KR20230065155A - 염증성 장 질환 치료용 나노입자 기반 온도감응성 생분해성 고분자 하이드로겔 조성물 - Google Patents
염증성 장 질환 치료용 나노입자 기반 온도감응성 생분해성 고분자 하이드로겔 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 폴리에틸렌글리콜 또는 그 유도체 및 카프로락톤을 기반으로 한 생분해성 온도감응성 고분자를 구성 성분으로 하고 다양한 염증성 장 질환 치료 약물을 유효성분으로 하는 하이드로겔 복합 약물전달체에 관한 것으로서, 상기 복합 약물전달체는 상온에서는 졸(sol) 상태를, 체내에서는 겔(gel) 상태의 상(phase)을 유지하여 약물 처치에 따른 부작용을 최소화하고 염증 부위에 선택적으로 점착되어 약물을 서서히 방출함으로서 염증성 장 질환 예방 및 치료에 탁월한 효과를 보여, 염증성 장 질환 치료 의약품으로 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 염증성 장 질환의 치료용으로 약물이 담지된 온도감응성 생분해성 하이드로겔 복합 약물전달체에 관한 것이다.
염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD)은 장관에 염증 또는 궤양이 발생하는 원인 불명의 만성 질환을 말한다. 대표적 질환으로 궤양성 대장염(ulcerative colitis)과 크론병(Crohn's disease)이 있다. 궤양성 대장염은 대장의 점막 또는 점막하층에 국한된 염증이 생기는 특징이 있다. 호전과 악화가 반복되고 설사, 혈변, 대변급박감 및 복통 등이 주증상이다. 반면 크론병(Crohn's disease)은 구강에서 항문까지 위장관 어느 부위라도 발생할 수 있다. 주증상은 복통, 설사, 체중 감소이며, 주로 젊은 연령에 발생하고 평생 지속되며, 장관 협착, 누공, 천공 등의 합병증을 유발할 수 있다. 아직까지 염증성 장 질환의 근본적 발병 원인은 명확하게 밝혀지지 않았고 유전적 요인, 환경적 요인, 장내 미생물 영향, 이상면역반응 등이 복합적으로 작용하는 것으로 추정되고 있다.
염증성 장 질환의 치료 목표는 증상을 호전시켜 관해를 유도하고 최대한 오랜 기간동안 관해 상태를 유지하는 것이다. 치료 방법은 질병의 범위, 중증도, 임상 양상, 감염 여부 등을 고려하여 의사의 판단에 따라 결정한다. 증상에 따라 5-ASA(5-aminosalicylic acid), 글루코코티코이드(glucocorticoid), 면역조절제, 생물학 제제, JAK(Janus kinase) 억제제 등의 약물이 사용되고 있고 약물 치료가 어려운 경우 절제 수술을 시행한다. 약물의 제형은 경도~중등도의 경우 주로 경구제 또는 국소 치료제(좌약, 관장제)가 사용되고 있고, 중증의 경우 주로 주사제가 사용된다.
염증성 장 질환을 효과적으로 치료하기 위해서 적절한 제형의 약물 개발이 매우 중요하다. 특히, 궤양성 대장염의 경우 발병 위치가 주로 직장, S자 결장, 또는 하행결장이기 때문에 경구 방식으로 약물을 효과적으로 전달하는 것이 용이하지 않아 과량을 복용하거나 관장제와 병행 투여해야 하는 한계점이 있다. 염증이 국소 부위가 아니라 전신에 생긴 중증 질환의 경우는 주사제가 국소 치료에 비해 더 효율적일 수도 있으나, 주사제 치료의 경우 약물이 전신작용을 하기 때문에 면역 강하 등의 부작용이 심하게 발생할 수 있다. 시중에서 판매되는 관장제를 포함한 국소치료제의 경우 미분화된 약물 입자가 수용액에 분산된 형태로서, 약물 입자들이 일반적으로 크고 용액 내에서 고르게 분산되어 있지 않기 때문에 치료제 주입 후 염증 부위 내부로 효과적으로 전달되는 데에 한계가 있으며 주입된 약물의 지속적인 효과를 기대하기 어렵다.
