ES2387156B1

ES2387156B1 - Uso de psgl-1 para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes

Info

Publication number: ES2387156B1
Application number: ES201031782A
Authority: ES
Inventors: Norman Andrés NUÑEZ ANDRADE; Ana Carmen URZAINQUI MAYAYO; Francisco SÁNCHEZ MADRID
Original assignee: Universidad Autonoma de Madrid
Current assignee: Universidad Autonoma de Madrid
Priority date: 2010-12-01
Filing date: 2010-12-01
Publication date: 2013-07-04
Anticipated expiration: 2030-12-01
Also published as: ES2387156A1

Abstract

La invención se relaciona con el uso de PSGL-1, un polinucleótido que codifica PSGL-1 ó un agente activador de PSGL-1 para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad inflamatoria y/o una enfermedad autoinmune. Asimismo, la invención se relaciona con el uso de un animal deficiente en PSGL-1 como modelo de enfermedades inflamatorias y autoinmunes.

Description

USO DE PSGL-1 PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES

INFLAMATORIAS Y AUTOINMUNES

CAMPO DE LA INVENCIÓN

S: La invención se relaciona con el uso de PSGL-l o un agente activador de PSGL-l

para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad inflamatoria y/o una enfermedad

autoinmune. Asimismo, la invención se relaciona con el uso de un animal transgénico

deficiente en PSGL-I como modelo de enfennerlades inflamatorias y autoinmunes.

10: ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las células inmunitarias innatas (incluyendo granulocitos, macrófagos, células

dendríticas (CD) y linfocitos citolíticos naturales (NK o nG/llral killer) residen en la

mucosa intestinal y secretan citocinas y quimiocinas que son cruciales para la regulación

de las respuestas inmunitarias innata y adaptativa en condiciones de estado estacionario y

15: durante la inflamación. Las enfermedades inflamatorias del intestino (EH) son

enfermedades inflamatorias crónicas del intestino que se desarrollan como resultado de

una respuesta inmunitaria desregulada frente a bacterias comensales. Ejemplos de

enfermedades inflamatorias crónicas son la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis

ulcerosa (CU), que son trastornos inflamatorios autoinmunitarios crónicos, de etiología

20: desconocida y que afectan a la mucosa intestinal.

Los procesos inflamatorios dependen del reclutamiento y la activación de células

inmunitarias, lo que a su vez requiere la formación de contactos intercelulares en los que

participan moléculas de adhesión celular. El ligando l de la glicoproteína selectina P

(PSGL-I) es un ligando de seleclinas P, E Y L, Y puede mediar el contacto (telherillg) y

25: rodamiento (rollillg) de leucocitos ci rculantes sobre el endotelio activado antes de su

extravasación (Carlow O el al. lmmunological Reviews 2009; 230 :75-96). Se ha

mostrado que la asociación de PSGL-I a sus ligandos o a un anticuerpo anti-PSGL-I

específico inicia señales intracelulares en leucocitos que inducen la activación de

factores de transcripción , tales como cFos, alterando así el estado de activación

30: leucocitaria, y facilitando su adhesión finne a las células endoteliales (Hidari K el al. J

Biol. Chem. 1997; 272:28750-6; Urzainqui el al. Immunity 2002; 17(4):401-12).

Además, se ha demostrado anteriormente que la interacción con sus ligandos de PSGL-l

en células dendríticas induce un programa tolerogénico que les permite desencadenar la

diferenciación de linfocitos T para dar lugar a células T reguladoras (Treg) (Urzainqui A

e l al. J Irnmunol. 2007 ; 179 :74 57-65). Por otro lado, se ha comprobad o que la

interacción de PSGL-l con selectina P suprime la proliferación de células progenitoras

S: hematopoyéti cas CD34+ humanas (Levesqu e J el a l. Irnmunity 1999; JI :369-78).

Asími smo, se ha observado recientemente que las célul as T de ratones deficientes en

PSGL-l proliferan más que las células de ratones sal vaj es (WT) (Matsumoto M el al. J.

Immunol. 20 09; 183:720411 ). Además, PSGL-I pa rticipa en el reclutami ento de

leucocitos hacia el íl eo, en un modelo de animal de Enfermedad de Crohn (Inoue T el al.

10: J. Leuk oc. Biol. 2005; 77:287-95), y en el reclutami ento de linfocitos Th I hacia la

lámina propia (LP) intesti nal (Haddad W el al. J. Exp. Med. 2003 ; 198:369-77). La

defi ciencia de PSGL-l aumenta la intensid ad de la gastroenteriti s aguda inducida por

infecci ón por Salmol1ella Iyphimurium, con un a síntesis aum entada de citocinas

proinflamatorias (KlIm W el al. J. Immllnol 2009; 182:6550-6 1) Todos estos datos

15: sugieren un papel de PSGL-l en la regulación de las respuestas inmunitarias en e!

intestino.

Las bacteri as comensales (mi crobi ota) existen normalm ente en un a relación

simbióti ca con e! intestin o hu ésped, pero mi emb ros de la mi crobi ota pueden invadir de

manera oportuni sta los tejidos mucosos , provocando graves probl emas en indi viduos

20: inmunodefi cientes. Para garanti zar la protección del huésped frente a tales invasiones por

bacterias oportuni stas, debe regularse estrechamente el equilibrio entre la tolerancia y la

inmunidad, y el sistema inmunitario se encarga de mantener esta ho meostasis intestinal.

Cuando bacterias infecciosas atraviesan la barrera epiteli al, los macrófagos y las CD las

eliminan mediante fagocitosis y producen citocinas proinflamatorias para reclutar

25: neutrófil os y otros leucocitos y acti var así respuestas de células T. Para mantener la auto

tolerancia a la mi crobiota y restaurar la homeostasis tras la infección, las respuestas

infl amatori as deben limitarse medi ante la generación de Treg. Además, otro pape!

importante de los macrófagos intestinales tras la lesión es ayud ar a restaurar la barrera

epitelial porque el daño al epitelio puede conducir a infecci ón bacteri ana, inflamación y

30: septicemia (Hooper L el al. Nat. Rev. Immunol. 20 l O; 10: l 59-69). Sin embargo, las

molécul as y célul as que participan en la regul ación de las respuestas innata y adaptati va

que se producen en los tejidos mucosos no se han ll egado a caracteri zar compl etam ente.

Una enfermedad autoinmune es una enfermedad causada porque el si stema

inmunitario ataca las células del propio organismo. En este caso, el sistema inmunitario

se convierte en el agresor y desencadena una respuesta inm une exagerada contra

sustancias y tejidos que normalmente están presentes en el cuerpo. Las causas son un

S: tanto desconocidas, pero están relacionadas con el reconocimiento proteico entre las

superficies de las membranas celulares del sistema inmunitario y las que forman el

organismo.

La esclerosis sistémica o esclerodermia es una enfermedad autoinmune que

presenta gran severidad, porque afecta a la piel y a todos los órganos internos,

10: acumulando colágeno y otros componentes de matriz extracelul ar en ellos, ocasionando

un fallo multiorgánico. Actualmente no existen buenos modelos animales que desarrollen

espontáneamente esclerodermia, una de las enfermedades autoinmunes más graves, sino

que se utilizan modelos en los que se trata localmente con determinados agentes

químicos que inducen la acumulación de colágeno en el órgano O tej ido tratado, lo que

1 S: permite el desarrollo de terapias para tratar la fibrosis producida en dicho órgano. En los

pacientes con esclerodermia se produce una fibrosis progresiva multiorgánica que se

agrava con el tiempo, además de que se produce daño vascular debido a la apoptosis de

las células endoteliales, debilidad muscular, etc. Sin embargo, no existe ningún modelo

animal que reproduzca todos los aspectos clínicos de la esclerosis sistémica. Por tanto,

20: existe la necesidad de desarrollar nuevos modelos animales que permitan estudiar

tratamientos que retrasen la aparición de síntomas, que mejoren o curen los síntomas,

que frenen o paren el avance de la enfermedad, así como estudiar factores químicos O

ambientales que agravan la enfermedad, para evitar la exposición a los mismos.

Las enfermedades inflamatorias intestinales, como la enfermedad de Crohn o la

2S: colitis ulcerosa, son enfermedades autoinmunes en las que se rompe el equilibrio

tolerancia/inmunidad del intestino lo que permite que bacterias comensales oportunistas

invadan la mucosa intestinal. Las terapias actuales para las EH emplean una secuencia de

tratamientos, dirigidos inicialmente a tratar la enfermedad aguda y posteriormente a

mantener la remisión (En gel M el al. J. Gastroenterology 20 10; 45(6):571-83). En

30: concreto, los tratamientos que se administran a los pacientes con EH son sistémicos y

están basados en citocinas anti-inflamatorias, como la IL-IO, o anticuerpos frente a las

citocinas e interleucinas proinflamatorias que se producen durante el transcurso de la

enfermedad. Sin embargo, no existen tratamientos que actúen específicamente sobre las

células del sistema inmune para regular su activación, el componente responsable de la

producción de estas citocinas e interleucinas. Aunque se han usado algunos agentes

biológicos para inhibir la respuesta inmunitaria aberrante en el intestino, estos agentes

S: tienen acción sobre otros tipos celulares, y por tanto conllevan efectos secundarios

perjudiciales para el paciente (Bosani M el al. Biologics: Targets and Therapy 2009;

3:77-97), por 10 que existe una necesidad de identificar nuevas dianas más eficaces y

más específicas para evitar los efectos secundarios deri vados de los tratamientos

sistémicos actuales.

