JP5686600B2 - 新規モノクローナル抗体とその用途 - Google Patents

Description

本発明は、ブチロフィリン（ＢＴＮ）３抗原を特異的に認識する新規モノクローナル抗体に関する。更には、当該モノクローナル抗体の用途に関する。

近年、細胞の解析技術の進歩により、一つ一つの細胞から非常に多くの情報を得る事が可能となった。例えばフローサイトメトリーでは、細胞が１個ずつ通る細い流路を作り、そこを流れる細胞にレーザー光が当たって起こる散乱光と蛍光を検出器によって検出し、得られた情報を分析する事で細胞の状況を知ることができる。特に細胞表面抗原の解析においては蛍光物質で標識された抗体で細胞を染色してフローサイトメトリー解析を行う方法が一般的に知られている。

上記のように細胞の解析を行うには、細胞表面抗原特異的な抗体を用いることが必要不可欠である。これまで数々の細胞表面抗原とそれぞれに特異的に対応する抗体が同定され、細胞機能解析に大きな成果を挙げている。そして現在も多くの研究者が新規抗原の発見とそれに対応する抗体の作製に取り組んでいるが、未だ存在が確認されながらも機能が明らかでない分子は多く、発見されていない分子も数多く存在すると考えられている。

細胞表面抗原分子について、ヒト白血球分化抗原に関する国際ワークショップではＷＨＯ（世界保健機構）の監修のもとで、造血系細胞に対するモノクローナル抗体を反応特異性に基づくクラスターに分類し、それぞれにＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）番号を付している。各々の抗体のＣＤ番号は特定の細胞表面抗原分子に対応している。

細胞表面抗原のひとつとしてブチロフィリン（以下、ＢＴＮ）抗原が知られている。ＢＴＮ抗原はイムノグロブリンスーパーファミリーに属し、サブファミリーによりＢＴＮ１、ＢＴＮ２、ＢＴＮ３に分類される膜貫通分子である。更に細かくは、メンバー分類が存在し、例えばＢＴＮ３についてはＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３と分類される。

ＢＴＮ３Ａ１（ブチロフィリン、サブファミリー３、メンバーＡ１）は、分子量５６ｋＤのＣＤ２７７として同定されており、この抗原はＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、単球、樹状細胞といった、リンパ球全般に発現が確認されている。これに対するモノクローナル抗体は、既にフランスのグループが取得しており、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社より試薬として製品化されている（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ２７７（Ｂ７ Ｆａｍｉｌｙ，Ｂｕｔｙｒｏｐｈｉｌｉｎ）、商品名；ｅＢｉｏＢＴ３．１）。しかしながら、その特徴はＢＴＮ３を特異的に認識するのみであり、ＢＴＮ３の機能及び特性については明らかにされていない（非特許文献１及び２）。

ＢＴＮ３Ａ３に対するマウスポリクローナル抗体としては、例えばイタリアのグループが取得した（ＢＴＮ３Ａ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ａｂｃａｍ）（非特許文献３）が、前記ＢＴ３．１同様に試薬として製品化されている。

また近年、モノクローナル抗体を用いた分子標的医薬又は抗体医薬の開発が盛んに行われているが、ＢＴＮ３Ａ３に対するモノクローナル抗体医薬に関する報告はなく、ＢＴＮ３の機能や性質についても報告はされていない。

これまで明らかにされていなかったＢＴＮ３の機能や性質を理解する事が重要であり、ＢＴＮ３の性質を利用する事で、自己免疫疾患の治療や、免疫細胞療法、臓器移植といった医療分野において更なる発展が期待できる。

細胞増殖を抑制する方法としては、例えば、免疫抑制剤としての抗ＣＤ３抗体から成るオルソクローンＯＫＴ３注（ムロモナブ−ＣＤ３注射液；ヤンセンファーマ）等があるが、これはＣＤ３を発現したＴ細胞のみを抑制する物である。リンパ球全般の増殖抑制に関与する分子の報告はされていない。

活性化細胞と非活性の細胞を識別する方法としては、活性化マーカーとして知られているＣＤ２５、ＣＤ６９等リンパ球活性化によって発現する分子が挙げられる。しかし、逆に非活性のリンパ球に発現し、活性化リンパ球には発現が低下する分子の例は殆ど知られていない。

Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４．Ｖｏｌ．３４，Ｐ２０８９−２０９９ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｔｉｃｓ，１９９７．Ｖｏｌ．４７，Ｐ５５−６３ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００２．Ｖｏｌ．２−７，Ｐ８５０−８５６

本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、細胞表面上に存在するＢＴＮ３を特異的に認識する新規モノクローナル抗体及びその利用方法を提供する事を課題とする。更には、該抗体を用いて作製される試薬及び医薬等を提供する事を課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を行ったところ、ＢＴＮ３を特異的に認識するモノクローナル抗体（以下、本発明抗体と記載）を得たことにより本発明を完成させた。また、本発明抗体を用いて更に研究を進めることによりこれまで明らかとなっていなかったＢＴＮ３が細胞増殖の抑制に関与していること、リンパ球の活性化とＢＴＮ３の発現は逆相関していることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は下記手段を提供するものである。

（１）膜貫通分子ＢＴＮ３を特異的に認識するモノクローナル抗体；（２）前記膜貫通分子ＢＴＮ３が、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２又はＢＴＮ３Ａ３であることを特徴とする（１）に記載のモノクローナル抗体；（３）前記モノクローナル抗体が、前記膜貫通分子ＢＴＮ３のＮ末端から３５−４０アミノ酸を抗原として認識する事を特徴とする（１）又は（２）に記載のモノクローナル抗体；（４）前記モノクローナル抗体が、リンパ球に対して増殖抑制に働くことを特徴とする（１）から（３）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体；（５）前記モノクローナル抗体が、微生物寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７７又はＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７８のハイブリドーマから産生される抗体と同一の抗原認識部位を有することを特徴とする、（１）から（４）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体。

（６）リンパ球の集団における活性化リンパ球又は非活性のリンパ球の割合の測定方法であって、リンパ球の集団に膜貫通分子ＢＴＮ３を特異的に認識するモノクローナル抗体を結合させる工程と、リンパ球に結合したモノクローナル抗体を検出する工程と、モノクローナル抗体が結合したリンパ球を非活性のリンパ球として、リンパ球の集団における活性化リンパ球又は非活性のリンパ球の割合を算出する工程、とからなる測定方法。；（７）前記膜貫通分子ＢＴＮ３が、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２又はＢＴＮ３Ａ３であることを特徴とする（６）に記載の測定方法；（８）前記モノクローナル抗体が、前記膜貫通分子ＢＴＮ３のＮ末端から３５−４０アミノ酸を抗原として認識する事を特徴とする（６）又は（７）に記載の測定方法；（９）前記モノクローナル抗体が、微生物寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７７又はＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７８のハイブリドーマから産生される抗体と同一の抗原認識部位を有することを特徴とする（６）から（８）のいずれか１に記載の測定方法。

（１０）膜貫通分子ＢＴＮ３を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた、活性化リンパ球と非活性のリンパ球の割合の測定装置；（１１）前記膜貫通分子ＢＴＮ３が、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２又はＢＴＮ３Ａ３であることを特徴とする（１０）に記載の測定装置；（１２）前記モノクローナル抗体が、前記膜貫通分子ＢＴＮ３のＮ末端から３５−４０アミノ酸を抗原として認識する事を特徴とする（１０）又は（１１）に記載の測定装置；（１３）前記モノクローナル抗体が、微生物寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７７又はＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７８のハイブリドーマから産生される抗体と同一の抗原認識部位を有することを特徴とする（１０）から（１２）に記載の測定装置。

