden comprender enlaces peptídicos, no peptídicos y/o peptídicos modificados. En una realización particular, los péptidos comprende al menos un enlace peptidomimético seleccionado de la intercalación de un grupo metileno (-CH2-) o fosfato (-PO2-), amina secundaria (-NH-) u oxígeno (-O-), alfa-azapéptidos, alfa-alquilpéptidos, N-alquilpéptidos, fosfonamidatos, depsipéptidos, hidroximetilenos, hidroxietilenos, dihidroxietilenos, hidroxietilaminas, péptidos retro-inversos, metilenoxi, cetometileno, ésteres, fosfinatos, fosfínicos o fosfonamidas. Además, los péptidos comprenden una función N-terminal y/o C-terminal protegida, por ejemplo, mediante acilación y/o amidación y/o esterificación.
Los péptidos pueden producirse mediante técnicas conocidas per se en la técnica, tales como síntesis química, biológica y/o genética.
Los fármacos pequeños preferidos son compuestos de hidrocarburos que se unen selectivamente a GIBsPLA2.
Los fármacos pequeños y los péptidos se obtienen preferiblemente mediante un método que comprende: (i) poner en contacto un compuesto de ensayo con GIBsPLA2, o uno de sus fragmentos, (ii) seleccionar un compuesto de ensayo que se une a GIBsPLA2, o a dicho uno de sus fragmentos, y (iii) seleccionar un compuesto de (ii) que inhibe una actividad de GIBsPLA2.
Los fármacos pequeños y los péptidos también pueden obtenerse mediante un método que comprende: (i) poner en contacto un compuesto de ensayo con un sustrato GIBsPLA2, cofactor o producto de degradación de GIBsPLA2, o uno de sus fragmentos, (ii) seleccionar un compuesto de ensayo que se une a dicho sustrato, cofactor o producto de degradación, o a uno de sus fragmentos, y (iii) seleccionar un compuesto de (ii) que inhibe una actividad de GIBsPLA2.
Receptores solubles de GIBsPLA2
En una realización alternativa, el inhibidor de GIBsPLA2 es una forma soluble de un receptor de GIBsPLA2. Dichos compuestos de receptores solubles son capaces de unirse a GIBsPLA2, inhibiendo con ello su actividad actuando como cebo o agente de enmascaramiento.
Una realización específica de dichos inhibidores es una forma soluble de un receptor de GIBsPLA2 humano o murino, o uno de sus fragmentos de unión a GIBsPLA2.
Las secuencias de aminoácidos de los receptores solubles murinos y humanos se muestran en SEQ ID NO:22 y 23, respectivamente. Por tanto, la expresión receptor soluble incluye cualquier polipéptido que se une a GIBsPLA2 que comprende la secuencia completa o un fragmento de SEQ ID NO:22 o 23.
Un fragmento de unión a GIBsPLA2 indica cualquier fragmento de dicho polipéptido que comprende preferiblemente al menos 5 aminoácidos consecutivos de este, más preferiblemente al menos 8, 10 o 12, que se une específicamente a PLA2GIB. La unión específica de la molécula de receptor indica que la molécula de receptor se une a PLA2GIB con una afinidad mayor (por ejemplo, en al menos 5 veces) que a PLA2-IIA o IID. Un fragmento, tal como se definió anteriormente, más preferiblemente comprende menos de 50 restos aminoácidos.
Los ejemplos de polipéptidos que se unen a GIBsPLA2 son, sin limitación, polipéptidos que comprenden al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
LSLYECDSTLVSLRWRCNRKMITGPLQYSVQVAHDNTWASRKYIHKW (SEQ ID NO: 24)
WEKDLNSHICYQFNLLS (SEQ ID NO: 25)
DCESTLPYICKKYLNHIDHEIVEK(SEQ ID NO: 26)
QYKVQVKSDNTWARKQIHRWIAYTSSGGDICE(SEQ ID NO: 27)
LSYLNWSQEITPGPFVEHHCGTLEWSA (SEQ ID NO: 28)
SRFEQAFITSLISSVAEKDSYFW (SEQ ID NO: 29)
WICRIPRDVRPKFPDWYQYDAPWLFYQNA (SEQ ID NO: 30)
AFHQAFLTVLLSRLGHTHWIGLSTTDNGQT (SEQ ID NO: 31)
Las SEQ ID NO:24-26 se derivan de la secuencia del receptor de PLA2GIB soluble humano, mientras que las SEQ ID NO:27-31 se derivan del receptor de PLA2GIB soluble murino.
Vacunación
Tal como se describe en la solicitud, la inhibición de GIBsPLA2 en un sujeto puede obtenerse mediante la vacunación (o la inmunización) del sujeto con un antígeno de GIBsPLA2. Como resultado de dicha vacunación o inmunización, el sujeto produce anticuerpos (o células) que inhiben GIBsPLA2. En particular, una o más inyecciones de un antígeno de GIBsPLA2 (por ejemplo, una GIBsPLA2 inmunogénica fundamentalmente exenta de actividad biológica) pueden generar anticuerpos en el sujeto tratado. Estos anticuerpos protegerán frente a un exceso de expresión de GIBsPLA2, y pueden usarse como inmunoterapia o una profilaxis de vacuna.
En la solicitud también se describe un método de vacunar un sujeto que comprende administrar al sujeto un antígeno de GIBsPLA2.
En la solicitud también se describe un antígeno de GIBsPLA2 para su uso para vacunar a un sujeto que lo necesita.
En un ejemplo particular, el antígeno de GIBsPLA2 usado para la vacunación es una molécula inmunogénica inactivada que induce una respuesta inmunológica contra GIBsPLA2 en un sujeto. La inactivación puede obtenerse, por ejemplo, mediante la alteración química o física de GIBsPLA2 o mediante la mutación o el truncamiento de la proteína, o ambos; y la inmunogenicidad puede obtenerse como resultado de la inactivación y/o la posterior conjugación de la proteína con un vehículo o hapteno adecuado, tal como KLH, HSA, polilisina, una anatoxina vírica, o similares y/o mediante polimerización, o similares. Por tanto, el antígeno puede modificarse de forma química o física, por ejemplo, para mejorar su inmunogenicidad.
En una descripción preferida, el antígeno de GIBsPLA2 de la invención comprende GIBsPLA2, o uno de sus fragmentos o mimotopos que contienen epitopos.
En una descripción particular, el antígeno de GIBsPLA2 comprende una proteína de GIBsPLA2 de longitud completa. En otra realización particular, el antígeno de GIBsPLA2 comprende una proteína que comprende SEQ ID NO:2, o una secuencia que tiene al menos 90% de identidad con SEQ ID NO:2.
En una descripción alternativa, el antígeno de GIBsPLA2 comprende un fragmento de una proteína de GIBsPLA2 que comprende al menos 6 restos aminoácidos consecutivos y que contiene un epitopo inmunogénico, o uno de sus mimotopos. En una realización preferida, el antígeno de GIBsPLA2 comprende al menos de 6 a 20 restos aminoácidos. Los ejemplos de péptidos contienen de 4 a 30 restos aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:2 (o de una correspondiente secuencia de un variante natural de SEQ ID NO:2). Los péptidos más preferidos comprenden de 5 a 25 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:2 (o de una correspondiente secuencia de un variante natural de SEQ ID NO:2), y comprenden además al menos uno de los siguientes restos aminoácidos de SEQ ID NO:2 (o de una correspondiente secuencia de un variante natural de SEQ ID NO:2): aminoácido 70, aminoácido 121, aminoácido 50, aminoácido 52, aminoácido 54, aminoácido 71, o sus combinaciones. Los ejemplos específicos de péptidos son péptidos con menos de 50 aminoácidos que comprenden cualquiera de las siguientes secuencias:
NNYGCY (SEQ ID NO: 13)
CYCGLG (SEQ ID NO: 14)
YNNYGCYCGLGGSG (SEQ ID NO: 15)
FLEYNNYGCYCGLGGSGTPV (SEQ ID NO: 16)
QTHDN (SEQ ID NO: 17)
CQTHDNC (SEQ ID NO: 18)
ECEAFICNC (SEQ ID NO: 19)
DRNAAI (SEQ ID NO: 20)
DRNAAICFSKAPYNKAHKNL (SEQ ID NO: 21)
El antígeno de GIBsPLA2 puede estar en diversas formas, tales como en forma libre o polimerizada, química o físicamente modificado y/o acoplado (es decir, conectado) con una molécula vehículo. El acoplamiento a un vehículo puede aumentar la inmunogenicidad y suprimir (aún más) la actividad biológica del polipéptido de GIBsPLA2. A este respecto, la molécula vehículo puede ser cualquier molécula vehículo o proteína que se emplea de modo convencional en inmunología, tal como, por ejemplo, KLH (hemocianina de lapa, "keyhole limpet hemocyanin"), ovoalbúmina, albúmina de suero bovina ("bovine serum albumin", BSA), una anatoxina vírica o bacteriana, tal como el toxoide del tétanos, el toxoide de la toxina B del cólera diftérico, sus mutantes, tales como la toxina de la difteria CRM 197, una proteína de vesícula de la membrana externa, una molécula de polilisina, o una partícula similar a un virus ("virus like particle", VLP). En una realización preferida, el vehículo KLH o CRM197 o una VLP.
El acoplamiento de GIBsPLA2 a un vehículo puede realizarse mediante la química covalente usando reacciones o grupos químicos de enlace, tales como, por ejemplo, glutaraldehído, biotina, etc. Preferiblemente, el conjugado o la proteína de GIBsPLA2 o fragmento o mimotopo se somete a un tratamiento con formaldehído para completar la inactivación de GIBsPLA2.
En una realización particular, el antígeno de GIBsPLA2 comprende una proteína de GIBsPLA2 de longitud completa, opcionalmente acoplada a una proteína vehículo. En una realización preferida, el antígeno de GIBsPLA2 comprende una proteína que comprende SEQ ID NO:2, o una secuencia que tiene al menos 90% de identidad con SEQ ID NO:2, acoplada a una proteína vehículo.
En otra realización particular, el antígeno de GIBsPLA2 comprende un péptido inmunogénico o mimotopo de GIBsPLA2, opcionalmente acoplado a una proteína vehículo. En una realización más preferida, el antígeno de GIBsPLA2 comprende un polipéptido con una longitud de al menos 10 aminoácidos, que comprende al menos uno de los siguientes restos aminoácidos de SEQ ID NO:2 (o de una correspondiente secuencia de un variante natural de SEQ ID NO:2): aminoácido 70, aminoácido 121, aminoácido 50, aminoácido 52, aminoácido 54, aminoácido 71, o sus combinaciones, opcionalmente acoplado a una molécula vehículo.
La inmunogenicidad del antígeno de GIBsPLA2 puede ensayarse mediante diversos métodos, tales como mediante la inmunización de un animal no humano injertado con células inmunológicas humanas, seguido de la verificación de la presencia de anticuerpos, o mediante un ELISA de sándwich usando anticuerpos humanos o humanizados. La falta de actividad biológica puede verificarse mediante cualquiera de los ensayos de actividad descritos en la solicitud. En una realización preferida, el antígeno de GIBsPLA2 tiene menos del 20%, más preferiblemente menos del 15%, 10%, 5% o incluso 1% de la actividad de una proteína de GIBsPLA2 de tipo salvaje en un método in vitro de (i) inducción de la formación de microdominios de membrana (MMD) en células T CD4, o (ii) hacer que las células T CD4 sean refractarias a la señalización de IL-2 o refractarias a la señalización de IL-7.
