CN105457024B

CN105457024B - 抗butyrophilin-3人源化抗体及其使用

Info

Publication number: CN105457024B
Application number: CN201410535718.0A
Authority: CN
Inventors: 李小彦; 钮晓音
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-10-13
Filing date: 2014-10-13
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2034-10-13
Also published as: WO2016058148A1; CN105457024A

Abstract

本发明提供使用抗butyrophilin‑3（嗜乳脂蛋白‑3）人源化抗体或其片段的组合物和方法，所述抗butyrophilin‑3人源化抗体或其片段包含了轻链可变区CDR序列QSLSDN(SEQ ID NO：1)、FAS(SEQ ID NO：2)和QQSHSWPYT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列GFTFSSYA(SEQ ID NO：4)、ISSGGNYS(SEQ ID NO：5)和ARHGPDDFTSWVDY(SEQID NO：6)。抗butyrophilin‑3人源化抗体或片段对治疗疾病(例如肿瘤、自身免疫性疾病和免疫排斥性疾病)是有益的，其中靶向的细胞表达butyrophilin‑3成员蛋白（butyrophilin‑3成员蛋白共包含三个蛋白：BTN3A1，BTN3A2和BTN3A3）。抗butyrophilin‑3人源化抗体能够同时识别BTN3A1，BTN3A2和BTN3A3，因此它是抗‑BTN3A1人源化抗体、抗‑BTN3A2人源化抗体和抗‑BTN3A3人源化抗体的总称。

Description

抗butyrophilin-3人源化抗体及其使用

技术领域

本发明属于医学生物技术和人源化抗体研究领域。本发明涉及对人butyrophilin-3（嗜乳脂蛋-3）的抗原决定簇具有特异性识别的人源化抗体分子和包含所述抗体分子及其片段的组合物。本发明还涉及人源化抗butyrophilin-3抗体在治疗各种疾病中的用途。

背景技术

人的butyrophilin-3（嗜乳脂蛋-3）基因家族位于6号染色体MHC I类分子基因簇的延伸端，最初称为MHC相关基因。Butyrophilin-3家族包含三个成员：BTN3A1，BTN3A2，BTN3A3。Butyrophilin-3基因在小鼠上缺失。Butyrophilin-3蛋白是单次穿膜蛋白，其胞外区结构属于免疫球蛋白超基因家族，包含有一个N端的IgV样结构域，和一个近膜端的IgC样结构域。BTN3A1，BTN3A2和BTN3A3的胞外区氨基酸组成上高度同源，其中IgV样结构域的同源性达99-100%。因此，针对IgV样结构域的抗butyrophilin-3抗体通常能同时识别BTN3A1，BTN3A2和BTN3A3，因此它是抗-BTN3A1人源化抗体、抗-BTN3A2人源化抗体和抗-BTN3A3人源化抗体的总称。

BTN3A1表达于人类各种肿瘤细胞膜表面，如非小细胞肺癌、肝细胞肝癌、胃癌、胰腺腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、急性原髓样白血病、慢性髓样白血病、多发性骨髓瘤、红白血病、骨髓瘤细胞、滑膜肉瘤、软骨肉瘤等。

针对肿瘤细胞膜表面BTN3A1的抗体能够抑制肿瘤细胞的生长和诱导肿瘤细胞微管蛋白的解聚。因此开发一种人源化抗butyrophilin-3抗体能够有效地治疗多种肿瘤。

发明内容

本发明是基于所获得的一株具有与人butyrophilin-3 蛋白特异性结合的亲本抗人butyrophilin-3鼠单克隆抗体6D9，通过克隆、鉴定与基因结构的分析，确定了其CDR 区序列，构建了相应的人源化抗体及其真核细胞表达载体，并获得了表达并分泌该抗人butyrophilin 3人源化抗体的细胞株，生产纯化了该人源化抗体。

本发明研发了针对butyrophilin-3蛋白IgV样结构域的人源化抗体，命名为Xylizumab（再力助单抗），发现Xylizumab能够识别BTN3A1，BTN3A2和BTN3A3三个蛋白，其结合的表位位于butyrophilin 3蛋白IgV样结构域。

