WO2023112454A1 - 腸管腫瘍抑制剤、ｐｇｅ２産生抑制剤、及びｉｌ－２２ｂｐ産生促進剤 - Google Patents

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WO2023112454A1
WO2023112454A1 PCT/JP2022/038130 JP2022038130W WO2023112454A1 WO 2023112454 A1 WO2023112454 A1 WO 2023112454A1 JP 2022038130 W JP2022038130 W JP 2022038130W WO 2023112454 A1 WO2023112454 A1 WO 2023112454A1
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mice
glucan
clec7a
intestinal
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洋一郎 岩倉
策 唐
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学校法人東京理科大学
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    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
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    • A61K31/716—Glucans
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present disclosure relates to intestinal tumor inhibitors, PGE 2 production inhibitors, and IL-22BP production promoters.
  • CRC Colorectal cancer
  • the C-type lectin receptor is one of the pattern recognition receptors and is mainly involved in host defense against pathogens by recognizing pathogen-specific sugar chain structures.
  • Dectin-1 also called Dectin-1 or DECTIN-1, gene symbol: Clec7a or CLEC7A
  • Clec7a or CLEC7A a member of the myeloid type II C lectin family
  • Non-Patent Document 1 Taylor, P.R., et al., J Immunol 169, 3876-3882 (2002)). Since glucans are major cell wall components of most fungi, dectin-1 is the first line of host defense against fungal infections (Taylor, P.R., et al., Nat Immunol 8,31-38 (2007 ), Saijo, S., et al., Nat Immunol 8, 39-46 (2007)).
  • curdlan a dectin-1 agonist ligand
  • curdlan a dectin-1 agonist ligand
  • autoimmune mice with spontaneous mutations in ZAP-70
  • Dectin-1-induced IL-22 exacerbates airway hyperreactivity by inducing proallergic chemokines and mucus (Lilly, L.M., et al., J Immunol 189, 3653-3660 (2012)) .
  • dectin-1 deficiency led to the overgrowth of the resident bacterium Lactobacillus murinus, which is capable of inducing the differentiation of regulatory T (Treg) cells, in the mouse colon, resulting in dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis.
  • Reg regulatory T
  • DSS dextran sodium sulfate
  • Dectin-1 therefore activates the immune system primarily to combat pathogens, but this activity can also induce or enhance inflammation-related diseases.
  • Dectin-1 signals enhance the tumoricidal activity of NK cells by binding to N-glycans of B16 melanoma cells and inducing INAM of DCs (Chiba, S., et al., Elife 3, e04177 ( 2014)).
  • Dectin-1 increases the expression of TNFSF15 and OX40L on DC by activating Raf1 and NF-kB, and promotes the differentiation of antitumor Th9 cells (Zhao, Y., et al., Nat Commun 7, 12368 (2016)). Dectin-1 is also reported to suppress the development of hepatocellular carcinoma caused by chemical carcinogens by inducing M-CSF and suppressing the expression of Toll-like receptor (TLR) 4 and CD14. (Seifert, L., et al., Cell Rep 13, 1909-1921 (2015)).
  • TLR Toll-like receptor
  • dectin-1 recognizes the non-canonical ligand galectin-9 expressed in pancreatic ductal adenocarcinoma and suppresses the differentiation of antitumor M1 macrophages, suggesting that dectin-1 signaling promotes the development of pancreatic tumors.
  • Non-Patent Document 2 Daley, D., et al., Nat Med 23, 556-567 (2017)).
  • the present disclosure has been made in view of the above, and the present disclosure provides an intestinal tumor suppressing agent capable of suppressing intestinal tumors, a PGE 2 production suppressing agent capable of suppressing PGE 2 production, and IL-22BP production.
  • An object of the present invention is to provide an IL-22BP production promoter capable of promoting
  • ⁇ 1> An intestinal tumor inhibitor containing ⁇ -glucan having dectin-1 inhibitory activity and suppressing intestinal tumors via dectin-1 inhibition.
  • ⁇ 2> The ⁇ -glucan according to ⁇ 1>, wherein the ⁇ -glucan is a ⁇ -glucan containing ⁇ -1,3 linkages or a ⁇ -glucan containing ⁇ -1,6-linked branch chains in the main chain of ⁇ -1,3 linkages. Intestinal tumor inhibitor.
  • ⁇ 3> The intestinal tumor inhibitor according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the ⁇ -glucan has a molecular weight of 0.2K to 100K.
  • ⁇ 4> The intestinal tumor inhibitor according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the ⁇ -glucan is laminarin.
  • ⁇ 5> A PGE 2 production inhibitor containing a ⁇ -glucan having dectin-1 inhibitory activity.
  • ⁇ 6> The ⁇ -glucan according to ⁇ 5>, wherein the ⁇ -glucan is a ⁇ -glucan containing ⁇ -1,3 linkages or a ⁇ -glucan containing ⁇ -1,6-linked branch chains in the main chain of ⁇ -1,3 linkages.
  • PGE 2 production inhibitor ⁇ 7> The PGE 2 production inhibitor according to ⁇ 5> or ⁇ 6>, wherein the ⁇ -glucan has a molecular weight of 0.2K to 100K.
  • ⁇ 8> The PGE 2 production inhibitor according to any one of ⁇ 5> to ⁇ 7>, wherein the ⁇ -glucan is laminarin.
  • ⁇ 9> IL-22BP production promoter containing ⁇ -glucan having dectin-1 inhibitory activity.
  • ⁇ 10> The ⁇ -glucan according to ⁇ 9>, wherein the ⁇ -glucan is a ⁇ -glucan containing ⁇ -1,3 linkages or a ⁇ -glucan containing ⁇ -1,6-linked branched chains in a ⁇ -1,3-linked main chain.
  • IL-22BP production promoter The PGE 2 production inhibitor according to any one of ⁇ 5> to ⁇ 7>, wherein the ⁇ -glucan is laminarin.
  • IL-22BP production promoter containing ⁇ -glucan having dectin-1 inhibitory activity.
  • IL-22BP production promoter The ⁇ -glucan according to ⁇ 9>, wherein the ⁇ -glucan is a ⁇ -glu
  • ⁇ 11> The IL-22BP production promoter according to ⁇ 9> or ⁇ 10>, wherein the ⁇ -glucan has a molecular weight of 0.2K to 100K.
  • ⁇ 12> The IL-22BP production promoter according to any one of ⁇ 9> to ⁇ 11>, wherein the ⁇ -glucan is laminarin.
  • ⁇ 13> An intestinal tumor inhibitor containing a dectin-1 inhibitor and suppressing intestinal tumors via dectin-1 inhibition.
  • ⁇ 14> The intestinal tumor inhibitor according to ⁇ 13>, wherein the dectin-1 inhibitor is a dectin-1 antagonist.
  • the intestinal tumor is an intestinal tumor with increased expression of PGE 2 or an intestinal tumor with decreased expression of IL-22BP, ⁇ 1> to ⁇ 4>, ⁇ 13>, and ⁇ 14 The intestinal tumor inhibitor according to any one of >.
  • ⁇ 18> The ⁇ -glucan having dectin-1 inhibitory activity according to ⁇ 17> above, wherein the intestinal tumor is an intestinal tumor associated with increased expression of PGE2 .
  • ⁇ 19> The ⁇ -glucan having dectin-1 inhibitory activity according to ⁇ 17> or ⁇ 18> above, wherein the intestinal tumor is an intestinal tumor associated with decreased expression of IL-22BP.
  • ⁇ 20> Use of a ⁇ -glucan having dectin-1 inhibitory activity in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of intestinal tumors.
  • ⁇ 21> The use according to ⁇ 20> above, wherein the intestinal tumor is an intestinal tumor associated with increased expression of PGE2 .
  • ⁇ 22> The use according to ⁇ 20> or ⁇ 21> above, wherein the intestinal tumor is an intestinal tumor associated with decreased expression of IL-22BP.
  • a method for predicting the severity of an intestinal tumor comprising measuring at least one of the dectin-1 protein expression level and the CLEC7A gene expression level in a tumor tissue.
  • an intestinal tumor suppressing agent capable of suppressing intestinal tumors
  • a PGE 2 production inhibitor capable of suppressing PGE 2 production
  • an IL-22BP production promoting agent capable of promoting IL-22BP production agents
  • Dectin-1 deficiency suppresses colon tumors, and this suppression is independent of resident microbes.
  • Germ-free (GF) WT and Clec7a ⁇ / ⁇ mice were administered AOM followed by 3 cycles of 1 wt % DSS administration. Thirty-six weeks after AOM administration, these mice were euthanized.
  • Dectin-1 signaling promotes MDSC differentiation in colon tumors.
  • Apc Min/+ and Apc Min/+ Clec7a ⁇ / ⁇ mice were administered 1 wt % DSS for 7 days and euthanized after 4 weeks.
  • Apc Min/+ and Apc Min/+ Clec7a ⁇ / ⁇ mice were administered 1 wt % DSS for 7 days and euthanized after 4 weeks.
  • WT and Clec7a ⁇ / ⁇ mice were administered AOM followed by 3 cycles of 1 wt % DSS administration and euthanized 12 weeks after AOM administration.
  • Flow cytometric analysis was performed to identify Dectin-1 expressing cells in colon polyps and non-polyp tissues.
  • WT SPF mice were administered AOM followed by 3 cycles of DSS.
  • mice After 11 weeks, these mice were euthanized and CD11b + and CD11c + cells were purified from colon polyps using autoMACS. Purified cells were stimulated with the agonist ⁇ -glucan OXCA or treated with the antagonist ⁇ -glucan laminarin for 3 hours followed by OXCA for 16 hours and the expression of Il6 and Il1b was measured by qPCR. .
  • the data in ( Figures 2a-2d) are representative of two independent experiments, and the data in ( Figures 2a, 2b, 2d) are expressed as mean ⁇ SD. *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001, ***p ⁇ 0.0001.
  • WT and Clec7a ⁇ / ⁇ GF mice were administered AOM followed by 3 cycles of 1 mass % DSS administration. Thirty-six weeks after AOM administration, these mice were euthanized (same experiments described in Figures 1i-1k) and RNA was purified from the polyps and surrounding non-polypoid tissue and analyzed by RNA-seq. Heat map showing comparison of cytokines, cytokine receptors, chemokines, cell surface markers, and T-cell transcription factor-related genes in polyp and non-polyp tissues between WT and Clec7a ⁇ / ⁇ mice.
  • the KEGG database was used to compare cell populations, signaling pathways, and metabolic pathways between polyps from GF Clec7a ⁇ / ⁇ mice and those from WT mice.
  • a heatmap is shown comparing WT and Clec7a ⁇ / ⁇ mice for MDSC- and non-MDSC-associated genes.
  • Heat map showing comparison of prostaglandin E 2 (PGE 2 ) synthase-encoding genes in WT and Clec7a ⁇ / ⁇ mice.
  • PGE 2 prostaglandin E 2
  • IL-22bp which is upregulated in Clec7a ⁇ / ⁇ mice, suppresses intestinal tumor development in Apc Min mice.
  • Representative photographs of the small intestine of 20 week old Apc Min/+ and Apc Min/+ Clec7a ⁇ / ⁇ mice and 15 week old Apc Min/+ Clec7a ⁇ / ⁇ Il-22bp ⁇ / ⁇ mice are shown.
  • the indicated cell types in polyp and non-polyp tissues were purified by autoMACS and examined for Il-22bp expression by qPCR.
  • CD11c + and CD11c ⁇ CD11b + cells were purified by autoMACS and the expression of Il-22bp in these subsets was examined by qPCR.
  • C57BL/6J mice were administered AOM followed by 3 cycles of DSS. Eleven weeks after AOM administration, these mice were euthanized and CD11b + CD11c + cells were purified from colonic polyps. Cells were then stimulated with OXCA and Il-22bp expression was measured by qPCR. In the final experimental group, laminarin treatment was performed 3 hours before OXCA treatment.
  • the data in (Figs. 4a, 4d-4h) are representative of two independent experiments, and the data in (Figs. 4a, 4d, 4f-4h) are expressed as mean ⁇ SD. **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001, ***p ⁇ 0.0001.
  • AOM was administered to C57BL/6J mice, and 5% by mass laminarin-containing powdered food was administered (continuously for 10 days/cycle) from 3 days before to the end of DSS administration for 1 week, for a total of 3 cycles.
  • AOM was administered to C57BL/6J mice, and 5% by mass laminarin-containing powdered food was administered (continuously for 10 days/cycle) from 3 days before to the end of DSS administration for 1 week, for a total of 3 cycles.
  • AOM was administered to C57BL/6J mice, and 5% by mass laminarin-containing powdered food was administered (continuously for 10 days/cycle) from 3 days before to the end of DSS administration for 1 week, for a total of 3 cycles.
  • CRC patients have altered expression of PGE2 synthase and IL22RA.
  • Dectin-1 deficiency suppresses colon tumors, and this suppression is independent of resident microbes.
  • Mouse anal prolapse was observed.
  • the incidence of anal prolapse and colon tumors in mice was statistically calculated.
  • Dectin-1 expressing cells in colon tumors are MHC-II - myeloid cells.
  • WT or Clec7a ⁇ / ⁇ GF mice were administered AOM, and 7 days later, 1 wt % DSS was administered for 5 days for a total of 3 cycles.
  • the experiment described in Figure 2a was performed and shows a dot plot panel showing the ratio of T cells, B cells and DC in tumor infiltrating cells as measured by flow cytometry.
  • WT mice were administered AOM, and 7 days later, 1 wt% DSS was administered for 7 days for a total of 3 cycles.
  • Mice were euthanized 13 weeks after the first AOM administration and Dectin-1 expressing cell types infiltrating colonic polyps were determined by flow cytometry. Note that the data in (FIGS. 9a-9d) are representative of two independent experiments.
  • RNA-seq Synthesis of retinoic acid (RA) is not directly controlled by Dectin-1 signaling.
  • WT or Clec7a ⁇ / ⁇ GF mice were administered AOM, and 7 days later, 1 wt % DSS was administered for 5 days for a total of 3 cycles. Mice were euthanized 36 weeks after the first AOM administration and the expression of genes encoding RA-associated synthase was measured by RNA-seq.
  • RNA of polyp or non-polyp intestinal tissue from WT and Clec7a ⁇ / ⁇ mice administered AOM followed by 3 cycles of DSS for a total of 16 weeks was harvested and expression of the indicated genes involved in RA synthesis was analyzed.
  • WT mice receiving AOM followed by 3 cycles of DSS for 12 weeks were euthanized and colonic CD11b + and CD11c + bone marrow-derived cells were purified by autoMACS. After pre-incubation with laminarin for 3 hours, these cells were stimulated with OXCA for 16 hours and mRNA expression of genes involved in RA synthesis was examined by RTqPCR.
  • the data in (Figs. 11a, 11c, and 11d) are expressed as mean ⁇ SD. *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001.
  • Dectin-1 endogenous ligand levels are unchanged in colonic polyps.
  • Dot panel of the flow cytometric analysis performed in Figure 6i WT or Clec7a ⁇ / ⁇ GF mice were administered AOM, and 7 days later, 1 wt % DSS was administered for 5 days for a total of 3 cycles. Mice were euthanized 36 weeks after the first AOM administration and expression of the indicated genes encoding potential Dectin-1 endogenous ligands was determined by RNA-seq.
  • PGE 2 synthase is induced by Dectin-1 signaling in CRC patients.
  • Disease-free (left panel) and progression-free survival (right panel) in patients with CLEC7A gene mutations or control CRC patients without gene mutations were compared by analyzing shared data from the TCGA database.
  • a total of 44 CRC patient non-tumor specimens were collected to demonstrate the correlation of expression between PGE 2 synthase and Dectin-1.
  • Fresh CRC specimens were collected after surgery and a small piece of tumor tissue was stimulated with curdlan for 20 hours. For laminarin treatment, the tissue was first treated with laminarin for 4 hours and then curdlan was added to the culture.
  • Expression of PGE2 synthase was determined by qPCR. Data are mean ⁇ SD of triplicate wells. *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ****p ⁇ 0.0001.
  • the present disclosure is not limited to the following embodiments.
  • its constituent elements including elemental steps, etc.
  • the term "process” includes a process that is independent of other processes, and even if the purpose of the process is achieved even if it cannot be clearly distinguished from other processes.
  • the numerical range indicated using "-" includes the numerical values before and after "-" as lower and upper limits, respectively.
  • the upper limit or lower limit of one numerical range may be replaced with the upper or lower limit of another numerical range described step by step. .
  • the upper and lower limits of the numerical ranges may be replaced with the values shown in the examples.
  • the content of each component in the composition is the total of the multiple types of substances present in the composition unless otherwise specified. means content.
  • the intestinal tumor suppressor of the present disclosure contains a dectin-1 inhibitor and suppresses intestinal tumors via dectin-1 inhibition.
  • the intestinal tumor suppressor of the present disclosure contains ⁇ -glucan with dectin-1 inhibitory activity and suppresses intestinal tumors via dectin-1 inhibition.
  • the PGE 2 production inhibitor and IL-22BP production promoter of the present disclosure contain ⁇ -glucan having dectin-1 inhibitory activity.
  • dectin-1 deficiency suppresses colon tumor development, and that this is mediated by suppression of PGE2 production and promotion of IL-22BP production, independent of indigenous microorganisms. rice field. This finding suggests that inhibition of dectin-1, suppression of PGE2 production, and/or promotion of IL-22BP production will be one of the useful strategies for suppressing intestinal tumors.
  • the term "dectin-1 inhibitor” refers to a substance having inhibitory activity on the function of dectin-1.
  • the inhibitory activity of Dectin-1 function may be, for example, the activity of inhibiting the active site of Dectin-1, or the activity of inhibiting other than the active site of Dectin-1 (i.e., non-competitive inhibition).
  • the Dectin-1 inhibitors of the present disclosure inhibit Dectin-1 function, suppress PGE2 production, and promote IL-22BP production.
  • the target substance is a dectin-1 inhibitor, ie, whether or not the target substance inhibits the function of dectin-1, is confirmed as follows. All cells of the spleen and regional lymph nodes were collected from C57BL/6 male mice, CD11b + & CD11c + cells were purified by MACS, placed in a 96-well culture plate at a cell count of 4 ⁇ 10 5 cells/well, and subjected to the target substance. was diluted to various concentrations and cultured for 3 hours.
  • depleted-Zymosan (InvivoGen, Catalog #tlrl-zyd, USA) treated with polymyxin B for 1 hour was added to the culture wells at a concentration of 100 ⁇ g/ml, cultured for an additional 48 hours, the supernatant was collected, and ELISA was performed. to examine the amount of TNF produced. Compare the amount of TNF produced when the target substance is added and when an equal amount of solvent is added instead of the control substance. If TNF production is suppressed, it can be determined that the function of Dectin-1 is inhibited. .
  • Dectin-1 inhibitors include binding inhibitors that inhibit ligand binding to dectin-1, dectin-1 activity inhibitors, and signal transduction inhibitors that inhibit signal transduction from dectin-1.
  • agonist activity can be evaluated by evaluating how much cytokine production such as IL-1 ⁇ and TNF ⁇ , which are induced when dectin-1-expressing cells are stimulated with long-chain ⁇ -glucan such as curdlan, is inhibited. can also be evaluated.
  • beta-glucans with dectin-1 inhibitory activity can be useful as intestinal tumor suppressors.
  • ⁇ -glucans with small molecular weights are known to inhibit dectin-1.
  • the ⁇ -glucans with large molecular weights are degraded into soluble ⁇ -glucan fragments with smaller molecular weights. That is, for example, when insoluble ⁇ -glucan with a large molecular weight is orally ingested, part of the ⁇ -glucan is decomposed into soluble ⁇ -glucan with a small molecular weight.
  • Soluble ⁇ -glucan is thought to suppress PGE 2 production by inhibiting intestinal dectin-1 signaling, thereby promoting IL-22BP production and consequently suppressing tumorigenesis in the intestinal tract. . Note that the present disclosure is in no way limited to the above estimation mechanism.
  • ⁇ -glucan is a polysaccharide in which glucose is polymerized via ⁇ -1,3 bonds.
  • Materials for producing ⁇ -glucan are not particularly limited as long as they contain ⁇ -glucan.
  • ⁇ -glucan is abundantly contained in the cell walls of mushrooms, fungi, yeasts, seaweeds, etc., and can be produced using these as materials.
  • ⁇ -glucan can be produced by a known method. For example, ⁇ -glucan can be extracted by soaking mushrooms, fungi, yeast, seaweed, etc. in hot water.
