KR20160117808A

KR20160117808A - 영장류 cd154에 특이적인 항체 및 이를 생산하는 융합 세포주

Info

Publication number: KR20160117808A
Application number: KR1020150045373A
Authority: KR
Inventors: 박정규; 김정식; 전태훈
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2015-03-31
Publication date: 2016-10-11
Also published as: KR101752280B1

Abstract

본 발명은 원숭이 CD154 항원에 특이적으로 결합하는 항-원숭이 CD154 항체, 상기 항체를 생산하는 융합 세포주에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항-원숭이 CD154 항체를 이용하여 영장류, 특히 인간 및 원숭이의 CD154 발현 세포를 탐지할 수 있으며, CD40-CD40L(CD40 ligand, CD154) 신호전달을 차단함으로써 관련 질병의 치료 및 면역 억제제로 활용될 수 있다.

Description

영장류 CD154에 특이적인 항체 및 이를 생산하는 융합 세포주 {Antibody to specific primates CD154 and hybridoma cell producing the same}

본 발명은 영장류 CD154 항원에 특이적으로 결합하는 항-영장류 CD154 항체, 상기 항체를 생산하는 융합 세포주, 상기 항체를 포함하는 CD40-CD40L(CD40 ligand, CD154) 신호전달 차단용 조성물, 면역 억제용 조성물, 영장류 CD154 발현 세포 탐지용 또는 영장류 가용성 CD154 검출용 조성물에 관한 것이다.

원숭이류(Non-human primates)는 유인원(Apes)과 원숭이(Monkey)로 크게 나누어 구분된다. 원숭이 중 실험용 동물로서 이용되고 있는 것은 약 30종 정도이며, 세계적으로 널리 이용되고 있는 원숭이는 레서스(Rhesus) 원숭이, 사이노몰거스(Cynomolgus) 원숭이 등의 마카카 속(Macaca genus) 원숭이와 바분(Baboon) 원숭이 및 코먼 마모셋(Common marmoset) 등이 있다. 수많은 연구들에서 주로 레서스 원숭이를 이용한 결과가 보고되었으며, 최근에는 원숭이를 이용한 AIDS, 뇌질환 등의 질환 연구와 이종 간 장기이식 등의 인공장기 개발 연구 등이 활발히 진행되고 있다(생명공학 정책 연구센터, Biozine, 2004-06-17).

이와 같이 원숭이를 이용한 연구가 성공적으로 진행되기 위해서는, 원숭이 면역체계의 이해와 분석방법의 확립이 무엇보다도 중요하며 각 면역세포의 변화 및 기능 분석을 위해 필수적인 항체의 생산이 선행되어야 한다.

한편, CD154(CD40 리간드, 또는 CD40L)는 활성화된 T세포에 일차적으로 발현되는 단백질로 TNF 분자 중 하나이다. 이것은 항원전달세포 (APC)위의 CD40에 결합하여 표적 세포의 종류에 의존해 여러 가지 효과를 유도한다. 일반적으로, CD154는 공동 자극성 분자로서 역할하고 APC위의 MHC 분자들에 의한 T 세포 수용체 자극과 함께 APC의 활성화를 유도한다. 완전한 CD154는 CD40, α5β1 인테그린, 그리고 αIIbβ13의 3개 분자와 결합할 수 있다. CD154는 일차적으로 활성화된 CD4+ T 림프구에서 발현되나, 가용성(sCD40L)으로도 발견된다. 이는 B세포 표면의 CD40과 결합함으로써 B 세포의 기능을 조절한다. 상기 유전자의 결함은 면역글로불린 종류의 전환을 일으키는 과정에서 활성을 나타내지 못하고, 하이퍼 아이지엠 신드롬(hyper IgM syndrome)을 나타낸다.

생체 내에서 CD40-CD40L 신호전달에 의한 면역세포의 활성화와 이에 따른 질환 유발과 관련하여 많은 연구가 진행되었다. B 세포는 CD40-CD40L 신호전달에 의해 NF-Kb를 활성화 시키고 각종 proinflammatory, proatherogenic 유전자를 활성화 시켜 질환을 유도한다. 혈소판 또한 이 신호 전달에 의해 활성화되기도 하며, 이때 다량의 sCD40L가 방출된다. CD40-CD40L 신호는 장기이식 시 면역세포의 활성화에 의한 이식된 장기의 손상에 관여하며, 류마티스와 같은 자가면역질환의 유도에도 관계가 깊다. 따라서 CD40-CD40L 신호전달을 차단할 수 있는 치료제의 개발이 요구된다.

