CN115361963A - 包含益生菌、胶原和细菌胞外多糖的生物复合材料及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物的生物复合物，其包括胶原支架和胞外多糖，所述胶原支架含有包埋在胶原支架中的益生菌。本发明还涉及获得生物复合物的方法以及生物复合物在医学中的用途，更具体地，在治疗细菌性阴道炎中的用途。

Description

包含益生菌、胶原和细菌胞外多糖的生物复合材料及其用途

技术领域

本发明涉及治疗学领域，更具体地，涉及使用形成生物复合材料的一部分的益生菌组合物治疗细菌性阴道炎。

背景技术

细菌性阴道炎(BV)是育龄妇女阴道疾病的最常见原因。这种感染最常见的症状是密集的异常阴道分泌物、疼痛、瘙痒和难闻的气味。独立研究证实，BV会增加其他疾病的发病风险，如盆腔炎和性传播感染(STI)，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)。此外，BV与早产和产后子宫感染密切相关。

从微生物学的角度来看，BV的特征是阴道微生物群的正常平衡发生改变，病理状态通常称为“阴道菌群失调”。天然微生物群有助于为阴道粘膜创造一个防止感染的保护屏障。然而，健康的微生物群对多种因素敏感，特别是粘膜pH值的变化，这会使微生物种群失衡，有利于感染微生物的出现。阴道微生物群的健康被认为是由乳酸菌(如乳酸杆菌(Lactobacilli))维持的。由于阴道液的pH值存在微小的不平衡(例如，在健康与不健康的环境中，pH值从4到5)，这些乳酸杆菌受到诸如阴道嗜血杆菌(GardnerelLa vaginalis)和动弯杆菌(Mobiluncus spp.)的致病细菌过度生长的抑制，这些细菌在健康时存在于小群体中，导致育龄妇女出现BV。

从化学角度来看，健康女性的阴道环境主要由乳酸菌家族的主要代谢产物乳酸控制。与其他典型有害细菌相关的其他短链脂肪酸(SCFA)如乙酸、丙酸和丁酸的浓度几乎低100倍。因此，pH值由乳酸(pKa＝3.80)调节，乳酸在健康阴道液中的浓度约为120mM，形成pH值约为4。乳酸杆菌数量的减少和病原菌的过度生长改变了代谢模式：SCFA增加，乳酸浓度急剧下降，达到约20mM。特别是，SCFA的主要成分乙酸的浓度可以从最初的2mM达到约120mM，这导致pH值上升至5，因为乙酸(4.86)的pKa高于乳酸。因此，阴道液的pH值从4(健康)变为5(BV)，随着时间的推移，病情恶化。事实上，pH变化是诊断BV的关键参数。例如，当阴道液的pH值高于4.5时，Amsel方法诊断为BV。

BV的传统治疗方法是抗生素，尤其是甲硝唑。然而，现有治疗方式的一些缺点需要开发新的治疗途径。首先，基于抗生素的治疗不能避免复发。其次，由于过度使用抗生素而导致的抗生素耐药细菌的发展仍然是现代医学面临的最大挑战。因此，迫切需要更有效的长期治疗，减少我们对抗生素的依赖。

鉴于BV期间发生的生化循环，即乳酸浓度的降低最终促进病原体的过度生长，针对BV的潜在治疗策略之一可能是将乳酸直接应用于受感染的阴道。虽然这种治疗可以减轻症状，但频繁和长期使用这种治疗有望避免BV的再次出现。最近的方法已经考虑了使用乳酸杆菌家族的益生菌。例如，WO2014184643描述了对引起阴道炎的细菌具有抗菌活性并且含有乳酸杆菌家族的益生菌的组合物。尽管前景看好，但该方法的效率将取决于受累于BV的(BV-compromised)微生命周期(microproliferation)内益生菌的粘附和增殖水平以及后续治疗，会导致BV复发。

发明内容

本发明的作者基于使用生物相容性胶原基质开发了一种治疗BV的新策略，该基质保护益生菌并允许其在受损阴道液中有效定位和增殖。特别是，本发明人已经表明，胶原支架(colLagen scaffold，col)能够保护乳酸杆菌属的两种产生物膜益生菌，即发酵乳杆菌(L.fermentum，Lf)和嗜酸乳杆菌(L.acidophilus，La)，分别产生具有增强的抗BV感染治愈特性的混合材料col-Lf和col-La。这两种材料对应于由胶原、益生菌和细菌EPS(胞外多糖)组成的生物复合物。col-Lf和col-La能够将受损的模拟BV液体的pH恢复到健康状态。这些胶原包埋的益生菌具有优异的稳定性，结合对阴道粘膜的高粘附性和胶原基质的固有生物相容性，使这些材料在非抗生素BV治疗中非常有前景。

附图说明

图1、在不存在(a-b)和存在益生菌Lf(c-d)的情况下，在PBS(pH 7.4)中组装的胶原纤维的SEM显微照片，然后在MRS中孵育以产生col-Lf(e-f)。箭头指示EPS。

图2、存在益生菌La时胶原纤维的SEM显微照片。不同放大倍数：26.60kx(a)和95.63kx(b)。

图3、胶原(Col)和Col-Lf的FTIR光谱(a)和TGA曲线(b)。(b)中的插图显示了相应的导数TGA曲线(DTG曲线)。两种表征都证实了细菌有效地结合到胶原支架中。(c)col和col-Lf的X射线衍射图。q表示散射矢量振幅，q＝4πsinθ/λ，θ为散射角，λ为X射线束的波长。

图4、用SYTO9(绿色)和碘化丙啶(红色)染料染色的col-Lf共聚焦图像。a)yz切片示出了细菌渗透并完全整合到胶原基质中。b)3D图像(318.20x 318.20x 38μm3)，显示细菌如何沿着胶原纤维特异性排列(箭头)。c)放大率较高的图像显示极少的死亡(红色)细菌(该图像是深度为6微米的最大强度投影)。

