KR20100000818A

KR20100000818A - 면역세포막의 덱틴-1에 결합활성을 가지는 것을 특징으로하는 면역증강 및 항암용 꽃송이버섯의 베타-1,3-글루칸

Info

Publication number: KR20100000818A
Application number: KR1020080060453A
Authority: KR
Inventors: 김하원; 박혁구
Original assignee: 서울시립대학교 산학협력단
Priority date: 2008-06-25
Filing date: 2008-06-25
Publication date: 2010-01-06

Abstract

본 발명은 꽃송이버섯에서 추출한, 면역세포막의 덱틴-1에 결합활성을 가지는 것을 특징으로 하는 면역증강 및 항암용 베타-1,3-글루칸에 관한 것이다. 보다 상세하게는 베타-1,3-글루칸이 경구 투여시 소장으로 흡수되어 면역세포막의 덱틴-1에 결합하고, NO, ROS, TNF, IL-6 의 생성을 촉진하여 면역증강의 작용 및 항암효과를 나타낼 수 있는 베타-1,3-글루칸에 관한 것이다.

본 발명에 기술된 베타-1,3-글루칸이 텍틴-1 막단백질에 결합하는 것은 FITC-Zymosan 전처리 방법에 의해 증명되고, 텍틴-1에 대한 siRNA를 대식세포에 주입하여 덱틴-1의 발현을 차단시킨 후에는 베타글루칸의 처리에 의하여 사이토카인을 분비하지 못함을 증명하여서 베타-1,3-글루칸이 덱틴-1에 결합 활성을 가지고 있음이 증명되었다. 또한, 실험동물에 베타-1,3-글루칸을 경구투여한 결과 혈액 중의 TNF와 IL-6의 발현이 증가하여 베타-1,3-글루칸이 소장으로 흡수됨을 입증하였으며, 대식세포에서 NO 와 ROS 분비를 증가시켜 대식세포를 활성화시켰고, 면역촉진성 사이토카인인 TNF와 IL-6의 분비를 촉진시키며, 면역억제성 사이토카인인 IL-10의 분비는 억제시키는 작용에서 면역증강 작용과 항암효과를 입증하였다.

꽃송이버섯, 베타글루칸, 덱틴-1, 사이토카인, TNF, IL-6, 대식세포, IL-10

Description

면역세포막의 덱틴-1에 결합활성을 가지는 것을 특징으로 하는 면역증강 및 항암용 꽃송이버섯의 베타-1,3-글루칸{The anticancer β-1,3-glucans of Sparassis crispa for immunity increase which have a combination activity in Dectin-1 of immunity cell membrane}

본 발명은 꽃송이버섯에서 추출한, 면역세포막의 덱틴-1에 결합활성을 가지는 것을 특징으로 하는 면역증강 및 항암용 베타-1,3-글루칸에 관한 것이다. 보다 상세하게는 베타-1,3-글루칸이 경구 투여시 소장으로 흡수되어 면역세포막의 덱틴-1에 결합하고, NO, ROS, TNF, IL-6 의 생성을 촉진하고, IL-10의 생성을 억제하여 면역증강의 작용 및 항암효과를 나타낼 수 있는 베타-1,3-글루칸에 관한 것이다.

꽃송이버섯은 한국·일본·중국·북아메리카·유럽·오스트레일리아 등에 분포하며 송이버섯과 같은 향이 난다. 꽃송이버섯은 덩어리 형태의 하얀 꽃모양으로 흰목이버섯과 비슷하게 생겼다. 자주 발견되는 버섯은 아니며, 암을 이긴다고 해 ‘신비의 버섯’이라고도 한다. 현대에 들어와 항암작용의 최대 열쇠를 쥐고 있는 성분으로 베타글루칸이 꼽힌다. 베타글루칸은 면역력을 높여주는 핵심 성분으로 신체의 면역체계를 바로잡아 암 및 고혈압·당뇨병 등을 다스리는 것으로 높이 평가받고 있다. 그런데 말린 꽃송이버섯 100ｇ에 약 43.6ｇ의 베타글루칸이 들어 있다. 이는 버섯 가운데 비교적 베타글루칸 성분이 많다고 알려진 신령버섯(아가리쿠스)보다도 3배 이상 높은 수치이다.

면역력을 높여서 암을 치료하려는 시도는 예부터 행해져왔다. 버섯에 함유돼 있는 베타글루칸 성분이 항암물질로서 세상에 등장한 것은 20세기 후반 무렵으로 많은 연구자들이 베타글루칸 연구에 몰두했다. 1975년 이를 집대성한 암 치료약이 나왔는데 그것은 구름버섯에서 추출한 클레스틴(PSK), 표고버섯에서 추출한 렌티난(LNT), 치마버섯에서 추출한 소니필란(SPG)이었다.

한편, 소득수준이 높아지고 고령화 사회로 접어들면서 건강유지 및 건강증진에 대한 국민들의 관심이 꾸준히 증가되고 있다. 이에 따라,생리기능이 있는 성분을 함유한 식품을 선호하는 추세가 증대되고 있는데 면역증강 및 항암효과가 있는 베타글루칸도 그 중 하나다.

베타글루칸은 암세포를 직접 공격하기보다는 비특이적 면역반응으로 대식세포, 자연살해세포, T 세포 등 면역세포의 면역기능을 활성화시켜 암세포의 증식을 억제한다.

