KR20220056186A - 면역 체크포인트 저해제, 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제, 면역 억제제, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 피브로넥틴 아날로그, 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하기 위한 키트, 및 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하는 방법 - Google Patents

면역 체크포인트 저해제, 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제, 면역 억제제, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 피브로넥틴 아날로그, 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하기 위한 키트, 및 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하는 방법 Download PDF

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amino acid
antibody
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토시유키 타카이
마사노리 이누이
메이 츄 스
쇼타 엔도
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고쿠리츠다이가쿠호진 도호쿠다이가쿠
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Abstract

피브로넥틴과 면역 억제성 수용체 LILRB4의 결합을 저해하는 물질을 유효 성분으로 함유하는 면역 체크포인트 저해제, 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제, 면역 억제성 수용체 LILRB4를 활성화하는 물질을 유효 성분으로 함유하는 면역 억제제, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 피브로넥틴 아날로그, 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하기 위한 키트, 및 상기 키트를 이용하는 생체 시료 중의 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하는 방법.

Description

면역 체크포인트 저해제, 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제, 면역 억제제, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 피브로넥틴 아날로그, 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하기 위한 키트, 및 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하는 방법
본 발명은, 면역 체크포인트 저해제, 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제, 면역 억제제, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 피브로넥틴 아날로그, 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하기 위한 키트, 및 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2019년 8월 13일에 출원된 일본 특허출원 2019-148423호에 기초해 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.
최근, 면역 체크포인트 저해제를 이용하는 암 면역요법이 주목받고 있다. 면역 체크포인트 저해제는, 자가에 대한 면역 응답을 억제하고, 과잉 면역 반응을 억제하는 작용을 갖는 면역 체크포인트 분자 혹은 그 리간드에 결합해, 면역 억제 시그널의 전달을 저해함으로써, 면역 체크포인트 분자에 의한 T 세포의 활성화 억제를 해제하는 약제이다.
본원 발명자들은 미지의 리간드에 대한 면역 억제성 수용체인 LILRB4(백혈구 Ig 유사 수용체(Leukocyte Ig-like receptor) B4, 이하, B4라고도 한다)를 이용함으로써, 감염 또는 자가 면역에 유래하는 염증성 질환을 판정할 수 있다는 것을 알아냈다(특허문헌 1).
LILRB4의 리간드로는, 최근, CD166, ApoE, Angptls 등이 보고되어 있다(비특허문헌 1∼3). 그러나, 이들이 생리적 리간드라는 점의 증명은 충분하다고는 할 수 없다.
피브로넥틴(Fibronectin; 이하, FN이라고도 한다)은 세포외 매트릭스(Extracellular Matrix; 이하, ECM이라고도 한다), 세포 표면상 및 체액 중에 존재하는 약 259 kDa의 당단백이다. 피브로넥틴은 단백 분해 효소인 서몰리신(thermolysin) 처리에 의해 6개의 영역(도메인)으로 분할된다. 이들은 각각의 특이적인 분자 결합능에 기반하여 1. 피브린·헤파린 결합 영역(Fibrin/Heparin binding-FN), 2. 콜라겐 결합 영역(Collagen binding-FN), 3. 헤파린 결합 영역(Heparin binding-FN), 4.세포/인테그린 결합 영역(cell/integrin-binding-domain(CBD)-FN), 5. 제2 헤파린 결합 영역(second Heparin binding-FN), 6. 제2 피브린 결합 영역(second Fibrin binding-FN)이라고 호칭되고 있다. 이와 같이, FN은 생리적 분자로의 결합능을 달리하는 복수의 도메인으로 구성된다. 지금까지, 전신 홍반 루푸스(Systemic Lupus Erythematosus; SLE)나 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis; RA)과 같은 일부 자가 면역 질환에서는 혈장 중이나 체액(예를 들면, 관절액) 중의 FN 농도의 변동이 보여지는 것 외에, 단일 클론 항체를 이용해 FN의 단편화(fragmentation)를 평가하는 도메인 해석이, 질환의 진단 내지 중증도 평가에 유용하다고 보고되고 있다(비특허문헌 4∼6). 특히, 피브린·헤파린 결합 영역(Fibrin/Heparin binding-FN) 농도는 정상인(61±18 ㎍/㎖)과의 비교에서, SLE는 24±12 ㎍/㎖(p＜0.003), RA는 36±22 ㎍/㎖(p＜0.00002)로 진단에서의 활용이 기대된다. 또한, FN이 폐암 세포주의 전이능과 침윤능을 촉진하는 것이 보고되고 있다(비특허문헌 7). 그러나, 전술한 어떤 문헌에도 FN이 LILRB4의 리간드인 것은 보고되어 있지 않다.
특허문헌 1: 일본 특허공개 2018-25554호 공보
비특허문헌 1: J Immunol. 2018 Feb 1; 200(3): 1207-1219. 비특허문헌 2: Blood. 2014 Aug 7; 124(6): 924-935. 비특허문헌 3: Nature. 2018 Oct; 562(7728): 605-609. 비특허문헌 4: Rheumatology(Oxford). 2007 Jul; 46(7): 1071-1075. 비특허문헌 5: J Rheumatol. 1987 Oct; 14(5): 1052-1054. 비특허문헌 6: Rheumatol Int. 2013 Jan; 33(1): 37-43. 비특허문헌 7: Br J Cancer 2009 Jul 21; 101(2): 327-334.
본 발명은, 면역 체크포인트 저해제, 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제, 면역 억제제, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 피브로넥틴 아날로그, 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하기 위한 키트, 및 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, LILRB4의 생리적 리간드가 ECM의 주요 구성 단백질의 하나인 피브로넥틴이라는 것을 알아내, 피브로넥틴 중의 LILRB4의 표적 서열을 특정하고, 이 표적 서열과 피브로넥틴의 결합을 저해하는 물질이 면역 체크포인트 저해제, 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제, 및 면역 억제제로서 유용하다는 것을 알아내 본 발명을 완성했다.
본 발명은 다음의 형태를 포함한다.
[1] 피브로넥틴과 면역 억제성 수용체 LILRB4의 결합을 저해하는 물질을 유효 성분으로 함유하는 면역 체크포인트 저해제.
[2] 상기 피브로넥틴이, 상기 피브로넥틴 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 통해 면역 억제성 수용체 LILRB4와 결합하는, [1]에 기재된 면역 체크포인트 저해제.
[3] 상기 피브로넥틴과 면역 억제성 수용체 LILRB4의 결합을 저해하는 물질이, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 항면역 억제성 수용체 LILRB4 항체 또는 그 유도체, 혹은 피브로넥틴 아날로그인, [1] 또는 [2]에 기재된 면역 체크포인트 저해제.
[4] 상기 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체가, 피브로넥틴 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 결합하는, [3]에 기재된 면역 체크포인트 저해제.
[5] 상기 피브로넥틴 아날로그가, 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나의 펩티드인, [3]에 기재된 면역 체크포인트 저해제.
(a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
(b) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개∼수 개의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드,
(c) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드.
[6] 피브로넥틴과 면역 억제성 수용체 LILRB4의 결합을 저해하는 물질을 유효 성분으로 함유하는 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제.
[7] 상기 피브로넥틴이, 상기 피브로넥틴 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 통해 면역 억제성 수용체 LILRB4와 결합하는, [6]에 기재된 치료제.
[8] 상기 피브로넥틴과 면역 억제성 수용체 LILRB4의 결합을 저해하는 물질이, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 항면역 억제성 수용체 LILRB4 항체 또는 그 유도체, 혹은 피브로넥틴 아날로그인, [6] 또는 [7]에 기재된 치료제.
[9] 상기 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체가, 피브로넥틴 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 결합하는, [8]에 기재된 치료제.
[10] 상기 피브로넥틴 아날로그가, 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나의 펩티드인, [8]에 기재된 치료제.
(a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
(b) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개∼수 개의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드,
(c) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드.
[11] 상기 면역 체크포인트 관련 질환이, 자가 면역 질환, 암, 염증성 질환, 및 알레르기성 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [6]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 치료제.
[12] 상기 암이, 암 전이에 의한 것인, [11]에 기재된 치료제.
[13] 면역 억제성 수용체 LILRB4를 활성화하는 물질을 유효 성분으로 함유하는 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제.
[14] 상기 면역 억제성 수용체 LILRB4를 활성화하는 물질이, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 항면역 억제성 수용체 LILRB4 항체 또는 그 유도체, 혹은 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 아날로그인, [13]에 기재된 치료제.
[15] 상기 피브로넥틴 아날로그가, 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나의 펩티드인, [14]에 기재된 치료제.
(a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
(b) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개∼수 개의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드,
(c) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드.
[16] 상기 면역 체크포인트 관련 질환이, 골(骨)질환인, [13]∼[15] 중 어느 하나에 기재된 치료제.
[17] 면역 억제성 수용체 LILRB4를 활성화하는 물질을 유효 성분으로 함유하는 면역 억제제.
[18] 상기 면역 억제성 수용체 LILRB4를 활성화하는 물질이, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 항면역 억제성 수용체 LILRB4 항체 또는 그 유도체, 혹은 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 아날로그인, [17]에 기재된 면역 억제제.
[19] 상기 피브로넥틴 아날로그가, 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나의 펩티드인, [18]에 기재된 면역 억제제.
(a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
(b) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개∼수 개의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드,
(c) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드.
[20] 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 결합하는 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체.
[21] 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나의 펩티드와 면역 글로불린 G의 Fc 영역이 융합한 피브로넥틴 아날로그.
(a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
(b) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개∼수 개의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드,
(c) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드.
[22] [20]에 기재된 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체를 포함하고, 생체 시료 중에 포함되는 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하기 위한 키트.
[23] [22]에 기재된 키트를 이용하는, 생체 시료 중의 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하는 방법.
본 발명에 따르면, 면역 체크포인트 저해제, 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제, 면역 억제제, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 피브로넥틴 아날로그, 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하기 위한 키트, 및 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 마우스 야생형 나이브 CD8 양성 T 세포(상단) 및 B4 결손 나이브 CD8 양성 T 세포(하단)에서의 B4(좌측), PD-1(중앙), Tim-3(우측)의 발현을 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 해석한 결과를 나타낸다. 종축은 히스토그램의 피크치를 100%로 했을 때의 세포의 비율, 횡축은 형광 강도(단백질의 발현 강도)를 나타내고 있다. 실선은 각 항원 특이적 항체에 의한 염색의 결과를, 실선 없는 회색은 아이소타입(isotype) 대조 항체에 의한 염색의 결과를 각각 나타낸다.
도 2는 마우스 야생형 CD8 양성 T 세포(상단) 및 B4 결손 CD8 양성 T 세포(하단)의 항CD3 항체/항CD28 항체에 의한 활성화 자극에서의 B4(좌측), PD-1(중앙), Tim-3(우측)의 발현을 유세포 분석에 의해 시계열적(0∼3일째)으로 해석한 결과를 나타낸다. 종축에 히스토그램의 피크치를 100%로 했을 때의 세포의 비율 및 횡축에 형광 강도(단백질의 발현 강도)로 나타낸 각 측정일의 히스토그램을 중첩한 도면으로 나타내고 있다. 실선은 각 항원 특이적 항체에 의한 염색의 결과를, 실선 없는 회색은 아이소타입 대조 항체에 의한 염색의 결과를 나타낸다.
도 3은 마우스 야생형 나이브 CD4 양성 T 세포(상단) 및 B4 결손 나이브 CD4 양성 T 세포(하단)에서의 B4(좌측), PD-1(중앙), Tim-3(우측)의 발현을 유세포 분석에 의해 해석한 결과를 나타낸다. 종축은 히스토그램의 피크치를 100%로 했을 때의 세포의 비율, 횡축은 형광 강도(단백질의 발현 강도)를 나타내고 있다. 실선은 각 항원 특이적 항체에 의한 염색의 결과를, 실선 없는 회색은 아이소타입 대조 항체에 의한 염색의 결과를 각각 나타낸다.