图5、a)在4℃下储存两周、四周和八周后，含Lf或col-Lf的1/10稀释MRS培养基中pH的时间演变。还示出了新鲜样品的pH变化。这些值的以标准偏差表示的误差小于±0.2。b)在4℃下储存两周、1个月或2个月后，含Lf或col-Lf的1/10稀释MRS中POM还原活性的时间演变。还示出了新鲜样品的POM还原活性的演变。误差条示出了标准偏差。

图6、a)在4℃下储存两周、1个月或2个月后，含La或col-La的1/10稀释MRS培养基中pH的时间演变。还示出了新鲜样品的pH值的变化。这些样品的以标准偏差表示的误差均小于±0.2。b)在4℃下储存两周、1个月或2个月后，含La或col-La的1/10稀释MRS中POM还原活性的时间演变。还示出了新鲜样品的POM还原活性的演变。误差条示出了标准偏差。

图7、a)粘附力实验的示意图。b)评估Lf和col-Lf与固定化粘蛋白的粘附性。590nm处的吸光度与粘附在粘蛋白上的细菌数量相关。还包括对照组(粘蛋白和粘蛋白+col)的吸光度值。数据以平均值±标准偏差(n＝3)表示。*p<0.01和***p<0 0.005。

图8、a)粘附力评价实验的示意图。b)La和col-La对固定化粘蛋白的粘附力评价。590nm处的吸光度与粘附在粘蛋白上的细菌数量相关。还包括对照组(粘蛋白和粘蛋白+col)的吸光度值。数据以平均值±标准偏差(n＝3)表示。*p<0.01和***p<0 0.005。

图9、评估Lf和col-Lf与固定化猪粘蛋白的粘附力。590nm处的吸光度与粘附在粘蛋白上的细菌数量相关。还包括对照组(粘蛋白和粘蛋白+col)在590nm处的吸光度值。示出了用BSA阻断或不阻断时的结果。误差条示出了标准偏差。星号表示粘蛋白粘附力的显著差异(**为p<0.01，***为p<1.005)。

图10、模拟BV液体(初始pH 5.0)中col-Lf和col-La、Lf和La的pH演变。以标准偏差表示的误差均小于±0.06。

具体实施方式

获得生物复合物的方法

在第一方面，本发明涉及制备包含胶原、益生菌和胞外多糖的生物材料的方法，其中所述方法包括：

i)使益生菌群与胶原单体接触，

ii)将步骤i)中获得的混合物在足以

iii)在足以使益生菌形成胞外多糖(EPS)的条件下孵育，直到生物材料中的EPS含量相对于生物材料的胶原含量以糖计的含量至少为2％(w/w)。

在第一步中，根据本发明的方法包括使益生菌群与胶原单体接触。

如本文所使用的术语“益生菌群”或“益生组合物”是指微生物的单一或混合培养物，当提供给哺乳动物(例如人)时，其有益地影响宿主。在一些实施方案中，本发明的益生菌组合物包含单一种类的细菌。在其他实施方案中，益生菌组合物包含两种或多种细菌，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000或更多种细菌。在一个实施方案中，益生菌组合物包含不超过20种细菌，例如20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种细菌。在示例性实施方案中，益生菌组合物包含8种细菌。在其他示例性实施方案中，益生菌组合物包含9种细菌。在其他实施方案中，如本文所述，益生菌组合物包含益生菌或与益生菌联合施用。

在一个实施方案中，益生菌群包含至少一种能够产生生物膜的菌株。

本文使用的术语“生物膜”是指微生物分散于其上的和/或形成菌落的细胞外基质。生物膜通常由多糖和其他大分子组成。能够产生可用于本发明的生物膜的菌株可通过使用如实施例1所述的测定法进行鉴定，其中所述菌株在相容培养基支架中的胶原支架内生长，并检测到糖含量的增加。如下所述，能够形成生物膜的菌株被定义为在最终材料中导致糖含量为至少2.5％(w/w)、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少5.5％、至少6％、至少6.5％、至少7％、至少7.5％、至少8％、至少8.5％、至少9％、至少9.5％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％或更多的菌株，以相对于生物复合物中的胶原含量的质量比(w/w)给出。可以理解，能够产生生物膜的菌株也可以使用SEM通过检测生物材料中对应于EPS的网络的形成来鉴定。

在本发明方法中用作益生菌组合物的优选细菌属包括乳酸杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)。

本文使用的术语“乳酸菌”或“LAB”是指能够产生乳酸或其至少一种衍生物(包括但不限于乙酸或丙酸)作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的任何细菌。因此，该术语旨在包括丙酸菌(PAB)，其生产丙酸作为碳水化合物发酵产物。乳酸菌的说明性非限制性实例是乳酸杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、乳酸球菌属(Lactococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)和链球菌属(Streptococcus)以及乳杆菌目(LactobacilLales)的气球菌属(Aerococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、酒球菌属(Oenococcus)、四链球菌属(Teragenococcus)、阴道球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weisella)。典型地，乳酸菌选自明串珠菌属(Leuconostoc spp.)的种、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、双歧乳杆菌(Lactobacillus bifidus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)，乳酸乳杆菌(Lactobacillus Lactis)，德氏乳杆菌(Lactobacillus delbreuckii)，植物乳杆菌(Lactobacillus pLantarum)，类植物乳杆菌(Lactobacillus parapLantarum)，卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)。

在优选实施方案中，乳酸菌是乳酸杆菌属的细菌。如本文所使用的术语“乳酸杆菌”是指在NCBI数据库中通过分类学ID 1578描述的属。在特定实施方案中，乳酸菌选自发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌和保加利亚乳杆菌。在更优选的实施方案中，乳酸菌是发酵乳杆菌。术语“发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)”或“发酵乳酸菌(L.fermentum)”是指在NCBI数据库中通过分类学ID 1613描述的乳酸杆菌属的一种。