효모 세포벽으로부터 추출한 베타글루칸은 1983년 미국 FDA로부터 안전한 식품으로 인정되어 FDA가 규정하는 일반안전기준(GRAS 규격 Title21, vol. 3)에 기재된 상태다. 이처럼 버섯류와 효모로부터 얻어진 베타글루칸의 효능과 안전성이 확인되어 여러 제품이 출시된 상황이지만 효모에서 얻어진 베타글루칸은 추출 및 분리·정제과정을 통해 얻어지는 제품의 순도가 높지 않으며, 버섯에서 얻어진 베타글루칸의 경우 존재하는 베타글루칸의 양이 적어 고가의 가격으로 판매되고 있다.

베타글루칸은 일반적으로 버섯류, 효모의 세포벽, 곡류에 존재하는 물질로 생물학적 반응 수정물질(BRMs, Biological Response Modifiers)로 알려져 있다. 미국의 Louis Pillemer 박사가 효모의 세포벽에서 비특이적인 면역반응을 일으키는 물질을 1941년 발견하여 Zymosan이라 명명하였고 1960년대 초 미국의 Nicholas Diluzio 박사는 효모 세포벽에서 추출한 고분자 다당을 면역증강작용이 있는 베타글루칸이라 명명하였다. 이러한 베타글루칸은 포도당만을 구성당으로 하는 포도당 중합체로서 포도당 단위체가 1, 3위치에 β-글리코시드 결합으로 연결된 기본골격을 이룬다. 특히, 포도당의 결합위치와 추출원에 따라 구조적인 차이와 함께 물리·화학적인 성질이 다르다. 효모나 버섯류, 곡류에서 분리된 베타글루칸은 β-1,4 결합 혹은 β-1,6 결합의 branch(측쇄)를 가지며 곡류나 버섯에서 발견되는 베타글루칸은 β-1,3의 주된 구조에 β-1,4 혹은 β-1, 6 측쇄결합에 의해 수용성을 띠기도 한다.

베타글루칸은 포도당의 결합형태에 따라 베타(1-3), (1-4), (1-6)의 구조를 가지며 이러한 구조적인 차이와 효능과의 비교는 아직까지 여러 보고가 있음에도 명확히 밝혀지지는 않았다. 그러나, 베타글루칸 연구의 세계적인 전문가인 일본 동경약과대의 야도마에(宿前理郞)교수의 연구결과에 따르면 베타(1-3)글루칸 구조를 가진 것만이 면역증강 및 각종 항암 효능을 발휘한다고 한다.

또 최근 태국 방콕에서 개최한 제20차 FAPA(아시아약학연맹) 학술발표에서도 베타-1,3-D 글루칸이 면역성세포, Macrophage를 조정해준다고 발표했다. 미생물 발효를 이용한 베타글루칸 생산은 세포 외로 베타글루칸을 생산하므로 버섯류와 효모에 비해 대량생산이 가능하며 고순도로 분리 정제할 수 있는데 FT-IR 및 13C NMR 구조분석 결과 베타-1,3-글루칸으로 존재함을 밝혔다.

미생물이 생산하는 베타글루칸의 면역활성 효능을 검증하기 위하여 한국생명공학연구원 공동으로 수행된 여러 연구결과 우선 인체 말초 단핵 세포 (pheriperal Blood Mononuclear cell; PBMCs)의 IFN에 미치는 영향에 대한 연구결과 IFN의 분비를 촉진하여 macrophage나 NK cell, cytotoxic T cell을 활성화하며 결과적으로 세포 내 세균 및 바이러스 감염에 억제능을 가지는 효능이 입증되었다.

이 밖에도 베타글루칸은 기능성 식품이라는 것이 보편화되면서 기능성 소재로 SARS(중증 급성호흡기 증후군)예방, 면역증진 효과 등 건강기능식품 소재로 활용이 가능하며, 이외에도 가공유, 발효유, 면류, 장류, 음료 등 일반 식품으로 적용범위가 확장되어 가고 있다.

그러나, 꽃송이 버섯의 베타글루칸이 어떤 기작으로 면역을 높이고, 항암효과를 나타내게 되는지에 대한 메커니즘은 아직 밝혀지지 아니한 상태였다.

본 발명은 꽃송이버섯에서 추출한, 면역세포막의 덱틴-1에 결합활성을 가지는 것을 특징으로 하는 면역증강 및 항암용 베타-1,3-글루칸에 관한 것이고, 보다 상세하게 베타-1,3-글루칸이 경구 투여시 소장으로 흡수되어 면역세포막의 덱틴-1에 결합하고, NO, ROS, TNF, IL-6 의 생성을 촉진하며, IL-10의 생성은 억제하여 면역증강의 작용 및 항암효과를 나타낼 수 있는 베타-1,3-글루칸을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 의하면, 본 발명은 꽃송이버섯에서 추출한, 면역세포막의 덱틴-1에 결합활성을 가지는 것을 특징으로 하는 면 역증강 및 항암용 베타-1,3-글루칸에 관한 것이고, 베타-1,3-글루칸이 경구 투여시 소장으로 흡수되어 면역세포막의 덱틴-1에 결합하고, NO, ROS, TNF, IL-6 의 생성을 촉진하며, IL-10의 생성은 억제하여 면역증강의 작용 및 항암효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

본란에서는 본 발명의 베타글루칸을 꽃송이버섯에서 추출하는 방법과 베타글루칸의 분석에 대해서만 설명하고, 나머지 덱틴-1과의 결합활성 등에 대해서는 이하 '발명의 실시를 위한 구체적인 내용' 란에서 구체적으로 설명하기로 한다. 이하, 베타글루칸을 꽃송이버섯에서 추출하는 방법에 대해 상술한다.