  • seaweed is suitable as a material because it contains a large fraction of ⁇ -glucan with a molecular weight of 0.2K to 100K.
  • ⁇ -glucan contained in seaweed is called laminarin. Since ⁇ -glucan extracted from mushrooms, fungi, yeast, etc. has a large molecular weight, it may be reduced in molecular weight by heat treatment, acid treatment, or the like. ⁇ -glucans extracted from mushrooms, fungi, yeast and the like are described, for example, in Ishimoto, Y., Ishibashi, K. I., Yamanaka, D., Adachi, Y., Kanzaki, K., Okita, K., Iwakura, Y., and Ohno, N. Modulation of an innate immune response by soluble yeast b-glucan prepared by a heat degradation method. Int. J. Biol.
  • Laminarin refers to a ⁇ -glucan derived from seaweed such as Eisenia Bicyclis, also called laminaran.
  • Laminarin is a type of soluble ⁇ -glucan.
  • Laminarin may be a ⁇ -glucan containing ⁇ -1,3 linkages or a ⁇ -glucan containing ⁇ -1,6-linked branch chains in a ⁇ -1,3-linked backbone. That is, laminarin may have ⁇ -1,6-linked side chains on the long ⁇ -1,3-linked sugar chain.
  • the structure of laminarin is represented, for example, by the following general formula (H is present at the non-reducing end and OH is present at the reducing end).
  • n1, n2 and m each represent the number of each structural unit.
  • the sum of n1 and n2 represents the length of the 1-3 bond main chain, and m represents the length of the 1-6 bond branch chain.
  • Each of n1, n2 and m represents an integer of 1 or more, preferably an integer of 2-500.
  • n1+n2 more preferably represents an integer of 2 to 25 from the viewpoint of superior antagonist activity against dectin-1.
  • laminarin is abundantly contained in the cell walls of brown algae such as Laminariales and Fucusaceae, and can be extracted from these brown algae. Extraction can be done by a variety of methods. For example, extraction by immersing the material in hot water, or as described in Matsuda et al. Extraction of laminarin can be performed by the method.
  • the ⁇ -glucan of the present disclosure is preferably soluble ⁇ -glucan, and ⁇ -glucan containing ⁇ -1,3 bond or ⁇ -1, A ⁇ -glucan containing a ⁇ -1,6-linked branched chain in the three-bonded main chain is also preferred, and a ⁇ -glucan derived from seaweed is also preferred. It is particularly preferred that the ⁇ -glucan of the present disclosure is laminarin.
  • soluble ⁇ -glucan is also referred to as water-soluble ⁇ -glucan.
  • soluble ⁇ -glucan means ⁇ -glucan that can dissolve 20 g or more in 1 L of water at 25°C.
  • the molecular weight of the ⁇ -glucan having dectin-1 inhibitory activity of the present disclosure is preferably 100K or less, and 0.2K, from the viewpoint of dectin-1 activation inhibitory action. ⁇ 100K is more preferred.
  • the molecular weight of the ⁇ -glucan of the present disclosure may be 0.2K to 50K, 1K to 10K, 5K or less, or 0.2K to 5K. It should be noted that the ⁇ -glucan of the present disclosure preferably has a molecular weight of 5K or less because of its excellent inhibitory activity against dectin-1.
  • the molecular weight distribution of the ⁇ -glucan of the present disclosure may be monomodal containing ⁇ -glucans of one molecular weight, bimodal containing ⁇ -glucans of two molecular weights, multimodal such as trimodal, Alternatively, it may have a smeared molecular weight distribution.
  • molecular weight indicates weight average molecular weight.
  • the molecular weight of ⁇ -glucan can be determined by known methods. Weight average molecular weight can be measured by gel permeation chromatography (GPC). A molecular weight of 1K indicates a molecular weight of 1,000.
  • a known method can be adopted as a method for obtaining ⁇ -glucan.
  • a ⁇ -glucan mixture containing ⁇ -glucans of various molecular weights is dissolved in distilled water (100 mg/ml) and treated against distilled water for 2 days at 4°C using dialysis membranes with arbitrary molecular weight cut-off values. After dialysis, the dialyzed internal solution is collected and freeze-dried to obtain ⁇ -glucan having an arbitrary molecular weight.
  • a ⁇ -glucan with a specific molecular weight can be obtained from a mixture containing ⁇ -glucans with various molecular weights by known methods such as ultrafiltration, dialysis and gel filtration.
  • ⁇ -glucan with a molecular weight of more than 100K is used as a material to prepare ⁇ -glucan with a molecular weight of 100K or less
  • the material can be chemically or enzymatically hydrolyzed before use.
  • chemical hydrolysis for example, acids can be used.
  • enzymatic hydrolysis for example, endo- ⁇ -glucanase-type enzymes can be used.
  • a dry powder of brown algae containing a high proportion of ⁇ -glucan with a specific molecular weight may be used as long as the effects of the present disclosure are achieved.
  • More detailed methods for obtaining ⁇ -glucan with a lower molecular weight from high-molecular-weight ⁇ -glucan include, for example, the following methods.
  • 1,000 mg of high-molecular-weight ⁇ -glucan eg, fungal-derived ⁇ -glucan
  • 50 ml of 58% (w/w) concentrated sulfuric acid are added while cooling, and stirred and mixed at 20° C. for 3 hours.
  • 350 ml of ice water is added to the flask to dilute it 8-fold, and calcium hydroxide is added to neutralize to pH 7.0.
  • the filtered substance is concentrated by an evaporator, centrifuged, and freeze-dried to obtain a low-molecular-weight ⁇ -glucan (for example, a molecular weight of 100K or less). of ⁇ -glucan) is obtained.
  • a low-molecular-weight ⁇ -glucan for example, a molecular weight of 100K or less.
  • the dectin-1 inhibitory activity of ⁇ -glucan refers to an activity capable of inhibiting dectin-1 activation by acting as a dectin-1 antagonist. More specifically, the dectin-1 inhibitory activity may be an activity that directly inhibits the active site of dectin-1 (ie, competitive inhibition), or inhibits other than the active site of dectin-1 (ie, non-competitive inhibition). may be active.
  • ⁇ -glucan has dectin-1 inhibitory activity by radioactively labeling curdlan, an agonist ligand of dectin-1, with [ 3 H] and detecting the binding inhibitory activity of this radioactivity to dectin-1. It can be confirmed by evaluation.
  • dectin-1 inhibitory activity is evaluated by how much cytokine production such as IL-1 ⁇ and TNF ⁇ , which is induced when dectin-1 expressing cells are stimulated with long-chain ⁇ -glucan such as curdlan, is inhibited. It is also possible to evaluate by
  • dectin-1 inhibition Suppression of intestinal tumors through dectin-1 inhibition is associated with dectin-1-regulated and intestinal tumor cytokines such as GM-CSF, IL-6, IL-1, TNF; PGE 2 ; IL It can be confirmed by measuring the expression level of -22 binding protein by ELISA.
  • the method of administering the dectin-1 inhibitor, ⁇ -glucan, or agent containing the same to the subject is not particularly limited, and may be oral or parenteral administration (e.g., subcutaneous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, eye drops, ear drops, etc.). , nasal administration, inhalation administration, transdermal administration, transrectal administration, intrathecal administration, or intravenous administration), but oral administration or enteral administration is preferred.
  • Dosage forms suitable for oral administration include, for example, tablets, capsules, powders, granules, liquids, elixirs and the like.
  • Subjects to which the dectin-1 inhibitor, ⁇ -glucan, or agent containing them is administered are not particularly limited, but humans, monkeys, cows, pigs, horses, donkeys, sheep, goats, deer, dogs, cats, rabbits, mice, Preferred are mammals such as rats, guinea pigs, hamsters and squirrels, and birds such as chickens, ducks, ducks, geese, pheasants, pigeons, quails, guinea fowls, turkeys, parakeets and parrots. Mammals are particularly preferred subjects.
  • the dectin-1 inhibitor or ⁇ -glucan used in the present disclosure is preferably administered to a subject after being mixed with a drug, food, or feed.
  • the intestinal tumor inhibitor, PGE 2 production inhibitor, and IL-22BP production promoter of the present disclosure may contain other components such as sugar chains other than ⁇ -glucan as long as they have the effects of the present disclosure.
  • ingredients include, for example, ingredients such as vitamins and amino acids, excipients, thickeners, tonicity agents (e.g., solutes such as salt and glucose), and other formulation additives.
  • Pharmaceutical additives include, for example, liquid media such as water, physiological saline, dextrose or similar sugar solutions; glycols such as ethylene glycol, propylene glycol, polyethylene glycol, polypropylene glycol; antioxidants such as sulfites; pH adjusters and buffers such as sodium citrate, sodium acetate and sodium phosphate; Stabilizers such as sodium pyrosulfite, EDTA, thioglycolic acid and thiolactic acid; Tonicity agents such as sodium chloride and glucose; Hydrochloric acid local anesthetics such as procaine and lidocaine hydrochloride; surfactants such as dimethylsulfoxide (DMSO); In addition to these, known additives may be contained according to the dosage form.
  • liquid media such as water, physiological s
  • the dosage of the intestinal tumor suppressor, PGE 2 production inhibitor, and IL-22BP production promoter of the present disclosure is an amount effective for suppressing intestinal tumor, suppressing PGE 2 production, or promoting IL-22BP production. Just do it. It is preferable that the dosage is appropriately increased or decreased depending on the age, condition, symptoms, family history and the like. Moreover, you may administer multiple times. When administering multiple doses, the administration interval is preferably increased or decreased as appropriate depending on the disease state, symptoms, and the like.
  • the intestinal tract may be either the large intestine (more specifically, the cecum, colon, rectum, etc.) or the small intestine (more specifically, the duodenum, jejunum, ileum, etc.). and small intestine.
  • the intestinal tumor inhibitor of the present disclosure may be a therapeutic agent for reducing the number of intestinal tumors, which is administered to a subject with an intestinal tumor and used therapeutically to reduce the number of already formed tumors.
  • the intestinal tumor inhibitor of the present disclosure is a prophylactic agent for reducing the number of intestinal tumors, which is administered to a subject who does not have an intestinal tumor and is used prophylactically to reduce the number of tumors that may form in the future. good too.
  • the intestinal tumor-suppressing agent of the present disclosure may be a therapeutic agent for reducing intestinal tumors, which is administered to a subject with an intestinal tumor and used therapeutically to reduce the size of an already formed tumor. .
  • the intestinal tumor-suppressing agent of the present disclosure is a prophylactic agent for intestinal tumor reduction, which is administered to a subject who does not have an intestinal tumor and is used prophylactically to reduce the size of a tumor that may be formed in the future. good too.
  • the intestinal tumor suppressor of the present disclosure By administering the intestinal tumor suppressor of the present disclosure to a subject, PGE 2 production in the subject can be suppressed. That is, the intestinal tumor inhibitor of the present disclosure may be used as a PGE 2 production inhibitor.
  • IL-22BP production in the subject can be promoted. That is, the intestinal tumor suppressor of the present disclosure may be used as an IL-22BP production promoter.
  • PGE 2 prostaglandin E 2
  • PGE 2 prostaglandin E 2
  • IL-22BP IL-22 binding protein
  • the intestinal tumor suppressor of the present disclosure inhibits dectin-1 signaling to suppress PGE 2 synthesized (produced) from MDSCs (myeloid-derived suppressor cells), thereby further inhibiting growth of MDSCs, and It is believed that the production of IL-22BP is promoted, ultimately suppressing intestinal tumorigenesis.
  • visual inspection endoscopic examination, histological examination (e.g., cytological examination, histopathological examination, etc.), marker examination (e.g., blood test, urine test, etc.) of the intestinal tract are used as indicators of intestinal tumor suppression. etc.), or image diagnosis (for example, X-ray examination, CT examination, MRI examination, PET examination, ultrasonography, etc.) or the like can be performed.
  • histological examination e.g., cytological examination, histopathological examination, etc.
  • marker examination e.g., blood test, urine test, etc.
  • image diagnosis for example, X-ray examination, CT examination, MRI examination, PET examination, ultrasonography, etc.
  • the protein expression level or mRNA expression level of PGE 2 in intestinal tumors or an enzyme involved in PGE 2 synthesis or its gene (e.g., Pla2g2a or Pla2g2e (Phospholipase A2 group IIA/IIE), Ptgs1
  • it can be evaluated by reducing the mRNA expression level of Ptgs2 (Cox1/Cox2), or Ptges2 or Ptges3 (PGE 2 synthase 2/3), etc.
  • an increase in IL-22BP protein expression level or IL-22BP gene (Il-22bp) mRNA expression level in intestinal tumors can be evaluated.
  • suppression of PGE 2 production can be judged by a decrease in the protein expression level or mRNA expression level of PGE 2 in the sample.
  • the protein expression level of PGE 2 can be measured by a known method such as ELISA.
  • the expression level of PGE2 mRNA can be measured by a known method such as real-time PCR.
  • promotion of IL-22BP production can be determined by an increase in IL-22BP protein expression level or mRNA expression level in a sample.
  • the protein expression level of IL-22BP can be measured by a known method such as ELISA.
  • the IL-22BP mRNA expression level can be measured by a known method such as real-time PCR.
  • the present disclosure also provides a method of preventing or treating intestinal tumors comprising administering an effective amount of a dectin-1 inhibitor to a subject. Furthermore, the present disclosure also provides a method for preventing or treating intestinal tumors, which comprises administering to a subject an effective amount of ⁇ -glucan having dectin-1 inhibitory activity.
  • the intestinal tumor may be an intestinal tumor with increased expression of PGE 2 or an intestinal tumor with decreased expression of IL-22BP.
  • the present disclosure also provides Dectin-1 inhibitors for use in preventing or treating intestinal tumors.
  • the present disclosure further provides ⁇ -glucans with dectin-1 inhibitory activity for use in preventing or treating intestinal tumors.
  • the intestinal tumor may be an intestinal tumor with increased expression of PGE 2 or an intestinal tumor with decreased expression of IL-22BP.
  • the present disclosure further provides use of Dectin-1 inhibitors in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of intestinal tumors. Furthermore, the present disclosure also provides use of ⁇ -glucan having dectin-1 inhibitory activity in the manufacture of a medicament for preventing or treating intestinal tumors.
  • the intestinal tumor may be an intestinal tumor with increased expression of PGE 2 or an intestinal tumor with decreased expression of IL-22BP.
  • “Increase in expression” and “decrease in expression” in the above embodiments can be evaluated by measuring the amount of the target molecule in tumor tissue and non-tumor tissue by ELISA, real-time PCR, or the like. It can also be evaluated by measuring the amount of the molecule of interest in tumor tissue and comparing it to a known standard amount.
  • the present disclosure also provides a method for predicting the severity of an intestinal tumor, which comprises measuring at least one of the Dectin-1 protein expression level and the CLEC7A gene expression level in tumor tissue. Measurements may be performed in vivo or in vitro.
  • the method for measuring the Dectin-1 protein expression level and the CLEC7A gene expression level in tumor tissue is not particularly limited, and a commonly performed protein quantification method (for example, ELISA) or gene (for example, mRNA) quantification method (for example, real-time PCR, etc.) may also be used.
  • a commonly performed protein quantification method for example, ELISA
  • gene for example, mRNA
  • quantification method for example, real-time PCR, etc.
  • Dectin-1 deficiency suppresses colon tumorigenesis in a manner independent of resident microbes.
  • Weight loss after DSS administration in Apc Min/+ dectin-1-deficient (Clec7a ⁇ / ⁇ ) mice was significantly milder than in Apc Min/+ mice (FIG. 8a).
  • Wild-type (WT) and Clec7a ⁇ / ⁇ mice were then given three cycles of azoxymethane (AOM) and DSS (AOM-3DSS) using another chemical-induced colon tumor model.
  • Clec7a ⁇ / ⁇ mice showed less weight loss than WT mice during 3 cycles of DSS administration (FIG. 8e).
  • Clec7a ⁇ / ⁇ mice had significantly milder shortening of colon length (FIGS. 1e, 8f).
  • the number of polyps in Clec7a ⁇ / ⁇ mice induced by AOM-3DSS was significantly lower than that in WT mice (FIG. 1f).
  • Clec7a ⁇ / ⁇ mice also had significantly milder anal prolapse (FIGS.
  • Dectin-1 is widely known to be expressed on DCs, but in mouse colonic polyps, flow cytometry analysis revealed that Dectin-1 expression was mainly found in CD103 ⁇ CD11c ⁇ CD11b + cells ( 2c, 92.4%). Further analysis of the Dectin-1 expressing population showed that nearly 75% of Dectin-1 + were MHC-II ⁇ , of which nearly 50% were Ly6C int Ly6G + CD11b + and 5% were Ly6C hi CD11b + . , 19% were CD11c ⁇ MHC-II ⁇ Gr1 ⁇ CD11b + cells (FIG. 9d).
  • tumor-infiltrating myeloid cells are commonly known as granulocytic polymorphonuclear and monocytic MDSCs (ref. 22). It has been reported that IL-6 and IL-1 ⁇ promote MDSC proliferation (references 23, 24), and CD11b + cells and CD11c + cells infiltrated into intestinal polyps are treated with Candida albicans-derived ⁇ -glucan OXCA. Upon stimulation, the expression of Il6 and Il1b was induced, and this induction was inhibited by the dectin-1 antagonist laminarin (Fig. 2d), suggesting that MDSC-promoting factors are directly induced by dectin-1 signaling. .
  • PGE 2 prostaglandin E 2
  • Pla2g2a phospholipase A2
  • Ptgs1 Cox1
  • Ptgs2 Cox2
  • mice lacking lymphocytes were WT. These lymphocytes were not involved in the suppression of colon cancer in mice, as polyps were even less developed compared to mice (FIGS. 10c, 10d).
  • Dectin-1 deficiency suppresses colon tumor development by promoting the production of IL-22 binding protein IL-22bp expression is significantly elevated in polyps of GF Clec7a -/- AOM-3DSS mice (Figs. 3a, 10a).
  • the expression of IL-22bp mRNA was also enhanced not only in polyp but also in non-polyp tissue (FIGS. 4a and 11a).
  • IL-18 has been reported as a direct suppressor of IL-22bp
  • IL-18 mRNA expression was normal in both GF Clec7a ⁇ / ⁇ and Apc Min/+ Clec7a ⁇ / ⁇ mice (Fig. 4a, 11a) (ref. 26).
  • IL-22bp ⁇ / ⁇ mice were generated on an Apc Min/+ Clec7a ⁇ / ⁇ background.
  • the extended lifespan of Apc Min/+ Clec7a ⁇ / ⁇ mice compared to Apc Min/+ mice was completely abrogated by IL-22bp deficiency, and even half IL-22bp deficiency reduced the lifespan of Clec7a ⁇ / ⁇ mice. was found to be shorter (Fig. 4b).
  • Polyp numbers were reduced in Apc Min/+ Clec7a ⁇ / ⁇ compared to Apc Min/+ mice (FIGS. 8c, 8d), whereas younger Apc Min/+ Clec7a ⁇ / ⁇ Il-22bp ⁇ / ⁇ mice More polyps were observed (Fig. 4c).
  • IL-22bp-expressing cells EpCAM + epithelial cells and CD45 + leukocytes were isolated from intestinal polyps, and qPCR confirmed that IL-22bp mRNA was expressed only in the CD45 + population ( Figure 4d).
  • IL-22bp protein was expressed on both CD11b ⁇ CD103 + and CD11b + CD103 int DCs, but not CD11c ⁇ CD11b + MDSCs (FIG. 4e).
  • Il-22bp was expressed only on CD11b + and CD11c + myeloid cells, but not on Thy1.2 + T cells, CD19 + B cells, EpCAM + epithelial cells, in both colon polyp and non-polyp tissues (Fig.
  • Retinoic acid has been reported to regulate the production of IL-22bp (refs. 27, 28), and polyps of Clec7a ⁇ / ⁇ mice express enzymes that catalyze RA synthesis, such as Adh1 and Aldh1a1. It was upregulated (Fig. 11b, 11c). However, ⁇ -glucan did not affect the expression of these enzymes (Fig. 11d), suggesting that RA synthesis is not directly regulated by Dectin-1 signals.
  • RNA-seq data obtained from GF mice treated with AOM-3DSS show Pla2g2a/2e (Phospholipase A2 group IIA/IIE), Ptgs1/2 (Cox1/Cox2) , Ptges2/3 (PGE 2 synthase 2/3) and other genes involved in PGE 2 synthesis were greatly elevated in polyps of WT mice, but not in polyps of Clec7a ⁇ / ⁇ mice. (Figs. 3d, 10a). Reduced expression of Ptgs2 in colonic polyps and non-polyp tissues was also observed in Clec7a ⁇ / ⁇ mice under SPF conditions (FIG.
