CN117205326A - β-葡聚糖在制备治疗肠道疾病的口服给药递送系统中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及葡聚糖技术领域，公开了β‑葡聚糖在制备治疗肠道疾病的口服给药递送系统中的应用，其中，所述β‑葡聚糖来源于黑木耳，其化学结构式为主链上每三个β‑(1,3)‑葡萄糖主链带有两个β‑(1,6)‑葡萄糖残基的侧链。本发明提供了该黑木耳β‑葡聚糖在制备治疗肠道疾病的口服给药递送系统中的新用途，所述黑木耳β‑葡聚糖能够抵抗胃酸以及消化酶的降解效果，并靶向到达结肠，该黑木耳β‑葡聚糖可以作为药物载体，实现药物的结肠定点靶向释药，也可以作为药物本身起到治疗肠道疾病的作用。

Description

β-葡聚糖在制备治疗肠道疾病的口服给药递送系统中的应用

技术领域

本发明涉及葡聚糖技术领域，具体涉及一种β-葡聚糖在制备治疗肠道疾病的口服给药递送系统中的应用。

背景技术

目前，治疗肠道疾病(ID)，例如炎性肠病(IBD)和结肠癌存在若干关键挑战，主要涉及结肠定位困难以及无效递送。口服给药治疗肠道疾病被认为是一种无创和安全的方法，有助于更大的患者依从性。尽管有许多优点，但由于胃肠道施加的屏障，口服给药仍有一些限制。因此，如何抵抗消化道内广泛的pH以及各种消化酶的降解从而实现药物的结肠有效递送是长期以来未解决的难题。

β-葡聚糖是由来自真菌、酵母、某些细菌和植物的细胞壁的葡萄糖构成的长链多糖。这些聚合物的主链包含线性β-D-(1,3)葡糖基单元，在O-6处被β-D-(1,6)葡糖基单元连接的侧链取代，其分子量大小和分布可以变化。β-葡聚糖具有极大的作为治疗剂和佐剂的潜力，但是天然β-葡聚糖难以达到靶向结肠的目的，往往需要进行结构修饰，引入有机试剂，从而限制了其在治疗肠道疾病中的应用。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的口服药物难以有效递送到结肠的问题，提供一种β-葡聚糖在制备治疗肠道疾病的口服给药递送系统中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供一种β-葡聚糖在制备治疗肠道疾病的口服给药递送系统中的应用，其中，所述β-葡聚糖来源于黑木耳，其化学结构式为主链上每三个β-(1,3)-葡萄糖主链带有两个β-(1,6)-葡萄糖残基的侧链。

优选地，所述β-葡聚糖的分子量为1.98×10⁶～2.40×10⁶g/mol。

优选地，所述口服给药递送系统包括β-葡聚糖纳米管和阿霉素，其中，所述阿霉素包封于所述β-葡聚糖纳米管的疏水空腔中。

优选地，所述口服给药递送系统按照以下工序制备：

(1)将所述β-葡聚糖和阿霉素与二甲基亚砜混合，得到混合液，其中，所述混合液中，所述β-葡聚糖的浓度为0.1～2mg/mL，所述阿霉素的浓度为0.1～2mg/mL；

(2)将所述混合液用水进行透析，然后冻干。

优选地，步骤(1)中，所述混合的时间为3～5h，温度为25～37℃。

优选地，所述口服给药递送系统的载药量为28～34％，包封率为52～65％。

优选地，所述肠道疾病为结肠癌。

优选地，所述口服给药递送系统含有β-葡聚糖水凝胶。

优选地，所述β-葡聚糖水凝胶按照以下工序制备：

将所述β-葡聚糖与水混合，控制溶液中所述β-葡聚糖的浓度在10～40mg/mL，在50～80℃的条件下加热，然后在2～8℃的条件下冷却，接着静置，得到β-葡聚糖水凝胶。