En una realización particular, la invención se refiere a una GIBsPLA2 inactivada e inmunogénica.
En otra realización particular, la invención se refiere a una proteína GIBsPLA2, o uno de sus fragmentos o mimotopo, conjugada con una molécula vehículo, preferiblemente con KLH.
En otro aspecto, la invención se refiere a una vacuna que comprende un antígeno de GIBsPLA2, un excipiente adecuado y, opcionalmente, un adyuvante adecuado.
Estas moléculas y conjugados y vacunas representan agentes potentes para su uso para inmunizar sujetos, provocando con ello una inhibición sostenida de GIBsPLA2. Tras su repetición, estos métodos pueden usarse para provocar una inhibición permanente de GIBsPLA2.
La invención también describe un método para inducir la producción de anticuerpos que neutralizan la actividad de GIBsPLA2 endógena en un sujeto que lo necesita, comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno o vacuna de GIBsPLA2.
La administración de un antígeno o vacuna de la invención puede realizarse mediante cualquier vía adecuada, tal como mediante inyección, preferiblemente intramuscular, subcutánea, transdérmica, intravenosa o intraarterial; mediante administración nasal, oral, mucósica o rectal.
El antígeno o vacuna de GIBsPLA2 puede usarse para tratar cualquier enfermedad relacionada con una sobreproducción de GIBsPLA2. De modo más específico, esta invención se refiere a un método para tratar una enfermedad relacionada con una sobreproducción de GIBsPLA2 en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno de GIBsPLA2 o de una composición de vacuna que comprende un antígeno de GIBsPLA2.
Agonistas o activadores de GIBsPLA2
El término "agonista" de GIBsPLA2, en el contexto de la presente invención, incluye cualquier sustancia que tiene actividad GIBsPLA2, o que media o sobrerregula esta actividad, tal como, sin limitación, un péptido, un polipéptido, una proteína recombinante, un conjugado, un ligando natural o artificial, un producto de degradación, un homólogo, un ácido nucleico, ADN, ARN, un aptámero, etc., o una de sus combinaciones. El término "agonista" incluye agonistas totales y parciales. Un ejemplo particular de un agonista de GIBsPLA2 es una proteína de GIBsPLA2 o un ácido nucleico que codifica una proteína de GIBsPLA2.
En una realización particular, la invención se refiere a métodos para inhibir una respuesta inmunológica en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una proteína de GIBsPLA2 o un ácido nucleico que codifica una proteína de GIBsPLA2.
Composiciones
La invención también se refiere a composiciones que comprenden un antígeno o modulador de GIBsPLA2, tal como se describió en la presente, como ingrediente activo y, preferiblemente, un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una "composición farmacéutica" se refiere a una formulación de un compuesto de la invención (ingrediente activo) y un medio generalmente aceptado en la técnica para la administración de compuestos biológicamente activos al sujeto que lo necesita. Este vehículo incluye todos los vehículos, diluyentes, medios o soportes para este farmacéuticamente aceptables. Puede emplearse la práctica farmacéutica convencional para proporcionar formulaciones o composiciones adecuadas a los sujetos, por ejemplo, en forma de una dosificación unitaria.
Los compuestos o las composiciones según la invención pueden formularse en forma de un ungüento, gel, pasta, disoluciones líquidas, suspensiones, comprimidos, cápsulas de gelatina, cápsulas, supositorios, polvos, gotas nasales o aerosoles, preferiblemente en forma de una suspensión o disolución inyectable. Para las inyecciones, los compuestos en general se envasan en forma de suspensiones líquidas, que pueden ser inyectadas por medio de jeringas o perfusiones, por ejemplo. A este respecto, los compuestos en general se disuelven en disolución salina, fisiológica, isotónica o tamponada, compatible con el uso farmacéutico y conocidas por los expertos en la técnica. Así, las composiciones pueden incluir uno o más agentes o excipientes seleccionados de dispersantes, solubilizantes, estabilizantes, conservantes, etc. Los agentes o excipientes que pueden usarse en las formulaciones líquidas y/o inyectables son, de modo notable, metilcelulosa, hidroximetilcelulosa, carboximetilcelulosa, polisorbato 80, manitol, gelatina, lactosa, aceites vegetales, goma arábiga, etc. El vehículo también puede seleccionarse, por ejemplo, de metil-beta-ciclodextrina, un polímero del ácido acrílico (tal como carbopol), una mezcla de polietilenglicol y polipropilenglicol, monoetanolamina e hidroximetilcelulosa.
Las composiciones comprenden, en general, una cantidad eficaz de un compuesto de la invención, por ejemplo, una cantidad que es eficaz para modular la GIBsPLA2. En general, las composiciones según la invención comprenden de aproximadamente 1 pg a 1000 mg de un modulador de GlBsPLA2, tal como de 0,001-0,01, 0,01-0,1, 0,05-100, 0,05-10, 0,05-5, 0,05-1, 0,1-100, 0,1-1,0, 0,1-5, 1,0-10, 5-10, 10-20, 20-50, y 50-100 mg, por ejemplo, entre 0,05 y 100 mg, preferiblemente entre 0,05 y 5 mg, por ejemplo, 0,05, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,2, 3, 4 o 5 mg. La dosificación puede ser ajustada por los expertos en la técnica dependiendo del modulador y de la enfermedad.
Las composiciones de la invención pueden comprender además uno o más compuestos activos adicionales, para un uso simultáneo o secuencial.
La invención también describe un método para preparar una composición farmacéutica, que comprende mezclar un modulador de GIBsPLA2, tal como se describió previamente, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, y formular la composición en cualquier forma o recipiente adecuado (jeringa, ampolla, matraz, botella, bolsa, etc.).
La invención también describe un kit que comprende (i) una composición que comprende un modulador de GIBsPLA2, tal como se describió previamente, (ii) al menos un recipiente y, opcionalmente, (iii) instrucciones escritas para usar el kit.
Enfermedades
Los compuestos y las composiciones de la invención pueden usarse para tratar cualquier enfermedad relacionada con una respuesta inmunológica inapropiada (por ejemplo, defectuosa o incorrecta), en particular con una actividad de células T CD4 inapropiada, así como cualquier enfermedad en la que un aumento en la inmunidad puede mejorar la condición del sujeto. Estas enfermedades a veces se denominan "trastornos inmunológicos" en la presente solicitud. Estas incluyen situaciones inmunodefectuosas (por ejemplo, provocadas por una infección vírica, una infección patogénica, un cáncer, etc.), enfermedades autoinmunológicas, injertos, diabetes, enfermedades inflamatorias, cánceres, alergias, asma, psoriasis, urticaria, eccema y similares.
Inmunodeficiencias y trastornos asociados
En un primer aspecto, la invención se basa en la inhibición de GIBsPLA2 en un sujeto, aumentando o restableciendo con ello una actividad inmunológica, en particular una actividad mediada por células T CD4.
Por tanto, en una realización particular, la invención se dirige a métodos para estimular una respuesta inmunológica en un sujeto que lo necesita, que comprenden inhibir la GIBsPLA2 en dicho sujeto.
En una realización particular, la invención se dirige a métodos para modular los leucocitos en un sujeto que lo necesita, que comprenden inhibir la GIBsPLA2 en dicho sujeto.
Los ejemplos de enfermedades que pueden beneficiarse de los inhibidores de GIBsPLA2 son todas enfermedades con una inmunodeficiencia, tal como una inmunodeficiencia mediada por VIH. A este respecto, en una realización particular, la invención se dirige a métodos para tratar una inmunodeficiencia o un trastorno asociado en un sujeto que lo necesita, que comprenden inhibir la GIBsPLA2 en dicho sujeto.
En otra realización particular, la invención se dirige a un inhibidor de GIBsPLA2 para su uso para tratar una inmunodeficiencia o un trastorno asociado en un sujeto que lo necesita.
Las inmunodeficiencias y los trastornos asociados indican cualquier afección o patología caracterizada y/o provocada por una función o respuesta inmunológica reducida en un sujeto. Las inmunodeficiencias pueden ser provocadas, por ejemplo, por una infección vírica (por ejemplo, VIH, hepatitis B, etc.), una infección bacteriana, cáncer u otras afecciones patológicas. Por tanto, la expresión “trastorno asociado a una inmunodeficiencia” indica cualquier enfermedad provocada o asociada con una inmunodeficiencia. La invención es particularmente adecuada para tratar inmunodeficiencias relacionadas con células T CD4 y enfermedades asociadas. En efecto, la presente solicitud demuestra que los efectos biológicos de GIBsPLA2 están implicados en un estado de enfermedad de las células T CD4. Por consiguiente, el bloqueo de la actividad de GIBsPLA2 tiene un beneficio terapéutico en sujetos con una respuesta alterada a citoquinas que causa inmunodeficiencia, tal como se observa a menudo en pacientes infectados por VIH.
Por consiguiente, en una realización particular, la invención se refiere a métodos para tratar una infección por VIH en un sujeto mediante la inhibición de GIBsPLA2 en el sujeto, preferiblemente mediante la administración de un inhibidor o vacuna de GIBsPLA2 al sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto es un paciente de VIH temprano, y los métodos provocan un aumento en la probabilidad de que el paciente sea un controlador de VIH. En algunas realizaciones, el sujeto es un paciente con baja inmunorreconstitución después de un tratamiento antirretrovírico y/o con linfopenia de células T CD4 idiopática (ICL) grave. La invención también se refiere a un método para aumentar la actividad de células T CD4 en un sujeto infectado por VIH inhibiendo la GIBsPLA2 en el sujeto, preferiblemente administrando un inhibidor o vacuna de GIBsPLA2 al sujeto.
En otra realización, la invención se refiere a métodos para tratar la inflamación aguda y/o crónica y procesos derivados de reacciones inflamatorias en un sujeto, mediante la inyección de GIBsPLA2 al sujeto, directamente o asociada con fármacos antiinflamatorios.
La invención también proporciona métodos para tratar el cáncer aumentando la respuesta inmunológica en el sujeto, que comprenden inhibir la GIBsPLA2 en el sujeto, preferiblemente mediante la administración de un inhibidor o vacuna de GIBsPLA2 al sujeto. La invención también proporciona métodos para tratar una inmunodeficiencia relacionada con células T CD4 asociada con un cáncer en un sujeto, mediante la inhibición de GIBsPLA2 en el sujeto, preferiblemente mediante la administración de un inhibidor o vacuna de GIBsPLA2 al sujeto.
Respuestas inmunológicas patológicas y enfermedades asociadas
En la solicitud también se describe un método para tratar cualquier enfermedad relacionada con una respuesta inmunológica inapropiada (por ejemplo, defectuosa o incorrecta), o con una (hiper)actividad o (hiper)activación no deseada del sistema inmunológico, en particular con una actividad de células T CD4 inapropiada. Estas enfermedades incluyen, por ejemplo, enfermedades autoinmunológicas, injertos, diabetes, alergias, asma, psoriasis, urticaria, eccema y similares.
En una realización particular, la invención describe métodos para inhibir una respuesta inmunológica en un sujeto que lo necesita, que comprenden inducir o activar la GIBsPLA2 en dicho sujeto.
En una realización particular, la invención describe métodos para inhibir los leucocitos en un sujeto que lo necesita, que comprenden inhibir la GIBsPLA2 en dicho sujeto.