  • Dectin-1 antagonists suppresses the development of intestinal polyps by reducing intestinal PGE2 .
  • 5% by mass of laminarin, a dectin-1 antagonist and soluble beta-glucan (laminarin derived from arame (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan), weight average molecular weight of 50K or less ) were fed to the mice.
  • laminarin-fed mice were found to develop significantly fewer colonic polyps than control mice (FIGS. 6a, 6b). Blocking the dectin- 1 signal suppressed PGE2 production in the mouse gut (Fig.
  • PGE 2 administration enhances the expression of MDSC markers CD11b (Itgam) and arginase-1 (Arg1), and oncogenes Cyclin D1 (Ccnd1) and c-Myc (Myc), while Il-22bp was suppressed (Fig. 6h), suggesting that MDSC invasion, tumor growth, and IL-22bp production in colon cancer were regulated by PGE2 .
  • stimulation of intestinal polyp-infiltrating cells with PGE2 directly induced the expression of MDSC markers such as Arg1, CD11b, and Nos2, and IL-22bp was directly suppressed by PGE2 administration. (Fig. 6i).
  • ⁇ -glucan has no chemical cytotoxic effects. Studies suggesting a cytotoxic effect of ⁇ -glucan have mostly been with crude extracts of ⁇ -glucan-containing herbs, such as Ganoderma lucidum, including Other active ingredients, such as ganoderic acid from S. cerevisiae and triterpenes from its spores (ref. 31), are indeed known to have direct anti-cancer effects. Previous studies have shown that oral administration of ⁇ -glucan enhances the antitumor effect of antitumor agents (Reference 32), and that oral administration of yeast-derived ⁇ -glucan particles increases the growth of subcutaneously inoculated Lewis lung carcinoma. has been shown to be suppressed (reference 33).
  • glucans with fluorescein to follow their processing in vivo after oral ingestion, and found that after uptake of large ⁇ -glucan molecules into macrophages via dectin-1, smaller soluble It was clarified that it is decomposed into ⁇ -1,3-glucan fragments (reference document 34).
  • a typical soluble ⁇ -glucan is laminarin, which is an antagonistic ligand of dectin-1.
  • part of the insoluble ⁇ -glucan with a large molecular weight is decomposed into laminarin, and the dectin-1 signal in the intestinal tract is inhibited. Inhibition is believed to result in anti-intestinal tumorigenesis.
  • Dectin-1 plays an important role in the development of colon cancer in mice and humans by regulating PGE2 concentration and IL-22bp expression.
  • PGE2 binds to the receptor EP2 and activates the ⁇ -catenin axis, thereby regulating colorectal cancer cell proliferation, Tnf, Il6, Cxcl1, and Cox2. It promotes the expression of inflammation/growth-related genes such as AOM-DSS, and plays an important role in the development of AOM-DSS-induced colorectal tumors (references 36, 11, 37).
  • intestinal polyposis in Apc-deficient mice is suppressed in Ptgs2-deficient mutant mice, and COX-2 inhibitors represented by NSAIDs such as aspirin can suppress the development and progression of colon cancer and polyps. (References 38, 39).
  • IL-22BP is a soluble inhibitory receptor for IL-22 (refs 42, 43). IL-22BP plays an important role in regulating tumorigenesis, and deficiency of this cytokine promotes colon tumorigenesis (ref. 26). In this study, we showed that IL-22bp deficiency completely abolished the polyp formation disorder induced by dectin-1 deficiency, indicating that IL-22bp greatly contributes to the suppression of tumorigenesis in Clec7a -/- mice. suggested.
  • IL-22bp is produced only by intestinal DCs, but not by MDSCs, and that IL-22bp expression in tumor-infiltrating cells was directly suppressed by PGE2 , the synthase mainly secreted by MDSCs.
  • Dectin-1 expression in colon tumors was also detected mainly in MDSCs, suggesting that impaired production of intestinal PGE 2 by dectin-1 deficiency resulted in upregulation of Il-22bp expression in DCs of Clec7a ⁇ / ⁇ mice. As a result, it is considered that tumorigenesis is suppressed. Supporting this notion, administration of PGE 2 to Clec7a ⁇ / ⁇ mice was shown to suppress colonic Il-22bp expression and abolish the impaired tumorigenesis resulting from Dectin-1 deficiency.
  • cytokines such as GM-CSF, IL-6, IL-1, and TNF, which are known to promote MDSC differentiation and enhance suppressive activity in mouse intestinal tumors (reference 23, 24) is downstream of dectin-1 signaling, explaining why the MDSC population and the expression of MDSC-related genes were reduced in colonic polyps of Clec7a ⁇ / ⁇ mice.
  • MDSCs are major producers of PGE2 synthase, and that PGE2 promotes differentiation of MDSCs by inducing Itgam and Arg1 in mice and ITGAM and CD33 in human intestinal tumor-infiltrating cells. rice field.
  • dectin-1 promotes the expansion and differentiation of MDSCs through an auto-amplification loop of the production of inflammatory cytokines and PGE2 , and promotes tumorigenesis of the intestinal tract.
  • Clec7a ⁇ / ⁇ mice MDSC suppresses anti-tumor responses, suggesting that a decrease in MDSC numbers promotes lymphocyte-mediated anti-tumor immunity.
  • Clec7a ⁇ / ⁇ GF mice did not increase Tregs, and Rag2 ⁇ / ⁇ mice, which lack lymphocytes, were also fully capable of developing intestinal tumors, suggesting that the gut of Clec7a ⁇ / ⁇ mice It is thought that the decrease in PGE2 and the increase in IL-22BP suppress polyp formation, not Tregs.
  • mice Clec7a ⁇ / ⁇ mice were backcrossed to C57BL/6J for 9 generations and used.
  • wild-type (WT) C57BL/6J mice purchased from Sankyo Lab Service were used.
  • Apc Min/+ mice provided by Professor Abe Ryo of Tokyo University of Science were mated with Clec7a ⁇ / ⁇ mice to produce Apc Min/+ Clec7a ⁇ / ⁇ mice.
  • Apc Min/+ Clec7a ⁇ / ⁇ Il-22bp ⁇ / ⁇ mice were generated by the CRISPR-Cpf1 method using Apc Min/+ Clec7a ⁇ / ⁇ conjugates.
  • mice Age- and sex-matched WT mice were separated or cohabited with Clec7a ⁇ / ⁇ mice after weaning at 4 weeks of age. All mice were fed X-ray-sterilized normal chow, acidified tap water (0.002N HCl, pH 2.00) in an environmentally controlled clean room at the Laboratory Animal Facility of Tokyo University of Science and the Laboratory Animal Facility of Nakayama University School of Medicine. 5), housed under specific pathogen-free conditions using an autoclave-sterilized wooden chip bed; All animal experiments were performed in accordance with institutional ethical codes and guidelines, using protocols approved by the Animal Care and Use Committee of Tokyo University of Science and the Laboratory Animal Care and Use Committee of Sun Yat-sen University, People's Republic of China.
  • mice Six to seven week old mice were intraperitoneally administered with 10 ⁇ g AOM (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka) per g body weight. One week after dosing, the drinking water of these mice was dosed with 1 wt% DSS (36-50 kDa; MP Biomedicals, Illkirch, France) for 7 days, followed by 14 days of normal water administration for one cycle. After 3 cycles of DSS/normal water treatment, the mice were housed for an additional 2-6 weeks before being euthanized.
  • AOM Flujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka
  • 7-AAD (7-amino-actinomycin D) viability staining solution was purchased from eBioscience (San Diego, USA).
  • 2.4G2 anti-FC ⁇ RII/III-specific mAb
  • All antibodies were used at a dilution of 1:250.
  • Cells isolated from mouse intestine were washed twice with FACS Hank's buffer (HBSS containing 2% FCS and 0.1% sodium azide) and then treated with 2.4G2 to block FcR binding. Cells were then surface stained with mAb for 25-30 minutes.
  • cytokine FACS For cytokine FACS, cells were first stimulated with 50 ng/ml PMA (Sigma Aldrich) + 500 ng/ml ionomycin (Sigma Aldrich) or no stimulation with 1 mM monensin (Sigma Aldrich) for 4 hours. After stimulation, cells were washed twice with FACS Hank's buffer (HBSS with 2% FCS and 0.1% sodium azide) and then treated with 2.4G2 to block FcR binding. Cells were then surface stained with mAb for 30 minutes, then fixed and permeabilized with Cytofix/Cytoperm solution (BD Biosciences) for 20 minutes.
  • PMA Sigma Aldrich
  • ionomycin Sigma Aldrich
  • monensin Sigma Aldrich
  • Negative fractions were stained with anti-mouse CD45 microbeads for subsequent leukocyte purification, anti-mouse CD11b and CD11c microbeads for myeloid-derived cells, and Thy1.2 for T cells.
  • CD19 was stained with a selection of autoMACS.
  • Ct value threshold
  • RNA Sequencing and Analysis was isolated from colon tumor or non-tumor tissue using the Sigma Aldrich total RNA-prep kit. RNA was prepared using Contech SmartSeq2 library prep kit and sequenced on NovaSeq6000. Normalize the data and use usgalaxy. org was used to identify differential expression of genes. Pathway and process enrichment analysis using relative gene expression data is described in metascape. org.
  • IL-22BP is regulated by the inflammasome and modulates tumorigenesis in the intestine. Nature 491, 259-263 (2012). 27. Martin, JC, et al. Interleukin-22 binding protein (IL-22BP) is constitutively expressed by a subset of conventional dendritic cells and is strongly induced by retinoic acid. Mucosal Immunol 7, 101-113 (2014). 28. Lim, C., Hong, M. & Savan, R. Human IL-22 binding protein isoforms act as a rheostat for IL-22 signaling. Sci Signal 9, ra95 (2016). 29. Greten, TF, Manns, MP & Korangy, F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases.
  • beta-glucans enhance anti-tumor effects of monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 51, 557-564 (2002). 33. Albeituni, SH, et al. Yeast-Derived Particulate beta-Glucan Treatment Subverts the Suppression of Myeloid-Derived Suppressor Cells (MDSC) by Inducing Polymorphonuclear MDSC Apoptosis and Monocytic MDSC Differentiation to APC in Cancer. J Immunol 196, 2167-2180 (2016). 34. Hong, F., et al.
  • MDSC Myeloid-Derived Suppressor Cells

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Abstract

デクチン－１阻害剤、又はデクチン－１阻害活性を有するβグルカンを含有しデクチン－１阻害を介して腸管腫瘍を抑制する腸管腫瘍抑制剤、デクチン－１阻害活性を有するβグルカンを含有するＰＧＥ２産生抑制剤、及びデクチン－１阻害活性を有するβグルカンを含有するＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤。

Description

腸管腫瘍抑制剤、ＰＧＥ２産生抑制剤、及びＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤
　本開示は、腸管腫瘍抑制剤、ＰＧＥ２産生抑制剤、及びＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤に関する。
　大腸がん（ＣＲＣ）は世界で３番目に多いがんであり、毎年、世界で１００万人以上が新たに発症し、５０万人が死亡している（Bray, F., et al., CA Cancer J Clin 68, 394-424 (2018)）。ＣＲＣの症例の多くは、高齢者や先進国の生活習慣を持つ人々に発生しており（Bosman, F. & Yan, P., Pol J Pathol 65, 257-266 (2014)）、食生活がＣＲＣの危険因子となりうることが示唆されている。しかし、腸管腫瘍の発生を制御する基本的なメカニズムは、完全には解明されていない。
　Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）は、パターン認識受容体の一つであり、病原体に特異的な糖鎖構造を認識することにより、病原体に対する宿主の防御に主に関与している。骨髄ＩＩ型Ｃ型レクチンファミリーのメンバーであるデクチン－１（Ｄｅｃｔｉｎ－１又はＤＥＣＴＩＮ－１ともいう、遺伝子記号：Ｃｌｅｃ７ａ又はＣＬＥＣ７Ａ）は、ミエロイド由来の細胞に優先的に発現するＣＬＲの一つであり、β－１，３結合のグルカン（βグルカン）又はβ－１，３結合の主鎖にβ－１，６結合分岐鎖を持つグルカン（βグルカン）の受容体である（非特許文献１：Taylor, P.R., et al., J Immunol 169, 3876-3882 (2002)）。グルカンはほとんどの真菌の主要な細胞壁成分であるため、デクチン－１は真菌感染に対する宿主の防御の第一線に立っている（Taylor, P.R., et al., Nat Immunol 8,31-38 (2007)、Saijo, S., et al., Nat Immunol 8, 39-46 (2007)）。しかし、最近の研究では、この受容体がアレルギー疾患、自己免疫疾患、癌疾患の発症にも関与していることが明らかになってきた（Tang, C., Makusheva, Y., Sun, H., Han, W. & Iwakura, Y., J Leukoc Biol 106, 903-917 (2019)、Brown, G.D., Willment, J.A. & Whitehead, L., Nat Rev Immunol 18, 374-389 (2018)）。
　デクチン－１のアゴニストリガンドであるカードランを投与すると、ＺＡＰ－７０の自然変異を持つ自己免疫性マウスであるＳＫＧマウスで、関節炎、脊椎関節炎、回腸炎が誘発される（Ruutu, M., et al., Arthritis Rheum 64, 2211-2222 (2012)、Yoshitomi, H., et al., J Exp Med 201, 949-960 (2005)）。デクチン－１が誘導するＩＬ－２２は、プロアレルギー性のケモカインや粘液を誘導することで、気道過敏症を悪化させる（Lilly, L.M., et al., J Immunol 189, 3653-3660 (2012)）。最近、デクチン－１の欠損により、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の分化を誘導することができる常在菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｕｒｉｎｕｓがマウス大腸で過剰に増殖し、その結果、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎が抑制されることを報告した（Tang, C., et al., Cell Host Microbe 18, 183-197 (2015)）。また、デクチン－１シグナルは、下流域でＩＬ－１７Ｆを誘導し、特異的な抗菌タンパク質を誘導することで、Ｔｒｅｇの分化を促進するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　Ｃｌｕｓｔｅｒ　ＸＩＶａを含む一群の常在菌の増殖を抑制する（Kamiya, T., et al., Mucosal Immunol 11, 763-773 (2018)、Tang, C., et al., Nat Immunol 19, 755-765 (2018)）。したがって、デクチン－１は基本的には病原体を撲滅するために免疫系を活性化するが、この活動は、一方で、炎症関連の疾患を誘発したり増強したりすることもある。
　腫瘍（以下、ポリープともいう）の発生におけるデクチン－１の役割については、矛盾した結果が報告されている（Tang, C., Makusheva, Y., Sun, H., Han, W. & Iwakura, Y., J Leukoc Biol 106, 903-917 (2019)）。デクチン－１のシグナルは、Ｂ１６メラノーマ細胞のＮ－グリカンに結合し、ＤＣのＩＮＡＭを誘導することで、ＮＫ細胞の殺腫瘍活性を高める（Chiba, S., et al., Elife 3, e04177 (2014)）。デクチン－１は、Ｒａｆ１とＮＦ－ｋＢを活性化することにより、ＤＣ上のＴＮＦＳＦ１５とＯＸ４０Ｌの発現を上昇させ、抗腫瘍性のＴｈ９細胞の分化を促進する（Zhao, Y., et al., Nat Commun 7, 12368 (2016)）。また、デクチン－１は、Ｍ－ＣＳＦを誘導してＴｏｌｌ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）４やＣＤ１４の発現を抑制することで、化学発癌物質による肝細胞癌の発生を抑制することが報告されている（Seifert, L., et al., Cell Rep 13, 1909-1921 (2015)）。一方、デクチン－１は、膵管腺癌に発現するｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ　ｌｉｇａｎｄ　ｇａｌｅｃｔｉｎ－９を認識し、抗腫瘍性のＭ１マクロファージの分化を抑制することから、デクチン－１シグナルが膵臓腫瘍の発生に促進的な役割を果たしていることが示唆される（非特許文献２：Daley, D., et al., Nat Med 23, 556-567 (2017)）。
Taylor, P.R., et al. The beta-glucan receptor, dectin-1, is predominantly expressed on the surface of cells of the monocyte/macrophage and neutrophil lineages. J Immunol 169, 3876-3882 (2002) Daley, D., et al. Dectin 1 activation on macrophages by galectin 9 promotes pancreatic carcinoma and peritumoral immune tolerance. Nat Med 23, 556-567 (2017)
　しかしながら、これまでの報告における腸管腫瘍に対する剤等に関する知見は限られている。
　本開示は上記に鑑みてなされたものであり、本開示は、腸管腫瘍を抑制することのできる腸管腫瘍抑制剤、ＰＧＥ２産生を抑制することのできるＰＧＥ２産生抑制剤、及びＩＬ－２２ＢＰ産生を促進することのできるＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤を提供することを課題とする。
　上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞　デクチン－１阻害活性を有するβグルカンを含有し、デクチン－１阻害を介して腸管腫瘍を抑制する、腸管腫瘍抑制剤。
＜２＞　前記βグルカンが、β－１，３結合を含むβグルカン又はβ－１，３結合の主鎖にβ－１，６結合分岐鎖を含むβグルカンである、＜１＞に記載の腸管腫瘍抑制剤。
＜３＞　前記βグルカンの分子量は０．２Ｋ～１００Ｋである、＜１＞又は＜２＞に記載の腸管腫瘍抑制剤。
＜４＞　前記βグルカンがラミナリンである、＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載の腸管腫瘍抑制剤。
＜５＞　デクチン－１阻害活性を有するβグルカンを含有する、ＰＧＥ２産生抑制剤。
＜６＞　前記βグルカンが、β－１，３結合を含むβグルカン又はβ－１，３結合の主鎖にβ－１，６結合分岐鎖を含むβグルカンである、＜５＞に記載のＰＧＥ２産生抑制剤。
＜７＞　前記βグルカンの分子量は０．２Ｋ～１００Ｋである、＜５＞又は＜６＞に記載のＰＧＥ２産生抑制剤。
＜８＞　前記βグルカンがラミナリンである、＜５＞～＜７＞のいずれか１項に記載のＰＧＥ２産生抑制剤。
＜９＞　デクチン－１阻害活性を有するβグルカンを含有する、ＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤。
＜１０＞　前記βグルカンが、β－１，３結合を含むβグルカン又はβ－１，３結合の主鎖にβ－１，６結合分岐鎖を含むβグルカンである、＜９＞に記載のＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤。
＜１１＞　前記βグルカンの分子量は０．２Ｋ～１００Ｋである、＜９＞又は＜１０＞に記載のＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤。
＜１２＞　前記βグルカンがラミナリンである、＜９＞～＜１１＞のいずれか１項に記載のＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤。
＜１３＞　デクチン－１阻害剤を含有し、デクチン－１阻害を介して腸管腫瘍を抑制する、腸管腫瘍抑制剤。
＜１４＞　前記デクチン－１阻害剤がデクチン－１アンタゴニストである、＜１３＞に記載の腸管腫瘍抑制剤。
＜１５＞　前記デクチン－１阻害剤が抗デクチン－１阻害抗体又はデクチン－１阻害低分子化合物である、＜１３＞に記載の腸管腫瘍抑制剤。
＜１６＞　前記腸管腫瘍はＰＧＥ２の発現量上昇を伴う腸管腫瘍であるか、ＩＬ－２２ＢＰの発現量低下を伴う腸管腫瘍である、＜１＞～＜４＞、＜１３＞、及び＜１４＞のいずれか１項に記載の腸管腫瘍抑制剤。
＜１７＞　腸管腫瘍の予防又は治療に用いるための、デクチン－１阻害活性を有するβグルカン。
＜１８＞　前記腸管腫瘍はＰＧＥ２の発現量上昇を伴う腸管腫瘍である、前記＜１７＞に記載のデクチン－１阻害活性を有するβグルカン。
＜１９＞　前記腸管腫瘍はＩＬ－２２ＢＰの発現量低下を伴う腸管腫瘍である、前記＜１７＞又は＜１８＞に記載のデクチン－１阻害活性を有するβグルカン。
＜２０＞　デクチン－１阻害活性を有するβグルカンの、腸管腫瘍の予防又は治療のための医薬の製造における使用。
＜２１＞　前記腸管腫瘍はＰＧＥ２の発現量上昇を伴う腸管腫瘍である、前記＜２０＞に記載の使用。
＜２２＞　前記腸管腫瘍はＩＬ－２２ＢＰの発現量低下を伴う腸管腫瘍である、前記＜２０＞又は＜２１＞に記載の使用。
＜２３＞　腫瘍組織中の、デクチン－１タンパク質発現量及びＣＬＥＣ７Ａ遺伝子発現量の少なくとも一方を測定することを含む、腸管腫瘍の重症度の予測方法。
　本開示によれば、腸管腫瘍を抑制することのできる腸管腫瘍抑制剤、ＰＧＥ２産生を抑制することのできるＰＧＥ２産生抑制剤、及びＩＬ－２２ＢＰ産生を促進することのできるＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤が提供される。
デクチン－１の欠損は大腸腫瘍を抑制し、この抑制は常在微生物とは無関係である。８～１０週齢のＡｐｃＭｉｎ／＋及びＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスに飲水に溶かした１質量％ＤＳＳを７日間投与し、４週間後に安楽死させた。大腸腫瘍の肉眼観察を実施した（ｎ＝５／群）。 ８～１０週齢のＡｐｃＭｉｎ／＋及びＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスに飲水に溶かした１質量％ＤＳＳを７日間投与し、４週間後に安楽死させた。表示サイズの大腸ポリープの個数カウントを実施した（ｎ＝５／群）。 ＡｐｃＭｉｎ／＋及びＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスをＳＰＦ条件で飼育し、２０～２３週齢で安楽死させた。大腸腫瘍の肉眼観察を行った（ｎ＝１４／ＡｐｃＭｉｎ／＋群、ｎ＝１７／ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－群）。 ＡｐｃＭｉｎ／＋及びＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスをＳＰＦ条件で飼育し、２０～２３週齢で安楽死させた。大腸ポリープの個数カウントを行った（ｎ＝１４／ＡｐｃＭｉｎ／＋群、ｎ＝１７／ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－群）。 ＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－を別々に飼育したマウスにＡＯＭを腹腔内投与し、その７日後に、後述する≪材料と方法≫に記載したように１質量％ＤＳＳを３サイクル投与した。最初のＡＯＭ投与から１６週目にマウスを安楽死させ、大腸腫瘍の肉眼観察を行った（ｎ＝５／群）。 ＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－を別々に飼育したマウスにＡＯＭを腹腔内投与し、その７日後に、後述する≪材料と方法≫に記載したように１質量％ＤＳＳを３サイクル投与した。最初のＡＯＭ投与から１６週目にマウスを安楽死させ、表示されたサイズの大腸ポリープの数のカウントを行った（ｎ＝５／群）。 ＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－マウスを４週齢で離乳後に同居させ、その４週後にＡＯＭを腹腔内投与し、続いて１質量％ＤＳＳを３サイクル投与した（≪材料と方法≫に記載）。最初のＡＯＭ投与から１６週目にマウスを安楽死させ、大腸腫瘍の肉眼観察を測定した（ｎ＝５／群）。 ＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－マウスを４週齢で離乳後に同居させ、その４週後にＡＯＭを腹腔内投与し、続いて１質量％ＤＳＳを３サイクル投与した（≪材料と方法≫に記載）。最初のＡＯＭ投与から１６週目にマウスを安楽死させ、表示サイズの大腸ポリープ数を測定した（ｎ＝５／群）。 無菌（ＧＦ）のＷＴ及びＣｌｅｃ７ａ－／－マウスにＡＯＭを投与した後、１質量％ＤＳＳ投与を３サイクル行った。ＡＯＭ投与から３６週間後、これらのマウスを安楽死させた。大腸腫瘍を観察した（ｎ＝４／ＧＦ　ＷＴ群、ｎ＝５／ＧＦ　Ｃｌｅｃ７ａ－／－群）。 無菌（ＧＦ）のＷＴ及びＣｌｅｃ７ａ－／－マウスにＡＯＭを投与した後、１質量％ＤＳＳ投与を３サイクル行った。ＡＯＭ投与から３６週間後、これらのマウスを安楽死させた。ポリープの直径が１ｍｍ以上の個体の頻度を測定した（ｎ＝４／ＧＦ　ＷＴ群、ｎ＝５／ＧＦ　Ｃｌｅｃ７ａ－／－群）。 無菌（ＧＦ）のＷＴ及びＣｌｅｃ７ａ－／－マウスにＡＯＭを投与した後、１質量％ＤＳＳ投与を３サイクル行った。ＡＯＭ投与から３６週間後、これらのマウスを安楽死させた。大腸内のポリープの体積を（直径）３として算出した（ｎ＝４／ＧＦ　ＷＴ群、ｎ＝５／ＧＦ　Ｃｌｅｃ７ａ－／－群）。なお（図１ａ～１ｊ）のデータは、少なくとも３つの独立した実験の代表である。（図１ａ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｇ、１ｈ、１ｊ）のデータは、平均値±ＳＤで表した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
大腸腫瘍ではデクチン－１シグナルによりＭＤＳＣの分化が促進される。ＡｐｃＭｉｎ／＋及びＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスに１質量％ＤＳＳを７日間投与し、４週間後に安楽死させた。腫瘍浸潤細胞全体に占めるＴ細胞、Ｂ細胞及びＤＣの割合をフローサイトメトリーで調べた（ｎ＝３／ＡｐｃＭｉｎ／＋群、ｎ＝５／ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－群）。 ＡｐｃＭｉｎ／＋及びＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスに１質量％ＤＳＳを７日間投与し、４週間後に安楽死させた。非ポリープ組織又は大腸のポリープに浸潤するＣＤ４５＋細胞に占めるＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞及びＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋細胞の割合をフローサイトメトリーで調べた（ｎ＝３／ＡｐｃＭｉｎ／＋群、ｎ＝５／ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－群）。 ＷＴ及びＣｌｅｃ７ａ－／－マウスにＡＯＭを投与した後、１質量％ＤＳＳ投与を３サイクル行い、ＡＯＭ投与１２週間後に安楽死させた。大腸ポリープと非ポリープ組織におけるデクチン－１発現細胞を同定するために、フローサイトメトリー分析を行った。 ＷＴ　ＳＰＦマウスにＡＯＭを投与し、続いてＤＳＳを３サイクル行った。１１週間後、これらのマウスを安楽死させ、ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１１ｃ＋細胞を、ａｕｔｏＭＡＣＳを用いて大腸ポリープから精製した。精製された細胞は、アゴニストのβグルカンであるＯＸＣＡで刺激され、あるいはアンタゴニストのβグルカンであるラミナリンで３時間処理された後ＯＸＣＡで１６時間刺激され、Ｉｌ６とＩｌ１ｂの発現がｑＰＣＲで測定された。なお（図２ａ～２ｄ）のデータは２回の独立した実験の代表であり、（図２ａ、２ｂ、２ｄ）のデータは平均値±ＳＤで表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
腫瘍関連免疫系を代表する遺伝子のほとんどの発現は、デクチン－１シグナルに依存しているが、常在する微生物の影響は受けない。ＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－のＧＦマウスにＡＯＭを投与した後、１質量％ＤＳＳ投与を３サイクル行った。ＡＯＭ投与から３６週後にこれらのマウスを安楽死させ（図１ｉ～１ｋに記載の実験と同じ）、ポリープとその周辺の非ポリープ組織からＲＮＡを精製し、ＲＮＡ－ｓｅｑで解析した。ポリープ及び非ポリープ組織におけるサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、細胞表面マーカー、Ｔ細胞転写因子関連遺伝子のＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－マウスの比較をヒートマップで示す。 ＫＥＧＧデータベースを用いて、ＧＦ　Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスのポリープとＷＴマウスのポリープの間で、細胞集団、シグナル伝達経路、代謝経路を比較した。 ＭＤＳＣ及び非ＭＤＳＣ関連遺伝子のＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－マウスの比較をヒートマップで示す。 プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）シンターゼコード遺伝子のＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－マウスの比較をヒートマップで示す。 ＧＦのＷＴ及びＣｌｅｃ７ａ－／－マウスの大腸ポリープ及び非ポリープ組織におけるデクチン－１ ｍＲＮＡ（Ｃｌｅｃ７ａ）の発現をｑＰＣＲで調べた（ＷＴ　ｎ＝３、Ｃｌｅｃ７ａ－／－　ｎ＝４）。なお（図３ｅ）のデータは２回の独立した実験の代表で、平均値±ＳＤで表した。＊ｐ＜０．０５。
Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスで発現が亢進しているＩＬ－２２ｂｐは、ＡｐｃＭｉｎマウスの腸管腫瘍の発生を抑制する。２０週齢まで飼育したＡｐｃＭｉｎ／＋及びＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスを安楽死させ、腸管ポリープ及び非ポリープ組織におけるＩｌ－２２ｂｐ及びＩｌ１８の発現レベルをｑＰＣＲで測定した（ＡｐｃＭｉｎ／＋　ｎ＝３、ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－　ｎ＝４）。 示されたマウスの生存率を示す（ＡｐｃＭｉｎ／＋　ｎ＝１９、ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－　ｎ＝６６、ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－Ｉｌ－２２ｂｐ＋／－　ｎ＝８、ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－Ｉｌ－２２ｂｐ－／－　ｎ＝８）。 ２０週齢のＡｐｃＭｉｎ／＋及びＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスと、１５週齢のＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－Ｉｌ－２２ｂｐ－／－マウスの小腸の代表的な写真を示す。 ２３週齢のＡｐｃＭｉｎ／＋及びＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスから採取した腸管ポリープの全細胞を、ａｕｔｏＭＡＣＳで上皮細胞と白血球に分離した。そして、Ｉｌ－２２ｂｐの発現をｑＰＣＲで調べた。 ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスのポリープ浸潤細胞をフローサイトメトリーで分析し、３つの表示されたミエロイド細胞集団におけるＩＬ－２２ｂｐの細胞内発現を調べた。ＩＬ－２２ｂｐパネル中の数字は平均蛍光強度を表す。 Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスにＡＯＭを投与した後、１質量％ＤＳＳ投与を３サイクル行い、ＡＯＭ投与１２週間後に安楽死させた。ポリープと非ポリープの組織の中の示された種類の細胞をａｕｔｏＭＡＣＳで精製し、Ｉｌ－２２ｂｐの発現をｑＰＣＲで調べた。 ＣＤ１１ｃ＋細胞及びＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋細胞をａｕｔｏＭＡＣＳで精製し、これらのサブセットにおけるＩｌ－２２ｂｐの発現をｑＰＣＲで調べた。 Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＡＯＭを投与した後、ＤＳＳを３サイクル投与した。ＡＯＭ投与１１週後、これらのマウスを安楽死させ、大腸ポリープからＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞を精製した。その後、細胞をＯＸＣＡで刺激し、Ｉｌ－２２ｂｐの発現をｑＰＣＲで測定した。最後の実験群では、ＯＸＣＡ処理の３時間前にラミナリン処理を行った。なお（図４ａ、図４ｄ～４ｈ）のデータは２回の独立した実験の代表であり、（図４ａ、４ｄ、４ｆ～４ｈ）のデータは平均値±ＳＤで表されている。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