1. 균주배양 및 베타글루칸 추출

(1) 균주 및 자실체 형성

실험에 사용된 꽃송이버섯의 균주는 Sparassis crispa Wulf. ex Fr.으로써 단기간으로는 감자-포도당-한천 배지 (Potato dextrose agar medium, PDA medium)에 계대 배양하여 보관하였다. 자실체로 만들기 위해서는 톱밥배지를 이용하며 자실체로 배양하였다. 톱밥배지를 121℃에서 고압증기 멸균한 후에 꽃송이버섯균사체를 무균적으로 접종하여 15 - 20℃의 재배실에서 배양하여 자실체로 만들었다.

(2) 자실체로부터 베타글루칸 추출

꽃송이버섯의 자실체는 수분을 흡수하는 능력이 매우 커서 항암성 베타글루칸을 추출하기가 쉽지 않다. 추출용매로써 물을 많이 첨가하여 베타글루칸을 추출할 경우에는 나중에 수분을 제거하는 과정을 거쳐야 하므로 원가의 상승이 따르게 된다. 본 과제에서는 하나바이오텍에서 특허(등록번호: 10-0540600)로 보유하고 있는 나노나이프 저온 추출법으로 베타글루칸을 추출하였으며 이 방법으로 추출을 수행하면 대량생산시에 저비용으로 고효율로 베타글루칸을 확보할 수 있게 된다.

나노나이프추출법으로 꽃송이버섯의 베타글루칸을 추출하기 위하여 꽃송이버섯 자실체를 분말화시킨 후에 최소량의 증류수를 가하여 2시간 동안 분말을 팽창시켰다. 그 후 나노나이프로 직경 10 - 1000 μm의 불용성 텅스텐 카바이드를 20% 비율로 가하여 혼화한 후에 40분간 고속유화기로 유화시키면 나노 크기로 절단되면서 최대의 효율로 추출되었다. 나노사이즈로 추출되면 증류수를 추가하여 가한 후에 15 - 60℃의 온도에서 추출을 수행하여 에너지의 낭비도 없으며 저비용으로 추출할 수 있었다. 텅스텐 카바이드는 원심분리하여 회수한 후에 재활용하였다. 분리한 꽃송이버섯의 베타글루칸은 동결건조하여 성분 분석에 사용하였다.

2. 베타글루칸의 기기분석

(1) 총다당체와 베타(1,3)-글루칸의 함량 분석

본 실험에 사용된 베타글루칸의 다당체 함량과 베타(1,3)-글루칸의 함량을 측정하였다. 페놀-황산법으로 상황버섯(PLG), 녹각영지(GLA), 갓영지(GLC), 꽃송이버섯(SCG) 등의 10 mg/ml 베타글루칸 용액에 함유된 다당체를 정량한 결과 각각 2.59, 0.59, 1.03, 8.14 mg/ml의 다당체가 함유되어있었다 (도1-a). 그 중에서 꽃송이버섯과 상황버섯의 10 mg/ml 베타글루칸 중에 함유된 베타(1,3)-글루칸의 함량을 측정한 결과 각각 68 μg/ml과 13 μg/ml를 나타내었다 (도1-b).

(2) H-NMR에 의한 베타(1,3)-글루칸의 분석

베타글루칸에 대하여 H-NMR 분석을 실시하면 베타(1,3)글루칸과 베타(1,6)글루칸의 존재와 함량을 알 수 있다. Ohno 등[(Carbohydrarte Research 316: 161-172(1999))]의 보고에 의하면 H-NMR 분석에서 베타(1,3)글루칸은 4.7 - 4.9 ppm의 범위에서 피크가 나타나며, 베타(1,6)글루칸은 4.45 - 4.65 ppm 의 범위에서 피크가 나타나는 것으로 보고되었다. 꽃송이버섯에서 분리한 베타글루칸의 H-NMR 분석을 실시한 결과 4.78 ppm에서 베타(1,3)글루칸의 피크가 나타났으며, 4.55 ppm에서 베타(1,6)글루칸의 작은 피크가 검출되었다 (도 2). 4.78 ppm의 베타(1,3)글루칸의 피크와 4.55 ppm의 베타(1,6)글루칸 피크의 비율은 99:1이었다. 따라서 꽃송이버섯의 베타글루칸은 베타(1,3)글루칸으로 되어있음을 알 수 있었다.

(3) 꽃송이버섯 베타글루칸의 구성 당 분석

꽃송이버섯 베타글루칸에 2M trifluoroacetic acid를 가하여 100℃에서 4시간 동안 분해한 다음 구성 당의 함량을 HPLC (Bio-LC DX-600, Dionex, USA)로 분석하였다. 구성 당의 함량은 CarboPac PA1 (Dionex, USA) 칼럼으로 분석하였으며, mobile phase는 16mM NaOH 용액이었으며, 유속은 1 ml/min 이었다. 구성 당 중에서 glucose, galactose, mannose, arabinose, xylose의 분석은 CarboPac PA1 카트리지 (4.5 x 50 mm)가 연결된 CarboPac PA1 칼럼 (4.5 x 250 mm)으로 분석하였으며 (도3-a), glucosamine의 정량은 CarboPac PA1 카트리지 (2.5 x 50 mm)가 연결된 CarboPac PA1 칼럼 (2.0 x 250 mm)으로 분석하였다 (도3-b). 구성 당을 분석한 결과 6종의 당이 검출되었으며, 구성 당의 종류와 함량은 glucose (295.6 mole), galactose(11.3 mole), mannose(4.0 mole), arabinose(0.1 mole), xylose(0.1 mole), glucosamine(2.5 mole)의 6종이었다 (표 1). 6종의 구성 당 중 포도당의 비율은 94.2%이었다. 이상의 결과로부터 꽃송이버섯의 베타글루칸은 HPLC 분석에서 glucose가 주성분이므로 글루칸임이 증명되었으며, H-NMR에 의해 베타(1,3)-글루칸임이 증명되었다. HPLC-GPC 분석에 의하면 꽃송이버섯의 베타글루칸의 평균 분자량은 510 kDa으로 나타났다. 따라서 이 글루칸을 꽃송이버섯(Sparassis crispa)의 학명을 본따 스파란(Sparan)이라 명명한다.