Xylizumab能够抑制 20种人类肿瘤细胞系的生长，这些细胞系覆盖了上皮来源的癌症细胞如非小细胞肺癌细胞系（Calu-1）、肝细胞肝癌细胞系（Huh7, HepG2）、胃癌细胞系（MGC80-3）、胰腺腺癌细胞系（PANC-1, BxPC-3, CFPAC-1）、乳腺癌细胞系（SKBR3）、卵巢癌细胞系（SKOV3）、宫颈癌细胞系（HeLa）；血液系统肿瘤，如急性原髓样白血病细胞系（HL-60,NB4）、慢性髓样白血病细胞系（K-562）、多发性骨髓瘤细胞系（U266，KM3）、红白血病细胞系（HEL）；肉瘤，如骨髓瘤细胞系(U-2 OS, MNNG/HOS)、滑膜肉瘤细胞系(SW982)、软骨肉瘤细胞系(SW1353)。但它对正常细胞系HFL1没有表现出抑制作用。Xylizumab能够诱导某些肿瘤细胞凋亡，这种现象对于HL-60细胞特别明显，并且Xylizumab能够完全抑制HL-60的生长。

Xylizumab介导的肿瘤生长抑制是通过抗体与细胞膜上的BTN3A1结合后，来向胞内传递生长抑制信号的。Xylizumab在正常浓度10ug/ml的水平下就能发挥抑制效应，当培养体系中浓度增加至500ug/ml的时候，它能诱导细胞内微管蛋白解聚。

动物实验显示Xylizumab能够减缓移植性肝癌HepG2和移植性骨肉瘤MNNG/HOS的生长，延长裸鼠的生存期。

另外，这个抗体能够抑制骨髓来源的原代急性髓性白血病M3和M4的细胞克隆形成，这说明该抗体能够治疗某些原代血液系统肿瘤。

由于BTN3A1广泛表达于几乎所有类型肿瘤细胞系中，所以BTN3A1能够做为不同类型肿瘤的共同靶标。Xylizumab能够通过与细胞膜上的BTN3A1结合来介导胞内微管解聚，这项功能的发现丰富了我们对抗体功能的认识，也拓展了抗体的应用范围。利用抗体的这一新功能，可以动态可逆地调节微管的聚合，并且以这个抗体为基础的免疫治疗也会具有广阔的应用前景。

因此，本发明主要涉及了以下几个方面：

第一方面，本发明涉及一种抗人butyrophilin-3人源化抗体，其中所述人源化抗体由含有3 个轻链可变区的轻链和含有3 个重链可变区的重链组成，其中所述3个轻链可变区CDR的氨基酸序列为QSLSDN (SEQ ID NO ：1)、FAS(SEQ ID NO ：2) 和QQSHSWPYT (SEQID NO ：3)，重链可变区CDR的氨基酸序列为GFTFSSYA(SEQ ID NO ：4)、 ISSGGNYS(SEQ IDNO ：5) 和ARHGPDDFTSWVDY (SEQ ID NO ：6)。本领域公知，抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR 序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR 区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。本发明涉及的具有与上述CDR 序列完全相同的CDR 序列的单克隆抗体变体，因其具有与本发明所述的人源化抗体完全相同的CDR 序列，因此具有相类似的生物活性。

第二方面，本发明涉及抗人butyrophilin-3人源化抗体的片段，其中该片段选自由F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv 和抗体最小识别单位组成的组。并且该片段包含了3 个轻链可变区的CDR和3 个重链可变区的CDR，其轻链可变区CDR氨基酸序列为QSLSDN (SEQ IDNO ：1)、FAS(SEQ ID NO ：2) 和QQSHSWPYT (SEQ ID NO ：3) 及重链可变区CDR 序列为GFTFSSYA(SEQ ID NO ：4)、 ISSGGNYS(SEQ ID NO ：5) 和ARHGPDDFTSWVDY (SEQ ID NO ：6)。