상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 본 발명자는 영장류 CD154 항원에 특이적으로 결합하는 항-영장류 CD154 항체를 생성하는 융합세포주를 제조하고, 상기 융합세포주로부터 생성된 항체가 특히 인간 및 원숭이의 CD154 발현 세포를 탐지할 수 있으며, CD40-CD40L(CD40 ligand, CD154) 신호전달을 차단함으로써 관련 질병의 치료 및 면역 억제제로 활용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 항-영장류 CD154 항체 및 이를 생산하는 융합 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 항체를 포함하는 CD40-CD40L 신호전달 차단용 조성물 및 면역억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 항체를 포함하는 영장류 CD154 발현 세포 탐지용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 항체를 포함하는 영장류 가용성 CD154 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-영장류 CD154 항체를 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 항체를 생산하는 융합 세포주를 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 항체를 포함하는 CD40-CD40L 신호전달 차단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 항체를 포함하는 면역억제용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 항체를 포함하는 영장류 CD154 발현 세포 탐지용 조성물 및 키트를 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 항체를 포함하는 영장류 가용성 CD154 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 항-영장류 CD154 항체는 영장류, 특히 인간 및 원숭이의 CD154 발현 세포를 탐지하고, 가용성 CD154를 검출할 수 있으며, CD40-CD40L(CD40 ligand, CD154) 신호전달을 차단함으로써 관련 질병의 치료 및 면역 억제제로 활용될 수 있다.

도 1은 CD154(CD40L) 특이적인 항체를 생성하는 융합세포주를 선별하기 위해서 ELISA 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항체를 정제한 후, 농도별 ELISA 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 CD40-발현 RAMOS B 세포를 CD40L 발현-CHO 세포와 혼합 배양 시 ICAM-1의 발현 정도를 분석한 결과로 CD40-CD40L 결합을 정량화하는 방법을 나타낸 도이다.
도 4는 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항체가 CD40-CD40L 신호전달을 억제하는 결과를 나타낸 도이다. RM9C3 항체 처리시 CD40-CD40L 결합시 발생하는 ICAM-1의 발현 정도를 정량한 결과이다.
도 5는 ICAM-1 발현 정도를 정량화하여 ED50/ED100을 계산한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항체 처리 시 활성화된 모노사이트 세포의 뭉친 정도를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항체 처리 농도에 따라 활성화된 모노사이트 세포의 뭉친 정도에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 8은 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항체의 서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항체의 영장류 CD154(CD40L) 발현 세포 탐지 활성을 나타낸 도이다.
도 10은 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항체의 sCD40 검출 활성을 나타낸 도이다.
도 11은 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항체의 sCD40L 검출 민감도 및 검출한도를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-영장류 CD154 항체를 제공한다.

본 발명에서 용어, "항체"는 영장류 CD154 항원에 특이적으로 결합하는 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 그의 항원 결합 단편을 포함한다.

본 발명에서 용어, “완전한 항체”란 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 디설파이드 결합으로 연결되어 있다.

본 발명에서 용어, “항체 분자의 항원 결합 단편”이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F (ab'), F (ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. 상기 F (ab')는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. 상기 F (ab')2는 F (ab')의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. 상기 Fv는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위만을 가지고 있는 최소의 항체 조각을 말한다. 이러한 항체 단편은 당업계에 공지된 방법에 따라 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있다. 예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F (ab')2 단편을 얻을 수 있다. 또한 상기 항체 단편은 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 용어, "가변 영역"이란 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상 많은 변이를 보이는 항체 분자의 부분을 의미한다. 상기 가변 영역에는 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)인 CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다. 상기 CDR 사이에는 프레임 워크 영역(framework region, FR) 부분이 존재하여 CDR 고리를 지지해주는 역할을 한다.

본 발명에서 용어, "상보성 결정 영역"은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정된다.

본 발명에서 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 발명에서 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 발명의 항체는 당업계에 알려진 기술을 참고하여 융합 세포주(하이브리도마) 방법에 의하여 제조되었다 (예, Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조).