10: Los modelos animales de EH son herramientas inestimables para la investigación

de los mecani smos patológicos subyacentes, la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas y

las pruebas de posibles tratamientos (Jurjus A el al. J. Pharmacol . Toxico!. Methods

2004; 50:8 1-92), por lo que existe la necesidad de desarrollar nuevos modelos animales

que cumplan dichas expectativas

15

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la invención se relaciona con el uso de un compuesto seleccionado

del grupo:

(i) PSGL-I o una variante funcionalmente equivalente;

20: (ii) un polinucleótido que codifica PSGL-l o una variante funcionalmente

equivalente; y

(iii) un agente activador de PSGL-I ,

para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una

enfermedad seleccionada del grupo formado por una enfermedad inflamatoria y una

25: enfennedad autoinmune.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un animal no humano

deficiente en el gen PSGL-I para:

(i) estudiar una enfermedad autoinmune y/o inflamatoria;

(ii) evaluar la progresión de una enfermedad autoinmune y/o inflamatoria; y/o

30: (iii) id entificar compuestos potencialmente terapéuticos frente a una enfermedad

autoinmune y/o inflamatoria.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura I muestra el núm ero de células presentes en ó rganos linfoicles y

pobl aciones de leucocitos residentes en órganos ¡infoirles de ratones PSGL-l"¡". (A) Se

obtuvieron ganglios linfáticos poplíteos (GLp), gangli os linfáti cos mesentéricos (GLm),

S: placas de Peyer (PP), tim o y bazo de ratones WT y defi cientes en PSG L-l , se

di sgregaron y se procesaron para obtener suspensiones celulares. Se contaron el número

de células totales en cada órgano en un contador celular automáti co (0=7). (B) Se midió

el porcentaje de linfocitos y granulocitos circulantes así como el número de leucocitos

por mi de sangre, en un analizador hematológico automáti co (0=2 1). Se analizaron las

10: CD (C Dl1 c+) y monocitos (Mo, F4/80+) circulantes medi ante FACS tras la tinción con

el conjunto de anticuerpos apropiado (n= lO). (e) y (D) Porcentaje de poblaciones de

leucocitos presentes en (C) GLm y (D) PP. Se tiñeron las células con los anti cuerpos

apropiados y se anali zaron mediante FACS: linfocitos T C04+ y C0 8+, células B

(B220+), CD (CD ll c+), CDp (CDllc+B220+), macrófa gos (F4/80+) y células NK

15: (DX5a+). Los datos son medi as ± desviación estándar (DE); *p<0,05; **p<O,OI;

***p<O,OO I.

La Fig ura 2 muestra las subpoblaciones de leucocitos residentes en la lámina

propi a (LP) del colon y la pi el de ratones PSGL_rfo . Se obtuvieron suspensiones

celulares a partir del colon y de la piel de ratones WT y defici entes en PSGL-I , se

20: tiñeron con cóctel de anti cuerpos y se analizaron mediante F AC S. (A) Porcentaje de

célul as C045+ en el infiltrado de LP y porcentajes de granul ocitos (Grl +), células B

(B220+), macrófagos (F4/80+), CD (C Dll c+), células T CD4+, células T CD8+ y

células NK (DX5a+) presentes en la población de células C045+. Los datos son medias

± DE (n= IO ratones). (B) Expresión de molécul as marcadoras de acti vación en la piel y

25: en la lamina propia de ra tone s WT y P SGL-l K.O. En las células de la LP, los

hi stogramas muestran un análisis de F ACS representativo de los ni veles de expresión de

moléculas MHC-Il en macrófagos y CO obtenidas a partir de la LP del colon de ratones

WT y defi cientes en PSG L-1. El di agrama de barras muestra el porcentaje de células

F4/80+ que expresan la molécul a coestimul ante C0 86 (media ± DE; n = 5 ratones). *

30: p<O,OS; *'" p<O,OI; "'*'" p<O,OO l.

La Figura 3 muestra el efecto de la inyección intravenosa de anti cuerpo anti

PSGL-l en el reclutamiento de poblacio nes leucocitarias y en su estado de activación.

(A) Número total de poblaciones leucocitarias en la lámina propi a tfas tres dosis de

200Jlg/rnl , administradas en días alternos, de anti cue rpo anti-PSG L-l. (B) Nivel de

expresión de distintos marcadores de acti vación (MHC-ll, C0 69 y CD86) en macró Cagos

y células dendriticas, tfas el tratamiento intravenoso con anti-PSGL-I . (e) Porcentaje de

S: pobl aciones efectoras de macrófagos en la LP de ratones WT, tfas el tratamiento

intravenoso con anticuerpo anti-PSGL-l

La Figura 4 muestra las células efectoras innatas y adaptati vas en ratones PSGL

]"'". (A) Porcentaje de diferentes subpoblaciones efectoras de macrófagos (F4/80+) y eo

(CDll c+) residentes en el infiltrado de CD4S+ de la LP del colon a partir de ratones WT

10: Y defi cientes en PSGL-I . Se anali zaron las células mediante FACS tras la tinción

intracelular para [L-4, IL-I O, [L-1 2, IL17 o fFNy. Los datos son medias ± DE (n=6

ratones). (8) Porcentaj e de subpoblaciones efectoras C04+ y C0 8+ en el infiltrado de

C045+ de la LP de! colon a partir de ratones WT y defi cientes en PSGL-l. Las células

se analizaron mediante FACS tras la tinción intracelular para fFNy (Th 1), fL-1 7 (Th 17) e

15: 1L-4 (Th2). Los datos son medi as ± DE (n~6). (C) Porcentaje de Treg (CD25h;~, Foxp

3+) en las sub poblaciones C 04+ y C0 8+ del infiltrado C045+ de la LP del colon. Los

datos son medias ± DE (n = 12 ratones); '" p<O,05 ; ** p<O,O I; **"'p<O,OO I.

La Fig ura 5 muestra la evolución de la coliti s ulcerosa (CU) inducida por DSS en

ratones PSGL-r'-. Se induj o coliti s ul cerosa en ratones WT y defi cientes en PSGL-I

20: incluyendo DSS al 4% (A-O) o DSS al 1 % (E) en el agua de bebida. (A) Porcentaje del

peso inicial desde el día O en e! dí a 5 del tratami ento con OSS al 4%. Los datos son

medi as ± DE (n=5 ratones) de un experimento representati vo de tres; '" p<O,05. (8)

Transcurso temporal del índice de acti vidad de la enfermedad (OAI), puntuado mediante

síntomas clínicos (véase el apartado rel ativo a Métodos). (e) Fotografias de cólones

25: representativos obtenidas tras el tratamiento durante 5 días con OSS al 4%. (D) Tinción

con hematoxilina/eosina de secciones de colon obtenidas tras el tratami ento durante 5

dí as con OSS al 4%. (E) Análi sis de evolución de la enferm edad en ratones WT y

defi cientes en PSGL-I tratados con DSS al 1% durante 10 días. Los datos son medias ±

DE (n=6 ratones) a partir de un experimento representativo de tres.

30: La Figum 6 muestra un infiltrado de leucocitos en la LP del colon de ratones

PSGL-I -Itras la inducción de CU. Se obtuvieron suspensiones celulares a pa.rtir de

cólones de ratones WT y defi cientes en PSGL-l tratados con OSS al 4% (5 días). Se

tiñeron las células con un cóctel de anticuerpos y se analizaron mediante F ACS. (A)

Porcentaje de células CD45+ en el infiltrado de LP y el porcentaje de células Gr 1 + en la

población CD45+. (B) Porcentaje de linfocitos T C04+ y C08+, células B (B220+), CO

(CDl lc+), macrófagos (F4/80+) y células NK (DX5a+) en la población CD45+. (C) Se

S: tiñeron las suspensiones de células F4/80+ con anticuerpos para marcadores de superficie

y se analizaron mediante F ACS (n~4). (D) y (E) Sub poblaciones de macrófagos (D) y

células dendríticas (E) anal1 zadas mediante tinción de citocinas intracelular y FACS. En

todos los casos, los datos son medias ± DE a partir de 6 ratones; * p<O,05; ** p<O,O l ;

*** p<O,OO I.

10: La Figura 7 describe las respuestas de Th y niveles de citocinas inflamatorias

aumentados en la LP del colon de ratones PSGL-¡-" tras la inducción de ev. Se obtuvo

el colon a partir de ratones WT y deficientes en PSGL-I tratados con OSS al 4%. (A) Se

incubaron lisados celulares de proteína total con el cóctel de anticuerpos del kit

FlowCytomix para Th1lTh2/Th17 y se analizaron mediante FACS. El panel muestra las

15: cantidades de fL-Ia, IL-22 e 1L-6 halladas en 300 ng de proteína total (n=12 ratones).

