KR20040054670A

KR20040054670A - Ｐ-셀렉틴 당단백질 리간드 1의 조절자

Info

Publication number: KR20040054670A
Application number: KR10-2004-7001711A
Authority: KR
Inventors: 롱-화린; 충-순우; 페이-링슈
Original assignee: 압제노믹스 코포레이션
Priority date: 2001-08-03
Filing date: 2002-03-13
Publication date: 2004-06-25
Also published as: ES2316569T3; PT1985634E; NO334850B1; NZ531199A; WO2003013603A8; JP2008260759A; AU2002305041B2; HK1124624A1; IL160168A0; MXPA04001047A; CN1304051C; CA2428822A1; NO20040460L; PT1411982E; DK1411982T3; NO333456B1; WO2003013603A1; KR100850731B1; IL160168A; ATE411045T1

Abstract

본 발명은 T 세포 또는 천연 킬러(NK) 세포 고갈 및 T 세포 또는 NK 세포의 세포자멸을 유도하는 데 사용될 수 있는 T 세포 또는 NK 세포 표면 상의 P-셀렉틴 당단백질-1(PSGL-1)에 결합하는 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물 및 방법은 자가면역성 질환, 이식 거부반응, 및 알레르기성 질환과 같은 증상에서 불필요한 T 세포-매개의 또는 NK 세포-매개의 면역 반응을 조절하는 데 사용될 수 있다.

Description

Ｐ-셀렉틴 당단백질 리간드 1의 조절자 {MODULATORS OF P-SELECTIN GLYCOPROTEIN LIGAND 1}

불필요한 면역 반응의 조절은 자가면역성 질환, 이식 거부반응, 알레르기성 질환, 및 몇몇 암과 같은 질환의 치료에 있어 중요한 문제이다. 과도하게 공격적인 T 세포는 면역학적 내성의 유도에 의하여 조절될 수 있다. 내성은 면역계가 항원에 대해 반응하지 않도록 되고, 항원에 대한 면역 반응을 감소시키는 면역억제가 보통 약물의 지속적인 사용을 요구하는 상태로서 정의된다. 기관 이식에서, T 세포는 동종항원에 대한 면역 반응에서 필수적인 역할을 담당한다. 현재의 면역억제 체제는 보통 T 세포의 중요 성장인자인 IL-2의 전사를 차단하거나, IL-2 의존성 증식을 저해하는 코르티코이드, 사이클로스포린 또는 라파마이신과 관련이 있다. 그러나, T 세포-고갈 제제(예를 들면, CD3, CD4, CD8), 또는 사이토카인 신호화 또는 T 세포의 공동-자극 경로의 저해인자(예를 들면, CD25, B7-1, B7-2, CD152, CTLA4)로서 작용하는 다양한 단일클론성 항체들은 제한된 부작용 또는 독성을 동반하는거부반응의 발생률 감소에 있어 입증된 효과를 갖는다. 이들 제제들 중 일부는 자가면역성 질환의 치료 및 이식편의 생존 연장에 있어 다소의 성공을 가져오는 것으로 나타나 있다.

세포자멸은 면역계의 적절한 기능 및 불필요한 세포를 제거하는 주요 메커니즘을 유지하는 데 극히 중요한 것으로 널리 믿어지고 있다(Kabelitz et al. Immunol. Today 14: 338-340 (1993); Raff, Nature: 356: 397-399 (1992)). 세포 내부 또는 외부로부터 기원하는 다양한 신호는 세포의 생존 및 사망에 영향을 준다. Fas(또는 CD95, MW = 43 kD), TNFR2(MW = 75 kD), CD2(MW = 45 kD) 및 CTLA-4(MW = 33 kD)와 같은 T 세포 표면 분자에 대항하는 항체는 T 세포의 세포자멸을 유도한다(Osborne, Curr. Opin. Immunol. 8: 245-248 (1996); Lin et al. J. Immunol. 158: 598-603 (1997); Zhang et al. Nature: 377:348-350 (1995); Lai et al. Eur. J. Immunol. 25: 3243-3248 (1995); Mollereau et al. J. Immunol. 156: 3184-3190 (1996); Gribben et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 811-815 (1995)). 불필요한 T 세포를 조절하는 Fas 및 TNFR2 분자들을 사용하고자 하는 시도는 이들 두 분자가 면역 세포뿐 아니라 다른 여러 중요한 기관계에서도 발현된다는 점에서 제한 받아왔다(Ogasawara et al. Nature 364: 806-809 (1993); Pfeffer et al. Cell: 73: 457-467 (1993); Engelmann et al. J. Biological Chemistry 265: 14497-14504 (1990)).

본 출원은 본 발명에 참고로 인용되는 2001년 8월 3일자로 출원된 U.S. 가출원 제60/310,196호로부터 우선권을 주장한다.

본 발명은 면역 반응 조절 조성물 및 방법에 관한 것이다.

도 1은 활성화된 T 세포가 TAB4(항-PSGL-1 단일클론성 항체)-매개의 세포자멸 신호에 대한 감수성을 갖는 경우 조사된 시간 경과에 따른 실험 결과를 나타낸 도면.

도 2는 TAB4 항체에 의하여 인식되는 항원의 세포 표면 바이오틴화(biotinylation) 및 면역침전의 결과를 나타낸 도면.

도 3은 비장 CD4⁺T 세포, CD8⁺T 세포, CD19⁺B 세포, 및 NK 세포에 대한 PSGL-1 항원의 발현을 나타낸 도면.

도 4는 CD4⁺, CD8⁺, 및 CD4⁺8⁺, 및 CD4^-8^-가슴샘 세포에 대한 PSGL-1 항원의 발현을 나타낸 도면.

도 5는 반응자로서 TAB4(또는 햄스터 Ig)-처리된 Balb/c 마우스로부터 분리된 비장 세포를 이용하고 촉진자로서 H2-미스매치 C3H 비장 세포를 이용해 혼합 백혈구 배지 내에서 생성된 IL-2의 수준을 나타낸 도면.

도 6은 (A) TAB4 항체로 면역 침전되는 단백질이 상업적으로 입수 가능한 항-PSGL-1 항체에 의하여 인식될 수 있으며, (B) 항-PSGL-1 항체를 이용한 T 세포 용출물의 사전 세정이 TAB4에 의해 인식된 단백질을 고갈시킬 수 있음을 입증하는 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 도면.

도 7은 Balb/c 마우스 유래의 피부가 이식되고 항-PSGL-1 항체(검은색 다이아몬드) 또는 대조군 항체(흰색 다이아몬드)로 처리된 C57BL/6 마우스 내에서 생존하는 이식편의 백분율을 나타낸 도면.

도 8은 항-인간 PSGL-1 항체로 활성화된 말초혈액 단일클론성 세포를 처리한 뒤 세포자멸 T 세포의 백분율을 나타낸 도면.

도 9는 항-PSGL-1 항체(검은색 정사각형) 또는 대조군 항체(흰색 정사각형)로 처리된 자가면역 비-비만 상태의 당뇨병(NOD) 수컷 마우스의 당뇨병 발생률을 나타낸 도면.

본 발명은 T 세포가 상기 T 세포 표면 항원 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)의 교합에 의하여 고갈 및/또는 세포자멸로 진행되도록 유도될 수 있다는 사실의 발견을 기초로 한다. T 세포 고갈은 과도한 또는 불필요한 T 세포-매개의 면역 반응, 또는 과도한 또는 불필요한 T 세포 증식과 관련된 증상의 치료에 특히 유용하다. 예를 들면, T 세포의 고갈은 자가면역성 질환, 이식 거부반응, 알레르기성 질환, 및/또는 T 세포-유래의 암과 관련된 바람직하지 못한 T 세포 활성 또는 증식의 감소 또는 제거를 유발할 수 있다. 본 발명은 T 세포-매개의 면역 반응을 예방 또는 감소시키는 PSGL-1 기능의 조절자를 이용하는 방법 및 PSGL-1 기능의 조절자의 선별 방법을 포함한다.

한 양태에서, 본 발명은 개체 내에서의 T 세포-매개의 면역 반응을 예방 또는 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 과도한 또는 불필요한 T 세포-매개의 면역 반응을 특징으로 하는 증상을 가지거나 가질 위험이 있을 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계; 및 상기 T 세포 표면 상에 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)에 결합하는 화합물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 T 세포 표면 상의 PSGL-1에 대한 화합물의 결합은 상기 T 세포의 사망을 초래하는 신호 변환 경로를 유도함으로써, 상기 개체 내에서 T 세포-매개의 면역 반응을 예방 또는 감소시킨다.

이러한 방법에 사용되는 화합물은 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 한 실시예에서, 상기 화합물은 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 단일클론성 항체이다. 한 구현형태에서, 상기 방법은 상상기 단일클론성 항체에 결합하여 T 세포 표면 상의 복수의 PSGL-1 항원의 가교결합을유도하는 제제를 투여하는 추가의 단계를 포함한다.

한 구현형태에서, 상기 방법은 상기 T 세포 표면 상의 복수의 PSGL-1 항원의 가교결합을 유도하는 단계를 포함하고, 상기 가교결합은 T 세포의 사망을 초래하는 신호 변환 경로를 유도한다.

한 실시예에서, 상기 방법은 자가면역성 질환을 가지는 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 동종(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic) 이식편을 수령하거나 수령할 것으로 기대되는 개체를 선별하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 알레르기성 질환을 가지는 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 T 세포 암을 가지는 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계를 포함한다.

한 구현형태에서, 상기 T 세포는 활성화된 T 세포이다. 한 실시예에서, 상기 T 세포는 CD4+ T 세포이다. 다른 실시예에서, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포이다.

한 구현형태에서, 상기 방법은 상기 화합물을 투여하기 전에 상기 개체로부터 채취한 제1 생물학적 샘플 내의 T 세포의 수를 검출하는 단계; 및 상기 결과를 상기 화합물을 투여한 후에 상기 개체로부터 채취한 제2 생물학적 샘플 내의 T 세포의 수와 비교하는 단계를 포함한다.