格氏乳杆菌(L.gasseri)的示例性菌株包括那些保藏为具有美国类型培养物保藏中心(ATCC)保藏号(ATCC No.33323、ATCC No.19992、ATCC No.4484、ATCC No.4479、ATCCNo.4481、ATCC No.4483、ATCC No.4480、ATCC No.4962、ATCC No.9857、ATCC No.4963、ATCCNo.29601、ATCC No.33323的菌株。格氏乳杆菌的一个示例性菌株是格氏乳杆菌JPS(L.Gaseri JPS)。干酪乳杆菌是广泛用于乳制品发酵的乳杆菌属的一种。干酪乳杆菌的示例菌株包括ATCC登录号为PTA-3945的菌株，该菌株也可以称为干酪乳杆菌KE01或干酪乳杆菌KE99。美国专利中描述了干酪乳杆菌PTA-39045。其他示例性菌株包括ATCC No.393、ATCCNo.334、ATCC No.4007、ATCC No.39539、ATCC No.27139、ATCC No.4940、ATCC No.39392、ATCC No.4913、ATCC No.4646、ATCC No.15008、ATCC No.334D-5、ATCC No.PTA-2662、ATCCNo.55825、ATCC No.55826、ATCC No.55841、ATCC No.PTA-5149、ATCC No.7469、ATCCNo.25598、ATCC No.27216、ATCC No.25599、ATCC No.25302、ATCC No.11582、ATCCNo.11982、ATCC No.39595、ATCC No.25180、ATCC No.11578、ATCC No.9595、ATCCNo.14435、ATCC No.12116、ATCC No.25303、ATCC No.13075、ATCC No.29599、ATCCNo.27092、ATCC No.11981、ATCC No.27773、ATCC No.8530、ATCC No.49178、ATCC No.335、ATCC No.14957、ATCC No.7469a、ATCC No.HB-12558、ATCC No.HB-12560、ATCC No.HB-12559、ATCC No.15820、ATCC No.27792、ATCC No.25937、ATCC No.27092-B1、ATCCNo.87074。嗜酸乳杆菌是一种自然存在于人和动物胃肠道的乳酸杆菌属，是正常阴道菌群的一部分。一些嗜酸乳杆菌菌株用于乳制品生产。示例性嗜酸乳杆菌菌株有ATCC No.4356、ATCC No.3154、ATCC No.53544、ATCC No.53544、ATCC No.43121、ATCC No.PTA-4482、ATCCNo.4796、ATCC No.53546、ATCC No.4355、ATCC No.9224、ATCC No.4357、ATCC No.832、ATCCNo.4357D-5、ATCC No.PTA-6751、ATCC No.6820。

在优选实施方案中，益生菌是发酵乳杆菌和/或嗜酸乳杆菌。在更具体的实施方案中，形成益生菌组合物的一部分的益生菌是发酵乳杆菌CECT5716、嗜酸乳杆菌CETC903或两者的组合。

发酵乳杆菌CECT5716是从人母乳中分离的菌株，其已在公开为WO2004003235的PCT申请中公开。

嗜酸乳杆菌CECT903是从人类分离的菌株，可从Colección

deCultivos Tipo免费获得(https://www.cect.org/vstrn.php？Lan＝es&cect＝903)。

如本文所提供的，治疗性组合物包含或可选地调节以下示例性细菌实体的定殖和/或植入：格氏乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌和、短双歧杆菌(B.breve)、长双歧杆菌(B.longum)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、齿双歧杆菌(B.dentium)。

本文中使用的术语“双歧杆菌属细菌(Bifidobacterium)”或“双歧菌属细菌(bifidobacterium)”是指在NCBI数据库中以分类学ID 1678描述的细菌属。合适的双歧杆菌的说明性非限制性实例是乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidium)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)，假链状双岐杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、青少年双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)和角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)。在特定实施方案中，双歧杆菌属的细菌选自短双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和动物双歧杆菌。

在一个实施方案中，益生菌组合物包括单个益生菌种。在另一个实施方案中，当益生菌组合物包含多于一种益生菌物种时，益生菌成分不包含选自植物乳杆菌菌株LMG P-21021-LP01、植物乳杆菌菌株LMG P-21020-LP02、发酵乳杆菌菌株DSM 26955(LF15)或发酵乳杆菌菌株DSM 26966(LF16)。

如本文所用，术语胶原是指通过在中性pH、微离子溶液中使单体胶原反应而产生的自组装生物聚合物。

主要单体溶液是合适的水溶液或非水溶液，取决于单体。在优选的实施方案中，控制溶液的pH，在特定的优选的实施例中，溶液是水溶液，并且pH被缓冲，优选在约7.2至约7.6的范围内。任何能够将pH保持在该范围内的缓冲液都是合适的；优选的缓冲液是磷酸盐缓冲液。主要单体溶液可以包括除单体之外的一种或多种添加剂。添加剂可被选择用于促进聚合、与单体结合以形成共聚物或在聚合物结构上提供涂层等作用。在聚合物为胶原的实施方案中，优选的添加剂是选自透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白的一种或多种的糖胺聚糖，或选自核心蛋白聚糖(decorin)、基膜聚糖(lumican)、双链蛋白聚糖(biglycan)、角膜蛋白聚糖(keratocan)、syndican的蛋白聚糖类及其混合物。可以选择添加剂来改变单体溶液的物理性质。例如，可以加入甘油以调节单体溶液的粘度。在其他实施方案中，可添加表面活性剂以改善基材的润湿性。

胶原构建体可以是无定向胶原凝胶、组织衍生胶原模板或纳米结构人工模板。典型地，胶原构建体包括选自I型胶原、N型胶原及其混合物的胶原。在优选实施方案中，胶原构建物包括I型胶原。在其他实施方案中，胶原构建体包括I型胶原和N型胶原的混合物。优选地，该构建物包含比N型胶原更多的I型胶原，在一个优选实施例中，该构建体包含约四份I型胶原到约一份N型胶原的混合物，在一些实施方案中，该胶原构建物还可以包括选自II型胶原、III型胶原、XI型胶原、IV型胶原及其混合物。自组装胶原原纤维可以是同型的或异型的。在一个实施方案中，所述胶原是I型胶原。