优选地，所述肠道疾病为肠道炎症。

在本发明中，β-葡聚糖来源于黑木耳，其化学结构式为主链上每三个β-(1,3)-葡萄糖主链带有两个β-(1,6)-葡萄糖残基的侧链。本发明提供了该黑木耳β-葡聚糖在制备治疗肠道疾病的口服给药递送系统中的新用途，所述黑木耳β-葡聚糖能够抵抗胃酸以及消化酶的降解效果，并靶向到达结肠，该黑木耳β-葡聚糖可以作为药物载体，实现药物的结肠定点靶向释药，也可以作为药物本身起到治疗肠道疾病的作用。

附图说明

图1是本发明所述的黑木耳β-葡聚糖纳米管的透射电镜图；

图2是本发明所述的黑木耳β-葡聚糖纳米管的扫描电镜图；

图3是本发明实施例1制得的黑木耳β-葡聚糖纳米管/阿霉素复合物的透射电镜图；

图4是本发明实施例1制得的黑木耳β-葡聚糖纳米管/阿霉素复合物的对结肠癌细胞存活率的影响图；

图5为本发明实施例2-4制得的黑木耳β-葡聚糖水凝胶的透射电镜图；

图6为本发明实施例2-4制得的黑木耳β-葡聚糖水凝胶的流变图；

图7是本发明测试例4中荧光标记BFP的紫外全波长扫描图；

图8是本发明测试例4中黑木耳β-葡聚糖水凝胶的组织分布图；

图9是本发明测试例5中黑木耳β-葡聚糖水凝胶的结肠长度图；

图10是本发明测试例5中黑木耳β-葡聚糖水凝胶H&E染色图；

图11是本发明测试例5中黑木耳β-葡聚糖水凝胶的IHC染色图；

图12是本发明测试例5中黑木耳β-葡聚糖水凝胶蛋白免疫印迹图；

图13是本发明测试例6中黑木耳β-葡聚糖的体外模拟胃肠道消化液的分子量图；

图14是本发明测试例6中市售阿霉素以及黑木耳β-葡聚糖纳米管/阿霉素复合物在体外模拟胃肠道消化液中的释药曲线图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

在本文中，“室温”指的是25℃。

本发明提供了β-葡聚糖在制备治疗肠道疾病的口服给药递送系统中的应用，其中，所述β-葡聚糖来源于黑木耳，其化学结构式为主链上每三个β-(1,3)-葡萄糖主链带有两个β-(1,6)-葡萄糖残基的侧链。

在具体的实施方式中，所述β-葡聚糖的分子量为1.98×10⁶～2.40×10⁶g/mol，优选为2.16×10⁶～2.29×10⁶g/mol。

研究表明，多糖的生物活性和多糖的结构和构象密切相关。不同来源的多糖结构不同，构象也不尽相同，所表现出来的生物活性亦不相同。本发明提供了黑木耳β-葡聚糖(BFP)在制备治疗肠道疾病的口服给药递送系统中的新用途，所述β-葡聚糖能够抵抗胃酸以及消化酶的降解效果，并靶向到达结肠，该β-葡聚糖可以作为药物载体，实现药物的结肠定点靶向释药，也可以作为药物本身起到治疗肠道疾病的作用。

对于所述β-葡聚糖从黑木耳中提取的具体方法，本发明不做限制，只要满足上述结构和分子量即可。在具体的实施方式中，所述β-葡聚糖是从黑木耳中以水提醇沉法提取所得。进一步地，所述β-葡聚糖按以下工序制备：将黑木耳子实体粉碎，经乙酸乙酯和丙酮分别回流4h后，在60℃烘箱干燥。随后使用70％乙醇水溶液浸泡黑木耳碎片，搅拌24h后，过滤弃滤液，将溶胀后的黑木耳残渣浸入0.9％的NaCl水溶液中，在85℃的条件下搅拌4h，再继续室温下搅拌过夜。收集上清液，然后脱色、脱蛋白、透析、冻干后得粗多糖。将粗多糖再溶于水中，用乙醇重沉淀，收集沉淀复溶于水，冷冻干燥后即得黑木耳多糖。将得到的黑木耳多糖进行化学结构表征，通过尺寸排阻色谱、甲基化分析、红外光谱和核磁共振光谱确定了所述黑木耳多糖为均一性β-葡聚糖，其化学结构式为主链上每三个β-(1,3)-葡萄糖主链带有两个β-(1,6)-葡萄糖残基的侧链，并进一步测得所述β-葡聚糖的分子量为1.98×10⁶～2.40×10⁶g/mol。