따라서, 약물이 혈중에 높은 농도로 존재하여 신체에 독성 및 부작용을 유발할 수 있는 주사제를 보완하고 염증 질환 부위에만 국부적이며 효과적으로 치료 약물을 전달할 수 있는 약물전달체(drug delivery system, DDS)에 대한 요구가 절실한 실정이다.
본 발명자들은 염증성 장 질환 염증 부위에 국부적, 선택적으로 점착이 가능하며 부작용을 최소화하고 담지된 약물을 서서히 전달시킬 수 있는 효과적인 방법을 제공하고자 노력한 결과, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG) 또는 그 유도체와 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL) 등을 기반으로 한 생분해성 고분자를 합성하고 이에 약물을 담지하여 복합 약물전달체를 제조하는 경우, 염증성 장 질환을 보다 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 i) 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG) 또는 그 유도체; 및
폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리락틱산(polylactic acid), 폴리글라이콜릭산(polyglycolic acid), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), poly(caprolactone-co-lactic acid), PCLGA(poly(caprolactone-co-glycolic acid)) 및 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상; 을 반응시키는 단계;
ii) 상기 단계 i) 에서 미반응물을 제거하고 반응물은 침전시켜 고분자를 수득하는 단계;
iii) 상기 단계 ii) 에서 수득한 고분자와 약물을 혼합하여 약물이 담지된 고분자를 수득하는 단계; 및
iv) 상기 단계 iii) 에서 수득한 고분자를 물에 녹여 60 ℃ 내지 90 ℃에서 가열한 후 상온에서 교반하여 하이드로겔을 수득하는 단계;
를 포함하는 온도감응성 생분해성 하이드로겔 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i) 의 반응 후, 이 반응을 종결시키기 위하여 트리에틸아민(triethylamine), 디에틸아민(Diethylamine), 4-디메틸아미노피리딘(4-Dimethylaminopyridine), 1,8-비스(디메틸아미노)나프탈렌(1,8-Bis(dimethylamino)naphthalene) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 첨가하여 스터링 하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 ii) 의 고분자의 중량평균분자량은 1,000~40,000 g/mol 인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii) 의 약물은 아미노살리실산(aminisalicylic acid) 제제, 부데소니드(budesonide), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 베클로메타손 디프로피오네이트(beclometasone dipropionate), 티오퓨린(thiopurine) 및 토파시티닙(tofacitinib) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 아미노살리실산(aminisalicylic acid) 제제는 설파살라진(sulfasalazine), 메살라진(mesalazine, 5-aminosalicylic acid, 5-ASA), 올살라진(olsalazine) 및 발살라지드(balsalazide) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 하이드로겔은 0 ℃ 이상 30 ℃ 이하 에서는 졸(sol) 상태이며, 30 ℃ 초과 40 ℃ 이하에서는 겔(gel) 상태 인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 하이드로겔은 염증성 장 질환 치료용인 것이다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 하이드로겔을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔을 포함하는 복합 약물전달체를 제공한다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 하이드로겔은 다양한 종류의 염증성 장 질환 약물 및 치료성분을 담지하여 복합 약물전달체로 활용할 수 있으며, 하이드로겔이 염증 부위에 점착되어 장 내 생리학적 조건에서 서서히 분해되면서 담지된 약물을 방출함으로써 효과적인 염증성 장 질환 치료효과를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 복합 약물전달체는 상온에서는 졸(sol) 상태를 유지하여 체내에 주입이 용이하고, 주입후에는 겔(gel) 상태로 상변화하여 염증 조직 병변에 선택적 점착이 가능하므로 보다 효과적인 약물치료효과를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 복합 약물전달체는 대량생산이 가능하며 GMP(good manufacturing practice) 환경내 제조에도 적합하여 생분해성 의약품으로의 상용화가 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 mPEG-PCL 하이드로겔 약물전달체의 GPC(gel permeation chromatography) 결과를 나타낸다.