用于构建本文所述胶原组合物的胶原原纤维基质构建块可从多种来源获得，包括例如猪皮。可用作用于分离胶原或用于制备本文所述胶原组合物的胶原组分的含胶原源材料的合适组织有温血脊椎动物粘膜下层或任何其他含细胞外基质的组织。用于制备粘膜下层的合适方法公开于美国专利No.4902508、No.5281422以及美国专利No.5275826中，其公开内容全部通过引用并入本文。根据本文公开的又一个实施方案，含有除粘膜下组织以外的细胞外基质材料的组织可用于获得胶原。由其它细胞外基质材料制备组织以用于获得纯化的胶原或部分纯化的细胞外基质组分的方法对于本领域技术人员是已知的。例如，美国专利No.5163955(心包组织)；美国专利No.5554389(膀胱粘膜下层)、No.099567(胃粘膜下层)、No.6576265(通常为细胞外基质组织)、No.6793939(肝基底膜组织)、919,121(肝基底组织)和WO2001/45765(通常为细胞外基质组织)，其各自通过引用并入本文。在各种其它实施方案中，含胶原的源材料可选自胎盘组织、卵巢组织、子宫组织、动物尾部组织、皮肤组织、骨、肌腱和软骨组织。在一些实施方案中，胶原选自猪皮胶原、牛胶原和人胶原；然而，根据本文的教导，任何合适的含细胞外基质的组织为纯化的胶原或部分纯化的细胞外基质。在本文中，将理解和知晓，其可用作分离基质组分的含胶原的源材料。在一个实施方案中，胶原是从马腱分离的I型胶原。

如上所述，用于制备胶原原纤维基质的一种构建块是低聚胶原。低聚胶原的存在允许构建块自组装到胶原原纤维基质中，提高了组装速度，胶原组合物具有清晰的原纤维微观结构和优异的机械完整性(如刚度)。

在一些实施方案中，胶原原纤维基质的构建块还包括各种比例的非低聚可溶性胶原分子。在一个实施例中，构建块包括端肽胶原(telocollagen)和/或去端肽胶原(atelocollagen)中的一种或两者。在某些实施方案中，构建块包括低聚胶原和去端肽胶原。在其他实施方案中，构建块包括低聚胶原和端肽胶原。在其他实施方案中，构建块包括低聚胶原、端肽胶原和去端肽胶原。低聚胶原、端肽胶原、去端肽胶原和/或其他非低聚可溶性胶原分子的数量可由合成胶原原纤维决定，所述合成胶原原纤由诸如刚度、强度、液体和质量传输、蛋白质水解和/或相容性决定。它可以在聚合开始之前在溶液中配制，以调节基质的一种或多种性质。应当理解，用于特定活性剂的低聚与非低聚可溶性胶原分子的预定比例可以不同于适于用于不同活性剂的比例。

胶原浓度可以以质量/体积或质量/质量表示。胶原含量可以通过本领域已知的任何方法测定，包括但不限于校准的比色测定，如天狼星红(Sirius red)和羟脯氨酸的氨基酸分析。胶原聚合物制剂的粘度受多种因素影响，包括但不限于溶液或分散剂/悬浮液、浓度、分子组成、分子大小、温度和操作条件。粘度测量可以通过本领域已知的任何手段获得，包括但不限于粘度计或流变仪。

本发明步骤(i)中组合物中存在的可溶性胶原的浓度可以变化。在一些实施方案中，胶原以约0.5mg/ml至约500mg/ml的浓度存在。在其他实施方案中胶原以约.05mg/ml至大约100mg/ml浓度存在。在其它实施方案中，胶原以约0.1mg/ml至约100mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，胶原以约0.2mg/ml至约50mg/ml的浓度存在。在其它实施方案中，胶原以约0.3mg/ml至约40mg/ml的浓度存在。在其它实施方案中，胶原以约0.4mg/ml至约30mg/ml的浓度存在。在其它实施方案中，胶原以约0.5mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，胶原以约0.6mg/ml至约10mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，胶原以约0.7mg/ml至约8mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，胶原以约0.8mg/ml至约6mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，胶原以约0.9mg/ml至约4mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，胶原以约1mg/ml至约8mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，胶原以约1.1mg/ml至约2mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，胶原以约1.2mg/ml至约1.8mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，胶原以约1.3mg/ml至约1.7mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，胶原以约1.4mg/ml至约1.6mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，胶原以约1.5mg/ml的浓度存在。

步骤(i)中使用的单体胶原溶液的pH没有特别限制，只要其足够酸性以防止胶原在步骤(ii)之前或与益生菌接触之前自发结合成纤维。在一个实施方案中，单体胶原溶液的pH为约1至4。在一个具体实施方案中，单体胶原溶液的pH为约3至4。在一个实施方案中，单体胶原的pH为约3.0。

在本文描述的实施方案中，合成胶原原纤维基质可以具有通过平均聚合物分子量(AMW)量化的低聚物含量。如本文所述，AMW的调整取决于基质聚合动力学、原纤维微观结构、分子性质和原纤维结构，如原纤维间分支、孔径和机械完整性(例如，基质刚度)。在另一个实施方案中，由平均聚合物分子量量化的预基质组合物的低聚物含量与基质硬度正相关。

在一些实施方案中，包括在步骤(i)中使用的组合物中的非低聚可溶性胶原是还原胶原。如本文所用，“还原胶原”是指已在体外减少以去除或显著减少活性醛的胶原。例如，可以通过用还原剂(例如硼氢化钠)处理胶原在体外还原胶原。

根据本发明的教导，胶原原纤维基质的纯度通过SDS-PAGE、肽图分析、直接在胶原聚合物上的氨基末端序列或在特定酶(细菌胶原酶)或化学(溴氰基)裂解后确定。测定可通过本领域已知的任何方法进行评估，包括但不限于非胶原杂质分析。表征胶原原纤维基质的方法包括阳离子交换HPLC、自然荧光法、LC/MS、MS、动态光散射法、分子筛色谱、粘度测量、圆二色谱、差示扫描量热法、胰蛋白酶法，包括但不限于灵敏度、杂质分析、TEM、SEM、冷冻SEM、共聚焦显微镜、扫描电镜、多光子显微镜和原子力显微镜。