도 4는 마우스 야생형 CD4 양성 T 세포(상단) 및 B4 결손 CD4 양성 T 세포(하단)의 항CD3 항체/항CD28 항체에 의한 활성화 자극에서의 B4(좌측), PD-1(중앙), Tim-3(우측)의 발현을 유세포 분석에 의해 시계열적(0∼3일째)으로 해석한 결과를 나타낸다. 종축에 히스토그램의 피크치를 100%로 했을 때의 세포의 비율 및 횡축에 형광 강도(단백질의 발현 강도)로 나타낸 각 측정일의 히스토그램을 중첩한 도면으로 나타내고 있다. 실선은 각 항원 특이적 항체에 의한 염색의 결과를, 실선 없는 회색은 아이소타입 대조 항체에 의한 염색의 결과를 나타낸다.
도 5는 마우스 CD8 양성 T 세포(상단) 및 CD4 양성 T 세포(하단)의 항CD3 항체/항CD28 항체에 의한 활성화 자극에서의 B4와 PD-1의 공발현에 대해 유세포 분석에 의해 시계열적(0∼3일째)으로 해석한 결과를 나타낸다. 종축은 PD-1의 발현 강도, 횡축은 B4의 발현 강도를 나타내고, 십자로 구획한 좌측 아래 영역은 PD-1 음성 B4 음성, 좌측 위 영역은 PD-1 단독 양성, 우측 위 영역은 PD-1 양성 B4 양성, 우측 아래 영역은 PD-1 음성 B4 양성을 각각 나타낸다.
도 6은 인간 CD8 양성 T 세포(상단) 및 CD4 양성 T 세포(하단)의 항CD3 항체/항CD28 항체에 의한 활성화 자극에서의 B4(좌측), PD-1(중앙), Tim-3(우측)의 발현을 유세포 분석에 의해 시계열적(0∼3일째)으로 해석한 결과를 나타낸다. 종축에 히스토그램의 피크치를 100%로 했을 때의 세포의 비율 및 횡축에 형광 강도(단백질의 발현 강도)로 나타낸 각 측정일의 히스토그램을 중첩한 도면으로 나타내고 있다. 실선은 각 항원 특이적 항체에 의한 염색, 옅은 회색은 아이소타입 대조 항체에 의한 염색의 결과를 나타낸다.
도 7은 인간 MSC와 B4-GFP 리포터 세포의 공배양에 있어서, 항FN30 단일 클론 항체에 의한 FN-B4 결합 저해 효과를 B4-GFP 리포터 세포의 GFP 발현 세포의 비율에 의해 평가한 결과를 나타낸다. 플롯의 종축은 세포의 크기, 횡축은 GFP의 형광 강도를 나타내고, 플롯 내의 수치는 GFP 양성 세포(프레임내)의 비율(%)을 나타낸다. 막대 그래프는 각 항체로 처리했을 때의 GFP 양성 세포의 비율(%)을 나타낸다.
도 8은 마우스 골수 유래 간엽계 줄기세포 및 인간 골수 유래 간엽계 줄기세포를 항FN30 단일 클론 항체로 염색해, 유세포 분석기(flow cytometer)로 해석한 결과를 나타낸다. 실선은 항FN30 단일 클론 항체에 의한 염색의 결과를, 실선 없는 회색은 아이소타입 대조 항체에 의한 염색의 결과를 각각 나타낸다.
도 9는 항FN30 단일 클론 항체 No. 5를 이용해 마우스 암세포주(상단) 및 인간 암세포주(하단)를 염색해, 유세포 분석기로 해석한 결과를 나타낸다. 실선은 항FN30 단일 클론 항체에 의한 염색의 결과를, 실선 없는 회색은 아이소타입 대조 항체에 의한 염색의 결과를 각각 나타낸다.
도 10은 야생형 마우스에 B16F10 세포주(상단, 2마리분) 및 3LL 세포주(하단, 3마리분)를 접종해 형성된 종양내에 침윤하고 있는 CD8 양성 T 세포에 대해, B4 및 PD-1의 발현을 유세포 분석기로 해석한 결과를 나타낸다. 종축은 PD-1의 발현 강도, 횡축은 B4의 발현 강도를 나타내고, 십자로 구획한 좌측 아래 영역은 PD-1 음성 B4 음성, 좌측 위 영역은 PD-1 단독 양성, 우측 위 영역은 PD-1 양성 B4 양성, 우측 아래 영역은 PD-1 음성 B4 양성을 각각 나타낸다.
도 11은 야생형 마우스에 B16F10 세포주(상단, 2마리분) 및 3LL 세포주(하단, 3마리분)를 접종해 형성된 종양내에 침윤하고 있는 CD4 양성 T 세포에 대해, B4 및 PD-1의 발현을 유세포 분석기로 해석한 결과를 나타낸다. 종축은 PD-1의 발현 강도, 횡축은 B4의 발현 강도를 나타내고, 십자로 구획한 좌측 아래 영역은 PD-1 음성 B4 음성, 좌측 위 영역은 PD-1 단독 양성, 우측 위 영역은 PD-1 양성 B4 양성, 우측 아래 영역은 PD-1 음성 B4 양성을 각각 나타낸다.
도 12는 인간 혈장 샘플중의 항피브로넥틴 항체를 이용한 웨스턴 블롯법에 의한 단백질의 검출 결과를 나타낸다. 좌측에 항피브로넥틴 다중 클론 항체를 이용한 염색의 결과를, 우측에 항FN30 단일 클론 항체 No. 4 및 No. 5로 염색한 결과를 각각 나타낸다.
도 13은 항피브로넥틴 항체를 이용한 정상 인간 혈장중 피브로넥틴 전장(全長) 분자, 및 피브로넥틴 24 kDa 단편의 정량 결과를 나타낸다. 스탠다드 단백의 흡광도를 기초로 4 파라미터 로지스틱 회귀로 비선형 근사를 실시해, 샘플의 흡광도값으로부터 농도를 산출했다. 상단은 항FN30 단일 클론 항체에서 검출되는 피브로넥틴 농도[A(㎍/㎖)]를, 하단은 항FN44 항체에서 검출되는 피브로넥틴 농도[B(㎍/㎖)]를 나타낸다.
도 14는 항FN 단일 클론 항체를 이용한 정상 인간 혈장중의 피브로넥틴 전장 분자 및 피브로넥틴 24 kDa 단편의 농도의, 제1, 제2, 제34 분위점 및 최대치, 최소치를 나타낸 박스 플롯(box and whisker plot)을 나타낸다. 좌측이 피브로넥틴 전장 분자 농도를, 우측이 피브로넥틴 24 kDa 단편의 농도를 나타낸다.
도 15는 BXSB/Yaa 마우스에 컨트롤 IgG 또는 FN30-Fc를 복강내 투여하고, 혈청중의 항dsDNA IgG 레벨을 측정한 결과를 나타낸다.
도 16은 BXSB/Yaa 마우스에 컨트롤 IgG 또는 항gp49B 단일 클론 항체 H1.1을 복강내 투여하고, 혈청중의 항dsDNA IgG 레벨을 측정한 결과를 나타낸다.
도 17a는 야생형(WT) B6 마우스 및 gp49B 결손 마우스에 루이스 폐암종(Lewis lung carcinoma) 세포(LLC)를 꼬리 정맥으로부터 주입하고, 30일 경과 후에, 폐의 표면을 H＆E 염색한 결과를 나타낸다. WT는 야생형 마우스, gp49B-/-는 gp49B 결손 마우스의 결과를 나타낸다.
도 17b는 야생형(WT) B6 마우스 및 gp49B 결손 마우스에 루이스 폐암종 세포(LLC)를 꼬리 정맥으로부터 주입하고, 30일 경과 후의 폐의 전이병소수의 정량 결과를 나타낸다.
도 17c는 야생형(WT) B6 마우스 및 gp49B 결손 마우스에 루이스 폐암종 세포(LLC)를 꼬리 정맥으로부터 주입하고, 30일 경과 후에, 간을 H＆E 염색한 결과를 나타낸다. WT는 야생형 마우스, gp49B-/-는 gp49B 결손 마우스의 결과를 나타낸다.
도 17d는 야생형(WT) B6 마우스 및 gp49B 결손 마우스에 루이스 폐암종 세포(LLC)를 꼬리 정맥으로부터 주입하고, 30일 경과 후의 간의 전이병소수의 정량 결과를 나타낸다.
도 18a는 야생형(WT) B6 마우스 및 gp49B 결손 마우스에 마우스 흑색종(melanoma) 세포 B16F10을 꼬리 정맥으로부터 주입하고, 20일 경과 후의 폐의 표면을 H＆E 염색한 결과를 나타낸다. WT는 야생형 마우스, gp49B-/-는 gp49B 결손 마우스를 나타낸다.
도 18b는 야생형(WT) B6 마우스 및 gp49B 결손 마우스에 마우스 흑색종 세포 B16F10을 꼬리 정맥으로부터 주입하고, 20일 경과 후의 간을 H＆E 염색한 결과를 나타낸다. WT는 야생형 마우스, gp49B-/-는 gp49B 결손 마우스를 나타낸다.
도 19는 야생형 마우스의 골수 세포 또는 gp49B 결손 마우스의 골수 세포를 입양 세포 이식(adoptive cell transfer)한 결과를 나타낸다. 좌측이 폐(상단), 간(하단)의 H＆E 염색의 결과, 우측이 폐(상단), 간(하단)의 전이병소수를 나타낸다. WT-R는 야생형 마우스, gp49B-/--R은 gp49B 결손 마우스를 나타낸다.
도 20a는 야생형(WT) B6 마우스에, 마우스 흑색종 세포 B16F10을 주입한 후, 대조 아이소타입 IgG 항체, 항PD-1 단일 클론 항체, 항gp49B 단일 클론 항체, 또는 항PD-1 단일 클론 항체와 항gp49B 단일 클론 항체의 조합을 투여하는 스케줄을 나타낸다.
도 20b는 야생형(WT) B6 마우스에, 마우스 흑색종 세포 B16F10을 주입한 후, 대조 아이소타입 IgG 항체, 항PD-1 단일 클론 항체, 항gp49B 단일 클론 항체, 또는 항PD-1 단일 클론 항체와 항gp49B 단일 클론 항체의 조합을 투여해, B16F10 종양을 일으키고 있는 마우스의 폐 및 간의 전이 상태를 나타낸 도면이다. 상단은 폐의 종양 결절, 하단은 간의 H＆E 염색상을 나타낸다.
도 20c는 야생형(WT) B6 마우스에, 마우스 흑색종 세포 B16F10을 주입한 후, 대조 아이소타입 IgG 항체, 항PD-1 단일 클론 항체, 항gp49B 단일 클론 항체, 또는 항PD-1 단일 클론 항체와 항gp49B 단일 클론 항체의 조합을 투여해, 폐의 종양 결절수를 각 항체 처치군에서 비교한 그래프이다.
도 20d는 야생형(WT) B6 마우스에, 마우스 흑색종 세포 B16F10을 주입한 후, 대조 아이소타입 IgG 항체, 항PD-1 단일 클론 항체, 항gp49B 단일 클론 항체, 또는 항PD-1 단일 클론 항체와 항gp49B 단일 클론 항체의 조합을 투여해, 간으로의 B16F10 전이병소수를 각 항체 처치군에서 비교한 그래프이다.