도 2는 온도감응성 생분해성 하이드로겔의 온도에 따른 졸(sol)-겔(gel) 상변화를 나타낸다. 흐르는 졸에서 흐르지 않는 겔 상태로 변한 것을 확인할 수 있었다.
도 3은 온도에 따른 하이드로겔의 점도 변화를 측정한 결과를 나타낸다. 샘플의 온도를 상온에서 37 ℃로 올리면서 하이드로겔의 점도를 측정하였고 겔(gel)로 상변화를 하며 점도가 급격히 상승하는 것을 확인할 수 있었다.
도 4는 C57BL/6 마우스의 체중 변화를 나타낸다 (정상대조군: Normal, 대장염 유발군: DSS, 대조약 투여군: Bud, 약물이 담지된 하이드로겔 투여군: HDG+Bud).
도 5는 C57BL/6 마우스의 체중 변화율을 나타낸다 (대장염 유발군: DSS, 대조약 투여군: Bud, 약물이 담지된 하이드로겔 투여군: HDG+Bud). 각 개체의 체중이 다르기 때문에 변화되는 양상을 상대적으로 파악하기 위해서 시험시작일을 기준으로 상대적 백분율로 표시하였다.
도 6은 약물주입일로부터 7일 후의 평균 체중 변화를 나타낸 것이다. 체중이 제일 감소하는 시점인 Day 6과 시험 종료일의 무게를 빼서 계산한 값이다. 정상군의 경우 체중이 평균적으로 5.18 g 증가하고, 대장염유발군의 경우 평균 1.35 g 감소, 대조약투여군의 경우 평균 0.16 g 감소, 시험물질 투여군의 경우 평균 2.04 g 증가하는 것으로 측정되었다.
도 7은 체중 회복율을 보여준다. 상기 [도 6]에서 얻은 값을 이용하여 계산하였다. 여기서 말하는 회복율이란 정상군에 비해서 얼마 체중이 회복되었는지를 백분율로 표시한 값이다.
도 8은 C57BL/6 시험 종료 후 적출된 마우스의 장을 나타낸다 (정상대조군: Normal, 대장염 유발군: DSS, 대조약 투여군: Bud, 약물이 담지된 하이드로겔 투여군: HDG+Bud).
도 9는 Masson's trichrome (MT) 염색한 현미경 사진이다. MT 염색을 통해 콜라겐을 선택적으로 염색할 수 있고 이를 통해 염증성 장 질환의 발병에 의한 장 섬유화 정도를 판단할 수 있다. 사진에서 푸른색으로 염색된 영역이 염색된 콜라겐에 해당된다.
도 10은 MT 염색의 발색 면적(Mean area, %)을 측정하여 평균 및 표준편차를 산정한 결과이다.
도 2는 온도감응성 생분해성 하이드로겔의 온도에 따른 졸(sol)-겔(gel) 상변화를 나타낸다. 흐르는 졸에서 흐르지 않는 겔 상태로 변한 것을 확인할 수 있었다.
도 3은 온도에 따른 하이드로겔의 점도 변화를 측정한 결과를 나타낸다. 샘플의 온도를 상온에서 37 ℃로 올리면서 하이드로겔의 점도를 측정하였고 겔(gel)로 상변화를 하며 점도가 급격히 상승하는 것을 확인할 수 있었다.
도 4는 C57BL/6 마우스의 체중 변화를 나타낸다 (정상대조군: Normal, 대장염 유발군: DSS, 대조약 투여군: Bud, 약물이 담지된 하이드로겔 투여군: HDG+Bud).
도 5는 C57BL/6 마우스의 체중 변화율을 나타낸다 (대장염 유발군: DSS, 대조약 투여군: Bud, 약물이 담지된 하이드로겔 투여군: HDG+Bud). 각 개체의 체중이 다르기 때문에 변화되는 양상을 상대적으로 파악하기 위해서 시험시작일을 기준으로 상대적 백분율로 표시하였다.
도 6은 약물주입일로부터 7일 후의 평균 체중 변화를 나타낸 것이다. 체중이 제일 감소하는 시점인 Day 6과 시험 종료일의 무게를 빼서 계산한 값이다. 정상군의 경우 체중이 평균적으로 5.18 g 증가하고, 대장염유발군의 경우 평균 1.35 g 감소, 대조약투여군의 경우 평균 0.16 g 감소, 시험물질 투여군의 경우 평균 2.04 g 증가하는 것으로 측정되었다.