在根据本发明的方法的步骤(i)中益生菌与胶原的比例没有特别限制，只要数量足够，使得在本发明的步骤(iii)之后，在生物复合物中发现足够数量的益生菌微生物，以实现期望的效果。在一个实施方案中，益生菌群与胶原单体以每毫克胶原约10⁴–10¹⁴CFU益生菌微生物的比例接触。在一个实施方案中，益生菌群与胶原单体以每毫克胶原约10⁵–10¹³CFU益生菌微生物的比例接触。在一个实施方案中，益生菌群以每毫克胶原约10⁶–10¹²CFU益生菌微生物的比例与胶原单体接触。在一个实施方案中，益生菌群与胶原单体以每毫克胶原约10⁷–10¹¹CFU益生菌微生物的比例接触。在一个实施方案中，益生菌群以每毫克胶原约10⁸–10¹⁰CFU益生菌微生物的比例与胶原单体接触。在一个实施方案中，益生菌群以每毫克胶原约10⁹–10¹⁰CFU益生菌微生物的比例与胶原单体接触。在一个实施方案中，益生菌群以每1.0mg胶原约6×10⁹CFU益生菌微生物的比例与胶原单体接触。

在步骤ii)中，将步骤i)中获得的混合物在足以使胶原单体自组装成胶原纤维的条件下培养，从而获得含有包埋益生菌的胶原纤维。

聚合动力学可以通过控制pH、温度和单体浓度等参数来调节。在不同的实施方案中，单体浓度如上所述。在优选实施例中，控制溶液流速、溶液粘度和基板旋转速度的参数。通常，在步骤(ii)中形成的溶液具有约6至9、约6.5至8.5、约7至8、约7.2至7.8、约7.4至7.7或约7.6的pH。

通常，控制溶液流速、溶液粘度和基板旋转速度的参数，以产生1s^-1至500000s^-1之间的剪切速率，优选10s^-1到10000s^-1。在一些实施方案中，以约0.05到约1000ml/min，优选约0.1到约100ml/min的恒定速率控制溶液流。在其它实施方案中，溶液粘度被控制在约1比热(MPa-sec)的范围内。在一个实施方案中，粘度为约10比热。

允许本发明方法的步骤(ii)进行预定时间或在连续监测下进行，直到足够百分比的胶原单体组装成纤维。使用公知的方法表征步骤(ii)中形成的结构，以表征胶原原纤维基质的微观结构特征，所述方法包括环境或冷冻台(cryostage)扫描电子显微镜、透射电子显微镜、红外光谱(FTIR)，以及在分子尺度通过X射线衍射。

在一个实施方案中，允许步骤(ii)继续进行，直到形成所述结构，当通过FTIR分析时，所述结构在1030和1078cm^-1处显示峰值，对应于碳水化合物基团的C-O延伸(ν(C-O))和分别由酰胺I、II和III产生的以1650、1550和1240cm-1为中心的宽吸收带。

在一个实施方案中，允许步骤(ii)继续进行，直到形成结构，当通过热重分析(TGA)分析时，该结构在室温和150℃之间有水分损失并在230和600℃之间有胶原分解。可选地或附加地，步骤(ii)之后形成的结构的特征在于重量损失在180和240之间。这适用于由Lf分解产生的Col-Lf生物复合材料。

在一个实施方案中，允许步骤(ii)继续进行，直到形成所述结构，当通过x射线衍射分析分析时，其对应于平伏的(equatorial)分子与分子的平均距离(separation)(即分子间横向间距)。

拉伸、压缩和粘弹性性能可通过流变仪或拉伸测试确定。所有这些方法在本领域中都是已知的。胶原特征和表征胶原特征的方法在ASTM International F3089-14，2014West Conshohoken PA中进行了讨论，其公开内容通过引用全部并入本文。在本发明的某些方面中，合成胶原原纤维基质表现出至少5Pa的刚度。在另一个实施方案中，合成胶原蛋白原纤维基质显示出5Pa和100GPa之间的硬度。刚度也可以称为弹性或线性模量。

在一个实施例中，形成直径在10和900nm之间，更优选在50和800nm之间，更加优选在100nm和700nm之间，进一步优选在150和600nm之间，甚至更优选在200和500nm之间的纤维。

在一个实施方案中，形成显示67nm周期性交错的D型条纹式样的胶原原纤维。

在一个实施方案中，根据本发明的方法的步骤ii)在连续搅拌下进行。通常采用机械搅拌。

在步骤(iii)中，将步骤(ii)中获得的含有包埋益生菌的胶原原纤维保持在足以由益生菌形成胞外多糖(EPS)的条件下，直到生物材料中的EPS含量相对于以糖含量测定的生物材料的胶原含量为至少2％(w/w)。

通常，“足以形成胞外多糖(EPS)的条件”是适合于包埋在胶原纤维中的益生菌增殖的条件。这通常需要将胶原纤维保持在培养基中，该培养基足以使包埋在胶原纤维中的益生菌生长。在步骤(iii)中使用的合适的培养基包括能够产生约10⁹cfu/mL的细胞浓度的任何培养基。在优选实施方案中，当益生菌群含有乳酸菌时，培养基是Man、Rogosa和Sharpe(MRS)培养基、强化梭菌培养基(Reinforced Clostridial Medium，RCM)、M17或脑心浸液(Brain Liver Infusion，BHI)、HANK’s培养基、APT培养基、LM17培养基、GM17培养基和Elliker培养基。在其他实施方案中，当益生菌群包含双歧杆菌时，步骤(iii)中使用的培养基包括MRS、胰蛋白胨植物蛋白胨酵母(Tryptone Phytone Yeast，TPY)、葡萄糖血肝(BL)、Columbia(CLB)、肝半胱氨酸乳糖(Liver cysteine lactose，LCL)、改良MRS(mMRS)、改良MRS和血液(mMRS+血液)、含血的改良BL(mBL)、改良RCM(mRCM)、RCPB等。MRS培养基和其他适合于乳酸菌和双歧杆菌培养的培养基的描述可在Handbook of Culture Media for FoodMicrobiology,Vol.34,edited by Janet E.L.Corry,G.D.W.Curtis,Rosamund M.Baird.中找到。