ＰＧＥ２の合成に関わる遺伝子は、デクチン－１シグナルによって活性化される。ＷＴ及びＣｌｅｃ７ａ－／－マウスにＡＯＭを投与した後、１質量％ＤＳＳ投与を３サイクル行い、ＡＯＭ投与１６週後に安楽死させた。大腸のポリープ、および非ポリープ部位におけるＣｏｘ２をコードするＰｔｇｓ２の発現をｑＰＣＲで測定した（ＷＴ　ｎ＝３、Ｃｌｅｃ７ａ－／－　ｎ＝４）。 ＷＴ及びＣｌｅｃ７ａ－／－マウスにＡＯＭを投与した後、１質量％ＤＳＳ投与を３サイクル行い、ＡＯＭ投与１６週後に安楽死させた。組織ホモジネート中のＰＧＥ２の濃度をＥＬＩＳＡで測定した（ＷＴ　ｎ＝５、Ｃｌｅｃ７ａ－／－　ｎ＝４）。 Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＡＯＭを投与した後、１質量％ＤＳＳ投与を３サイクル行い、ＡＯＭ投与１２週後に安楽死させた。ＣＤ１１ｃ＋細胞及びＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋細胞を大腸ポリープ及び非ポリープ組織からａｕｔｏＭＡＣＳで精製し、示された遺伝子のｍＲＮＡ発現をｑＰＣＲで測定した。 ２０週齢のＡｐｃＭｉｎ／＋及びＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスの腸管ポリープ及び非ポリープ組織におけるＰｔｇｓ２の発現をｑＰＣＲで測定した（ｎ＝３／群）。 ２０週齢のＡｐｃＭｉｎ／＋及びＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスの組織浸潤ＣＤ４５＋白血球におけるＰｔｇｓ２の発現をｑＰＣＲで測定した（ｎ＝３／群）。 ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスの全ポリープ浸潤細胞を採取し、カードランで２０時間刺激した後、ＰＧＥ２合成に関わる遺伝子の発現をｑＰＣＲで測定した。ラミナリン処理はカードランで処理する前に４時間行った。 ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスの精製したＣＤ１１ｂ＋ポリープ浸潤細胞を採取し、カードランで２０時間刺激した後、ＰＧＥ２合成に関わる遺伝子の発現をｑＰＣＲで測定した。ラミナリン処理はカードランで処理する前に４時間行った。なお（図５ａ～５ｇ）のデータは２回の独立した実験の代表であり、平均値±ＳＤで表した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
ラミナリンの経口投与は大腸の腫瘍形成を抑制し、ＰＧＥ２投与は腫瘍形成を促進する。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＡＯＭを投与し、その３日前から１週間のＤＳＳ投与終了まで、５質量％ラミナリン含有粉末食品を投与（１０日間／サイクルで継続）し、合計３サイクル行った。最初のＡＯＭ投与から１１週目にマウスを安楽死させ、大腸における腫瘍の発生を肉眼で観察した（ｎ＝７／群）。 Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＡＯＭを投与し、その３日前から１週間のＤＳＳ投与終了まで、５質量％ラミナリン含有粉末食品を投与（１０日間／サイクルで継続）し、合計３サイクル行った。最初のＡＯＭ投与から１１週目にマウスを安楽死させ、表示された大きさの大腸ポリープの数を数えた（ｎ＝７／群）。 Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＡＯＭを投与し、その３日前から１週間のＤＳＳ投与終了まで、５質量％ラミナリン含有粉末食品を投与（１０日間／サイクルで継続）し、合計３サイクル行った。最初のＡＯＭ投与から１１週目にマウスを安楽死させ、組織ホモジネート中のＰＧＥ２濃度をＥＬＩＳＡで測定した（ｎ＝７／群）。 Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＡＯＭを投与し、その３日前から１週間のＤＳＳ投与終了まで、５質量％ラミナリン含有粉末食品を投与（１０日間／サイクルで継続）し、合計３サイクル行った。最初のＡＯＭ投与から１１週目にマウスを安楽死させ、ＣＤ１１ｂ（Ｉｔｇａｍ）のｍＲＮＡ発現をｑＰＣＲで調べた（ｎ＝７／群）。 ８週齢のＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウス（ｎ＝３）に２質量％ＤＳＳを１週間投与した後、ＰＧＥ２（４０ｇ／マウス）又はＰＢＳを１日おきに４週間腹腔内投与した。安楽死させた後、ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスにおいて、ＰＧＥ２処理の有無にかかわらず、大腸ポリープの発生をＡｐｃＭｉｎ／＋マウスのそれと比較して調べた（ｎ＝３／群）。 ８週齢のＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウス（ｎ＝３）に２質量％ＤＳＳを１週間投与した後、ＰＧＥ２（４０ｇ／マウス）又はＰＢＳを１日おきに４週間腹腔内投与した。安楽死させた後、ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスにおいて、ＰＧＥ２処理の有無にかかわらず、大腸ポリープの発生をＡｐｃＭｉｎ／＋マウスのそれと比較して調べた（ｎ＝３／群）。 ８週齢のＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウス（ｎ＝３）に２質量％ＤＳＳを１週間投与した後、ＰＧＥ２（４０ｇ／マウス）又はＰＢＳを１日おきに４週間腹腔内投与した。安楽死させた後、ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスにおいて、ポリープにおけるＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓ及びＭＨＣ－ＩＩ－ＣＤ１１ｂ＋ＭＤＳＣｓの集団をフローサイトメトリーで測定した（ｎ＝３／群）。 ８週齢のＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウス（ｎ＝３）に２質量％ＤＳＳを１週間投与した後、ＰＧＥ２（４０ｇ／マウス）又はＰＢＳを１日おきに４週間腹腔内投与した。安楽死させた後、ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスにおいて、示された遺伝子の発現をｑＰＣＲで調べた（ｎ＝３／群）。 ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスの腫瘍浸潤細胞（ｎ＝２、採取時にプールした細胞）を採取し、示された用量のＰＧＥ２で２０時間刺激した後、ｑＰＣＲにより示された遺伝子の発現を測定した。データは、３ウェルの平均値±ＳＤである。 ＡＯＭ＋ＤＳＳ処理後のＧＦ又はＳＰＦマウスの大腸ポリープにおけるＩｌ－２２ｂｐとＰｔｇｓ２の発現レベルの相関関係を示す（ｎ＝８／ＧＦ群、ｎ＝１１／ＳＰＦ群）。なお（図６ａ～６ｈ）は２回、（図６ｉ）は３回の独立した実験の代表である。（図６ｂ～６ｄ、６ｆ～６ｉ）のデータは平均値±ＳＤで表した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
ＣＲＣ患者では、ＰＧＥ２合成酵素とＩＬ２２ＲＡの発現が変化している。３６名のＣＲＣ患者から標本を採取し、腫瘍組織におけるデクチン－１　ｍＲＮＡ発現量が２未満（ｎ＝１２）又は２～２０（ｎ＝２４）（ＧＡＰＤＨで正規化）の患者の術後生存率を示す。 ３６名のＣＲＣ患者から標本を採取し、腫瘍組織におけるデクチン－１　ｍＲＮＡ発現量が２未満（ｎ＝１２）又は２～２０（ｎ＝２４）（ＧＡＰＤＨで正規化）の患者のデクチン－１発現量と腫瘍ＴＮＭステージとの相関を示す。腫瘍ＴＮＭステージは個々の臨床情報に従って算出した。 ３６名のＣＲＣ患者から標本を採取し、腫瘍組織におけるデクチン－１　ｍＲＮＡ発現量が２未満（ｎ＝１２）又は２～２０（ｎ＝２４）（ＧＡＰＤＨで正規化）の患者の各ステージにおけるデクチン－１発現量が２以上の患者の割合との相関を示す。腫瘍ＴＮＭステージは個々の臨床情報に従って算出した。 合計６８名のＣＲＣ患者から、同一人物の腫瘍と非腫瘍の標本を２３組集めた。腫瘍及び非腫瘍組織におけるＩＬ－２２ＢＰ及びＰＴＧＳ２の発現をｑＰＣＲで調べた（腫瘍群ｎ＝４７、非腫瘍群ｎ＝４４）。 同一個体から２３組の腫瘍と非腫瘍の標本を採取し、ＩＬ－２２ＢＰとＰＴＧＳ２の発現を調べた（ｎ＝２３／群）。 ＣＲＣ組織におけるＰＧＥ２合成酵素とデクチン－１の発現量の相関関係（ｎ＝４７／群）。 ＣＲＣサンプルを採取し、腫瘍浸潤細胞をカードランで２０時間刺激した。ラミナリン処理の場合は、まず細胞をラミナリンで４時間処理した後、カードランを加えて培養した。ＰＧＥ２合成酵素の発現をｑＰＣＲで測定した。データは３ウェルの平均値±ＳＤ。 ＣＲＣサンプルを採取し、腫瘍浸潤細胞、正常組織浸潤細胞をカードランで２０時間刺激した。ラミナリン処理の場合は、まず細胞をラミナリンで４時間処理した後、カードランを加えて培養した。ＣＤ３３の発現をｑＰＣＲで測定した。データは３ウェルの平均値±ＳＤ。 ＣＲＣ患者の腫瘍組織を採取し、ミンチにした後、ＰＧＥ２の存在下で２０時間培養した。データは３ウェルの平均値±ＳＤ。なお（図７ｇ～図７ｉ）のデータは２つの独立した実験の代表である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
デクチン－１の欠損は大腸腫瘍を抑制し、この抑制は常在微生物とは無関係である。８～１０週齢のＡｐｃＭｉｎ／＋及びＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスに１質量％ＤＳＳを７日間投与し、４週間後に安楽死させた。体重の変化は、ＤＳＳ投与後に時系列で測定した（ｎ＝５／群）。 ８～１０週齢のＡｐｃＭｉｎ／＋及びＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスに１質量％ＤＳＳを７日間投与し、４週間後に安楽死させた。結腸の長さの測定は解剖後に実施した（ｎ＝５／群）。 ＡｐｃＭｉｎ／＋及びＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスは、２０～２３週齢で安楽死させた。マウスの小腸腫瘍の肉眼観察を行った（ｎ＝１０／ＡｐｃＭｉｎ／＋群、ｎ＝８／ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－群）。 ＡｐｃＭｉｎ／＋及びＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスは、２０～２３週齢で安楽死させた。マウスのポリープの個数カウントを行った（ｎ＝１０／ＡｐｃＭｉｎ／＋群、ｎ＝８／ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－群）。 ＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－を別々に飼育したマウスにＡＯＭを腹腔内投与し、その７日後に、後述する≪材料と方法≫に記載したように１質量％ＤＳＳを３サイクル投与した。大腸腫瘍の誘発中に体重減少を時系列で測定した（ｎ＝５／群）。 ＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－を別々に飼育したマウスにＡＯＭを腹腔内投与し、その７日後に、後述する≪材料と方法≫に記載したように１質量％ＤＳＳを３サイクル投与した。最初のＡＯＭ投与から１６週目にマウスを安楽死させ、結腸の長さの測定を行った。 ＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－マウスにＡＯＭを投与し、７日後、１質量％ＤＳＳを７日間だけ投与した後、安楽死させる前にさらに１０週間通常の飼育を行った（ＷＴ　ｎ＝８、Ｃｌｅｃ７ａ－／－　ｎ＝９）。マウスの肛門脱を観察した。 ＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－マウスにＡＯＭを投与し、７日後、１質量％ＤＳＳを７日間だけ投与した後、安楽死させる前にさらに１０週間通常の飼育を行った（ＷＴ　ｎ＝８、Ｃｌｅｃ７ａ－／－　ｎ＝９）。マウスの肛門脱及び大腸腫瘍の発生率を統計的に計算した。 ＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－マウスにＡＯＭを投与し、７日後、１質量％ＤＳＳを７日間だけ投与した後、安楽死させる前にさらに１０週間通常の飼育を行った（ＷＴ　ｎ＝８、Ｃｌｅｃ７ａ－／－　ｎ＝９）。結腸の長さを測定した。 ＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－マウスにＡＯＭを投与し、７日後、１質量％ＤＳＳを７日間だけ投与した後、安楽死させる前にさらに１０週間通常の飼育を行った（ＷＴ　ｎ＝８、Ｃｌｅｃ７ａ－／－　ｎ＝９）。結腸の長さを測定した。 ＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－マウスにＡＯＭを投与し、７日後、１質量％ＤＳＳを７日間だけ投与した後、安楽死させる前にさらに１０週間通常の飼育を行った（ＷＴ　ｎ＝８、Ｃｌｅｃ７ａ－／－　ｎ＝９）。マウスの直腸ポリープの数を測定した。 ＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－マウスを４週齢で離乳後に同居させ、その４週間後ＡＯＭを腹腔内投与し、続いて１質量％ＤＳＳを３サイクル投与した（≪材料と方法≫に記載）。体重減少は、横軸（ｎ＝５／群）に示すように、最初のＤＳＳ投与の開始から時系列で測定した（ｎ＝５／群）。 ＷＴとＣｌｅｃ７ａ－／－マウスを４週齢で離乳後に同居させ、その４週間後ＡＯＭを腹腔内投与し、続いて１質量％ＤＳＳを３サイクル投与した（≪材料と方法≫に記載）。最初のＡＯＭ投与から１６週目にマウスを安楽死させ、結腸の長さを測定した（ｎ＝５／群）。 無菌（ＧＦ）のＷＴ及びＣｌｅｃ７ａ－／－マウスにＡＯＭを投与した後、１質量％ＤＳＳ投与を３サイクル行った。ＡＯＭ投与から３６週間後、これらのマウスを安楽死させ、結腸の長さを測定した。なお（図８ａ、８ｂ、８ｅ、８ｆ、８ｌ、８ｍ）のデータは３つの実験の代表であり、（図８ｎ）のデータは２つの独立した実験の代表である。（図８ｃ、８ｄ）のデータは、３つの独立した実験から得られたデータをプールしたものである。（図８ａ、８ｂ、８ｄ、８ｅ、８ｆ、８ｊ～８ｎ）のデータは、平均値±ＳＤで表した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
大腸腫瘍におけるデクチン－１発現細胞の大部分はＭＨＣ－ＩＩ－骨髄細胞である。ＷＴ又はＣｌｅｃ７ａ－／－マウスにＡＯＭを投与し、７日後に、１質量％ＤＳＳを７日間合計３サイクル投与した。最初のＡＯＭ投与から１６週目にマウスを安楽死させ、結腸ポリープ又は非ポリープ組織における示された遺伝子のｍＲＮＡ発現をｑＰＣＲによって決定した（ｎ＝３）。 ＷＴ又はＣｌｅｃ７ａ－／－ＧＦマウスにＡＯＭを投与し、７日後に、１質量％ＤＳＳを５日間合計３サイクル投与した。最初のＡＯＭ投与から３６週目にマウスを安楽死させ、結腸ポリープ又は非ポリープ組織における示された遺伝子のｍＲＮＡ発現をｑＰＣＲによって決定した（ＷＴ　ｎ＝４、Ｃｌｅｃ７ａ－／－　ｎ＝５）。 図２ａに記載の実験を実施し、フローサイトメトリーで測定した腫瘍浸潤細胞におけるＴ細胞、Ｂ細胞、ＤＣの比率を示すドットプロットパネルを示した。 ＷＴマウスにＡＯＭを投与し、７日後に、１質量％ＤＳＳを７日間合計３サイクル投与した。最初のＡＯＭ投与から１３週目にマウスを安楽死させ、結腸ポリープに浸潤しているデクチン－１発現細胞型をフローサイトメトリーで測定した。なお（図９ａ～９ｄ）のデータは、２つの独立した実験の代表である。
腫瘍関連免疫系を代表する遺伝子のほとんどの発現は、デクチン－１シグナルに依存しているが、常在する微生物の影響は受けない。図３ａ～３ｄに記載の実験を実施し、結腸ポリープ又は非ポリープ組織における、免疫細胞マーカー及び腫瘍関連因子をコードする選択された遺伝子の発現レベルを、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析によって決定した。 図３ａ～３ｄに記載の実験を実施し、結腸ポリープ又は非ポリープ組織における、Ｔｈ１又はＴｈ１７に関連する遺伝子の発現レベルを、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析によって決定した。 ＷＴ及びＲａｇ２－／－マウスにＡＯＭを腹腔内投与し、その７日後に、後述する≪材料と方法≫に記載したように１質量％ＤＳＳを３サイクル投与した。結腸腫瘍誘導の１２週間後、これらのマウスを安楽死させ、大腸腫瘍の肉眼観察を行った（ＷＴ　ｎ＝８、Ｒａｇ２－／－　ｎ＝６）。 ＷＴ及びＲａｇ２－／－マウスにＡＯＭを腹腔内投与し、その７日後に、後述する≪材料と方法≫に記載したように１質量％ＤＳＳを３サイクル投与した。結腸腫瘍誘導の１２週間後、これらのマウスを安楽死させ、ポリープの数のカウントを行った（ＷＴ　ｎ＝８、Ｒａｇ２－／－　ｎ＝６）。なお（図１０ｃ、１０ｄ）のデータは、２つの独立した実験の代表であり、平均値±ＳＤで表した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
レチノイン酸（ＲＡ）の合成は、デクチン－１シグナルによって直接制御されない。図２ｅ～２ｊに記載されているようにＲＮＡを調製し、ＩＬ－２２ｂｐ（Ｉｌ２２ｒａ２）及びＩＬ－１８（Ｉｌ１８）の発現をｑＰＣＲ（ＷＴ　ｎ＝４、Ｃｌｅｃ７ａ－／－　ｎ＝５）で測定した。 ＷＴ又はＣｌｅｃ７ａ－／－ＧＦマウスにＡＯＭを投与し、７日後に、１質量％ＤＳＳを５日間合計３サイクル投与した。最初のＡＯＭ投与から３６週目にマウスを安楽死させ、ＲＡ関連シンターゼをコードする遺伝子の発現をＲＮＡ－ｓｅｑで測定した。 ＡＯＭを投与した後に合計１６週間の３サイクルのＤＳＳを投与したＷＴ及びＣｌｅｃ７ａ－／－マウスからのポリープ又は非ポリープ腸組織のｔｏｔａｌ　ＲＮＡを採取し、ＲＡ合成に関与する示された遺伝子の発現をＲＴｑＰＣＲで調べた（ＷＴ　ｎ＝３、Ｃｌｅｃ７ａ－／－　ｎ＝５）。 ＡＯＭを投与した後にＤＳＳを３サイクル１２週間投与したＷＴマウスを安楽死させ、結腸のＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１１ｃ＋骨髄由来細胞をａｕｔｏＭＡＣＳによって精製した。ラミナリンと一緒に３時間前培養した後、これらの細胞をＯＸＣＡで１６時間刺激し、ＲＡ合成に関与する遺伝子のｍＲＮＡ発現をＲＴｑＰＣＲで調べた。なお（図１１ａ、１１ｃ、１１ｄ）のデータは、平均値±ＳＤで表した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
潜在的なデクチン－１内因性リガンドのレベルは、大腸ポリープでは変化しない。図６ｉで実施されたフローサイトメトリー分析のドットパネルである。 ＷＴ又はＣｌｅｃ７ａ－／－ＧＦマウスにＡＯＭを投与し、７日後に、１質量％ＤＳＳを５日間合計３サイクル投与した。最初のＡＯＭ投与から３６週目にマウスを安楽死させ、潜在的なデクチン－１内因性リガンドをコードする示された遺伝子の発現をＲＮＡ－ｓｅｑによって決定した。 ＡＯＭを投与した後に合計１６週間の３サイクルのＤＳＳを投与したＷＴ及びＣｌｅｃ７ａ－／－マウスからのポリープ又は非ポリープ腸組織のｔｏｔａｌ　ＲＮＡを採取し、潜在的なデクチン－１内因性リガンドをコードする示された遺伝子の発現をｑＰＣＲで調べた（ＷＴ　ｎ＝３、Ｃｌｅｃ７ａ－／－　ｎ＝５）。なお（図１２ｂ、１２ｃ）のデータは、平均値±ＳＤで表した。＊ｐ＜０．０５。
ＰＧＥ２合成酵素の発現は、ＣＲＣ患者のデクチン－１シグナルによって誘導される。ＣＬＥＣ７Ａ遺伝子変異を持つ患者、又は遺伝子変異を持たない対照のＣＲＣ患者における無病率（左パネル）と無増悪生存率（右パネル）を、ＴＣＧＡデータベースの共有データを分析することによって比較した。 合計４４人のＣＲＣ患者の非腫瘍標本を収集し、ＰＧＥ２合成酵素とデクチン－１との間の発現の相関関係を示す。 手術後に新鮮なＣＲＣ標本を収集し、腫瘍組織の小片をカードランで２０時間刺激した。ラミナリン処理の場合、組織を最初にラミナリンで４時間処理し、次にカードランを培養物に添加した。ＰＧＥ２合成酵素の発現はｑＰＣＲによって決定した。データは３ウェルの平均±ＳＤである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
　以下、本開示の一実施形態について詳細に説明する。但し、本開示は以下の実施形態に限定されるものではない。以下の開示において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合を除き、必須ではない。数値及びその範囲についても同様であり、本開示を制限するものではない。
本開示において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
本開示において「～」を用いて示された数値範囲には、「～」の前後に記載される数値がそれぞれ下限値及び上限値として含まれる。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本文中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示において組成物中の各成分の含有率は、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計の含有率を意味する。
≪腸管腫瘍抑制剤、ＰＧＥ２産生抑制剤、及びＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤≫
　一態様において、本開示の腸管腫瘍抑制剤は、デクチン－１阻害剤を含有し、デクチン－１阻害を介して腸管腫瘍を抑制する。一態様において、本開示の腸管腫瘍抑制剤は、デクチン－１阻害活性を有するβグルカンを含有し、デクチン－１阻害を介して腸管腫瘍を抑制する。一態様において、本開示のＰＧＥ２産生抑制剤及びＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤は、デクチン－１阻害活性を有するβグルカンを含有する。
　発明者らは、デクチン－１の欠損が大腸腫瘍の発生を抑制すること、及びこれが常在微生物に依存せずに、ＰＧＥ２の産生抑制及びＩＬ－２２ＢＰの産生促進を介していることを見出した。本知見から、デクチン－１の阻害、ＰＧＥ２の産生抑制、及び／又はＩＬ－２２ＢＰの産生促進は腸管腫瘍抑制のための有用な戦略の１つとなると考えられる。
　本開示において、「デクチン－１阻害剤」との語は、デクチン－１の機能の阻害活性を有する物質を表す。デクチン－１の機能の阻害活性は、例えば、デクチン－１の活性部位を阻害する活性であってもよく、デクチン－１の活性部位以外を阻害（すなわち非競合阻害）する活性であってもよい。一態様において、本開示のデクチン－１阻害剤は、デクチン－１の機能を阻害し、ＰＧＥ２の産生を抑制し、ＩＬ－２２ＢＰの産生を促進する。
　対象物質がデクチン－１阻害剤であるか否か、すなわち対象物質によりデクチン－１の機能が阻害されるか否かは以下のように確認する。Ｃ５７ＢＬ／６の雄マウスから脾臓と所属リンパ節の全細胞を回収し、ＭＡＣＳでＣＤ１１ｂ＋＆ＣＤ１１ｃ＋細胞を精製してから、４ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で９６ウェル培養プレートに入れ、対象物質を種々の濃度に希釈したものを添加し、３時間培養する。その後、ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ　Ｂで１時間処理したｄｅｐｌｅｔｅｄ－Ｚｙｍｏｓａｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｃａｔａｌｏｇ　＃ｔｌｒｌ－ｚｙｄ、ＵＳＡ）を１００μｇ／ｍｌの濃度で培養ウェルに添加し、更に４８時間培養してから上清を回収し、ＥＬＩＳＡでＴＮＦの産生量を調べる。対象物質を加えた場合と対照物質の代わりに等量の溶媒を加えた場合でＴＮＦの産生量を比較し、ＴＮＦ産生が抑制されている場合は、デクチン－１の機能が阻害されたと判断できる。
　デクチン－１阻害剤としては、デクチン－１へのリガンドの結合を阻害する結合阻害剤、デクチン－１活性阻害剤、デクチン－１からのシグナル伝達を阻害するシグナル伝達阻害剤等が挙げられる。