在本发明中，经试验发现，将所述黑木耳β-葡聚糖在室温下溶解于水中，并控制溶液中黑木耳β-葡聚糖浓度在0.1～1mg/mL，可形成黑木耳β-葡聚糖纳米管。利用黑木耳β-葡聚糖在水中可自组装形成纳米管的特性，可以将其作为药物载体，通过变性/复性行为包覆药物，如此，制备的口服给药递送系统能够抵抗胃酸以及消化酶的降解效果，在结肠菌群存在的情况下有效释放药物，实现药物的结肠定点靶向释药。

阿霉素(Doxorubicin,Dox)是蒽环类抗肿瘤抗生素，抗癌谱广，疗效好，是目前临床上应用最多也是最成功的一种高效、广谱的抗肿瘤药物之一。

在一种具体实施方式中，所述口服给药递送系统包括β-葡聚糖纳米管和阿霉素，其中，所述阿霉素包封于所述β-葡聚糖纳米管的疏水空腔中。

进一步地，所述口服给药递送系统按照以下工序制备：

(1)将所述β-葡聚糖和阿霉素与二甲基亚砜(DMSO)混合，得到混合液，其中，所述混合液中，所述β-葡聚糖的浓度为0.1～2mg/mL，所述阿霉素的浓度为0.1～2mg/mL；

(2)将所述混合液用水进行透析，然后冻干。

在具体的实施方式中，步骤(1)中，所述混合的时间为3～5h，温度为25～37℃。

在具体的实施方式中，步骤(2)包括：将所述混合液在超纯水中透析3～5天，然后将透析后的溶液冻干。

在本实施方式中，制得的所述口服给药递送系统的载药量为28～34％，包封率为52～65％，具有极高的载药量和包封率，治疗效果好。

在本实施方式中，制得的所述口服给药递送系统可用于治疗结肠癌。

在本实施方式中，所述口服给药递送系统的制备方法简单，能够抵抗胃酸以及消化酶的降解效果，在结肠菌群存在的情况下有效释放药物，可用于结肠癌的治疗。

在另一种实施方式中，所述口服给药递送系统含有β-葡聚糖水凝胶。

进一步地，所述β-葡聚糖水凝胶按照以下工序制备：将所述β-葡聚糖与水混合，控制溶液中所述β-葡聚糖的浓度在10～40mg/mL，在50～80℃的条件下加热，然后在2～8℃的条件下冷却，接着静置，得到β-葡聚糖水凝胶。

优选地，所述静置的时间为8～14h。

所述β-葡聚糖水凝胶能够减轻肠道炎症，同时对肠道屏障有修复作用，其可以单独作为药物来治疗肠道疾病，也可以作为药物载体，携带其他治疗肠道疾病的药物至结肠中释放。

在本实施方式中，所述口服给药递送系统可用于治疗肠道炎症。

在本实施方式中，含水凝胶的所述口服给药递送系统的制备工艺简单，无有机试剂的引入，绿色环保，成本低。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。