（１４）膜貫通分子ＢＴＮ３を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた、活性化リンパ球と非活性のリンパ球の分離方法；（１５）前記分離方法が、リンパ球の集団にＢＴＮ３を特異的に認識するモノクローナル抗体を添加する工程と、リンパ球の集団に含まれる非活性のリンパ球とモノクローナル抗体とを結合させる工程と、モノクローナル抗体の結合したリンパ球と結合していないリンパ球とを分離する工程と、からなる（１４）に記載の分離方法。
（１６）前記膜貫通分子ＢＴＮ３が、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２又はＢＴＮ３Ａ３であることを特徴とする（１４）又は（１５）に記載の分離方法；（１７）前記モノクローナル抗体が、前記膜貫通分子ＢＴＮ３の、Ｎ末端から３５−４０アミノ酸を抗原として認識する事を特徴とする（１４）から（１６）に記載の分離方法；（１８）前記モノクローナル抗体が、微生物寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７７又はＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７８のハイブリドーマから産生される抗体と同一の抗原認識部位を有することを特徴とする（１４）から（１７）のいずれか１に記載の分離方法。

（１９）膜貫通分子ＢＴＮ３を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた、活性化リンパ球と非活性のリンパ球の分離装置；（２０）前記膜貫通分子ＢＴＮ３が、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２又はＢＴＮ３Ａ３であることを特徴とする（１９）に記載の分離装置；（２１）前記モノクローナル抗体が、前記膜貫通分子ＢＴＮ３の、Ｎ末端から３５−４０アミノ酸を抗原として認識する事を特徴とする（１９）又は（２０）に記載の分離装置；（２２）前記モノクローナル抗体が、微生物寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７７又はＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７８のハイブリドーマから産生される抗体と同一の抗原認識部位を有することを特徴とする（１９）から（２１）のいずれか１に記載の分離装置。

（２３）膜貫通分子ＢＴＮ３を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた、リンパ球の増殖の抑制方法；（２４）前記膜貫通分子ＢＴＮ３が、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２又はＢＴＮ３Ａ３であることを特徴とする（２３）に記載の抑制方法；（２５）前記モノクローナル抗体が、前記膜貫通分子ＢＴＮ３の、Ｎ末端から３５−４０アミノ酸を抗原として認識する事を特徴とする（２３）又は（２４）に記載の抑制方法；（２６）前記モノクローナル抗体が、リンパ球に対して増殖抑制に働くことを特徴とする（２３）から（２５）のいずれか１に記載の抑制方法；（２７）前記モノクローナル抗体が、微生物寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７７又はＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７８のハイブリドーマから産生される抗体と同一の抗原認識部位を有することを特徴とする（２３）から（２６）のいずれか１に記載の抑制方法。

（２８）膜貫通分子ＢＴＮ３を特異的に認識するモノクローナル抗体を含む、リンパ球の増殖抑制剤；（２９）前記膜貫通分子ＢＴＮ３が、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２又はＢＴＮ３Ａ３であることを特徴とする（２８）に記載のリンパ球の増殖抑制剤；（３０）前記モノクローナル抗体が、前記膜貫通分子ＢＴＮ３の、Ｎ末端から３５−４０アミノ酸を抗原として認識する事を特徴とする（２８）又は（２９）に記載のリンパ球の増殖抑制剤；（３１）前記モノクローナル抗体が、リンパ球に対して増殖抑制に働くことを特徴とする（２８）から（３０）のいずれか１に記載のリンパ球の増殖抑制剤；（３２）前記モノクローナル抗体が、微生物寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７７又はＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７８のハイブリドーマから産生される抗体と同一の抗原認識部位を有することを特徴とする（２８）から（３１）のいずれか１に記載のリンパ球の増殖抑制剤。

（３３）膜貫通分子ＢＴＮ３からなる活性化リンパ球の逆相関マーカー；（３４）前記膜貫通分子ＢＴＮ３が、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２又はＢＴＮ３Ａ３であることを特徴とする（３３）に記載のマーカー；（３５）（３３）または（３４）に記載のマーカーと、前記マーカーに特異的に結合するモノクローナル抗体とを結合させ、マーカーの発現量を調べることを特徴とする非活性のリンパ球の検出方法；（３６）前記モノクローナル抗体が、微生物寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７７又はＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７８のハイブリドーマから産生される抗体と同一の抗原認識部位を有することを特徴とする（３５）に記載の非活性のリンパ球の検出方法。

本発明抗体は、現在市販されている抗ＣＤ２７７抗体（ｅＢｉｏＢＴ３．１、以下ＢＴ３．１と記す）の８倍〜９倍の親和性を持つため、ＢＴＮ３の発現をより明確に検出する事が可能である。

また、本発明抗体はリンパ球に対して増殖抑制の作用を示すことを発見した。従って、例えばモノクローナル抗体医薬として開発した場合には、自己免疫疾患や臓器移植後の免疫抑制剤として利用できる可能性がある。

更に、本発明者らは、本発明抗体を用いた研究により、活性化シグナルを享受したリンパ球においてＢＴＮ３の発現が減少する事を見出した。この現象は、前記ＢＴ３．１を用いてもある程度観察できるが、より高い親和性をもつ本発明抗体を用いる事でより明確に識別でき、更には生体外においてどの程度の細胞が活性化刺激を受けたかを即座に判断する事が可能となる。例えば、患者血液から採取したリンパ球を生体外で大量に増殖、活性化させて患者体内へ投与する免疫細胞療法を行う場合に、活性化しているリンパ球の割合を知る測定方法・装置として用いることが可能である。

ＢＴＮ３分子が活性化状態のリンパ球での発現が低下する性質から、例えば、本発明抗体による吸着ネガティブセレクション用カラムに応用することで、活性化状態の抗腫瘍免疫に有効な細胞集団を選択的に回収することが可能となる。

ｍｏｃｋ ｇｅｎｅを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞と、ＢＴＮ３Ａ３を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞それぞれにコントロールＩｇＧ２ａ、２３２−５由来モノクローナル抗体した場合の反応を比較した結果である。これらの結果から、本発明抗体（図中、２３２−５）はＢＴＮ３Ａ３に対して特異的なモノクローナル抗体を産生していることを確認した。 図１と同様の実験を、ＩｇＧ２ａ、２３２−５抗体、３４−７抗体を用いて行った結果を示す図である。 予めＢＴ３．１処理していたＰＢＭＣｓにおいて、ＢＴ３．１の濃度依存的に本発明抗体による蛍光強度は減少した。ＢＴ３．１と本発明抗体は共にＢＴＮ３抗原近傍のエピトープを認識していることを示した図である。 ＢＴ３．１及び、本発明抗体（２３２−５抗体）の認識領域がＶｓｅｔ又はＣｓｅｔの何れかを検討するため、ＢＴＮ３のＣｓｅｔのみ（下段：Ｃｏｓ−７ ｐＤｉｓｐｌａｙ ＢＴＮ３ Ｃｓｅｔ）又はＶｓｅｔとＣｓｅｔ両者を発現する（上段：Ｃｏｓ−７ ｐＤｉｓｐｌａｙ ＢＴＮ３ ＥＣ）ベクターにそれぞれの抗体を反応させた。その結果、共に抗原認識部位はＮ末端側のＶｓｅｔ領域に存在することが明らかになった図である。 図４と同様の実験を、ＢＴ３．１、２３２−５抗体、３４−７抗体を用いて行った結果を示す図である。 ＢＴＮ３抗原のＶｓｅｔ領域内での抗原認識部位を推定するためのプラスミドを作製し、ウエスタンブロッティングを行った。これによりＢＴ３．１はＢＴＮ３抗原の４０−５０間のアミノ酸配列を、本発明抗体（２３２−５抗体）はＢＴＮ３抗原の３５−４０間のアミノ酸配列を認識していることが推定された図である。 図６と同様の実験を、ＢＴ３．１、２３２−５抗体、３４−７抗体を用いて行った結果を示す図である。 ＢＴＮ３抗原に対する抗原親和性を比較した。本発明抗体はＢＴ３．１に比べ最大で８〜９倍の親和性を持つことが示された図である。 各種リンパ球集団におけるＢＴＮ３抗原の発現をフローサイトメーターで検証した図である。本発明抗体は各リンパ球集団の細胞表面の殆ど（＞９５％）を認識した。 ＰＢＭＣｓ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に対する、それぞれの抗体の増殖抑制効果を比較した図である。これにより、本発明抗体にのみ増殖抑制効果を確認できた。 図１０と同様の実験を、ＩｇＧ２ａ、ＢＴ３．１、２３２−５抗体、３４−７抗体を用いて行った結果を示す図である。 （ａ）Ｔ細胞のみを選択的に活性化させ、活性化したＴ細胞にのみＢＴＮ３の発現減少が起こることを確認した図である。（ｂ）Ｂ細胞のみを選択的に活性化させ、活性化したＢ細胞にのみＢＴＮ３の発現減少が起こることを確認した図である。 ＰＢＭＣｓをＯＫＴ３／ｒＩＬ−２で７２時間刺激し、ｍＲＮＡを調製し、そこから得られたｃＤＮＡを用いてＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３の発現を検証した図である。未処理、又は培地のみで培養したＰＢＭＣｓでは３種類のＢＴＮ３分子の発現は維持されていたが、ＯＫＴ３／ｒＩＬ−２で培養することで、その発現は減少した。 ＣＤ４陽性Ｔ細胞に比べＣＤ８陽性Ｔ細胞のほうが、活性化マーカーＣＤ２５の発現上昇とＢＴＮ３の発現減少がより顕著であることが示された図である。 ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＯ−ナイーブＴ細胞を分離し、６日間培養を行った時のＢＴＮ３発現減少と活性化マーカーとの逆相関を示す図である。 ナイーブＴ細胞をＯＫＴ３／αＣＤ２８／ｒＩＬ−２で６日間刺激し、その後各種活性化・メモリーマーカーと本発明抗体、ＢＴ３．１を用いてフローサイトメーター解析を実施した図である。ＢＴＮ３抗原の発現は活性化・メモリーマーカーの発現と逆相関を示した。