En otra realización particular, la invención describe métodos para tratar un trastorno provocado por una respuesta inmunológica no deseada en un sujeto que lo necesita, que comprenden inducir o activar la GIBsPLA2 en dicho sujeto.
La inducción o la activación de GIBsPLA2 en un sujeto preferiblemente comprende administrar al sujeto un agonista de GIBsPLA2, por ejemplo, una proteína de GIBsPLA2, o uno de sus fragmentos funcionales.
En otra realización particular, la invención describe un agonista o un activador de GIBsPLA2 para su uso para tratar un trastorno provocado por una respuesta inmunológica no deseada en un sujeto que lo necesita.
Los ejemplos de enfermedades que pueden beneficiarse de los agonistas de GIBsPLA2 son trastornos autoinmunológicos, cánceres, enfermedades víricas, infecciones bacterianas, etc.
En una realización particular, la invención describe métodos para tratar un trastorno autoinmunológico en un sujeto que lo necesita, que comprenden estimular o inducir la GIBsPLA2 en dicho sujeto.
En otra realización particular, la invención describe un compuesto o una composición de la invención para su uso para tratar un trastorno autoinmunológico en un sujeto que lo necesita.
En una realización particular, la invención describe métodos para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprenden estimular o inducir la GIBsPLA2 en dicho sujeto.
En otra realización particular, la invención describe un compuesto o una composición de la invención para su uso para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesita.
La invención también describe un método para tratar (por ejemplo, reducir o prevenir o inhibir) el rechazo a injertos o para tratar la enfermedad del injerto frente al receptor en un sujeto trasplantado, que comprende estimular o inducir la GIBsPLA2 en dicho sujeto. La invención también describe un método para mejorar la tolerancia a injertos alogeneicos en un sujeto, que comprende estimular o inducir la GIBsPLA2 en dicho sujeto.
Actividad antimicrobiana
La presente solicitud también describe un método para matar microbios usando GIBsPLA2. Actuando directamente sobre las membranas, la GIBsPLA2 puede destruir o matar bacterias, virus con envuelta, parásitos y similares. En infecciones o en infecciones agudas, la GIBsPLA2 puede usarse por sí sola o asociada con antibióticos, fármacos antivíricos, antirretrovíricos y antiparasitarios. En el caso de los microbios resistentes a fármacos antimicrobianos conocidos, la GIBsPLA2 puede representar una terapia alternativa. Puede usarse en un tratamiento a muy corto plazo, por ejemplo, en situaciones clínicas agudas y muy peligrosas.
Los ejemplos específicos de enfermedades que pueden beneficiarse del tratamiento con GIBsPLA2 según la invención son todas las situaciones clínicas con una hiperactividad del sistema inmunológico o una inflamación crónica, tales como esclerosis múltiple, miastenia grave, neuropatías autoinmunológicas, tales como síndrome de Guillain-Barré, uveitis autoinmunológica, uveitis, anemia hemolítica autoinmunológica, anemia perniciosa, trombocitopenia autoinmunológica, arteritis temporal, síndrome antifosfolípidos, vasculitis, tales como granulomatosis de Wegener, enfermedad de Behcet, aterosclerosis, psoriasis, dermatitis herpetiforme, pénfigo vulgar, vitíligo, pénfigo vulgar, micosis fungoide, dermatitis por contacto alérgica, dermatitis atópica, liquen plano, PLEVA, eccema, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmunológica, diabetes mellitus de tipo 1, enfermedad de Addison, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, ooforitis y orquitis autoinmunológicas, tiroiditis autoinmunológica, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, escleroderma, polimiositis, dermatomiositis, espondiloartropatías, tales como espondilitis anquilosante, o síndrome de Sjogren. La duración, las dosificaciones y la frecuencia de administración de los compuestos o las composiciones de la invención puede adaptarse según el sujeto y la enfermedad. El tratamiento puede usarse por sí solo o en combinación con otros ingredientes activos, de modo simultáneo o secuencial o por separado.
Los compuestos o las composiciones según la invención pueden administrarse en diversas formas o vías, tales como, sin limitación, mediante inyección sistémica, por vía intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, cutánea, subcutánea, dérmica, transdérmica, intratecal, ocular (por ejemplo, corneal) o rectal, o mediante administración típica en un sitio de inflamación, y preferiblemente mediante inyección intramuscular o intravenosa.
Un régimen típico comprende una única administración o administraciones repetidas de una cantidad eficaz de un modulador de GIBsPLA2 a lo largo de un periodo de uno a varios días, hasta un año, e incluye entre una semana y aproximadamente seis meses. Se entiende que la dosificación de un compuesto o una composición farmacéutica de la invención administrados in vivo dependerá de la edad, la salud, el sexo y el peso del receptor (sujeto), el tipo de tratamiento concurrente, si existe, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto farmacéutico deseado. Los intervalos de dosis eficaces proporcionados en la presente no pretenden ser limitantes y representan intervalos de dosis preferidos. Sin embargo, la dosificación más preferida se adaptará al sujeto individual, tal como entienden y pueden determinar los expertos en la técnica pertinente (véase, por ejemplo, Berkowet et al., eds., The Merck Manual, 16a edición, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Goodmanetna., eds., Goodman and Cilman's, The pharmacological Basis of Therapeutics, 10a edición, Pergamon Press, Inc., Elmsford, NY, (2001)).
Diagnosis
La invención también describe métodos para detectar un defecto inmunológico en un sujeto basándose en la detección de la presencia o la cantidad o la ausencia de GIBsPLA2 en una muestra procedente de un sujeto. El método puede realizarse usando una diversidad de tecnologías o plataformas de detección conocidas per se en la técnica, tales como, sin limitación, ensayo de captura, ensayo de sándwich, ensayo de competición, radioinmunoensayos, marcadores enzimáticos con sustratos que generan productos coloreados, fluorescentes, quimioluminiscentes o electroquímicamente activos, fluorescencia, polarización fluorescente, quimioluminiscencia, óptica y colorimétrica, electroquimioluminiscencia, fluorescencia de resolución en el tiempo, resonancia de plasmón de superficie, ondas evanescentes, placas de múltiples pocillos (ELISA), ensayo individual, ensayo de múltiplex, ensayo de múltiplex con esferas de látex, micromatrices (superficie laminar)-ensayo de múltiplex, ensayos basados en placas de vidrio o ensayos basados en tiras.
En una realización particular, el método comprende determinar la presencia o la cantidad o la ausencia de un polimorfismo en el gen, ARN o proteína de GIBsPLA2. Los resultados de los inventores demuestran que la GIBsPLA2 está sujeta a un elevado polimorfismo y que esto se correlaciona con el estado fisiológico de los sujetos. Por tanto, la invención comprende (i) determinar la presencia o la cantidad o la ausencia de una isoforma polimórfica concreta de GIBsPLA2 y/o (ii) determinar la tasa global de polimorfismo de la GIBsPLA2 en un sujeto, correlacionándose dichos datos con el estado fisiológico del sujeto. En particular, las isoformas específicas pueden ser características de la predisposición, la presencia o la aparición en un sujeto de un trastorno, tal como se describió anteriormente. Esta determinación también puede usarse en la medicina personalizada para ajustar el tratamiento.
Métodos para controlar y/o diagnosticar una inmunodeficiencia asociada con defectos en las células T CD4 que comprenden detectar la GlBsPLA2
También se describen métodos para controlar y/o diagnosticar una inmunodeficiencia asociada con defectos en las células T CD4, en particular, en una infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un sujeto. En algunas realizaciones, los métodos comprenden (a) proporcionar una muestra que contiene un fluido corporal, preferiblemente plasma procedente de un sujeto, y (b) detectar un nivel de GIBsPLA2 en la muestra por encima de un umbral. La presencia de GIBsPLA2 en la muestra puede detectarse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, mediante un método que comprende un ensayo enzimático, un ensayo de ligandos de captura y/o un inmunoensayo.
En algunas realizaciones, el método comprende obtener una muestra que comprende plasma procedente de un sujeto y determinar si el plasma tiene al menos una actividad seleccionada de inducir la formación de microdominios de membrana (MMD) anómalos en células T CD4 procedentes de sujetos sanos, y hacer que las células T CD4 de sujetos sanos sean refractarias a la señalización de interleuquina-7 (IL-7). Si el plasma procedente del sujeto comprende esta actividad, entonces se determina que el sujeto, en algunas realizaciones, tiene una inmunodeficiencia relacionada con células T CD4, tal como se observa a menudo en paciente infectados por VIH, pero no solo en estos. Si la fracción de plasma no comprende esta actividad, entonces se determina que el sujeto, en algunas realizaciones, tiene una baja exposición a una inmunodeficiencia relacionada con la alteración de células T CD4 frente a la homeostasis regulada por citoquinas.
En algunas realizaciones, se determina que el sujeto tiene una infección por VIH. Por contraste, si la fracción de proteínas no comprende esta actividad, entonces se determina que el sujeto, en algunas realizaciones, no tiene una inmunodeficiencia relacionada con defectos en las células T CD4, tal como se describe en la presente. En algunas realizaciones, se determina que el sujeto no tiene una infección por VIH.
En algunas realizaciones, los métodos comprenden poner en contacto la muestra que comprende un fluido corporal, preferiblemente plasma, procedente del sujeto con un anticuerpo específico de GIBsPLA2, y determinar la presencia o la ausencia de una reacción inmunológica. En algunas realizaciones, la presencia o la ausencia de una reacción inmunológica se determina mediante un método que comprende un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). La presencia de una reacción inmunológica entre el anticuerpo específico de GIBsPLA2 y la muestra indica la presencia de GIBsPLA2 en la muestra, lo cual, a su vez, indica que el sujeto tiene una inmunodeficiencia asociada con defectos en las células T CD4. En algunas realizaciones, se determina que el sujeto tiene una infección por VIH. Por contraste, la ausencia de una reacción inmunológica entre el anticuerpo específico de GIBsPLA2 y la muestra indica que el sujeto no tiene una inmunodeficiencia asociada con defectos en las células T CD4, tal como se describe en la presente. En algunas realizaciones, se determina que el sujeto no tiene una infección por VIH.
En algunas realizaciones, el ensayo para la presencia de GIBsPLA2 en la muestra es cualitativo. En algunas realizaciones, el ensayo para la presencia de GIBsPLA2 en la muestra es cuantitativo.
En algunas realizaciones, los métodos comprenden comparar los resultados del ensayo con los resultados de un ensayo similar de una muestra control que comprende plasma procedente de un sujeto que no tiene una inmunodeficiencia asociada con defectos en las células T CD4. En algunas realizaciones, los métodos comprenden comparar los resultados del ensayo con los resultados de un ensayo similar de una muestra que comprende plasma del mismo sujeto recolectada antes.
Métodos para controlar y/o diagnosticar una inmunodeficiencia asociada con la alteración de células T CD4 que comprenden caracterizar los microdominios de membrana sobre las células T CD4
Los datos en los ejemplos demuestran que los pacientes infectados por VIH presentan la formación de microdominios de membrana (MMD) distintivos sobre la superficie de células T CD4, aunque muy pocas células están realmente infectadas por VIH. Por consiguiente, esta descripción también proporciona métodos para diagnosticar una inmunodeficiencia asociada con una alteración en las células T CD4, tal como, por ejemplo, una inmunodeficiencia provocada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un sujeto. En algunas realizaciones, los métodos comprenden: (a) aislar linfocitos T CD4 de un sujeto, y (b) medir el número y/o el tamaño de los microdominios de membrana (MMD) sobre las células T. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además al menos uno de (c) medir la cantidad de fosfo-STAT5 en las células T, y (d) ensayar la fracción de importación nuclear de fosfo-STAT5 en las células T. En algunas realizaciones, se mide el número y/o el tamaño de los MMD sobre las células T en ausencia de interleuquinas. En algunas realizaciones, se mide el número y/o el tamaño de los MMD sobre las células T en ausencia de IL-2. En algunas realizaciones, se mide el número y/o el tamaño de los MMD sobre las células T en ausencia de IL-7. En algunas realizaciones, se mide el número y/o el tamaño de los MMD sobre las células T en presencia de un nivel subumbral de interleuquinas.