以下实施例中，所用的原料、化学试剂和实验动物如下所示：

二甲基亚砜(DMSO)、无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司；

结肠癌CT26细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；

噻唑蓝染料(MTT)、异硫氰酸荧光素(FITC)、柳氮磺吡啶(SASP)、二月桂酸二丁基锡购自上海麦克林生化科技有限公司；

阿霉素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

布氏肉汤、厌氧培养袋购自青岛高科技工业园海博生物科技有限公司；

实验小鼠由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，8周龄C57BL/6健康雄性小鼠；

实验大鼠由湖北贝恩特生物科技有限公司提供，220～250g SD健康雄性大鼠；

黑木耳β-葡聚糖(BFP)的化学结构式为主链上每三个β-(1,3)-葡萄糖主链带有两个β-(1,6)-葡萄糖残基的侧链，分子量为2.16×10⁶g/mol。

实施例1

本实施例用于说明本发明所述的口服给药递送系统(黑木耳β-葡聚糖纳米管/阿霉素复合物)的制备方法。

(1)采用DMSO溶解黑木耳β-葡聚糖和阿霉素，体系中阿霉素和黑木耳β-葡聚糖的浓度均为1mg/mL,然后在37℃的条件下继续搅拌3h，得到混合液；

(2)将所述混合液在超纯水中透析3天，冻干，得到黑木耳β-葡聚糖纳米管/阿霉素复合物，记作BFP-DOX。

实施例2

本实施例用于说明本发明所述的口服给药递送系统(水凝胶)的制备方法。

称取黑木耳β-葡聚糖20mg于2mL超纯水中(黑木耳β-葡聚糖浓度为10mg/mL)，在60℃的条件下加热完全溶解，在4℃冷却静置12h，得到黑木耳β-葡聚糖水凝胶。

实施例3

本实施例用于说明本发明所述的口服给药递送系统(水凝胶)的制备方法。

称取黑木耳β-葡聚糖40mg于2mL超纯水中(黑木耳β-葡聚糖浓度为20mg/mL)，在60℃的条件下加热完全溶解，在4℃冷却静置12h，得到黑木耳β-葡聚糖水凝胶。

实施例4

本实施例用于说明本发明所述的口服给药递送系统(水凝胶)的制备方法。

称取黑木耳β-葡聚糖80mg于2mL超纯水中(黑木耳β-葡聚糖浓度为40mg/mL)，在60℃的条件下加热完全溶解，在4℃冷却静置12h，得到黑木耳β-葡聚糖水凝胶。

测试例1

本测试例用于说明黑木耳β-葡聚糖可在水中自组装形成纳米管。

取黑木耳β-葡聚糖5mg充分溶解于5mL水中，得到β-葡聚纳米管溶液。

将所述黑木耳β-葡聚糖纳米管溶液进行以下形貌表征：

(1)将所述黑木耳β-葡聚糖纳米管溶液，滴一滴于200目铜网上，待样品被吸附10min后，滤纸除去剩余溶液，室温下晾干铜网，通过透射电子显微镜观察其在溶液状态下形貌，结果如图1所示。

由图1可以看出，在液体状态下，黑木耳β-葡聚糖呈现出管状结构。

(2)将黑木耳β-葡聚糖纳米管溶液于液氮中放置10min后，冻干3天，后45℃真空干燥24h。将干燥后的样品黏着于样品盘上，置于真空喷镀仪内镀导电金膜，加速电压设置为15kv，观察黑木耳β-葡聚糖干燥状态下的形貌，结果如图2所示。

由图2可以看出，在干燥状态下，黑木耳β-葡聚糖也呈现出管状结构。

由此可见，当溶液中黑木耳β-葡聚糖浓度在1mg/mL时，可形成黑木耳β-葡聚糖纳米管。

测试例2

将实施例1制得的黑木耳β-葡聚糖纳米管/阿霉素复合物进行理化表征和抗结肠癌活性评价：

1、载药量和包封率测试

测试方法：

取市售阿霉素充分溶解于DMSO中配成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07mg/mL的一系列浓度，紫外分光光度计在504.5nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