다른 한 구현형태에서, 상기 방법은 상기 화합물을 투여하기 전에 상기 개체로부터 채취한 제1 생물학적 샘플 내의 T 세포의 생물학적 활성을 검출하는 단계; 및 상기 결과를 상기 화합물을 투여한 후에 상기 개체로부터 채취한 제2 생물학적 샘플 내의 T 세포의 생물학적 활성과 비교하는 단계를 포함한다.

한 구현형태에서, 상기 투여는 상기 개체 내의 말초혈액 CD3+ 세포의 적어도 20%의 고갈을 초래한다. 몇몇 구현형태에서, 상기 투여는 상기 개체 내의 말초혈액 CD3+ 세포의 적어도 30%, 40%, 50% 이상의 고갈을 초래한다.

한 구현형태에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 상기 항체 또는 항원 결합 단편에 노출된 후 상기 개체 내의 말초혈액 CD3+ 세포의 적어도 20%의 사망을 유도한다. 몇몇 구현형태에서, 상기 투여는 상기 개체 내의 말초혈액 CD3+ 세포의 적어도 30%, 40%, 50% 이상의 사망을 초래한다. 세포 사망은 예를 들면 항체 또는 항원 결합 단편에 노출시킨 후 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간 또는 수일 뒤의 어느 시기에나 측정할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 T 세포 또는 천연 킬러(NK) 세포의 사망을 유도하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 표면 상에 PSGL-1을 발현시키는 T 세포 또는 NK 세포를 제공하는 단계; 및 상기 T 세포 또는 NK 세포와 이들 세포 표면의 PSGL-1에 결합하는 화합물을 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 T 세포 또는 NK 세포 표면 상에 PSGL-1에 대한 상기 화합물의 결합이 T 세포 또는 NK 세포의 사망을 초래하는 신호 변환 경로를 유도한다.

상기 방법에 사용되는 화합물은 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 한 실시예에서, 상기 화합물은 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 단일클론성 항체이다. 한 구현형태에서, 상기 방법은 상기 단일클론성 항체를 상기 단일클론성 항체에 결합하여 상기 T 세포 또는 NK 세포 표면 상의 복수의 PSGL-1 항원의 가교결합을 유도하는 제제와 접촉시키는 단계를 추가로포함한다.

한 구현형태에서, 상기 방법은 상기 T 세포 또는 NK 세포 표면 상의 복수의 PSGL-1 항원의 가교결합을 유도하는 단계를 포함하고, 상기 가교결합은 T 세포 또는 NK 세포의 사망을 초래하는 신호 변환 경로를 유도한다.

한 구현형태에서, 상기 세포는 활성화된 T 세포이다. 한 실시예에서, 상기 세포는 CD4+ T 세포이다. 다른 실시예에서, 상기 세포는 CD8+ T 세포이다.

한 구현형태에서, 상기 방법은 상기 화합물과 접촉시킨 후의 상기 T 세포 또는 NK 세포의 생존력을 평가하는 단계를 포함한다.

한 구현형태에서, 상기 방법은 상기 화합물과 접촉시킨 후의 상기 T 세포 또는 NK 세포의 생물학적 활성을 평가하는 단계를 포함한다.

다른 한 양태에서, PSGL-1 기능의 조절자를 선별하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 표면 상에 PSGL-1을 발현시키는 세포를 제공하는 단계; 상기 세포와 테스트 물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 세포와 테스트 물질을 접촉시킨 후 세포의 생존력을 측정함으로써, 상기 테스트 물질이 PSGL-1 기능의 조절자인지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.

한 구현형태에서, 상기 방법은 상기 테스트 물질에 의하여 유도되는 세포의 사망을 검출함으로써, 상기 테스트 물질이 PSGL-1 기능의 조절자인지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.

한 구현형태에서, 상기 테스트 물질은 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 한 실시예에서, 상기 테스트 물질은 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 단일클론성 항체이다. 한 구현형태에서, 상기 방법은 상기 단일클론성 항체를 상기 단일클론성 항체와 결합하여 상기 세포 표면 상의 복수의 PSGL-1 항원의 가교결합을 유도하는 제제와 접촉시키는 단계를 포함한다.

한 구현형태에서, 상기 방법은 상기 세포 표면 상의 복수의 PSGL-1 항원의 가교결합을 유도하는 단계를 포함하고, 상기 가교결합은 상기 세포의 사망을 초래하는 신호 변환 경로를 유도한다.

한 구현형태에서, 상기 세포는 활성화된 T 세포이다. 한 실시예에서, 상기 세포는 CD4+ T 세포이다. 다른 한 실시예에서, 상기 세포는 CD8+ T 세포이다.

한 구현형태에서, 상기 방법은 상기 테스트 물질을 대량 생산하는 단계 및 제약학적으로 허용 가능한 담체 내에 상기 테스트 물질을 제형화하는 단계를 포함한다.

다른 한 양태에서, 본 발명은 T 세포 표면 상의 PSGL-1에 결합하는 화합물로서, 이러한 T 세포 표면 상의 PSGL-1으로의 결합이 상기 T 세포의 사망을 초래하는 신호 변환 경로를 유도하는 화합물; 및 자가면역, 이식 거부반응, 알레르기성 증상, 또는 T 세포 암을 치료하기 위하여 상기 화합물을 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 특징으로 한다. 다른 구현형태에서, 상기 키트는 상술한 임의의 질환 또는 이상을 치료하기 위하여 사용하는 기구를 포함한다.

본 발명의 장점은 불필요하거나 유해한 관련 면역 반응을 유발하지 않고 T 세포의 고갈 및/또는 T 세포 내의 세포자멸을 일으키는 것이다. 예를 들면, 개체로의 항-PSGL-1 항체의 투여는 IL-2 또는 TNF-E와 같은 염증성 사이토카인 수준의불필요한 상승을 유발하지 않는다.

본 발명의 다른 장점은 대부분 백혈구, 및 특히 T 세포 및 NK 세포로 한정되는 세포 표면 단백질 PSGL-1의 표적화가 가능하다는 것이다. 따라서, 상기한 화합물들은 간세포와 같은 다른 세포 유형의 유의한 수준의 세포자멸은 유도하지 않는다. 생명을 위협하는 전신성 사이토카인 반응을 유의하게 유도하지 않고 다른 기관계를 손상시키지 않는 선택적 고갈을 위한 T 세포 및 NK 세포의 표적화(이식 거부반응과 관련되는 중요한 CD3^-세포 유형)는 면역억제제에 요구되는 특징이다.

달리 정의하지 않는 한, 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 상술한 것들과 유사하거나 등가의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질은 이하에 제시한다. 본 명세서에서 언급하는 모든 공보, 특허 출원, 특허, 및 기타 참조문헌은 그 내용이 본 발명에 참고로 인용되는 것이다. 용어의 충돌 시, 본 명세서는 조절할 것이다. 또한, 제시한 물질 및 방법들은 단지 예시를 위한 것으로서, 제한하고자 하는 것이 아니다.

본 발명의 기타 특징 및 장점은 이하의 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 보다 명확해질 것이다.

본 발명은 T 세포 표면에 존재하는 PSGL-1 분자들의 기능을 조절하여 T 세포 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 상술한 조성물들과 PSGL-1의 교합은 T 세포의 고갈을 초래하고/초래하거나 T 세포를 세포자멸되게 할 수 있다. 따라서, 이들조성물은 자가면역성 질환, 이식 거부반응, 알레르기성 질환, 및/또는 T 세포-유래의 암과 같은 면역-관련 증상을 조절하기 위한 치료제로서 유용하다. 상기 조성물은 또한 T 세포의 존재 또는 활성이 요구되지 않는 임의의 생물학적 샘플로부터 T 세포의 고갈을 유발하는 데도 유용하다.

PSGL-1 단백질

PSGL-1은 호중구, T-림프구 및 B-림프구, NK 세포, 단핵세포, 수지상 세포, 및 원시 인간 CD34 조혈모세포 상에서 발현되는 세포 표면 부착 분자이다. 셀렉틴과 상호작용하는 능력을 통해, PSGL-1은 내피에 대한 백혈구의 회전 및 염증 조직으로의 백혈구를 유출을 매개한다. E-셀렉틴 및 P-셀렉틴에 대한 T 세포의 PSGL-1-매개의 결합 또는 이동은 차별적으로 조절된다. 예를 들면, CLA(피부 림프구 항원) 에피토프의 출연은 T 세포가 변화를 기억하는 성향이 되도록 유도하는 것으로 생각된다. 활성화된 헬퍼 1뿐 아니라 헬퍼 2 T 세포도 기능성 PSGL-1을 발현시키고, 피부의 염증 구역으로 이동할 수 있다.

PSGL-1은 P-셀렉틴에 결합하기 위해서는 특이적으로 시알릴화(sialylated), 푸코실화(fucosylated), 및 설페이트화되어야 하는 시알로뮤신이다. PSGL-1 분자는 그의 N-말단의 글리코실화 및 설페이트화 자리의 상이한 정도에 따라 특징지어지는 이형으로서 존재한다. 휴지 상태의 말초혈액 T 및 B 세포, 임파성 세포주, 및 시험관내 활성화된 말초혈액 T 세포는 유사한 수준의 PGSL-1을 발현시킨다. 그럼에도 불구하고, 단지 활성화된 T 세포만이 PSGL-1의 기능적 형태를 나타내고, P-셀렉틴에 활발히 결합한다. 이러한 활성화-의존성 결합 활성은 활성화된 T 세포내에서 알파 (1,3) 푸코실트랜스퍼라아제 활성 수준의 증가로부터 판단할 때, 번역후 변형의 결과인 것으로 여겨진다. PSGL-1 이형 또한 L-셀렉틴 및 E-셀렉틴에 대하여 상이한 친화성을 나타낸다. 예를 들면, CLA-양성 이형을 나타내는 인간 T 세포는 E-셀렉틴 및 P-셀렉틴 모두에 결합해 역할을 할 수 있는 한편, CLA 에피토프 없이 PSGL-1을 발현시키는 T 세포는 단지 P-셀렉틴에만 결합한다. 나아가, P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합은 설페이트화를 위한 3개의 티로신 잔기 및 글리코실화를 위한 1개의 트레오닌 잔기를 함유하는 말단 데카펩타이드의 존재에 종속한다.