도 20e는 야생형(WT) B6 마우스에, 루이스 폐암종 세포(LLC)를 주입한 후, 대조 아이소타입 IgG 항체, 항PD-1 단일 클론 항체, 항gp49B 단일 클론 항체, 또는 항PD-1 단일 클론 항체와 항gp49B 단일 클론 항체의 조합을 투여하는 스케줄을 나타낸다.
도 20f는 야생형(WT) B6 마우스에, 루이스 폐암종 세포(LLC)를 주입한 후, 대조 아이소타입 IgG 항체, 항PD-1 단일 클론 항체, 항gp49B 단일 클론 항체, 또는 항PD-1 단일 클론 항체와 항gp49B 단일 클론 항체의 조합을 투여하고, LLC 세포가 주입된 마우스의 21일 후의 in vivo 발광 영상(bioluminescence imaging)의 결과를 나타낸다.
도 20g는 야생형(WT) B6 마우스에, 루이스 폐암종 세포(LLC)를 주입한 후, 대조 아이소타입 IgG 항체, 항PD-1 단일 클론 항체, 항gp49B 단일 클론 항체, 또는 항PD-1 단일 클론 항체와 항gp49B 단일 클론 항체의 조합을 투여하고, LLC 세포가 주입된 마우스의 21일 후의 in vivo 발광 영상을 기초로, 평균직경(photons/s/㎠/steradian)으로 생체발광(Bioluminescence) 해석하여 각 항체 처치군에서 비교한 결과를 나타낸다.
도 21은 야생형(WT) B6 마우스에, 루이스 폐암종 세포(LLC)를 주입한 후, 대조 아이소타입 IgG 항체, 항PD-1 단일 클론 항체, 항gp49B 단일 클론 항체, 또는 항PD-1 단일 클론 항체와 항gp49B 단일 클론 항체의 조합을 투여한 마우스의 폐와 간의 병리 절편의 해석 결과를 나타낸다. 상단이 폐의 표면, 하단이 간의 H＆E 염색을 나타낸다. 화살표는 암 전이병소의 위치를 나타낸다.
도 22는 대조 아이소타입 IgG 항체, 항gp49B 단일 클론 항체 H1.1, 항gp49B 단일 클론 항체 H1.1의 F(ab')2 플래그먼트 또는 항FN30 단일 클론 항체 No. 6 첨가에 의한 골수 세포로부터의 파골세포로의 분화 유도의 결과를 나타낸다. 사진이 파골세포의 TRAP 염색상을 나타내고, 그래프는 각 항체 첨가에 의한 분화 유도율을 나타낸다. 사진 및 그래프에 있어서, Mock은 항체 비첨가의 경우를 나타낸다.
도 23은 항LILRB4 단일 클론 항체 ZM4.1(우측) 또는 마우스 IgG1κ(좌측)를 첨가한 경우의 파골세포의 TRAP 염색상을 나타낸다.
도 24는 야생형 B6 마우스 또는 gp49B 결손 마우스의 골수 세포로부터 파골세포를 분화 유도한 결과를 나타낸다. 사진 왼쪽이 야생형 B6 마우스의 골수 세포로부터 분화한 파골세포, 사진 오른쪽이 gp49B 결손 마우스의 골수 세포로부터 분화한 파골세포의 TRAP 염색상을 나타낸다. 그래프는, 야생형 B6 마우스의 골수 세포, gp49B 결손 마우스의 골수 세포로부터 각각 파골세포를 분화 유도시킨 경우의 분화 유도율을 나타낸다. WT는 야생형 B6 마우스, gp49B-/- 및 KO는 gp49B 결손 마우스를 나타낸다.
도 25는 야생형 B6 마우스 및 gp49B 결손 마우스의 대퇴골중의 파골세포의 TRAP 염색상을 나타낸다. 좌측이 야생형 B6 마우스, 우측이 gp49B 결손 마우스의 파골세포의 TRAP 염색상을 나타낸다.
[면역 체크포인트 저해제]
본 발명의 면역 체크포인트 저해제는, 피브로넥틴과 면역 억제성 수용체 LILRB4의 결합을 저해하는 물질을 유효 성분으로 함유한다. 피브로넥틴은, 상기 피브로넥틴 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 통해 LILRB4와 결합할 수 있다. 즉, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열은, LILRB4의 피브로넥틴 중의 표적 서열이다.
피브로넥틴과 LILRB4의 결합을 저해하는 물질로는, 피브로넥틴과 LILRB4의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질이라면 특별히 제한은 없지만, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 항LILRB4 항체 또는 그 유도체, 피브로넥틴 아날로그 등을 들 수 있다.
항피브로넥틴 항체로는, 피브로넥틴과 반응하는 항체라면 단일 클론 항체, 다중 클론 항체의 어느 것이라도 무방하지만, 단일 클론 항체가 바람직하게 이용된다. 당해 항체의 제작은 주지의 방법으로 제작할 수 있다. 예를 들면, 다중 클론 항체의 제작에는, 면역하는 동물로서 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 염소, 양, 닭 등이 이용된다. 항혈청은, 항원을 동물의 피하, 피내, 복강 등에 1회 또는 수 회 투여한 후, 혈청으로부터 얻을 수 있다. 단백질, 펩티드를 항원으로 이용할 때에는, 면역 활성 효과를 갖는 보액과의 혼합물의 면역이 보다 바람직하다.
또한, 단일 클론 항체의 제작에는, 공지의 단일 클론 항체 제작 방법, 예를 들면 나가무네 요시아키, 테라다 히로시 공저, 「단일 클론 항체」, 히로카와 서점(1990년)이나, Jame W. Golding, 「Monoclonal Antibody」, 3rd edition, Academic Press, 1996년에 따라 제작할 수 있다. 또한, DNA 면역법에 의해 단일 클론 항체를 제작할 수도 있으며, Nature 1992 Mar 12; 356 152-154나 J. Immunol Methods Mar 1; 249 147-154를 참고로 제작할 수 있다.
항체 제작에 이용되는 항원으로는, 피브로넥틴, 또는 그 일부 단편(펩티드), 혹은 피브로넥틴 또는 그 일부 단편을 코딩하는 cDNA를 조합한 벡터를 이용할 수 있다. 피브로넥틴과 LILRB4의 결합을 저해하는 단일 클론 항체를 얻기 위해서는, 피브로넥틴 중의 LILRB4의 표적 서열인 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 이용하는 것이 바람직하다. 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩하는 유전자가 들어있는 구축물인 피브로넥틴 벡터가 최적의 면역용 항원 유전자로서 사용될 수 있다. DNA 면역법은, 상기 유전자 구축물을 단독 또는 혼합하고, 면역 동물에 대해 여러 가지 유전자 도입법(예를 들면 근육주사, 전기천공(electroporation), 유전자총 등)의 어느 하나를 이용해 동물(마우스 또는 래트 등)의 피하에 주입하여, 세포 내에 도입시킴으로써 실시할 수 있다.
상기 항피브로넥틴 단일 클론 항체는, 통상의 방법에 따라 작성한 하이브리도마(hybridoma)를 배양하고, 배양상청으로부터 분리하는 방법, 그 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유류 동물에 투여해, 복수로서 회수하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 상기 항피브로넥틴 단일 클론 항체는, 공지의 유전자 재조합 기술을 이용해 제작할 수도 있다. 구체적으로는, 상기에서 제작한 하이브리도마가 생산하는 단일 클론 항체, 상기 항체를 코딩하는 유전자를 클로닝해, 상기 유전자를 포함하는 벡터를 제작하고, 이것을 숙주 세포에 도입해 형질 전환시킴으로써 항피브로넥틴 항체를 발현하는 세포를 취득하고, 이것을 세포 배양함으로써 제작할 수 있다. 이 조제에 사용되는 세포, 벡터의 종류, 세포의 종류, 배양 조건 등은 당업자의 기술적 범위내이며, 적의 적절한 조건을 설정할 수 있다.
항체는, 필요에 따라 그것을 보다 정제해 사용할 수 있다. 항체를 정제·단리하는 방법으로는, 종래 공지의 방법, 예를 들면 황산암모늄 침전법 등의 염석, 세파덱스(Sephadex) 등에 의한 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그래피법, 프로틴 A 칼럼 등에 의한 어피니티(affinity) 정제법 등을 들 수 있다.
항피브로넥틴 항체의 유도체로는, 예를 들면 상기 항피브로넥틴 항체의 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv, 이들의 변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질 또는 융합 펩티드 등을 들 수 있다. 항피브로넥틴 항체의 유도체는, 공지의 항체 유도체의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체는, 피브로넥틴 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 그 부분 서열에 결합한다. 본 발명의 면역 체크포인트 저해제에 있어서, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체는, 피브로넥틴 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 그 부분 서열에 결합함으로써, 피브로넥틴과 LILRB4의 결합을 저해할 수 있다.
항LILRB4 항체로는, LILRB4와 결합하는 항체라면 단일 클론 항체, 다중 클론 항체의 어느 것이라도 무방하지만, 단일 클론 항체가 바람직하게 이용된다. 상기 항LILRB4 항체는 상기 항피브로넥틴 항체와 같은 방법에 의해 제작할 수 있다.
항LILRB4 항체 제작에 이용되는 항원으로는, LILRB4 단백질 또는 그 일부 단편(펩티드), 혹은 LILRB4 단백을 코딩하는 cDNA를 조합한 벡터를 이용할 수 있다. LILRB4의 고차 구조를 인식하는 단일 클론 항체를 얻기 위해, 인간 LILRB4 전장(全長) 유전자가 들어있는 구축물인 전장 LILRB4 벡터가 최적의 면역용 항원 유전자가 되지만, 그 외, LILRB4 서열의 일부 영역이 삽입된 구축물도 면역용 항원 유전자로 사용할 수 있다. LILRB4 서열의 일부 영역으로는, 피브로넥틴 중의 LILRB4의 표적 서열인 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열이 LILRB4에 결합하는 LILRB4의 영역(피브로넥틴 결합 부위)이 바람직하다. DNA 면역법은, 상기 유전자 구축물을 단독 또는 혼합하고, 면역 동물에 대해 여러 가지 유전자 도입법(예를 들면 근육주사, 전기천공, 유전자총 등)의 어느 하나를 이용해 동물(마우스 또는 래트 등)의 피하에 주입하여, 세포 내에 도입시킴으로써 실시할 수 있다.
상기 항LILRB4 항체의 정제는, 상기 항피브로넥틴 항체와 같은 방법에 의해 실시할 수 있다. 상기 항LILRB4 항체의 유도체로는, 예를 들면 상기 항LILRB4 항체의 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv, 이들의 변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질 또는 융합 펩티드 등을 들 수 있다.
본 발명의 면역 체크포인트 저해제에 있어서, 항LILRB4 항체 또는 그 유도체는, 피브로넥틴이, 피브로넥틴 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 통해 LILRB4에 결합하는 것을 저해할 수 있다.
피브로넥틴과 LILRB4 결합의 저해는, LILRB4를 발현하고 있는 세포에의 피브로넥틴 결합의 저해를 평가함으로써 실시할 수 있다. LILRB4를 발현하고 있는 세포로는, LILRB4를 발현하고 있는 세포라면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 비장 세포, 말초혈 백혈구, 골수 세포, 혹은 이들로부터 단리된 B 세포, 형질 세포, 단구·대식 세포, 수지상 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 비만 세포, 활성화 T 세포 등을 들 수 있다.