도 7은 체중 회복율을 보여준다. 상기 [도 6]에서 얻은 값을 이용하여 계산하였다. 여기서 말하는 회복율이란 정상군에 비해서 얼마 체중이 회복되었는지를 백분율로 표시한 값이다.
도 8은 C57BL/6 시험 종료 후 적출된 마우스의 장을 나타낸다 (정상대조군: Normal, 대장염 유발군: DSS, 대조약 투여군: Bud, 약물이 담지된 하이드로겔 투여군: HDG+Bud).
도 9는 Masson's trichrome (MT) 염색한 현미경 사진이다. MT 염색을 통해 콜라겐을 선택적으로 염색할 수 있고 이를 통해 염증성 장 질환의 발병에 의한 장 섬유화 정도를 판단할 수 있다. 사진에서 푸른색으로 염색된 영역이 염색된 콜라겐에 해당된다.
도 10은 MT 염색의 발색 면적(Mean area, %)을 측정하여 평균 및 표준편차를 산정한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
온도감응성 하이드로겔은 온도에 따라 물질의 상태가 변하는 하이드로겔로서, 주입의 편의성으로 인하여 최근 의약품과 의료기기에 적용하고자 하는 다양한 연구가 시도되고 있다. 예를 들어, 상온에서는 졸(sol) 상태로 존재하다가 체온에서는 겔(gel) 상태로 변하는 하이드로겔의 경우, 용액 상태의 하이드로겔을 주사기로 체내에 주입하면 체온에 의해서 서서히 겔화(gelation)되고 국소 부위에서 점착되어 지속적으로 약물을 전달할 수 있는 특징이 있다.
따라서, 본 발명은 i) 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG) 또는 그 유도체; 및
폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리락틱산(polylactic acid), 폴리글라이콜릭산(polyglycolic acid), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), poly(caprolactone-co-lactic acid), PCLGA(poly(caprolactone-co-glycolic acid)) 및 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상; 을 반응시키는 단계;
ii) 상기 단계 i) 에서 미반응물을 제거하고 반응물은 침전시켜 고분자를 수득하는 단계;
iii) 상기 단계 ii) 에서 수득한 고분자와 약물을 혼합하여 약물이 담지된 고분자를 수득하는 단계; 및
iv) 상기 단계 iii) 에서 수득한 고분자를 물에 녹여 60 ℃내지 90 ℃에서 가열한 후 상온에서 교반하여 하이드로겔을 수득하는 단계;
를 포함하는 온도감응성 생분해성 하이드로겔 제조방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서, 온도감응성 생분해성 하이드로겔 약물전달체를 구성하는 고분자로서 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(mPEG-PCL) 블록 공중합체를 사용하였다. 상기 고분자들은 미국 식품의약청(US Food and Drug Administration, US FDA)으로부터 인체에 사용가능한 생분해성 물질로 승인되어 연구용 및 상업용으로 다양하게 사용되어 왔다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i) 의 반응 후, 이 반응을 종결시키기 위하여 트리에틸아민(triethylamine), 디에틸아민(Diethylamine), 4-디메틸아미노피리딘(4-Dimethylaminopyridine), 1,8-비스(디메틸아미노)나프탈렌(1,8-Bis(dimethylamino)naphthalene) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine) 등의 약염기로 이루어진 군에서 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상 을 첨가하여 스터링 하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 ii) 의 고분자의 중량평균분자량은 1,000~40,000 g/mol 인 것일 수 있다. 바람직하게는 1,500~20,000 g/mol 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 2,600 내지 3,000 g/mol 인 것일 수 있다. 또한, 하이드로겔 내 고분자의 농도는 10~40%가 바람직하며, 15~30%가 보다 바람직하다. 상기 고분자는 수용액 내에서 마이셀 또는 나노입자 구조를 형성하는데 이때 입자의 크기와 고분자의 농도를 조절하여 약물 방출 속도를 제어할 수 있는 특징이 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii) 의 약물은 아미노살리실산(aminisalicylic acid) 제제, 부데소니드(budesonide), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 베클로메타손 디프로피오네이트(beclometasone dipropionate), 티오퓨린(thiopurine), 및 토파시티닙(tofacitinib) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 아미노살리실산(aminisalicylic acid) 제제는 설파살라진(sulfasalazine), 메살라진(mesalazine, 5-aminosalicylic acid, 5-ASA), 올살라진(olsalazine) 및 발살라지드(balsalazide) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 하이드로겔은 0 ℃ 이상 30 ℃ 이하의 상온에서는 졸(sol) 상태이며, 30 ℃ 초과 40 ℃ 이하의 생리학적 온도에서는 겔(gel) 상태 인 것으로 상변화(phase transformation)을 일으키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 하이드로겔은 염증성 장 질환 치료용인 것이다.