PSGL-1 단백질은 재조합 방법 및/또는 생물학적 물질로부터 천연 PSGL-1 단백질의 분리를 통해 제조할 수 있다. 재조합 PSGL-1 단백질은 원핵생물 또는 진핵생물 세포 내에서 시험관내 또는 생체내 생산될 수 있다. PSGL-1을 코딩하는 핵산이 상기 단백질의 재조합 생산을 위하여 사용될 수 있다(참조: 예를 들면, PSGL-1 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 경우는 GenBank 수탁번호 NM_003006). PSGL-1 관련 항체도 공지되어 있으며, 항원의 정제에 사용될 수 있고(참조: 예를 들면, Herron et al. (2000) Science Jun 2; 288 (5471): 1653-56; WO 00/25808), 본 명세서에 제시된 방법에 사용될 수 있다. PSGL-1은 또한 비제한적으로 Sako et al. (1993) Cell 75: 1179; Vachino et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 21966; 및 Veldman et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 16470을 비롯한 참조문헌에 제시되어 있다.

PSGL-1의 재조합 생산을 위하여, PSGL-1 및 그의 변형 알파-(1,3) 푸코실트랜스퍼라아제 Fuc-TVII의 동시 발현이 PSGL-1의 기능적 발현에 요구될 수 있다.부가적으로 또는 대안적으로, PSGL-1의 재조합 생산은 티로신 설포트랜스퍼라아제를 코딩하는 핵산 및/또는 프로펩타이드를 제거하기 위한 PACE를 코딩하는 핵산을 공동-트랜스펙션시킴으로써 달성될 수 있다.

항-PSGL-1 항체는 생물학적 물질로부터 PSGL-1 항원의 분리 및 정제에 사용될 수 있다. PSGL-1 단백질을 발현하는 임의의 세포, 예를 들면 개체로부터 유래된 T 세포 또는 T 세포주는 상기 단백질의 공급원으로서 사용될 수 있다. 정제 시, 상기 단백질은 본 명세서에 제시된 다양한 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 정제된 PSGL-1 단백질은 T 세포 상의 PSGL-1 기능의 조절자를 시험관내 선별하는 데 사용할 수도 있고, 상기 단백질에 대항해 유도되는 항체를 제조하는 면역원으로서 사용할 수도 있다.

또한, PSGL-1 항원은 셀렉틴-Fc 융합, 예를 들면, P-셀렉틴-Fc 융합을 이용해 정제할 수 있다.

항-PSGL-1 항체

PSGL-1 폴리펩타이드(또는 면역원성 단편 또는 그들의 유사체)는 본 발명의 방법에 유용한 항체의 생산에 사용될 수 있다. 상술한 바와 같이, PSGL-1 폴리펩타이드 또는 그의 펩타이드 단편은 재조합 기술로 생산할 수도 있고, 고체상 합성법에 의하여 합성할 수도 있다. 재조합 PSGL-1 폴리펩타이드 또는 그의 펩타이드 단편은 항-PSGL-1 항체를 생산하는 면역원으로서 사용할 수 있다. 그 외에도, TAB4 단일클론성 항체와 같은 항-PSGL-1 항체는 PSGL-1 폴리펩타이드, 예를 들면, 천연 형질전환 상태의 PSGL-1 폴리펩타이드를 정제하는 데 사용할 수 있으며, 그런뒤에는 추가의 항-PSGL-1 항체를 생산하는 면역원으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 항체는 PSGL-1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 단일클론성, 다중클론성, 또는 조작 항체일 수 있다. 특정 항원, 예를 들면 PSGL-1 폴리펩타이드에 "특이적으로 결합하는" 항체는 한 샘플 내의 다른 분자들에 대해서는 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드에 결합하는 테스트 화합물(예를 들면, 항체)의 동정 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 상기 폴리펩타이드와 테스트 화합물을 접촉시키는 단계; 상기 폴리펩타이드가 상기 테스트 화합물에 결합하는 지의 여부를 검출하는 단계(예를 들면, 결합의 직접 검출, 폴리펩타이드에 대한 테스트 화합물의 결합을 붕괴시키는 경쟁 분자의 검출, 및/또는 세포자멸을 유도하는 활성에 대한 분석을 이용하는 결합의 검출)를 포함한다.

일반적으로, PSGL-1 폴리펩타이드는 아쥬번트와 혼합된, KLH와 같은 담체 단백질에 커플링될 수 있으며, 포유류 숙주 내로 주입될 수 있다. 이어서, 그러한 동물 내에서 생산된 항체는 펩타이드 항원 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제될 수 있다.

특히, 다양한 숙주 동물이 PSGL-1 폴리펩타이드 또는 그의 항원성 단편의 주입에 의하여 면역화될 수 있다. 통상적으로 사용되는 숙주 동물은 토끼, 마우스, 기니아피그, 및 래트를 포함한다. 면역 반응을 증가시키기 위하여 사용될 수 있는 각종 아쥬번트는 숙주의 종류에 따라 결정되며, 프로인트의 아쥬번트(완전 및 불완전), 수산화알루미늄과 같은 미네랄 겔, 표면 활성 물질, 예를 들면 라이솔레시틴,플루로닌 폴리올, 폴리아니온, 펩타이드, 오일 에멀젼, 키홀 림페트 헤모시아닌, 및 디니트로페놀을 포함한다. 잠재적으로 유용한 인간 아쥬번트는 BCG(bacille Calmette-Guerin) 및Corynebacterium parvum를 포함한다. 다중클론성 항체는 면역화된 동물의 혈청 내에 함유된 항체 분자들의 이질 군집이다.

따라서, 본 발명에 속하는 항체들은 다중클론성 항체 및 단일클론성 항체, 인간화 또는 키메라 항체, 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 및 Fab 발현 라이브러리를 이용해 생산되는 분자들을 포함한다.

특정 항원에 대한 이질 군집의 항체인 단일클론성 항체는 상기 PSGL-1 폴리펩타이드 및 표준 하이브리도마 기술(참조: 예를 들면, Kohler et al., Nature 256: 495 [1975]; Kohler et al., Eur J Immunol 6: 511 [1976]; Kohler et al., Eur J Immunol 6: 292 [1976]; Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. [1981])을 이용해 제조할 수 있다.

특히, 단일클론성 항체는 Kohler 등의 Nature 256: 495 (1975), 및 U.S. 특허 제4,376,110호에 제시된 바와 같은 배지 내 연속 세포주에 의해 항체 분자를 생산하는 기술; 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor et al., Immunology Today 4: 72[1983]; Cole et al., Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026 [1983]), 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 [1983])에 의하여 얻을 수 있다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD를 포함하는 임의의 면역글로불린 부류 및 그의 하위 부류(subclass)일 수 있다. 본 발명의 mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내 배양될 수 있다. 높은 역가의 mAb를 생체내 생산하는 능력은 이를 특히 유용한 생산 방법으로 만들어주었다.

제조 후, 다중클론성 또는 단일클론성 항체는 예를 들면, Ausubel 등의 상술한 문헌에 제시된 바와 같은 표준 방법에 의한 웨스턴 블롯 또는 면역침전 분석에 의하여 특정 PSGL-1에 대하여 테스트된다. PSGL-1을 특이적으로 인식해 결합하는 항체가 본 발명에 유용하다. T 세포, 예를 들면, CD3+ 세포 상의 PSGL-1 항원에 결합하여 개체 내에서 T 세포의 고갈 및/또는 세포자멸을 유도하는 항-PSGL-1 항체가 특히 유용하다.

상기 항체는 예를 들면, 치료 체제(예를 들면, 자가면역성 질환, 이식 거부반응, 알레르기성 질환, 및 T 세포 유래의 암과 같은 증상과 관련된 T 세포 매개의 면역 반응과 같은 원치 않는 면역 반응의 감소 또는 제거)의 일부로서 사용될 수 있다. 항체는 PSGL-1에 결합하는 후보 화합물의 능력을 선별 평가하는 데 사용될 수도 있다.

그 외에도, 적합한 생물학적 활성의 인간 항체 분자 유래의 유전자와 함께 적합한 항원 특이성의 마우스 항체 분자 유래의 유전자의 스플라이싱에 의한 "키메라 항체"의 생산용으로 개발된 기술(Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 6851 [1984]; Neuberger et al., Nature 312: 604 [1984]; Takeda et al., Nature 314: 452 [1984])도 사용할 수 있다. 키메라 항체는 상이한 부분이 설치류 단일클론성 항체 및 인간 면역글로불린 불변 부위로부터 유래된 가변 부위를 가지는 것들과 같이 상이한 동물종으로부터 유래된 분자이다.

대안적으로, 단쇄 항체의 생산용으로 제시된 기술(U.S. 특허 제4,946,778호, 제4,946,778호, 및 제4,704,692호)은 PSGL-1 폴리펩타이드에 대항하는 단쇄 항체, 또는 그의 단편을 생산하기 위하여 채택될 수 있다. 단쇄 항체는 단쇄 폴리펩타이드가 얻어지는 아미노산 결합을 통해 중쇄 및 경쇄 단편을 연결시킴으로써 형성된다.

특정 에피토프를 인식하고 결합하는 항체 단편은 공지된 기술에 의하여 제작할 수 있다. 예를 들면, 그러한 단편은 비제한적으로 항체 분자의 펩신 분해에 의하여 제조될 수 있는 F(ab')2 단편, 및 F(ab')2 단편의 이황화 결합의 환원에 의하여 제조될 수 있는 Fab 단편을 포함한다. 대안적으로, Fab 발현 라이브러리는 원하는 특이성을 가지는 단일클론성 Fab 단편의 신속하고 용이한 동정을 가능하게 하기 위한 것으로 조작될 수 있다(Huse et al., Science 246: 1275 [1989])

항체는 당 기술분야에 공지된 방법에 의하여 인간화될 수 있다. 예를 들면, 원하는 결합 특이성을 가지는 단일클론성 항체는 공업적으로 인간화될 수 있다(Scotgene, Scotland; Oxford Molecular, Palo Alto, Calif.). 트랜스제닉 동물 내에서 발현되는 것들과 같은 완전한 인간 항체도 본 발명의 특징이다(Green et al., Nature Genetics 7: 13[1994]; 및 U.S. 특허 제5,545,806호 및 제5,569,825조).