LILRB4의 염기 서열 및 아미노산 서열은, 미국 생물공학 정보 센터(NCBI)에 의해 제공되는 데이터베이스로부터 알 수 있다. 인간(Homo sapiens) LILRB4의 경우, 예를 들면 Entrez GeneID는 11006(2019년 6월 17일 시점), RefSeq ProteinID는 NP_001265355.2, NP_001265356.2, NP_001265357.2, NP_001265358.2, NP_001265359.2(아이소폼(isoform) 1∼5에 상당)를 들 수 있다. 마우스(Mus musculus) LILRB4로는, GeneID는 14728(2016년 6월 24일 시점), NP_038560.1을 들 수 있고, 래트(Rattus norvegicus) LILRB4로는, GeneID는 292594(2019년 4월 18일 시점), RefSeq ProteinID는 NP_001013916을 들 수 있고, 다른 동물도 LILRB4를 갖는 것이 알려져 있다. 상기 LILRB4로 한정되지 않고, 다른 LILRB4도 본 발명에서의 LILRB4에 포함된다.
피브로넥틴의 염기 서열 및 아미노산 서열은, 미국 생물공학 정보 센터(NCBI)에 의해 제공되는 데이터베이스로부터 알 수 있다. 인간(Homo sapiens) 피브로넥틴의 경우, 예를 들면 Entrez GeneID는 2335, RefSeq ProteinID는 NP_997647, NP_001352447, XP_005246463 등을 들 수 있다. 마우스(Mus musculus) 피브로넥틴으로는, GeneID는 14268을 들 수 있고, 래트(Rattus norvegicus) 피브로넥틴으로는, GeneID는 25661, RefSeq ProteinID는 NP_062016을 들 수 있으며, 다른 동물도 피브로넥틴을 갖는 것이 알려져 있다. 상기 피브로넥틴으로 한정되지 않고, 다른 피브로넥틴도 본 발명에서의 피브로넥틴에 포함된다.
피브로넥틴은, 상기 피브로넥틴 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 통해 형질 세포, T 세포, 대식 세포 등의 세포 표면에 존재하는 LILRB4와 결합해 면역 체크포인트 분자를 활성화한다. 환언하면, LILRB4는 피브로넥틴 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 통해 피브로넥틴과 결합함으로써, 면역 억제 기능을 발현한다.
본 발명에 있어서, 피브로넥틴 아날로그로는, 피브로넥틴과 LILRB4의 결합을 저해하는 작용을 갖고 있으면, 모든 피브로넥틴의 아날로그를 포함하지만, 예를 들면 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나의 펩티드를 들 수 있다.
(a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
(b) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개∼수 개의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드,
(c) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드.
상기 아미노산 서열의 동일성은 80% 이상이지만, 85% 이상이 바람직하고, 90% 이상이 보다 바람직하고, 95% 이상이 더 바람직하고, 98% 이상이 한층 더 바람직하다. 또한, 상기 아미노산 서열의 결실, 치환 혹은 부가의 수는, 1∼5개가 바람직하고, 1∼4개가 보다 바람직하고, 1∼3개가 더 바람직하고, 1∼2개가 한층 더 바람직하다. 아미노산 서열의 동일성은, GenBank 데이터베이스에서 제공되는 BLAST 검색에 의해 구할 수 있다.
상기 피브로넥틴 아날로그로는, 상기 (a)∼(c) 중 어느 하나의 펩티드와 면역 글로불린 G의 Fc 영역이 융합한 피브로넥틴 아날로그라도 된다.
상기 피브로넥틴 아날로그는, 공지의 방법, 예를 들면 유전자 재조합 기술에 의해 제작할 수 있다.
본 발명의 면역 체크포인트 저해제는, 피브로넥틴과 LILRB4의 결합을 저해하는 물질을 유효 성분으로 함유하고, 약학적으로 허용 가능한 담체나 첨가물을 더 함유하고 있어도 된다.
담체 및 첨가물의 예로는, 물, 식염수, 인산 완충액, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 약학적으로 허용되는 유기용제, 콜라겐, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 카복시비닐 폴리머, 카복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 폴리아크릴산 나트륨, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카복시메틸 스타치 나트륨, 펙틴, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 잔탄검, 아라비아검, 카제인, 한천, 폴리에틸렌 글리콜, 디글리세린, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴 알코올, 스테아린산, 인간 혈청 알부민, 만니톨, 소르비톨, 락토스, 계면활성제 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 면역 체크포인트 저해제는, 여러 가지 형태, 예를 들면 액제(예를 들면, 주사제), 분산제, 현탁제, 정제, 환제, 분말제, 좌제 등으로 할 수 있다. 바람직한 형태는, 주사제이며, 비경구(예를 들면, 정맥내, 경피, 복강내, 근내)로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 면역 체크포인트 저해제는, 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명의 면역 체크포인트 저해제의 투여량은, 예를 들면 0.025∼50 ㎎/㎏, 바람직하게는 0.1∼50 ㎎/㎏이며, 보다 바람직하게는 0.1∼25 ㎎/㎏, 더 바람직하게는 0.1∼10 ㎎/㎏ 또는 0.1∼3 ㎎/㎏으로 할 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다.
[면역 체크포인트 관련 질환의 치료제]
본 발명의 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제는, 피브로넥틴과 LILRB4의 결합을 저해하는 물질을 유효 성분으로 함유한다.
피브로넥틴과 LILRB4의 결합을 저해하는 물질로는, 피브로넥틴과 LILRB4의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질이라면 특별히 제한은 없지만, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 항LILRB4 항체 또는 그 유도체, 피브로넥틴 아날로그 등을 들 수 있다. 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 항LILRB4 항체 또는 그 유도체, 및 피브로넥틴 아날로그로는 전술한 것을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 면역 체크포인트 관련 질환으로는, 면역 체크포인트 분자인 LILRB4가 관여하는 질환이라면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 자가 면역 질환, 암, 염증성 질환, 알레르기성 질환 등을 들 수 있다.
자가 면역 질환으로는, 예를 들면 바제도병(Basedow's disease), 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염(Hashimoto thyroiditis), 1형 당뇨병, 전신 홍반 루푸스, 혈관염, 애디슨병(Addison's disease), 다발성 근염, 피부 근염, 건선, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 전신성 강피증, 사구체신염 등을 들 수 있다.
암으로는, 예를 들면 폐암, 대장암, 신장암, 악성 흑색종, 호지킨 림프종, 두경부암, 췌장암, 간암, 전립선암, 골육종, 백혈병 등을 들 수 있다. 암은 원발성이라도 되고, 전이성이라도 무방하지만, 전이성의 암에 대해 바람직하게 이용된다.
염증성 질환으로는, 예를 들면 전신 홍반 루푸스, 피부 근염, 가와사키병(Kawasaki disease), 건선, 대상 포진, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 기관지 천식, 아토피성 피부염, 류마티스 관절염, 항인지질 항체 증후군, 다발성 근염, 혈관염 증후군, 쇼그렌 증후군, 베체트병(Behcet's disease), 바제도병, 하시모토병, 심근염, 대동맥염 증후군, 궤양성 대장염, 크론병, 원발성 담즙성 간경변, 자가 면역성 간염, 자가 면역성 췌장염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 사구체신염, ANCA 관련 신염, 아밀로이드증(amyloidosis), TINU 증후군, 과민성 폐렴, 호산구성 폐렴, 사르코이드증(sarcoidosis) 등을 들 수 있다.
알레르기 질환으로는, 알레르기성 비염, 기관지 천식, 두드러기·아토피성 피부염, 대상 포진, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 알레르기성 결막염, 음식 알레르기, 아나필락시스, 자가 면역성 용혈성 빈혈, 혈소판 감소증, 과립구 감소증, 신생아 용혈성 황달, 혈청병, 과민성 폐렴, 루푸스 신염(만성 사구체신염), 전신 홍반 루푸스, 접촉 피부염, 하시모토병, 베체트병, 장기 이식 후의 거절반응이나 이식편대 숙주병(GVHD) 등을 들 수 있다.
본 발명의 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제는, LILRB4를 활성화하는 물질을 유효 성분으로 함유해도 된다. LILRB4를 활성화하는 물질로는, LILRB4와 결합함으로써 LILRB4를 활성화하는 물질이라면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 항LILRB4 항체 또는 그 유도체, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 아날로그 등을 들 수 있다. 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 항LILRB4 항체 또는 그 유도체, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 아날로그로는, 전술한 것을 들 수 있는데, 본 발명의 LILRB4를 활성화하는 물질을 유효 성분으로 함유하는 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제에 있어서는, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 항LILRB4 항체 또는 그 유도체, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 아날로그가 LILRB4와 결합함으로써 LILRB4를 활성화해 LILRB4의 면역 억제 기능을 발현시킨다.
본 발명의 LILRB4를 활성화하는 물질을 유효 성분으로 함유하는 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제에 있어서, 상기 면역 체크포인트 관련 질환으로는, LILRB4를 활성화하는 것에 의한 면역 기능 억제에 의해 치료 효과를 갖는 질환이라면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 류마티스성 관절염, 골화석병, 골다공증 등의 골(骨)질환 등을 들 수 있다. 본 발명의 LILRB4를 활성화하는 물질은, 예를 들면 파골세포의 증식을 억제함으로써 골(骨)질환을 치료할 수 있다.
본 발명의 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제는, 약학적으로 허용 가능한 담체나 첨가물을 더 함유해도 된다. 약학적으로 허용 가능한 담체 및 첨가물은, 전술한 것을 들 수 있다.
본 발명의 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제는, 여러 가지 형태, 예를 들면 액제(예를 들면, 주사제), 분산제, 현탁제, 정제, 환제, 분말제, 좌제 등으로 할 수 있다. 바람직한 형태는 주사제이며, 비경구(예를 들면, 정맥내, 경피, 복강내, 근내)로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제의 투여량은, 예를 들면 0.025∼50 ㎎/㎏, 바람직하게는 0.1∼50 ㎎/㎏이며, 보다 바람직하게는 0.1∼25 ㎎/㎏, 더 바람직하게는 0.1∼10 ㎎/㎏ 또는 0.1∼3 ㎎/㎏로 할 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다.
[면역 억제제]
본 발명의 면역 억제제는, LILRB4를 활성화하는 물질을 유효 성분으로 함유한다. LILRB4를 활성화하는 물질로는, 상기 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제에서 전술한 것을 들 수 있다. 본 발명의 LILRB4를 활성화하는 물질을 유효 성분으로 함유하는 면역 억제제에 있어서는, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 항LILRB4 항체 또는 그 유도체, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 아날로그가 LILRB4와 결합함으로써 LILRB4를 활성화해 LILRB4의 면역 억제 기능을 발현시킨다. 본 발명의 면역 억제제는 이식 의료에의 응용이 가능하다.
본 발명의 면역 억제제는, 약학적으로 허용 가능한 담체나 첨가물을 더 함유해도 된다. 약학적으로 허용 가능한 담체 및 첨가물은 전술한 것을 들 수 있다.
본 발명의 면역 억제제는, 여러 가지 형태, 예를 들면 액제(예를 들면, 주사제), 분산제, 현탁제, 정제, 환제, 분말제, 좌제 등으로 할 수 있다. 바람직한 형태는 주사제이며, 비경구(예를 들면, 정맥내, 경피, 복강내, 근내)로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 면역 억제제의 투여량은, 예를 들면 0.025∼50 ㎎/㎏, 바람직하게는 0.1∼50 ㎎/㎏이며, 보다 바람직하게는 0.1∼25 ㎎/㎏, 더 바람직하게는 0.1∼10 ㎎/㎏ 또는 0.1∼3 ㎎/㎏로 할 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다.
[피브로넥틴 검출 키트 및 피브로넥틴 검출 방법]
본 발명의 피브로넥틴 또는 그 부분 펩티드를 검출하기 위한 키트는, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 결합하는 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체를 포함하고, 생체 시료 중의 상기 피브로넥틴 또는 그 부분 펩티드를 검출할 수 있다.
생체 시료로는 특별히 제한은 없고, 예를 들면 혈액, 타액, 소변, 퇴척수액, 골수액, 흉수, 복수, 관절액, 누액, 안방수, 유리체액, 림프액 등을 들 수 있다.