以下、本発明を実施するための最良の形態について説明する。

ＢＴＮ３に対するモノクローナル抗体
まず、ＢＴＮ３分子に対する本発明抗体について説明する。
本発明抗体は、膜貫通分子であるＢＴＮ３を特異的に認識するモノクローナル抗体である。

ここで、膜貫通分子ＢＴＮ３とはイムノグロブリンスーパーファミリーに属し、サブファミリーによって１〜３に分類された、ブチロフィリン、サブファミリー３を意味している。更にメンバー分類したものが、ＢＴＮ３Ａ１（メンバーＡ１）であり、分子量５６ｋＤのＣＤ２７７として同定されている。この抗原は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞といった、リンパ球全般に発現が確認されている。配列表中の配列番号１及び２はＢＴＮ３Ａ１の遺伝子配列及びアミノ酸配列を、配列番号３及び４はＢＴＮ３Ａ２の遺伝子配列及びアミノ酸配列を、配列番号５及び６はＢＴＮ３Ａ３の遺伝子配列及びアミノ酸配列をそれぞれ示している。細胞膜外領域は３分子とも同様で、配列表に示したアミノ酸配列（それぞれ配列番号２、４又は６）の１〜２４８である。

本発明抗体が認識するＢＴＮ３は、リンパ球において非活性の状態で発現が多く認められるが、活性化シグナルを受けると共にその発現は減少することが明らかとなった。上記の通り、本発明の抗体は、とりわけ非活性のリンパ球に特異的に結合する特性を有する。

本発明抗体は、クローン化されたイムノグロブリン抗体であれば何であってもよく、抗体の由来する動物種、イムノグロブリンのタイプやサブタイプ、抗体の産生方法は問わない。また、抗体を断片化して免疫反応部位を残したもの、それら断片の修復物、抗体そのものの修飾物、二種類の抗体を結合させたキメラ抗体等も包含する。

本発明抗体は、従来公知の方法を適宜用いることで作製する事が可能である。具体的には、例えば目的抗原をコードする遺伝子配列を組み込んだプラスミドＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：デオキシリボ核酸）を作製し、動物へ免疫する。その免疫動物から得たＢ細胞と株化ミエローマ細胞を融合させ、目的の抗原に反応するハイブリドーマを純粋にクローニングし、樹立する。そのハイブリドーマから産生された抗体を抽出、精製する事で必要なときに必要な量を得られる。免疫動物の動物種は特に問わないが、一般的にマウス、ラット、ハムスター、ウサギ等が用いられる。

マウス、ラット等の動物を免疫する免疫原は様々なものを用いることができる。例えば、ＢＴＮ３タンパク質又はそのペプチド断片、ＢＴＮ３をコードする遺伝子又はその断片を導入したベクター、ＢＴＮ３を発現するトランスフェクタント等が挙げられる。本発明の機能を有する抗体を作製する場合には、前記した免疫原いずれのものを用いることもできるが、特に膜外領域を免疫原として用いたり、特にＶｓｅｔ領域（配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列の２６〜１３９の領域）を用いたりすることが考えられる。

本発明抗体は、ＢＴＮ３のＮ末端から３５−４０アミノ酸を抗原として認識する事を特徴とする抗体であるから、ＢＴＮ３のＮ末端から３５−４０アミノ酸を含むペプチドを免疫原として用いることも可能である。ＢＴＮ３のＮ末端から３５−４０アミノ酸とは、配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列の３５番目から４０番目までのアミノ酸配列を指す。この３５番目から４０番目までのアミノ酸配列はＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２及びＢＴＮ３Ａ３で共通しているため、この部分を含むペプチドを免疫原として用いることで、３つのＢＴＮ３分子を認識する抗体となる。

免疫動物（例えば、マウス）にＢＴＮ３の免疫を行う。ＢＴＮ３をコードする遺伝子配列を挿入したベクターと金コロイド等の免疫賦活剤の混合物を、Ｂａｌｂ／ｃマウス、雌８〜１０週齢に遺伝子銃で導入し、約２〜３ヶ月飼育する。

ＢＴＮ３に対する抗体価の上昇は以下の手順により確認できる。
１）適当な細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）に当該遺伝子挿入ベクターを導入し、ＢＴＮ３を一過的に発現させた細胞を作製する。
２）免疫動物から採取した血清（ＢＴＮ３に対するポリクローナル抗体を含んでいる）と混合する。
３）蛍光標識した抗マウスポリクローナル抗体（二次抗体）を用いてフローサイトメーター解析を行う。
上記のように、ＢＴＮ３を一過性発現させた細胞を用いて、抗体価を確認することにより、ＢＴＮ３の細胞膜外に出ている立体構造を認識する抗体が得られているかを確認することができる。

抗体価の強い上昇が確認された後、免疫動物はＢＴＮ３を一過的に発現させた細胞（例えばＣＨＯ細胞）を腹腔内に注射し、最終免疫を行う。最終免疫の３〜５日後、免疫動物の脾臓細胞を取り出して、ミエローマ細胞（例えば、ＳＰ２／０マウスミエローマ細胞）とポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００など）を用いて融合し、ハイブリドーマを作製する。作製したハイブリドーマ細胞株群の中から目的のＢＴＮ３に対する抗体を産生しているハイブリドーマは、ＢＴＮ３を一過的に発現させた細胞とハイブリドーマ培養上清を混合した後、蛍光標識した抗ポリクローナルマウス抗体（二次抗体）を用いてＦＣＭ解析を行うことで選択することができる。

このようにして得られたハイブリドーマ２株を独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国際寄託した。１株はＡｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＢＴＮ３ Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２３２−５（以下、２３２−５と記す）と命名し、２００８年１０月２１日に前記センターに国内寄託を行い（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７０６）、２００９年９月８日にブタペスト条約に基づく国際寄託へ移管した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７７）。もう１株はＡｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＢＴＮ３ Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ３４−７（以下、３４−７と記す）と命名し、２００９年９月１７日に国際寄託を行った（受領番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−１１１７８）。これらのハイブリドーマを用いることにより、本発明抗体を容易に得ることができる。

得られた抗体の精製方法として、例えば硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコール等を用いる塩析法、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過、アフィニティカラム等が挙げられるが、いかなる方法であっても構わない。