PSGL-1 기능을 조절하는 화합물에 대한 선별 분석

본 발명은 또한 비제한적으로 PSGL-1 결합 시 T 세포 고갈 및/또는 T 세포의 세포자멸을 유도하는 화합물을 포함하는, PSGL-1(또는 PSGL-1의 도메인)과 상호작용하는 화합물의 동정 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 PSGL-1 활성을 조절하는 막관통, 세포외 또는 세포내 단백질 및 PSGL-1 활성을 조절하는 화합물과 PSGL-1의 상호작용을 조절하는 화합물을 포함한다.

본 발명에 따라 선별될 수 있는 화합물은 비제한적으로, 상술한 바와 같이 PSGL-1에 결합하여 PSGL-1에 의하여 매개되는 생물학적 기능을 조절하는 펩타이드, 항체 및 그의 단편, 및 기타 유기 화합물을 포함한다.

이러한 화합물들은 비제한적으로 펩타이드, 예를 들면 랜덤 펩타이드 라이브러리의 일원들을 포함하는 가용성 펩타이드; (Lam et al., Nature 354: 82 [1991]; Houghten et al., Nature 354: 84 [1991]), 및 D-배열 및/또는 L-배열 아미노산, 포스포펩타이드(비제한적으로, 랜덤 또는 축퇴성 직접 포스포펩타이드 라이브러리의 일원들 포함; Songyang et al., Cell 72: 767 [1993]), 항체(비제한적으로, 다중클론성, 단일클론성, 인간화, 항-이디오타입, 키메라 또는 단쇄 항체, 및 FAb, F(ab')2 및 FAb 발현 라이브러리 단편, 및 그의 에피토프-결합 단편), 및 작은 유기 또는 무기 분자들을 포함하는 화학적 조합을 통해 얻어지는 분자 라이브러리를 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 선별될 수 있는 기타 화합물은 비제한적으로, 상술한 바와 같은 PSGL-1 단백질의 활성에 영향을 주는 작은 유기 분자들을 포함한다.

컴퓨터 모델링 및 검색 기술은 PSGL-1 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 화합물의 동정, 또는 이미 동정된 화합물의 개선을 가능하게 한다. 그러한 화합물 또는 조성물을 동정함으로써, 활성 자리 또는 부위가 동정되었다. 그러한 활성 자리는 통상적으로 활성의 천연 조절자에 대한 결합 자리일 것이다. 활성 자리는 예를 들면, 펩타이드의 아미노산 서열, 핵산의 뉴클레오타이드 서열, 또는 관련 화합물 또는 조성물과 천연 리간드의 복합체 연구로부터 당 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 동정할 수 있다. 후자의 경우, 인자 상에 조절자(또는 리간드)가 발견되는 장소를 밝힘으로써 활성 자리를 찾기 위하여 화학적 또는 X-선 결정학적 방법이 사용될 수 있다.

결합을 변화시킬 수 있는 화합물의 설계 및 조작과 관련해서는 상기에 설명하였으나, 당업자는 PSGL-1 단백질에 결합하여 T 세포의 고갈을 유발하고/유발하거나 T 세포의 세포자멸을 유도하는 천연 산물 또는 합성 화학물질을 포함하는 공지된 화합물, 및 단백질을 포함하는 생물학적 활성 물질의 라이브러리를 선별할 수 있을 것이다.

시험관내 시스템은 PSGL-1(또는 PSGL-1의 도메인)과 상호작용할 수 있는 화합물을 동정하도록 설계될 수 있다. 동정된 화합물은 예를 들면, 본 명세서에 설명한 바와 같이 T 세포 활성의 조절에 유용할 수 있으므로, 자가면역성 질환, 이식 거부반응, 알레르기성 질환, 및 T 세포 유래의 암의 치료에 유용할 수 있다.

PSGL-1에 결합하는 화합물의 동정에 사용되는 분석 원리는 두 성분들이 상호작용하고 결합함으로써, 반응 혼합물 내에서 제거될 수 있고/있거나 검출될 수 있는 복합체의 형성이 허용되는 충분한 조건 및 시간 하에 PSGL-1(또는 그의 도메인) 및 테스트 화합물의 반응 혼합물을 준비하는 단계를 포함한다. 사용되는 PSGL-1 종은 선별 분석의 목적에 따라 달라질 수 있다. 일부의 경우에는, 분석 시스템(예를 들면, 라벨링, 얻어진 복합체의 분리 등)에 장점을 제공하는 이형(heterologous) 단백질 또는 폴리펩타이드에 융합된 PSGL-1의 도메인에 해당하는 펩타이드를 이용하는 것이 바람직하다.

선별 분석은 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들면, PSGL-1 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합 단백질 또는 테스트 물질을 고체상에 부착시키는 단계, 및 반응 종료 시 고체상에 부착된 PSGL-1/테스트 화합물 복합체를 동정하는 단계를 포함하는 분석 방법을 수행할 수 있다. 그러한 방법의 한 구현형태에서, PSGL-1 반응물은 고체 표면에 부착될 수 있으며, 부착되지 않은 테스트 화합물은 직접 또는 간접적으로 라벨링될 수 있다.

실제, 미세적정 플레이트가 고체상으로서 편리하게 이용될 수 있다. 부착된 성분은 비공유 또는 공유 부착에 의하여 고정될 수 있다. 비공유 부착은 간단히 고체 표면을 단백질 용액으로 코팅하고 염색함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 고정할 단백질에 대해 특이적인 고정된 항체, 바람직하게는 단일클론성 항체를 고체 표면에 단백질을 부착시키는 데 사용할 수 있다. 표면은 미리 제조해 저장할 수 있다.

상기 분석의 실시를 위하여, 비고정 성분이 부착된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가된다. 반응 종료 후, 미반응 성분들은 형성된 임의의 복합체들은 고체 표면에 고정된 상태로 유지되는 조건 하에서 (예를 들면, 세척에 의하여) 제거되다. 고체 표면 상에 부착된 복합체의 검출은 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 사전 비고정 성분이 사전 라벨링된 경우, 표면 상에 고정된 라벨의 검출은 복합체가 형성되었음을 시사한다. 사전 비고정 성분이 사전 라벨링되지 않은 경우에는, 간접 라벨이 예를 들면, 사전 비고정 성분에 대해 특이적인 라벨링된 항체(라벨링된 항-Ig 항체로 직접 또는 간접 라벨링될 수 있는 항체)를 이용해 표면 상에 부착된 복합체를 검출하는 데 사용될 수 있다.

대안적으로, 반응은 미반응 성분들로부터 분리된 반응 산물 및 검출된 복합체, 예를 들면 용액 내에서 형성된 임의의 복합체를 부착시키는 PSGL-1 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합 단백질 또는 테스트 화합물에 대해 특이적인 고정된 항체, 및 부착된 복합체의 검출을 가능하게 하는 복합체의 다른 성분에 대하여 특이적인 라벨링된 항체를 이용해 액체상 내에서 실시될 수 있다.

대안적으로, PSGL-1과 상호작용하는 화합물을 동정하기 위하여 세포-기준의 분석을 이용할 수도 있다. 이러한 목적으로, PSGL-1을 발현하는 세포주, 또는 PSGL-1을 발현하도록 유전자 조작된 세포주를 이용할 수 있다. 세포 기준의 분석은 본 명세서에 제시한 선별에 의하여 동정된 화합물의 기능적 효과를 평가하는 데 특히 유용하다. 예를 들면, PSGL-1 단백질에 결합하는 능력을 기준으로 화합물이동정되면, 그 화합물은 예를 들면, 시험관내 또는 생체내에서 T 세포 세포자멸을 유도하거나, 시험관내 또는 생체내에서 T 세포를 고갈시키는 능력에 대해 테스트될 수 있다.

제약학적 조성물

본 발명의 목적은 개체 내에서 면역 반응을 변화시키는 것이라고 밝혔으나, 예를 들면 PSGL-1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, 소분자, 또는 기타화합물을 함유하는 제약학적 조성물도 본 발명의 특징이다. 바람직한 실시예에서, 상기 화합물은 PSGL-1의 작용제(agonist)로서 작용한다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 제약학적 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 1종 이상의 담체 또는 부형제를 이용해 통상의 방식으로 제형화될 수 있다. 따라서, 상기 화합물 및 그들의 생리학적으로 허용 가능한 염 및 용매물질은 다양한 투여 경로를 통한 투여용으로 제형화될 수 있다.

상기 화합물들은 주사, 예를 들면 환약 주사 또는 연속 주입에 의하여 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 보존제가 첨가된, 예를 들면 앰플과 같은 단일 투약 형태로 존재하거나, 또는 다중-투약 용기 내에 보관될 수 있다. 상기 조성물은 유계 또는 수계 부형체 내의 현탁액, 용액, 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정화제, 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 상기 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들면 살균 피로젠 무함유 수와 구성되기 위한 분말 형태일 수도 있다.

T 세포-매개의 면역 반응의 조절 및 T 세포 군집의 고갈 방법

본 명세서에 제시한 선별 분석에는 예를 들면, PSGL-1 폴리펩타이드에 의하여 매개되는 생물학적 기능의 조절 및/또는 과도한 또는 불필요한 면역 반응, 예를 들면, T 세포-매개의 면역 반응과 관련된 질환의 치료용으로 상세히 제시한 화합물이 유용할 수 있다. 이들 화합물은 비제한적으로 T 세포 표면 상의 PSGL-1에 결합하여 T 세포의 사망을 초래하는 신호 변환 경로를 유도하는 펩타이드, 항체 및 그의 단편, 및 기타 유기 화합물을 포함한다. 본 발명의 방법은 세포 표면 상의PSGL-1의 가교결합을 유도하는 가교결합제의 첨가를 선택적으로 포함한다. 본 명세서에 제시된 화합물들은 T 세포 활성의 고갈 또는 제거가 요구되는 경우에 유용할 수 있다. 본 발명의 화합물을 이용해 치료될 수 있는 특히 유용한 증상으로는 자가면역성 질환, 이식 거부반응, 알레르기성 질환, 및 T 세포 유래의 암이 포함된다.