본 발명의 키트에 있어서, 피브로넥틴의 부분 펩티드로는, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체가 결합하는 것이면 특별히 제한은 없지만, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 분자량 24 kDa의 부분 펩티드인 것이 바람직하다.
본 발명의 키트에는, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 결합하는 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체 외에, 피브로넥틴의 검출에 필요한 다른 구성 요소, 예를 들면 반응 완충액이나 반응 용기를 포함할 수 있다.
본 발명의 피브로넥틴 또는 그 부분 펩티드를 검출하기 위한 키트를 이용함으로써, 생체 시료 중의 피브로넥틴 또는 그 부분 펩티드를 검출할 수 있다.
생체 시료 중의 피브로넥틴 또는 그 부분 펩티드를 검출하는 방법으로는, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 결합하는 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체를 포함하고, 생체 시료 중의 피브로넥틴 또는 그 부분 펩티드를 검출할 수 있으면 특별히 제한은 없지만, 상기 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체를 이용한 면역학적 방법에 의해 측정하는 것이 바람직하다. 면역학적 방법으로는, 예를 들면 면역 염색(웨스턴 블롯), 효소 결합 면역 흡착 측정법(ELISA), 샌드위치 ELISA, 면역침강법, 면역비탁법(TIA나 LTIA), 효소 면역 측정법(enzyme immunoassay), 화학 발광 면역 측정법, 형광 면역 측정법, 유세포 분석법 등을 이용해, 피브로넥틴 또는 그 부분 펩티드의 분자량과 일치하는 밴드 혹은 스팟, 또는 피크를 검출함으로써 실시할 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
《실시예》
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 마우스 T 세포에서의 LILRB4의 발현
48 웰 플레이트(Thermo 제품, #150687)에 항마우스 CD3 항체(BD Bioscience 제품, Clone: 145-2C11, #553058) 및 항마우스 CD28 항체(BD Bioscience 제품, Clone: 37.51, #553298)를 각각 10 ㎍/㎖ 농도로 함유하는 PBS(-) 완충액을 100㎕ 첨가해 실온에서 30분간 웰을 코팅한 후, 500㎕의 PBS(-) 완충액으로 3회 웰을 세정했다. 10주령의 암컷 gp49B 결손 마우스 또는 야생형 마우스의 비장으로부터 채취한 비장 세포를 용혈 처리 후에, 10% 소태아혈청(BioWest 제품, #S1530), 50μM 2-메르캅토 에탄올(후지 필름 와코우 제품, #139-06861), 1% 페니실린(5000 U/㎖)/스트렙토마이신(5000 ㎍/㎖) 용액(Sigma 제품, #P4458)을 포함하는 RPMI-1640 배지(Sigma 제품, #R8758)에 현탁했다. 한편, gp49B는, 마우스에서의, 인간 LILRB4와 상동인 분자이다.
항체를 코팅한 웰에, 현탁한 비장 세포를 1×106 세포/200㎕/웰의 농도로 파종해, 37℃, 5% 이산화탄소의 조건하에서 0∼3일간 배양했다. 세포를 웰로부터 회수한 후, 2% 소태아혈청과 0.05% 아지드화 나트륨(Sigma 제품, #S8032)을 포함하는 PBS(-) 완충액에 현탁하고, 빙온 조건하에서, FITC 표지 항마우스 CD4 항체(BioLegend 제품, Clone: GK1.5, #100406), Alexa647 표지 항마우스 CD8a 항체(BD Biosciences 제품, Clone: 53-6.7, #557882), PE 표지 항마우스 gp49A/B 항체(BioLegend 제품, Clone: H1.1, #144904), BV421 표지 항마우스 PD-1 항체(BioLegend 제품, Clone: 29F.1A12, #135218), PerCP-Cy5.5 표지 항마우스 Tim-3(BioLegend 제품, Clone: B8.2C12, #134012), 아이소타입 대조 항체로서 PE 표지 아르메니아 햄스터 IgG(BioLegend 제품, Clone: HTK888, #400908), BV421 표지 래트 IgG2a(BioLegend 제품, Clone: RTK2758, #400549), PerCP-Cy5.5 표지 래트 IgG1(BioLegend 제품, Clone: RTK2071, #400426)을 이용해 염색하고, BD FACSAriaIII 셀 소터(BD Biosciences 제품)에 의해 측정해 FlowJo 소프트웨어(BD Biosciences 제품)에 의해 데이터를 해석했다. 그 결과를 도 1∼도 5에 나타낸다.
도 1에, 마우스 나이브 CD8 양성 T 세포에서의 B4, PD-1, Tim-3의 발현을 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 마우스 나이브 CD8 양성 T 세포에서는, PD-1의 발현이 조금 인정되었지만, B4 및 Tim-3의 발현은 인정되지 않았다. 또한, B4를 결손함으로써 PD-1이나 Tim-3 발현에의 영향은 볼 수 없었다.
도 2에, 마우스 CD8 양성 T 세포에서의 항CD3 항체/항CD28 항체 자극 후의 B4, PD-1, Tim-3의 발현을 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 항CD3 항체/항CD28 항체에 의한 활성화 자극에 의해, 마우스 CD8 양성 T 세포상의 PD-1의 발현은 1일째에 거의 극대가 되지만, B4와 Tim-3의 발현은 1일째에 약간 발현이 상승해 2일 이후에 극대가 되어, PD-1의 발현과는 다른 조절을 받고 있다는 것이 시사되었다. B4 결손 CD8 양성 T 세포에서는, 항CD3 항체/항CD28 항체에 의한 활성화 자극에 의해 PD-1 발현에의 영향은 인정되지 않았지만, Tim-3의 발현에 감소가 인정되었다.
도 3에, 마우스 나이브 CD4 양성 T 세포에서의 B4, PD-1, Tim-3의 발현을 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 마우스 나이브 CD4 양성 T 세포에서는, PD-1의 약하면서도 분명한 발현이 인정되었지만, B4 및 Tim-3의 발현은 인정되지 않았다. 또한, B4를 결손함으로써 PD-1이나 Tim-3 발현에의 영향은 볼 수 없었다.
도 4에, 마우스 CD4 양성 T 세포에서의 항CD3 항체/항CD28 항체 자극 후의 B4, PD-1, Tim-3의 발현을 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 항CD3 항체/항CD28 항체에 의한 활성화 자극에 의해, 마우스 CD4 양성 T 세포상의 PD-1의 발현은 1일째에서 거의 극대가 되지만, B4와 Tim-3의 발현은 1일째에 약간 발현이 상승해 2일 이후에 극대가 되어, PD-1의 발현과는 다른 조절을 받고 있다는 것이 시사되었다. B4 결손 CD4 양성 T 세포에서는, 항CD3 항체/항CD28 항체에 의한 활성화 자극에 의해 PD-1 발현에의 영향은 인정되지 않았지만, Tim-3의 발현에 감소가 인정되었다.
도 5에, 마우스 CD8 양성 T 세포 및 CD4 양성 T 세포에서의 항CD3 항체/항CD28 항체 자극 후의 B4 및 PD-1의 발현을 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 마우스 CD8 양성 T 세포 및 CD4 양성 T 세포는, 모두 PD-1의 발현이 먼저 상승한 다음 B4의 발현이 늦게 상승하여, PD-1과 B4의 이중 양성 세포가 되는 것이 인정되었다.
이상의 결과로부터, B4는 마우스 T 세포에 발현하고, PD-1이나 Tim-3과는 다른 면역 체크포인트 분자라는 것이 분명해졌다.
[실시예 2] 인간 T 세포에서의 LILRB4의 발현
48 웰 플레이트(Thermo 제품, #150687)에 항인간 CD3 항체(BD Bioscience 제품, Clone: UCHT1, #555329) 및 항인간 CD28 항체(BD Bioscience 제품, Clone: CD28.2, #555725)를 각각 10 ㎍/㎖ 농도로 함유하는 PBS(-) 완충액을 100㎕ 첨가해 실온에서 30분간 웰을 코팅한 후, 500㎕의 PBS(-) 완충액으로 3회 웰을 세정했다. 동결 인간 말초혈 단핵구(C.T.L. 제품)를 37℃의 온욕으로 급속 해동하고, 10% 소태아혈청, 50μM 2-메르캅토 에탄올, 1% 페니실린(5000 U/㎖)/스트렙토마이신(5000 ㎍/㎖) 용액, 20 U/㎖ DNase I(Sigma 제품, #D5025)을 포함하는 RPMI-1640 배지(Sigma 제품, #R8758)에 현탁해 철야 배양한 후, 세포를 회수해 Naive Pan T cell Isolation Kit, human(Miltenyi 제품, #130-097-095)를 이용해 T 세포를 정제하고, 상기 조성의 DNase I을 포함하지 않는 배지에 현탁했다. 항체를 코팅한 웰에, 현탁한 T 세포를 1×106 세포/200㎕/웰의 농도로 파종해, 37℃, 5% 이산화탄소의 조건하에서 0∼3일간 배양했다. 세포를 웰로부터 회수한 후, 2% 소태아혈청과 0.05% 아지드화 나트륨을 포함하는 PBS(-) 완충액에 현탁하고, 빙온 조건하에서, FITC 표지 항인간 CD4 항체(BioLegend 제품, Clone: RPA-T4, #300506), Alexa647 표지 항인간 CD8a 항체(BioLegend 제품, Clone: RPA-T8, #301022), PE 표지 항인간 CD85k(LILRB4) 항체(eBioscience 제품, Clone: ZM4.1, #12-5139-42), BV421 표지 항인간 PD-1 항체(BioLegend 제품, Clone: EH12.2H7, #329920), PerCP-Cy5.5 표지 항인간 Tim-3(BioLegend 제품, Clone: F38-2E2, #345016), 아이소타입 대조 항체로서 PE 표지 마우스 IgG1, k(eBioscience 제품, Clone: P3.6.2.8.1, #12-4714-42), BV421 표지 마우스 IgG1(BioLegend 제품, Clone: MOPC-21, #400158), PerCP-Cy5.5 표지 마우스 IgG1(BD Biosciences 제품, Clone: MOPC-21, #552834)을 이용해 염색하고, BD FACSAriaIII 셀 소터(BD Biosciences 제품)에 의해 측정해 FlowJo 소프트웨어(BD Biosciences 제품)에 의해 데이터를 해석했다.
도 6에, 인간 CD8 양성 T 세포 및 CD4 양성 T 세포에서의 항CD3 항체/항CD28 항체 자극 후의 B4, PD-1, Tim-3의 발현을 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 인간 CD8 양성 T 세포 및 CD4 양성 T 세포는, 무자극(0일째)에서는 B4, PD-1, Tim-3 모두 발현이 인정되지 않았다. 그러나, 항CD3 항체/항CD28 항체에 의한 활성화 자극에 의해, PD-1 및 Tim-3과 마찬가지로 B4의 발현 상승이 인정되었다.
이상의 결과로부터, B4는 인간 T 세포에 발현하고, PD-1이나 Tim-3과는 다른 면역 체크포인트 분자라는 것이 분명해졌다.
[실시예 3] 피브로넥틴의 LILRB4에의 결합 부위의 해석
인간 피브로넥틴은 2q35에 위치하는 단일 유전자로부터 전사되는 다종의 mRNA 아이소폼(isoform)으로부터 번역되어, 일반적으로는 26 잔기의 시그널 펩티드를 포함해 2240∼2483개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 피브로넥틴은 혈장중에서는 가용성의 2량체로서 존재하고, 세포 표면이나 세포외 매트릭스(ECM)에서는 2량체 혹은 다량체로서 존재하고 있다. 2량체의 피브로넥틴은 2가닥의 거의 동일한 210 kDa∼250 kDa의 폴리펩티드가 C말단 근처에서 2개의 디술피드 결합한 구조로서, 각 폴리펩티드는 다수의 기능적 모듈로 구성되며, 이들 모듈은 피브린, 콜라겐, 인테그린, 헤파린, 신데칸, 및 피브로넥틴을 포함하는 다른 단백질과 결합하는 성질을 갖고 있다.