　一態様において、デクチン－１阻害剤としては、デクチン－１アンタゴニストが挙げられる。対象物質がデクチン－１アンタゴニストであるか否かは、デクチン－１のアゴニストリガンドであるカードランを［３Ｈ］で放射性標識し、この放射性活性のデクチン－１への結合阻害活性を評価することにより確認できる。カードランのデクチン－１への結合が非阻害状態に比べて有意に阻害された場合に（ｐ＝０．０５）、βグルカンがデクチン－１阻害活性を有すると評価する。デクチン－１阻害活性は、１０％以上、２０％以上、又は３０％以上阻害されてもよい。又は、アゴニスト活性は、カードランなどの長鎖βグルカンでデクチン－１発現細胞を刺激した際に産生誘導されるＩＬ－１βやＴＮＦαなどのサイトカイン産生がどれだけ阻害されるかを評価することによっても評価することが可能である。
　一態様において、デクチン－１阻害活性を有するβグルカンは、腸管腫瘍抑制剤として有用となり得る。一般的に、分子量の小さなβグルカンはデクチン－１を阻害することが知られている。一方で、例えば分子量の大きなβグルカンの場合でも、デクチン－１を介してマクロファージに取り込まれると、分子量の大きなβグルカンは、より小さな分子量であり可溶性であるβグルカン断片に分解される。すなわち、例えば分子量の大きい不溶性βグルカンを経口摂取すると、βグルカンの一部は分子量の小さい可溶性βグルカンへと分解される。そして可溶性βグルカンは、腸管のデクチン－１シグナルを阻害することで、ＰＧＥ２産生を抑制し、それによりＩＬ－２２ＢＰ産生を促進し、そして結果的に腸管における腫瘍形成を抑制するものと考えられる。
　なお、本開示は、上記推定機構には何ら制限されない。
　βグルカンは、グルコースがβ－１，３結合等を介して重合した多糖類である。βグルカンを製造するための材料は、βグルカンを含むものであれば特に限定されない。βグルカンは、キノコ類、真菌類、酵母、海藻等の細胞壁に多く含まれ、これらを材料として製造することができる。βグルカンの製造は、公知の方法で行うことができる。例えば、キノコ類、真菌類、酵母、海藻等を熱水に浸漬することによってβグルカンを抽出することができる。本開示に用いられるβグルカンの材料のうち、分子量０．２Ｋ～１００Ｋのβグルカンの分画を多く含有していることから、海藻が材料として好適である。海藻に含有されるβグルカンは、ラミナリンと呼ばれている。また、キノコ、真菌類、及び酵母等から抽出されたβグルカンは、分子量が大きいため、加熱処理や酸処理等により低分子化されてもよい。キノコ、真菌類、及び酵母等から抽出されたβグルカンは、例えば、Ishimoto, Y., Ishibashi, K. I., Yamanaka, D., Adachi, Y., Kanzaki, K., Okita, K., Iwakura, Y., and Ohno, N. Modulation of an innate immune response by soluble yeast b-glucan prepared by a heat degradation method. Int. J. Biol. Macromol., 104, 367-376 (2017 Nov). doi: 10.1016/j.ijbiomac.2017.06.036. [Epub 2017 Jun 8].、又は、Ishimoto, Y., Ishibashi, K. I., Yamanaka, D., Adachi, Y., Kanzaki, K., Iwakura, Y., and Ohno, N. Production of low-molecular weight soluble yeast b-glucans by an acid degradation method. Int. J. Biol. Macromol., 107, 2269-2278 (2018 Feb). doi: 10.1016/j.ijbiomac.2017.10.094. [Epub 2017 Oct 16].等に記載された方法に従って、低分子化することができる。
　ラミナリン（ＣＡＳ登録番号９００８－２２－４）は、アラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ　Ｂｉｃｙｃｌｉｓ）などの海藻に由来するβグルカンを指し、ラミナランとも呼ばれる。ラミナリンは可溶性βグルカンの一種である。ラミナリンは、β－１，３結合を含むβグルカン、又はβ－１，３結合の主鎖にβ－１，６結合分岐鎖を含むβグルカンであってもよい。すなわちラミナリンは、長鎖β－１，３結合糖鎖上にβ－１，６結合側鎖を有していてもよい。ラミナリンの構造は、例えば下記一般式で表される（非還元末端にはＨ、還元末端にはＯＨがそれぞれ存在）。下記一般式において、ｎ１、ｎ２、及びｍはそれぞれ各構
造単位の数を表す。ｎ１とｎ２の和は１－３結合の主鎖の長さを表し、ｍは１－６結合の分岐鎖の長さを表す。ｎ１、ｎ２、及びｍは共に１以上の整数を表し、好ましくは２～５００の整数である。なお下記一般式において、ｎ１＋ｎ２は、デクチン－１に対するアンタゴニスト活性により優れている観点から、２～２５の整数を表すことがさらに好ましい。また、ｍ＜（ｎ１＋ｎ２）である。
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　ラミナリンは、海藻類のうちコンブ目、ヒバマタ目等の褐藻類の細胞壁に多く含まれ、これらの褐藻類から抽出することができる。抽出は種々の方法によって行うことができる。例えば、材料を熱水に浸漬することによる抽出、あるいは、松田らによる北海道大学水産科学研究彙報（BULLETIN OF FISHERIES SCIENCES, HOKKAIDO UNIVERSITY, 56(3):75-86、2005年12月）に記載の方法によってラミナリンの抽出を行うことができる。
　βグルカンの詳細は、国際公開第２０１４／１３６９８２号も参照することができる。
　腸管腫瘍抑制、ＰＧＥ２産生抑制、又はＩＬ－２２ＢＰ産生促進の観点から、本開示のβグルカンは、可溶性βグルカンであることが好ましく、β－１，３結合を含むβグルカン又はβ－１，３結合の主鎖にβ－１，６結合分岐鎖を含むβグルカンであることも好ましく、海藻由来のβグルカンであることも好ましい。本開示のβグルカンは、ラミナリンであることが特に好ましい。
　本開示において、可溶性βグルカンは水溶性βグルカンともいう。本開示において可溶性βグルカンとは、２５℃の水１Ｌに対して２０ｇ以上溶解できるβグルカンを意味する。
　本開示のデクチン－１阻害活性を有するβグルカン（以下、本開示のβグルカンともいう）の分子量は、デクチン－１の活性化阻害作用の観点から、１００Ｋ以下であることが好ましく、０．２Ｋ～１００Ｋであることがより好ましい。本開示のβグルカンの分子量は、０．２Ｋ～５０Ｋであってもよく、１Ｋ～１０Ｋであってもよく、５Ｋ以下であってもよく、０．２Ｋ～５Ｋであってもよい。なお本開示のβグルカンの分子量は、デクチン－１に対する阻害活性がより優れていることから、５Ｋ以下であることが好ましい。本開示のβグルカンの分子量の分布は１種類の分子量のβグルカンを含有する一峰性のものでもよいし、２種類の分子量のβグルカンを含有する二峰性、三峰性以上の多峰性、あるいはスメアな分子量分布を示すものでもよい。
　本明細書において「分子量」は重量平均分子量を示す。βグルカンの分子量は、既知の
方法によって決定することができる。重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定することができる。なお、分子量１Ｋは分子量が１０００であることを示す。
より詳細には、βグルカンの重量平均分子量の分析は、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて以下の条件で実施する。
　カラム　　　　：Ｇ６０００ＰＷＸＬ及びＳＢ８０２
　カラム温度　　：Ｐｕｍｐ：４０℃、Ｃｏｌｕｍｎ：６０℃
　移動相　　　　：水
　流速　　　　　：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
　検出器　　　　：ＲＩ
　サンプル濃度　：０．１％（ｗ／ｗ）
　サンプル注入量：５０μｌ
　βグルカンを取得する方法としては公知の方法を採用できる。例えば、多様な分子量のβグルカンを含むβグルカン混合物を、蒸留水（１００ｍｇ／ｍｌ）中に溶解し、任意の分子量カットオフ値を有する透析膜を使用して４℃で２日間蒸留水に対して透析し、透析後、透析された内部液を回収して凍結乾燥することで、任意の分子量を有するβグルカンを得ることができる。
　特定の分子量のβグルカンは、種々の分子量のβグルカンを含む混合物から、限外濾過、透析及びゲル濾過などの既知の方法によって得ることができる。例えば材料として分子量１００Ｋを超えるβグルカンを用いて分子量１００Ｋ以下のβグルカンを調製する場合には、当該材料を化学的又は酵素的に加水分解して使用することもできる。化学的な加水分解としては、例えば、酸を使用することができる。酵素的な加水分解としては、例えば、エンドβ－グルカナーゼ型の酵素を使用することができる。あるいは、本開示の効果を有する限りは、特定の分子量のβグルカンを高い割合で含有する褐藻の乾燥粉末等を使用することもできる。
　高分子量のβグルカンからより低分子量のβグルカンを得る方法としては、より詳細には、例えば、以下の方法が挙げられる。２００ｍｌ容量のフラスコ内に、高分子量のβグルカン（例えばカビ由来のβグルカン）１，０００ｍｇ及び５８％（ｗ／ｗ）濃硫酸５０ｍｌを冷却しながら加え、２０℃で３時間撹拌混合する。次に、前記フラスコ内に、さらに氷水３５０ｍｌを加えて８倍希釈し、さらに水酸化カルシウムを加えてｐＨ７．０になるまで中和する。そして、前記中和された物質を濾過して硫酸カルシウムを除去した後、濾過された物質をエバポレーターで濃縮し、遠心分離し、凍結乾燥することで、低分子量のβグルカン（例えば、分子量１００Ｋ以下のβグルカン）が得られる。
　なお本開示において、βグルカンのデクチン－１阻害活性とは、デクチン－１のアンタゴニストとして作用することにより、デクチン－１の活性化を阻害することのできる活性をいう。より詳細には、デクチン－１阻害活性は、デクチン－１の活性部位を直接阻害（すなわち競合阻害）する活性であってもよく、デクチン－１の活性部位以外を阻害（すなわち非競合阻害）する活性であってもよい。
　本開示において、βグルカンがデクチン－１阻害活性を有することは、デクチン－１のアゴニストリガンドであるカードランを［３Ｈ］で放射性標識し、この放射性活性のデクチン－１への結合阻害活性を評価することにより確認できる。カードランのデクチン－１への結合が非阻害状態に比べて有意に阻害された場合に（ｐ＝０．０５）、βグルカンがデクチン－１阻害活性を有すると評価する。デクチン－１阻害活性は、１０％以上、２０％以上、又は３０％以上阻害されてもよい。又は、デクチン－１阻害活性は、カードランなどの長鎖βグルカンでデクチン－１発現細胞を刺激した際に産生誘導されるＩＬ－１βやＴＮＦαなどのサイトカイン産生がどれだけ阻害されるかを評価することによっても評価することが可能である。
　デクチン－１阻害を介して腸管腫瘍が抑制されることは、デクチン－１に制御され、かつ腸管腫瘍に関連するＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１、ＴＮＦ等のサイトカイン；ＰＧＥ２；ＩＬ－２２結合タンパク質の発現量をＥＬＩＳＡで測定することにより確認できる。
　対象にデクチン－１阻害剤、βグルカン又はこれを含有する剤を投与する方法は特に制限されず、経口投与又は非経口投与（例えば、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、点眼、点耳、経鼻投与、吸入投与、経皮投与、経直腸投与、髄腔内投与、又は静脈内投与等）のいずれであってもよいが、経口投与又は経腸投与が好ましい。経口投与に適した剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液剤、エリキシル剤等が挙げられる。
　デクチン－１阻害剤、βグルカン又はこれを含有する剤を投与する対象は特に制限されないが、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、シカ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、リスなどの哺乳類、ニワトリ、アヒル、カモ、ガチョウ、キジ、ハト、ウズラ、ホロホロ鳥、七面鳥、インコ、オウムなどの鳥類が好ましい。特に好ましい対象は哺乳類である。
　本開示に用いるデクチン－１阻害剤又はβグルカンは、医薬品又は食品若しくは飼料に配合して対象に投与することが好適である。本開示の腸管腫瘍抑制剤、ＰＧＥ２産生抑制剤、及びＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤は、本開示の効果を有する限りは、βグルカン以外の糖鎖等、他の成分を含んでいてもよい。
　他の成分としては、例えば、ビタミン類、アミノ酸等の成分、賦形剤、増粘剤、等張化剤（例えば、食塩、グルコース等の溶質）、その他の製剤用添加物等が挙げられる。製剤用添加物としては、例えば、水、生理食塩液、デキストロース又は類似の糖溶液等の液状媒体、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレンルリコール等のグリコール類；亜硫酸塩等の抗酸化剤；クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等のｐＨ調節剤及び緩衝剤；ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等の安定化剤；塩化ナトリウム、ブドウ糖等の等張化剤；塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等の局所麻酔剤；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の界面活性剤などが挙げられる。また、これらの他にも剤型に合わせて公知の添加物を含有することができる。
　本開示の腸管腫瘍抑制剤、ＰＧＥ２産生抑制剤、及びＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤の投与量は、腸管腫瘍の抑制、ＰＧＥ２産生の抑制、又はＩＬ－２２ＢＰ産生の促進に有効な量であればよい。投与量は、年齢、病態、症状、家族歴等により適宜増減することが好ましい。また、複数回投与してもよい。複数回投与する場合には、投与間隔は病態、症状等により適宜増減することが好ましい。
　本開示の腸管腫瘍抑制剤において、腸管は、大腸（より詳細には、盲腸、結腸、直腸等）及び小腸（より詳細には、十二指腸、空腸、回腸等）のいずれであってもよく、大腸及び小腸であってもよい。
　本開示の腸管腫瘍抑制剤は、腸管腫瘍を有する対象に投与され、既に形成された腫瘍の数を減少させるために治療的に用いられる、腸管腫瘍数減少用治療剤であってもよい。本開示の腸管腫瘍抑制剤は、腸管腫瘍を有さない対象に投与され、将来的に形成され得る腫瘍の数を減少させるために予防的に用いられる、腸管腫瘍数減少用予防剤であってもよい。あるいは、本開示の腸管腫瘍抑制剤は、腸管腫瘍を有する対象に投与され、既に形成された腫瘍の大きさを縮小させるために治療的に用いられる、腸管腫瘍縮小用治療剤であってもよい。本開示の腸管腫瘍抑制剤は、腸管腫瘍を有さない対象に投与され、将来的に形成され得る腫瘍の大きさを縮小させるために予防的に用いられる、腸管腫瘍縮小用予防剤であってもよい。
　本開示の腸管腫瘍抑制剤を対象に投与することによって、投与対象のＰＧＥ２産生を抑制することができる。つまり、本開示の腸管腫瘍抑制剤は、ＰＧＥ２産生抑制剤として用いてもよい。
　本開示の腸管腫瘍抑制剤を対象に投与することによって、投与対象のＩＬ－２２ＢＰ産生を促進することができる。つまり、本開示の腸管腫瘍抑制剤は、ＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤として用いてもよい。
　ＰＧＥ２（プロスタグランジンＥ２）は、生理活性脂質であるプロスタグランジンの一種である。ＩＬ－２２ＢＰ（ＩＬ－２２結合タンパク質）は、腫瘍形成の強力な制御因子である。本開示の腸管腫瘍抑制剤は、デクチン－１シグナルを阻害することにより、ＭＤＳＣ（骨髄由来抑制細胞）から合成（産生）されるＰＧＥ２が抑制され、それによりＭＤＳＣの増殖がさらに阻害され、そしてＩＬ－２２ＢＰの産生が促進され、最終的に腸管の腫瘍形成が抑制されると考えられる。
　なお本開示において、腸管腫瘍抑制の指標として、腸管の、視診、内視鏡検査、組織学的検査（例えば、細胞診、病理組織学的検査等）、マーカー検査（例えば、血液検査、尿検査等）、又は画像診断（例えば、Ｘ線検査、ＣＴ検査、ＭＲＩ検査、ＰＥＴ検査、超音波検査等）等を実施することができる。あるいは、腸管腫瘍抑制の指標として、腸管腫瘍の、ＰＧＥ２のタンパク質発現量若しくはｍＲＮＡ発現量、又はＰＧＥ２合成に関与する酵素若しくはその遺伝子（例えば、Ｐｌａ２ｇ２ａ若しくはＰｌａ２ｇ２ｅ（ＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＡ２　ｇｒｏｕｐ　ＩＩＡ／ＩＩＥ）、Ｐｔｇｓ１若しくはＰｔｇｓ２（Ｃｏｘ１／Ｃｏｘ２）、又はＰｔｇｅｓ２若しくはＰｔｇｅｓ３（ＰＧＥ２　ｓｙｎｔｈａｓｅ　２／３）等）のｍＲＮＡ発現量が低下していることにより評価することができる。あるいは、腸管腫瘍抑制の指標として、腸管腫瘍の、ＩＬ－２２ＢＰのタンパク質発現量若しくはＩＬ－２２ＢＰの遺伝子（Ｉｌ－２２ｂｐ）のｍＲＮＡ発現量が増加していることにより評価することができる。
　本開示において、ＰＧＥ２産生の抑制は、試料中のＰＧＥ２のタンパク質発現量又はｍＲＮＡ発現量が低下していることにより判断できる。ＰＧＥ２のタンパク質発現量は、ＥＬＩＳＡ等の公知の方法で測定できる。ＰＧＥ２のｍＲＮＡ発現量は、リアルタイムＰＣＲ等の公知の方法で測定できる。
　本開示において、ＩＬ－２２ＢＰ産生の促進は、試料中のＩＬ－２２ＢＰのタンパク質発現量又はｍＲＮＡ発現量が上昇していることにより判断できる。ＩＬ－２２ＢＰのタンパク質発現量は、ＥＬＩＳＡ等の公知の方法で測定できる。ＩＬ－２２ＢＰのｍＲＮＡ発現量は、リアルタイムＰＣＲ等の公知の方法で測定できる。
≪他の実施形態≫
　本開示は、デクチン－１阻害剤の有効量を対象に投与することを含む、腸管腫瘍の予防又は治療方法も提供する。さらに本開示は、デクチン－１阻害活性を有するβグルカンの有効量を対象に投与することを含む、腸管腫瘍の予防又は治療方法も提供する。前記腸管腫瘍は、ＰＧＥ２の発現上昇を伴う腸管腫瘍であってもよく、ＩＬ－２２ＢＰの発現低下を伴う腸管腫瘍であってもよい。
　さらに本開示は、腸管腫瘍の予防又は治療に用いるための、デクチン－１阻害剤も提供する。さらに本開示は、腸管腫瘍の予防又は治療に用いるための、デクチン－１阻害活性を有するβグルカンも提供する。前記腸管腫瘍は、ＰＧＥ２の発現上昇を伴う腸管腫瘍であってもよく、ＩＬ－２２ＢＰの発現低下を伴う腸管腫瘍であってもよい。
　さらに本開示は、デクチン－１阻害剤の、腸管腫瘍の予防又は治療のための医薬の製造における使用も提供する。さらに本開示は、デクチン－１阻害活性を有するβグルカンの、腸管腫瘍の予防又は治療のための医薬の製造における使用も提供する。前記腸管腫瘍は、ＰＧＥ２の発現上昇を伴う腸管腫瘍であってもよく、ＩＬ－２２ＢＰの発現低下を伴う腸管腫瘍であってもよい。
　上記実施形態における、「発現上昇」及び「発現低下」は、腫瘍組織中及び非腫瘍組織中の対象分子の量をＥＬＩＳＡ又はリアルタイムＰＣＲ等で測定することにより評価できる。また、腫瘍組織中の対象分子の量を測定し、既知の標準量と比較することによっても評価できる。
　さらに本開示は、腫瘍組織中の、デクチン－１タンパク質発現量及びＣＬＥＣ７Ａ遺伝子発現量の少なくとも一方を測定することを含む腸管腫瘍の重症度の予測方法も提供する。測定は生体内で行っても生体外で行ってもよい。
　腸管腫瘍の重症度の予測方法の作用は明確ではないが、以下のように推定される。
　腸管腫瘍は、デクチン－１シグナルの活性化により促進される。一方で、腸管腫瘍は、デクチン－１シグナルの阻害により抑制される。そして、デクチン－１タンパク質発現量、又はデクチン－１タンパク質をコードするＣＬＥＣ７Ａ（Ｃ－Ｔｙｐｅ　Ｌｅｃｔｉｎ　Ｄｏｍａｉｎ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　７Ａ）遺伝子発現量は、腸管腫瘍の重症度と正の相関を有する。よって、デクチン－１タンパク質発現量、又はデクチン－１タンパク質をコードするＣＬＥＣ７Ａ遺伝子発現量を測定することで、それらの発現量が多いほど腸管腫瘍の重症度が高くなり、それらの発現量が少ないほど腸管腫瘍の重症度が低くなると考えられる。
　なお、本開示は、上記推定機構には何ら制限されない。
　腫瘍組織中のデクチン－１タンパク質発現量及びＣＬＥＣ７Ａ遺伝子発現量の測定方法は、特に限定されず、通常実施されるタンパク質の定量方法（例えばＥＬＩＳＡ等）又は遺伝子（例えばｍＲＮＡ）の定量方法（例えばリアルタイムＰＣＲ等）を用いてもよい。
　上記各実施形態における、デクチン－１阻害剤、デクチン－１阻害活性を有するβグルカン、対象、腸管腫瘍、ＰＧＥ２、ＩＬ－２２ＢＰ等の各要件の詳細は、前述の事項を適用できる。
　以下、本開示を実施例により更に具体的に説明するが、本開示はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
１．デクチン－１の欠損は、常在微生物に依存しない方法で大腸腫瘍の発生を抑制する
　腸管腫瘍形成におけるデクチン－１の潜在的な役割を調べるために、我々はまず、β－カテニンシグナル伝達経路に変異のあるＡｐｃＭｉｎ（ＡｐｃＭｉｎ－ＤＳＳ）マウスをＤＳＳ処理した場合の大腸腫瘍形成に対するデクチン－１シグナルの影響を調べた（参考文献１８）。ＡｐｃＭｉｎ／＋デクチン－１欠損（Ｃｌｅｃ７ａ－／－）マウスのＤＳＳ投与後の体重減少は、ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスに比べて有意に軽度であった（図８ａ）。ＤＳＳ投与後２８日目には、大腸炎の症状の一つである大腸の長さの短縮は、ＤＳＳのみを投与したＣｌｅｃ７ａ－／－マウス（参考文献１１）と同様に、ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスでも軽度であり（図１ａ、８ｂ）、大腸のポリープ数はＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスで有意に減少した（図１ａ、１ｂ）。
　また、ＤＳＳを投与していないＡｐｃＭｉｎマウスの腫瘍の発生に対するデクチン－１欠損の影響を調べた。２０～２３週齢のマウスを安楽死させた後、ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスでは、大腸と小腸両方でポリープの発生がＡｐｃＭｉｎ／＋マウスに比べて有意に抑制されていることがわかった（図１ｃ、１ｄ、８ｃ、８ｄ）。ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスの小腸では、３ｍｍ以下のポリープの数が有意に減少した（図８ｄ）。
　次に、別の化学物質誘発大腸腫瘍モデルを用いて、野生型（ＷＴ）及びＣｌｅｃ７ａ－／－マウスにアゾキシメタン（ＡＯＭ）及びＤＳＳを３サイクル投与した（ＡＯＭ－３ＤＳＳ）。Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスは、ＤＳＳを３サイクル投与する間、ＷＴマウスよりも軽度な体重減少を示した（図８ｅ）。Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスでは、大腸の長さの短縮が有意に軽度であった（図１ｅ、８ｆ）。ＡＯＭ－３ＤＳＳによって誘発されたＣｌｅｃ７ａ－／－マウスのポリープの数は、ＷＴマウスのポリープの数よりも有意に少なかった（図１ｆ）。Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスでは、ＡＯＭと１サイクルのＤＳＳのみを行った場合、肛門脱（図８ｇ、８ｈ）と結腸長の短縮（図８ｉ、８ｊ）も有意に軽度であった。すべてのＷＴマウスに大腸ポリープが発生したが、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスでは半数のマウスに小さいサイズのポリープが発生した（図８ｈ、８ｋ）。これらの結果は、デクチン－１シグナルの遮断が腸の腫瘍形成を抑制することを示している。