본 명세서에 제시된 항-PSGL-1 화합물을 이용해 치료할 수 있는 증상의 예로는 비제한적으로, 당뇨병, 관절염(류머티스성 관절염, 아동 류머티스성 관절염, 골관절염 및 건선성 관절염 포함), 다발성 경화증, 뇌척수염, 중증 근무력증, 전신 낭창성 홍반, 자가면역성 갑상선염, 피부염(아토피성 피부염 및 습진성 피부염), 건선, 조그렌 증후군(Sjogren's Syndrome), 크론 증후군(Crohn's disease), 아프타 궤양, 홍채염, 결막염, 각막 결막염, I형 당료병, 염증성 내장 질환, 궤양성 대장염, 천식, 알레르기성 천식, 피부 낭창성 홍반, 경피증, 질염, 직장염, 약물 발진, 나병 전도 반응, 나병 결정 홍반, 자가면역성 포도막염, 알레르기성 뇌척수염, 급성 회사 출혈성 뇌질환, 특발성의 세균에 의한 진행성 신경 청각 손실, 무형성 빈혈, 순수 적혈구 세포성 빈혈, 특발성 저혈소판증, 다발연골염, 베게너의 그래뉼로말토시스(Wegener's granulomaltosis), 만성 활성 간염, 스티븐스-존슨 증후군(Stevens-Johnson syndrome), 특발성 탕구, 평평 태선, 그라브스병(Graves' disease), 유육종증, 초기 담즙 경화, 후부 포도막염, 간질성 폐섬유증, 이식편-대-숙주 질환, 골수 이식, 간 이식, 또는 임의의 기관 또는 조직의 이식과 같은 이식의 병상(동형 또는 이형 조직을 이용한 이식 포함), 아토피성 알레르기와같은 알레르기, AIDS, 및 백혈병 및/또는 림프종과 같은 T-세포 신생이 포함된다.

본 발명의 방법은 시험관내 또는 생체내 세포 군집으로부터 T 세포를 고갈시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들면 개체로부터 유래된 생물학적 샘플은 선택적으로 가교결합제와 함께 본 명세서에 제시된 항-PSGL-1 화합물과 샘플의 접촉에 의하여 시험관내에서 T 세포가 고갈될 수 있다. 이 방법은 예를 들면 세포 군집 내의 비-T 세포의 강화 및 세포 군집으로부터 T 세포 활성의 감소 또는 제거에 유용할 수 있다.

다음은 본 발명을 실시를 위한 실시예들이다. 이들 실시예는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예 1: 항-T 세포의 세포자멸 유도 단백질("TAIP") 단일클론성 항체의 제조

원하는 항체를 분비하는 하이브리도마를 생산하기 위해, 공지된 Kohler 및 Milstein의 세포 융합법((1976) European Journal of Immunology 6:511-519)을 적용하여 TAIP-특이성 단일클론성 항체를 제작하였다. 항체 분비 하이브리도마를 생성하도록, 콘카노발린 A(Concanovalin A, Con A)-활성화 Balb/c 비장 T 세포를 주사한 햄스터의 항체 형성 세포를 골수종 세포주와 융합시켰다. 상기 두 군집의 세포들을 폴리에틸렌 글리콜과 융합시키고, 그 결과 생성된 항체 형성 세포를 클로닝하여 표준 조직 배양법에 따라 증식시켰다. 상기 방법에 따라 제작한 하나의 하이브리도마에서 단일클론성 항체가 분비되었고, 이는 시험관내에서 T 세포의 세포자멸 및 체내에서의 T 세포 고갈을 유도할 수 있었으므로, TAB4라 지정하였다. 상기 TAB4에 의해 인식되는 단백질을 T 세포의 세포자멸 유도 단백질(TAIP)이라 지정하였다.

C57BL/6J(B6) 및 BALB/c 마우스들을 Jackson lab(Bar Harbor, ME)에서 입수하였다. 시리아 햄스터는 National Taiwan University Medical College의 Animal Core Facility에서 입수하였다.

상기 TAB4 하이브리도마의 농축 배양 상청액을 20,000xg로 10분간 원심분리하고, 그 상청액을 결합 완충액(0.1 M의 아세트산나트륨, pH 5.0)을 이용하여 1:1의 비로 희석시켰다. 단백질 G 칼럼(대략 1 ㎖의 충전 부피)을 3 내지 5 ㎖의 상기 결합 완충액으로 3회 세척하였다. 세척한 배양 상청액을 단백질 G 칼럼에 충전하고, 칼럼 통과물을 수집하여 이를 다시 상기 칼럼에 충전하였다. 상기 칼럼을 6 내지 10 ㎖의 결합 완충액으로 세척하고, 결합된 항체를 5 ㎖의 용리 완충액(0.1 M의 글리신-HCl, pH 2.8)으로 용리시켰다. 각 분획은 용리된 항체를 1 ㎖씩 함유하였고, 1 ㎖의 각 분획과 50 ㎕의 1M Tris-HCl(pH 7.5)를 혼합하고, 용리된 분획의pH를 중성으로 조정하였다. 상기 항체를 함유하는 분획들을 혼합해, 2 ℓ의 PBS, pH 7.4에 대해 매 회의 투석 시간을 3시간씩으로 하여 3회에 걸쳐 투석하였다. Bio-Rad 단백질 분석법(BIO-RAD, Hercules, CA)을 이용해 Bradford가 제시한 절차에 따라 상기 항체 샘플 내 단백질의 농도를 측정하였다.

실시예 2: 마우스의 비장 세포 현탁액 제조 및 T 세포의 활성화와 증식

마우스의 비장에 살균 커버 슬립으로 저민 8 ㎖의 HBSS(Hank's balanced salt solution)을 침윤시켜, 15 ㎖의 원심분리관(Costar)에 옮겨 넣고, 200xg로 5분간 원심분리하였다. 그 상청액을 폐기하고, 원심분리관벽을 가볍게 두드려 세포 펠릿을 잔존하는 완충액에 재현탁하였다. 오염시킨 적혈구(RBC)에 1 ㎖의 적혈구 용해 완충액(0.6 M의 NH₄Cl, 0.17 M의 Tris-염기, pH 7.65)을 첨가하여 용해시킨 뒤, 실온에서 2분간 배양한 다음, 9 ㎖의 HBSS와 함께 급속 냉각시켰다. 이들 세포를 200xg로 5분간 펠릿화하고, 2회 세척하여, RPMI 배지에 재현탁하였다. 혈구계(Cambridge Scientific Inc. 제조) 및 트리판 블루 배제법(Trypan blue exclusion)을 이용하여, 상기 혼합물 내 세포의 농도 및 생육성을 평가하였다.

RPMI 배지에서의 상기 비장 세포의 최종 농도가 3×10⁶/㎖가 되도록 조정하고, 그 최종 농도가 2 ㎍/㎖가 되도록 콘카노발린 A를 첨가하여 T 세포를 활성화하였다. 상기 세포 현탁액을 6-웰 플레이트(5 ㎖/웰) 또는 10㎝ 배양 디쉬(10 ㎖/디쉬)에 옮기고, 37℃, 5% CO₂하에서 48시간 동안 배양하여 수집하였다. 활성화된 T 세포를 포함하는 활성화된 비장 세포들을 5 ㎖의 HBSS에 재현탁하고, 원심분리관내 5 ㎖, 55%의 Percoll 용액 쿠션의 정상에 조심스럽게 덮었다. 이 때, 분리층이 붕괴되지 않도록 주의하였다. 상기 세포를 25℃에서 제동하지 않고 1,900xg로 13분간 원심분리하였다. 증식시킨 T 세포를 두 층의 계면에서 수집하여 HBSS로 2회 세척하여 실험을 준비하였다.

실시예 3: 활성화된 T 세포의 세포자멸

활성화 T 세포(실시예 2 참조)를 최종 농도가 5×10⁵셀/㎖이 되도록 5 ng/㎖의 IL-2를 함유하는 RPMI 배지에 재현탁하고, 표 1에 나타낸 조건에 따라 대조군 Ig, TAB4 또는 항-CD3으로 처리하였다.

[표 1]

실험군	처리^*
음성 대조군	3 ㎍/㎖의 햄스터 Ig5 ng/㎖의 IL-23 ㎍/㎖의 가교 항체(항-햄스터 Ig)
TAB4	3 ㎍/㎖의 TAB4 햄스터 mAb5 ng/㎖의 IL-23 ㎍/㎖의 가교 항체(항-햄스터 Ig)
양성 대조군	1 ㎍/㎖의 항-CD3 mAb5 ng/㎖의 IL-21 ㎍/㎖의 가교 항체(항-마우스 Ig)
^*: 배지 내 지정된 반응제의 최종 농도

이를 18 내지 24 시간 주기로 배양한 뒤, 7-AAD 세포자멸 분석법을 이용하여 각 배양물 내의 세포자멸 정도를 평가하였다. 처리된 세포를 FACS 튜브(Falcon)으로 옮기고, 차가운 FACS 용액(PBS 내 1% 소의 태아 혈청, 0.05%의 소듐 아자이드)으로 2회 세척하고, 4℃에서 200xg로 펠릿화 하였다. 상기 세포들의 최종 농도가1-2×10⁷세포/㎖가 되도록, 차가운 FACS 용액 내에 재현탁하였다. 이 재현탁된 세포들을 염색하기 위하여, 0.1 ㎖의 이들 세포를 7-AAD와 혼합하여 최종 농도가 2 ㎍/㎖가 되도록 하고, 이어서 4℃의 암실에서 20분간 배양하였다. 끝으로, 염색된 세포들을 차가운 FACS 용액으로 2회 세척하고, 0.5 ㎖의 FACS 용액 내에 재현탁하고, BD LSR 흐름 세포계측기(Beckton Dickison 제조)로 분석하였다.