En algunas realizaciones, si el número de MMD sobre las células T aisladas del sujeto es al menos un umbral, esto indica que el sujeto tiene una inmunodeficiencia asociada con la alteración de células T CD4. En algunas realizaciones, esto indica que el sujeto tiene una infección por VIH. En algunas realizaciones, si el número de MMD sobre las células T aisladas del sujeto no es al menos un umbral, esto indica que el sujeto no tiene una inmunodeficiencia asociada con la alteración de células T CD4, tal como se describe en la presente. En algunas realizaciones, esto significa que el sujeto no tiene una respuesta de células T CD4 alterada frente a la señalización de citoquinas. En algunas realizaciones, esto significa que el sujeto no tiene una respuesta de células T CD4 alterada frente a la interleuquina-7. En algunas realizaciones, esto indica que el sujeto no tiene una infección por VIH. En algunas realizaciones, el umbral es al menos aproximadamente 80 por célula, al menos aproximadamente 90 por célula, al menos aproximadamente 100 por célula, al menos aproximadamente 110 por célula, o al menos aproximadamente 120 por célula. En una realización preferida no limitante, el umbral es de aproximadamente 100 por célula. En algunas realizaciones, si los MMD sobre las células T aisladas del sujeto tienen un diámetro de al menos un umbral, esto indica que el sujeto tiene una infección por VIH. En algunas realizaciones, si los MMD sobre las células T aisladas del sujeto no tienen un diámetro de al menos un umbral, esto indica que el sujeto no presenta una respuesta alterada a la interleuquina-7 y, más en general, a citoquinas. En algunas realizaciones, esto indica que el sujeto no tiene una infección por VIH. En algunas realizaciones, el umbral es un diámetro de al menos 100 nm, al menos 110 nm, al menos 120 nm, al menos 130 nm, o al menos 140 nm. En una realización preferida no limitante, el umbral es un diámetro de al menos aproximadamente 120 nm.
Debido a que RIF puede alterar la capacidad de respuesta de las células T CD4 a la IL-7 agregando los receptores de membrana en MMD anormalmente grandes, también pueden verse afectadas las respuestas a otras citoquinas y gamma-c, y RIF también podría asociarse con otras patologías que implican una respuesta de células T CD4 alterada.
Métodos para identificar candidatos a agentes terapéuticos
Esta invención también describe métodos para identificar un candidato a agente terapéutico, que comprenden: (a) poner en contacto linfocitos T CD4 con GIBsPLA2 en presencia de un agente, y (b) medir la activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2. En algunas realizaciones, los métodos comprenden (c) comparar el nivel de activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 en presencia del agente con el nivel de activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 en ausencia del agente. En algunas realizaciones, si el nivel de activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 en presencia del agente es menor que el nivel de activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 en ausencia del agente, entonces el agente se identifica como candidato a agente terapéutico para la inmunodeficiencia. En algunas realizaciones, el agente se identifica como un candidato a agente terapéutico para el VIH. En algunas realizaciones, si el nivel de activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 en presencia del agente es mayor que el nivel de activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 en ausencia del agente, entonces el agente se identifica como candidato a agente terapéutico inmunosupresor.
En algunas realizaciones, la medición de la activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 comprende determinar el número de MMD por célula T CD4.
En algunas realizaciones, la medición de la activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 comprende determinar el diámetro promedio de MMD en células T CD4.
En algunas realizaciones, la medición de la activación de células T CD4 inducida por GIBsPLA2 comprende determinar la capacidad de respuesta a IL-7 de células T CD4 ensayada mediante fosforilación de STAT5 y/o importación nuclear.
Tal como se emplea en la presente, un "agente" puede ser cualquier entidad química en evaluación como producto terapéutico potencial. En algunas realizaciones, el agente es una molécula orgánica. En algunas realizaciones, el agente comprende de 2 a 100 átomos de carbono, tal como de 2 a 50 átomos de carbono, de 5 a 50 átomos de carbono, o de 10 a 50 átomos de carbono. En algunas realizaciones, el agente es un péptido, una proteína, una glicoproteína o una lipoproteína. En algunas realizaciones, el agente es un anticuerpo.
En algunas realizaciones, no se ha determinado previamente que el agente tenga una actividad biológica que implique una utilidad como agente terapéutico para el tratamiento de la inmunodeficiencia, tal como la que se asocia a menudo con una infección por VIH. En algunas realizaciones, se ha determinado previamente que el agente tiene una actividad biológica que implica una utilidad como agente terapéutico para el tratamiento de la inmunodeficiencia, tal como la que se asocia a menudo con una infección por VIH.
Tal como se emplea en la presente, un "candidato a agente terapéutico para la inmunodeficiencia" o un "candidato a agente terapéutico para el VIH" es un agente que inhibe la capacidad de RIF para activar a las células T CD4 en al menos un ensayo. En coherencia con los datos indicados en la presente, la capacidad de un agente para inhibir la capacidad de GIBsPLA2 para activar células T CD4 en al menos un ensayo es una manera útil para identificar agentes que es probable que sean terapéuticamente útiles para tratar inmunodeficiencias que incluyen inmunodeficiencias asociadas con infecciones por VIH. Por consiguiente, también es una manera útil para identificar agentes que es probable que sean terapéuticamente útiles para tratar una infección por VIH. Por supuesto, como con todas las moléculas terapéuticas, será necesaria una caracterización posterior. Sin embargo, esto no disminuye la utilidad de los candidatos a agentes terapéuticos para el VIH de esta descripción.
En la siguiente sección experimental, que se considerará ilustrativa, se describen otros aspectos y ventajas de la invención.
Ejemplos
1. Materiales y métodos
1.1. Pacientes
Los VP incluidos en el estudio habían sido positivos a VIH durante más de un año. Nunca habían recibido ningún fármaco antirretrovírico y tenían una carga vírica > 10.000 copias de ARN/ml con un recuento de CD4 > 200/pl en el momento de la recogida de sangre (estudios ANRS EP 33 y EP20). Todas las muestras de sangre procedentes de los VP se extrajeron en Centre Hospitalier de Gonesse. La sangre procedente de los HD fue suministrada por Etablissement Frangais du Sang (Centre Necker-Cabanel, París). Las muestras de plasma procedentes de pacientes ART se extrajeron de individuos que habían estado recibiendo tratamiento durante al menos un año. Su carga vírica había permanecido indetectable durante al menos 6 meses, y sus recuentos de CD4 > 500/pl en el momento de la recogida de sangre. Las muestras de plasma procedentes de pacientes HIC se extrajeron de individuos con una carga vírica indetectable durante 10 años después de la infección. Las muestras de plasma se recogieron en Centre d'Infectiologie Necker-Pasteur.
1.2. Análisis de los microdominios de membrana (MMD), tasas de difusión de receptores y compartimentalización celular de fosfo-STAT5 en linfocitos T CD4 purificados
Se purificaron células T CD4 mediante selección negativa como se ha descrito previamente (10) y después se activaron con IL-7 humana glicosilada recombinante 2 nM (Cytheris) o 40 pg de PHA (Sigma). La microscopía confocal y de STED usadas para estudiar los microdominios (MMD) de la superficie celular y la distribución en compartimentos celulares de fosfo-STAT5 ya han sido descritas (10, 12). También se ha descrito el análisis por FCS de la difusión de proteínas en la superficie de células vivas (10, 12).
1.3. Preparación y análisis de microdominios resistentes a detergentes (DRM)
La preparación de lisados con Triton-X100 de linfocitos T CD4 procedentes de HD o VP, seguida de una centrifugación a través de gradientes de sacarosa y análisis de la transferencia Western de las fracciones recogidas se ha descrito previamente (12). Se usaron mAb específicos de flotilina, IL-7Ralfa y gamma c para detectar las correspondientes bandas mediante transferencias Western (12).
1.4. Caracterización de RIF a partir de plasma de VP
1.4.1. Bioensayos
El ensayo de inducción de MMD fue como sigue: el plasma de VP (al 5 o 10%) primero se incubó (20 min) en medio con células T CD4 de HD purificadas. Después las células se cultivaron en portaobjetos de vidrio revestidos con polilisina durante 10 min, después se activaron mediante 15 min con IL-7 (2 nM) o sin IL-7 para el control (NS), después se fijaron mediante PFA (PFA, al 1,5%, 15 min a 37 °C, seguidos de 15 min a temperatura ambiente) equilibrándose durante una hora en PBS/SVF al 5% antes de teñirse con la toxina B del cólera (CtxB-AF488). Los MMD se contaron mediante microscopía de STED.
Los ensayos para la inhibición de la fosforilación de STAT y la translocación nuclear fueron como sigue: el plasma de VP (al 5 o 10%) primero se incubó con células T CD4 de HD purificadas (20 min) antes de una estimulación con IL-7 (2 nM, 15 min). Después las células se cultivaron en portaobjetos de vidrio revestidos con polilisina durante 10 min, después se activaron mediante 15 min con IL-7 (2 nM) o sin IL-7 para el control (NS), después se fijaron mediante PFA (PFA, al 1,5%, 15 min a 37 °C, seguidos de 15 min a temperatura ambiente) y se permeabilizaron con metanol (al 90% a -20 °C). Las células se equilibraron durante una hora en PBS/SVF al 5%, después el fosfo-STAT5 se tiñó con anti-STAT5 de conejo marcado con anti-Atto642 de conejo de cabra y se analizaron mediante FACS o microscopía de STED.
1.4.2. Tratamientos con enzimas
Se evaluaron los efectos de una digestión con enzimas sobre la actividad RIF tratando plasma de VP filtrado con una membrana de 30 kDa. Se usaron los compuestos del plasma con PM < 10 kDa como controles negativos. Se ensayaron los efectos de la tripsina porcina (1 U/ml durante 30 min a 37 °C, seguido de una inhibición de PMSF e intercambio del tampón con filtros de centrífuga de membrana de 5 kDa de Millipore), o ADNasa I (1 U/ml durante 30 min a 37 °C), o ARNasa (1 U/ml durante 30 min a 37 °C) o péptido N-glicanasa (1 U/ml durante 30 min a 37 °C). Todas las preparaciones se analizaron a una concentración final del 10%.
1.4.3. Determinación del PM o purificación de RIF
Se realizó una cromatografía de exclusión molecular cargando 1,6 ml de plasma en una columna de 85 ml Sephadex G100 preequilibrada con carbonato de amonio (0,1 M) o PBS, y después recogiendo fracciones de 0,8 ml del eluato. La columna se calibró usando un conjunto de proteínas (GE-Healthcare). La concentración de proteínas se midió mediante el método de Bradford. Se ensayó el plasma de VP filtrado con una membrana de 100 kDa y el plasma de VP total, y ambos produjeron idénticos resultados. Se recogieron las fracciones entre 13-17 kDa, que contienen RIF semipurificado.