根据需要进行步骤(iii)，直到生物复合物中的糖含量相对于胶原含量为至少2％(w/w)。使用本领域已知的任何方法测定反映生物复合物中EPS含量的糖含量，以测定样品中的总糖含量。在优选实施方案中，使用标准苯酚-硫酸法测定生物复合物中的糖含量(DuBois，K.a.等人，Anal.Chem.1956，28350)。在一个实施方案中，允许步骤(iii)继续进行，直到生物复合物中的糖含量为至少2.5％(w/w)、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、最少5％、至少5.5％、至少6％、至少6.5％、最少7％、至少7.5％、至少8％、至少8.5％、至少9％、至少9.5％、最多10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％或更多，所有这些值均以相对于生物复合物中的胶原含量的w/w表示。应当理解，步骤(iii)的进展也可以通过检测生物材料中对应于EPS网络的形成来通过SEM监测。

人们将理解，根据本发明的方法产生了生物材料，其中包埋在胶原支架中的大量益生菌保持存活。在本发明方法的步骤(iii)之后，此处提及的益生菌“保持存活”意味着所述益生菌可被培养。虽然这并不意味着在步骤(iii)之后获得的生物材料中的每一种益生菌细胞都保持存活，但可以将其解释为可检测数量的益生菌可被培养。

在不同的实施方案中，在步骤(iii)之后，材料中至少100％、至少99.9％、至少99.8％、至少99、7％、至少99.6％、至少99.5％、至少99.4％、至少99.3％、至少99.2％、至少99.1％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％或至少50％的益生菌在25℃和60％的相对湿度下可存活至少6个月，例如至少24个月、例如至少20个月、例如至少16个月、例如至少12个月、例如至少8个月、例如至少5个月、例如至少4个月、例如至少1个月、例如至少14天、或者例如14天到24个月、例如14天到16个月、例如14天到8个月、例如14天到4个月、例如14天到2个月、例如14天到1个月。

本领域中已知的用于确定益生菌群的活力的任何方法可用于确定生物材料中的活性益生菌的含量，使用电致变色多金属氧酸盐(polyoxometalate，POM)(González，N.等人，Chem.Common.2015，51)。一旦被还原，POM在紫外-可见光谱中呈现出以820nm为中心的吸收带。

本发明的生物复合物

本发明的作者已经发现，如上所述的方法产生了生物复合材料，该生物复合材料即使在苛刻条件下储存后，在保持其中所含益生菌的活力方面也显示出某些意想不到的特性。

因此，在另一方面，本发明涉及可通过本发明的方法获得的生物材料。

在另一方面，本发明涉及包含胶原支架、益生菌和胞外多糖(EPS)的生物材料。在一个实施方案中，胶原支架包括直径在100和500nm之间的原纤维。在另一个实施方案中，胶原支架包括以67nm周期性交错的D型条纹式样为特征的原纤维。在另一个实施方案中，生物材料中的糖含量相对于所测量的生物材料的胶原含量为至少2％(w/w)。

术语“益生菌”已在根据本发明的生物材料的制备方法的上下文中详细解释，并在根据本的生物材料上下文中以相同的含义使用。在优选实施方案中，所述益生菌是乳酸菌、双歧杆菌或两者的组合。在更优选的实施方案中，乳酸杆菌选自发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌和格氏乳杆菌，或其中双歧杆菌选自短双歧杆菌、长双歧杆菌和齿双歧杆菌或其任何组合。在更优选的实施方案中，益生菌是发酵乳杆菌和/或嗜酸乳杆菌，更具体地，发酵乳杆菌CECT5716和/或亲酸乳杆菌CETC903或其组合。

在生物材料中，包埋在胶原支架中的大量益生菌在不同的实施方案中保持存活，生物材料中至少100％、至少99.9％、至少99.8％、至少99.7％、至少99.6％、至少99.5％、至少99.4％、至少99.3％、至少99.2％、至少99.1％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％或至少50％的益生菌在25℃和60％相对湿度下可存活至少6个月，例如至少24个月、例如至少20个月、例如至少16个月、例如至少12个月、例如至少8个月、例如至少5个月、例如至少4个月、例如至少1个月、例如至少14天、或者例如14天到24个月、例如14天到16个月、例如14天到8个月、例如14天到4个月、例如14天到2个月、例如14天到1个月。

本文中使用的术语“胶原支架”是指当置于微酸、中性或微碱介质中时，胶原单体自发聚集而形成的基质。“胶原单体”一词已在上述获得生物复合物的方法中详细解释，并同样适用于本例。在优选实施方案中，胶原支架由I型胶原获得。

生物复合物中益生菌的合适浓度为每克胶原至少6×10¹²CFU。

在一个实施方案中，胶原支架的特征在于，当通过FTIR分析时，其在约1030和1080cm^-1处显示峰值，对应于碳水化合物基团的C-O延伸(ν(C-O))和宽吸收带，其中心位于1650、1550和1240cm^-2处，分别由酰胺I、II和III而得。在另一个实施方案中，胶原支架的特征在于，当通过X射线衍射分析时，其显示以约q＝13.25nm^-1为中心的宽峰和以q＝5.46nm^-1的布拉格峰(Bragg peak)，分别导致0.47和1.15nm的d间距。在另一个实施方案中，胶原支架的特征在于，当通过热重分析分析时，其在室温和150℃之间发生水分损失并且在230和600℃之间发生胶原分解。