본 발명에서 용어, "융합 세포주(하이브리도마)"는 항체를 생산하는 B 림프구와 골수종 암세포(미엘로마 세포)를 융합하여 얻은 세포를 의미하는데, 미엘로마 세포는 형질전환된 세포로, 배양접시에서 오랜 기간 배양할 수 있는 장점이 있어, 한 가지 항체만을 만들어 내는 미엘로마 융합 세포를 분리해 내면 손쉽게 단일클론항체를 대량으로 획득할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 레서스 원숭이(Rhesus monkey) 유래 CD154를 항원으로 이용하여 이에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 융합 세포주(하이브리도마)를 선별하였으며, 이를 RM9C3으로 명명하였다. 상기 융합 세포주(하이브리도마)에 의해 생산되는 항체를 동정하고(수탁번호 KCLRF-BP-00335), 이의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열을 분석한 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 확인하였다. 상기 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열에는 CDR1, CDR2 및 CDR3 지역이 포함되어 있다.

상기 융합 세포주가 생산하는 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 융합 세포주를 이용하여 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리할 수 있다.

이에 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-영장류 CD154 항체를 생산하는 융합세포주를 제공한다.

본 발명자는 상기의 특징을 가지는 항체를 분비하는 융합 세포주를 동정한 후, 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라, 2015년 01월 27일자로 한국세포주연구재단에 수탁번호 KCLRF-BP-00335로서 기탁하였다.

본 발명에서 융합 세포주(하이브리도마)의 스크리닝은 당업계에 공지된 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 면역원으로서 이용한 원숭이 CD154 항원을 고체 지지체에 결합시키고, 하이브리도마 배양 상청액에 대하여 ELISA 등의 주지의 면역 측정을 수행하여 본 발명의 항체를 생산하는 융합 세포주를 스크리닝할 수 있다.

또한 본 발명은, 상기 항체를 포함하는 면역 억제용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.

본 발명에 따른 항체는 CD40L(CD40 ligand, CD154)에 결합하여 반대 수용체인 CD40과의 결합을 억제 또는 방해함으로써 CD40-CD40L 신호전달을 차단하는 효과를 가지고 있다.

상기 CD40-CD40L 신호전달은 장기이식 시 면역세포의 활성화에 의한 이식된 장기의 손상 및 자가면역질환의 유도 등에 관여하는바, 본 발명에 따른 항체는 CD40-CD40L 신호전달에 의해 매개되거나 이와 관련된 질환의 예방 또는 치료, 및 장기이식 거부반응의 면역 억제용 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "자가면역질환"은 자기관용의 유도 또는 계속적 유지에 문제가 발생하여, 자기항원에 대한 면역반응이 일어나고, 이로 인해 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 의미한다.

상기 자가면역질환에는 알로페시아 그레아타(alopecia greata), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디슨 질환, 부신의 자가면역질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루우-피부염(celiac spruedermatitis), 만성 피로 면역이상 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증, Churg-Strauss 증후군, 반흔성 유천포창, CREST 증후군, 한냉 응집소 질환, 크론씨병, 원판성 낭창, 복태성복합한냉글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스 질환, 귈레인 바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, IgA 신경염, 연소자성 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼합성 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 타입 I 또는 면역-매개 당뇨병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결정성 다발동맥염, 다발연골염, 자가면역성 다선 증후군, 류마티스 다발성근통, 다발성 근염과 피부근염, 일차성 무감마글로불린혈증, 일차성 담증성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증, 강직인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 다가야스 동맥염, 일시적 동맥염, 거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물을 약학적 조성물로 이용할 경우, 유효성분 외에 약학적으로 허용되는 담체 등이 포함될 수 있다. 상기 담체에는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구로 투여된다. 비경구로 투여되는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 수용자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

또한 본 발명은, 상기 항체를 포함하는 영장류 CD154 발현 세포 탐지용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 영장류 CD154 발현 세포 탐지용 키트 및 상기 조성물을 이용한 영장류 CD154 발현 세포 탐지 방법을 제공한다.

본 발명에서 “영장류”는 바람직하게는 고등 영장류이며, 더욱 바람직하게는 인간 또는 원숭이이다.

본 발명에 따른 항체는 영장류, 특히 인간 및 원숭이의 CD154와 결합하는바, 항원-항체 반응을 유도한 후, 공지된 방법을 통해 상기 CD154를 발현하는 세포를 탐지하는데 이용할 수 있다.