将实施例1制得的黑木耳β-葡聚糖纳米管/阿霉素复合物溶于DMSO中，紫外测定其吸光度，带入标准曲线。其中载药量(DLC)和包封率(DLE)按下式计算得到：

其中，W_drug为负载在多糖纳米结构中的药物质量，W_p为加入的多糖的质量，W₀为加入的药物的质量。

测试结果：阿霉素的标准曲线测试结果如下表1所示。

表1

如表1所示，拟合得到标准曲线为y＝19.433x+0.0706，R²＝0.9991。经计算，实施例1制得的黑木耳β-葡聚糖纳米管/阿霉素复合物的载药量为30.46％±0.16％，包封率为60.9％±0.3％。

2、形貌表征

取实施例1制得的黑木耳β-葡聚糖纳米管/阿霉素复合物1mg，充分溶解于2mL超纯水中，滴一滴于200目铜网上，待样品被吸附10min后，滤纸除去剩余溶液，室温下晾干铜网，通过透射电子显微镜观察其在溶液状态下形貌，结果如图3所示。

由图3可以看出，DOX成功封装于黑木耳β-葡聚糖纳米管的疏水空腔中。

3、抗结肠癌活性评价

将CT26细胞以5×10³个/孔接种于96孔板中，在37℃、5％ CO₂培养箱中培养24h，至细胞完全贴壁后弃去原培养液，更换为含有不同浓度阿霉素(0、0.0625μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL)的游离阿霉素和黑木耳β-葡聚糖纳米管/阿霉素复合物的新鲜培养液200μL，在恒温培养箱中培养24h。培养结束后弃去旧培养液，更换为MTT溶液，在37℃、5％ CO₂培养条件下孵育4h，后加入150μL DMSO后用酶标仪检测570nm波长下每个孔OD值。计算细胞增殖抑制率(细胞存活率)，公式如下：

测试结果如图4所示。

由图4可以看出，游离DOX和黑木耳β-葡聚糖纳米管/阿霉素复合物(BFP-DOX)表现出剂量依赖的细胞毒性。

测试例3

将实施例2-4制得的黑木耳β-葡聚糖水凝胶进行理化性质表征。

(1)形貌表征

将实施例2-4制得的黑木耳β-葡聚糖水凝胶于液氮中放置10min后冻干机冻干3天，采用扫描电子显微镜进行形貌表征，即分别称取不同浓度的冻干水凝胶样品2mg，45℃真空干燥24h。将干燥后的样品黏着于样品盘上，置于真空喷镀仪内镀导电金膜，加速电压设置为15kv，观察其形貌，结果如图5所示。

由图5可以看出，黑木耳β-葡聚糖水凝胶呈现出水凝胶特有的三维网络结构。较低浓度的黑木耳β-葡聚糖水凝胶网孔较大，随着浓度的提高，网孔结构逐渐致密。

(2)流变性测试：黑木耳β-葡聚糖水凝胶试样的流体力学行为采用ARES-RFS III流变仪(TA Instruments,USA)进行测试。使用同心圆筒模具，在25℃下，应变为1％的线性粘弹性区域测量黑木耳β-葡聚糖水凝胶的动态参数，包括存储模量(G′)、损耗模量(G″)和复合粘度(η*)，测试结果如图6所示。

由图6可以看出，在1～100rad/s的频率范围内，浓度为10～40mg/mL的黑木耳β-葡聚糖水凝胶的存储模量(G′)都高于损耗模量(G″)，并显示出频率依赖性，表明黑木耳β-葡聚糖水凝胶具有明显的凝胶特性。

测试例4

对本发明中提供的黑木耳β-葡聚糖水凝胶进行肠道驻留效果评价。

(1)荧光标记黑木耳β葡聚糖的制备：200mg BFP，28mg异硫氰酸荧光素(FITC)，80μL吡啶和16μL二月桂酸二丁基锡加入到20mL DMSO中，于高压反应试管中100℃避光反应4h。产物用4倍体积无水乙醇沉淀，室温条件下3000rpm/min离心15分钟。沉淀再用无水乙醇反复洗3次，然后在超纯水中透析3天，冷冻干燥得到黄色絮状产物，命名为FITC-BFP。取上述FITC-BFP 2mg溶于4mL DMSO中，在紫外分光光度计上进行全波长扫描，结果如图7所示。