피브로넥틴 중의 B4 결합 사이트를 특정하기 위해 이들 모듈을 포함하는 개별 도메인을 리포터 세포 assay 및 BLI(Bio-layer interferometry) 해석으로 B4 결합성을 해석했다.
BLI 해석은 BLItz를 이용해 다음과 같이 행하였다. 인간 His 태그를 넣은 인간 LILRB4를 Ni-NTA 센서에 고상화하고, 결합하지 않은 단백질은 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 씻어냈다. 이 센서를 피험 단백질에 담근 후, PBS에 담그어 해리시켰다. 곡선 회귀와 데이터 처리는 BLItz Pro 소프트웨어로 행했다.
리포터 세포 assay는, 세포외 도메인이 인간 LILRB4이고, 막관통 도메인과 세포내 도메인이 활성화형 paired immunoglobulin-like receptor beta인 키메라 리셉터를 이용해, NFAT-GFP 리포터 유전자 및 DAP12를 발현하는 마우스 T 세포 하이브리도마 세포주에 레트로 바이러스 벡터를 이용해 트랜스펙션하여, 얻어진 5×104개의 리포터 세포를 피험 단백질과 배양하고, GFP의 발현을 유세포 분석으로 해석함으로써 행하였다.
그 결과, 인간 피브로넥틴의 N말단의 카텝신 D 소화 단편 70 kDa 폴리펩티드와 그 트립신 소화 단편인 N말단측의 30 kDa 플래그먼트에 결합성이 있고, C말단측의 45 kDa 단편에는 리포터 세포 assay 및 BLI 해석에서 결합성이 없었다. 피브로넥틴의 보다 C말단측의 부분, 즉 아미노산 잔기 607∼1265, 1266∼1908, 1277∼2477은 리포터 세포 assay에서도 BLI 해석에서도 시그널을 유도하지 않았다. 이 결과로부터, 피브로넥틴 중의 B4 결합 사이트는 N말단의 30 kDa 플래그먼트(FN30) 중에 있다는 것이 나타났다.
또한, 펩티드 매핑을 FN30의 20 아미노산 잔기마다 각각 8 잔기씩 오버랩 시켜 간 결과, Cys123∼His142의 아미노산 서열(CysThrCysIleGlyAlaGlyArgGlyArgIleSerCysThrIleAlaAsnArgCysHis)만이 리포터 세포에서 현저한 시그널을 유도했다. 피브로넥틴의 Cys123∼His142의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타낸다. 이 결과로부터, 피브로넥틴은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 통해 B4에 결합하는 것이 분명해졌다.
[실시예 4] 재조합 피브로넥틴 표적 서열-Fc융합 단백질의 조제
인간 피브로넥틴의 N말단 30 kDa(40번 글루타민 잔기∼282번 글리신 잔기에 상당, Sigma 제품, #9911, 이하, FN30이라고도 한다)를 마우스 IgG2a의 Fc와 융합시킨 재조합 단백질(이하, FN30-Fc라고도 한다)을 이하의 순서로 조제했다.
FN30을 코딩하는 DNA 플래그먼트를 인간 간엽계 줄기세포 유래의 mRNA로부터 이하의 프라이머로 증폭했다.
FN30 포워드 프라이머: 5'-ATAGAATTCGCAGTCCCCGGTGGCTGTCAGT-3'(서열 번호 2)
FN30 리버스 프라이머: 5'-TTAAGATCTTCCGCTCGATGTGGTCTGCAC-3'(서열 번호 3)
증폭된 FN30 DNA 플래그먼트를 Eco RI와 Bgl II로 소화해, pFUSE-mIgG2Ae1-Fc2 벡터의 각각의 사이트에 삽입했다. 본 벡터는, Fc 부분에, IgG2a의 Fc가 본래 갖는 항체 의존성 세포 장애 활성(ADCC)과 보체 의존성 세포 장애 활성(CDC)을 저감시키기 위해 L235E, E318A, K320A, K322A의 변이를 도입한 것이다.
얻어진 플라스미드 pFUSE-mIgG2Ae1-Fc2/FN30을 서열 해석해 확인한 후, 단백질 발현에 제공했다. FN30-Fc의 발현을 위해, 본 플라스미드를 리포펙타민(Lipofectamine) 2000을 이용해 CHO-K1 세포에 트랜스펙션하여, 안정 도입 세포 클론을 Zeocin(0.8 mg/㎖)으로 선택한 후, 한외 희석법으로 얻었다. 재조합 FN30-Fc는 세포 배양 상청으로부터 HiTrap Protein G HP 컬럼으로 정제한 후, PBS(-)에 대해 투석했다.
[실시예 5] 항피브로넥틴 항체의 조제
인간 혈장 유래 피브로넥틴을 카텝신 D 처리해 얻어지는 70 kDa 단편을 트립신 처리 후에 헤파린 결합성을 이용해 정제한 피브로넥틴의 N말단측 30 kDa 단편(FN30; Sigma 제품, #9911)을 항원으로 하여 WKY 래트에게 면역하고, 장골 림프절 세포를 50% 폴리에틸렌 글리콜 존재하에서 골수종(myeloma) 세포와 융합시켜 하이브리도마를 얻었다. 인간 FN30, 실시예 4에서 얻어진 FN30-Fc, 마우스 FN(Abcam 제품, #ab92784), FN30의 합성 펩티드 단편을 이용한 ELISA로 선택함으로써, 항피브로넥틴 단일 클론 항체(이하, FN30 단일 클론 항체라고도 한다)를 생산하는 하이브리도마를 9 클론 수득했다. 수립한 9 종류의 항FN30 단일 클론 항체의 클론명, 아이소타입, 마우스 MSC와의 결합성, 인간 MSC와의 결합성을 표 1에 나타낸다. 표에서, (-)는 결합성 없음, (+)는 약결합성, (++)는 강결합성을 각각 나타낸다.
항체 번호 아이소타입(래트 IgG) 마우스 MSC와의 결합성 인간 MSC와의 결합성
1 IgG2b - -
2 IgG2a - -
3 IgG2b - -
4 IgG2a ++ ++
5 IgG2a ++ ++
6 IgG2b ++ ++
7 IgG2c + +
8 IgG2a - -
9 IgG2a - +
[실시예 6] 항피브로넥틴 항체의 블로킹 효과
인간 골수 유래 간엽계 줄기세포(PromoCell 제품, #C-12974)를 간엽계 줄기세포 증식 배지(PromoCell 제품, C-28009)에 현탁해 1×105 세포/300㎕/웰로 48 웰 플레이트에 파종하고, 37℃, 5% 이산화탄소의 조건하에서 배양했다. 배양 24시간 후의 간엽계 줄기세포가 플레이트에 충분히 붙은 상태에서 배지를 흡인해 제거하고, 실시예 5에서 얻어진 항FN30 단일 클론 항체(No. 1∼No. 9) 20 ㎍/㎖를 포함하는 PBS(-) 완충액 300㎕를 첨가해 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 항FN30 단일 클론 항체를 포함하는 PBS(-) 완충액을 흡인해 제거하고, 0.5% 소태아혈청, 50μM 2-메르캅토 에탄올, 1% 페니실린(5000 U/㎖)/스트렙토마이신(5000 ㎍/㎖) 용액을 포함하는 RPMI-1640 배지 500㎕로 2회 웰을 세정하고, 동일한 조성의 RPMI-1640 배지에 현탁한 B4 키메라 수용체 GFP 리포터 세포(B4-2B4 세포) 또는 키메라 수용체를 발현하지 않은 컨트롤 GFP 리포터 세포(2B4 세포)를 1×105 세포/200㎕/well로 파종해, 37℃, 5% 이산화탄소의 조건하에서 18시간 배양했다. 세포를 웰로부터 회수한 후, 2% 소태아혈청과 0.05% 아지드화 나트륨을 포함하는 PBS(-) 완충액에 현탁하고, BD FACSCalibur 유세포 분석기(BD Biosciences 제품)에 의해 측정해, FlowJo 소프트웨어에 의해 데이터를 해석했다. 그 결과를 도 7에 나타낸다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 항FN30 단일 클론 항체 No. 1∼5, 7∼9로 처리한 경우에는, 항체 없음의 양성 대조와 동등한 GFP 발현을 나타내고 있는데 비해, 항FN30 단일 클론 항체 No. 6으로 처리한 경우에는, 리포터 세포만의 음성 대조와 동등한 GFP 발현인 것으로부터, No. 6 항체는 FN30과 B4의 결합을 저해하는 항체라고 할 수 있다.
[실시예 7] 각 항인간 FN30 단일 클론 항체의 교차성(마우스 골수 유래 간엽계 줄기세포(MSC) 및 인간 골수 유래 간엽계 줄기세포의 염색)
효소 처리 등을 하지 않고 샤레로부터 피펫팅에 의해 회수한 마우스 골수 유래 간엽계 줄기세포(Cyagen 제품, #MUBMX-01001) 및 인간 골수 유래 간엽계 줄기세포를 2% 소태아혈청과 0.05% 아지드화 나트륨을 포함하는 PBS(-) 완충액에 현탁하고, 빙온 조건하에서, 실시예 5에서 얻어진 항FN30 단일 클론 항체 또는 PE 표지 래트 IgG1, k(BD Biosciences 제품, Clone: R3-34, #553925)로 처리해, 세정 후에 PE 표지 염소 항래트 IgG 다중 클론 항체(BioLegend 제품, #405406)로 염색하고, BD FACSCalibur 유세포 분석기에 의해 측정하여, FlowJo 소프트웨어에 의해 데이터를 해석했다. 그 결과를 도 8에 나타낸다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 항FN30 단일 클론 항체 No. 4, No. 5, 및 No. 6은 마우스 MSC 및 인간 MSC 모두 강하게 염색하고, No. 7 항체는 마우스 MSC 및 인간 MSC를 약하게 염색했다. No. 9 항체는 인간 MSC만을 약하게 염색했다. No. 1, No. 2, No. 3, 및 No. 8 항체는 모든 MSC를 염색하지 않았다.
[실시예 8] 인간 및 마우스 암세포주에서의 피브로넥틴(FN30) 세포 표면 발현
효소 처리 등을 하지 않고 샤례로부터 피펫팅에 의해 회수한 마우스 암세포주의 B16F10(흑색종), 3LL(루이스 폐암), 인간 암세포주의 Daudi(버킷 림프종), HL60(전골수구성 백혈병), HeLa(자궁경부 유상피종), HepG2(간세포암), Saos-2(골육종)를 2% 소태아혈청과 0.05% 아지드화 나트륨을 포함하는 PBS(-) 완충액에 현탁하고, 빙온 조건하에서 항FN30 단일 클론 항체(No. 5) 또는 PE 표지 래트 IgG2a, k(BD Biosciences 제품, Clone: R35-95, #554689)로 처리해, 세정 후에 Alexa488 표지 염소 항래트 IgG 다중 클론 항체(Invitrogen 제품, #A-11006)로 염색하고, BD FACSCalibur 유세포 분석기에 의해 측정하여, FlowJo 소프트웨어에 의해 데이터를 해석했다. 그 결과를 도 9에 나타낸다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 마우스 암세포주에서의 피브로넥틴(FN30)의 세포 표면에서의 발현은 B16F10에서 약하고, 3LL에서 강한 것이 인정되었다. 인간 암세포주에 있어서는, Daudi, HL60, HeLa에서 세포 표면 발현이 없고, HepG2 및 Saos-2에서 강한 세포 표면에서의 발현이 인정되었다.