도 1은 활성화 T 세포가 TAB4(항-TAIP)-매개의 세포자멸 신호에 대한 감수성을 얻는 시간을 조사하기 위한 대표적인 시간 경과 실험의 결과를 나타낸다. 마우스의 비장세포를 Con-A로 활성화하고, IL-2 함유 배지에 유지시켰다. 상기 활성화된 T 세포를 배양하여 재현탁하고, TAB4 단일클론성 항체 또는 가교결합제로서 항-햄스터 IgG 항체의 존재 하에 대조군 햄스터 IgG를 상기 활성화된 T 세포에 투여하였다. 투여 첫째 날에는, 낮은 수준(6.5%)의 세포자멸성 세포사를 유도하는 TAIP 가교 능력이 확실하게 나타났다. 그러나, TAB4로 유도한 세포의 세포자멸 정도는 투여 2일째에 17%로 증가하였고, 4일째에 52%로 정점에 달했다가, 6일째에 44%로 감소하였다. 단지, IL-2만은 처리한 배양물과 비교할 때, 대조군인 상기 햄스터 IgG는 특이적으로 세포자멸성 T 세포의 사망을 유도하지 않았다. 항-CD3(양성 대조군)은 48시간의 활성화 이후, 38%의 T 세포의 세포자멸을 유도하였다(데이터는 나타내지 않음).

실시예 4: 상이한 조직 내에서의 TAIP 항원의 발현

차가운 FACS 용액(PBS 내 1%의 소의 태아 혈청, 0.05%의 소듐 아자이드)으로2회 세척하고, 4℃의 FACS 튜브(Falcon) 내에서 200xg로 펠릿화 하였다. 상기 세포들을 최종 농도가 1×10⁷세포/㎖이 되도록 차가운 FACS 용액 내에 재현탁하고, 각 분석에 FACS 튜브(Falcon) 내의 재현탁된 세포 분액 0.1 ㎖을 사용하였다. 이들의 표면을 염색하기 위해, 최종 농도 2 ㎍/㎖가 되도록 상기 세포들에 TAB4 단일클론성 항체 또는 대조군인 햄스터 Ig를 첨가하고, 이 혼합물을 4℃ 암실에서 30분간 배양시켰다. 상기 세포들을 차가운 FACS로 1회 세척하고, 이어서 (1) 비장 세포들은 차가운 100 ㎕ FACS 용액 내의 사이크롬-접합된 항-CD3 항체(2 ㎍/㎖), FITC-접합된 항-햄스터 Ig, 및 PE-접합된 항-CD8/CD4/CD19/CD11b/pan-NK/I-A/I-E/Mac-3 항체(2 ㎍/㎖)를 이용해 염색하고, (2) 가슴샘 세포들은 차가운 100 ㎕의 FACS 용액 내의 FITC-접합된 항-햄스터 Ig, PE-접합된 항-CD8, 및 사이크롬-접합된 항-CD4 항체(2 ㎍/㎖)를 이용하여 염색하였다. 상기 반응을 4℃ 암실에서 30분간 수행하였다. 끝으로, 염색된 세포들을 차가운 FACS 용액으로 2회 세척하고, 1 ㎖의 FACS 용액 내에 재현탁하여, BD LSR 흐름 세포계측기(Beckton Dickison 제조)를 이용하여 분석하였다.

도 3 및 도 4는 FACS 분석에 따른, 다양한 하위 군집의 비장세포 및 가슴샘 세포에 대한 TAIP 항원의 분포를 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이, CD19⁺B 세포는 적게 발현하였지만, 그 표면 상의 TAIP 단백질의 양은 검출 가능하였다. CD3⁺T 세포 및 NK 세포의 분획에서 다량의 TAIP 단백질이 검출되었다. CD4⁺, CD8⁺및CD4⁺8⁺가슴샘 T 세포의 대부분은 다량의 TAIP 단백질을 발현하였다. 반면, TAIP 단백질은 단지 CD4^-8^-가슴샘 T 세포의 소군집에서만 발현되었다(도 4).

뇌, 가슴샘, 심장, 폐, 간, 위, 신장, 비장 및 피부를 포함하는, B6 및 BALB/c 마우스에서 얻은 조직을 수집하고, 10% 포름알데하이드로 실온에서 하룻밤 동안 고정하고, 파라핀 블록 내에 통합하였다. Leica RM 2135 마이크로톰을 이용하여 상기 파라핀 블록으로부터 4 ㎛ 두께의 조직 절편을 준비하고, 45℃ 물에 분산시킨 뒤, 코팅된 슬라이드 위에 놓았다. 이 슬라이드를 37℃에서 건조시켜 다음 실험을 준비하였다.

상기 조직의 파라핀 절편을 함유하는 슬라이드에서 왁스를 제거하고, 표준 프로토콜에 따라 자일렌-100% 에탄올을 차례로 통과시켜 건조하고, 끝으로 100% 에탄올 내에 보관하였다. 상기 절편들을 최종 PBS 용액에 대한 표준 프로토콜에 따라 100% 에탄올-90% 에탄올-85% 에탄올-70% 에탄올-PBS로 차례로 통과시켜 재수화하였다. 이하의 반응은 모두 습한 상자 내에서 수행하였다. 차단 완충액(1%의 일반 염소 혈청) 내의 상기 조직 절편들을 실온에서 1시간 동안(또는 4℃에서 하룻밤 동안) 배양하고, 상기 조직 절편들의 비특이적 결합을 차단하였다. 상기 차단 완충액을 제거하고, 상기 조직에 TAB4 또는 일반 햄스터 Ig(1:200로 희석)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안(또는 4℃에서 하룻밤 동안) 계속 배양하였다. 상기 절편들을 PBS 내에서 매회 5분간 2회 세척하여 1차 항체를 제거하고, 1:250의 비로 희석한 알칼리성 포스파타아제-접합된 염소의 항-햄스터 Ig와 반응시켜, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 다시, 상기 절편들을 PBS로 매회 5분간 2회 세척하여, 항체-효소 접합체를 제거하고, BCIP/NBT 기질 용액을 이용하여 실온의 암실 내에서 30분간 색상 반응을 전개하였다. 상기 절편들을 다시 PBS로 세척하여 과잉 효소 기질을 제거하고, PBS-에탄올-자일렌으로 차례로 통과시켜 탈수한 뒤, 현미경 상에 탑재시켰다.

그 결과, TAIP 단백질이 실험에 이용된 조직들 중 골수 유래의 조직에서만 발현된 것으로 나타났다.

실시예 5: 세포 표면의 바이오틴화 및 TAIP 항체의 면역침전

5×10⁷RL♂1 또는 NIH-3T3 세포를 얼음 중탕 중의 0.5 ㎎/㎖ 설포-NHS-바이오틴(Pierce)을 포함하는 1 ㎖의 PBS 내에서 30분간 표면 바이오틴화하였다. 상기 세포들을 0.5 ㎖의 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Life Technologies, Inc.)과 함께 얼음 중탕으로 10분 동안 배양한 뒤, 반응을 종료하였다. 상기 세포들을 1 ㎖의 DMEM으로 1회 세척한 다음, 1 ㎖의 PBS(phosphate-buffered saline)로 2회 세척하였다.

라벨링된 세포들을 5.0×10⁷세포/㎖의 밀도로 완전 단백분해효소 억제제 칵테일(Roche)을 함유하는 차가운 용해 완충액(1% Triton X-100, 20 mM의 Tris-HCl, pH 8.0, 160 mM NaCl, 1 mM의 CaCl₂)을 이용하여 15분간 용해시키고, 불용성 물질을 10,000xg로 10분간 펠릿화하였다. 이들 단계 및 후속의 모든 단계들은 4℃에서 수행하였다. 면역침전 시, 용출물을 50 ㎕의 충전된 단백질 G-세파로오즈(AmershamPharmacia Biotech)와 함께 사전 배양하고, 비특이적으로 결합하는 단백질을 제거하였다. 비드를 펠릿화하고, 상기 상청액 분액(통상적으로 5.0×10⁷개의 세포에 해당함)을 일반 햄스터 혈청에서 얻은 10 ㎍의 mAb TAB4 또는 IgG로 미리 충전된 20 ㎕의 단백질 G-세파로오즈와 함께 배양하였다. 이를 4℃에서 4 시간 동안 배양한 다음, 그 수지를 세척 완충액(0.05%의 Triton X-100, 50 mM의 Tris-HCl, pH 8.5, 400 mM의 NaCl, 1 mM의 CaCl₂, 1 ㎎/㎖의 오브알부민)을 이용하여 4회 세척하고, 상기 400 mM의 NaCl 대신 250 mM의 NaCl을 함유하는 동일 세척 완충액을 사용하여 2회 세척하였다. TAB4와 특이적으로 결합한 단백질을 50 ㎕의 1×SDS 샘플 완충액으로 용리시켰다. 용리된 단백질을 8%의 SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로오즈막(Millipore)으로 옮겼다. 여과물을 퍼옥시다아제-접합된 아비딘(Avidin)(PharMingen)을 이용하여 바이오틴화된 단백질에 대하여 분석하고, 화학발광제(Chemiluminescence reagent, NEN^TMLife Science Products)로 전개시켰다.

도 2에 나타낸 바와 같이, TAB4에 의해 RL□1 세포(TAIP⁺T 세포) 내에서는 분자량이 약 120 kD인 바이오틴화 표면 단백질이 확인되었으나, 3T3 세포(TAIP^-세포)에서는 확인되지 않았다. 반면, 햄스터의 일반 혈청으로 코팅된 단백질 G 세파로오즈는 120 kDa의 단백질을 회수할 수 없었다. 이들 결과는 120 kDA의 단백질은 T 세포의 표면에서 단일클론성 항체 TAB4에 의해 항원으로 인식됨을 시사한다.

실시예 6: 생체내 T 세포의 고갈

생체내 T 세포 및 기타 세포들 군집에 대한 TAB4의 효과를 조사하기 위하여, 마우스들에게 300 ㎍의 TAB4 또는 대조군 햄스터 Ig를 복강 내 주사하고, 전체 세포의 개수 조사 및 FACS에 의한 세포 표면 표지 분석을 위하여 주사 4일 뒤, 비장 세포, 가슴샘 세포 및 말초혈액 단핵 세포를 수집하였다.