[표 1]

HPLC 에 의한 꽃송이버섯 베타글루칸의 구성당 분석

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구성당 함량 (mole)

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Glucose 295.6

Galactose 11.3

Mannose 4.1

Glucosamine 2.5

Arabinose 0.1

Xylose 0.1

Fucose 0

Rhamnose 0

Galactosamine 0

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상기와 이하의 과제 해결 수단 및 발명의 실시를 위한 구체적인 내용에 따른 본 발명의 꽃송이 버섯에서 분리된 베타-1,3-글루칸은 면역세포막의 덱틴-1에 결합활성을 가져 면역작용과 항암효과를 촉진시켜 주는 효과가 있다.

특히, 꽃송이 버섯에서 분리된 베타-1,3-글루칸은 NO, ROS, TNF, IL-6의 생성을 촉진하고, IL-10의 생성을 억제함으로써 면역을 활성화하고 항암효과를 촉진 시키는 효과가 있다.

이하, 본 발명에 따른 덱틴-1에 결합활성을 가지는 베타-1,3-글루칸을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다.

1. 베타글루칸의 Dectin -1 결합 증명

(1) FITC-Zymosan 전처리에 의한 결합증명

꽃송이 버섯의 베타글루칸이 대식세포의 Dectin-1에 결합하는지 증명하기 위하여 대식세포를 12시간 동안 12-well plate에서 배양하여 trypsin으로 떼어내어 단세포로 만든 다음에 꽃송이 버섯의 베타글루칸을 10 μg/ml로 처리하여 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척한 후에 다시 FITC-zymosan을 가하여 4℃에서 30분 동안 반응시켜 세척 후 FACS 또는 luminometer로 분석하였다. FACS로 형광의 세기를 측정하였을 때 스파란을 전처리하고 FITC-zymosan을 반응시키면 형광의 세기가 100%에서 77%로 감소되었다(도 4-a). 이것은 전처리한 꽃송이 버섯의 베타글루칸이 이미 Dectin-1에 결합하였기 때문에 이후에 처리한 FITC-zymosan의 결합이 감소된 것이다. FITC-zymosan은 Dectin-1에 결합한다는 사실은 이미 잘 알려져 있다. 따라서 베타글루칸은 Dectin-1에 잘 결합한다는 것을 알 수 있는 것이다. 이를 더욱 뒷받침하기 위하여 스파란을 전처리하고 FITC-zymosan을 반응시킨 후에 형광의 세기를 luminometer로 측정하였을 때도 대조 군의 16,743의 형광이 14,325로 감소되었다 (도 4-b). 따라서 베타글루칸이 Dectin-1에 결합함이 증명되는 것이다.

(2) Dectin-1 siRNA 주입에 의한 Dectin-1 발현 불활성화 증명

대식세포인 RAW 264.7 세포주에 Dectin-1 siRNA를 주입하여 Dectin-1의 발현을 차단한 후에 스파란을 처리하여 TNF의 발현을 분석하였다. 대조군에는 녹색형광을 띄는 단백질인 GFP를 발현하는 벡터를 주입하였다. Magnetofection시킨 세포에 LPS를 처리하면 대조군인 GFP주입 세포에서는 47,350 pg/ml의 TNF를 발현한 반면, Dectin-1 siRNA를 주입한 세포에서는 21,367 pg/ml의 TNF가 분비되어 크게 감소되었다. 스파란을 1 μg/ml을 주입하였을 때도 27,750 pg/ml에서 12,033 pg/ml로 감소되었으며, 스파란을 10 μg/ml을 주입하였을 때도 유사하게 감소되었다. LPS의 존재하에서 스파란을 1 μg/ml과 10 μg/ml을 처리하였을 대도 유사하게 감소되었다 (도 5). 따라서 주입시킨 siRNA에 의하여 Dectin-1의 발현이 감소되어 TNF의 발현이 감소된 것이다. 이것은 스파란이 Dectin-1에 결합하여 면역활성작용을 나타낸다는 것을 의미한다.

2. 일산화질소( NO )의 생성

(1) RT-PCR에 의한 iNOS의 발현유도

꽃송이버섯에서 분리한 베타-1,3-글루칸을 마우스의 대식세포주인 RAW264.7 세포에 1 μg/ml과 10 μg/ml의 농도로 처리하였다. 또한 세포주에 LPS 100 ng/ml의 농도로 처리한 상태에서 베타-글루칸을 1 μg/ml과 10 μg/ml의 농도로도 처리하였다. 시약을 처리한 후 12시간 후에 총 RNA를 분리하여 역전사효소법으로 각각의 사이토카인에 해당하는 primer를 가하여 유전자를 증폭하여 베타-글루칸처리에 의하여 발현이 변화된 사이토카인의 mRNA를 전기영동으로 정량하였다.