1.4.4 Determinación del punto isoeléctrico
Se realizó una cromatografía de intercambio aniónico o catiónico en columnas de 1 ml MonoQ o MonoS (GE-Healthcare) con elución mediante sucesivas etapas de pH (tampones carbonato de amonio/acetato de amonio). Se midió el pH de cada fracción eluida y estas después se ajustaron a pH 7,4 antes de ensayar sus efectos biológicos. Se midió la actividad RIF en las correspondientes fracciones inmediatamente después de la elución.
1.4.5 Análisis de MS
Se liofilizaron muestras procedentes de la filtración en gel (G100), después se resuspendieron, se reunieron y se proteolizaron con tripsina porcina, según métodos conocidos per se en la técnica. Después se separaron los péptidos proteolíticos en 12 fracciones mediante una cromatografía a través de una columna C18 eluida en acetato de amonio. Las 12 fracciones se separaron a través de C18 eluida en fase inversa (acetonitrilo) y directamente se inyectaron mediante electropulverización en un orbitrap Velos (Thermo Scientific) para el análisis de MS con fragmentación de Ar secundaria y después MS/MS para los 10 picos de mayor intensidad por barrido de MS.
Se usaron los programas informáticos Mascot y X-Tandem convencionales. Para cada proteína de los subconjuntos de la base de datos, se calcularon 3 criterios:
- Puntuación de i: Cálculo de la especificidad teórica de cada péptido procedente de la digestión con tripsina de una única proteína en la base de datos NextProt enriquecida con proteínas maduras con ruptura del péptido señal (número de péptidos exclusivos/proteína): número de péptidos específicos en todas las secuencias humanas (todas), secuencias con un péptido señal N-terminal (sec) por proteína.
- Cálculo de la aparición teórica de péptidos compatibles con picos procedentes de toda la serie de barridos de MS (picos que se corresponden con péptidos teóricos/proteína).
- Cálculo de la cobertura teórica de la secuencia de la proteína con los péptidos que se corresponden con picos. Para cada proteína se determinó una puntuación p, como un cálculo de las tres puntuaciones.
Ejemplo 1: Activación aberrante de linfocitos T CD4 procedentes de VP medida mediante la presencia de microdominios de membrana (MMD) anómalos
Este ejemplo describe la investigación de nuevos parámetros moleculares y celulares que explican algunas de las respuestas anómalas observadas en los linfocitos T CD4 en pacientes infectados crónicamente por VIH. La activación crónica del sistema inmunológico habitualmente se mide evaluando la sobreexpresión de moléculas de la superficie celular, tales como CD38, HLA-DR y CD25, que se consideran como los marcadores principales de la disfunción de CD4 (15). Sin embargo, a pesar de muchos esfuerzos, estos datos siguen sin estar claros, y el fenotipo de las células T CD4 no puede explicar directamente sus defectos inmunológicos.
Se usó la microscopía de STED y el marcaje con la toxina B del cólera (CtxB-AF488) para detectar la presencia de MMD (12). Antes de cualquier estimulación, se descubrió que la superficie de los linfocitos T CD4 purificados a partir de VP porta muchos más MMD que los linfocitos T CD4 quiescentes purificados a partir de HD (figura 1a). Además, y de lo modo más importante, todas las células T CD4 procedentes de VP muestraron un número mayor de MMD. Este patrón anómalo no es consecuencia de la estimulación con IL-7 en plasma de VP, puesto que el promedio de concentración de IL-7 en este plasma (0,4 pM) es solo la 100 parte de la Kd de la IL-7R (13, 14). Cuando las células T CD4 purificadas procedentes de HD se estimularon con IL-7, se observó un gran número de MMD. Por contraste, el patrón de MMD de las células T CD4 procedentes de VP no se vio afectado por IL-7 (figura 1a). Esta activación anómala, acoplada con la ausencia de cualquier respuesta a IL-7, puede ser imitada por un estímulo no fisiológico, tal como con fitohemaglutinina (PHA) (figura 1a).
Después se cuentan estos diversos MMD anómalos. Se observaron aproximadamente 150-200 MMD por célula T CD4 procedentes de VP, así como en células T CD4 de HD estimuladas con PHA (figura 1c). De nuevo, en este caso, los resultados obtenidos demuestran que todas las células T CD4 procedentes de VP expresan MMD, incluyendo todas las subpoblaciones principales de CD4 (figura 1c). La IL-7 no aumentó el número de MMD en VP. Por contraste, el número de MMD en células T CD4 de HD aumentó desde un nivel de fondo hasta aproximadamente 10 MMD/célula hasta 300 después de una estimulación con IL-7. También se realizó un estudio del tamaño de los MMD (figuras 1d y e). Este demostró que los MMD sobre las células T CD4 procedentes de VP y sobre las células T CD4 de HD estimuladas con PHA eran mucho mayores (250 nm) que los procedentes de células T CD4 de HD estimuladas con IL-7 (90 nm).
Ejemplo 2: Todas las cadenas IL-7R alfa y gamma-c son secuestradas en los microdominios de membrana resistentes a detergentes (DRM) anómalos aislados a partir de células T CD4 de VP
Se analizaron células T CD4 de HD en reposo para verificar que las cadenas IL-7R alfa y gamma-c estaban localizadas en fracciones de alta densidad fuera de los MMD. Cuando estas células T CD4 de HD son estimuladas por IL-7, estas dos cadenas se localizan en fracciones de baja densidad, que se corresponden con MMD resistentes a detergentes o DRM que contienen todas las proteínas secuestradas en MMD (figura 2).
Cuando se repitió el estudio con células T CD4 purificadas a partir de VP, el patrón fue diferente (figura 2). Antes de cualquier estimulación, todas las cadenas IL-7R alfa y gamma-c ya se encontraban secuestradas en los DRM; ninguna estaba localizada en las fracciones de alta densidad que se corresponden con los receptores libres fuera de los MMD. Además, una preestimulación de las células T CD4 con IL-7, antes de la preparación de los DRM, no afectó a este patrón (los datos no se muestran). De nuevo, en este caso, la preestimulación de las células T CD4 de HD con PHA no fisiológico reproduce esta situación patológica. Esto confirma los datos en la figura 1 y demuestra que las células T CD4 en VP están sometidas a una activación aberrante antes de cualquier estimulación. Además, estos MMD anómalos contienen todas las cadenas IL-7R (figura 2).
Ejemplo 3: Análisis en gel bidimensional del señalosoma de IL-7 en células T CD4 purificadas procedentes de HD, VP y células de estimuladas con IL-7. Caracterización del estado de activación aberrante mediante el patrón de proteínas recuperadas después de una inmunoprecipitación
Se usó una electroforesis bidimensional para demostrar que la composición del señalosoma de IL-7 en VP es anómalo y diferente del que aparece en células T CD4 de HD activadas con IL-7 y quiescentes (figura 7a, 7b y 7c). Se inmunoprecipitaron proteínas con anti-IL-7Ralfa (mAb de ratón 40131, R&D System) inmovilizado sobre proteína G-Sepharose 4G a partir de un lisado de células T CD4 purificadas, y se separaron en una 2D-PAGE (IEF en tiras de gel de pH 3-10, seguido por gel de SDS con bis-acrilamida al 12%). Se muestran las escalas de pH y PM (kDa). Los geles se tiñeron con Sypro-Ruby. Los geles mostrados son representativos de 8 parejas de NS/IL-7 obtenidas a partir de HD y 3 geles procedentes de VP.
Figura 7a: Células T CD4 de HD no estimuladas (NS).
Figura 7b: Células T CD4 de VP. Se observaron más manchas en geles bidimensionales teñidos con Sypro Ruby preparados a partir de VP, que los preparados a partir de HD. Además, se observó que las manchas comunes eran más intensas cuando los geles bidimensionales se prepararon con extractos de VP.
Figura 7c: Células T CD4 de HD estimuladas con IL-7. El patrón en las células T CD4 de HD estimuladas con IL-7 difiere del de células T CD4 de VP. Esto apoya aún más la propuesta de que la activación aberrante que se encuentra en VP no es la consecuencia de una estimulación con IL-7 que pueda tener lugar en órganos con niveles elevados de IL-7, por ejemplo, en órganos productores de IL-7.
A partir de este análisis, puede concluirse que las cadenas de IL-7R en VP no solo son parte de los MMD anómalos, sino que también interaccionan con complejos de proteínas diferentes de los que se encuentran en el señalosoma de IL-7 normal.
Ejemplo 4: Tasa de difusión de IL-7Ralfa en la superficie de células T CD4 purificadas procedentes de HD, VP y células HD estimuladas con PHA. La IL-7Ralfa en células T CD4 de VP se introduce en MMD anómalos ricos en lípidos, limitando con ello sus tasas de difusión y evitando cualquier interacción con el citoesqueleto y, por tanto, cualquier capacidad de transmitir señales.
La difusión bidimensional de IL-7Ralfa teñida con mAb AF488-anti-IL-7Ralfa se midió mediante FCS en la superficie de células T CD4 vivas. Los resultados se muestran en la figura 8. Se midieron los tiempos de difusión t D (en 10-3 seg) en ausencia de IL-7 (o, autocorrelación) o en presencia de IL-7-biotina-SAF633 (•, correlación cruzada) como se ha descrito (10, 12). Estos momentos después se representaron gráficamente frente a la superficie específica celular wü2 (en 103 nm2) interceptada por el volumen confocal. Se muestran las gráficas de difusión con y sin pretratamiento con inhibidores de MMD (COasa 1 pg/ml más SMasa 0,1 pg/ml durante 30 min) o inhibidores del citoesqueleto (CitD 20 pM más Col 10 pM durante 30 min).
Las barras indican PEE para 5 experimentos independientes. Las pendientes de la regresión lineal produjeron unas tasas de difusión eficaz Deff y un tiempo de confinamiento extrapolado por intersección con y t0 como describieron previamente los inventores (12). Se muestran las Deff en la gráfica de barras de la figura 3a.
Figuras 8a, 8d: En la superficie de células T CD4 de HD.
Figuras 8b, 8e: En la superficie de células T CD4 de VP.
Figuras 8c, 8f: En la superficie de células T CD4 de HD preactivadas con PHA (1 pg/ml).
Figura 8g: Esquema del mecanismo de la difusión de IL-7Ralfa introducidos en MMD antes y después de un tratamiento con inhibidores de MMD o inhibidores del citoesqueleto. Los MMD se indican mediante discos, los receptores mediante varillas, y el citoesqueleto se muestra como una red. Se indican las tasas de difusión (rápida, lenta, muy lenta) para facilitar la interpretación de los datos. Este esquema ilustra los resultados que también se indican en la figura 3a.
Ejemplo 5: Las cadenas de IL-7R secuestradas en los MMD anómalos de células T CD4 de VP no son funcionales Se miden las tasas de difusión de IL-7R alfa en la superficie de células T CD4 tal como se ha descrito previamente (10, 12) y como se detalla en el ejemplo 4. Antes de cualquier estimulación, se observa que estas tasas de difusión son tres veces más lentas en células T CD4 de VP que de HD (figura 3a). Esto vuelve a demostrar que las cadenas IL-7R alfa están introducidas en MMD anómalos en la superficie de estas células T CD4 (figura 3a). Un tratamiento con COasa más SMasa libera el receptor de sus restricciones por MMD y, por tanto, aumenta su tasa de difusión (figura 3a). Por contraste, un tratamiento con citocalasina D (Cit D) más colchicina (Col) (que desorganiza el citoesqueleto) no produce efecto sobre la tasa de difusión de la cadena IL-7R alfa en células T CD4 de VP (figura 3a). Puesto que la organización del citoesqueleto es una necesidad absoluta para la transducción de señales, esta ausencia de cualquier conexión funcional o estructural entre IL-7R alfa y la red del citoesqueleto sugiere que la señalización no puede producirse cuando los complejos de IL-7R son secuestrados en MMD anómalos, como es el caso en las células T CD4 de VP.