상기 탐지방법은 유세포 분석, 형광 면역법 또는 면역조직 염색법 등에 의해 이루어질 수 있다.

상기 유세포 분석법은 수많은 세포를 플루이드 컬럼 (fluid column) 안에서 single flow로 형성하여 레이저 빔(laser beam)을 통과하면서 각 세포의 크기, 구조 및 과립도 등을 측정하므로 다양한 세포의 특징을 분석할 수 있는 방법이다. 상기 방법은 극히 미량의 형광 물질도 인지할 수 있어 정확도와 민감도가 높고 다양한 혼합 세포군에서 소수의 아형군을 측정 혹은 분리할 수 있다.

상기 형광 면역법은 항체와 항원이 선택적으로 결합하는 특성을 이용하여 특정한 생물분자의 정량과 분자량의 측정 및 그 분자가 세포나 조직 내에서 존재하는 위치 등을 알아내는 방법을 말한다. 이때 사용되는 항체에는 형광물질이 인위적으로 부착되어 있어서 특정 파장의 빛을 받으면 형광이 발생할 수 있다.

또한 본 발명은, 상기 항체를 포함하는 가용성 CD154 검출용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 가용성 CD154 검출용 키트 및 상기 조성물을 이용한 가용성 CD154 검출 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 항체는 가용성 CD154와 결합하는바, 항원-항체 반응을 통해 가용성 CD154를 검출하고, 이를 정량 하는데 이용할 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 항 원숭이 CD154 항체를 분비하는 융합 세포주의 제작

원숭이 CD154 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 융합 세포주를 제조하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

1-1. 항원 면역 및 융합 세포주의 제조

먼저, 원숭이 CD154(CD40L) 항원의 cDNA를 CHO 세포에 유전자전달감염(트랜스펙션, transfection)함으로써 상기 특정 항원이 발현되는 유전자 전달 감염체(트랜스펙턴트, transfectant)를 확립하였다. 또한 CD154(CD40L)-hFC 융합 단백질을 생산하는 CHO 세포주를 확립하였다.

CD154(CD40L) 특이적인 항체를 개발하기 위해 CD40L-hFc 융합단백질을 하기 표 1과 같은 조건으로 마우스에 항원 면역 하였다(ODN: Oligodinucleotide).

항원면역 (Immunization)	기간	면역경로	양	마리수	면역증강제
항원면역 (Immunization)	2 달-1 달-1 달: 총 3번	복강	CD40L-hFc/1~5g/마우스	5 마리/각 그룹	ODN

다음으로, 융합 세포주를 생성하기 위해 면역이 유도된 생쥐(immunized mice)에서 얻은 비장세포(splenocyte)를 P3X63Ag8.653 마우스의 골수종(myeloma) 세포와 융합하였다. 이를 위해, 골수종 세포를 10%의 FBS를 함유한 RPMI 배지(Roswell Park Memorial Institute medium)에서 성장시키고, 세포융합 전 FBS(Fetal bovine serum)가 포함되지 않은 RPMI 배지로 3회 세척한 후, 트립판 블루 계수법으로 배지에 부유된 세포수를 확인하였다. 한편, 비장세포는 마우스에서 비장을 적출한 뒤 잘게 절제하고 튜브에 옮겨 RPMI배지에 2분 정도 정치시키고 PBS로 3회 세척한 후 세포를 계수하였다. 상기 골수종 세포와 비장세포를 1:5의 비율로 혼합하고 1,300 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 완전히 제거하였다. 남은 펠렛에 미리 37℃로 데운 50% PEG-1500 1ml을 1분에 걸쳐 서서히 첨가하고, 1분 동안 부드럽게 흔들어 주었다. 이 후 RPMI 배지를 1ml, 1ml, 3ml씩을 각각 1분 동안 서서히 첨가하고, 14ml을 2분 동안 서서히 첨가하여 천천히 단계적으로 희석하였다. 이를 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하고 남은 융합된 세포의 침전물(pellet)을 서서히 풀어준 뒤 1×HAT가 포함된 RPMI 배지(20% FBS, 히포잔틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine)을 포함)에 부유시켰다. 상기 세포를 96 웰 배양 플레이트에 200 ul씩 분주한 다음, 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하여 세포 융합을 유도하였다. 배양 7일째에 HT 배지(20% FBS, 히포잔틴(hypoxanthine), 및 티미딘(thymidine)을 포함)로 교환하고, 4~5일 더 배양하였다. 이후 하기와 같이 군락을 형성한 웰 중 indirect FACS staining법을 이용하여 원숭이 PBL에 특이하게 반응하는 항체 생성 융합 세포주를 선별하였다.