FACS 분석을 위하여, 상기 세포들을 4℃에서 2%의 파라포름알데하이드로 20분간 고정하고, 2회 세척하여, 차가운 FACS 용액에 최종 농도가 1×10⁷셀/㎖가 되도록 재현탁하였다. 각각의 분석에는 상기 FACS 튜브(Falcon) 내의 재현탁 세포 분액 100 ㎕를 사용하였다. 최종 농도 2 ㎕/㎎가 되도록 TAB4 또는 대조군인 햄스터 Ig를 상기 세포에 첨가하고, 그 혼합물을 4℃의 암실에서 30분간 배양시켰다. 상기 세포들을 차가운 FACS로 1회 세척하고, (1) 비장 세포은 차가운 100 ㎕의 FACS 용액 내에 사이크롬-접합된 항-CD3 항체(2 ㎍/㎖), FITC-접합된 항-햄스터 Ig, 및 PE-접합된 항-CD8/CD4/CD19/CD11b/pan-NK/I-A/I-E/Mac-3 항체(2 ㎍/㎖)와 반응시키고, (2) 가슴샘 세포들은 차가운 100 ㎕의 FACS 용액 내에 FITC-접합된 항-햄스터 Ig, PE-접합된 항-CD8, 및 사이크롬-접합된 항-CD4(2 ㎍/㎖)와 반응시켰다. 상기 반응을 4℃의 암실에서 30분간 수행하였다. 끝으로, 염색된 세포를 차가운 FACS 용액으로 2회 세척하고, 1,000 ㎕의 FACS 용액 내에 재현탁하고, BD LSR 흐름 세포계측기(Beckton Dickison 제조)를 이용하여 분석하였다.

주사 4일 후, 말초혈액 백혈구(PBL)에서 CD3⁺T 세포의 백분율은 대조군 마우스에서의 36.7%부터 TAB4로 처리한 마우스에서의 4.1%까지 감소하였다(표 2). TAB4 처리는 비장세포의 총수를 다소 감소시켰다. 그러나, TAB4로 처리한 마우스에서는 CD3⁺T 세포수는 62%, NK 세포수는 50% 감소하였고, CD19+B 세포의 총수는 약간 증가하였다. TAB4-처리된 마우스에서 회수된 전체 가슴샘 세포수는 대조군에서 나타난 수준의 단지 48%이었다(52% 감소). 또한, CD4+T 세포를 제외한, 모든 CD8+, CD4+CD8+ 및 CD4-CD8-T 세포가 감소하였으며, CD4+CD8+ 하위 군집이 크게 영향을 받았다(64.7% 감소),.

[표 2]

비장
×10⁶	비처리	일반 햄스터 Ig	TA-B4 처리	고갈율(%)
전체 비장 세포	123	93.3	105	14.6
CD3⁺T 세포	32.8	28.4	12.4	62.2
CD3^-CD19⁺	72.2	53.4	72.9	-0.8
CD3^-NK⁺	3.6	5.4	1.80	50

말초혈액 백혈구
	비처리	일반 햄스터 Ig	TA-B4 처리	고갈율(%)
CD3⁺T 세포	36.7%	36%	4.1%	88.8%

가슴샘
×10⁶	비처리	일반 햄스터 Ig	TA-B4 처리	고갈율(%)
전체 가슴샘 세포	94	229	45	52.1
CD4⁺	9.3	28.4	10.9	-16.6
CD8⁺	5.2	7.7	3.6	30.3
CD4⁺CD8⁺	73.8	182	23	64.7
CD4^-CD8^-	5.6	10.5	4.5	19.3

(3회 실험에서 얻은 대표 데이터)

실시예 7: 항-TAIP 항체는 IL-2 또는 TNF-α의 분비를 유도하지 않음

Balb/c 마우스(H-2d)에 300 ㎍의 TAB4 또는 대조군 햄스터 Ig와 함께 복강 내 주사하였다. 주사한지 7일 후, 비장세포를 분리하고 미토마이신 C로 처리된 C3H(H-2K) 비장세포(자극제로서)와 함께, 배양액 내 반응자로 사용하였다. 3일 뒤, 배양 상청액을 수확하고, ELISA 세트(PharMingen)로 IL-2 함량을 측정하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 TAB4로 처리된 마우스에서 유래된 반응자 세포에서는 대조군 마우스에 비해 IL-2의 생성이 억제되었다. 또한, IL-2 및 TNF-a의 혈장 수준을 분석한 결과, 대조군 및 TAB4로 처리된 마우스의 혈청에서는 IL-2(또는 TNF-a)의 수준에서 유의한 차이가 나타나지 않았다. IL-2의 생성은 T 세포 활성에 중추적이기 때문에, 상기 결과를 통해, TAB4와 같은 TAIP-특이성 항체가 생체내에서 자가면역 질환 및 이식 거부반응과 관련된 T 세포 및 대조군의 불필요한 T-세포 매개의 면역 반응을 조절하는데 사용될 수 있음을 확인할 수 있다.

실시예 8: 이식 거부반응을 예방하기 위한 항-TAIP 항체의 용도

8주령 내지 12주령의 마우스(Jackson Laboratory에서 입수함)를 아세프로마진 말레에이트(Acepromazin maleate, Fermenta Animal Health Co., Kansas City, MO)로 마취시켰다. 상기 마우스에 피부 이식을 수행하기 7일 전에, 흉선을 절제하지 않은 수령체 C57BL/6 마우스(H-2^b)에 500 ㎍의 TAB4 또는 동형 대조용 항체를 복강 내 투여하였다. 투여 7일 뒤, 항체로 사전 처리한 C57BL/6 마우스들의 외측 옆구리에 완전한 이형의 미스매치 Balb/cj 마우스(H-2^d)들의 외측 옆구리 피부를 이식하였다. 이식 7일 후, 상기 마우스들에게 다시 500 ㎍의 TAB4 또는 동형 대조용 항체를 주사하였다. 이식 후, 상기 마우스들을 매일 관찰하였다. 상기 이식은 공여체 피부의 50%가 괴사한 경우 거부된 것으로 간주하였다. 도 7은 이식 생존률을 나타낸다(n=8). 상기 데이터는 TAB4 항체 처리가 동종이형 피부 이식편의 생존을 연장시킴을 보여준다.

실시예 9: PSGL-1로서의 TAIP의 동정

CD162라고도 명명된 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)은 T 세포를 포함하는 백혈구 상에서 발현되는 주요 P-셀렉틴 리간드이다(Sako 외(1993) Cell 75:1179; Vachino 외(1995)J. Biol. Chem. 270:21966; Veldman 외(1995)J. Biol. Chem. 270:16470). TAIP의 분자량 및 다이머화 경향과 같은 그의 생화학적 특성은 TAB4가 PSGL-1과 유사할 수 있다. 이들 두 항원간의 관계를 조사하기 위하여, 1) TAB4에 의해 침전된 항원이 상업적으로 입수 가능한 항-PSGL1 항체에 의해 인식될 수 있는지, 및 2)항-PSGL-1 항체가 세포 융출물로부터 TAB4를 고갈시킬 수 있는지의 여부를 테스트하였다.

RL♂1 T 세포를 1.0×10⁸세포/㎖의 밀도로 프로테아제 저해제 칵테일을 함유하는 용해 완충액(1%의 Triton X-100, 20 mM의 Tris-HCl, pH 8.0, 160 mM의 NaCl, 1 mM의 CaCl₂)을 이용하여 1시간 동안 용해시키고, 불용성 물질을 10,000xg로 10분간 펠릿화하였다. 상기 단계와 그 후속의 단계들은 모두 4℃에서 수행하였다. 5.0×10⁷개의 세포에 해당하는 융출물을 10 ㎍의 항-PSGL-1 mAb(클론 2PH1,PharMingen, San Diego, CA), 항-TAIP mAb, TAB4, 또는 일반 햄스터의 혈청에서 얻은 IgG를 미리 충전한 20 ㎕의 단백질 G-세파로오즈와 함께 배양하였다. 이들을 4℃에서 4시간 동안 배양한 뒤, 세척 완충액(0.05%의 Triton X-100, 50 mM의 Tris-HCl, pH 8.5, 400 mM의 NaCl, 1 mM의 CaCl₂, 1 ㎎/㎖의 오브알부민)을 사용하여 상기 비드들을 5회 세척하고, 상기 400 mM의 NaCl 대신 250 mM의 NaCl을 함유하는 동일한 세척 완충액을 사용하여 다시 2회 세척하였다. 결합된 단백질을 40 ㎕의 1×SDS 샘플 완충액으로 용리하였다. 용리된 단백질을 6%의 SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로오즈막으로 이동시켰다. 상기 막을 항-PSGL-1 mAb으로 면역블롯하고, 퍼옥시다아제-접합된 염소 항-래트 IgG(H+L) 및 이어서 화학발광제(Renaissance, NEN)를 이용해 가시화하였다.

표면 바이오틴화된 RL♂1 T 세포를 1.0×10⁸세포/㎖의 밀도로 용출 완충액 내에서 용출시켰다. 상기 세포 추출물을 4℃에서 하룻밤 동안 40㎕의 단백질 G-세파로오즈에 결합된 20 ㎍의 항체와 함께 배양하였다. 고갈은 항-PSGL-1 mAb(2PH1) 또는 대조군 래트의 IgG와, TAB4 또는 대조용 일반 햄스터 혈청을 이용하여 실시하였다. 고갈된 용출물에 각각 TAB4 또는 항-PSGL-1-mAb를 이용하여 추가로 면역침전을 수행하였다. 그 면역침전물을 6%의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 분리시키고, 형광법(fluorography)으로 검출하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 항-PSGL-1 항체는 T 세포 용출물로부터 TAIP 단백질을 고갈시킬 수 있다. 아울러, 항-TAIP 항체(TAB4)로 면역침전된 단백질은 웨스턴 분석에 의해 항-PSGL-1 항체에 의해 인식될 수 있다.

실시예 10: 항-PSGL-1 항체에 의한 인간 T 세포 내에서의 세포자멸의 유도

인간 T 세포의 세포자멸에서 PSGL-1가 담당하는 역할을 확인하기 위하여, 활성화된 인간 T 세포가 PSGL-1-매개의 세포자멸 신호에 대한 감수성을 획득할 때를 조사하기 위하여 시간-경과 실험을 수행하였다. 인간 T 세포를 식물적혈구 응집소(PHA: phytohemagglutinin) 미토겐으로 자극하고, IL-2를 함유하는 배지 내로 확장시켰다. 활성화된 T 세포를 수집한 뒤, IL-2 및 가교 항체의 존재 하에 항-PSGL-1를 투여하였다.