リンパ球増殖の抑制方法
本発明抗体を用いることでリンパ球増殖を抑制することができる。例えば生体外にてリンパ球の増殖を抑制するには、本発明抗体をリンパ球が懸濁された溶液中に添加し培養することにより、リンパ球の増殖を抑制することができる。本発明抗体を用いてリンパ球の増殖を抑制する場合、添加濃度１〜１０μｇ／ｍｌにて３日間以上共培養することにより増殖抑制効果が現れる。

リンパ球増殖の抑制機能を利用して、本発明抗体を医薬として用いることができる。例えば自己免疫疾患の患者に投与し、リンパ球の活性化を抑制することにより、自己免疫疾患の症状を抑制することが可能となる。また、臓器移植を行った患者に投与し、患者体内のリンパ球の増殖を抑制することにより、臓器移植後の拒絶反応を抑制することが可能となる。

活性化リンパ球と非活性のリンパ球との分離装置
非活性のリンパ球とは、ＰＢＭＣ（末梢血単核球、Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ
Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ）から回収直後の活性因子による刺激を受けていない状態のリンパ球を指す。形状としては、小さく球状のものである。それに対し活性化リンパ球とは、何らかの活性化因子により刺激を受けた状態のものを指す。形状は大きく、サイトカイン産生能を有し、必ずしも球状とは限らず歪な形をしたものを多く含む。

本発明抗体は活性化リンパ球と非活性のリンパ球との分離装置・方法として用いることができる。本発明の分離装置・方法はリンパ球が活性化シグナルを享受するとＢＴＮ３の発現量が低下することを利用した方法・装置である。

本発明の活性化リンパ球と非活性のリンパ球との分離装置・方法は、例えば本発明抗体とビーズなどの高分子化合物とを結合させ、それをカラム等に充填することにより、ＰＢＭＣ等のリンパ球の集団から効率的に活性化リンパ球又は非活性リンパ球を選択的に分離することができる。

ここでいう高分子化合物としては、体液と接触しても溶解することなく、血球成分と接触しても害を及ぼさない毒性の低いポリマーから選ばれ、例えばポリウレタン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリ塩化ビニル、アクリル系樹脂、ポリアミド系樹脂、フェノキシ樹脂、ウレタン樹脂、フッ素系樹脂、シリコン系樹脂、セルロース系樹脂、キチン、キトサン、アガロース、デキストラン等が挙げられる。また、これらの高分子材料を単独で用いてもよいし、共重合体、複合体、あるいは混合物から構成されていても良い。

具体的な構成例としては、例えば、本発明抗体を結合させた上記高分子化合物をカラムに充填することで、そこに培養後リンパ球を通すことにより非活性のリンパ球を吸着除去し、活性化リンパ球のみを抽出する装置・方法等が挙げられる。

このような分離には抗原との親和性が低い抗体では十分に吸着できないため分離には適さず、親和性が高い抗体が求められる。本発明抗体は従来の市販品に比べ８倍〜９倍の親和性を有するため、効率よく非活性のリンパ球と活性化リンパ球の分離することができる。

本発明抗体とこれら高分子化合物の結合は化学結合により固定されるが、化学結合としては、共有結合、イオン結合、疎水結合などがあり、中でも固定が十分に可能であることから、共有結合が好ましい。この共有結合で固定するためには、これら高分子化合物は適当な官能基を持っていることが好ましく、例えば、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、チオール基、グリシジル基、イソシアナート基、ハロゲン基などを有していることが好ましい。中でも例えばトシル基やエポキシル基が好適に用いられる。

これら本発明の抗体と高分子化合物をカラムに充填するときの充填剤の形状は特に限定されるものではなく、例えば、ビーズのほか、フィルム、繊維、中空糸、ゲル等があげられる。

本発明抗体の上記高分子化合物への固定化量としては、本発明抗体が少なすぎると除去効果が不十分となる恐れがあり、多すぎると抗体同士が重なり合って互いに立体障害となる恐れがあるため、高分子化合物１ｇあたり１ｐｍｏｌ〜１０ｐｍｏｌの範囲で固定化することが好ましい。

また、以下の手順により分離することも可能である。リンパ球の集団を含む懸濁液に本発明の抗体を添加し、リンパ球と本発明抗体を結合させる。リンパ球をＰＢＳ等で洗浄した後、抗マウスＩｇＧ又はプロテインＧ等を固定化した磁気ビーズを添加する。磁石を用いて磁気ビーズを回収する。これにより、磁気ビーズには非活性のリンパ球が回収され、溶液中に残るリンパ球は活性化リンパ球となる。また、本発明抗体と抗マウスＩｇＧ又はプロテインＧ等を固定化した磁気ビーズは予め結合させておいた状態で、リンパ球集団を含む懸濁液へ添加しても構わない。

このように構成された、本発明の非活性化リンパ球の分離装置・方法は、カラムに吸着しなかったリンパ球を活性化リンパ球として、吸着した細胞を非活性のリンパ球として、効率よく分離することができる。

活性化リンパ球と非活性のリンパ球の割合を測定する装置・方法
本発明抗体は活性化リンパ球と非活性のリンパ球の割合を測定する装置・方法として用いることができる。

例えば、リンパ球の集団（ＰＢＭＣ等）の懸濁液に、蛍光標識した本発明抗体を添加し、非活性のリンパ球に発現しているＢＴＮ３分子と本発明抗体を結合させる。結合していない抗体を除去（遠心分離等）した後、フローサイトメーター等で蛍光標識された細胞を測定することで、当該リンパ球の集団中に含まれる非活性のリンパ球の割合を測定することができる。

本発明抗体を用いた活性化リンパ球と非活性のリンパ球の割合を測定する装置・方法は、例えば免疫細胞療法等に用いることができる。免疫細胞療法とは、患者リンパ球をサイトカイン等と共に培養する事でリンパ球を非特異的に活性化させ、患者へ投与する治療法である。その際、投与前に培養後のリンパ球の一部を本発明抗体と混合し、フローサイトメーター等で測定する事により活性化リンパ球の割合を知ることができ、免疫細胞の質を測り得るものである。

膜貫通分子ＢＴＮ３からなる活性化リンパ球の逆相関マーカー
本発明の活性化リンパ球の逆相関マーカーについて説明する。
本発明の活性化リンパ球の逆相関マーカーは膜貫通分子ＢＴＮ３からなるものである。膜貫通分子ＢＴＮ３は、活性化していないリンパ球や単球細胞の細胞表面に発現し、リンパ球が活性化シグナルを享受するとＢＴＮ３の発現量が低下し、リンパ球の活性化と逆相関している。そのため、活性化していないリンパ球と活性化リンパ球を識別する活性化リンパ球の逆相関マーカーとして用いることができる。

膜貫通分子ＢＴＮ３を利用した非活性化リンパ球の検出方法
上記した活性化リンパ球の逆相関マーカー（膜貫通分子ＢＴＮ３）は、マーカーに特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させ、膜貫通分子ＢＴＮ３（マーカー）の発現量を調べることによって非活性のリンパ球の検出方法として用いることが可能である。例えば、免疫細胞療法を行う患者に対し、治療前後の採血で得られた血液の一部を活性化リンパ球の逆相関マーカー特異的モノクローナル抗体と混合し、フローサイトメーター等で活性化リンパ球の逆相関マーカーを発現する細胞の割合を測定することで、治療前後の患者体内にて、活性化リンパ球の増加減少が数値として確認でき、免疫細胞療法の効果を示す新たな指標になり得るものである。また、例えば免疫細胞療法で用いるべく患者から得られた末梢血を体外で培養した際、そのリンパ球群の一部を活性化リンパ球の逆相関マーカー特異的モノクローナル抗体と混合して活性化リンパ球の逆相関マーカーの発現細胞量を調べることで、患者に投与する前に活性化リンパ球群の質を測る指標となり得るものである。これにより、投与する細胞の活性化状態を数値で示すことが可能となる。