(B) Porcentajes de células T C04+ (izquierda) y CD8+ (derecha) que expresan IFNy

(Th l), IL-17 (THI7) e IL-4 (Th2) (n=6). (C) Porcentaje de Treg (CD25high Foxp-n en

las subpoblaciones C04+ y C08+ (n=6). En todos los casos, los datos son medias ± DE;

* p<0,05; ** p<O,OI ; *** p<O,OOI.

20: La Figura 8 muestra la presencia de autoanticuerpos nucleares y citoplasmáticos

en el suero sanguí neo de varios ratones WT y deficientes en PSGL-l. Análisis en

microscopio de fluorescencia de la presencia de anticuerpos que reaccionan con

antígenos nucleares y citoplasmáticos presentes en células Hep2 de carcinoma de laringe.

La Figura 9 muestra tinciones de Hematosilina-Eosi na de cortes de piel de

25: ratones de 4 meses y tinción tricrómica de Masson de cortes de pulmones de ratones de

20 meses de edad, incluidos en parafina y que se han obtenido de ratones WT y de

ratones deficientes para PSGL-l .

DESCRIPCIÓN DETALLA DA DE LA INVENCIÓN

30: Los autores de la presente invención han observado que PSGL-I puede ser una

diana para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y/o autoinmunes. Así, tal y

como se ilustra en el Ejemplo (véase el apartado 2.5), ratones deficientes en la proteína

PSGL-l desarrollaron una forma exacerbada de coliti s ul cerosa tras inducció n con

dextrán sulfato sódi co (OSS), y la respuesta de células T en la lámina propia del colon

aumenta considerablemente durante la coliti s ulcerosa (CU) (véase el apartado 2.6 del

Ejemplo). Además, estos ratones deficientes en PSGL-l desarrollan de forma espontánea

S: síntomas que son compatibl es con esclerosis sistémica (véase apartados 2.8 y 2.9).

Puesto que se conoce que la señalización de PSGL-l modifica el estado de

acti vación de leucocitos mieloides (Urzainqui A el al. lmmunity 2002; 17:40 1-1 2), en la

presente invención se utili za un modelo de CU experimental en ratones defi cientes en

PSGL-l , inducida por DSS, para explorar la implicación de PSGL-I en la patogénesis de

10: la CU y se describe el desarrollo de esclerosis sistémica espontánea en ausencia de

P SGL-l. Se han obtenido evidencias claras de que PSGL-l ejerce un papel homeostático

en el tejido linfoide asociado al intestino ya la piel , y de que este receptor de adhesión

partici pa en la patogénesis de la Cu. Además se ha visto que PSGL-I juega un papel

importante en el control de la autoinmunidad , ya qu e en su au sencia se desarrolla la

l S: esclerodermia, una de las enfermedades autoinmunes más severas.

La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatori a del intestino que también

puede ser englobada dentro de las enfermedades autoinmunes. Esta enfermedad puede

ser considerada como representati va de otras enfermedades inflamatori as y autoinmunes.

20: Usos teraoéuticos

del grupo formado por:

(i) la proteína PSGL-I o una variante funcionalmente equi valente;

(ii) un polinucleótido que codifica PSGL-I o una variante funcionalmente

2S: equi valente;

(jii) un anticuerpo anti-PSGL-I ; y

(iii) un agente activador de PSGL-l ,

en la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una

30: enfermedad autoinmune

La proteína "PSGL-I " según se utiliza en la presente invención, recibe también el

nombre de "ligando I de la glicoproteína selectina P" o CO 162 y es una glicoproteína

que se encuentra en los leucocitos y células endoteliales y que se une a la selectinas P, L

Y E, aunque con mayor afi nidad a la selectina P. El término PSGL-l , tal como aquí se

utili za incluye la proteín a PSGL-l de cualquier especie animal , en parti cular, de un

mamífero, por ejemplo, PSGL-l humana, tal y como se define en la base de datos NCBl

S: con número de acceso Q14242 (versión de 19 de noviembre de 2010), PSGL-l de ratón

(Mus museu/lls) correspondi ente a la proteína descrita en NCBl con número de acceso

Q99L34 (versión de 2 1 de octubre de 2010), etc.

El término "variante funcionalmente equivalente de PSGL-1 " tal como aquí se

utili za incluye cualqui er péptido deri vado de la secuencia aminoacídica de PSG L-l

10: generado medi ante modifi cación, sustitución, adición, inserción y/o deleción de uno O

más aminoácidos, siempre y cuando di cho péptido mantenga sustancialmente la fun ción

de la proteína PSGL-I . En concreto, la vari ante fun cionalmente equival ente muestra al

menos un a funci ón relacionad a con la capacidad de provocar señales intracelulares en

leucocitos que promu even su adhesión a células end oteliales e inducen la activación

15: transcripcional de factores de transcripción, que alteran el estado de activación de los

leucocitos; d e reclut ar le ucocitos al íl eo y de reclutar linfocitos Thl y célul as

monocíti cas a la lámina propi a intestin al. Métodos adecuados para determinar la

capacidad de PSGL-I de ll evar a cabo alguna de las funciones descritas anteriorm ente

incluyen los métodos descritos en el Ejemplo que acompaña a esta descripción (en

20: parti cular, véanse los apartados 2.2 y 2.3), basados en la detección de dos subconjuntos

(MHC_lI dim y MHC_lIhigh) , tanto de macrófagos como de células dendríticas, en la lámina

propia de ratones que presentan PSGL-I y en la evaluación del perfil de producción de

citocinas, respecti vamente. Entre las variantes funcionalmente equi valentes de PSGL-I ,

tal como aquí se definen, se encuentra la fracción soluble de la PSGL-I .

25: Variantes adecuadas para su uso en la presente invención incluyen aqu ellas que

muestran al menos un 25%, al menos 40%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%,

al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos

99% de identidad de secuencia con respecto a las secuencias de PSGL-I arriba indicadas.

El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por

30: métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de

secuencias conocidos en el estado de la técnica, tales como, por ejemplo BLAST

(Altschul S.F. el al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5;

215(3):403-10). El experto en la materia entenderá que las secuencias de aminoácidos a

las que se hace referencia en esta descripción pueden estar modificadas químicamente,

por ejemplo, mediante modificaciones químicas que son fisiológicamente relevantes,

tales como, glicosilaciones, fosforilaciones, acetilaciones, etc.

S: En una realización particular, la proteína PSGL-l se puede utilizar en la presente

invención en forma soluble para señalizar a las células endoteliales vía selectinas. En el

caso de la esclerosis sistémica, las células endoteliales mueren por apoptosis, por 10 que

se reduce la formación y el tamaño de los vasos sanguíneos, y es posible que la ausencia

o reducción de señal es vía selectinas-PSGL-I sea causante de este problema, por lo que

ID: la proteína soluble puede resolver o reducir dicho problema. Además, se contempla

también que la proteína PSGL-I se utilice en la presente invención con el fin de competir

con la molécula presente en la membrana de los leucocitos para impedir que se produzca

una señalización vía PSGL-l-selecti na s en los leucocitos y así impedir las señales

tolerogénicas que los induce y aumentar la inmunogenicidad leucocitaria y por tanto la

l S: respuesta inmunológica, lo que es de gran importancia en el caso de los tumores. En una

realización particular, debido a que hay células tumorales que expresan PSGL-l yes

probable que su presencia aumente la capacidad migratoria de dichas células y por tanto,

la capacidad de formar metastásis tumorales, la proteína PSGL-l soluble se puede

utilizar a alta concentración para contribuir tanto a la inhibición de la tolerancia como a

20: la reducción de la capacidad migratoria de las células tumorales que expresan PSGL-l en

su membrana, en el caso de la esclerosis sistémica.

En una realización particular, la invención contempla el uso de un polinucleótido

que codifica PSGL-I o que codifica una variante funcionalmente equivalente de PSGL-l,

con el fin de administrar por terapia génica dicho polinucleótido y que se exprese la

25: proteína PSGL-1.

El término "polinuc1 eótido", según se usa en la presente invención, se refiere a

una forma polimérica de nuc1eótidos de cualquier longitud y formada por ribonucleótidos

y/o deoxiribonucleótidos. El término incluye tanto polinucl eótidos de cadena sencilla

como de cadena doble, así como polinuc1eótidos modificados (metilados, protegidos y

30: similares)

Polinucleótidos que codifican PSGL-l , adecuados para su uso en la presente

invención, incluyen, sin limitación, los polinucleótidos descritos en las bases de datos

que codifican PSGL-I humana, como el descrito en la base de datos GenBank/EMBL

con número de acceso NC 000012 (versión de 23 de noviembre de 2010), PSGL-I de

rata (Ral/us Jlorvegicus) correspondiente al polinuc1 eótido descrito en GenBankJEMBL

con número de acceso NC_00511 1 (versión de 23 de noviembre de 2010), PSGL-l de

S: ratón (Mlls muself/us) correspondiente al polinucleótido descrito en GenBankJEMBL con

número de acceso NC 000071 (versión de 23 de noviembre de 2010).