건강한 성인으로부터 말초혈액을 채취하고, 헤파린을 첨가한 뒤, Ficoll-Paque Plus(Pharmacia Biotech)를 이용하여 차별적인 밀도를 기준으로 말초혈액의 단핵 세포(PBMC)를 보강하였다. 상기 PBMC를 1%의 PHA(Life Technologies, GibcoBRL)로 48시간 동안 활성화하고, 이어서 분석기간 동안 인간 재조합 IL-2(5 ng/㎖) 내에 유지시켰다. 항-인간 PSGL-1 항체의 세포자멸 유도 능력을 평가하기 위하여, 활성화된 세포를 (1) 1㎍의 항-PSGL-1 항체 클론 KPL-1(BD PharMingen)과 가교결합제인 토끼의 항-마우스 Ig(0.5 ㎍/㎖)(Jackson ImmunoResearch Laboratories); (2) 가교결합제인 토끼 항-마우스 Ig와 결합된 동형의 대조용 정제 마우스 Ig; 또는 (3) 가교결합제인 토끼의 항-마우스 Ig 단독으로 처리하였다. 처리 6시간 후, 항-아넥신 V(Annexin V, BD PharMingen) 및 PI(Sigma)로 염색하는 FACS에 따라 초기 세포자멸 세포의 백분율을 측정하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 항-PSGL-1 항체와 가교결합제를 이용하여 PSGL-1에 의해 유발되는 신호화는 PHA-활성화된 인간 PBMC(대개 T 세포) 내에서 유의한 수준의 세포자멸을 유발하였다. 항-PSGL-1 처리된 배지 내에서의 세포자멸성 세포의 백분율은 제3일째에 8.5%에서 제8일째에 24%로 증가하였다. 동형-매치된 대조군 및 단독 가교 항체 모두 이들 세포들에 아무런 영향을 주지 않았다.

실시예 11: 자가면역성 질환을 치료하기 위한 항-PSGL-1의 용도

자가면역성 당뇨병에 잘 걸리는 동물인 NOD-비만 마우스를 표준 조건 하에서 사육하였다. 약 20주령의 NOD 마우스에 자발성 당뇨병을 발병시켰다. 실험군으로서, 마우스에 항-PSGL-1 항체(TAB4)를 14, 15 및 17주령의 마우스 당 300 ㎍을 3회에 걸쳐 복강 내 수여하였다. 24주령 및 26주령의 마우스에게는 상기와 동일한 양으로 2회 더 추가 주사하였다. 대조군에는 상기와 동일한 양으로 햄스터 Ig를 수여하였다. 이 마우스들이 15주령이 된 이후에, 메디-테스트 글루코오스 스트립(Macherey-Nagel, 독일)에 의해 당뇨(glucose uria)를 매주 2회 모니터링하였다. 비단식 요당 수준이 2회 연속 측정값으로 300 ㎎/㎗ 이상 경우는 당뇨병으로 간주하였다.

도 9에 나타낸 바와 같이, TAB4(항-PSGL-1) 항체 처리군은 대조군의 항체 처리와 비교해 유의한 보호효과를 나타내었다. 따라서, 항-PSGL-1 항체 처리군은 자가면역성 T 세포를 억제할 수 있고, I형 당뇨병의 발병을 지연시킬 수 있다.

기타 구현형태

본 발명의 구현형태는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 발명의 양태, 장점 및 변형은 이하의 청구의 범위에포함된다.

Claims

개체 내에서 T 세포-매개의 면역 반응을 예방 또는 감소시키는 방법에 있어서,

과도한 또는 불필요한 T 세포-매개의 면역 반응을 특징으로 하는 증상을 가지거나 가질 위험이 있을 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계; 및

상기 T 세포 표면 상에 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)에 결합하는 화합물을 상기 개체에 투여하는 단계

를 포함하고, 상기 T 세포 표면 상의 PSGL-1에 대한 화합물의 결합이 상기 T 세포의 사망을 초래하는 신호 변환 경로를 유도함으로써, 상기 개체 내에서 T 세포-매개의 면역 반응을 예방 또는 감소시키는 방법.
제1항에 있어서,

상기 화합물이 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법.
제1항에 있어서,

상기 화합물이 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 단일클론성 항체인 방법.
제3항에 있어서,

상기 단일클론성 항체에 결합하여 T 세포 표면 상의 복수의 PSGL-1 항원의 가교결합을 유도하는 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 방법은 상기 T 세포 표면 상의 복수의 PSGL-1 항원의 가교결합을 유도하는 단계를 포함하고, 상기 가교결합은 T 세포의 사망을 초래하는 신호 변환 경로를 유도하는 방법.
제1항에 있어서,

자가면역성 질환을 가지는 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서,

동종(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic) 이식편을 수령하거나 수령할 것으로 기대되는 개체를 선별하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서,

알레르기성 질환을 가지는 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서,

T 세포 암을 가지는 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 T 세포가 활성화된 T 세포인 방법.
제1항에 있어서,

상기 T 세포가 CD4+ T 세포인 방법.
제1항에 있어서,

상기 T 세포가 CD8+ T 세포인 방법.
제1항에 있어서,

상기 방법이 상기 화합물을 투여하기 전에 상기 개체로부터 채취한 제1 생물학적 샘플 내의 T 세포의 수를 검출하는 단계; 및 상기 결과를 상기 화합물을 투여한 후에 상기 개체로부터 채취한 제2 생물학적 샘플 내의 T 세포의 수와 비교하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 방법이 상기 화합물을 투여하기 전에 상기 개체로부터 채취한 제1 생물학적 샘플 내의 T 세포의 생물학적 활성을 검출하는 단계; 및 상기 결과를 상기 화합물을 투여한 후에 상기 개체로부터 채취한 제2 생물학적 샘플 내의 T 세포의 생물학적 활성과 비교하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 투여가 상기 개체 내의 말초혈액 CD3+ 세포의 적어도 20%의 고갈을 초래하는 방법.
제2항에 있어서,

상기 항체 또는 항원 결합 단편이 상기 항체 또는 항원 결합 단편에 노출된 후 상기 개체 내의 말초혈액 CD3+ 세포의 적어도 20%의 사망을 유도하는 방법.
T 세포 또는 천연 킬러(NK) 세포의 사망을 유도하는 방법에 있어서,

표면 상에 PSGL-1을 발현시키는 T 세포 또는 NK 세포를 제공하는 단계; 및

상기 T 세포 또는 NK 세포와 이들 세포 표면의 PSGL-1에 결합하는 화합물을 접촉시키는 단계

를 포함하고, 상기 T 세포 또는 NK 세포 표면 상에 PSGL-1에 대한 상기 화합물의 결합이 T 세포 또는 NK 세포의 사망을 초래하는 신호 변환 경로를 유도하는 방법.
제17항에 있어서,

상기 화합물이 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법.
제17항에 있어서,

상기 화합물이 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 단일클론성 항체인 방법
제19항에 있어서,

상기 단일클론성 항체를 상기 단일클론성 항체에 결합하여 상기 T 세포 또는 NK 세포 표면 상의 복수의 PSGL-1 항원의 가교결합을 유도하는 제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제17항에 있어서,

상기 방법은 상기 T 세포 또는 NK 세포 표면 상의 복수의 PSGL-1 항원의 가교결합을 유도하는 단계를 포함하고, 상기 가교결합은 T 세포 또는 NK 세포의 사망을 초래하는 신호 변환 경로를 유도하는 방법.
제17항에 있어서,

상기 세포가 활성화된 T 세포인 방법.
제17항에 있어서,

상기 세포가 CD4+ T 세포인 방법.
제17항에 있어서,

상기 세포가 CD8+ T 세포인 방법.
제17항에 있어서,

상기 방법이 상기 화합물과 접촉시킨 후의 상기 T 세포 또는 NK 세포의 생존력을 평가하는 단계를 포함하는 방법.
제17항에 있어서,

상기 방법이 상기 화합물과 접촉시킨 후의 상기 T 세포 또는 NK 세포의 생물학적 활성을 평가하는 단계를 포함하는 방법.
PSGL-1 기능의 조절자를 선별하는 방법으로서,

표면 상에 PSGL-1을 발현시키는 세포를 제공하는 단계;

상기 세포와 테스트 물질을 접촉시키는 단계; 및

상기 세포와 테스트 물질을 접촉시킨 후 세포의 생존력을 측정함으로써, 상기 테스트 물질이 PSGL-1 기능의 조절자인지의 여부를 결정하는 단계

를 포함하는 방법.
제27항에 있어서,

상기 테스트 물질에 의하여 유도되는 세포의 사망을 검출함으로써, 상기 테스트 물질이 PSGL-1 기능의 조절자인지의 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제28항에 있어서,

상기 테스트 물질이 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법
제28항에 있어서,

상기 테스트 물질이 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 단일클론성 항체인 방법.
제30항에 있어서,

상기 단일클론성 항체를 상기 단일클론성 항체와 결합하여 상기 세포 표면 상의 복수의 PSGL-1 항원의 가교결합을 유도하는 제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제28항에 있어서,

상기 방법은 상기 세포 표면 상의 복수의 PSGL-1 항원의 가교결합을 유도하는 단계를 포함하고, 상기 가교결합은 상기 세포의 사망을 초래하는 신호 변환 경로를 유도하는 방법.
제28항에 있어서,

상기 세포가 활성화된 T 세포인 방법.
제28항에 있어서,

상기 세포가 CD4+ T 세포인 방법.
제28항에 있어서,

상기 세포가 CD8+ T 세포인 방법.
제28항에 있어서,

상기 테스트 물질을 대량 생산하는 단계 및 제약학적으로 허용 가능한 담체 내에 상기 테스트 물질을 제형화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
T 세포 표면 상의 PSGL-1에 결합하는 화합물로서, 이러한 T 세포 표면 상의 PSGL-1으로의 결합이 상기 T 세포의 사망을 초래하는 신호 변환 경로를 유도하는 화합물; 및

자가면역, 이식 거부반응, 알레르기성 증상, 또는 T 세포 암을 치료하기 위하여 상기 화합물을 사용하기 위한 설명서

를 포함하는 키트.