1-2. 항체 생성 융합 세포의 선별

마우스의 복강에서 분리한 복강 마크로 파지(macrophage)를 이용하여 공급자 세포 배양 또는 융합세포용 배지를 제조하여, 하기와 같은 과정을 통해 항체를 생성하는 것으로 확인된 융합 세포주를 1차 선별하였다.

먼저, 96 웰 플레이트에 anti-mouse IgG 항체를 코팅하고 각각의 배양액과 반응시켰다. 그 후 anti-mouse IgG-Biotin과 반응시키고, streptoavidine-HRP와 반응시켜 양성 반응이 나오는 웰 중 활성도가 높은 웰을 선택하여 그 융합 세포주를 HT 배지에 희석한 후 한계희석배양법(limit dilution culture)으로 2회 또는 3회 단일세포 배양을 실시하였다.

다음으로, 원숭이 CD154(CD40L) 특이적인 항체를 생성하는 융합세포주를 선별하기 위해서 ELISA 분석을 실시하였다. 이를 위해 먼저, CD40L 항원을 코팅한 후 단일세포 배양액을 50ul 첨가하고 1시간 동안 반응시켰다. 이를 PBST(Phosphate-Buffered Saline+ Tween 20) 버퍼로 5회 세척한 후, anti-mouse IgG-Biotin으로 반응시켰다. 다시 같은 버퍼로 세척한 후 streptoavidine-HRP와 2차 반응시키고, NBT-BCIP로 발색하였다. ELISA Reader를 이용하여 540 nm 파장에서 결과 값을 수득하였다. 양성 대조군(+)으로는 5C8 (commercial antibody)을 이용하였으며, 음성대조군(-)으로는 CD40L만 코팅하고 항체를 넣지 않은 군을 이용하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, CD40L에 반응성을 보이는 클론으로 1C1, 1H1, 1H9, 2C11, 3E11, 5A1, 7G2, 6E7, RM9C3(9C3) 등 총 9가지를 확인하였다.

또한, 상기 과정을 통해 확인한 RM9C3 항체를 affinity chromatography법으로 정제(m9C3.Aff-biotin) 또는 이온-교환법을 이용하여 정제(m9C3.IEX-biotin)하고, 농도별 ELISA를 실시하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 항체의 농도가 증가함에 따라 CD40L에 대한 affinity가 증가함을 확인하였으며, 이를 통해 RM9C3 항체가 CD40L에 반응하는 항체임을 확인하였다.

이상의 과정을 통해 수득한, 항 원숭이 CD154 항체를 생산하는 융합 세포주(하이브리도마)를 RM9C3으로 명명하였으며, 이를 2015년 01월 27일에 한국세포주연구재단에 기탁하고, 수탁번호 KCLRF-BP-00335를 부여받았다.

실시예 2. 항 원숭이 CD154 항체의 CD40 - CD40L 신호전달 차단 효과 검증

CD40-CD40L 신호가 전달되는 경우 인간 RAMOS B 세포는 ICMA-1 발현이 촉진된다. 상기 실시예 1에서 수득한 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항 원숭이 CD154 항체가 이러한 CD40-CD40L 신호전달을 차단하는지를 확인하기 위해 인간 RAMOS B 세포에 CD40 발현-CHO 세포를 24시간 동안 혼합 배양하여 CD40-CD40L 신호가 전달되는 모델을 만들었다(도 3 참조). 상기 모델에 실시예 1에서 수득한 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항 원숭이 CD154 항체를 농도별로 처리한 후, ICAM-1의 발현을 감소시키는가를 확인하였다(도 4 및 도 5 참조). 양성 대조군으로는 5C8 (commercial antibody)을 이용하였으며, isotype 대조군으로는 hIgg를 이용하였다. 이상의 실험 결과를 도 3 내지 도 5에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, RAMOS B 세포를 CD40 발현-CHO 세포와 혼합 배양하면 CHO 세포에서 발현되는 CD40L이 RAMOS B 세포의 CD40 신호를 자극하여 신호전달이 유도되어 ICAM-1의 발현량이 증가함을 확인하였다 (RAMOS+CD40L CHO). 반면, 상업적으로 판매하는 CD40L 항체(5C8)를 처리하면 CD40-CD40L 신호전달이 차단됨으로써 ICMA-1 발현이 증가하지 않음을 확인하였으며, hIgg의 처리시에는 영향을 받지 않음을 확인하였다. 이 때 도 3에 표시된 수치는 유세포 분석 시 특정 항원의 발현 정도를 표시하는 수치로 M.F.I(mean fluorescence intensity)를 의미하며, 높을수록 발현량이 많다는 것을 의미한다.