本文使用的术语“胞外多糖”是指由糖残基组成的高分子量天然聚合物，并由微生物分泌到其环境中。胞外多糖可以互换地称为胞外多糖类(EPS)。EPS建立了生物膜的功能和结构完整性，被认为是决定生物膜理化性质的基本成分。EPS占生物膜总有机物的50％至90％。然而，一些胞外多糖也包含非碳水化合物取代基(如乙酸酯、丙酮酸、琥珀酸和磷酸)。示例性胞外多糖包括但不限于乙聚糖(木醋杆菌(Acetobacter xylinum))、藻聚糖(alginate)(棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii))、纤维素(木醋菌(Acetobacterxylinum))、壳聚糖(毛霉菌属(Mucorales sp.))、可得然胶(粪产碱菌杆菌(Alcaligenesfaecalis var.myxogenes))、cyclosophorans(农杆菌属(Agrobacterium sp.)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)和黄单胞菌属(Xanthomonas sp.))、葡聚糖(肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、葡聚糖明串珠菌(Leuconostoc dextranicum)和希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii))，emulsan(钙醋酸不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus))、半乳糖多糖(galactoglucopolysaccharides)(无色杆菌属(Achromobacter sp.)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)和菌胶团菌属(Zooglea sp))、结冷胶(Aureomonas elodea和少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis))、葡糖醛酸(glucuronan)(苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti))、N-乙酰氨基葡糖(表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))、N-乙酰肝素前体(N-acetyl-heparosan)(大肠杆菌(Escherichia coli))、透明质酸(马链球菌(Streptococcus equi))，吲哚-3-硫酸(indican)(印度贝氏固氮菌(Beijerinckia indica))、开菲尔多糖(希氏乳杆菌)、香菇多糖(香菇(Lentinus elodes))、左聚糖(粘性产碱杆菌(Alcaligenes viscosus)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、普鲁兰多糖(出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans))、小核硬葡聚糖(scleroglucan)(罗氏白绢菌(Sclerotium rolfsii)、翠雀小核菌(Sclerotium delfinii)和Sclerotium glucanicum)、裂褶菌多糖(裂褶菌(Schizophylum communie))、stewartan(玉米细菌性枯萎病菌(Pantoae stewartii subsp.Stewartiii))，琥珀酰聚糖(粪产碱杆菌、苜蓿中华根瘤菌)，黄原胶(黄单胞菌campestris)和韦蓝胶(welan)(产碱杆菌属(Alcaligenes sp.))。

在根据本发明的生物复合物中发现的合适的EPS包括由形成益生菌细胞群的一种或多种益生菌菌株产生的任何EPS。在益生菌细胞群包括乳酸菌(LAB)的特定情况下，形成生物复合物一部分的EPS可以是同多糖(HoPS)、杂多糖(HePS)或其混合物。

根据权利要求14所述的生物材料，其中所述HoPS选自α-葡聚糖、β-葡聚糖和β-果聚糖，并且所述HePS包含选自N-乙酰基葡萄糖胺(GluNAc)、N-乙酰-半乳糖胺(GalNAc)、岩藻糖、葡萄糖醛酸、甘油和甘露糖的D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖和N-乙酰化单糖中的任何一种。

HoPS由一种类型的组成单糖(D-吡喃葡萄糖或D-呋喃果糖)组成，包括但不限于α-葡聚糖、β-葡聚糖和β-果聚糖，HePS包括选自N-乙酰基葡萄糖胺(GluNAc)、N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、岩藻糖、葡糖醛酸、甘油和甘露糖的D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖和N-乙酰化单糖中的任何一种。

在其他实施方案中，形成根据本发明的生物复合物的一部分的EPS包括RuasMadiedo等人(International Dairy Journal，2002，12，163-171)的表2中总结的一种或多种HoPS，其包括：

-α-D-葡聚糖，包括葡聚糖、突变聚糖(mutan)、交替糖(alternan)，

-β-D-葡聚糖，

-果聚糖，包括左聚糖和菊粉类

-聚半乳糖

HePS由重复亚基的主链组成，这些亚基是支链的(在C2、C3、C4或C6位置)或非支链的，并且由三至八个单糖、单糖衍生物或取代的单糖组成。

在一些实施方案中，形成根据本发明的生物复合物的一部分的HoPS和HePS包括deVuyst等人(International Dairy Journal，2001，11687-707)表1中所示的任何分子，其全部内容通过引用并入本文。这些包括HoPS和HePS，其中重复单元包括不同组合的葡萄糖(Glc)、GlcNAc(N-乙酰葡萄糖胺)、半乳糖、(Gal)、GalNAc(N-乙基半乳糖胺)、鼠李糖(Rha)和岩藻糖(Fuc)，其中重复单元是三糖、四糖、五糖、六糖、五糖和八糖。

在其他实施方案中，形成根据本发明的生物复合物的一部分的HoPS和HePS包括Vaningelgem等人(Applied and Environment Microbiology，2004，70:900-912)表4中所示的任何分子，其内容通过引用全部并入本文。这些包括由半乳糖和葡萄糖组成的EPS(第一组)、半乳糖、葡萄糖和鼠李糖(第二组)、半乳糖、葡萄糖和N-乙酰半乳糖胺(第三组)、半胱糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和鼠李糖(第四组)、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半胱糖胺和鼠李糖(第五组)或半乳糖，葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖(第六组)。

在其他实施方案中，形成根据本发明的生物复合物的一部分的HePS包括具有RuasMadiedo等人(International Dairy Journal，2002，12，163-171)表2中总结的任何重复单元的HePS，其内容通过引用并入本文。

在一个实施方案中，形成根据本发明的生物复合物的一部分的EPS选自葡聚糖、左聚糖、突变糖、交替糖、罗伊氏糖(reuteran)和菊粉类。在另一个实施方案中，EPS是葡聚糖、左聚糖或其组合。

本发明的生物复合物中EPS的含量没有特别限制。EPS的含量可以通过测量生物复合物中的糖含量来确定，所述生物复合物使用本领域已知的任何方法来测量样品中的总糖含量。在一些实施方案中，生物复合物中的糖含量可以为至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、最少4％、至少4.5％、最低5％、至少5.5％、至少6％、至少6.5％、最小7％、至少7.5％、至少8％、至少8.5％、至少9％、至少9.5％、、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％或更多，所有这些值指的是相对于生物复合物中的胶原含量的质量比(w/w)。