El término "agente activador de PSGL-I ", según se usa en la presente invención,

se refiere a cualquier compuesto que es capaz de provocar un aumento en la actividad de

PSGL-l , independi enteme nte de que dicho aumento sea debido a un aumento de la

10: actividad de PSGL-l preexistente o a un aumento en la síntesis de PSGL-I en las células

endometriales o leucocitos. Ejemplos ilustrativos de agentes activadores de PSGL-I

incluyen, aunque no se limitan a:

ligandos de PSGL-I , tal como las selectinas (selectina P, L o E) o análogos de

di cha s selectina s funcionalmente equivalentes, inclu yendo péptidos qu e

15: comprenden la fra cción soluble de una selectina, en parti cul ar, de la P

selectina;

compuestos que aumentan el ni vel plasmático de las selectinas solubl es

(aumentando, por ejemplo, su expresión) o que estimul an la translocación de

la selectina a la membrana celular; ejemplos ilustrati vos, no limitativos, de

20: dichos compuestos incluyen trombina, histamina, bradiquinina, fragmentos de

proteínas del complemento, radicales libres deri vados de oxígeno y algunas

citocinas;

compuestos que facilitan o incrementan la uni ón entre PSGL-I y su ligando

(selectinas), tales como la 0.-1,3 fucosiltransferasa que lleva a cabo la 0

25: glicación de PSGL-I , generándose una glicoforma que presenta mayor

afinidad por la P-selectina y la tirosilprotein sulfotransferasa que lleva a cabo

la sulfatación de algunas tiresinas de PSGL-I, aumentando la afinidad por la

selectina; y

un anticuerpo anti-PSGL-I dirigido específicamente a PSGL-I .

30: Por "anticuerpo anti-PSGL-I" se entiende en el contexto de la presente invención

todo aquel anticuerpo que es capaz de unirse a PSGL-I de manera específica y provoca

el mi smo efecto que provocaría la uni ón de PSGL-I a su/s ligando/s. Los anticuerpos

anti-PSGL-l están dirigidos específicamente contra epítopos de la proteína esenciales

para desempeñar su función o contra la proteína completa. Los anticuerpos pueden ser

preparados usando cualquiera de los métodos que son conocidos para el experto en la

materia. Así , los anticuerpos policlonales se preparan mediante inmunización de un

S: animal con la proteína que se desea inhibir. Los anticuerpos monoclonales se preparan

usando el método descrito por Kohler, Mil stei n y coL (Nature, 1975, 256 : 495).

Anticuerpos adecuados en el contexto de la presente invención incluyen anticuerpos

intactos que comprende una región variable de unión a antígeno y una región constante,

fragmentos "Fab", "F(ab ')2" y "Fab''', Fv, scFv, diabodies y anticuerpos biespecíficos.

10: Cualquier anticuerpo dirigido contra la proteína PSGL-l que transmita señales

intracelulares se puede utilizar para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad

seleccionada entre: enfermedad inflamatoria y una enfermedad autoinmune. Ejemplos

ilustrativos de anticuerpos incluyen, aunque no se limitan a, el anticuerpo monoc1onal

dirigido a PSGL-l humana descrito en Snapp KR el al. (Blood Y 1998, voL 9l: 154

15: 164), el anticuerpo anti-PSGL-l descrito por Huang C el al. (European Joumal of

lmmunology 2005 ; Vol. 35: 2239-2249) y los anticuerpos anti PSGL-l descri tos en las

solicitudes de patente US 20090198044 Y US2009028S8 12. Los anticuerpos, al unirse a

PSGL-I ini cian señales intracelulares y activan rutas de señalización que finalmente

ind ucen la expresión génica de factores de tran scripción (cFos, C/EBP, AP 1),

20: responsables de controlar la síntesis de determinadas interleucinas y citocinas que son las

responsables de la actividad inmunogénica/reguladora de las células del sistema inmune,

por lo que actúan como verdaderos li gandos de la molécula.

Tal como entenderá un experto en la materia, es posible utilizar una combinación

de los compuestos mencionados anteriormente: (i) la proteína PSGL-l O una variante

2S: funcionalmente equi valente; (ii) un polinucl eótido que codifica PSGL-I o una variante

funcionalmente equivalente; y (iii ) un agente activador de PSGL-l , de manera que su

efecto sea mayor.

Tal como se utili za en la presente in venci ón , el término " enfermedades

inflamatorias" incluye cualqui er enfermedad causada por una activación descontrolada y

30: continuada de las respuesta s inflamatorias que causan daño en los tejidos; dicha

respuesta inflamatoria puede ser desencadenada por agentes infecciosos, agentes fisicos,

agentes químicos, tumores y muerte celular. Las enfermedades autoinmunes, en la

medida en que tambi én ti enen un componente infl am atorio, caen dentro del término

"enfermedades inflamatori as" tal como aquí se utili za. En general , las enfermedades

inflamatorias se clasifican según el tejido dañado, por ejemplo:

(i) las enfermedades inflamatorias intestinales (E H) que comprenden un conjunto

S: de enfermedades cuya característica principal es la presencia de una inflamación crónica,

sostenida o recurrente en el intestino, tales como la enfermedad de Crohn, colitis

ulcerosa, colitis colagenosa. coliti s isquémica, coliti s por diversión, síndrome de Beh¡;:et,

colitis linfocítica, enterocolitis eosinofili ca, gastroenteriti s, enfermedad injerto versus

huésped (GVH) y la coliti s actínica entre otras;

10: (ii) las enferm edades inflamatorias de las arti culaciones, por ejemplo, artriti s

reumatoide, artritis gotosa, polimialgia reumática, tendinitis y bursitis, entre otras;

(iii) otras enfermedades inflamatorias como la psoriasis y el asma; y

(i v) enferm edades que cursan con un comp onente inflam atori o aunque su

etiología no sea fundamentalmente inflamatoria

l S: El término "enfermedad autoinmune" según se emplea en la presente invención

se refi ere a una enfermedad causada porque el sistema inmunitari o ataca las células del

propio organismo; estas enfermedades pueden ser especí fi cas de órgano o sistémi cas.

Ejempl os de enferm edades autoinmune s incluyen, aunque no se limitan a, esclerosis

sistémi ca o escl erodermi a, alopeci a areata, espondiliti s anquilosante, cardi omi opatía

20: autoinmune, anem13 hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad

autoinmune del oído interno, síndrome linfoproliferativo autoinmune, neuropatía

periférica autoinmune, pancreatiti s autoinmune, síndrome poli endocrino autoinmune,

dermatiti s autoinmune por progesterona, púrpura trombocitopénica autoinmune, uveíti s

autoinmune, enfermedad celiaca, enfermedad de la aglutinina fría, enfermedad de Crohn,

2S: dermatomiositis, diabetes mellitus tipo 1, fascitis eosinofili ca, penfigoide gastrointestinal,

síndrome de Goodp asture, enferm edad de G raves, síndrome de Guill ain-Barré,

encefalitis de Hashimoto, tiroiditi s de Hashimoto, lupus eritematoso, síndrome Mill er

Fi sher, enfermedad mi xta del tejido conectivo, mi asteni a grave, narcolepsia, pénfigo

vulgar, anemia perniciosa, polimiositi s, ci rrosis biliar primaria, colangitis esclerosante

30: primaria, psoriasis, artriti s psoriatica, poli condriti s recidivante, artriti s reumatoide,

síndrome de Sjogren's, arteriti s temporal , coliti s ul cerosa, vasculitis y granulomatosis de

Wegener.

El término "enfermedad de Crohn" se refiere en la presente invención a la

enfermedad crónica autoinmune en el cual el sistema inmunitario del individuo ataca su

propio intestino produciendo inflamación. Frecuentemente la parte afectada es el íleon o

tramo final del intestino delgado, aunque la enfermedad puede aparecer en cualquier

S: lugar del tracto digestivo.

El ténnino "colitis ulcerosa" se refiere en la presente invención a una enfermedad

inflamatoria del colon (el intestino grueso) y del recto. Está caracterizada por la

inflamación y ulceración de la pared interior del colon.

El ténnino "esclerodermia o esclerosis sistémica o síndrome de erest" se refiere a

10: una enfermedad autoinmune del tejido conectivo difuso caracterizada por cambios en la

piel , vasos sanguíneos, músculos esqueléticos y órganos internos. Se desconoce(n) la(s)

causa(s) de dicha enfermedad.