由图7可以看出，在485nm处出现了FITC的特征吸收峰，表明荧光标记的FITC制备成功。

(2)黑木耳β-葡聚糖水凝胶的肠道驻留评价：取上述荧光标记黑木耳β-葡聚糖(FITC-BFP)按照实施例2-4中的方法分别制备成黑木耳β-葡聚糖20mg/mL、40mg/mL的口服凝胶制剂。将得到的口服凝胶剂对C57BL/6健康雄性小鼠采用灌胃的方式进行给药，在8h时进行成像，结果如图8所示。

由图8可以看出，8h后网状结构更加致密的水凝胶可能具备更佳的肠道粘附性，可延长多糖与结肠部位的接触时间。

测试例5

将实施例3(浓度为20mg/mL)和实施例4(浓度为40mg/mL)制得的黑木耳β-葡聚糖水凝胶进行抗结肠炎活性评价。

(1)抗炎和肠道修复：8周龄雄性C57BL/6小鼠分为5组(每组6只)，即对照组、模型组、BFP低剂量给药组(剂量为200mg/kg，根据小鼠的重量投喂相应体积的实施例3制得的β-葡聚糖水凝胶)、BFP高剂量给药组(剂量400mg/kg，根据小鼠的重量投喂相应体积的实施例4制得的葡聚糖水凝胶)和柳氮磺吡啶(SASP)阳性给药组(200mg/kg)。在建模前7天至建模结束使用BFP低剂量和高剂量给药组以及SASP阳性给药组进行药物干预。在此期间，对照组和模型组小鼠自由饮用纯净水。第8天，除对照组外，其他各组小鼠均自由饮用4.0％的DSS溶液5天以建立UC模型，每天更换新鲜的DSS溶液。实验结束后，处死小鼠。将整个结肠平铺以测量长度，后取部分放入多聚甲醛溶液中固定，进行H&E切片染色和免疫组化(IHC)染色，剩余部分放入-80℃冰箱冷冻保存，测试结果如图9-11所示。

由图9可以看出，黑木耳β-葡聚糖水凝胶能够有效缓解结肠炎导致的结肠长度缩短(其中，与对照组相比，^#p<0.05表示差异显著,^##p<0.01表示差异极显著；与模型组相比，^*p<0.05表示差异显著,^**p<0.01表示差异极显著)。

图10显示：H&E染色中正常组小鼠结肠组织黏膜完整，黏膜下层无水肿，隐窝结构存在。黑木耳β-葡聚糖水凝胶给药组能够有效缓解小鼠造模后出现的黏膜受损，黏膜下层伴有的大量炎性细胞浸润和隐窝结构消失的现象。

图11的免疫组化(IHC)染色结果显示黑木耳β-葡聚糖水凝胶能够增加黏蛋白MUC-2以及紧密连接蛋白ZO-1、occludin和Claudin的表达，有助于修复结肠炎小鼠的肠道屏障。

(2)蛋白免疫印迹检测：将结肠组织样品从-80℃冰箱取出，置于冰上，取20mg加入200μL裂解液、蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂(体积比100:1:1)，置于匀浆器中匀浆，静置30min后，8000r/min，4℃离心10min，取上清液。采用BCA法测定所得蛋白样品浓度，即按照BCA检测说明书的方法绘制标准曲线。将BSA标准溶液(2000μg/mL)配制成浓度为2000μg/mL、1500μg/mL、1000μg/mL、750μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、25μg/mL、0μg/mL的待测标准溶液。依次向96孔板中加入25μL各浓度的待测标准溶液，每种浓度设3个复孔，再向每孔加200μL BCA工作液(Regent A:Regent B＝50:1)，混匀后置于37℃下孵育30min，置于酶标仪562nm处检测吸光度，绘制得BCA标准曲线。