우선 TNF-α를 보면 LPS 처리에 의하여 증가되었다. 꽃송이버섯 베타-글루칸 1 μg/ml과 10 μg/ml 처리에 의하여 농도 의존적으로 mRNA의 발현이 증가되었다. 이러한 현상은 LPS 존재하에서도 유사한 결과를 나타내었다. 이러한 사실은 꽃송이버섯의 베타-글루칸을 경구로 복용하였을 때 소장에서 대장균과 함께 베타-글루칸이 M 세포로 흡수되어 Payer's patch로 흡수되어 대기중인 대식세포와 만났을 때 대식세포가 TNF-α를 분비할 수 있음을 의미한다. 인체에는 베타-글루칸을 분해하는 효소가 없기 때문에 위장이나 소장에서 분해되지 않고 흡수될 수 있는 것이다. 소장의 M 세포에서는 베타-글루칸과 같은 분자량이 큰 물질을 분해시키지 않고 통과시킬 수 있다. 이러한 연구결과는 꽃송이버섯의 베타-글루칸을 경구복용하였을 때 체내에서는 TNF-α의 발현이 증가되어 암세포를 살상시킬 뿐만 아니라 다른 연역세포도 활성화시켜 면역을 증강시켜 인체의 방호작용을 증강시킬 수 있는 것이다. 본 실험에서는 면역을 증강시키는 다른 사이토카인으로 IL-1β, IL-6, IL-10의 mRNA와 일산화질소(NO) 합성효소인 iNOS의 mRNA 발현을 역전사효소법으로 분석하였다.

꽃송이버섯의 베타-글루칸을 대식세포에 처리한 후에 12시간 후에 IL-1β의 mRNA 발현을 보면 베타-글루칸 1 μg/ml과 10 μg/ml의 농도에서 농도의존적으로 IL-1β의 mRNA 발현이 증가되었다. LPS 존재하에서는 크게 증가하지 않았다. IL-6의 발현을 보면, 베타-글루칸 1 μg/ml과 10 μg/ml의 농도에서 농도의존적으로 IL-6의 mRNA 발현이 증가되었다. LPS의 존재하에서는 그 효과가 명확하게 농도의존적으로 증가되었다. 더욱 흥미로운 사실은 IL-10의 발현에 있었다. IL-10은 염증을 억제시키는 사이토카인으로써 면역억제작용을 나타낸다. 꽃송이버섯의 베타-글루칸을 1 μg/ml과 10 μg/ml의 농도로 처리하였을 때 IL-10의 발현이 억제되었다. 따라서 꽃송이버섯의 베타-글루칸에 의해서는 면역억제성 사이토카인발현은 억제된다는 것을 알 수 있었다. 다음으로 iNOS의 mRNA 발현을 보면 베타-글루칸 1 μg/ml과 10 μg/ml의 농도에서 농도의존적으로 iNOS의 mRNA 발현이 증가되었다 (도 6). iNOS가 증가되면 NO의 발현이 증가되었음을 뜻한다. NO가 증가되면 대식세포가 활성화되었음을 의미하므로 꽃송이버섯의 베타-글루칸은 대식세포를 활성화시켰음을 의미한다.

(2) 그리스시약에 의한 NO 정량

6 well 플레이트에 RAW 264.7 대식세포를 배양하여 LPS 또는 꽃송이버섯의 베타-글루칸을 농도별로 처리하여 12시간 동안 배양 후 배양액 100 μl와 그리스(Griess) 시약 100 μl를 섞은 후 ELISA 측정기로 540 nm에서 측정하였다. 대식세포는 자극을 받아 활성화되면 일산화질소(NO)를 분비한다. 분비된 일산 화질소는 세포 내에서 포식한 병원체 또는 암세포를 사멸시키는데 사용한다. 세포 내에서 분비된 NO는 배지 중으로도 확산되며, 이것을 그리스 시약으로 측정할 수 있다. 마우스의 대식세포주인 RAW264.7세포주에 꽃송이버섯에서 추출한 베타-글루칸을 단독 또는 LPS 존재하에 베타-글루칸을 처리하여 배지 중으로 분비되는 NO의 분비 정도를 그리스시약으로 측정하였다.

RAW264.6 세포주에 아무것도 처리하지 않은 대조군에서는 1.48 ± 0.27 μM의 NO를 분비하였지만 꽃송이버섯의 베타-글루칸을 1 μg/ml과 10 μg/ml의 농도로 단독 처리하였을 때는 각각 3.74 ± 0.23 μM과 7.92 ± 0.58 μM의 NO를 분비하였다. 이것은 대조군에 비하여 2.5배와 5.4배 증가한 것이다. 꽃송이버섯의 베타-글루칸을 경구복용하였을 경우에는 소장에서 LPS와 함께 흡수되어 대식세포를 자극할 수 있으므로 100 ng/ml의 LPS 존재하에 꽃송이버섯 베타-글루칸을 1 μg/ml과 10 μg/ml을 가하였을 경우에 NO의 분비가 각각 9.03 ± 0.58 μM과 9.43 ± 0.78 μM이었다. 이러한 수치는 LPS 단독으로 처리하였을 때 분비되는 9.03 ± 0.62 μM의 NO 농도와 비슷한 수치이다 (도 7). 따라서 꽃송이버섯의 베타-글루칸은 1 μg/ml 또는 10 μg/ml의 단독처리에서 대식세포를 자극하여 NO의 생성을 유의성있게 증가시켰지만 LPS와 상승작용은 나타내지 못하였다.

상기의 실험결과로부터 꽃송이버섯에서 추출한 베타-글루칸을 마우스의 대식세포에 처리하였을 때 면역을 촉진시키는 사이토카인인 TNF-α와 IL-6의 단백 질 발현은 크게 증가하였으며, 발열작용을 일으키는 사이토카인인 IL-1의 발현에는 거의 영향을 미치지 않아 부작용을 나타내지 않았다. 또한 꽃송이버섯의 베타-글루칸은 면역억제성 사이토카인인 IL-10의 발현은 오히려 감소시키는 경향을 나타내었다. 따라서 꽃송이버섯에서 추출한 베타-글루칸은 체내에서 면역을 증강시킴으로써 병원체를 효율적으로 막아낼 뿐만 아니라 암세포도 제거할 수 있는 능력을 부여하는 기능을 가지고 있다고 사료된다.