以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものでないことは言うまでもない。

＜抗ＢＴＮ３モノクローナル抗体の調製＞
まず、本発明のモノクローナル抗体作製にかかるハイブリドーマ細胞を作製するため、プラスミドＤＮＡの調製を行った。
ヒト全長ＢＴＮ３Ａ３分子は、ヒト末梢血単核球（以下ＰＢＭＣｓ）由来のｃＤＮＡ（相補性ＤＮＡ）ライブラリから、以下２つのプライマーを用いて、クローニングを行った。
５’−ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＡＡ ＴＧＡ ＡＡＡ ＴＧＧ ＣＡＡ ＧＴＴ ＣＣＣ ＴＧ−３’（配列番号７）
５’−ＡＧＴ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＡ ＧＴＡ ＡＡＧ ＴＧＣ ＴＴＣ ＡＧＴ ＧＣＧ ＴＧＣ ＣＴ−３’（配列番号８）

ＤＮＡ増幅には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を行い、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクル実行した。

次に、上記ＰＣＲにて得られたＢＴＮ３Ａ３分子全長ｃＤＮＡ（配列番号５、アミノ酸配列は配列番号６に記載）をサイトメガロウイルス由来プラスミドベクター（ｐＲＣ−ＣＭＶ）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ領域に挿入しプラスミドＤＮＡを完成させた。
ＢＴＮ３Ａ３を発現したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞はｐＲＣ−ＣＭＶ−ＢＴＮ３Ａ３を用いてＢＴＮ３Ａ３を強制発現させることにより作製した。その際の遺伝子導入には、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を使用した。まず該当プラスミドベクター３０ｍｇに対し７５ｍｌリポフェクトアミン２０００を添加し、室温で２０分反応させた。その後、７５ｃｍ^２フラスコ（Ｓｕｍｉｌｏｎ）に播種しておいた４×１０^６個ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞に添加し、４８時間後に回収したものを免疫原細胞とした。

次に、上記調製プラスミドＤＮＡをマウスへ免疫しポリクローナル抗体を得る。具体的には、８〜１０週齢メスＢａｌｂ／ｃマウスの皮下に対し、３０μｇの上記プラスミドＤＮＡを移入した。この操作を２週間おきに４回行った。

その後、免疫後のマウスより採取した血清に含まれるポリクローナル抗体の力価をフローサイトメーターにて測定した。具体的にはチャイニーズハムスター由来ＣＨＯ−Ｋ１細胞にｐＴｒａｃｅｒ−ＢＴＮ３Ａ３−ＧＦＰ（ＢＴＮ３Ａ３分子とＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）分子を両方発現するベクター；ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を一過性に発現させた。前記プラスミドベクター３０mgに対し７５mlリポフェクトアミン２０００を添加し、室温で２０分反応させた。その後、７５ｃｍ^２フラスコ（Ｓｕｍｉｌｏｎ）に播種しておいた４×１０^６個ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞に添加し、４８時間後に回収したものをトランスフェクタントとして用いた。

上記１×１０^６個トランスフェクタントを懸濁した懸濁液に対し、採取血清を１／１００、１／１０００の割合となるように添加し、４℃で３０分反応させた。ＰＢＳ（−）で洗浄後、０．５ｍｌのＰＥラベル抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭポリクローナル抗体を添加し、４℃で３０分反応させた。ＰＢＳ（−）で洗浄後、フローサイトメーターで解析を行った。フローサイトメーター解析で１／１０００でも反応することが確認され、十分にＢＴＮ３Ａ３分子に対するポリクローナル抗体が作製されている事を確認した。

対象マウスの脾臓細胞１×１０^８個とＳＰ２／０ミエローマ細胞（ＡＴＣＣより購入し、培養したもの）２×１０^７個とを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００；ＳＩＧＭＡ）を用いて融合した。

この融合細胞を１５％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、ＨＡＴ（ヒポキサンチン１００μＭ、アミノプテリン０．４μＭ、チミジン１６μＭ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、さらに１０％メチルセルロース（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＤＭＥＭ培地に播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーター内で培養した。

培養から１０〜１２日後、形成されたハイブリドーマのコロニーをピックアップし、ポリクローナル抗体測定時と同様にフローサイトメーターによるスクリーニングを行った。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの選択は、フローサイトメーターの検出結果をＧＦＰと抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭポリクローナル抗体の結合量で展開し、ＧＦＰの発現と抗体の結合量が正比例の関係にあるものを選択した。スクリーニングを行う中で、ハイブリドーマ２３２−５及び３４−７を得た。約１Ｌの２３２−５又は３４−７それぞれの細胞上清をＰＲＯＴＥＩＮ Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で精製し、２３２−５又は３４−７由来のモノクローナル抗体（以下、それぞれの抗体を２３２−５抗体、３４−７抗体と記す。）を得た。

得られた本発明抗体のサブクラスは、Ｉｓｏｓｔｒｉｐ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）により、免疫グロブリンＧ２ａ（ＩｇＧ２ａ）であることを確認した。

次に、ＣＨＯ−Ｋ１にｐＴｒａｃｅｒ−ＢＴＮ３Ａ３−ＧＦＰ又はｐＴｒａｃｅｒ ｍｏｃｋ ｇｅｎｅを一過性に発現させ、本発明抗体（２３２−５抗体）又はコントロールＩｇＧ２ａを反応させた。

図１は、細胞を洗浄後フローサイトメーターで測定した結果である。ｍｏｃｋ ｇｅｎｅ（偽遺伝子）を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞ではコントロールＩｇＧ２ａ、本発明抗体（２３２−５抗体）ともに反応しなかった。一方、ＢＴＮ３Ａ３を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞では本発明抗体（２３２−５抗体）のみ反応した。これらの結果から本発明抗体（２３２−５抗体）はＢＴＮ３Ａ３に対して特異的なモノクローナル抗体であることが示された。

また、同様の実験をＩｇＧ２ａ、２３２−５抗体、３４−７抗体を用いて行った結果を図２に示す。図１では、２３２−５抗体がＢＴＮ３Ａ３特異的なモノクローナル抗体であることが明らかとなったが、図２から、３４−７抗体もＢＴＮ３Ａ３特異的なモノクローナル抗体であることが明らかとなった。

＜抗原認識部位の推定１＞
ＰＢＭＣｓに０、０．１、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌのＢＴ３．１抗体を反応させ、洗浄後ＦＩＴＣ標識した２３２−５抗体を１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で反応させた後、フローサイトメーターでＦＩＴＣの蛍光強度を測定した。

図３はフローサイトメーター解析の結果を示す図である。予めＢＴ３．１処理していたＰＢＭＣｓにおいて、ＢＴ３．１の濃度依存的に本発明抗体（２３２−５抗体）による蛍光強度は減少した。このことから、ＢＴ３．１と２３２−５抗体はＢＴＮ３抗原の非常に近傍のエピトープを認識していることが示された。

＜抗原認識部位の推定２＞
ＢＴＮ３抗原は細胞外領域にイムノグロブリンスーパーファミリーに属するＶｓｅｔ領域とＣｓｅｔ領域を保有する。ＢＴ３．１及び、本発明抗体（２３２−５）の認識領域がＶｓｅｔ又はＣｓｅｔの何れかを検討するため、ＢＴＮ３Ａ３のＣｓｅｔのみ又はＶｓｅｔとＣｓｅｔ両者を発現するベクター（ｐＤｉｓｐｌａｙ−Ｃｓｅｔ又はｐＤｉｓｐｌａｙ−ＡＬＬ）を作製した。

上記ｐＤｉｓｐｌａｙベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）はＨＡ Ｔａｇを挿入している。ＣＯＳ−７細胞にｐＤｉｓｐｌａｙ−Ｃｓｅｔ又はｐＤｉｓｐｌａｙ−ＡＬＬプラスミドを一過性にトランスフェクションし、ＢＴ３．１又は本発明抗体（２３２−５抗体）を反応させた。更に、ｐＤｉｓｐｌａｙベクターの発現確認のため、抗ＨＡ（Ａ型肝炎ウイルス）抗体でも染色をおこなった。

図４はフローサイトメーターの結果である。ＢＴ３．１、２３２−５両者でｐＤｉｓｐｌａｙ−Ｃｓｅｔでは蛍光は検出できなかった。一方、ｐＤｉｓｐｌａｙ−ＡＬＬトランスフェクタントでは両者の抗体で蛍光が検出された。これらの結果から、ＢＴ３．１、本発明抗体（２３２−５抗体）による抗原認識部位はＢＴＮ３抗原のＮ末端側のＶｓｅｔ領域に存在することが明らかになった。