상기 염증성 장 질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis)과 크론병(Crohn's disease)을 포함하며 장 내부에 비정상적이 염증이 만성적으로 발병하는 질환이다.
궤양성 대장염은 점막과 점막하조직에만 염증이 생기고 이 이하의 조직인 근육층과 장막층에는 염증이 없는 것이 특징으로 항문에 인접한 직장에서 시작하여 점차 안쪽까지 진행되며 여기저기 흩어져 있지 않고 모두 연결되는 특징이다. 궤양성 대장염의 원인은 아직까지 밝혀지지 않았으나 유전적, 환경적 요인이 복합적으로 작용하여 발생하며 만성적인 혈변, 설사, 대변절박증을 호소하며 중증의 경우 동반 증상으로 전신쇠약감, 식욕부진, 발열 등 발생할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 하이드로겔을 제공한다. 상기 하이드로겔은 A-B, A-B-A, B-A-B 구조의 블록 공중합체이다. 여기서 A는 친수성, B는 소수성 고분자를 나타낸다. A는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG) 또는 그 유도체이고, B는 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리락틱산(polylactic acid), 폴리글라이콜릭산(polyglycolic acid), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), poly(caprolactone-co-lactic acid), PCLGA(poly(caprolactone-co-glycolic acid)) 및 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로써 이들의 혼합물인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 하이드로겔은 염증성 장 질환의 염증 부위에 선택적으로 점착이 가능한 것이어서, 염증성 장 질환 치료용인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔을 포함하는 복합 약물전달체를 제공한다.상기 복합 약물전달체는 염증성 장 질환 치료에 보다 효과적인 방법을 제공한다.
상기 하이드로겔 복합 약물전달체는 관장을 통해 직장, S자 결장, 하행결장에 도포될 수 있다. 또는 대장 내시경을 실시하며 직장을 포함한 모든 결장 부위에 도포될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되지 않는다는 것은 본 발명의 통상적인 지식을 가진 자에게 있어 자명할 것이다.
[제조예 1]
메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤 (mPEG-PCL) 블록 공중합체의 제조
메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG, 평균분자량: 750 g/mol), 카프로락톤(ε-caprolactone), 디클로로메탄(dichloromethane)을 잘 건조된 둥근 플라스크에 넣고 상온에서 질소 퍼징을 10분 정도 하였다. 마그네틱 바를 이용해 용액을 스터링을 하고 모든 물질이 완전히 녹으면 촉매를 넣었다. 15시간 동안 중합을 진행하고 반응을 종결하기 위해 트리에틸아민(triethylamine)을 넣고 30분 간 스터링 하였다. 미반응 단량체와 촉매를 제거하고 mPEG-PCL를 침전하기 위해 반응 용액을 에탄올과 에테르(diethyl ether) 혼합용매(180 ml, 에탄올:에테르=1:9)에 넣었다. 침전된 고분자를 거름종이로 거른 후 감압 건조하여 순수한 고분자를 얻었다. 순도를 높이기 위해 침전 과정을 여러 번 반복할 수 있다. Gel permeation chromatography(GPC)를 이용하여 합성된 고분자의 분자량을 측정하였다.