Para su administración a un sujeto, tanto la proteína PSGL-I o la variante

funcionalmente equivalente, el polinucleótido que codifica PSGL-l o una va riante

l S: funcionalmente equivalente, como el agente activador de PSGL-I , se formulan en una

composición farmacéutica apropiada. Por tanto, la invención contempla el desarrollo de

una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de

dichos compuestos, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

El término "sujeto", tal como aquí se utili za, se refiere a un miembro de una

20: especie de un animal mamífero e incluye, pero no se limita a, animales domésticos,

primates y humanos; preferiblemente dicho sujeto es un ser humano masculino o

femenino de cualquier edad o raza.

En el contexto de la prese nte invención se entiende por " cantidad

terapéuticamente eficaz" la cantidad de principio activo (e.g., polinucleótido que codifica

2S: PSGL-I o una variante funcionalmente equivalente o agente activador de PSGL-l)

necesaria para conseguir el efecto deseado, por ejemplo, prevenir y/o tratar una

enfermedad inflamatoria, o una enfermedad autoinmune. La cantidad de dicho principio

activo que puede estar presente en la composición farmacéutica puede variar dentro de

un amplio intervalo. En general, la cantidad terapéuticamente eficaz de dicho principio

30: activo a administrar depend erá, entre otros factores, del tipo de compuesto que se vaya a

administrar, del sujeto que vaya a ser tratado, de su edad, de su estado, de la severidad de

la enfermedad que padezca dicho sujeto, de la form a de admini stración elegida, de la vía

y frecuencia de administración del principio acti vo a administrar, etc.

El término "vehículo farmacéuticamente aceptable", tal como aquí se utiliza, se

refiere a un vehículo que debe estar aprobado por una agencia regul adora del gobierno

S: federal o un gobi erno estatal o enum erado en la Farmacopea Estadounidense o la

Farm acopea Europea, u otra fa rm acopea reconocida generalm ente para su uso en

anim ales, y más concretam ente en humanos. El término " vehí cul o" se refi ere a un

diluyente, coadyuvante, excipiente o portador con el que se deben admini strar el

principio acti vo (e.g., la proteína PSGL-l , el polinucleótido que codifica PSGL-l o una

10: variante funcionalmente equivalente o el agente acti vador de PSGL-I ); obviamente,

di cho vehícul o debe ser compatible con dichos productos.

En una reali zación parti cular, el compuesto a adm ini strar es un producto de

naturaleza olgonuc1 eotídi ca, tal como un polinuc1eótido que codifi ca PSGL-I o una

variante funci onalmente equivalente; en este caso, dicho polinucleótido estará incluido

15: ventajosamente en un vector, tal como un vector viral o un vector no viral adecuado para

su empl eo en terapia génica, que comprende di cho polinucleótido O formando parte de

una construcción géni ca que comprende la citada secuencia.

Existen dos enfoques principales para introducir un polinucleótido en las células

de un sujeto: il1 vivo y ex lIivo. Para la admini stración iJl villa, se inyecta la molécula de

20: ácido nucleico directamente en el paciente, habitualmente en el sitio en el que se requiere

el polinucleótido, o se incluyen secuencias que lo dirigen a la célula y/o tejido de interés.

P ara la admini stración ex vivo, se extraen células del paciente, se introduce el

polinucleótido en esas células aisladas y se admini stran las células modificadas al suj eto

bien directamente O bien encapsuladas, por ejempl o, dentro de membranas porosas que

25: se implantan en el paciente (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses US

4.892.538 y US 5.282. 187). Otros medi os para la di stribución de genes a una célul a o

t ejido incluyen, pero sin limitarse a, métodos balí sti cos, transferencia medi ada por

lip oso ma s, transf erenci a m edi a da po r recept o res (compl ej o li ga nd o-ADN),

electroporación, precipitación con fosfato cálcico, etc. (véase por ejemplo US 4.970. 1 54,

30: WO 96/40958, US 5 679 559, US 5676954 Y US No 5 593 875

Existen numerosas técni cas di sponibl es para introducir polinucleótidos en células

viables. Las técnicas varí an dependi endo de si se transfiere el polinucleótido en células

cultivadas ;11 vilro o in V;IIO en las célul as del huésped. Las técni cas adecuadas para la

transferencia del polinu cleótido en células de mamífero il1 vilro incl uyen el uso de

liposomas, electroporación, mi croinyección, fu sión celular, DEAE-dextrano, el método

de precipitación con fosfato de cal cio, etc. Las técni cas para transferir molécul as de

S: ácido nuc1 eico in vivo convencional es incluyen la transfección con vectores virales. A

modo ilustrati vo, no limitati vo, dichos vectores pueden ser vectores virales basados en

retroviru s, a denoviru s, et c., o en caso de los no virales, los vectores puede n ser

compl ejos ADN-liposoma, ADN-p olím ero, ADN-polím ero-liposoma, etc. [véase

" Nonviral Vectors for Gene Th erapy", editado por Hu ang, Hung y Wagner, Academi c

10: Press ( 1999)]. Para una revisión de los protocolos de terapia génica conocidos en la

actualidad véase Anderson el al., Science 256:808-8 13 (1 992).

En una reali zación particular, el compuesto a admini strar es un agente activador

de PSGL-l , de naturaleza oli gonuc1eotídi ca o no oli gonuc1 eotídi ca, o bi en la proteín a

PSGL-l En este caso, di cho age nte acti vador de PSGL-l o la proteína P SG L-l se

15: admini stra en una cantidad terapéuti cament e efi caz y se formula con los vehí culos

fann acéuti carn ente aceptabl es adecuados a la form a de admini stración elegida.

Para el tratami ento de las enfermedades y patologías previamente mencionadas,

e l compu es t o ac ti va do r d e P SGL-I d e natur a leza o li gonu c leot ídi ca o no

oligonuc1 eotídica o la proteína PSGL-I contenido en la comp osición farmacéuti ca

20: proporcionada por esta in vención puede ser admini strado por cualqui er medio que

produzca el contacto de di cho compuesto con el siti o de acción del mi smo en el cuerpo

humano o animal.

Las composiciones farm acéuti cas pro porcionadas por la invención pueden

presentarse en cualqui er forma de administración adecuada, por ejempl o, sólida, líquida,

25: etc., y pueden admini strarse por cualqui er vía de admini stración apropiada, por ejemplo,

por vía oral, parent eral ( e.g., subcután ea, intramu scul ar, intraperitoneal , intratecal,

intraven osa , et c .), rectal , tó pi ca, e tc. , para l o cual in clui rá n los vehí c ul os

farmacéuticamente aceptabl es necesarios para la formul ación de la forma de

admini straci ón deseada. Ej empl os ilustrativos, no limitativos, de formas farmacéuticas de

30: administración por vía oral incluyen comprimidos, cápsula s, granulad os, solu ciones,

suspensiones, etc., las cuales pueden contener los vehí cul os apropi ados convencionales,

tales como aglutinantes, diluyentes, desintegrantes, lubrificantes, humectantes, etc., y

pueden ser preparadas por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la

materia. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas por esta invención también

pueden ser adaptadas para su administración parenteral, en forma de, por ejemplo,

soluciones, suspensiones o productos liofilizados, estériles, en la forma de dosificación

S: apropiada; en este caso, dichas composiciones farmacéuticas incluirán los vehículos

farmacéuticamente aceptables adecuados, tales como tampones, tensioactivos, etc. , y

materia. Otras formas de administración de la composición farmacéutica proporcionada

por esta invención incluyen aerosol es, colirios, pomadas, etc., para lo cual se utilizarán

lO: los vehículos farmacéuticamente aceptables apropiados. En cualquier caso, los vehículos

farmacéuticamente aceptables se elegirán en función de la forrna farrnacéutica de

adrninistración seleccionada. Una revisión de las di stintas forrna s farrnacéutica s de

adrninistración de fármacos y de los vehículos farmacéuticarn ente aceptables necesarios

para su obtención así como de sus métodos de producción pued e encontrarse, por

15: ejernplo, en el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A.

Ediciones, Madrid; y en Remington 's Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 20a

edición, Williams & Wilkins PA, USA (2000).

La composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede contener

un agente acti vador de PSGL-l junto con, opcionalmente, uno o más, compuestos

20: adecuados para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y/o enfermedades

autoinmunes, que actúen frente a otras dianas diferentes de PSGL-I . Dichos compuestos

son conocidos por los técnicos en la materia.

Aunque los métodos de administración y dosificación varían según la edad y e!

peso corporal del paciente, un experto en la técnica puede seleccionarlos de manera

25: rutinaria. La dosificación apropiada de! compuesto utili zado en la invención (proteína

PSGL-I , polinucleótido que codifi ca PSGL-I o agente activador de PSGL-I) depende

del tipo de enfermedad que se va a tratar, la gravedad y e! curso de la enfermedad, y a

que se administre dicho compuesto para fin es de prevención o terapéuticos. Asimi smo,

en el caso del agente activador de PSGL-l también depende de la naturaleza de dicho

30: agente. El compuesto terapéutico se puede administrar al paciente de manera adecuada

en una sola vez o a lo largo de una serie de tratamientos.

,.