3. 반응활성산소류(ROS)의 생성

(1) LPS와 베타-글루칸의 ROS 생성

스파란을 RAW264.7 세포에 처리하여 생산되는 ROS의 양을 FACS로 분석하였다. 대조군의 형광세기는 46이었으며, 양성대조군으로써 PMA를 처리하였을 때는 형광세기가 120으로 크게 증가하였다. 또한 LPS를 처리하였을 때 형광의 세기는 168이었다. 스파란 (10 μg/ml)을 처리하였을 때는 놀랍게도 형광의 세기가 160이었다 (도 8). 비교적 낮은 농도인 10 μg/m에서 LPS와 거의 동등한 효능을 나타내어 스파란이 대식세포에서 ROS를 강력하게 분비하여 대식세포를 활성화시킴을 확인하였다.

(2) NO 억제제인 L-NAME과 베타-글루칸의 ROS 생성

총 ROS의 양에는 반응질소산화물(RNS, Reactive nitrogen species)도 함유되어있으므로 NO 생성 억제제인 N-(G)-nitro-L- arginine methyl ester (L-NAME, 100 μM) 을 6시간 처리하여 NO의 생성을 완전히 차단한 상태에서 스파란 (Cryspan, 10 μg/ml)을 가하여 순수한 ROS의 양을 FACS로 측정하였다. RAW세포에 L-NAME을 처리하였을 때는 형광의 세기가 16으로써 대조군의 46보다 낮게 나타났다. L-NAME 존재하에 PMA와 LPS를 처리하였을 때는 순수한 ROS의 양이 각각 68과 96이었다. L-NAME 존재하에 스파란 (10 μg/ml)을 처리하였을 때는 105이었다. 이 수치는 L-NAME이 없을 때의 수치인 160보다는 낮은 수치였다. L-NAME 존재하에 LPS와 스파란 (10 μg/ml)을 처리하였을 때는 90으로 저하되었다 (도 9).

4. 실험동물에서의 TNF 와 IL -6 분비 촉진

경구로 투여한 스파란이 면역세포를 활성화시키는지 증명하기 위하여 ICR 마우스에 Sarcoma-180 세포를 마우스당 200만 세포를 복강에 주입하여 면역을 저하시켰다. 다음날부터 스파란을 1, 10, 100 mg/kg의 농도로 1일 1회 10일간 경구로 투여한 후에 암접종한지 14일 후에 심장으로부터 혈액을 채취하여 혈중의 TNF와 IL-6의 농도를 ELISA로 측정하였다. 대조군의 혈액 중의 TNF의 농도는 108 pg/ml이었으며, 스파란을 1, 10, 100 mg/kg의 농도로 10일간 경구투여한 마우스의 혈중 TNF 농도는 208, 250, 400 pg/ml이었다 (도 10). 또한 IL-6의 혈중 농도를 측정한 결과는 스파란 1, 10, 100 mg/kg의 경구투여에 의하여 34, 316, 299 pg/ml이었다 (도 11). 따라서 경구투여한 베타글루칸이 소장으로 흡수되어 소장막아래에 있는 면역세포를 자극한 것이다. 이러한 연구결과는 분자량이 큰 베타글루칸일지라도 소장막의 M 세포 또는 소장막 밖으로 뻗어나온 대식세 포에 의하여 면역을 자극시켜 혈중의 TNF의 농도가 증가한 것으로 생각된다.

5. 대식세포에서 사이토카인의 분비 촉진

상기의 연구에서는 대식세포에 꽃송이버섯의 베타-글루칸 처리에 의한 사이토카인의 mRNA 발현을 분석하였다. 이러한 연구결과를 더욱 뒷받침하기 위하여 이러한 사이토카인을 단백질발현 수준에서 확인하였다. 즉, TNF-α, IL-6, IL-10의 발현을 단백질수준에서 분석하기 위하여 해당하는 각각의 항체를 사용하여 샌드위치 엘라이자법(Sandwich ELISA)을 사용하여 분석하였다.

6 well plate에 RAW 264.7 대식세포를 배양하여 LPS, 꽃송이버섯 베타-글루칸을 농도별로 처리하여 12시간 동안 배양 후 배양액을 1.5 ml 튜브에 넣은 후 1,000 rpm 에서 3분간 원심분리하였다. 96-well 플레이트 바닥에 TNF-α, IL-6, IL-10 등의 1차 항체를 부착시키기 위하여 1차 항체를 부착용 완충액에 1:250으로 희석하여 96-well 플레이트의 각 well에 100 ㎕씩 넣고 플레이트를 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 12시간 후에 부착용 완충액을 제거하고 각 well당 300 ㎕의 세척 완충액으로 3 회 세척한 후, well당 200 ㎕의 희석용액으로 플레이트를 blocking 하고, 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 희석용액을 제거하고 각 well당 300 ㎕의 세척완충액으로 3 회 세척해 주었다. 각 well에 준비된 표준시료와 베타-글루칸을 100 ㎕씩 넣어 주고 실온에서 2 시간 동안 배양하고, 2 시간 후 상등액을 제거하고 각 well당 300 ㎕의 세척완충액으로 5 회 세척 하였다. 검출시약 (검출용 2차항체 + SAv-HRP 시약 모두 1:250으로 희석된 것)을 각 well 당 100 ㎕씩 넣어 주고 플레이트를 밀봉한 후 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 1시간 후 검출시약을 제거하고 각 well당 300 ㎕의 세척완충액으로 7 회 세척한 후, 기질용액 (TMB 기질용액 세트)을 1:1로 섞어주고 각 well당 100 ㎕씩 넣고 플레이트가 빛에 노출되지 않게 하여 실온에서 30분간 배양하였다. 30 분후 각 well에 50 ㎕의 반응정지용액 (2 N H2SO4 (or 1 M H3PO4))을 넣어 주고, 450 ㎚에서 측정하였다.