또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 도 3에 개시된 CD40-CD40L 신호전달 차단 항체를 선별하는 방법을 이용한 결과, 실시예 1에서 수득한 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항 원숭이 CD154 항체의 농도가 높아질수록 RAMOS B 세포의 ICAM-1 발현 정도가 감소하며, 이를 통해 상기 항체가 인간 CD40-CD40L 신호전달을 효과적으로 차단함을 확인하였다.

또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 도 4의 결과를 바탕으로 ICAM-1 발현 정도를 정량화하여 상기 항체가 가지는 CD40-CD40L 신호전달 차단 효과를 ED50/ED100 (effective dosage 50% or 100%)로 계산한 결과, ED50은 약 0.72ug/ml이고, ED100은 2.2ug/ml임을 확인하였다.

실시예 3. 항 원숭이 CD154 항체의 면역세포 활성 억제 효과 검증

상기 실시예 1에서 수득한 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항 원숭이 CD154 항체가 원숭이 면역세포의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, CD40L-CD40 신호전달에 의해 활성화된 단핵구(monocyte)가 ICAM-1등의 부착인자 발현을 통해 서로 뭉치는 성질을 나타내는 것을 이용하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 원숭이 CD154(CD40L) 항원을 코팅한 웰(1ug/well)에 원숭이 단핵구(1X105/well)를 24시간 동안 배양하고, 상기 실시예 1에서 수득한 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항 원숭이 CD154 항체를 처리한 후, 세포가 뭉치는 정도를 확인하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다. 양성 대조군으로는 5C8 (commercial antibody)을 이용하였으며, isotype 대조군으로는 hIgg를 이용하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1에서 수득한 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항 원숭이 CD154 항체(1ug/ml)의 처리에 의해 CD40L-CD40 신호전달이 차단되어 뭉친 세포가 감소함을 확인하였다.

또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1에서 수득한 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항 원숭이 CD154 항체의 처리 농도에 의존적으로 뭉친 세포가 감소함을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명의 RM9C3은 실시예 2의 결과와 같이 인간뿐 아니라 원숭이의 CD40-CD40L 신호전달을 차단할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. 항 원숭이 CD154 항체 CDRs 에 대한 cDNA 염기서열 분석

항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체를 형성하는 항체의 주요부위는 중쇄와 경쇄의 가변 부위이며, 특히 CDR(complementarity determining region)이 항원-항체 복합체의 친화력을 결정한다. 따라서 상기 실시예 1에서 수득한 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항 원숭이 CD154 항체 유전자를 클로닝하여 항체 중쇄 및 경쇄의 가변부위에 대한 염기서열을 분석하였다.

먼저, 상기 실시예 1에서 수득한 RM9C3 융합 세포주의 RNA를 추출한 후, Mouse Ig-Primer set(Novagen,CA, USA)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 증폭된 유전자를 셔틀 벡터(shuttlevector)에 클로닝하고, 해당 유전자의 염기서열을 분석하였다. 이때 중쇄의 가변 영역인 VH (variable region of heavy chain) 및 경쇄의 가변 영역인 VL(variableregion of light chain) 유전자 염기서열은 아미노산으로 치환하여 서열화하였다. 구체적인 서열을 도 8에 개시하였으며, 붉은색으로 표시한 부분은 좌측부터 순서대로 CDR1, CDR2 , CDR3 지역을 의미한다.