Uso de un animal transgénico no humano deficiente en PSGLI

Los autores de la invención han observado que los ratones deficientes en PSGL-I

pueden ser uti li zados como modelo de una enferm edad autoinmune, tal como la

esclerosis sistémica o esclerodermia, así como para analizar la posible utilidad de

S: diferentes compuestos para el tratamiento de dichas patologías o para el retraso en su

aparición. Así , tal como se muestra en el Ejemplo (véase apartado 2.2.), se observa que

los ratones deficientes en PSGL-l desarrollan espontáneamente esclerodermia, siendo un

modelo para dicha enfermedad autoinmune, así como para otras enfermedades

autoinmunes.

10: La esclerosis sistémica o esclerodermia es una de las enfermedades autoinmunes

más graves y que afecta a múltiples órganos. Para su estudio se util izan modelos en los

que se trata localmente con determinados agentes químicos que inducen la acumulación

de colágeno en el órgano o tejido tratado, lo que permite el estudio de terapias para tratar

la fibrosis producida en dicho órgano. Sin embargo, en los pacientes con esclerodermia

l S: se produce una fibrosis progresiva multiorgánica que se agrava con el tiempo, además de

que se produce daño vascular debido a la apoptosis de las células endoteliales, debilidad

mu scular, etc. Actualmente no existe ningún modelo animal que desarroll e

espontáneamente una enfermedad autoinmune, tal como esclerodermia.

Por tanto, un aspecto la in vención se relaciona con el uso de un animal

20: transgénico deficiente en PSGL-I para (i) estudiar una enfermedad autoinmune y/o una

enfermedad inflamatoria; (ii) evaluar la progresión de una enfermedad autoinmune y/o

una enfermedad inflamatoria; y (iii) identificar y eval uar compuestos potencialmente

terapéuticos frente a una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria.

Dicho animal deficiente en PSGL-I presenta la deleción de ambos alelos del gen

2S: PSGL-I y puede servir como modelo animal para cualqui er enfermedad en la que el gen

PSGL-I se encuentre reprimido. En una reali zación particular, el animal transgénico es

un primate no humano o un roedor. En una reali zación preferida dicho animal es un

roedor, tal como un ratón o una rata . Métodos para generar ratones tran sgénicos

deficientes en PSGL-I son ampliamente conocidos en el estado de la técnica. Un ej emplo

30: de dicho método se describe en Yang, J el al. 1. Exp. Med. 190: 1769-1782

En una reali zación particular, la invención contempla el uso de un animal

transgénico deficiente en PSGL-I para (i) estudiar la esclerodermia; (ii) evaluar la

progresión de dicha enfermedad; y (jii) identificar y evaluar compuestos potencialmente terapéuticos frente a la esclerodermia. Los animales transgénicos de la invención son deficientes en PSGL-I y por tanto, presentan un fenotipo alterado que se corresponde con el fenotipo de una enfermedad

S inflamatoria o autoinmune. Dicho fenoti po se puede utilizar para estudiar o anali zar en detalle dichas enfermedades, así como para evaluar la progresión de las citadas enfermedades e incluso para identificar y evaluar la reversión del fenotipo de los animales transgénicos deficientes y por tanto se pueden identificar compuestos útiles para el tratamiento de las enfermedades mencionadas anteriormente.

lOEn una realización particular la enfermedad autoinmune es la esclerodermia o esclerosis sistémica.

El siguiente Ejemplo sirve para ilustrar la invención y no debe ser considerado como limitativo del alcance de la misma 15 EJEMPLO I Evaluación de la colitis ulcerosa inducida en un modelo animal

I. MATERIALES Y MÉTODOS 20 1 Reactivos y anticuerpos monoclonales

Los siguientes anticuerpos conjugados (Ac) se obtuvieron de BO Pharmingen (San José, CA, EE.UU.): anti-CDllc-PECy7, F4/80-biotina, MHC-FITC, CD4-PE, CD8-APC, CD25-biotina, B220-FITC, Grl-APC, DXSu-biotina, CD3-FITC, IL-12-PE,

25 1L-IO-PE, fFNy-FITC, IL-4-APC, IL-1 7-PE y estreptavidina-PerCP. El DSS (dextrán sulfato sódico) procedía de MP Biomedicals, LLC (rIlkirch, Francia). Colagenasa lA, dispasa, ADNasa 1 y el reactivo TR¡@ procedían de Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo,

EE.UU.). El kit Thlffh2 10plex de ratón procedía de Bender Medsystems GmbH (Viena, Austria). Las proteínas tisulares se extrajeron con tampón de extracción de 30 proteínas tisulares T-PER@ de Thermo Scientific (Rockford, IL, EE.UU.), Y se cuantificaron con el kit de ensayo de proteínas BCA n.1 (pierce, Rockford, [L, EE.UU.).

1.2 Ratones

Los ratones C57B 1/6 PSGL-I·¡· fueron proporcionados amablemente el Dr. M. K.

Wild y el Oc D. Vestweber (Max Planck lnstitute for Molecular Biomedicine, Münster,

Alemania). Los ratones C5781/6 WT se obtuvieron de "The Jackson Laboratory". Se

S: criaron los ratones en las instalaciones para animales de los inventores durante de 3 a 4

meses antes de usarse para los experimentos, y todos los experimentos con animales se

reali zaron de acuerdo con las directrices nacionales e institucionales para el cuidado de

los animales.

10: 1.3 Preparación de células a partir de tejidos y análisis

Se obtuvieron suspensiones celulares a partir de ganglios linfáticos mesentéricos

y poplíteos (GLm y GLp), bazo y placas de Peyer (PP) mediante desagregación por

fricción entre dos portaobjetos de microscopio. Se procesaron las suspensiones celulares

para determinar el recuento celular, tinción de anticuerpos y aná li sis de FACS

15: (citometría de flujo). Se analizaron los linfocitos de sangre periférica con un analizador

hematológico automático Junior Vet de ABACUS o se tiñeron para el análisis de F ACS.

Para preparar suspensiones celulares a partir de Lámina Propia (LP), se

extirparon los colon, se lavaron con PBS (tampón fosfato salino), se cortaron en trozos

de l mm y se incubaron en medio RPMl suplementado con suero de ternera fetal al 4% y

20: colagenasa lA 1 mg/ml, dispasa l mg/ml y AONasa I 40 ¡.tg/ml en un baño con agitación

a 37°C durante l h. Después se lavaron las células, se suspendieron en PBS que contenía

BSA (albúmina de suero bovino) al 1%, EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 0,5 M Y

se inmunotiñeron de la siguiente manera: en primer lugar se añadió anticuerpo

biotinilado y se incubaron las muestras a 4°C durante 1 S mino Entonces se fijaron las

25: célul as, se permeabilizaron y simultáneamente se marcaron con estreptavidina-PerCP y

los anticuerpos conjugados indicados. Se analizaron las células marcadas en un citómetro

de flujo FACSCalibur. Para medir las citocinas, se congelaron los colon y GLm en

nitrógeno líquido, se pulverizaron y se suspendieron en tampón de lisis de extracción de

proteínas. Se cuantifi có el contenido en proteína con el kit BCA™ y se determinaron los

30: ni veles de citocinas con el kit 10plex de ratón para citocinas, siguiendo las instrucciones

del fabricante.

1.4 Inducción de colitis ulcerosa y evaluación de la enfermedad

Se indujo colitis ulcerosa (CU) mediante administración diaria de DSS a14% o al

1% (peso molecular de 30.000 a 40 .000 Da) disuelto en el agua de bebida. Los

parámetros clínicos usados para puntuar la enfermedad (índice de actividad de la

S: enfermedad o DA]) fueron la pérdida de peso, heces sueltas/dianea y presencia de

hemorragia oculta/macroscópica (Cooper H el al. Laboratory lnvestigati on 1993 ;69: 238

249). Se pesaron los animales antes de iniciar el tratamiento (peso ini cial) y cada día

hasta el final del tratamiento. También se revisaron los animales diariamente para

determinar la consistenci a de las heces y detectar la presencia de sangre en las heces. Al

10: final del tratamiento, se procesaron los colon para realizar un análisis histológico para

comprobar la presencia de infiltrado en la LP.

1.5 Análisis estadístico

Se estimó la signifi cación estadí sti ca aplicando la prueba de la U de Mann

15: Whitney. Las diferencias se consideraron significati vas a *p < 0,05.

2. RESULTADOS

2.1 La deficiencia de PSGL-I altera la homeostasis del sistema inmunitario

20: Aunque las selectinas y sus li gandos participan en la recirculación (homing) de

leucocitos a diferentes tejidos, no se ha descrito el papel exacto de PSGL-I en el

establecimi ento de poblaciones de células inmunitarias residentes en el tejido linfoide

asociado al intestino. Por tanto se analizó la celularidad de órganos linfoides y la

di stribución de poblaciones de leucocitos en ratones defici entes en PSGL-I. Se observó

25: que los bazos de esos animales contenían un número aumentado de células en

comparación con bazos WT, tal como se muestra en la Figura I A. En cambio, el número

de células en GLp y GLm así como las PP de animales PSGL-l"'-(pSGL-l KO) estaba

significati vamente disminuido (Figura lA). La sangre de los ratones PSGL-I-'-mostró un

aumento significativo, por mi de sangre, de granulocitos, CO y monoci tos (Figura 18),

30: alterando las proporciones homeostáticas en la sangre de las diferentes poblaciones

leucocitarias, reduciendo la proporción de linfocitos. Además, los GLm procedentes de

ratones deficientes en PSGL-I contení an un número reducido de linfocitos T C04-y

células NKT CD8+ (Figura 1 C). Finalmente, las PP de estos animal es mostraro n una

reducción significativa en el número de células NKT C D8+ o CD4+ y CDp (Figura ID).