(1) 꽃송이버섯 베타-글루칸에 의한 TNF-α의 단백질 발현

대식세포주인 RAW264.7 세포주에 꽃송이버섯에서 추출한 베타-글루칸을 단독 또는 LPS 존재하에 베타-글루칸을 처리하여 배지 중으로 분비되는 사이토카인중 TNF-α의 분비정도를 단백질수준에서 ELISA방법으로 측정하였다. 발현되는 mRNA를 측정할 경우에는 mRNA 모두가 단백질로 만들어지는 것이 아니기 때문에 단백질을 측정하는 것은 매우 의미깊은 것이다.

RAW264.6세포주에 아무것도 처리하지 않은 대조군에서는 292 ± 65 pg/ml의 TNF-α를 분비하였지만 꽃송이버섯의 베타-글루칸을 1μg/ml과 10 μg/ml의 농도로 단독 처리하였을 때는 각각 33,167 ± 18,175 pg/ml과 75,500 ± 19,494 pg/ml의 TNF-α를 분비하였다. 이것은 대조군에 비하여 114배와 259배 증가한 것이다. 꽃송이버섯의 베타-글루칸을 경구복용하였을 경우에는 소장에서 LPS와 함께 흡수되어 대식세포를 자극할 수 있으므로 100 ng/ml의 LPS 존재하에 꽃송이버섯 베타-글루칸을 1 μg/ml과 10 μg/ml을 가하였을 경우에 TNF-α의 분비가 각각 123,933 ± 16,986 pg/ml과 130,167 ± 5,133 pg/ml로 증가하였다. 이러한 수치는 LPS 단독으로 처리하였을 때 분비되는 118,733 ± 28,593 pg/ml의 TNF-α 농도보다 높은 수치이다 (도 12). 따라서 꽃송이버섯의 베타-글루칸은 극미량의 농도인 1 μg/ml 또는 10 μg/ml에서도 대식세포를 충분히 자극하여 면역을 증강시킬 수 있었다.

(2) 꽃송이버섯 베타-글루칸에 의한 IL-6의 단백질 발현

IL-6는 활성화된 대식세포 또는 T 세포에서 분비되는 사이토카인의 일종으로써 체내로 침입하는 병원체 또는 체내에서 발생한 암세포 등에 방어하는 작용을 나타낸다. 대식세포주인 RAW264.7 세포주에 꽃송이버섯에서 추출한 베타-글루칸을 단독 또는 LPS 존재하에 베타-글루칸을 처리하여 배지 중으로 분비되는 사이토카인중 IL-6의 분비 정도를 단백질수준에서 ELISA방법으로 측정하였다.

RAW264.6세포주에 아무것도 처리하지 않은 대조군에서는 4 ± 3 pg/ml의 IL-6를 분비하였지만 꽃송이버섯의 베타-글루칸을 1 μg/ml과 10 μg/ml의 농도로 단독 처리하였을 때는 각각 307 ± 239 pg/ml과 1,681 ± 391 pg/ml의 IL-6를 분비하였다. 이것은 대조군에 비하여 77배와 420배 증가한 것이다. 꽃송이버섯의 베타-글루칸을 경구복용하였을 경우에는 소장에서 LPS와 함께 흡수되어 대 식세포를 자극할 수 있으므로 100 ng/ml의 LPS 존재하에 꽃송이버섯 베타-글루칸을 1 μg/ml과 10 μg/ml을 가하였을 경우에 IL-6의 분비가 각각 5,434 ± 2,252 pg/ml과 9,604 ± 803 pg/ml로 증가하였다. 이러한 수치는 LPS 단독으로 처리하였을 때 분비되는 5,050 ± 499 pg/ml의 IL-6 농도보다 높은 수치이다 (도 13). 따라서 꽃송이버섯의 베타-글루칸은 극미량의 농도인 1 μg/ml 또는 10 μg/ml에서도 대식세포를 충분히 자극하여 면역을 증강시킬 수 있었다.

(3) 꽃송이버섯 베타-글루칸에 의한 IL-10의 단백질 발현

단핵세포가 활성화되면 대식세포로 변한다. IL-10은 면역억제능을 가진 사이토카인으로써 단핵세포에서 주로 분비되어 면역을 억제한다. IL-10은 다른 사이토카인의 분비를 억제하며 특히 장관막에서 면역을 억제하는 성질을 가지고 있다. 대식세포주인 RAW264.7 세포주에 꽃송이버섯에서 추출한 베타-글루칸을 단독 또는 LPS 존재하에 베타-글루칸을 처리하여 배지중으로 분비되는 사이토카인중 IL-10의 분비정도를 단백질수준에서 ELISA방법으로 측정하였다.