그 결과, [도 1] 에서 나타난 바와 같이 mPEG-PCL의 측정된 수평균분자량은 2,439 g/mol, 중량평균분자량은 2,822 g/mol, 분산도(중량평균분자량/수평균분자량, PDI)는 1.16 인 것을 확인할 수 있었다.
[제조예 2]
약물이 담지된 mPEG-PCL 하이드로겔 복합 약물전달체의 제조
상기 <제조예 1> 에서 합성한 mPEG-PCL 블록 공중합체 2g과 부데소니드(budesonide) 또는 덱사메타손(dexamethasone) 10 mg을 아세톤 10ml에 녹였다. 시린지필터(PTFE, 0.45 μm)를 이용해 용액에 있는 이물질을 제거하였다. 회전 증발기를 이용해서 아세톤을 제거하고 약물이 담지된 mPEG-PCL 필름을 얻었다. 여기에 초순수(deionized water) 8 ml를 넣었다. 80 ℃로 설정된 항온 수조에 이 샘플을 넣고 5분간 가열하였다. 샘플을 항온수조에서 꺼내서 상온에서 서서히 식히면서 마그네틱 바를 이용해 교반을 하여 하이드로겔을 제조하였다. 고분자의 농도는 전체 중량 대비 약 10~30%가 적당하다. 농도가 그 이하인 경우 상온에서 겔화가 잘 되지 않고 그 이상인 경우 점도가 너무 높아 주입하는 것이 어렵다. 또한 약물의 농도는 고분자의 중량 대비 최대 5%까지 조절할 수 있다. 그 이상은 약물의 일부가 고분자에 담지 되지 않는 것이 관찰된다. 하이드로겔의 졸-겔 변화를 보기 위해서 샘플이 담긴 바이알을 37 ℃로 가열하였다.
그 결과, [도 2]에서 나타나는 바와 같이 상온에서는 졸(sol) 상태이고 37 ℃에서는 겔(gel) 상태로 변하는 것을 확인하였다. 또한, 15 ℃ 에서 37 ℃로 빠르게 가열하면서 점도를 측정한 결과 하이드로겔의 점도가 빠르게 늘어나는 것을 확인할 수 있었다(도 3).
DSS를 이용한 염증성 장 질환 모델의 제작 및 약물이 담지된 하이드로겔의 치료 효과 (급성 염증성 장 질환 모델)
급성 염증성 장 질환 증상을 보이는 동물 모델을 구축하기 위하여 C57BL/6 male 마우스(17~19 g) 6주령을 ㈜오리엔트바이오(대한민국, 성남)에서 구입하였다. 1주동안 고형사료와 물을 자유롭게 섭취시키면서 일정한 습도와 온도를 유지하였고 12시간 주기로 명암이 조절되는 실험 환경에서 1주간 적응시켰다. 1주일동안 적응 기간을 거친 후, 정상대조군(Normal, n=4, negative control), 대장염 유발군(DSS, n=11, vehicle control), 대조약 투여군(Bud, n=11, positive control), 약물이 담지된 하이드로겔 투여군(HDG+Bud, n=11, test article)으로 나누었다. 정상대조군을 제외한 모든 군에 유발 개시일부터 5일(Day 5)까지 2% DSS(Dextran sulfate sodium) 용액을 자유롭게 섭취하도록 하여 염증성 장 질환을 유발시켰다. 2% DSS 용액은 3일에 한번 새로 만들어 교체하였다. 5일 뒤 일반 음수로 교체해준 뒤 16시간 절식한 후 6일 째에 대조약 (부데소니드, Bud, budesonide 용액 100 μL, 농도는 0.161 mg/mL)과 약물이 담지된 하이드로겔 (HDG+Bud, 하이드로겔의 농도는 25%, budesonide의 농도는 0.161 mg/mL, 각 100 μL)을 PE(Polyethylene) 존대를 사용하여 직장을 통해 단회 주입을 하였다. 주입하는 위치는 항문으로부터 약 4 cm 가 되도록 하였다. 주입 직후 주입된 약물의 유출 방지를 위하여 약 5분간 꼬리를 들어주었다.