また、同様の実験をＢＴ３．１、２３２−５抗体、３４−７抗体を用いて行った結果を図５に示す。３４−７抗体も他の２つの抗体同様にＢＴＮ３抗原のＮ末端側のＶｓｅｔ領域を認識することが明らかとなった。

＜抗原認識部位の推定３＞
次に、ＢＴＮ３抗原のＶｓｅｔ内での抗原認識部位を推定するため以下のプラスミドを作製した。それらはＶ−ａｌｌ、Ｖ−３５、Ｖ−４０、Ｖ−５０、Ｖ−６０の５種類で、それぞれＢＴＮ３抗原（ＢＴＮ３Ａ３）の細胞外ドメインの２６−１３９、３５−１３９、４０−１３９、５０−１３９、６０−１３９のアミノ酸をコードする。

上記プラスミドを作製する際に用いたプライマーは、
Ｖ−ａｌｌ：５’−ＧＴＴ ＧＧＧ ＧＣＡ ＡＣＧ ＣＣＧ ＣＣＣ ＴＣＴ ＴＴＴ
ＧＧＡ ＧＧＧ ＴＴ−３’（配列番号９）、
Ｖ−３５： ５’−ＴＣＡ ＡＴＧ ＧＣＣ ＣＡＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ＧＧＡ ＣＣＣ
ＴＣＴ ＧＧＧ ＣＣＣ ＡＴ−３’（配列番号１０）、
Ｖ−４０： ５’−ＴＣＡ ＡＴＧ ＧＣＣ ＣＡＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＧ−３’（配列番号１１）、
Ｖ−５０： ５’− ＴＣＡ ＡＴＧ ＧＣＣ ＣＡＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＣＣ ＴＧＴ ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＴ−３’（配列番号１２）、
Ｖ−６０： ５’− ＴＣＡ ＡＴＧ ＧＣＣ ＣＡＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＧＡＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＴ−３’（配列番号１３）
であり、共通のリバースプライマーは、
５’− ＴＣＡ ＡＴＧ ＴＣＧ ＡＣＡ ＡＧＡ ＴＣＡ ＧＡＡ ＣＣＣ ＡＡＴ ＧＣＴ Ｇ−３’（配列番号１４）
である。

ＰＢＭＣｓ由来ｃＤＮＡライブラリＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ法により各種ＰＣＲ産物（Ｖｓｅｔ領域のＤＮＡ断片）を得た。ＰＣＲは９５℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒で２５サイクル行った。

上記プラスミドをｐＤｉｓｐｌａｙベクターのＳｆｉ／Ｓａｌサイトに挿入し、ＣＯＳ−７に一過性に強制発現させた。２４時間後に細胞を回収し、ウエスタンブロッティングにて発現の確認を行った。詳しくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）サンプルバッファに溶解し熱処理を行い（１００℃ ５分間）、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）メンブレン（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）に転写し、３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）でメンブレンをブロッキングした。その後、ＢＴ３．１又は本発明抗体を１μｇ／ｍｌでメンブレンに添加し室温で一時間反応させた。ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝食塩水−界面活性剤）で洗浄後、ヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを２０００倍希釈で室温、３０分間反応させた。ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎで洗浄後、ＨＲＰの基質であるＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を添加し、Ｘ線フィルムに感光させた。

図６は上記ウエスタンブロットの結果である。ＢＴ３．１はＶ−ａｌｌ、Ｖ−３５、Ｖ−４０でバンドが検出されたが、Ｖ−５０、Ｖ６０では検出されなかった。よってＢＴ３．１はＢＴＮ３抗原の４０−５０間のアミノ酸配列を認識していることが示唆された。

一方、本発明抗体（２３２−５抗体）に特異的なバンドはＶ−ａｌｌ、Ｖ−３５で検出され、Ｖ−４０ではその濃さは薄いものであった。また、Ｖ−５０、Ｖ６０ではバンドは検出されなかった。このことから、本発明抗体はＢＴＮ３抗原の３５−４０間のアミノ酸配列を認識していることが推定された。

また、同様の実験をＢＴ３．１、２３２−５抗体、３４−７抗体を用いて行った結果を図７に示す。２３２−５抗体と同様に、３４−７抗体もＢＴＮ３抗原の３５−４０間のアミノ酸配列を認識していることが推定された。３５−４０間のアミノ酸配列はＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３で一致しており、本発明抗体がＢＴＮ３のいずれの分子も認識するモノクローナル抗体であることが推定された。

＜ＢＴ３．１及び本発明抗体のＰＢＭＣｓにおけるＢＴＮ３抗原の発現割合及び抗原親和性＞
ＰＢＭＣｓをＢＴ３．１又は２３２−５抗体（１０μｇ／ｍｌ）により染色後、ＦＩＴＣ−ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を反応させ、フローサイトメーターで解析した。また、ＢＴ３．１、２３２−５抗体の最終濃度が０．０１、０．１、１、１０、１００、１００ｎｇ／ｍｌになるよう調製した。これらの溶液をＰＢＭＣｓに反応させ、反応後フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。

結果を図８に示す。
フローサイトメーター解析の結果、ＢＴ３．１はＰＢＭＣｓの約８０％を染色するのに対し、２３２−５抗体は約９５％染色することが示された。また本発明抗体はＢＴ３．１に比べＢＴＮ３抗原に対する抗原親和性が最大で８〜９倍（１０ｎｇ／ｍｌ時）あることが示された。

＜各種リンパ球サブセット細胞表面におけるＢＴＮ３抗原の発現＞
実施例５において、本発明抗体はＰＢＭＣｓの約９５％を染色することを示したが、リンパ球の各サブセットにおけるＢＴＮ３抗原の発現を検証した。

１×１０^６個ＰＢＭＣｓに対し、ＦＩＴＣラベルを施した２３２−５抗体と各種リンパ球マーカーであるＰＥ−ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ５６、γδＴＣＲ抗体（以上、ベックマンコールター社製）を用いてフローサイトメーター解析を行った。また、ＦＩＴＣ−２３２−５のネガティブコントロールとして、ＦＩＴＣ−ＩｇＧ２ａ（ベックマンコールター製）を用いた。

結果を図９に示す。
フローサイトメーター解析の結果、各種リンパ球マーカー陽性画分の殆ど全てがＢＴＮ３陽性であった。

＜本発明抗体の細胞増殖に対する作用＞
ＰＢＭＣｓにＣＦＳＥ（カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル；ＤＯＪＩＮＤＯ社）を最終濃度２μＭになるように０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に添加し３７℃で１０分反応させた後、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を添加することでその反応を停止させた。ＣＦＳＥラベルされたＰＢＭＣｓをＯＫＴ３（５μｇ／ｍｌ）がプレコーティングされている２４穴（ｗｅｌｌ）プレートに１×１０^６／ｍｌで播種した。その際、コントロールマウス抗体、ＢＴ３．１、本発明抗体（２３２−５抗体）をそれぞれ１μｇ／ｍｌで添加した。培地は１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０に対し、ｒｈＩＬ−２（組替えヒトインターロイキン−２）を５０Ｕ／ｍｌ添加したものである。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで３日間培養後、フローサイトメーターで解析した。この際、フィコエリスリン（ＰＥ）−抗ヒトＣＤ４（１３Ｂ．２；ベックマンコールター）、或いはＰＥ−抗ヒトＣＤ８ａ（Ｂ９．１１；ベックマンコールター）を用いた。

本試験の結果を図１０に示す。
ＣＦＳＥは細胞が分裂する割合に伴い、その蛍光強度が減弱する性質を持つ。それぞれのサンプルをフローサイトメーター解析すると、本発明抗体（２３２−５）を添加したＰＢＭＣｓでのみ細胞分裂の抑制が観察された。これは全ＰＢＭＣｓを対象にした場合だけでなく、ＣＤ４又はＣＤ８に限定した場合でも同様の傾向が観察された。ＢＴ３．１添加群にはそのような傾向は観察されなかった。