RAW264.6 세포주에 아무것도 처리하지 않은 대조군에서는 199 ± 40 pg/ml의 IL-10을 분비하였지만 꽃송이버섯의 베타-글루칸을 1 μg/ml과 10 μg/ml의 농도로 단독 처리하였을 때는 각각 353 ± 354 pg/ml과 147 ± 1 pg/ml의 IL-10을 분비하였다. IL-10은 대조군에 비하여 오히려 감소하는 경향을 나타내었다. 꽃송이버섯의 베타-글루칸을 경구복용하였을 경우에는 소장에서 LPS 와 함께 흡수되어 대식세포를 억제할 수 있으므로 100 ng/ml의 LPS 존재하에 꽃송이버섯 베타-글루칸을 1 μg/ml과 10 μg/ml을 가하였을 경우에 IL-10의 분비가 각각 198 ± 141 pg/ml과 172 ± 64 pg/ml로 감소되었다. 이러한 수치는 LPS 단독으로 처리하였을 때 분비되는 676 ± 386 pg/ml의 IL-10 농도보다 오히려 낮은 수치이다 (도 14). 따라서 꽃송이버섯의 베타-글루칸은 10 μg/ml이상의 농도에서는 대식세포를 억제하는 사이토카인인 IL-10을 감소시켰다. 이로 인하여 상대적으로 면역기능은 강화될 수 있다.

상기에서 설명한 바와 같이 본 발명은 상기의 실험을 통해 덱틴-1에 결합활성이 있고, 그로 인해 면역작용과 항암효과가 입증되었지만 본 발명은 상기의 실험에 의해서만 반드시 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다.

도 1은 실험에 사용된 베타글루칸의 총다당류(a)와 BG-star법으로 정량한 베타(1,3)글루칸의 정량(b)의 측정결과이다. PLG은 Phellinus linteus , GLA는 Ganoderma lucidum (antler), GLC는 Ganoderma lucidum (cap), SCG는 Sparassis crispa이다.

도 2는 꽃송이버섯에서 분리한 베타글루칸의 H-NMR 분석결과이다.

도 3은 HPLC에 의한 꽃송이버섯의 베타글루칸의 구성 당 성분 분석결과이다.

도 4는 FITC-Zymosan 전처리에 의한 스파란의 Dectin-1 결합의 분석결과로, (a)는 FACS 분석결과를 그래프로 나타낸 것이고, (b)는 형광의 세기를 luminometer로 측정한 결과의 그래프이다.

도 5는 Dectin-1 siRNA를 Magnetofection 시킨 후에 스파란에 의한 TNF의 발현 감소를 나타내는 결과이다. (■: pBI-EGFP (5121 bp)를 magnetofection 시킨 것; □: Dectin-1 siRNA를 magnetofection 시킨 것)

도 6은 RAW264.7 대식세포에서 꽃송이버섯의 베타-글루칸을 12시간 동안 처 리한 후 발현된 사이토카인의 mRNA 발현량을 역전사법으로 증폭하여 전기영동한 결과이다. LPS (100 ng/ml), β1 (1 ug/ml), β10(10 ug/ml). 약자는 다음과 같다. [TNF-α(Tumor necrosis factor α, 암괴사인자), IL (Interleukin, 인터루킨), iNOS (induced nitric oxide synthase, 유도된 일산화질소합성유전자), GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase).]

도 7은 RAW264.7 대식세포에서 꽃송이버섯의 베타-글루칸을 12시간동안 처리한 후 발현된 NO를 분석한 결과이다. LPS (100 ng/ml), β1 (1 ug/ml), β10(10 ug/ml). 수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. **p < 0.005

도 8은 스파란에 의한 대식세포에서 ROS의 생산을 나타내는 결과이다.

도 9는 NOS 생성을 억제한 상황에서 순수한 ROS의 양 측정결과이다.

도 10은 스파란 (BGS)을 경구 투여한 마우스에서 혈액중의 TNF농도 측정결과이다.

도 11은 스파란을 경구 투여한 마우스에서 혈액 중의 IL-6농도 측정한 결과이다.

도 12는 RAW264.7 대식세포에서 꽃송이버섯의 베타글루칸을 12시간 동안 처리한 후 발현된 TNF-α 단백질을 ELISA법으로 분석한 결과이다. LPS (100 ng/ml), β1 (1 ug/ml), β10(10 ug/ml). 수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. * p < 0.05, **p < 0.005

도 13은 RAW264.7 대식세포에서 꽃송이버섯의 베타-글루칸을 12시간 동안 처리한 후 발현된 IL-6 단백질을 ELISA법으로 분석한 결과이다. LPS (100 ng/ml), β1 (1 ug/ml), β10(10 ug/ml). 수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. **p < 0.005

도 14는 RAW264.7 대식세포에서 꽃송이버섯의 베타-글루칸을 12시간 동안 처리한 후 발현된 IL-10 단백질을 ELISA법으로 분석한 결과이다. LPS (100 ng/ml), β1 (1 ug/ml), β10(10 ug/ml). 수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였다.

Claims

면역세포막의 덱틴-1에 결합활성을 가지는 것을 특징으로 하는 면역증강 및 항암용 베타-1,3-글루칸.
제1항에 있어서,

상기 베타-1,3-글루칸은 꽃송이버섯으로부터 추출된 것을 특징으로 하는 면역증강 및 항암용 베타-1,3-글루칸.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 베타-1,3-글루칸은 경구투여시 소장으로 흡수되는 것을 특징으로 하는 면역증강 및 항암용 베타-1,3-글루칸.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 베타-1,3-글루칸은 NO의 생성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 면역증강 및 항암용 베타-1,3-글루칸.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 베타-1,3-글루칸은 ROS(반응활성산소류)의 생성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 면역증강 및 항암용 베타-1,3-글루칸.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 베타-1,3-글루칸은 대식세포의 TNF-알파 분비를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 면역증강 및 항암용 베타-1,3-글루칸.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 베타-1,3-글루칸은 대식세포의 IL-6 분비를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 면역증강 및 항암용 베타-1,3-글루칸.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 베타-1,3-글루칸은 대식세포의 IL-10 분비를 억제하는 것을 특징으로 하는 면역증강 및 항암용 베타-1,3-글루칸.