약물이 담지된 하이드로겔의 유효성 평가를 위해서 마우스의 체중을 13일간 측정하고(도 4), 이와 함께 DSS 주입일을 기준으로 평균 체중 변화율을 표시하였다(도 5). 도에서 오차 막대(error bar)는 측정값의 표준편차를 나타낸다.
모든 군에서 5일과 6일 사이에 체중이 급격하게 떨어지는 것을 확인하였고 이는 약물투입 전 절식에 기인한 것으로 판단하였다. 정상군(Normal)의 경우 체중 회복이 매우 빠르게 관찰되었다. 반면 대장염 유발군(DSS)의 경우 체중이 지속적으로 내려갔으며 대조약 투여군(Bud)의 경우 체중이 빠진 상태로 유지되었다. 약물이 담지된 하이드로겔군(HDG+Bud)의 경우 체중이 유의미하게 회복되는 것으로 확인되었다.
약물을 주입한 날로부터(Day 6) 일주일 뒤 (Day 13) 평균 체중 차이를 계산하였다(도 6). 정상군의 경우 평균 약 5.18 g 증가, DSS 유발군은 평균 약 1.35 g 감소, 대조약 투여군은 평균 약 0.16 g 감소, 약물이 담지된 하이드로겔군은 약 평균 2.04 g 증가하였다. 정상군의 체중 회복 정도를 회복율 100%라고 산정하였을 때 각 군의 회복율을 계산하였다(도 7). DSS 유발군은 평균 약 26% 정도 체중이 감소하였고 대조약 투여군(Bud)은 평균 약 3% 감소하였다. 반면, HDG+Bud 군은 평균 약 39% 정도 체중이 회복되었다. 또한, 약물 주입 후 7일째에 각각의 동물을 마취하여 희생시키고 대장을 적출하여 대장의 상태를 육안을 관찰하였을 때 약물이 담지된 하이드로겔을 주입한 마우스 대장의 상태가 상대적으로 좋았다(도 8).
DSS를 이용한 염증성 장 질환 모델의 제작 및 약물이 담지된 하이드로겔의 치료 효과 (만성 염증성 장 질환 모델)
만성 염증성 장 질환(IBD)을 유도하기 위하여 실험동물은 1.25 % DSS를 음수에 타서 7 일 동안 공급한 다음 14 일 동안 정상적인 음수를 공급하였다. 이 사이클을 3 회 반복하여 염증성 장 질환 및 대장 섬유화를 유도하였다. DSS 공급기간 동안 3 일에 한번 새로 만든 DSS 로 교체시켜주었다. 급성 염증성 장 질환 동물 모델과 마찬가지로 각 군은 Normal군(n=8, negative control), DSS군(n=10, vehicle control), Bud군(n=8, positive control), HDG+Bud군(n=8, test article) 로 구분하였다.
약물 투여군(Bud 및 HDG+Bud)에는 직장 투여를 위해 NIL식 FLEXIBLE ORAL ZONDE NEEDLE이 장착된 1㎖ 주사기를 마우스 항문으로부터 직장의 4 cm 깊이로 주입하여 10 초간 천천히 약물을 100 ㎕/head 투여한 후 항문을 막아 60 초간 고정하였다. 시험물질은 DSS 투여가 끝나고 4일, 7일, 11일, 14일 후에 투여하였다. 이 사이클을 3회 반복하여 만성 염증성 장 질환을 유도하였고 약물은 총 12회 투여하였다.