第三方面，本发明涉及一种治疗疾病的方法，其中所述疾病选自由以下组成的组：肿瘤，如：骨肉瘤、软骨肉瘤、滑膜肉瘤、甲状腺髓样癌(MTC)、结肠直肠癌、肝细胞癌、肝癌、胃癌、食道癌、肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈部癌、膀胱癌、尿路上皮癌、前列腺癌、血液系统肿瘤、淋巴系统肿瘤、胸腺瘤、黑素瘤等；自身免疫性疾病，如：类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、系统性血管炎、自身免疫性肝病、天疱疮、硬皮病、皮肌炎、混合性结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、Crohn氏病、银屑病、干燥性综合症、恶性贫血、新生儿溶血、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、胰岛素依赖型糖尿病、强直性脊柱炎、硬皮病、重症肌无力、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病、亚急性细菌性心内膜炎等；免疫排斥性疾病，如宿主抗移植物反应、移植物抗宿主反应、输血相关性移植物抗宿主病、过敏性反应等。

附图说明

图1a 是采用ELISA方法证实抗- butyrophilin-3人源化抗体Xylizumab识别从CHO细胞表达纯化的BTN3A1、BTN3A2和BTN3A3。b 是采用ELISA方法证实抗- butyrophilin-3人源化抗体Xylizumab识别的抗原决定簇位于butyrophilin-3蛋白的Ig V 结构域。由于butyrophilin-3蛋白的Ig V 结构高度同源，因此Xylizumab能够同时识别BTN3A1、BTN3A2和BTN3A3。

图2是Xylizumab抑制裸鼠移植性肝细胞肝癌HepG2的生长。

图3是Xylizumab抑制裸鼠移植性骨肉瘤MNNG/HOS的生长。

图4是Xylizumab延长移植性肝细胞肝癌HepG2荷瘤裸鼠的生存期(log-ranktest, Chi square=14.36, P< 0.001)。

图5是Xylizumab延长移植性骨肉瘤MNNG/HOS荷瘤裸鼠的生存期(log-rank test,Chi square=12.67, P< 0.001)。

<110> LI, Xiaoyan；NIU, Xiaoyin

<120> 抗butyrophilin-3人源化抗体及其使用

<130> BTN3A1

<160> 6

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRL1

<400> 1

Gln Ser Leu Ser Asp Asn

1 5

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRL2

<400> 2

Phe Ala Ser

1

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRL3

<400> 3

Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRH1

<400> 4

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRH2

<400> 5

Ile Ser Ser Gly Gly Asn Tyr Ser

1 5

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRH3

<400> 6

Ala Arg His Gly Pro Asp Asp Phe Thr Ser Trp Val Asp Tyr

1 5 10

Claims

1.抗-butyrophilin-3人源化抗体、单链抗体或其抗体片段，其特征在于包含轻链可变区CDR与重链可变区CDR，所述轻链可变区CDR 序列为QSLSDN(SEQ ID NO：1)、FAS(SEQ IDNO：2)和QQSHSWPYT(SEQ ID NO：3)，所述重链可变区CDR序列为GFTFSSYA(SEQ ID NO：4)、ISSGGNYS(SEQ ID NO：5)和ARHGPDDFTSWVDY(SEQ ID NO：6)。

2.根据权利要求1所述的抗butyrophilin-3人源化抗体包含人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。

3.根据权利要求1所述的抗体片段，其特征在于所述抗体片段选自F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv和抗体最小识别单位。

4.根据权利要求1所述的抗-butyrophilin-3人源化抗体或其抗体片段是裸抗体或其片段。

5.根据权利要求1所述的抗-butyrophilin-3人源化抗体，其抗体与butyrophilin 3A1（BTN3A1），butyrophilin 3A2（BTN3A2），butyrophilin 3A3（BTN3A3）结合。

6.抗-butyrophilin-3人源化抗体或其片段在制备治疗骨肉瘤、肝癌疾病的药物中的用途，其特征在于，所述抗-butyrophilin-3抗体或其片段包含轻链可变区CDR及重链可变区CDR，所述轻链可变区CDR序列为QSLSDN(SEQ ID NO：1)、FAS(SEQ ID NO：2)和QQSHSWPYT(SEQ ID NO：3)，所述重链可变区CDR序列为GFTFSSYA(SEQ ID NO：4)、ISSGGNYS(SEQ IDNO：5)和ARHGPDDFTSWVDY(SEQ ID NO：6)。