取6μL蛋白样品上清液，用PBS稀释10倍，依次向96孔板中加入25μL各浓度的待测标准溶液，每种样品设3个复孔，再向每孔加200μL BCA工作液(Regent A:Regent B＝50:1)，混匀后置于37℃下孵育30min，置于酶标仪562nm处检测吸光度。将所得吸光度、稀释倍数带入标准曲线计算样品中蛋白浓度。上清液中剩余蛋白样品加入Loading Bufer(5x)，95℃煮沸5min，置于-20℃冰箱用于后续凝胶电泳实验。即清洗玻璃板，配制浓缩胶和分离胶，后上样进行电泳。电泳完成后进行转膜以及使用5％脱脂蛋白封闭1h和孵育一抗12h。一抗孵育结束后，TBST洗涤3次，每次10min。孵育二抗(1h)。二抗孵育结束后，TBST洗涤3次，每次10min。最后使用ECL发光液，利用G:BOX化学成像分析系统进行成像，测试结果如图12所示。

图12的蛋白免疫印迹结果表明黑木耳β-葡聚糖水凝胶能够有效抑制炎症因子(IL-6和TNF-α)的表达，有效缓解结肠炎。

测试例6

将黑木耳β-葡聚糖(BFP)和实施例1制得的黑木耳β-葡聚糖纳米管/阿霉素复合物(BFP-DOX)进行体外模拟胃肠道消化。

体外胃肠道消化液的配置：

模拟胃液(SGF)：0.2g NaCl，7.0mL HCl(1.0M)在去离子水中加至总体积1.0L，将pH调节至1.2±0.1，将236mg胃蛋白酶加入到1L模拟胃液中，得到人工模拟胃液；

将BFP溶液(2.5mg/mL)与人工胃液以1:1(v/v)的比例充分混合，随后在37℃，100rpm/min条件下孵育，在反应1h和2h后，取出消化液，煮沸5min，确保胃蛋白酶失活，收集样品于截留分子量为8000～14000Da的透析袋中透析3天，冻干。

模拟小肠液(SIF)：2.74g KH₂PO₄在去离子水中加至总体积1.0L，1mol/L NaOH调节pH至7.2±0.2，将130mg胰蛋白酶加入到1L模拟小肠液中，得到人工模拟小肠液；

将来自模拟胃消化液的溶液用1M NaHCO₃中和至pH 7.0，并与人工小肠液以10:3(v/v)的比例混合。混合后的液体在37℃，100rpm/min条件下孵育，在反应2h和4h后，取出消化液，煮沸5min，确保胰蛋白酶失活，收集样品于截留分子量为8000～14000Da的透析袋中透析3天，冻干。

体外发酵液(模拟结肠液，SCF)：

粪便悬液的制备：将3只来自SD大鼠的相同质量的新鲜粪便混合，在超净台中与无菌PBS涡旋3min，并以500g离心5min。收集上清液并转移至50mL无菌管中以获得20％(w/v)以及4％(w/v)的粪便悬浮液；

每1L发酵培养基的制备：称取布氏肉汤28.1g(由10g蛋白胨、2g酵母浸粉、10g胰酪蛋白胨、5g NaCl、1g葡萄糖和0.1g亚硫酸氢钠组成)溶解在超纯水中，然后定容至1L，于120℃高压灭菌30min即得；

体外发酵：将8mL的20％粪便悬浮液接种到含有BFP(2.5mg/mL)的培养基中。放置于在厌氧培养袋中，于37℃，100rpm/min环境下孵育。在发酵3、6、12、24、48h后，收集培养基并置于冰上15min以终止微生物代谢。将培养基以8000g离心10min以除去细菌。收集样品于截留分子量为8000～14000Da的透析袋中透析3天，冻干。