Entonces se empleó una microscopía de STED pulsada para estudiar la fosforilación de STAT5 (fosfo-STAT5) y el reparto de fosfo-STAT5 en el citoplasma y el núcleo de células T CD4 de HD y VP. La figura 3b muestra imágenes de STED de la distribución de fosfo-STAT5 antes y después de 15 min de estimulación con IL-7. Se advirtió que el fosfo-STAT5 se acumula en el núcleo de células T CD4 de HD, y este fenómeno fue inhibido por la desorganización del citoesqueleto. Por contraste, no se produjo translocación de fosfo-STAT5 al núcleo en células T CD4 de VP ni en las células T CD4 de HD preestimuladas con PHA (figura 3b).
Después se siguió la cinética de aparición de fosfo-STAT5 en el citoplasma y el núcleo durante una hora (figura 3c, d, e). Esto demuestra que la fosfo-STAT5 en las células T CD4 de VP se acumula mayoritariamente en el citoplasma y no migra al núcleo (figura 3d), como en las células T CD4 de HD estimuladas con PHA (figura 3e). Esto resultó particularmente evidente cuando los resultados se comparan con los obtenidos en los cinco minutos siguientes a la estimulación con IL-7 de las células T CD4 de HD, en las que 50% de fosfo-STAT5 se encontró en el núcleo (figura 3c).
Ejemplo 6: El plasma procedente de VP induce MMD anómalos en la superficie de células T CD4 de HD purificadas Después se investigó el origen de la activación aberrante de las células T CD4 de VP. El hecho de que todas las células T CD4 estuviesen implicadas y que una señal no fisiológica, tal como PHA, imita el resultado condujo a una investigación del plasma de VP. Se incubaron células T CD4 de HD purificadas con plasma de VP al 10% durante 30 min y se contaron los MMD en la superficie de las células T CD4, según se detecta mediante la toxina B del cólera marcada (CtxB-AF488). La figura 4a muestra las imágenes obtenidas. El plasma de VP por sí solo un gran número de MMD sobre células T CD4 de HD. La adición de IL-7 no afectó al tamaño o al número de estos MMD (figura 4a). Estos resultados se muestran para el plasma procedente de cinco VP diferentes (figura 4b) y se verificaron usando muchas más muestras de plasma procedentes de estos VP (> 15). Los experimentos también se repitieron usando células T CD4 procedentes de HD diferentes (> 5). Los controles consistieron en el ensayo de muestras de plasma procedentes de pacientes controladores de VIH ("HIV-controllers", HIC) y tratados con antirretrovíricos ("antiretroviral-treated", ART) en células T CD4 de HD purificadas. Ninguna de estas indujo MMD ni inhibió la inducción de IL-7 de MMD (figura 4c).
Esto se volvió verificó a verificar mediante el ensayo de un gran número de diluciones de los diversos plasmas (figura 4d). El plasma de VP rebajado a una dilución al 0,1% provocó la formación de MMD dispersados a través de la superficie celular. El plasma de VP diluido en 50 a 100 veces produjo 50% de actividad máxima. Ninguna de las muestras de plasma procedentes de pacientes HIC o ART indujo MMD a ninguna dilución.
Ejemplo 7: El plasma procedente de VP inhibe la translocación nuclear de fosfo-STAT5 inducida por IL-7
Se ensayó la función de la IL-7R en células T CD4 de HD tratadas con plasma de VP siguiendo la fosforilación de STAT5 y la translocación nuclear. Tal como puede observarse en la figura 5a, la preincubación de células T CD4 de HD con plasma de VP (concentración al 10%) inhibió la fosforilación de STAT5 inducida por IL-7 y su translocación nuclear. La figura 5b muestra los resultados obtenidos con cinco muestras de plasma de VP. En todos los casos, a una dilución del 10% se inhibió la translocación nuclear de fosfo-STAT5. Estos resultados fueron confirmados con plasmas procedentes de VP diferentes (> 15) y diversas fuentes de células T CD4 de HD (>5).
También se ensayó el efecto de plasma derivado de pacientes HIC y ART mediante su preincubación con células T CD4 de HD purificadas (figura 5a y 5c). De nuevo, en este caso, solo el plasma de VP fue capaz de inhibir la translocación nuclear de fosfo-STAT5 inducida por IL-7. También se determinó (figura 5d) que el plasma de VP es activo hasta una dilución del 0,1%, y se obtuvo la actividad semimáxima a una dilución en 50 a 100 veces, lo cual se correlaciona con la capacidad para inducir MMD anómalos (figura 4d).
También se ensayó el efecto de plasma derivado de pacientes tratados ART, pero no respondedores (CD4-NR) a su tratamiento (bajo recuento de ARN vírico y bajo recuento de células T CD4) mediante su preincubación con células T CD4 de HD purificadas. De nuevo, en este caso, solo el plasma de CD4-NR fue capaz de inhibir la translocación nuclear de fosfo-STAT5 inducida por IL-7. También se determinó que el plasma de CD4-NR es activo hasta una dilución del 0,1%, y se obtuvo la actividad semimáxima a una dilución en 50 a 100 veces, lo cual se correlaciona con la capacidad para inducir MMD anómalos, tal como se observa con VP.
Ejemplo 8: Caracterización molecular del factor inductor del estado refractario
Se investigó la naturaleza química del RIF. Los estudios realizados (figura 6a) demostraron que el RIF es una proteína, puesto que la tripsina destruyó su actividad. El tratamiento con péptido N-glicanasa (PNGasa) no produjo ningún efecto, lo cual indica que no es necesaria una N-glicosilación para la actividad RIF.
Después se midió el peso molecular de RIF mediante cromatografía de exclusión molecular en una columna Sephadex G-100. Se midió la inducción de MMD (figura 6b) y la inhibición de la translocación nuclear de fosfo-STAT5 inducida por IL-7 (figura 6c) en todas las fracciones eluidas de la columna. En la figura 6 se muestran dos perfiles de columna representativos. Ambos demuestran que RIF es un único factor, con un PM entre 10 y 15 kDa. La figura 6b muestra las densidades de los péptidos o proteínas víricos medidas mediante transferencia por puntos en cada una de las 100 fracciones recogidas de la columna Sephadex G100. Las mediciones se repitieron tres veces con diferentes anticuerpos policlonales procedentes de muestras de plasma de VP caracterizadas por su alta actividad contra proteínas víricas. Para cada experimento, las señales obtenidas con los plasmas de HD después se restaron de los valores. El patrón mostrado en la figura 6b demuestra que no se detectaron fragmentos o proteínas víricas en la fracción que contenía actividad RIF, mientras que el ensayo de transferencia por puntos fue capaz de detectar proteínas víricas con un PM mayor (de 190 a 32 kDa).
Después se usaron fracciones enriquecidas activas de 10 a 15 kDa procedentes de las columnas Sephadex G100 para enmarcar el punto isoeléctrico de RIF mediante la retención en columnas de intercambio aniónico (MonoQ) o catiónico (MonoS), seguido de una elución de pH (el pH aumenta con MonoS o el pH disminuye con MonoQ) (figura 6d). Después se midió la actividad inductora de MMD de las diversas fracciones de pH después de ajustar su pH a 7,4. En todos los casos, se recuperó del 25 al 30% de la actividad inicial en dos fracciones, un resultado coherente con un punto isoeléctrico de 6,5 a 8,0.
Por tanto, RIF es una proteína segregada, con un PM de aproximadamente 15k Da, un pI de aproximadamente 7,5­ 8,0, que contiene un puente disulfuro. Siguiendo las anteriores características estructurales y funcionales, se obtuvo directamente la identidad de RIF. En particular, de entre las 36853 proteínas humanas conocidas, solo 62 presentaban las anteriores cuatro características de RIF. Se analizó un material semipurificado preparado a partir de tres pacientes virémicos y tres HD usando una espectrometría de masa y el programa Mascot convencional. Las proteínas recuperadas se clasificaron según la puntuación p descrita en la sección de materiales y métodos. Los resultados mostrados en la siguiente tabla 1 indican clara y directamente que RIF es GIBsPLA2.
Tabla 1
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Por tanto, la proteína encontrada en el plasma de pacientes virémicos es la forma segregada de GIBsPLA2. La proteína madura tiene 125 aa (PM 14138), PI de 7,95 y 7 puentes disulfuro. Usando GIBsPLA2 porcina purificada del mercado, fue posible verificar in vitro que esta proteína induce MDM anómalos, que bloquean la translocación nuclear de pSTAT5 IL-7 en el plasma de pacientes virémicos, lo cual vuelve a confirmar que RIF es GIBsPLA2, más específicamente su forma segregada. La secuencia de aminoácidos de GIBsPLA2 humana se proporciona como SEQ ID NO:2.
Ejemplo 9: PLA2sGIB induce la falta de respuesta (anergia) de linfocitos CD4
El ejemplo 7 demuestra que PLA2sGIB, a través de la inducción de aMMD, induce un bloqueo de la translocación nuclear de fosfo-STAT5 inducida por IL-7 (NT pSTAT5). Por consiguiente, los linfocitos T CD4 no responde a IL-7 y, a pesar del nivel elevado de esta citoquina en el plasma de pacientes VIH, su número disminuye, lo cual conduce a linfopenia de CD4, la característica de los pacientes infectados por VIH.
En este caso se investigó la posibilidad de que PLA2sGIB también participe en la inducción de la anergia, otra característica de los linfocitos CD4 procedentes de pacientes infectados crónicamente con VIH.
Bioensayo
Inducción de MMD:
En primer lugar, se incubó plasma de VP que contenía PLA2sGIB (20 min) en medio con células T CD4 de HD. Después las células se cultivaron en portaobjetos de vidrio revestidos de polilisina durante 10 min más. Después se fijaron con paraformaldehído (PFA, al 1,5%, 15 min a 37 °C, seguido de 15 min a temperatura ambiente) antes de teñirse con la toxina B del cólera (CtxB-AF488), y los MMD se contaron mediante microscopía de CW-STED.
Inhibición de la fosforilación de STAT y translocación nuclear:
En primer lugar, el plasma de VP que contenía PLA2sGIB se incubó con células T CD4 de HD purificadas (20 min) antes de una estimulación con IL-7 (2 nM, 15 min). Después las células se cultivaron en portaobjetos de vidrio revestidos de polilisina antes de una fijación con PFA (al 1,5%) y una permeabilización con metanol (90% a - 20 °C). Después pSTAT5 se tiñó con anti-STAT5 de conejo marcado con anti-Atto642 de conejo de cabra y se analizó mediante FACS o microscopía de STED pulsada.
Resultados
La figura 10a demuestra que, después de la exposición a PLA2 GIB (plasma de paciente virémico), los linfocitos CD4 procedentes de donantes sanos (HD) no pudieron responder a IL-2, según se mide mediante la inhibición de NT pSTAT5 inducida por IL-2. Esta inhibición es total con plasma al 3%, y muy significativa con plasma al 1% (p<0,0001).