　我々は以前、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）誘導性の常在菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｕｒｉｎｕｓのコロニー形成がＣｌｅｃ７ａ－／－マウスの腸内で亢進し、腸の炎症を抑制することを報告した（参考文献１１）。実際、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより、ポリープと非ポリープ組織におけるＦｏｘｐ３（Ｔｒｅｇマーカー）の発現が、デクチン－１欠損マウスで有意に増加していることがわかった（図９ａ）。Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスの腫瘍形成の制御における腸内細菌叢の影響を調べるため、離乳後のＣｌｅｃ７ａ－／－マウスとＷＴマウスを継続的に同居させ、これらの同居マウスにＡＯＭ－３ＤＳＳを投与して大腸腫瘍を誘発した。しかし、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスの大腸のポリープ数はＷＴマウスに比べて有意に少なく、ＷＴマウスでは特に直径３ｍｍ以上の大きなポリープが認められた（図１ｇ、１ｈ）。
　デクチン－１による腫瘍形成の制御における常在微生物叢の影響をさらに解析するために、無菌（ＧＦ）のＷＴ及びＣｌｅｃ７ａ－／－マウスにＡＯＭ－３ＤＳＳを投与した。ＡＯＭ投与から３６週後にマウスを安楽死させたところ、大腸の長さは両マウス間でほぼ同じであったが、大腸ポリープはＷＴマウスにのみ発生し、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスには発生しなかった（図１ｉ～１ｋ）。これらのＧＦマウスでは、腸内のＦｏｘｐ３の発現はＷＴマウスとＣｌｅｃ７ａ－／－マウスで同様であった（図９ｂ）。これらの結果から、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスの腫瘍発生の抑制は、常在する微生物に依存しないことが示された。
２．Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスのポリープでは骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の浸潤が減少している
　次に、ＡｐｃＭｉｎ／＋バックグラウンドのＣｌｅｃ７ａ－／－マウスに１質量％ＤＳＳを投与し、大腸内の腫瘍浸潤細胞集団の変化を解析した。フローサイトメトリー解析により、ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスのポリープでは、Ｔ細胞（αβ型Ｔ細胞及びγδ型Ｔ細胞の両方を含む）、Ｂ細胞（ＩｇＧ＋Ｂ細胞を含む）、ＤＣｓ（ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞）がＡｐｃＭｉｎ／＋マウスに比べて有意に増加し（図２ａ、９ｃ）、ＭＨＣ－ＩＩ－ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が大幅に減少したことがわかった（図３ｂ）。
　デクチン－１はＤＣに発現していることが広く知られているが、マウス大腸ポリープでは、フローサイトメトリー解析により、デクチン－１の発現は主にＣＤ１０３－ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋細胞に見られた（図２ｃ、９２．４％）。さらにデクチン－１を発現している集団を解析したところ、デクチン－１＋の７５％近くがＭＨＣ－ＩＩ－であり、そのうち５０％近くがＬｙ６ＣｉｎｔＬｙ６Ｇ＋ＣＤ１１ｂ＋、５％がＬｙ６ＣｈｉＣＤ１１ｂ＋、１９％がＣＤ１１ｃ－ＭＨＣ－ＩＩ－Ｇｒ１－ＣＤ１１ｂ＋細胞であった（図９ｄ）。これらの腫瘍浸潤性ミエロイド細胞は、一般的に顆粒球性多形核及び単球性ＭＤＳＣとして知られている（参考文献２２）。ＩＬ－６やＩＬ－１βはＭＤＳＣの増殖を促進することが報告されており（参考文献２３、２４）、腸管ポリープに浸潤したＣＤ１１ｂ＋細胞やＣＤ１１ｃ＋細胞をＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ由来のβ－グルカンＯＸＣＡで刺激すると、Ｉｌ６やＩｌ１ｂの発現が誘導され、この誘導はデクチン－１アンタゴニストのラミナリンで阻害された（図２ｄ）ことから、ＭＤＳＣ促進因子がデクチン－１シグナルによって直接誘導されることが示唆された。
３．いくつかの腫瘍制御パスウェイがデクチン－１シグナルに依存している
　デクチン－１シグナルが腫瘍形成を制御するメカニズムを明らかにするために、ＡＯＭ－３ＤＳＳ投与後のＧＦマウスの腫瘍組織及び非腫瘍組織における遺伝子発現をＲＮＡ－ｓｅｑ解析により調べた。ＧＦ条件ではＳＰＦ条件よりも全体の遺伝子バックグラウンドが低く、デクチン－１制御遺伝子を容易に見つけることができた。その結果、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスの大腸ポリープでは、Ｔ細胞－（Ｃｄ３ｅ、Ｃｄ２８、Ｃｄ６９、Ｃｃｒ６、Ｃｃｒ９など）、Ｔｈ１－（Ｃｄ４、Ｔｂｘ２１、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ１２ａ、Ｃｘｃｒ３など）、Ｂ細胞－（Ｃｄ１９、Ｉｇ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ、Ｃｘｃｒ５など）、ＤＣ－（Ｉｔｇａｘ、Ｈ２－Ａｂ１、Ｃｃｒ７など）に関連した遺伝子は大幅に増加し、Ｔｈ１７関連遺伝子（Ｉｌ１７ａ、Ｉｌ２３ａなど）が減少していた（図３ａ、１０ａ、１０ｂ）。Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスの大腸ポリープでは、ＩＬ－２２（Ｉｌ２２）やＩＬ－１８（Ｉｌ１８）などの腫瘍制御サイトカインの発現は変化しなかったが、ＩＬ－２２拮抗受容体であるＩＬ－２２結合タンパク質（Ｉｌ２２ｂｐ又はＩｌ２２ｒａ２）の発現が大幅に増加していた（図３ａ、１０ａ）。また、ＫＥＧＧ遺伝子エンリッチメント解析により、抗体産生、リンパ球活性化、ＮＫ細胞介在性細胞傷害、抗原提示などの免疫関連遺伝子が、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスの腫瘍組織でＷＴマウスに比べて上昇していることがわかった（図２ｂ）。一方、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスの大腸では、Ｗｎｔシグナル、ＩＬ－１７シグナル、Ｒａｓシグナル、アラキドン酸代謝などの経路が抑制されていた（図３ｂ）。Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスのポリープでは、ＭＤＳＣ関連遺伝子（参考文献２５）の発現が抑制されており、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスの大腸腫瘍におけるＭＤＳＣの浸潤が損なわれていることと一致していた（図２ｂ）。また、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスのポリープでは、ＭＤＳＣの分化を促進するＣｓｆ２、Ｉｌ６、Ｉｌ１ｂ、Ｔｎｆの発現が大きく損なわれていた（参考文献２３、２４）（図３ａ、１０ａ、１０ｂ）。興味深いことに、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスのポリープでは、Ｐｌａ２ｇ２ａ（ホスホリパーゼＡ２）、Ｐｔｇｓ１（Ｃｏｘ１）、Ｐｔｇｓ２（Ｃｏｘ２）などのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）合成酵素をコードする遺伝子の発現が低下していることもわかった（図３ｄ、１０ａ）。大腸ポリープではデクチン－１遺伝子Ｃｌｅｃ７ａの発現が非ポリープ組織に比べて上昇しており（図３ｅ）、大腸腫瘍における主要なデクチン－１発現細胞であるＭＤＳＣの拡大・浸潤を反映していると考えられた（図２ｂ）。
　Ｔ細胞と抗体を産生するＢ細胞はともに抗腫瘍免疫に関与しているが（参考文献１９～２１）、Ｒａｇ２－／－マウスにＡＯＭ－３ＤＳＳを投与したところ、リンパ球を持たないマウスはＷＴマウスに比べてポリープの発生がさらに少なくなった（図１０ｃ、１０ｄ）ことから、これらのリンパ球がマウスの大腸がんの抑制には関与していないことがわかった。
４．デクチン－１の欠損はＩＬ－２２結合蛋白質の産生を促進することで大腸腫瘍の発生を抑制する
　ＧＦ　Ｃｌｅｃ７ａ－／－ＡＯＭ－３ＤＳＳマウスのポリープでは、ＩＬ－２２ｂｐの発現が有意に上昇していた（図３ａ、１０ａ）。ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－－ＤＳＳマウスの腸でも、ＩＬ－２２ｂｐのｍＲＮＡの発現は、ポリープだけでなく、非ポリープ組織でも亢進していた（図４ａ、１１ａ）。ＩＬ－１８はＩＬ－２２ｂｐの直接的な抑制因子として報告されているが、ＧＦ　Ｃｌｅｃ７ａ－／－とＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスの両方でＩｌ１８のｍＲＮＡの発現は正常であった（図４ａ、１１ａ）（参考文献２６）。
　ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－のバックグラウンドでＩＬ－２２ｂｐ－／－マウスを作製した。その結果、ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスのＡｐｃＭｉｎ／＋マウスと比較した寿命の延長は、ＩＬ－２２ｂｐ欠損によって完全にキャンセルされ、半分のＩＬ－２２ｂｐ欠損でもＣｌｅｃ７ａ－／－マウスの寿命が短くなることがわかった（図４ｂ）。ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－ではＡｐｃＭｉｎ／＋マウスに比べてポリープの数が減少したが（図８ｃ、８ｄ）、年齢の低いＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－Ｉｌ－２２ｂｐ－／－マウスではさらに多くのポリープが観察された（図４ｃ）。これらの結果から、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスの腸管腫瘍発生の抑制には、ＩＬ－２２ｂｐのアップレギュレーションが重要であることがわかった。
　腸内のＩＬ－２２ｂｐ発現細胞を同定するために、腸管ポリープからＥｐＣＡＭ＋上皮細胞とＣＤ４５＋白血球を分離し、ｑＰＣＲでＩｌ－２２ｂｐ　ｍＲＮＡがＣＤ４５＋集団にのみ発現していることを確認した（図４ｄ）。フローサイトメトリーにより、ＩＬ－２２ｂｐタンパク質はＣＤ１１ｂ－ＣＤ１０３＋及びＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１０３ｉｎｔＤＣｓの両方に発現していたが、ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋ＭＤＳＣｓには発現していなかった（図４ｅ）。Ｉｌ－２２ｂｐは、大腸ポリープと非ポリープの両方の組織において、Ｔｈｙ１．２＋Ｔ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＥｐＣＡＭ＋上皮細胞ではなく、ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１１ｃ＋骨髄系細胞でのみ発現し（図４ｆ）、その発現は主にＤＣで検出されたが、ＣＤ１１ｃ－ＭＤＳＣでは検出されなかった（図４ｇ）。大腸のＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１１ｃ＋細胞をデクチン－１リガンドで処理しても、Ｉｌ－２２ｂｐの発現は影響を受けなかった（図４ｈ）ことから、デクチン－１はＩｌ－２２ｂｐの発現制御に直接関与していないと考えられる。
　レチノイン酸（ＲＡ）はＩＬ－２２ｂｐの産生を調節することが報告されており（参考文献２７、２８）、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスのポリープではＡｄｈ１やＡｌｄｈ１ａ１などのＲＡ合成を触媒する酵素の発現が亢進していた（図１１ｂ、１１ｃ）。しかし、βグルカンはこれらの酵素の発現に影響を与えなかった（図１１ｄ）ことから、ＲＡの合成はデクチン－１シグナルによって直接制御されていないことが示唆された。
５．デクチン－１シグナルがＰＧＥ２産生を直接促進する
　ＡＯＭ－３ＤＳＳを投与したＧＦマウスから得られたＲＮＡ－ｓｅｑデータは、Ｐｌａ２ｇ２ａ／２ｅ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ａ２　ｇｒｏｕｐ　ＩＩＡ／ＩＩＥ）、Ｐｔｇｓ１／２（Ｃｏｘ１／Ｃｏｘ２）、Ｐｔｇｅｓ２／３（ＰＧＥ２　ｓｙｎｔｈａｓｅ　２／３）などのＰＧＥ２合成に関与する遺伝子の発現が、ＷＴマウスのポリープでは大きく上昇していたが、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスのポリープでは上昇していなかった（図３ｄ、１０ａ）。大腸ポリープ及び非ポリープ組織におけるＰｔｇｓ２の発現低下は、ＳＰＦ条件下のＣｌｅｃ７ａ－／－マウスでも観察され（図５ａ）、非ポリープ組織ホモジネート中のＰＧＥ２濃度はＣｌｅｃ７ａ－／－マウスで有意に低下した（図５ｂ）。ＰＧＥ２合成に関与する酵素は、ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋ＭＤＳＣｓに優先的に発現していたが、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓもこれらの遺伝子を低レベルで発現していた（図５ｃ）。
　腸管ポリープにおけるＰｔｇｓ２の発現低下は、ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスでも観察され（図５ｄ）、この低下はＣＤ４５＋腸管白血球でより明らかであった（図５ｅ）。ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスのポリープ浸潤白血球をデクチン－１アゴニストの不溶性βグルカンであるカードラン（すなわちβ－１，３－グルカン、土壌細菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ｖａｒ．　ｍｙｘｏｇｅｎｅｓ由来のカードラン、重量平均分子量１００Ｋ超（富士フイルム和光純薬株式会社、日本、大阪））で処理すると、ＰＧＥ合成酵素３をコードする遺伝子（Ｐｔｇｅｓ３）、Ｃｏｘ１をコードする遺伝子（Ｐｔｇｓ１）、Ｃｏｘ２をコードする遺伝子（Ｐｔｇｓ２）の発現が有意に誘導され、その誘導はデクチン－１アンタゴニスト（阻害剤）のラミナリンで抑制された（図５ｆ）。精製したポリープ浸潤ＣＤ１１ｂ＋細胞に対するデクチン－１シグナルの刺激及び遮断は、ＰＧＥ２合成酵素の発現を同様に変化させた（図５ｇ）ことから、デクチン－１シグナルは、腸管腫瘍浸潤ＭＤＳＣｓにおいてＰＧＥ２合成を直接誘導することが示された。
６．デクチン－１アンタゴニストの投与は、腸内のＰＧＥ２を減少させることにより、腸管ポリープの発生を抑制する
　デクチン－１遮断の腸管腫瘍形成に対する治療効果を検討するために、ＷＴマウスにＡＯＭ－３ＤＳＳを投与し、ＤＳＳ投与を３サイクル行う間、５質量％のデクチン－１アンタゴニストであり可溶性βグルカンであるラミナリン（アラメ由来のラミナリン（東京化成工業株式会社、日本、東京）、重量平均分子量は５０Ｋ以下）を含む食餌をマウスに与えた。Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスでの観察結果と同様に、ラミナリンを与えたマウスは、コントロールマウスに比べて大腸ポリープの発生が有意に少ないことがわかった（図６ａ、６ｂ）。デクチン－１シグナルを遮断すると、マウス腸管のＰＧＥ２産生が抑制され（図６ｃ）、それに伴いＣＤ１１ｂ（Ｉｔｇａｍ）の発現も減少した（図６ｄ）。一方、ＤＳＳ処理したＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスにＰＧＥ２を４週間間欠的に投与すると、ポリープ数はＡｐｃＭｉｎ／＋マウスと同程度に増加した（図６ｅ、６ｆ）。ＰＧＥ２投与後のポリープでは、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ及びＴ細胞の浸潤が抑制されたが、ＣＤ１１ｂ＋ＭＤＳＣの浸潤は促進された（図６ｇ、１２ａ）。また、ＰＧＥ２投与により、ＭＤＳＣマーカーであるＣＤ１１ｂ（Ｉｔｇａｍ）とアルギナーゼ－１（Ａｒｇ１）、がん遺伝子であるＣｙｃｌｉｎ　Ｄ１（Ｃｃｎｄ１）とｃ－Ｍｙｃ（Ｍｙｃ）の発現が亢進する一方、Ｉｌ－２２ｂｐの発現は抑制された（図６ｈ）ことから、大腸がんにおけるＭＤＳＣの浸潤、腫瘍の成長、ＩＬ－２２ｂｐの産生は、ＰＧＥ２によって制御されていると考えられた。ＰＧＥ２の制御機能を確認するために、腸管ポリープ浸潤細胞をＰＧＥ２で刺激したところ、Ａｒｇ１、ＣＤ１１ｂ、Ｎｏｓ２などのＭＤＳＣマーカーの発現が直接誘導され、ＩＬ－２２ｂｐがＰＧＥ２投与により直接抑制されることがわかった（図６ｉ）。興味深いことに、大腸ポリープでは、ＧＦとＳＰＦの両方の条件下で、Ｃｏｘ２　ｍＲＮＡレベルがＩｌ－２２ｂｐの発現と負の相関関係にあることもわかった（図６ｊ）。これらの結果から、デクチン－１シグナルを阻害することにより、ＭＤＳＣから合成されるＰＧＥ２が抑制され、ＭＤＳＣの増殖がさらに阻害され、ＩＬ－２２ｂｐが促進され、最終的に腸管の腫瘍形成が抑制されると考えられる。
７．デクチン－１シグナルは大腸がん患者におけるＰＧＥ２合成を促進する
　ヒトにおけるＣＲＣ発症に対するデクチン－１シグナルの役割を評価するために、まずＣＲＣ標本を採取し、ＣＬＥＣ７Ａの発現を調べた。その結果、ＣＬＥＣ７Ａの発現レベルが高い（相対発現量２以上、ＧＡＰＤＨで正規化）患者の術後生存率は、ＣＬＥＣ７Ａの発現レベルが低い（２未満）患者よりも有意に低いことがわかった（図７ａ）。次に、ＣＬＥＣ７Ａの発現レベルが病理学的な腫瘍の悪性度と正の相関関係にあることに気づいた（図７ｂ、７ｃ）。また、ＣＬＥＣ７Ａに変異があるＣＲＣ患者では、疾患率や進行率が相対的に低下していたが、ＴＣＧＡ（がんゲノムアトラス）データベースではＣＬＥＣ７Ａに変異があるＣＲＣ患者の数が少ないため、この傾向は有意ではなかった（図１３ａ）。これらの観察結果は、ヒトにおけるデクチン－１シグナルがＣＲＣの発症を促進することを示唆している。
　マウスで発見された「デクチン－１－ＰＧＥ２－ＩＬ－２２ｂｐ軸」の可能性がヒトにも存在するかどうかを明らかにするために、まずＣＲＣ患者の腫瘍におけるＩＬ－２２ＢＰとＣＯＸ２のｍＲＮＡ発現を調べた。腫瘍部分では、非腫瘍部分に比べてＩＬ－２２ＢＰが相対的に減少し、ＰＴＧＳ２が有意に増加しており（図７ｄ）、この傾向は同一人物のサンプル（腫瘍組織と非腫瘍組織の２３組）を比較するとより顕著であった（図７ｅ）。さらに、ＣＲＣ患者の腸内におけるＣＬＥＣ７Ａの発現量とＰＬＡ２Ｇ２Ａ、ＰＴＧＳ２、ＰＴＧＥＳの発現量との間に強い正の相関関係があることを見出し（図７ｆ、１３ｂ）、ＣＲＣ組織や癌浸潤白血球にカードランを投与すると、ＰＧＥ２合成酵素遺伝子の発現が誘導されることも確認した（図７ｇ、１３ｃ）。さらに、カードランは、ヒトＭＤＳＣｓ（参考文献２９）の共通マーカーであるＣＤ３３の発現を腫瘍又は正常組織の両方で上昇させ（図７ｈ）、デクチン－１シグナルがＣＲＣにおいてもＭＤＳＣｓを促進することが示唆された。ＣＲＣにおけるＣＤ３３及びＣＤ１１Ｂ（ＩＴＧＡＭ）の発現は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＰＧＥ２により直接誘導され、ヒトＩＬ－２２ＢＰもＰＧＥ２により用量依存的に抑制された（図７ｉ）。これらの結果は、「デクチン－１－ＰＧＥ２－ＩＬ－２２ＢＰ軸」も存在し、ヒト大腸発癌の制御に関与している可能性を示唆している。
≪考察≫
　現在では、βグルカンには化学的な細胞毒性作用がないことが知られている。βグルカンの細胞毒性作用を示唆する研究は、ほとんどがＧａｎｏｄｅｒｍａ　ｌｕｃｉｄｕｍのようなβグルカン含有ハーブの粗抽出物を用いた研究であったが、その中には、その菌糸体（参考文献３０）からのガノデリン酸やその胞子（参考文献３１）からのトリテルペンのような他の有効成分が、実際に直接的な抗癌作用を持つことが知られている。これまでの研究で、βグルカンを経口投与すると、抗腫瘍剤の抗腫瘍効果が増強されること（参考文献３２）、酵母由来のβ－グルカン粒子を経口投与すると、皮下接種したＬｅｗｉｓ肺癌の増殖が抑制されること（参考文献３３）が明らかになっている。しかし、Ｃｈｅｕｎｇらは、グルカンをフルオレセインで標識することで、経口摂取後の生体内での処理を追跡し、大きなβグルカン分子がデクチン－１を介してマクロファージに取り込まれた後、より小さな可溶性のβ－１，３－グルカン断片に分解されることを明らかにした（参考文献３４）。可溶性βグルカンの代表的なものは、デクチン－１の拮抗リガンドであるラミナリンであることから、経口摂取後、分子量の大きい不溶性βグルカンの一部がラミナリンに分解され、腸管のデクチン－１シグナルを阻害することで、結果的に抗腸管腫瘍形成を示すものと考えられる。
　本研究では、デクチン－１を阻害することで、ＡＯＭ－ＤＳＳ誘発ＣＲＣモデル及びＡｐｃＭｉｎ家族性腺腫性ポリポーシス大腸腫瘍モデルのマウスにおいて、大腸腫瘍の発生を効果的に抑制することを明らかにした。Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスでは、Ｃｏｘ２、Ｃｏｘ１、Ｐｔｇｅｓ３などのＰＧＥ２合成酵素の発現が低下していたため、ＭＤＳＣの増殖や腫瘍の発生を促進するＰＧＥ２のレベルが低下していた。また、ＩＬ－２２の活性を阻害することで大腸がんの発生を抑制することができるＩＬ－２２ｂｐの発現がＣｌｅｃ７ａ－／－マウスで有意に増加していた。さらに、デクチン－１の発現量が多いＣＲＣ患者は、発現量が少ないＣＲＣ患者に比べて生存期間が短いことがわかった。デクチン－１の発現レベルと大腸癌のステージには正の相関が認められた。ＣＲＣ患者では、正常組織と比較して、腫瘍ではＩＬ－２２ＢＰの発現が減少し、ＰＴＧＳ２の発現が増加していた。これらの結果から、デクチン－１はＰＧＥ２濃度やＩＬ－２２ｂｐの発現を調節することで、マウスやヒトの大腸癌の発生に重要な役割を果たしていることが示唆された。
　炎症性疾患の主要なメディエーターとしてよく知られているＰＧＥ２は、受容体ＥＰ２に結合し、β－カテニン軸を活性化することで、大腸がん細胞の増殖や、Ｔｎｆ、Ｉｌ６、Ｃｘｃｌ１、Ｃｏｘ２などの炎症・成長関連遺伝子の発現を促進し、ＡＯＭ－ＤＳＳ誘導性大腸腫瘍の発生に重要な役割を果たしている（参考文献３６、１１、３７）。実際、Ａｐｃ欠損マウスの腸管ポリープ症はＰｔｇｓ２欠損変異マウスでは抑制されており、アスピリンなどのＮＳＡＩＤｓに代表されるＣＯＸ－２阻害剤は、大腸がんやポリープの発生や進行を抑制することができる（参考文献３８、３９）。本研究では、デクチン－１の欠損により、ＰＧＥ２の合成に関わる一連の酵素、特にホスホリパーゼＡ２とＣｏｘ２の発現が、ＡＯＭとＡｐｃＭｉｎ誘発腸管腫瘍の両方で損なわれることを明らかにした。また、デクチン－１シグナルが、腫瘍に浸潤したＭＤＳＣｓにおいて、これらのＰＧＥ２合成酵素の発現を直接誘導することも明らかにした。