(1)分子量测定：上述冻干后的多糖样品的分子量由尺寸排阻色谱仪(LC-20,SHIMADZU，Japan)结合多角度激光光散色仪(DAWNHELEOSⅡλ₀＝633nm，WyattTechnologyCo.Ltd.,USA)和示差检测器来分析。配备色谱柱(SB-806HQ和SB-804HQ column,7.8mm×300mm，Shodex,Japan)和保护柱(OHpak SB-G,Shodex,Japan)。将上述多糖样品以1mg/mL的浓度溶于0.9％的NaCl溶液中，进样前用0.45μm过滤头过滤进行光学除尘。柱温为25℃，流速0.5mL/min，进样为0.5mL。测试结果如图13所示。

由图13可以看出，在胃液中，BFP分子量显示出与未处理的BFP相似的单峰，表明胃液对BFP无明显破坏。BFP与模拟小肠液孵育4h后分子量有轻微改变，但是在24min左右出现的主峰仍然存在；BFP与肠道菌群发酵液共培育后，随着发酵时间的延长，BFP于24min处的峰面积逐渐减小，在27min出现新峰，表明其分子量逐渐减小，在发酵24h和48h后，BFP在24min处的峰消失，27min处的峰面积减小，说明BFP被肠道微生物逐步分解。上述结果表明，BFP能够在胃和小肠部位结构保持相对稳定，在结肠环境下，肠道菌群存在的情况下逐步分解。

(2)体外释放：采用膜透析法测定BFP-DOX以及市售阿霉素(2.5mg/mL)在模拟胃液(SGF)、小肠液(SIF)、结肠液(SCF)下的药物释放，SGF、SIF、SCF(含或不含4％盲肠内容物)分别代表胃、小肠和结肠的生理环境，市售阿霉素为对照。37℃、100rpm恒温震荡80h。在特定时间间隔取出2mL释放介质，同时补充2m L新鲜的相应释放介质。取出的释放介质采用紫外分光光度计法测定药物含量并绘制药物累积释放曲线，测试结果如图14所示。

图14显示：BFP-DOX在胃液和小肠液中的累积释药量为6.25±0.10％，比DOX组(58.51±0.51％)低9.3倍，当转移至加4％大鼠盲肠内容物的结肠液中时，BFP-DOX相较于不含大鼠盲肠内容物的DOX的释放量增加更为显著，24h内达到了55.33±1.52％。可能是BFP-DOX在胃液和小肠液中结构保持相对完整，当转移至时4％含有大鼠盲肠内容物的结肠液中时多糖被肠道菌群发酵产生的酶降解，导致药物释放增加。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.β-葡聚糖在制备治疗肠道疾病的口服给药递送系统中的应用，其中，所述β-葡聚糖来源于黑木耳，其化学结构式为主链上每三个β-(1,3)-葡萄糖主链带有两个β-(1,6)-葡萄糖残基的侧链。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述β-葡聚糖的分子量为1.98×10⁶～2.40×10⁶g/mol。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述口服给药递送系统包括β-葡聚糖纳米管和阿霉素，其中，所述阿霉素包封于所述β-葡聚糖纳米管的疏水空腔中。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述口服给药递送系统按照以下工序制备：

(1)将所述β-葡聚糖和阿霉素与二甲基亚砜混合，得到混合液，其中，所述混合液中，所述β-葡聚糖的浓度为0.1～2mg/mL，所述阿霉素的浓度为0.1～2mg/mL；

(2)将所述混合液用水进行透析，然后冻干。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述混合的时间为3～5h，温度为25～37℃。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述口服给药递送系统的载药量为28～34％，包封率为52～65％。

7.根据权利要求3-6中任意一项所述的应用，其特征在于，所述肠道疾病为结肠癌。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述口服给药递送系统含有β-葡聚糖水凝胶。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述β-葡聚糖水凝胶按照以下工序制备：

将所述β-葡聚糖与水混合，控制溶液中所述β-葡聚糖的浓度在10～40mg/mL，在50～80℃的条件下加热，然后在2～8℃的条件下冷却，接着静置，得到β-葡聚糖水凝胶。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述肠道疾病为肠道炎症。