また、同様の実験をＢＴ３．１、２３２−５抗体、３４−７抗体を用いて行った結果を図１１に示す。２３２−５抗体と同様に３４−７抗体でも、細胞分裂の抑制が観察された。これらの結果から本発明抗体（２３２−５抗体及び３４−７抗体）が細胞増殖の抑制効果を有することが明らかとなった。

＜ＰＢＭＣｓを刺激した際のＢＴＮ３の発現減少＞
Ｔ細胞及びＮＫ（ナチュラルキラー）細胞を刺激することを目的とし、１×１０^６個ＰＢＭＣｓをＯＫＴ３（５μｇ／ｍｌ）プレコーティング２４ｗｅｌｌプレートに播種し、１０％ＦＣＳ、５０Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−２を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養を行った。

またＢ細胞を刺激する目的で、別の培養系として１×１０^６個ＰＢＭＣｓにｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（リポ多糖：ＬＰＳ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌで添加した。３日後細胞を回収し、ＦＩＴＣ−２３２−５／ＰＥ−ヒトＣＤ３（ＵＣＨＴ１；ベックマンコールター）、ＦＩＴＣ−２３２−５／ＰＥ−ヒトＣＤ４、ＦＩＴＣ−２３２−５／ＰＥ−ヒトＣＤ８ａ、ＦＩＴＣ−２３２−５／ＰＥ−ヒトＣＤ１９（Ｊ４．１１９；ベックマンコールター）、ＦＩＴＣ−２３２−５／ＰＥ−ヒトＣＤ５６（Ｎ９０１；ベックマンコールター）、ＦＩＴＣ−２３２−５／ＰＥ− ヒトγδＴＣＲ（ＩＭＭＵ５１０；ベックマンコールター）で染色し、フローサイトメーター解析した。

本試験の結果を図１２に示す。
ＯＫＴ３／ｒｈＩＬ−２で刺激したＰＢＭＣｓを回収してフローサイトメーター解析すると、Ｔ細胞の表面マーカーであるＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、γδＴＣＲや、ＮＫ細胞の表面マーカーであるＣＤ５６陽性細胞においてＢＴＮ３の発現が減少していた。Ｂ細胞の表面マーカーであるＣＤ１９陽性細胞ではその現象は観察されなかった。

一方、ＬＰＳで刺激したＰＢＭＣｓをフローサイトメーター解析すると、ＣＤ１９陽性細胞のみにＢＴＮ３の発現減少が見られ、その他の画分ではＢＴＮ３発現減少は見られなかった。このことから、刺激されたリンパ球ではＢＴＮ３の発現減少が起こることが明らかとなった。

＜ＰＢＭＣｓを刺激した際のＢＴＮ３の発現減少（ｍＲＮＡの解析）＞
実施例８において、リンパ球が活性化されるとＢＴＮ３分子の発現が減少していることを示したが、ＢＴＮ３分子を構成するＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３のいずれの分子が影響を受けているかは、抗体を用いての解析では検証することができない。そこで、リンパ球を活性化させた際にｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成後にＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３それぞれに対する特異的プライマーを用いてＰＣＲを行った。

（１）健常人採血直後の１×１０^６個ＰＢＭＣｓ群、（２）健常人１×１０^６個ＰＢＭＣｓを培地のみで培養した群、（３）健常人１×１０^６個ＰＢＭＣｓを固相化ＯＫＴ３、（５μｇ／ｍｌ）とｒＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）で３日間刺激する群の３群を用意し、１ｍｌのＩＳＯＧＥＮ（Ｗａｋｏ）に溶解した。トータルＲＮＡ、ｃＤＮＡ合成後にＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３それぞれに対する特異的プライマーを用いてＰＣＲを行った。
各プライマーの配列は以下の通りである。インターナルコントロールとして、Ｇ３ＰＤＨを用いた。
ＢＴＮ３Ａ１：５’− ＧＣＡ ＴＣＴ ＣＧＧ ＧＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＡ−３’（配列番号１５）、５’− ＧＡＡ ＴＡＴ ＧＣＧ ＡＴＣ ＣＡＴ ＣＣＡ ＣＡ−３’（配列番号１６）、
ＢＴＮ３Ａ２：５’− ＧＡＴ−ＧＧＡ−ＧＴＧ−ＧＧＣ−ＣＴＡ−ＴＡＴ−ＧＡ−３’（配列番号１７）、５’−ＴＣＡ−ＧＧＣ−ＴＧＡ ＣＴＴ ＡＴＴ Ｇ− ３’（配列番号１８），
ＢＴＮ３Ａ３：５’− ＡＴＧ ＧＣＴ ＣＧＴ ＧＧＡ ＧＡＧ ＡＡＧ ＴＣ−３’（配列番号１９）、５’− ＡＧＡ ＴＡＴ ＧＡＧ ＡＴＣ ＣＡＴ ＣＴＧ ＴＧ−３’（配列番号２０）、
Ｇ３ＰＤＨ：５’− ＡＣＣ ＡＣＡ ＧＴＣ ＣＡＴ ＣＴＣ ＡＴＣ ＡＣ−３’（配列番号２１）、５’− ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＡ−３’（配列番号２２）
ＰＣＲの条件は９４℃（３０秒）、５０℃（３０秒）、７２℃（１分）のサイクルを３５回行った。

その結果を図１３に示す。採血直後のＰＢＭＣｓではＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３いずれのｍＲＮＡも発現していた。それらの発現はＰＢＭＣｓを培地のみで培養した際も維持されていた。一方、ＯＫＴ３／ｒＩＬ−２で刺激したＰＢＭＣｓではＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３全てのｍＲＮＡの発現が減少していた。これらのことからリンパ球を活性化すると、ＢＴＮ３分子を構成するＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３の３分子全てのｍＲＮＡが減少することが判明した。

＜ＢＴＮ３発現減少と活性化マーカーとの逆相関１＞
実施例８において、リンパ球を活性化するとＢＴＮ３分子の発現が減少することが判明した。そこで、リンパ球が活性化した際に強発現するＩＬ−２レセプターα鎖（ＣＤ２５）との相関を検証した。

１×１０^６個ＰＢＭＣｓをＯＫＴ３（５μｇ／ｍｌ）プレコーティング２４ｗｅｌｌプレートに播種した。１０％ＦＣＳ、５０Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−２を含むＲＰＭＩ１６４０で３日間培養し、ＦＩＴＣ−２３２−５／ＰＥ−ヒトＣＤ２５／ＰＣ５−ヒトＣＤ８ａ（Ｂ９．１１；ベックマンコールター）又はＦＩＴＣ−２３２−５／ＰＥ−ヒトＣＤ２５／ＰＣ５−ヒトＣＤ４（１３Ｂ．８．２；ベックマンコールター）で染色し、フローサイトメーター解析を行った。

本試験の結果を図１４に示す。
フローサイトメーター解析の結果、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に比べＣＤ８陽性Ｔ細胞のほうが、活性化マーカーＣＤ２５の発現上昇とＢＴＮ３の発現減少の逆相関がより顕著であることが示された。また、ＰＢＭＣｓをＦＳＣ（細胞の大きさ）、ＳＳＣ（細胞の密度）のパラメータで展開した場合、両パラメータ値が高い群が活性化リンパ球で、低い群は刺激が入っていない非活性のリンパ球であると予測された。

ＦＳＣ／ＳＳＣ高値にゲートをかけた場合、ＣＤ８、ＣＤ４陽性細胞ともにＣＤ２５高発現、ＢＴＮ３減少の細胞集団（ポピュレーション）が濃縮されて観察された。一方ＦＳＣ／ＳＳＣ低値にゲートをかけた場合は前者とは対照的に、ＣＤ２５低発現、ＢＴＮ３高発現ポピュレーションが観察された。