Estos resultados sugieren que PSGL-I ej erce un importante papel regul ador en la

di stribución ti sular de diferentes subconjuntos de leucocitos.

5

2.2 PSGL-l participa en la distribución y el estado de acti vación de leucocitos de la LP y

de la piel

Darlas las frecuencias alteradas de células inmunitarias en GLm y PP de ratones

PSGL-1 -l-en condiciones de estado estacionario, a continuación se analizó el fenotipo de

10: los leucocitos en la LP del colon y en la piel, puesto que se observó que un 30% de los

animales deficientes para PSGL-l presentaban heridas en la piel que no eran debidas a

infección por estreptococos. En la lámina propia se observaron números relati vos

aumentados de granul ocitos, célul as C0 8+ y células 8 (Fi gura 2A ) y, en cambi o, se

observó un número di sminuid o de macrófagos (F4/80+), cn (negativas para linaje,

15: CDIl c+) y linfocitos NK (DX5a+) en la LP de ratones defi cientes en PSGL-I (PSGL-l

KO). Asimismo, en la piel se encontraron números relati vos aumentados de granulocitos

y linfocitos B, y números relativos disminuidos de m acrófagos y de linfocitos CD8+

Además, mientras que en la lámina propia de ratones WT se detectaron dos subconjuntos

(MHC_ndim y MH C_nhigh) tanto de macrófagos com o de CD, en la LP de ratones

20: deficientes en PSGL-l sólo se observaron células MHC_1I1llcd, indicando la ausencia de la

población no activada (Figura 28). Además, todos los macrófagos PSGL-r" expresaron

la molécula co-estimulante CD86, mientras que sólo el 20% de los macrófagos de los

ratones WT e ran positi vos para esta molécul a (Fi gura 2B). En el caso de la pi el, los

macrófagos presentan fenotipo proinflamatorio (CDll chighGrl high), y presentan mayores

2S: ni veles de expresión del marcador de activación C0 69, al igual que las CO, que también

expresan mayores niveles de MHC-II y CD86. Estos datos sugieren que en la LP del

colon y en la piel de ratones PSGL-¡-" la mayoría de las CD y los macrófagos están en

estado acti vado, actuando probabl emente como célul as presentadoras de antí genos

efi caces.

30

2.3 El tratamiento in vivo con anticuerpo anti-PSGL-l reduce el reclutamiento de

macrófagos células dendríticas y linfocitos B a la lámina propia del colon y reduce su

estado de activación.

Se analizó el papel del tratamiento por vía intravenosa con anticuerpo anti-PSGL

S: en ratones WT. Para ello se realizaron, en días alternos, tres inyecciones (200

¡.tglinyección) del anticuerpo anti-PSGL-l 4RA-IO o del control de isotipo. Los animales

se sacrificaron 18 horas después de la última inyección y se anali zaron en ell os las

poblaciones leucocitarias en la LP del colon. Como se observa en la Figura 3A, el

tratamiento con anti-PSGL-l por vía sa nguínea, redujo la presencia de linfocitos S ,

10: macrófagos y CD en el colon, pero a diferencia de lo que ocurre en el KO de PSGL-I ,

los macrófagos y las células dendríticas presentaban ni veles más bajos de MHC-lI y de

los marcadores de activación CD69 y CD86, indicando que la unión del anticuerpo anti

PSGL-l induce señales que inhiben la activación de estas células(Figura 38), lo que se

traduce en menor porcentaj e de macrófagos, presentes en la LP, que producen citocinas

l S: proinflamatorias como fL-12 e fFNy (Figura 3C)

2.4 La deficiencia de PSGL-I genera un entorno proinflamatorio en la LP del colon con

niveles aumentados de citocinas Thl y Th2 Y números reducidos de Treg

Se evaluó el perfil de producción de citocinas mediante macrófagos y CD

20: residentes en la LP del colon de ratones WT y PSGL-rf -en condiciones de estado

estacionario. Tal como se muestra en la Figura 4A, la mayoría de las CD y macrófagos

de ratones WT sintetizaron interleucina 10 (IL-IO), produciendo sólo un pequeño

porcentaje de células lL-12, lL-4, lL-1 7 o lFNy (interferón y). En cambio, en ratones

deficientes en PSGL-l el número de macrófagos y CD IL-IO+ se redujo notablemente,

2S: mientras que la proporción de células que producían IL-12, IL-4 e IL-17 aumentó, un

perfil de citocinas que puede favorecer la generación de fenómenos inflamatorios.

También se estudiaTOn las características de los linfocitos T residentes en la LP

del colon. Tal como se muestra en la Figura 48, se detectó un número aum entado de

linfocitos T CD4 lFN-y+ O lL-4+ en ratones PSGL_¡-f-. Además, se observó una

30: proporción aumentada de células T C08 lL-4+ en estos animales (Figura 48).

Asimismo, el porcentaje de células T con fenotipo regulador (CD2Shigh Foxp-3+) se

redujo significativamente en la LP de ratones deficientes en PSGL-I (Figura 4C).

2.5 Los ratones PSGL-I"¡' desarrollan una forma exacerbada de coliti s ulcerosa

Para evaluar la influencia de la homeostasis de intestino alterada de ratones

deficientes en PSGL-l sobre el inicio y la evolución de la enfermedad inflamatoria del

S: intestino, se utilizó un modelo de colitis ulcerosa experimental inducida por dextrán

sulfato sódico (DSS). La adición de DSS al 1% al agua de bebida provoca síntomas

apenas detectables en el día siete del tratamiento en ratones C57/8 16, mientras que el

tratamiento con DSS al 4% provoca enfermedad aguda con sí ntomas clínicos e

hi stológicos graves (Cooper el al. citado ad supra). A cualquier dosis, los síntomas

10: clínicos comenzaron más temprano en raton es PSGL_I-f -(Figura SA, B Y E). El examen

de la enfermedad inducida por OSS al 4% mostró que la enfermedad evolucionaba más

rápido y era más grave en ratones PSGL-l"I": en el día 5 de tratamiento los ratones

deficientes habían perdido en promedio el 20% de su peso inicial (Figura SAl, tenían un

alto Índice de actividad de la enfermedad (Figura SS) y mostraban inflamación de colon

1S: más grave que los WT (Figura Se). Además, tres de los 16 ratones deficientes murieron

en el día S antes de completar el análisis. El análisis hi stológico mostró que los colon de

los ratones PSGL-I-1 -estaban más di stendidos y mostraban una mayor infiltración y un

grado más alto de destrucción de la cripta que los de los ratones WT (Figura 50). El

tratamiento con OSS al 1 % indujo síntomas clínicos en ratones PSGL-r'" que

20: comenzaron a los 3 días, y se alcanzó el DAl máximo en el día 8, presentando todos los

animales heces sueltas y hemorragia (Figura SE). El análi sis histológico mostró más

puntos de infiltración en la LP de los ratones deficientes en PSGL-l (Figura SE). Estos

resultados indican que los ratones deficientes en PSGL-l inician la colitis ulcerosa más

temprano y desarrollan una enfermedad más grave que los ratones WT.

25

2.6 La deficiencia de PSGL-l altera los perfiles de subpoblaciones de células

inmunitarias inflamatorias en la LP del colon afectada por CU

Se anali zó el infiltrado de células inflamatorias del colon inducido por el

tratamiento con OSS. Tal como se muestra en las Figuras 6A y 68, se observó un

30: número disminuido de en y macrófagos en el infiltrado de células inflamatorias de

ratones PSGL-l KO. Sin embargo, se observó una expresión aumentada del marcador de

activación C069 en la población de macrófagos de estos animales (Figura 6C). Además,

se detectó una proporción aumentada de células NKT C08+ en ratones deficientes en

PSGL-l (Figura 68). El análisis de la producción de citocinas mostró que los porcentajes

de macrófagos que producían IL-12, lL-4 e fFNy eran superiores en los ratones PSGL-1 -l

(Figura 60). Además, la proporción de CD fL-IO+ era inferior en ratones deficientes en

S: PSGL-l , mientras que el porcentaje de células que producían l L-4 estaba

significativamente aumentado (Figura 60). La baja proporción de CO, macrófagos y

linfocitos NK que se ha detectado en la LP de ratones deficientes en PSGL-l podría

explicarse mediante el papel de PSGL-l en el reclutamiento de leucocitos hacia LN, íleo

y LP.