[실시예 9] 종양내 침윤 림프구의 B4 및 PD-1의 발현
야생형 마우스의 왼발 대퇴부에, 5×105 세포/100㎕/마리의 B16F10 세포 또는 3LL 세포를 피하 접종한 후, 직경이 1.5㎝ 정도로 성장한 단계에서 마우스를 탄산 가스 과잉 흡인에 의해 안락사시키고, 종양을 취출해 Tumor Dissociation Kit, mouse(Miltenyi 제품, #130-096-730)와 gentleMACS Dissociator(Miltenyi 제품, #130-093-235)를 이용해 단세포 현탁액을 조제해, Percoll(GE Healthcare 제품, #17089102)에 의한 비중 분리에 의해 림프구를 회수했다. 회수한 세포는, 2% 소태아혈청과 0.05% 아지드화 나트륨을 포함하는 PBS(-) 완충액에 현탁하고, 빙온 조건하에서, FITC 표지 항마우스 CD4 항체, Alexa647 표지 항마우스 CD8a 항체, PE 표지 항마우스 gp49A/B 항체, BV421 표지 항마우스 PD-1 항체, 아이소타입 대조 항체로서 PE 표지 아르메니아 햄스터 IgG, BV421 표지 래트 IgG2a를 이용해 염색하고, BD FACSAriaIII 셀 소터에 의해 측정하여, FlowJo 소프트웨어에 의해 데이터를 해석했다. 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타낸다.
도 10에, 종양내 침윤 림프구(마우스 CD8 양성 T 세포)의 B4 및 PD-1의 발현을 나타내었다. 도 10에 나타낸 바와 같이, B16F10의 종양내에 침윤하고 있는 CD8 양성 T 세포의 일부에 B4 및 PD-1의 발현이 인정되고, 그 중 대부분이 B4와 PD-1 이중 양성 세포이며, B4 단독 양성 세포도 인정되었다. 3LL의 종양내에 침윤하고 있는 CD8 양성 T 세포는 대부분이 B4 양성이며, 그 중 80% 이상이 PD-1도 양성이었다.
도 11에 종양내 침윤 림프구(마우스 CD4 양성 T 세포)의 B4 및 PD-1의 발현을 나타내었다. 도 11에 나타낸 바와 같이, B16F10의 종양내에 침윤하고 있는 CD4 양성 T 세포의 일부에 B4 및 PD-1의 발현이 인정되고, B4와 PD-1 이중 양성 세포와 B4 단독 양성 세포도 인정되었다. 3LL의 종양내에 침윤하고 있는 CD4 양성 T 세포는 대부분이 B4와 PD-1 이중 양성 세포였다.
[실시예 10] 혈장 샘플의 항피브로넥틴 다중 클론 항체, 항피브로넥틴 단일 클론 항체에 의한 단백 검출(웨스턴 블롯법)
혈장 샘플로서 정상 남성(연령: 25∼31세)의 혈액을 이용해 혈액 10.5 ㎖/인을 베노젝트 II 진공 채혈관(등록상표)에 채취하고, 유니버설 냉각 원심기(KUBOTA S911)로 2500 rpm×3분간 원심분리해 혈장을 분리·회수했다.
혈장 샘플을 초순수로 15배 희석하고, 환원제(1M β-ME) 및 계면활성제(4% SDS)를 첨가해 95℃×5분간 가열 후의 환원 조건하에서, 7.5% 아크릴아미드겔로 영동했다. 영동 후, 분리한 단백을 폴리불화 비닐리덴(PVDF)막에 전사했다. 얻어진 블롯은 일차 항체로서 항FN 다중 클론 항체, 및 실시예 5에서 얻어진 항FN30 단일 클론 항체 No. 4 및 No. 5, 2차 항체로서 각각 항rabbit IgG-HRP 항체(cell signaling 제품, #7074), 항rat IgG-HRP 항체(Biolegend 제품, Clone: Poly4054, #405405)를 첨가한 후, 기질로 ThermoFisher 제품 Pierce ECL Western Blotting Substrate를 이용해 염색을 실시했다. 화상 해석에는 GE 헬스케어 제품 ImageQuant LAS 4000 mini를 이용했다. 결과를 도 12에 나타낸다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 항FN30 단일 클론 항체 No. 4, No. 5에서 250 kDa의 밴드를 확인했다. 항FN 다중 클론 항체 및 항FN30 단일 클론 항체 전부에서 분자량 약 24 kDa의 밴드가 보여져, 정상 인간 혈장중의 24 kDa의 FN 단편의 존재를 확인했다.
[실시예 11] 항피브로넥틴 항체를 이용한 정상 인간 혈장중 피브로넥틴 전장 분자, 및 피브로넥틴 24 kDa 단편의 정량(ELISA법)
실시예 5에서 얻어진 항FN30 단일 클론 항체 No. 6 및 Collagen binding-FN을 항원으로 하는 항FN 44 kDa 항체(Origene 제품, Clone: OTI3F9, 이하, 항FN44 항체라고도 한다) 및 다중 클론 항체인 Anti-Fibronectin antibody produced in rabbit(Sigma-Aldrich 제품, #F3648, 이하, 항FN 다중 클론 항체라고도 한다)을 사용해, 96 웰 플레이트(Greiner Bio-one 제품, MICROLON(등록상표))에 각 단일 클론 항체를 최종 농도 4 ㎍/㎖가 되도록 탄산 버퍼(NaHCO3 0.01M)에서 희석해, 4℃, 12시간 가만히 두어 플레이트를 코팅했다. 1% BSA 함유 PBS에서 블로킹 후, 스탠다드 FN 단백(R＆D 제품, Fibronectin ELISA DuoSet) 및 정상 인간 혈장을 첨가했다.
단일 클론 항체에 결합한 피브로넥틴량은 항FN 다중 클론 항체(13500배 희석) 및 항rabbit IgG-HRP 항체(250배 희석)를 이용해 검출했다. 각 조작간의 플레이트 세정에는 TBS 0.1% Tween20을 사용했다. 기질을 첨가한 다음, 마이크로 플레이트 리더(BioRad 제품, Model 680)로 파장 450㎚의 흡광도를 측정해 수치화했다.
스탠다드 단백의 흡광도를 기준으로 4 파라미터 로지스틱 회귀로 비선형 근사를 실시하여, 샘플의 흡광도값으로부터 농도를 산출했다. 그 결과를 도 13에 나타낸다. 항FN30 단일 클론 항체에서 검출되는 피브로넥틴 농도[A(㎍/㎖)]와 항FN44 항체에서 검출되는 피브로넥틴 농도[B(㎍/㎖)]는 도 13에 나타낸 농도라고 생각된다.
피브로넥틴 전장 분자를 x(㎍/㎖), 24 kDa 결손 피브로넥틴을 y(㎍/㎖), 24 kDa 피브로넥틴을 z(㎍/㎖)라고 하면, 24 kDa 결손 피브로넥틴과 24 kDa 피브로넥틴이 모두 분해 산물인 점, 2차 항체가 결합하는 다중 클론 항체는 분자량에 대략 비례하는 점을 고려하면, 하기 수식의 관계가 된다.
Figure pct00001
이 식으로부터, x, y 및 z는 하기의 식으로 산출된다.
Figure pct00002
결과를, 제1, 제2, 제34 분위점 및 최대치, 최소치를 나타낸 박스 플롯 표시로서 나타냈다(도 14). 이 결과, 피브로넥틴 전장 분자 농도는 279±131 ㎍/㎖이며, 공지의 FN 농도(300 ㎍/㎖)에 합치했다. 항FN30 단일 클론 항체 No. 6 및 항FN44 항체를 이용하고 각 농도의 차분을 이용해, 혈장중의 FN 24 kDa 농도는 6.49±7.44 ㎍/㎖로 산출되었다.
[실시예 12] FN30의 자가 항체 질환에 대한 치료 효과
FN30의 저해가 gp49B와 피브로넥틴의 결합을 저해해 병원성의 플라즈마 셀에 의한 자가 항체 생성에 대해 치료적인 효과를 나타내는지 여부를 이하와 같이 하여 검증했다.
BXSB/Yaa 마우스에 컨트롤 IgG 또는 실시예 4에서 얻어진 FN30-Fc를 복강내 투여하는 것을 2주 간격으로 2회 반복했다. 그 결과를 도 15에 나타낸다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 컨트롤 IgG가 투여된 마우스의 군은 항dsDNA IgG 혈청 항체가가 서서히 상승했지만, FN30-Fc 투여군에서는 관찰 기간중 IgG 자가 항체 레벨이 비교적 일정하게 유지되었다.
이 억제 효과는 BXSB/Yaa 마우스에, FN30-Fc 투여와 같은 스케줄로 항gp49B 단일 클론 항체 H1.1을 복강내에 투여하는 것에서도 마찬가지로 관찰되었다(도 16). 자가 항체가의 상승 억제는 비장 중량, 총비장 세포수, 총골수 세포수, 비장과 골수중의 플라즈마 셀의 비율, 비장중의 dsDNA 자가 항체 생성 세포의 빈도 등에 특별한 영향을 주지 않았다.
이들 결과는 FN30-Fc 혹은 항gp49B 단일 클론 항체 H1.1을 BXSB/Yaa 마우스에 투여함으로써, 항체 생성 세포를 특별히 소거시키지 않고, 항dsDNA IgG가 더 상승하는 것을 억제했다고 시사한다. 이들 결과로부터, FN-30 및 항B4 항체는, B4와 FN의 결합을 블로킹함으로써, 자가 면역 질환을 완화시키는 효과가 있다고 생각된다.
[실시예 13] 암 전이에서의 LILRB4의 관여
LILRB4(마우스에서는 gp49B)가 종양의 전이에 관여하는지 여부를 평가하기 위해, 야생형(WT) B6 마우스 및 gp49B 결손 마우스에 루이스 폐암종 세포(LLC) 또는 마우스 흑색종 세포 B16F10을 꼬리 정맥으로부터 주입하고, 각각 30일, 20일 경과 후에 폐와 간을 적출하여, H＆E 염색 또는 표면의 종양 결절수를 카운트해 평가했다. LLC 주입의 결과를 도 17a∼도 17d에, B16F10 주입의 결과를 도 18a, 도 18b 및 도 19에 나타낸다.
도 17a 및 도 17b에 나타낸 바와 같이, LLC의 폐로의 전이는 WT에 비해, gp49B 결손 마우스에서 저하되었다. 또한, 도 17c 및 도 17d에 나타낸 바와 같이, 종양이 전이된 부위는 LLC가 주입된 WT 마우스의 간에서만 보여지고, gp49B 결손 마우스의 간에서는 관찰되지 않았다.
B16F10에 대해서는, 도 18a 및 도 18b에 나타낸 바와 같이, gp49B 결손 마우스에서는 폐의 총표면의 종양 결절수가 우월하게 저하(도 18a)되었고, 간으로의 전이도 저하되었다(도 18b).
다음으로, C57BL/6 NJcl 마우스를 8.5 Gy로 전신 방사선 조사를 행하고, 1일 후에 야생형 및 gp49B 결손 마우스 유래의 골수 세포를 꼬리 정맥으로부터 5×106 세포/마리로 주사해 이식했다. 입양 세포 이식 후, 마우스를 1개월간 젠타마이신(gentamycin)으로 처치하고, 이식 후 4주간의 시점에 총혈액상을 유세포 분석기에서 도너 세포의 치환 상태를 확인했다. 그 결과를 도 19에 나타낸다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 폐와 간으로의 전이는 gp49B 결손의 골수 세포를 입양 세포 이식한 마우스에서 야생형 마우스의 골수 세포를 입양 세포 이식한 컨트롤 마우스보다 저하되고 있었다. 이들 결과로부터, gp49B는 종양 세포의 전이에 관여하는 것이 나타났다.