これらのことからＢＴＮ３分子は活性化に伴いその発現が減少し、活性化マーカーとの発現と逆の相関を示すことが判明した。

＜ＢＴＮ３発現減少と活性化マーカーとの逆相関２＞
ＢＴＮ３は殆どのＰＢＭＣｓに発現しているが、ＣＤ４５ＲＯを発現しているメモリーＴ細胞画分では一部ＢＴＮ３の発現が減少している。
実施例８において、活性化リンパ球ではＢＴＮ３の減少が起こることを記載したが、刺激前からＢＴＮ３が減少している画分が増殖したという可能性を打ち消す目的で、ＢＴＮ３を１００％発現しているナイーブＴ細胞（ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＯ⁻）を分離して刺激を行った。

ナイーブＴ細胞の分離はまずＰＢＭＣｓからＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ネガティブセレクションによってＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を得た。

続いて、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞１×１０^７個に対してヒトＣＤ４５ＲＯマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を１０μｌ添加し、ＭＡＣＳバッファ（１％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｉｎ ＰＢＳ）で洗浄後、磁場カラムに通し、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＯ⁻ナイーブＴ細胞を得た。

こうして得られた上記ナイーブＴ細胞１×１０^６個をＯＫＴ３（５μｇ／ｍｌ）プレコーティング２４ｗｅｌｌプレートに播種し、１０％ＦＣＳ、５０Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−２、５μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＤ２８抗体を含む培地で６日間培養した。６日後、細胞を回収し、ＦＩＴＣ−２３２−５／ＰＥ−ヒトＣＤ２５（２Ａ３；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＦＩＴＣ−２３２−５／ＰＥ−ヒトＣＤ４５ＲＯ（ＵＣＨＬ１；ベックマンコールター）で染色した。またＢＴ３．１にもＦＩＴＣ化を施し（ＤＯＪＩＮＤＯ）、同様の染色を行い、フローサイトメーター解析を行った。

図１５に本試験の結果を示す。
ＣＤ２５は活性化マーカー、ＣＤ４５ＲＯはメモリーマーカーとして知られている。フローサイトメーターの結果、本発明抗体によるＢＴＮ３の発現減少と、ＣＤ２５／ＣＤ４５ＲＯ分子の発現が逆相関していることが示された。ＢＴ３．１を用いても同様の傾向は観察されたが、本発明抗体（２３２−５抗体）を用いた場合程の明瞭な結果は得られなかった。

＜リンパ球活性化に伴う活性化マーカーとの相関性＞
ＢＴＮ３分子はリンパ球活性化に伴い減少することを示したが、ＢＴＮ３分子を発現していないリンパ球も存在するので、ほぼ１００％ＢＴＮ３分子を発現しているナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いて検証を行った。

健常人ＰＢＭＣｓからヒトＣＤ４ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ）とヒトＣＤ２５ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ４５ＲＯビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＯ−ナイーブＴ細胞を得た。これらの細胞を固相化ＯＫＴ３（５μｇ／ｍｌ）、ｒＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）、αＣＤ２８抗体（５μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で７日間刺激し、その後フローサイトメーター解析を行った。染色はＦＩＴＣ−２３２−５、ＦＩＴＣ−３４−７、ＦＩＴＣ−ＢＴ３．１、ＦＩＴＣ−ＩｇＧ２ａ（ベックマンコールター）、ＰＥ−ＣＤ２５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ）、ＰＥ−ＣＤ４５ＲＯ（ベックマンコールター）、ＰＥ−ＣＤ７０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥ−ＣＤ１０３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥ−ＩＣＯＳ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥ−ＰＤ−１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた。

本試験の結果を図１６に示す。
図１４と同様にナイーブＴ細胞を活性化させた際にもＣＤ２５の発現に伴いＢＴＮ３分子の発現減少が観察された。その他の活性化／メモリーマーカー（ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７０、ＣＤ１０３、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１）とＢＴＮ３分子の発現について解析しても、ＢＴＮ３分子の活性化に伴う発現減少が観察された。これらのことから、ＢＴＮ３分子はＣＤ２５以外の活性化／メモリーマーカーとも発現が逆相関することが確認された。一方、ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のＢＴ３．１を用いて解析した場合も活性化、メモリーマーカーとの逆相関が観察されたが、２３２−５、３４−７を用いたようなクリアな結果（細胞集団を明確に分けること）を得ることは出来なかった。

以上説明したように、本発明の抗体はＢＴＮ３を特異的に認識する特性を有する。また、リンパ球は活性化するとＢＴＮ３の発現が低下する。これらの特性を利用して、活性化したリンパ球と非活性のリンパ球を効率よく識別する事ができる。例えば、抗体吸着カラム等に応用する事で、活性化リンパ球集団から活性化したリンパ球と非活性リンパ球を効率よく分離する事ができる。また、免疫細胞療法を実施する機関においては、リンパ球の活性化効率を投与前に診断する事が可能となる。
さらに、本発明の抗体はリンパ球に対し増殖抑制に働く特性を持つことから、抗体医薬品として開発された場合には免疫抑制剤として機能すると考えられるため、自己免疫疾患、臓器移植後の治療等に応用できる可能性がある。

Claims (15)

1. 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７７又はＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７８のハイブリドーマから産生される抗体と同一の抗原認識部位を有する、膜貫通分子ブチロフィリン（ＢＴＮ）３を特異的に認識するモノクローナル抗体。
2. 前記膜貫通分子ＢＴＮ３が、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２又はＢＴＮ３Ａ３であることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. 前記モノクローナル抗体がＢＴＮ３（配列番号２、４又は６）の３５番目〜４０番目間のアミノ酸配列を抗原として認識する事を特徴とする請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。
4. 前記モノクローナル抗体が、リンパ球に対して増殖抑制に働くことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
5. 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７７又はＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７８のハイブリドーマから産生される抗体である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
6. リンパ球の集団における活性化リンパ球又は非活性のリンパ球の割合の測定方法であって、
   リンパ球の集団に膜貫通分子ブチロフィリン（ＢＴＮ）３を特異的に認識する請求項１乃至５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を結合させる工程と、
   リンパ球に結合したモノクローナル抗体を検出する工程と、
   モノクローナル抗体が結合したリンパ球を非活性のリンパ球として、リンパ球の集団における活性化リンパ球又は非活性のリンパ球の割合を算出する工程、
   とからなる測定方法。
7. 膜貫通分子ブチロフィリン（ＢＴＮ）３を特異的に認識する請求項１乃至５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を用いた、リンパ球の集団における活性化リンパ球又は非活性のリンパ球の割合の測定装置。
8. 膜貫通分子ブチロフィリン（ＢＴＮ）３を特異的に認識する請求項１乃至５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を用いた、活性化リンパ球と非活性のリンパ球の分離方法。
9. 前記分離方法が、
   リンパ球の集団にブチロフィリン（ＢＴＮ）３を特異的に認識する請求項１乃至５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を添加する工程と、
   リンパ球の集団に含まれる非活性のリンパ球と前記モノクローナル抗体とを結合させる工程と、
   前記モノクローナル抗体の結合したリンパ球と結合していないリンパ球とを分離する工程と、
   からなる請求項８に記載の分離方法。
10. 膜貫通分子ブチロフィリン（ＢＴＮ）３を特異的に認識する請求項１乃至５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を用いた、活性化リンパ球と非活性のリンパ球の分離装置。
11. 膜貫通分子ブチロフィリン（ＢＴＮ）３を特異的に認識する請求項１乃至５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体とリンパ球とを体外において接触させることを特徴とするリンパ球の増殖抑制方法。
12. 膜貫通分子ブチロフィリン（ＢＴＮ）３を特異的に認識する請求項１乃至５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む、リンパ球の増殖抑制剤。
13. 膜貫通分子ブチロフィリン（ＢＴＮ）３からなる活性化リンパ球の逆相関マーカー。
14. 前記膜貫通分子ＢＴＮ３が、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２又はＢＴＮ３Ａ３であることを特徴とする請求項１３に記載のマーカー。
15. 請求項１３または１４に記載のマーカーと、前記マーカーに特異的に結合する請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体とを結合させ、マーカーの発現量を調べることを特徴とする非活性のリンパ球の検出方法。