Después se estudió la respuesta de linfocitos T reg CD4+ CD25+ a PLA2 GIB. Los resultados se presentan en la figura 10b. Tal como se ilustran, mientras que 100% de las células sanas responden a IL-2 mediante NT pSTAT5, PLA2 GIB (plasma de pacientes virémicos al 1%) inhibe completamente este mecanismo de transducción de señales. Puesto que las células CD4+ CD25+ representan menos del 5% de las células T CD4 totales, no pueden influir significativamente en los datos presentados en la figura 10a.
IL-7 e IL-2 son miembros de la familia de citoquinas gamma c. Para confirmar que la falta de respuesta a esta citoquina puede estar relacionada con gamma c, se ensayó la respuesta a IL-4. Se midió la respuesta a IL-4 siguiendo la NT de pSTAT6 inducida por IL-4 (figura 11). Los resultados de los inventores demuestran claramente que la respuesta a IL-4 es inhibida por PLA2 GIB (completamente con plasma al 3% y en gran medida por plasma al 1%).
Por tanto, estos resultados demuestran que los mecanismos de señalización inducidos por citoquinas de la familia gamma c son alterados por PLA2 GIB. Esto concuerda totalmente con el descubrimiento de los inventores de que la cadena del receptor de gamma c se encuentra completamente secuestrada en aMMD que se encuentran espontáneamente sobre la superficie de linfocitos CD4 procedentes de pacientes con VIH (los datos no se muestran).
Ejemplo 10: Actividad de las formas recombinantes de PLA2 GIB
En este ejemplo, se ensayó la actividad de diversas formas purificadas de proteínas de PLA2 GIB para confirmar aún más el efecto de esta proteína en forma purificada sobre el sistema inmunológico, y para confirmar aún más su especificidad.
Ensayo enzimático
El ensayo se realizó con el kit de ensayo Enz Check PLA2 de Life Technologies (referencia: E102147). Este ensayo proporciona un control a tiempo real rápido y continuo de las actividades de la enzima de PLA2. La actividad PLA2 se sigue mediante el aumento en la intensidad de una única longitud de onda a 515 nm. PLA2 se detecta mediante cambios en la proporción de intensidad de emisión a 515/575 nm con excitación a 460 nm. Las actividades específicas se expresan en cantidad de sustrato fluorescente (U) obtenido por segundo y por |jg de enzima en disolución.
Resultados
Los datos se proporcionan en la siguiente tabla 2.
Tabla 2: Actividad de proteínas de PLA2 GIB recombinantes
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Los resultados demuestran que PLA2 GIB humana recombinante producida en E. coli muestra una potente actividad enzimática. Además, los resultados también demuestran que la PLA2GIB porcina recombinante producida en E. coli tiene una actividad específica similar a la de la PLA2GIB humana recombinante. Por contraste, PLA2GIIA y PLA2GIID recombinantes no son activas, y PLA2GX tiene una actividad muy limitada.
Por tanto, PLA2 GIB recombinante representa un agente activo potente para su uso en la presente invención.
Ejemplo 11: Los efectos de PLA2sGIB sobre linfocitos CD4 implican a su actividad enzimática
En este ejemplo se investigó si la actividad de PLA2sGIB sobre los linfocitos CD4 implica (por ejemplo, es consecuencia) a una actividad enzimática (por ejemplo, catalítica) de PLA2sGIB. Esta actividad enzimática modificaría la estructura de membrana que conduce a la formación de múltiples aMMD en la superficie de linfocitos CD4.
En estos experimentos, se ensayó un mutante de PLA2sGIB, en el que una histidina crucial en la posición 48 fue reemplazada por glutamina (H48Q mutante). Usando el ensayo enzimático descrito en el ejemplo 10, se comparó la actividad enzimática de PLA2 GIB porcina recombinante producida en E. coli con la actividad de H48Q mutante también producida en E. coli. Cada proteína se usó a 200 microM. Tal como se muestra en la figura 12, el mutante ha perdido toda su actividad enzimática, lo cual ilustra el papel crucial de la histidina en la posición 48 en PLA2 GIB. Después se comparó la actividad de PLA2 GIB porcina de tipo salvaje con su H48Q mutante en un bioensayo. Los resultados presentados en la figura 13 demuestran que el mutante ha perdido la capacidad de wtPLA2 GIB de inducir aMMD o de reducir o abrogar la translocación nuclear de pSTAT5 inducida por IL-7 (NT pSTAT5).
Por tanto, estos resultados demuestran que la actividad enzimática está implicada en los efectos patogénicos de PL2 GIB sobre los linfocitos CD4.
Ejemplo 12: Los anticuerpos anti-GIBsPLA2 restablecen la actividad de células T CD4 en el plasma de pacientes VIH virémicos
Este ejemplo ilustra que, en el plasma de paciente virémicos, GIBsPLA2 transforma los linfocitos CD4 procedentes de HD en linfocitos "enfermos", comparables a los caracterizados en la sangre de pacientes infectados por VIH. Este ejemplo demuestra además que los anticuerpos anti-GIBsPLA2 suprimen, de modo eficaz, la actividad patogénica. En una primera serie de experimentos, el plasma se trató con esferas de Sepharose revestidas con anticuerpos de cabra dirigidos contra GIBsPLA2 humana o con dos anticuerpos de cabra control dirigidos contra antígenos no pertinentes. La figura 14(a) claramente demuestra que los anticuerpos anti-GIBsPLA2 abolen o eliminan completamente la actividad del plasma, que ya no puede inducir MMD anómalos en linfocitos CD4 procedentes de HD. Los anticuerpos control I y control II no produjeron ningún efecto. Estos experimentos se repitieron tres veces para cada plasma y se estudiaron tres plasmas diferentes procedentes de pacientes virémicos.
La figura 14(b) muestra resultados idénticos. En este caso, el plasma se trató como anteriormente, pero se analizó usando el segundo bioensayo. El plasma tratado con esferas de Sepharose revestidas con anticuerpos anti-GIBsPLA2 ya no inhibe la translocación nuclear de pSTAT5 inducida por IL-7. Los anticuerpos de cabra de control I y control II no afectaron a la capacidad del plasma procedente de pacientes virémicos para inhibir la translocación nuclear de pSTAT5 inducida por IL-7.
En una segunda serie de experimentos, se ensayaron los efectos de anticuerpos neutralizantes de conejo dirigidos específicamente contra GIBsPLA2, -GIIA y -GIID. Estos anticuerpos se incubaron con el plasma y las células durante los bioensayos. Los resultados obtenidos demuestran que los anticuerpos anti-GIBsPLA2 neutralizan los efectos del plasma virémico según se mide mediante la inducción de MMD anómalos y mediante la inhibición de la translocación nuclear de pSTAT5 inducida por IL-7. Merece la pena mencionar que los anticuerpos dirigidos contra PLA2-GIIA segregada o PLA2-GIID segregada, dos fosfolipasas que están muy relacionadas con GIBsPLA2, no produjeron ningún efecto en este ensayo.
Estos resultados demuestran que los anticuerpos anti-GIBsPLA2 pueden revertir y prevenir el efecto inmunosupresor del plasma virémico. Estos resultados demuestran que los anticuerpos anti-GIBsPLA2 pueden prevenir la inmunodeficiencia y reestimular la respuesta inmunológica en sujetos inmunodefectuosos.
Estos resultados también demuestran que la respuesta es específica. GIBsPLA2 es el único efector implicado en el efecto patogénico examinado y que caracteriza al plasma de pacientes virémicos.
Ejemplo 13: Los anticuerpos anti-PLA2 GIB inhiben los efectos de PLA2 GIB sobre células CD4
Se usó PLA2G1B humana clonada y purificada para inmunizar conejos. Se prepararon fracciones de inmunoglobulina de los correspondientes sueros. Se midió su capacidad para inhibir la actividad enzimática de PLA2G1B en membranas de E. coli radiomarcadas. Se añadieron las fracciones de inmunoglobulina activa al bioensayo que incluyen linfocitos CD4 purificados a partir de la sangre de donantes sanos. Después se añadió PLA2 segregada clonada y purificada (GIB, GIIA, GIID y GX) a los cultivos. Como controles se usaron fracciones de inmunoglobulina preparadas a partir de conejos inmunizados con diversas PLA2 segregadas.
La figura 15 demuestra que diferentes concentraciones de anticuerpo policlonal inhiben la inducción de aMMD (figura 15a) y bloquean la NT de pSTAT5 inducida por IL-7 (figura 15b). Esta actividad puede obtenerse desde 1 pg/ml a 100 pg/ml de Ig que contiene anticuerpos anti-PLA2 GIB. Esta actividad es totalmente específica, puesto que los anticuerpos dirigidos contra PLA2 GIIA, PLA2GIID o PLA2GX no produjeron efectos en el bioensayo (figura 15 a y b).
Estos resultados vuelven a demostrar que puede usarse la inhibición de PLA2GIB para tratar inmunodeficiencias y para restablecer la actividad CD4.
Ejemplo 14: El receptor de PLA2GIB soluble inhibe los efectos de PLA2 GIB sobre células T CD4
Como otra demostración de que los inhibidores de PLA2GIB pueden ejercer un efecto terapéutico, se ensayó una forma soluble de un receptor de PLA2GIB.
En una primera serie de experimentos, se usó el receptor murino soluble específico de PLA2 GIB que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:22):
MVQWLAMLQLLWLQQLLLLG1HQGIAQDLTHIQEPSLEWRDKGIFIIQSESLKTCIQAGK SVLTLENCKQPNEHMLWKWVSDDHLFNVGGSGCLGLNISALEQPLKLYECDSTLISLRWH CDRKMIEGPLQYKVQVKSDNTVVARKQ1HRWIAYTSSGGDICEHPSRDLYTLKGNAHGMP CVFPFQFKGHWHHDCIREGQKEHLLWCATTSRYEEDEKWGFCPDPTSMKVFCDATWQRNG SSRICYQFNLLSSLSWNQAHSSCLMQGGALLSIADEDEEDFIRKHLSKVVKEVWIGLNQL DEKAGWQWSDGTPLSYLNWSQEITPGPFVEHHCGTLEVVSAAWRSRDCESTLPYICKRDL NHTAQGILEKDSWKYHATHCDPDWTPFNRKCYKLKKDRKSWLGALHSCQSNDSVLMDVAS LAEVEFLVSLLRDENASETWIGLSSNKIPVSFEWSSGSSVIFTNWYPLEPRILPNRRQLC VSAEESDGRWKVKDCKERLFYICKKAGQVPADEQSGCPAGWERHGRFCYKIDTVLRSFEE ASSGYYCSPALLTITSRFEQAFITSLISSVAEKDSYFWIALQDQNNTGEYTWKTVGQREP VQYTYWNTRQPSNRGGCVVVRGGSSLGRWEVKDCSDFKAMSLCKTPVKIWEKTELEERWP FHPCYMDWESATGLASCFKVFHSEKVLMKRSWREAEAFCEEFGAHLASFAHIEEENFVNE LLHSKFNWTQERQFWIGFNRRNPLNAGSWAWSDGSPVVSSFLDNAYFEEDAKNCAVYKAN KTLLPSNCASKHEWICRIPRDVRPKFPDWYQYDAPWLFYQNAEYLFHTHPAEWATFEFVC GWLRSDFLTIYSAQEQEF1HSKIKGLTKYGVKWWIGLEEGGARDQIQWSNGSPVIFQNWD KGREERVDSQRKRCVFISSITGLWGTENCSVPLPSICKRVKIWVIEKEKPPTQPGTCPKG WLYFNYKCFLVTIPKDPRELKTWTGAQEFCVAKGGTLVSIKSELEQAFITMNLFGQTTNV WIGLQSTNHEKWVNGKPLVYSNWSPSDIINIPSYNTTEFQKHIPLCALMSSNPNFHFTGK WYFDDCGKEGYGFVCEKMQDTLEHHVNVSDTSAIPSTLEYGNRTYKIIRGNMTWYAAGKS CRMHRAELASIPDAFHQAFLTVLLSRLGHTHWIGLSTTDNGQTFDWSDGTKSPFTYWKDE ESAFLGDCAFADTNGRWHSTACESFLQGAICHVVTETKAFEHPGLCSETSVPWIKFKGNC YSFSTVLDSRSFEDAHEFCKSEGSNLLAIRDAAENSFLLEELLAFGSSVQMVWLNAQFDN NNKTLRWFDGTPTEQSNWGLRKPDMDHLKPHPCVVLRIPEGIWHFTPCEDKKGFICKMEA GIPAVTAQPEKGLSHSIVPVTVTLTLIIALGIFMLCFWIYKQKSDIFQRLTGSRGSYYPT LNFSTAHLEENILISDLEKNTNDEEVRDAPATESKRGHKGRPICISP
El inhibidor se ensayó en el bioensayo descrito en el ejemplo 9, a una concentración de 100 nM. Los resultados se presentan en la figura 16. Estos demuestran que puede usarse un receptor soluble de PLA2 recombinante como potente antagonista, y que dicha molécula es capaz de bloquear significativamente el efecto negativo de PLA2sGIB sobre la NT de pSTAT5 (figura 16).