실시예 5. 항 원숭이 CD154 항체를 이용한 진단 시약으로서의 이용 가능성 검증

상기 실시예 1에서 수득한 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항 원숭이 CD154 항체의 진단 시약으로써의 이용 가능성을 검증하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

5-1. 영장류 CD154 발현 세포 탐지용으로서의 이용 가능성 검증

실시예 1에서 수득한 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항 원숭이 CD154 항체 및 CD40L-CHO를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다. 보다 구체적으로 상기 실시예 1에서 수득한 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항 원숭이 CD154 항체를 1차(primary) 항체로, FITC-conjugated anti-Igg (Sigma, MO, USA) 항체를 2차 항체로 이용하여 종래 공지된 방법에 따라 유세포 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체는 CHO 세포에는 반응하지 않고 CHO-CD40L 세포에만 반응하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명의 항체를 CD40L 발현세포의 특이적 검출에 이용할 수 있음을 확인하였다.

5-2. 가용성 CD154 검출용으로서의 이용 가능성 검증

sCD40L는 가용성(soluble) 형태의 CD40L로 혈소판의 활성화에 의해 주로 분출되며 제 2형 당뇨병, 심혈관질환(cadiovascular disease) 및 HIV와 연관된 신경염증성(neuroinflammatory) 질환과 연관되어 있다.

상기 실시예 1에서 수득한 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항 원숭이 CD154 항체 및 Sandwich ELISA법을 이용하여 sCD40L를 검출할 수 있는 진단법을 개발하였다. 1차 코팅 항체로는 본 발명의 항체(10ug/ml)를 비롯하여, 시판 중인 항 CD40L 항체(CD40L 반응 Polyclonal 항체 (2ug/ml, Bioss, USA), 본 발명자가 FACS 를 통해 원숭이 CD154에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 융합세포주로 선별한 2H2 또는 8E5가 생산하는 항 원숭이 CD154 항체(10ug/ml)를 이용하였다. 항원으로는 sCD40L (Biolegend, USA)를 이용하여 반응시켰다. 2차 검출 항체로는 5C8-Biotin (Mass Biologics, Non-human Primate Resource Reagents, USA)를 사용하였다. 발색을 위하여 streptoavidin-HRP와 반응시킨 후 NBT-BCIP로 발색하여 ELISA Reader기로 540nm의 파장에서 측정값을 확인하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체(RM9C3)를 코팅한 군에서만, sCD40L를 높은 수준으로 검출할 수 있음을 확인하였으며(도 11 좌), 특히 10 ug/ml 이상의 농도에서 우수한 sCD40 검출 효과 보임을 확인하였다(도 11의 우).

상기 과정을 통해 확립된 방법을 이용하여, sCD40L 검출 민감도 및 검출한도를 분석하였다. 이를 위해, 실시예 1에서 수득한 RM9C3 융합 세포주가 생산하는 항 원숭이 CD154 항체를 10ug/ml 코팅하고 sCD40L를 농도별 (0-100pg/ml)로 처리한 후, 상기와 동일한 ELISA법을 수행하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, R2 value는 0.998였으며 최소 민감도는 10pg/ml, Detection range는 10pg/ml-100pg/ml임을 확인하였다.

한국세포주연구재단

KCLRFBP00335

20150127

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Antibody to specific primates CD154 and hybridoma cell producing the same <130> 105 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RM9C3 Heavy chain variable region <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Phe Arg Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Leu Phe Asp Cys Asp Val Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RM9C3 Light chain variable region <400> 2 Asn Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp His Ser Ser Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-영장류 CD154 항체.
제1항에 있어서,
상기 항체는 수탁번호가 KCLRF-BP-00335인 융합 세포주에 의하여 생산되는 것을 특징으로 하는 항-영장류 CD154 항체.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역으로 이루어지는, 원숭이 CD154 항원에 특이적으로 반응하는 항-영장류 CD154 항체를 생산하는 융합세포주(수탁번호 KCLRF-BP-00335).
제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는, CD40-CD40L 신호전달 차단용 조성물.
제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는, 면역 억제용 조성물.
제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는, 영장류 CD154 발현 세포 탐지용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 영장류는 인간 또는 원숭이인 것을 특징으로 하는, 영장류 CD154 발현 세포 탐지용 조성물.
제6항의 조성물을 포함하는, 영장류 CD154 발현 세포 탐지용 키트.
제1항 또는 제2항의 항체를 검체 시료와 접촉시켜 항원-항체 반응을 수행하는 단계를 포함하는, 영장류 CD154 발현 세포 탐지방법.
제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는, 가용성 CD154 검출용 조성물.
제10항의 조성물을 포함하는, 가용성 CD154 검출용 키트.