DSS 유도에 의해 결장 조직에 콜라겐 축적의 정도 측정을 위한 Masson Trichrome (MT) staining은 외부기관에 의뢰하여 수행하였으며 일정한 단면을 400 배 이미지로 촬영하여 발색 면적을 계산하였다 (도 9). 콜라겐 축적은 염증성 장 질환에서 대표적으로 발생하는 현상이며 그 축적 정도는 염증 발현의 지표로 활용될 수 있다. 대장 조직에서 콜라겐에 특이적으로 염색되는 MT 염색의 발색 면적 Mean area, %)을 측정하여 평균 및 표준편차를 산정한 결과 normal군은 6.47 ± 1.87, DSS 유발군은 17.58 ± 3.11, Bud군은 14.15 ± 4. 21, HDG+Bud군은 9.38 ± 4.03 %로 측정되었다(표 1). MT 염색의 발색 면적은 Normal 군에 비하여 DSS 유발군에서 2.7 배(p<0.01) 통계학적으로 유의하게 증가한 것으로 관찰되었다. Normal군에서의 발색 정도를 기준으로 산정하였을 때, DSS 유발군에 비하여 Bud군은 평균 30.9 %(p<0.05), HDG+Bud군은 평균 73.8%(p<0.01) 통계학적으로 유의하게 MT staining의 발색이 감소한 것으로 측정되었다. 따라서 HDG+Bud 군은 대장염의 섬유화(fibrosis)를 감소시키고 점막손상을 완화하는 것으로 보아 염증성 장 질환의 개선 및 치료와 항염효과에 도움을 줄 수 있다고 판단된다.
| 그룹 | MT (Mean area %) |
| Normal | 6.47 ± 1.87 |
| DSS | 17.58 ± 3.11 |
| Bud | 14.15 ± 4.21 |
| HDG+Bud | 9.38 ± 4.03 |
Claims (10)
- i) 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG) 또는 그 유도체; 및
폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리락틱산(polylactic acid), 폴리글라이콜릭산(polyglycolic acid), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), poly(caprolactone-co-lactic acid), PCLGA(poly(caprolactone-co-glycolic acid)) 및 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상; 을 반응시키는 단계;
ii) 상기 단계 i) 에서 미반응물을 제거하고 반응물은 침전시켜 고분자를 수득하는 단계;
iii) 상기 단계 ii) 에서 수득한 고분자와 약물을 혼합하여 약물이 담지된 고분자를 수득하는 단계; 및
iv) 상기 단계 iii) 에서 수득한 고분자를 물에 녹여 60 ℃내지 90 ℃에서 가열한 후 상온에서 교반하여 하이드로겔을 수득하는 단계;
를 포함하는 온도감응성 생분해성 하이드로겔 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 i) 의 반응 후, 이 반응을 종결시키기 위하여 트리에틸아민(triethylamine), 디에틸아민(Diethylamine), 4-디메틸아미노피리딘(4-Dimethylaminopyridine), 1,8-비스(디메틸아미노)나프탈렌(1,8-Bis(dimethylamino)naphthalene) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상 을 첨가하여 스터링 하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 ii) 의 고분자의 중량평균분자량은 1,000~40,000 g/mol 인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 iii) 의 약물은 아미노살리실산(aminisalicylic acid) 제제, 부데소니드(budesonide), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 베클로메타손 디프로피오네이트(beclometasone dipropionate), 티오퓨린(thiopurine) 및 토파시티닙(tofacitinib) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 제조방법.
- 제4항에 있어서, 상기 아미노살리실산(aminisalicylic acid) 제제는 설파살라진(sulfasalazine), 메살라진(mesalazine, 5-aminosalicylic acid, 5-ASA), 올살라진(olsalazine) 및 발살라지드(balsalazide) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 0 ℃ 이상 30 ℃ 이하 에서는 졸(sol) 상태이며, 30 ℃ 초과 40 ℃ 이하에서는 겔(gel) 상태 인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 염증성 장 질환 치료용인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 제조방법.
- 제1항의 제조방법으로 제조된 하이드로겔.
- 제8항에 있어서, 상기 하이드로겔은 염증성 장 질환 치료용인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
- 제8항의 하이드로겔을 포함하는 복합 약물전달체.
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|---|---|---|---|---|
| CN117180182A (zh) * | 2023-09-05 | 2023-12-08 | 上海交通大学医学院附属新华医院 | 一种口服硒化纳米水凝胶制剂的制备方法和用途 |
| CN117205326A (zh) * | 2023-09-26 | 2023-12-12 | 湖北中医药大学 | β-葡聚糖在制备治疗肠道疾病的口服给药递送系统中的应用 |
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-
2022
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