10: El perfil de citocinas y el fenotipo de estos macrófagos y CD indica que están en

un estado activado (expresión de CD86 y MHC-lI y síntesis aumentada de IL-4, IL-12 e

lL-I?, con una producción di sminuida de lL-1 O), un fenómeno que podría asociarse

causalmente con los números aumentados de granulocitos, células B y células T CD8+.

Se ha descrito ampli amente que lL-IO es un potente supresor de la activación de

I S: macrófagos clásica, y los animales deficientes en esta citocina muestran intlamación

intestinal espontánea así como síntesis aumentada de las citocinas prointlamatorias IL-12

y TNFa. Sin embargo, a pesar del entorno prointlamatorio detectado en la LP del colon

de los ratones PSGL-I-1 -, estos animales no desarrollan espontáneamente inflamación

intestinal o CU. Resulta viable que la proporción relati va baja de Treg observada en

20: ratones deficientes en PSGL-l es suficiente para limitar la proliferación de células

efectoras Th 1, Th2 Y Th l? en condiciones de estado estacionario. Con respecto al papel

de PSGL-l sobre linfocitos T y el desarrollo de CU, se han observado resultados

aparentemente opuestos. Por tanto, se ha mostrado que la deficiencia para PSGL-I

exacerba el desarrollo de la intlamación en un modelo de colitis ulcerosa (CU) en ratón

2S: inducida por la transferencia adoptiva de células T indiferenciadas a huéspedes

deficientes en RAG. Sin embargo, usando el mismo modelo de ratón, otro estudio

notificó que no se requería PSGL-l para iniciar CU.

2.7 La respuesta de células T en la LP del colon durante la CU se exacerba en ratones

30: deficientes en PSGL-l

A continuación se llevó a cabo un análisis de múltiples citocinas de

homogeneizados de colon. Resulta interesante que los niveles de IL-Ia, IL-22 e IL-6

inducidos mediante tratamiento con DSS fueron notablemente superiores en el colon de

ratones PSGL-l'¡' (Figura 7A). Además, se detectó un número aumentado de células T

C04+ que producían IFN-y e lL-17 (células Th 1 Y Th 17, respectivamente) en ratones

deficientes en PSGL-I (Figura 7B). El análisis de linfocitos T C08+ mostró un aumento

S: similar en células IFN-y+ e IL-17+ (Figura 7B). En cambio, se observaron niveles

similares de células Treg en ratones WT y PSGL-I -1 -(Figura 7e).

2.8 Presencia de autoanticueroos en el suero sanguíneo de los ratones deficientes para

PSGL-l.

10: Se obtuvo suero sanguíneo a partir de la sangre de ratones WT y KO, y se

analizó, mediante ensayos de inmunotluorescencia, la presencia de anticuerpos que

reconocen proteínas nucleares y/o citoplasmáticas, que es prueba diagnóstica de

autoinmunidad. Como se observa en la Figura 8, el suero procedente de ratones WT no

reconoce ningún antígeno nuclear ni citoplasmático (panel superior», mientras que el

I S: suero procedente de ratones PSGL-¡-" KO tiene una alta reactividad con antígenos

nucleares y, en algunos ratones, también citoplasmáticos (panel inferior).

2.9 Presencia de infiltrado leucocitario y acumulación de matriz extracelular en la dermi s

y en los pulmones de los ratones deficientes para PSGL-I compatible con esclerodermia

20: Dado que el 30% de los ratones deficientes en PSGL-I presentaban heridas en la

piel, se tiñeron cortes de piel incluida en parafina con Hematosilina-Eosina. El análisis

comparativo de la piel obtenida de ratones WT y KO mostró que la piel de los ratones

PSGL-r/ presentaba mayo r infiltrado leucocitario y además presentaba un

engrosami ento de la dermis por acúmulo de colágeno (panel superior), lo que es una

2S: prueba diagnóstica de esclerosis sistémica o esclerodermia. También se realizó un

experimento de envejecimiento, y a partir de los 20 meses comenzaron a presentar

síntomas graves de dolor, falta de reactividad, adelgazamiento, malestar y muerte en el

20% de los casos, por lo que hubo que sacrificarlos. El análisis comparativo de los

pulmones de estos ratones de 20 meses con los de ratones WT de la misma edad (panel

30: inferior) indicó que en todos los casos presentaban infiltrado leucocitario y fibrosis, lo

que también es característico de la esclerosis sistémica.

Por consigui ente, en la presente invención se demuestra que PSGL-I tie ne un

papel relevante en el mantenimiento del equilibri o entre la tolerancia y la inmunidad,

tanto en la piel como en el intestino, debido a que se ha visto que los ratones defi cientes

en PSGL-l muestran un tamaño reducido de órganos linfoides asociados al intestino, y

S: que su perfil de poblaciones de células inmunitarias es anómalo, 10 que sugiere una

homeostasis alterada.

A pesar del número relativamente bajo de macrófagos y células dendríticas en la

LP y en la piel de ratones defi cientes en PSGL-l, en condiciones de estado estacionari o,

estos animales desarrollan rápidamente una forma agresiva de CU tras el tratamiento con

10: DSS y, espontáneamente, esclerosis sistémica. Este fenómeno sugiere que estos ratones

tienen una capacidad aumentada para generar respuestas inm u nitari as innatas, y

concuerda con el fenotipo acti vado de macrófagos de la LP y de la piel. Con respecto a

ésto, se ha descrito que las CO inmunogénicas y los macrófagos activados pueden

sintetizar las citocinas proinflamatorias IL-6 e IL-I , que inducen la diferenciación de

15: célul as Th1 7. Por tanto, e s muy probable que en ratones defi cientes en PSGL-I , la

presencia de un gran número de macrófagos acti vados en condi ciones de estado

estacionari o favorezca la diferenciación de linfocitos Th1 7, en presencia de un factor

desencadenante tal como DSS. A su vez, los linfocitos Th 17 serí an responsables de la

sobreproducción observada de IL-22, que junto con IL-1 7 ejerce un importante efecto

20: proinflamatori o. Resulta interesante que estudios recientes en seres humanos con EH han

detectado niveles aumentados de ARNm de 1L-17, fL-l e 1L-6 en la mucosa intestinal y

una razón reducida de Tregffh 17 circul ante.

Tambi én se ha observado en ratones defi cientes en PSGL-I con CU que a pesar

de un número aumentado de linfocitos IL-1 7+ e IFN-y+ efectores de LP, estos animales

25: muestran una proporción similar de células Treg que los ratones WT, lo que indica que el

balance Treg/Teff está muy di sminuido. Estos datos soportan adici onalmente que los

ratones defi cientes en PSGL-I tienen una generación defectuosa de células Treg, un

fenómeno que contribuye muy probablemente al daño ti sular aumentado observado tras

la inducción de CU. Por tanto, estos hallazgos indican que el acoplamiento de PSGL-l en

30: CO y macrófagos es necesario para la regulación de respuestas de células inmunitarias

inn atas así como para la modulación de respuestas de células T adaptati va s y el

inicio/resolución de los fenómenos inflamatorios. Como consecuencia, ésto sitúa a la

2.

PSGL-l como una diana potencial novedosa para la intervención farmacológica para

mejorar o resolver enfermedades inflamatorias tales como EH y autoinmunes como la esclerosis sistémica.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Uso de un agente activador de PSGL-I para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad seleccionada entre una enfermedad inflamatoria y una enfermedad autoinmune, en donde dicho activador de PSGL-I es un ant ¡cuerpo anti-PSGL-l.
2.

Uso según la reivindicación 1, en el que dicha enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria del intestino.
3.

Uso según la reivindicación 2, en el que dicha enfermedad inflamatoria del intestino se selecciona del grupo formado por colitis ulcerosa, colitis colagenosa, colitis litlfocítica, colitis isquémica, colitis por diversión, síndrome de Beh<;et, colitis indeterminada, gastroenteritis y enfermedad de Crohn.
4.

Uso según la reivindicación 1, en el que dicha enfermedad autoinmune se selecciona del grupo formado por esclerosis sistémica, alopecia areata, espondilitis anquilosante, cardiomiopatía autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad autoinmune del oído interno, síndrome linfoproliferativo autoinmune, neuropatía periférica auto inmune, pancreatitis auto inmune, síndrome poliendocrino auto inmune, dermatitis auto inmune por progesterona, púrpura trombocitopénica autoinmune, uveítis autoinmune, enfermedad celiaca, enfermedad de la aglutinina fría, enfermedad de erohn, dermatomiositis, diabetes mellitus tipo 1, fascitis eosinofilica, penfigoide gastrointestinal, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, encefalitis de Hashimoto, tiroiditis de Hashimoto, lupus eritematoso, síndrome Miller-Fisher, enfermedad mixta del tejido conectivo, miastenia grave, narcolepsia, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, polimiositis, cirrosis biliar primaria, colangitis escJerosante primaria, psoriasis, artritis psoriatica, policondritis recidivante, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren's, arteritis temporal, colitis ulcerosa, vasculitis y granulomatosís de Wegener.