Pueden obtenerse resultados similares en otros conjuntos de experimentos que emplean polipéptidos de unión a PLA2-GIB que comprenden la secuencia de SEQ ID NO:25 o 28.
Ejemplo 15: La sobreexpresión de GIBsPLA2 induce una deficiencia inmunológica
Se ha demostrado previamente que la terapia antirretrovírica muy activa ("Highly Active Anti-Retroviral Therapy", HAART), que reduce la carga vírica, también induce un aumento del recuento de CD4 en la mayoría de los pacientes. Sin embargo, en algunos pacientes, a pesar del hecho de que el VIH se hace indetectable, los recuentos de CD4 no aumentan. Los inventores han estudiado previamente esta situación clínica y han demostrado que, en estos pacientes denominados CD4 no respondedores (CD4-NR), aparecen defectos fuertes y persistentes en la población de linfocitos T CD4.
La figura 17 demuestra que el plasma de pacientes CD4-NR contiene más actividad PLA2 GIB que el plasma procedente de un paciente virémico tomado como control. Esto se midió en primer lugar mediante la inducción de MMD anómalos por célula. Estos datos también fueron confirmados midiendo la capacidad para inhibir la translocación nuclear de pSTAT5 inducida por IL-7.
Tomados conjuntamente, los resultados demuestran que el plasma de los pacientes CD4-NR contiene cientos de veces más actividad PLA2 GIB que el plasma procedente de pacientes virémicos.
Análisis
Los resultados de los inventores demuestran que PLA2 GIB induce una inmunosupresión similar a la que caracteriza a las células T CD4 procedentes de pacientes virémicos, incluyendo la incapacidad para responder a IL-2 (anergia) y a IL-7 (mecanismo central hacia la linfopenia de CD4). Por tanto, la expresión de GIBsPLA2 durante una infección por VIH desempeña un papel central en la patofisiología de la enfermedad inmunológica que caracteriza a estos pacientes. Estos defectos son específicos del tipo de célula, puesto que los linfocitos T CD8 procedentes de pacientes con VIH no muestran MMD anómalos y continúan respondiendo a IL-7 (los datos no se muestran). El modo de acción PLA2 GIB probablemente es consecuencia de su actividad enzimática. Mediante el ataque a la membrana del linfocito CD4 se modifica su fluidez y esto probablemente permite la formación de MMD muy grandes y anómalos.
Las reacciones inflamatorias desempeñan un papel importante durante la infección por VIH. Sin embargo, su papel exacto en la patogénesis del VIH sigue sin aclararse. Tomando en consideración los datos de los inventores, se puede establecer la hipótesis de que la infección por VIH induce un tipo muy peculiar de inflamación que incluye a GIBsPLA2. Además, se puede especular que, después de la inducción de PLA2 GIB, su secreción escapa a los procesos reguladores normales, conduciendo, por tanto, a una producción crónica y a trastornos inmunológicos, que son la consecuencia directa de la disfunción de los linfocitos T CD4. Como consecuencia indirecta de la disfunción de los linfocitos T CD4, también pueden observarse otros defectos. Por ejemplo, una producción disminuida de interferón gamma disminuirá las funciones de monocitos/macrófagos y de asesinas naturales.
La correlación entre la recuperación de la actividad PLA2 GIB plasmática y las características de diferentes grupos de paciente también proporciona mucha información. Los "controladores de VIH" son pacientes muy poco habituales que mantienen una carga vírica indetectable y recuentes de CD4 cuasinormales a lo largo de los años. Los resultados de los inventores demuestran que no expresan actividad PLA2 GIB en su plasma. Por contraste, en la mayoría de los pacientes, esta enzima se expresa y representa el lado negativo de la inflamación que conduce a la enfermedad inmunológica. De modo global, esto claramente establece que PLA2 GIB es un parámetro muy crucial en la patofisiología de la infección por VIH.
A la disminución de la carga vírica en HAART le sigue un restablecimiento inmunológico, que incluye un aumento en los recuentos de CD4. Durante este tratamiento, la actividad PLA2 GIB desaparece en el plasma de los pacientes. Puesto que se considera que HAART disminuye las reacciones inflamatorias, esto también sugiere que PLA2 GIB es parte de estos procesos inflamatorios. De manera más importante, en la presente se describe el caso de los pacientes CD4-NR que permanecen con recuentos de CD4 muy bajos, mientras que HAART controla su carga vírica. La sobreproducción de PLA2 GIB que se encuentra en estos individuos puede explicar la persistencia de la enfermedad inmunológica que caracteriza este estado clínico. Por tanto, después de HAART, se produce una fuerte correlación entre la producción disminuida de PLA2 GIB que conduce al restablecimiento inmunológico, o su persistente sobreproducción que conduce a la irreversibilidad de la enfermedad inmunológica.
Las consecuencias terapéuticas y utilidades de este descubrimiento son inmensas. En efecto, la inhibición de PLA2 GIB puede usarse para prevenir o curar la enfermedad inmunológica de pacientes con VIH, así como, de modo más general, de sujetos inmunodeprimidos. Aplicados de modo temprano durante la infección, los inhibidores de PLA2 GIB conducen a los pacientes hacia un estado de controlador de VIH. Aplicados más tarde, por sí solos o junto con/en alternancia con HAART, aceleran la recuperación de las funciones de los linfocitos T CD4, y mediante el refuerzo de las defensas del hospedante, los inhibidores de PLA2 GIB conducen a un equilibrio entre el virus y el sistema inmunológico, al igual que en muchas otras infecciones crónicas víricas. Por tanto, los inhibidores de PLA2 GIB representa agentes muy potentes para su uso, por sí solos o en combinación, para tratar trastornos asociados con una actividad o respuesta inmunológica anómala. También pueden ayudar a no tomar HAART y podrían conducir a la interrupción de estos tratamientos, conocidos por sus graves efectos perjudiciales.
Además, puesto que la falta de expresión de GIBsPLA2 (como en ratones KO para el correspondiente gen) es bien tolerada, la supresión transitoria o permanente de GIBsPLA2 usando inhibidores o a través de una vacunación, representa una inmunoterapia potente y válida de trastornos inmunológicos, en particular en pacientes con VIH. Referencias bibliográficas
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Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Un compuesto para su uso en un método para tratar una inmunodeficiencia de células T CD4 en un sujeto que lo necesita, en el que el compuesto es un inhibidor de la fosfolipasa A2 del grupo IB segregada (PLA2GIB) seleccionada de un anticuerpo anti-PLA2GIB o un receptor de PLA2GIB soluble, en el que la PLA2GIB es una proteína que comprende los restos aminoácidos 23-148 de SEQ ID NO:2, o uno de sus variantes naturales.
  2. 2. - El compuesto para su uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo de PLA2GIB se selecciona de anticuerpos policlonales anti-PLA2GIB, anticuerpos monoclonales anti-PLA2GIB, y sus fragmentos que se unen a PLA2GIB seleccionados de fragmentos F(ab’)2 y Fab, fragmentos variables monocatenarios (scFv), fragmentos de anticuerpo de dominio único VHH, y fragmentos de anticuerpos de diacuerpos bivalentes.
  3. 3. - El compuesto para su uso según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
  4. 4. - El compuesto para su uso según la reivindicación 2 o 3, en el que el anticuerpo es humano o está humanizado.
  5. 5. - El compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para tratar una inmunodeficiencia provocada por una infección vírica o bacteriana.
  6. 6. - El compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para tratar una inmunodeficiencia provocada por un cáncer.
  7. 7. - El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en un método para tratar el SIDA en un sujeto infectado por VIH.
  8. 8. - El compuesto para su uso según la reivindicación 7, para suprimir o revertir la inmunodeficiencia mediada por VIH.
  9. 9. - El compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto se administra mediante inyección, preferiblemente intramuscular, subcutánea, transdérmica, intravenosa o intraarterial; mediante administración nasal, oral, mucósica o rectal, o mediante inhalación.
  10. 10. - Una composición farmacéutica que comprende, en forma de una disolución inyectable o una suspensión inyectable, (i) un anticuerpo inhibidor contra la fosfolipasa A2 del grupo IB segregada (PLA2GIB) seleccionado de anticuerpos policlonales anti-PLA2GIB, anticuerpos monoclonales anti-PLA2GIB, y sus fragmentos que se unen a PLA2GIB seleccionados de fragmentos F(ab’)2 y Fab, fragmentos variables monocatenarios (scFv), fragmentos de anticuerpo de dominio único (VHH o nanocuerpos), y fragmentos de anticuerpos bivalentes (diacuerpos), y (ii) un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para una disolución inyectable o una suspensión inyectable, y en la que la PLA2GIB es una proteína que comprende los restos aminoácidos 23-148 de SEQ ID NO:2, o uno de sus variantes naturales.
  11. 11. - La composición de la reivindicación 10, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
  12. 12. - La composición de la reivindicación 10 u 11, en el que el anticuerpo es humano o está humanizado.
  13. 13. - Una composición farmacéutica para su uso en un método para tratar una inmunodeficiencia de células T CD4 en un sujeto que lo necesita, que comprende (i) un anticuerpo inhibidor contra la fosfolipasa A2 del grupo IB segregada (PLA2GIB) seleccionado de anticuerpos policlonales anti-PLA2GIB, anticuerpos monoclonales anti-PLA2GIB, y sus fragmentos que se unen a PLA2GIB seleccionados de fragmentos F(ab’)2 y Fab, fragmentos variables monocatenarios (scFv), fragmentos de anticuerpo de dominio único (VHH o nanocuerpos), y fragmentos de anticuerpos bivalentes (diacuerpos), y (ii) un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, y en la que la PLA2GIB es una proteína que comprende los restos aminoácidos 23-148 de SEQ ID NO:2, o uno de sus variantes naturales.
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