[실시예 14] LILRB4 저해에 의하지만 전이 억제 효과
실시예 12에 나타낸 바와 같이, gp49B를 결손하면 종양의 전이가 감소하는 것으로부터, 항gp49B 단일 클론 항체 H1.1을 사용해 gp49B를 저해함으로써 종양의 전이가 어떻게 영향을 받는지를 다음과 같이 하여 조사했다.
B16F10이 주입된 B6 마우스에, 대조 아이소타입 IgG 항체, 항PD-1 단일 클론 항체, 항gp49B 단일 클론 항체, 혹은 항PD-1 단일 클론 항체와 항gp49B 단일 클론 항체의 조합으로 6회 복강내 주사하고, 항체 투여 후, 폐의 종양 결절수, 간의 전이병소수를 평가했다. 그 결과를 도 20a∼도 20d에 나타낸다.
도 20a∼도 20d에 나타낸 바와 같이, 항gp49B 단일 클론 항체 처리군은, 항PD-1 단일 클론 항체 처리군, 혹은 항gp49B 단일 클론 항체와 항PD-1 단일 클론 항체의 조합으로 처리한 군과 마찬가지로, 폐, 간 모두 B16F10 종양의 전이병소수가 저하되었다. 또한, B6 마우스에 루시페라아제(luciferase) 발현하는 LLC(LLC-Luc2)를 주사하여, 대조 아이소타입 IgG 항체, 항PD-1 단일 클론 항체, 항gp49B 단일 클론 항체, 혹은 항PD-1 단일 클론 항체와 항gp49B 단일 클론 항체 조합의 효과를 조사한 결과, 항gp49B 단일 클론 항체 처리군, 및 항PD-1 단일 클론 항체와 항gp49B 단일 클론 항체의 조합 처리군에 있어서, 폐, 간 모두 LLC-Luc2 종양의 전이병소수가 감소되어 있었다(도 20e∼도 20g).
또한, LLC-Luc2 종양을 갖는 마우스에서 항PD-1 단일 클론 항체와 항gp49B 단일 클론 항체를 병용한 결과, 통계적으로 유의미하게 전이병소수를 감소시켰다(도 20g). gp49B 저해는 PD-1과 gp49B의 동시 저해와 마찬가지로, 병리 절편의 해석에서도 폐와 간의 LLC-Luc2의 전이를 억제하고 있었다(도 21). 이들 결과로부터, LILRB4를 저해함으로써 암의 전이가 억제되는 것이 분명해졌다.
[실시예 15] LILRB4 저해에 의한 파골세포 분화 촉진 효과의 검증 1
야생형 B6 마우스로부터 골수 세포를 채취하고, 10% FCS 및 10 ㎍/㎖의, 대조 아이소타입 IgG 항체, 항gp49B 단일 클론 항체 H1.1, 항gp49B 단일 클론 항체 H1.1의 F(ab')2 플래그먼트 또는 항FN30 단일 클론 항체 No. 6을 포함하는 α-MEM 배지를 이용해, 48 웰 플레이트에서 5.0×105 cells/well로 배양했다. 배양 2시간 후에 M-CSF를 20 ng/well 첨가해 48시간 더 배양했다. 이 시점으로부터, 파골세포로의 분화 유도를 위해 20 ng/㎖ M-CSF 및 100 ng/㎖ RANKL을 포함하는 10% FCS 첨가α-MEM을 더 첨가하고, 6일 후에 TRAP 염색을 행했다. 그 결과를, 도 22에 나타낸다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 파골세포로의 분화 유도는, 항gp49B 단일 클론 항체 H1.1 또는 항gp49B 단일 클론 항체 H1.1의 F(ab')2 플래그먼트의 첨가로, 각각 분화 유도율(%)(파골세포수/전체 세포수×100)이 3.5%, 3.4%가 되어, 대조 아이소타입 IgG 항체의 경우(2.7%)와 비교해 약간 상승하는 경향이 보여졌다. 또한, 항FN-30 단일 클론 항체 No. 6의 첨가로 분화 유도율이 7.9%가 되어, 현저한 상승이 보여졌다.
[실시예 16] LILRB4 저해에 의한 파골세포 분화 촉진 효과의 검증 2
정상인으로부터 채취한 혈액 샘플로부터 조제한 말초혈 단핵세포(PBMC)로부터 마그네틱 셀 소터 MACS(Miltenyi Biotec 제품)를 이용해 CD11b 양성의 단구를 얻었다. 이를 100 ng/㎖ RANKL, 25 ng/㎖ M-CSF를 포함하는 10% FCS 첨가α-MED 배지중에서 항LILRB4 단일 클론 항체 ZM4.1(Thermo Fisher Scientific 제품) 1.0 ㎍/㎖ 또는 대조 아이소타입 항체로서 마우스 IgG1κ(Biolegend 제품) 1.0 ㎍/㎖를 첨가해 7일간 배양하고, TRAP 염색했다. 그 결과를 도 23에 나타낸다.
도 23에 나타낸 바와 같이, PBMC로부터의 파골세포로의 분화 유도율은, 13.7%가 되어, 대조 아이소타입 항체의 경우(7.6%)와 비교해, 항LILRB4 항체의 첨가로 파골세포로의 분화 유도는 약 2배 항진했다.
[실시예 17] LILRB4 저해에 의한 파골세포 분화 촉진 효과의 검증 3
야생형 B6 마우스 및 gp49B 결손 마우스로부터 골수 세포를 채취하고, 10% FCS, 20 ng/㎖ M-CSF, 1.0×106 cells/㎖의 α-MEM 배지를 이용해 24 웰 플레이트에서 2일간 배양했다. 그 후, 파골세포로의 분화 유도를 위해, M-CSF를 20 ng/well 및 100 ng/㎖ RANKL를 포함하는 10% FCS 첨가α-MEM을 첨가하고, 5일 후에 TRAP 염색을 행했다. 그 결과를 도 24에 나타낸다.
도 24에 나타낸 바와 같이, 파골세포로의 분화 유도율은, 야생형 마우스 유래의 골수 세포와 비교해, gp49B 결손 마우스 유래의 골수 세포에서 대략 3배 상승했다.
[실시예 18] LILRB4 저해에 의한 파골세포 분화 촉진 효과의 검증 4
18주령의 야생형 B6 마우스(암컷) 및 18주령의 gp49B 결손 마우스(암컷)로부터 대퇴골을 단리하고, 가와모토법(「비탈회 경조직 동결 절편 표본 작성 기술(가와모토법 2008)과 그 응용」, 가와모토 다다후미, 「병리기술 72권 2호 p. 76-83, 2009년」)으로 포매(embedding)한 후 동결 절편을 작성해, TRAP 염색하여 파골세포를 검출했다. 그 결과를 도 25에 나타낸다.
도 25에 나타낸 바와 같이, 파골세포는, 야생형 B6 마우스와 비교해, gp49B 결손 마우스가 다수 검출되었다.
《산업상의 이용 가능성》
본 발명에 의하면, 면역 체크포인트 저해제, 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제, 면역 억제제, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 피브로넥틴 아날로그, 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하기 위한 키트, 및 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Tohoku university <120> Immune checkpoint inhibitor, therapeutic agent for immune checkpoint-related disease, immunosuppressant, anti-fibronectin antibody or derivative thereof, fibronectin analog, kit for detecting fibronectin or partial protein thereof and method for detecting fibronectin or partial protein thereof <130> PC-30385 <140> JP 2019-148423 <141> 2019-08-13 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Cys Thr Cys Ile Gly Ala Gly Arg Gly Arg Ile Ser Cys Thr Ile Ala 1 5 10 15 Asn Arg Cys His 20 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FN30 forward primer <400> 2 atagaattcg cagtccccgg tggctgtcag t 31 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FN30 reverse primer <400> 3 ttaagatctt ccgctcgatg tggtctgcac 30

Claims (23)

  1. 피브로넥틴과 면역 억제성 수용체 LILRB4의 결합을 저해하는 물질을 유효 성분으로 함유하는 면역 체크포인트 저해제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 피브로넥틴이, 상기 피브로넥틴 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 통해 면역 억제성 수용체 LILRB4와 결합하는, 면역 체크포인트 저해제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 피브로넥틴과 면역 억제성 수용체 LILRB4의 결합을 저해하는 물질이, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 항면역 억제성 수용체 LILRB4 항체 또는 그 유도체, 혹은 피브로넥틴 아날로그인, 면역 체크포인트 저해제.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체가, 피브로넥틴 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 결합하는, 면역 체크포인트 저해제.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 피브로넥틴 아날로그가, 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나의 펩티드인, 면역 체크포인트 저해제.
    (a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
    (b) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개∼수 개의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드,
    (c) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드.
  6. 피브로넥틴과 면역 억제성 수용체 LILRB4의 결합을 저해하는 물질을 유효 성분으로 함유하는 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 피브로넥틴이, 상기 피브로넥틴 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 통해 면역 억제성 수용체 LILRB4와 결합하는, 치료제.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 피브로넥틴과 면역 억제성 수용체 LILRB4의 결합을 저해하는 물질이, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 항면역 억제성 수용체 LILRB4 항체 또는 그 유도체, 혹은 피브로넥틴 아날로그인, 치료제.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체가, 피브로넥틴 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 결합하는, 치료제.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 피브로넥틴 아날로그가, 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나의 펩티드인, 치료제.
    (a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
    (b) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개∼수 개의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드,
    (c) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 관련 질환이, 자가 면역 질환, 암, 염증성 질환, 및 알레르기성 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 치료제.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 암이, 암 전이에 의한 것인, 치료제.
  13. 면역 억제성 수용체 LILRB4를 활성화하는 물질을 유효 성분으로 함유하는 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 면역 억제성 수용체 LILRB4를 활성화하는 물질이, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 항면역 억제성 수용체 LILRB4 항체 또는 그 유도체, 혹은 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 아날로그인, 치료제.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 피브로넥틴 아날로그가, 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나의 펩티드인, 치료제.
    (a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
    (b) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개∼수 개의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드,
    (c) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 관련 질환이, 골질환인, 치료제.
  17. 면역 억제성 수용체 LILRB4를 활성화하는 물질을 유효 성분으로 함유하는 면역 억제제.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 면역 억제성 수용체 LILRB4를 활성화하는 물질이, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 항면역 억제성 수용체 LILRB4 항체 또는 그 유도체, 혹은 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 아날로그인, 면역 억제제.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 피브로넥틴 아날로그가, 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나의 펩티드인, 면역 억제제.
    (a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
    (b) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개∼수 개의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드,
    (c) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드.
  20. 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 결합하는 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체.
  21. 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나의 펩티드와 면역 글로불린 G의 Fc 영역이 융합한 피브로넥틴 아날로그.
    (a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
    (b) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개∼수 개의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드,
    (c) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 면역 억제성 수용체 LILRB4의 피브로넥틴 결합 부위에 대해 결합능을 갖는 펩티드.
  22. 제20항에 기재된 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체를 포함하고, 생체 시료 중에 포함되는 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하기 위한 키트.
  23. 제22항에 기재된 키트를 이용하는, 생체 시료 중의 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하는 방법.
KR1020227007906A 2019-08-13 2020-08-06 면역 체크포인트 저해제, 면역 체크포인트 관련 질환의 치료제, 면역 억제제, 항피브로넥틴 항체 또는 그 유도체, 피브로넥틴 아날로그, 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하기 위한 키트, 및 피브로넥틴 또는 그 부분 단백질을 검출하는 방법 KR20220056186A (ko)

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