　実際、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスではＰＧＥ２の腸内レベルが低下しており、外因性ＰＧＥ２の投与により大腸ポリポーシスが回復した。これらの結果は、デクチン－１シグナルがＰＧＥ２合成を促進することで、腸管の腫瘍化を促進することを示している。これまでの報告では、ハウスダストによるアレルギー性気道炎症（参考文献４０）や真菌Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（参考文献４１）によるヒト好中球のＰＧＥ２産生へのデクチン－１の関与が示唆されている。
　ＩＬ－２２ＢＰは、ＩＬ－２２の可溶性抑制性受容体である（参考文献４２、４３）。ＩＬ－２２ＢＰは腫瘍形成の制御に重要な役割を果たしており、このサイトカインが欠損すると大腸腫瘍の発生が促進される（参考文献２６）。本研究では、ＩＬ－２２ｂｐを欠損させると、デクチン－１欠損によるポリープ形成障害が完全に消失することを示し、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスの腫瘍形成抑制にＩＬ－２２ｂｐが大きく寄与していることを示唆した。ＩＬ－２２ｂｐは、ＭＤＳＣではなく腸管ＤＣでのみ産生され、また、ＭＤＳＣが合成酵素を主に分泌するＰＧＥ２によって、腫瘍浸潤細胞のＩＬ－２２ｂｐ発現が直接抑制されることもわかった。
　大腸腫瘍におけるデクチン－１の発現も主にＭＤＳＣｓに検出されたことから、デクチン－１欠損による腸管ＰＧＥ２の産生障害が、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスのＤＣｓにおけるＩｌ－２２ｂｐ発現のアップレギュレーションをもたらし、結果的に腫瘍形成を抑制していると考えられる。この考えを裏付けるように、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスにＰＧＥ２を投与すると、大腸のＩｌ－２２ｂｐの発現が抑制され、デクチン－１欠損に起因する腫瘍発生の障害が消失することが示された。
　腫瘍におけるＭＤＳＣの蓄積は、浸潤、血管新生、転移を促進し、抗腫瘍免疫を阻害することにより、癌の進行を促進すると考えられている（参考文献４４、４５）。本研究では、マウス腸管腫瘍において、ＭＤＳＣの分化を促進したり、抑制活性を高めたりすることが知られているＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１、ＴＮＦなどのサイトカイン（参考文献２３、２４）がデクチン－１シグナルの下流にあることを発見し、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスの大腸ポリープでＭＤＳＣ集団やＭＤＳＣ関連遺伝子の発現が減少した理由を説明した。さらに、ＭＤＳＣはＰＧＥ２合成酵素の主要な生産者であり、ＰＧＥ２は、マウスではＩｔｇａｍとＡｒｇ１を、ヒト腸管腫瘍浸潤細胞ではＩＴＧＡＭとＣＤ３３を誘導することでＭＤＳＣの分化を促進することを示した。これらの結果から、デクチン－１は、炎症性サイトカインやＰＧＥ２の産生の自動増幅ループにより、ＭＤＳＣの拡大・分化を促進し、腸管の腫瘍化を促進している可能性が考えられる。Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスでは、ＭＤＳＣが抗腫瘍反応を抑制することから、ＭＤＳＣの数が減少すると、リンパ球を介した抗腫瘍免疫が促進されると考えられる。
　腸内細菌叢や炎症環境などの腸内環境が大腸腫瘍の発生に影響することが示唆されている。本研究では、ＧＦマウスにＡＯＭ－ＤＳＳを投与した場合、明らかな大腸腫瘍が誘発されるまでに３６週間を要したのに対し、ＳＰＦマウスでは１６週間であった。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のような慢性的な腸の炎症は、腸の腫瘍形成の危険因子と考えられている（参考文献４６）が、いくつかの臨床研究ではＩＢＤと消化器系悪性腫瘍との間に弱い相関関係しか認められていない（参考文献４７）。我々は以前、デクチン－１シグナルが、好中球上の抗菌性ｃａｌｐｒｏｔｅｃｔｉｎを直接誘導したり、ＩＬ－１７Ｆを介して抗菌性ペプチドを誘導することで、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓやＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種などのＴｒｅｇ誘導菌の増殖を抑制することを明らかにした（参考文献１１－１３）。このように、デクチン－１シグナルを遮断すると、大腸Ｔｒｅｇ細胞が増加し、マウスの大腸炎を抑制することができる（参考文献１１－１３）。しかし、本研究では、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスをＷＴマウスと同居させたり、ＧＦ条件下でＣｌｅｃ７ａ－／－マウスを飼育したりしても、ポリープの発生数はＷＴマウスよりも少ないことから、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスのポリープ形成減少には常在菌は関与していないと考えられた。Ｃｌｅｃ７ａ－／－のＧＦマウスではＴｒｅｇｓが増加せず、リンパ球を持たないＲａｇ２－／－マウスでも腸管腫瘍の発生に対して十分な能力を発揮していることから、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスの腸内ではＴｒｅｇｓではなく、ＰＧＥ２の減少とＩＬ－２２ＢＰの増加がポリープ形成を抑制していると考えられる。
　我々は、デクチン－１の拮抗リガンドであるラミナリンをマウスに経口投与することで、ＡＯＭ－ＤＳＳによる大腸ポリープ症が抑制されることを示した。デクチン－１リガンドの供給源については、マウスの餌にはグルカンを豊富に含む酵母エキスが１０質量％以上含まれている。また、私たちの食生活でも、キノコ類、酵母、海藻類など、グルカンを含む食品が多く含まれている。最近の報告では、膵臓癌の組織に内因性のリガンドであるガレクチン－９が存在することが確認されている（参考文献１７）。本研究では、ガレクチン－９の発現量を調べたところ、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスではポリープ以外の組織に比べてポリープで発現が増加していたが、ＷＴマウスでは増加していなかった（図１２ｂ、１２ｃ）。以上、本研究では、デクチン－１がＭＤＳＣ－ＰＧＥ２を介したＩＬ－２２ｂｐの抑制を促進することで、腸管の腫瘍形成に重要な役割を果たしていることを明らかにした。このことは、デクチン－１がＣＲＣの予防と治療のための有望なターゲットであることを示唆している。
≪材料と方法≫
１．マウス
　Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊに９世代にわたって戻し交配して使用した。対照として、三協ラボサービスから購入した野生型（ＷＴ）のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用した。東京理科大学の阿部良先生から提供されたＡｐｃＭｉｎ／＋マウスをＣｌｅｃ７ａ－／－マウスと交配し、ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスを作製した。ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－Ｉｌ－２２ｂｐ－／－マウスは、ＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－の接合体を用いてＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１法により作製した。年齢・性別を一致させたＷＴマウスは、４週齢で離乳した後、Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスと分離又は同居させた。すべてのマウスは、東京理科大学生命医科学研究所及び中山大学医学部の実験動物施設の環境制御されたクリーンルーム内で、Ｘ線滅菌した普通食、酸性化した水道水（０．００２Ｎ　ＨＣｌ、ｐＨ２．５）、オートクレーブ滅菌した木製チップベッドを用いて、特定の病原体のない条件で飼育した。すべての動物実験は、東京理科大学の動物実験委員会及び中華人民共和国中山大学の実験動物管理利用委員会で承認されたプロトコールを用いて、機関の倫理規定及びガイドラインに従って実施された。
２．ヒトＣＲＣサンプル採取
　ＣＲＣ患者からヒトサンプルを採取する前に、大腸腫瘍摘出手術の前に各患者から書面によるインフォームドコンセントを得ており、すべての実験は中華人民共和国中山大学の第一附属病院の臨床試験委員会で承認されたプロトコールに基づき、機関の倫理規定とガイドラインに沿って実施された。組織浸潤細胞の精製又は組織・細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養は、各手術後に腫瘍標本又は／及び腫瘍周囲の正常組織を切り取り、氷冷したＰＢＳに移して使用するまで氷上に置いた。ｍＲＮＡレベルと相対的生存率の分析のために、７０人のＣＲＣ患者から４７の腫瘍標本と４３の非腫瘍標本を収集し、その中には２３組の同一人物の腫瘍と非腫瘍が含まれていた。性別、年齢、重症度など、患者の臨床情報の詳細は、表１～表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
３．細胞・組織のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養
　マウス／ヒト大腸腫瘍／非腫瘍組織（２×１０５）又はマウス／ヒト大腸腫瘍／非腫瘍組織片（３ｍｍ×３ｍｍカット）に浸潤した細胞を、デクチン－１リガンドであるカードラン、ＯＸＣＡ、ラミナリンを用いて、又はＰＧＥ２刺激を加えて、５％ＣＯ２下、３７℃で２０時間培養した９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に、０．２ｍｌのＲＰＭＩに１０％ＦＢＳと１％ストレプトマイシン＋ペニシリンを加えたものを使用した。培養後、細胞又は組織を回収し、後述する「定量的逆転写ＰＣＲ」の項で説明したｑＰＣＲ法により、腫瘍関連／抗腫瘍関連遺伝子のｍＲＮＡ発現を測定した。
４．大腸腫瘍の化学的誘導
　６～７週齢のマウスに、体重１ｇあたり１０μｇのＡＯＭ（富士フイルム和光純薬株式会社、大阪）を腹腔内投与した。投与から１週間後、これらのマウスの飲水に１質量％ＤＳＳ（３６～５０ｋＤａ；ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）を７日間投与した後、１４日間の通常水投与を１サイクルとした。ＤＳＳ／通常水処理を３サイクル行った後、これらのマウスをさらに２～６週間飼育してから安楽死させた。
５．自然発生的な小腸ポリープと大腸腫瘍の誘発
　ＡｐｃＭｉｎ／＋又はＡｐｃＭｉｎ／＋Ｃｌｅｃ７ａ－／－マウスを生後１９～２１週間ＳＰＦ状態で正常に飼育したところ、小腸のポリープが自然に発生した。大腸腫瘍の誘発には、６～７週齢の同じマウスに１質量％ＤＳＳを１週間飲用させた後、さらに４～５週間普通に飼育してから安楽死させた。
６．細胞の準備
　大腸の腫瘍／非腫瘍組織に浸潤した細胞は、以下の方法で分離した。組織を１ｍｍの厚さに切り、３ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で３７℃で４０分間振盪した。培養上清に浮遊していた上皮内リンパ球及び大腸上皮細胞を捨て、腸切片をＨＢＳＳで２回洗浄した後、１０％ＦＢＳ及び１％ストレプトマイシン＋ペニシリンを含むＲＰＭＩ、２００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼ（Ｃ２１３９；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び５Ｕ／ｍｌ　ＤＮａｓｅ　１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３７℃で１２０分間振とうした。培養後、サンプルを１０秒間ボルテックスし、滅菌したガーゼでろ過した後、単一細胞懸濁液を採取した。４５％／６６．６％不連続Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）グラジエントで２０分間、組織浸潤細胞をリンパ球にまで精製した実験もあった。
７．フローサイトメトリー
　マウスに対する抗体ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８α（５３－６．７）、ＴＣＲγδ（ＧＬ３）、ＣＤ４５（３０－Ｆ１１）、ＣＤ１９（６Ｄ５）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ（Ｍ５／１１４．１５．２）、ＣＤ１０３（２Ｅ７）、ＩｇＧ１（ＲＭＧ１－１）、ＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２）とＩＬ－１７（ＴＣ１１－１８Ｈ１０．１）は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入した。マウスのデクチン－１（２Ａ１１）に対する抗体は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から購入した。抗マウスＩＬ－２２ｂｐポリクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入した。７－ＡＡＤ（７－ａｍｉｎｏ－ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　Ｄ）ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入した。２．４Ｇ２（ａｎｔｉ－ＦＣγＲＩＩ／ＩＩＩ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍＡｂ）はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。すべての抗体は、１：２５０の希釈で使用した。マウス腸から分離した細胞をＦＡＣＳハンクス緩衝液（２％ＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＨＢＳＳ）で２回洗浄した後、２．４Ｇ２で処理してＦｃＲ結合をブロックした。その後、細胞をｍＡｂで２５～３０分間表面染色した。サイトカインＦＡＣＳのために、まず細胞を５０ｎｇ／ｍｌ　ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）＋５００ｎｇ／ｍｌ　ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）で、あるいは何も刺激せずに、１ｍＭ　ｍｏｎｅｎｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）で４時間刺激した。刺激後、細胞をＦＡＣＳハンクス緩衝液（２％ＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＨＢＳＳ）で２回洗浄し、次に２．４Ｇ２で処理してＦｃＲの結合をブロックした。その後、細胞をｍＡｂで３０分間表面染色した後、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２０分間固定し、透過させた。１×洗浄バッファーで洗浄した後、細胞を抗マウスＩＦＮ－γ　ｍＡｂ及びＩＬ－１７　ｍＡｂとさらに３０分間インキュベートした。解析には、Ｃａｎｔｏ　ＩＩ又はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とＦｌｏｗＪｏ　１０．０　ＦＡＣＳソフトウェアを使用した。
８．大腸からの上皮細胞、骨髄由来細胞、その他の免疫細胞の精製
　マウスの全腸又はポリープから採取した全単細胞を、ビオチン標識抗マウスＣＤ３２６（Ｇ８．８）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）で標識した後、抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ　Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で標識した。ＣＤ３２６＋上皮細胞は、ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてポジティブに精製した。陰性画分は、次の白血球精製のために抗マウス　ＣＤ４５マイクロビーズで染色したり、骨髄系由来細胞のために抗マウスＣＤ１１ｂ及びＣＤ１１ｃマイクロビーズで染色したり、Ｔ細胞のためにＴｈｙ１．２を、あるいはＢ細胞の精製のためにＣＤ１９を、ａｕｔｏＭＡＣＳのセレクションで染色した。
９．定量的逆転写ＰＣＲ
　トータルＲＮＡは、Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて抽出した。ＲＮＡは、オリゴｄＴプライマーの存在下で変性させた後、Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて逆転写した。ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ｑＰＣＲ　ｋｉｔ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）及びＣ１０００　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）を用いて、表４に記載したプライマーセットでｑＰＣＲを行い、各ｍＲＮＡの発現量の相対レベルを比較サイクル閾値（Ｃｔ値）法で算出し、Ｇａｐｄｈ　ｍＲＮＡの発現量で正規化した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
１０．ＰＧＥ２濃度測定
　マウス大腸のポリープ及び非ポリープ組織を採取し、５００μｌのタンパク質用溶解バッファー（ＲＩＰＡバッファー：５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）＋１００ｍＭ　ＮａＣｌ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）とプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を入れた２ｍｌチューブに入れた。組織をビーズとＭｉｃｒｏ　Ｓｍａｓｈｅｒ（ＭＳ－１００Ｒ、ＴＯＭＹ）を用いてホモジナイズした。遠心分離後、組織ホモジネートの上清を回収し、ＰＧＥ２濃度をＥＬＩＳＡ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　ＰＧＥ２（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）で測定した。ＰＧＥ２の最終濃度は、各個体の総タンパク質濃度で正規化した。
１１．ＲＮＡシークエンスと解析
　Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社のｔｏｔａｌ　ＲＮＡ－ｐｒｅｐ　ｋｉｔを用いて、大腸腫瘍又は非腫瘍組織からＲＮＡを単離した。ＲＮＡはＣｏｎｔｅｃｈ　ＳｍａｒｔＳｅｑ２　ｌｉｂｒａｒｙ　ｐｒｅｐ　ｋｉｔを用いて調製し、ＮｏｖａＳｅｑ６０００でシークエンスを行った。データを正規化し、ｕｓｅｇａｌａｘｙ．ｏｒｇを用いて遺伝子の差異発現を同定した。遺伝子の相対的な発現データを用いたパスウェイ及びプロセスのエンリッチメント解析は、ｍｅｔａｓｃａｐｅ．ｏｒｇを用いて行った。
１２．統計解析
　パラメトリックデータの差は、対になっていない両側のＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ　ｔｅｓｔで評価した。２つ以上の相対的な群を含む実験では、一元配置のＡＮＯＶＡに続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定又はＴｕｋｅｙの多重比較検定を行った。群間の生存率の統計的有意性は、ｌｏｇ－ｒａｎｋ検定で評価した。統計はＰＲＩＳＭ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で計算した。ＣＲＣ患者の研究では、カテゴリー変数はＦｉｓｈｅｒ検定で比較し、相関関係はＳｐｅａｒｍａｎの相関検定で分析した。統計解析は、Ｒソフトウェア（バージョン４．０．３、Ｒ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）を用いて行った。ｐ値＜０．０５の差を統計的に有意とした。
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　日本国特許出願第２０２１－２０４５７２号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。

Claims (16)

  1. 　デクチン－１阻害活性を有するβグルカンを含有し、デクチン－１阻害を介して腸管腫瘍を抑制する、腸管腫瘍抑制剤。
  2. 　前記βグルカンが、β－１，３結合を含むβグルカン又はβ－１，３結合の主鎖にβ－１，６結合分岐鎖を含むβグルカンである、請求項１に記載の腸管腫瘍抑制剤。
  3. 　前記βグルカンの分子量は０．２Ｋ～１００Ｋである、請求項１又は請求項２に記載の腸管腫瘍抑制剤。
  4. 　前記βグルカンがラミナリンである、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の腸管腫瘍抑制剤。
  5. 　デクチン－１阻害活性を有するβグルカンを含有する、ＰＧＥ２産生抑制剤。
  6. 　前記βグルカンが、β－１，３結合を含むβグルカン又はβ－１，３結合の主鎖にβ－１，６結合分岐鎖を含むβグルカンである、請求項５に記載のＰＧＥ２産生抑制剤。
  7. 　前記βグルカンの分子量は０．２Ｋ～１００Ｋである、請求項５又は請求項６に記載のＰＧＥ２産生抑制剤。
  8. 　前記βグルカンがラミナリンである、請求項５～請求項７のいずれか１項に記載のＰＧＥ２産生抑制剤。
  9. 　デクチン－１阻害活性を有するβグルカンを含有する、ＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤。
  10. 　前記βグルカンが、β－１，３結合を含むβグルカン又はβ－１，３結合の主鎖にβ－１，６結合分岐鎖を含むβグルカンである、請求項９に記載のＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤。
  11. 　前記βグルカンの分子量は０．２Ｋ～１００Ｋである、請求項９又は請求項１０に記載のＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤。
  12. 　前記βグルカンがラミナリンである、請求項９～請求項１１のいずれか１項に記載のＩＬ－２２ＢＰ産生促進剤。
  13. 　デクチン－１阻害剤を含有し、デクチン－１阻害を介して腸管腫瘍を抑制する、腸管腫瘍抑制剤。
  14. 　前記デクチン－１阻害剤がデクチン－１アンタゴニストである、請求項１３に記載の腸管腫瘍抑制剤。
  15. 　前記デクチン－１阻害剤が抗デクチン－１阻害抗体又はデクチン－１阻害低分子化合物である、請求項１３に記載の腸管腫瘍抑制剤。
  16. 　前記腸管腫瘍はＰＧＥ２の発現量上昇を伴う腸管腫瘍であるか、ＩＬ－２２ＢＰの発現量低下を伴う腸管腫瘍である、請求項１～請求項４、請求項１３、及び請求項１４のいずれか１項に記載の腸管腫瘍抑制剤。
     
PCT/JP2022/038130 2021-12-16 2022-10-12 腸管腫瘍抑制剤、ｐｇｅ２産生抑制剤、及びｉｌ－２２ｂｐ産生促進剤 WO2023112454A1 (ja)

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