本发明生物复合物的医疗用途和药物组合物

本发明的作者已经发现，本发明的生物复合物可以附着到猪粘蛋白上，所述粘附部分依赖于溶液中胶原的存在。此外，本发明的生物复合物还能够通过将病理条件中出现的pH值5改变为对应于健康状态的pH值4，恢复出现在模拟细菌性阴道炎液体的液体健康状态。在不受到任何理论约束情况下，这种pH值的变化肯定是由于益生菌分泌的乳酸，这与先前的证据一致，即细菌在被包埋到胶原基质中时，仍保持活性。有趣的是，使用Lf和不使用胶原的La的pH值下降要慢得多，并且没有达到4.0的健康pH值。

因此，在另一方面，本发明涉及用于医学的根据本发明的生物材料。在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗阴道菌群失调、优选阴道感染的根据本发明的生物材料或生物复合物。在另一方面，本发明涉及一种用于治疗或预防受试者阴道菌群失调，更优选阴道感染的方法，其包括施用根据本发明的生物材料或生物复合材料。

如本文所用，“预防(preventing)”或“预防(prevention)”指的是由于方法的作用(例如，如本文所述的益生菌和/或益生元的施用)而未发生疾病状态的任何方法。在一个方面，可以理解的是，预防也可以意味着该疾病未达到未治疗对照中发生的程度。例如，与未治疗的对照相比，疾病频率的发生可以减少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。因此，疾病的预防包括相对于未经治疗的受试者(例如，未接受本文所述的益生菌和/或益生元的受试者)降低受试者发生疾病的可能性。

“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指减少疾病或病症影响的方法。治疗也可以指减少疾病或病症本身的方法，而不仅仅是症状。治疗可以是治疗前水平的任何降低，并且可以是但不限于完全消除疾病、病症、或疾病或病症的症状。因此，在所公开的方法中，治疗“可指确定疾病或疾病进展的严重程度降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，如果与同一受试者或对照受试者的治疗前水平相比，感染受试者疾病的一个或多个症状减少10％，则用于减少阴道感染影响的公开方法被视为治疗。因此，与天然或对照水平相比，减少量可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或两者之间的任何减少量。要理解并在本文设想，“治疗”不一定指疾病或病症的治愈，而是指疾病或病症(如细菌性阴道炎)的前景的改善。

术语“菌群失调”或“菌群失调病症”被定义为微生物群通过(a)微生物群自身含量或数量的定性和定量变化，(b)其代谢活动的变化，和/或(c)其局部分布的变化而产生有害影响的状态。具体而言，阴道生态失调被定义为健康状态的异常。在这种情况下，健康状态被定义为对性传播疾病的易感性相对较低的状态。人们普遍认为，乳酸杆菌的活性有助于通过产生乳酸来保护阴道环境免受病原体的侵害，从而维持这种低敏感性，从而导致低pH。因此，阴道菌群失调的特征之一是存在相对高的pH。

在一个实施方案中，阴道菌群失调是阴道感染。

本文使用的术语“阴道感染”是指由病原体在阴道中不期望的生长引起的病症或疾病，所述病原体选自：光滑念珠菌(Candida glabrata)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、克鲁塞念珠菌(Candida krusei)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、阴道嗜血杆菌(Gardnerella vaginalis)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、大肠杆菌、单纯疱疹(Herpes simplex)和杜克雷嗜血杆菌(Hemophilus ducreyie)。该术语包括但不限于念珠菌病、阴道炎、外阴阴道炎和细菌性阴道炎。

在一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料用于治疗选自细菌性阴道炎、滴虫性阴道炎或念珠菌病的感染。在又一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料用于治疗由细菌、酵母或原生动物寄生虫引起的感染。

在一个实施方案中，感染是由外阴阴道区域的酵母过度生长引起的，在这种情况下，根据本发明的组合物用于“阴道酵母菌感染”。阴道酵母菌感染通常由念珠菌酵母过度生长引起，如但不限于共生生物白色念珠菌(Candida albicans)。与阴道酵母菌感染有关的其他念珠菌种类包括但不限于光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁塞念珠菌和热带念珠菌。阴道酵母菌感染可被称为“阴道念珠菌病”或“念珠菌性阴道炎”。阴道酵母菌感染也可由非念珠菌酵母引起，如毛孢菌属(Trichosporon species)，如白吉利丝孢酵母(TrichosporonBeigeli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。阴道酵母菌感染的症状是阴道刺激、分泌物以及阴道和外阴的强烈瘙痒。与BV一样，广谱抗生素、杀精剂、激素和其他尚未完全了解的因素可能会破坏正常菌群，导致阴道酵母菌感染。阴道酵母菌感染在免疫功能低下的受试者中也很常见。

在另一个实施方案中，所述感染是细菌性阴道炎。

术语“细菌性阴道炎”(缩写为“BV”)和类似术语应广义理解为女性受试者阴道菌群组成与基础、参考或“正常”阴道菌群构成相比的变化。BV不限于特定女性受试者或女性受试人群中观察到的特定阴道菌群组成或任何特定症状。本文定义的术语“阴道炎”包括选自细菌性阴道炎、真菌性阴道炎或毛滴虫阴道炎的阴道炎，优选地，由阴道嗜血杆菌、脆弱拟杆菌(Bacterioid fragilis)、阴道毛滴虫、白色念珠菌、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、金黄色链球菌(Streptococcus aureus)、葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、淋病奈瑟菌、大肠杆菌、阴沟杆菌(Enterobacter cloacae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)等。在一个实施方案中，细菌性阴道炎是由选自阴道嗜血杆菌或活动弯曲杆菌属(Mobiluncus spp.)的正常阴道菌群过度生长引起的。

本文提供了使用益生菌阴道制剂的方法。例如，在一些实施方案中，益生菌阴道制剂用于酸化或维持阴道环境的酸度。因此，益生菌阴道制剂可用于调节酸化的方法，包括增加酸度、维持酸度或降低阴道酸度或pH。在一些实施方案中，益生素阴道制剂用于建立或改善阴道菌群，例如，通过增加阴道菌群中乳酸杆菌的水平或降低酵母(如念珠菌酵母)的水平。益生菌阴道制剂也可用于治疗、减轻、预防或降低受试者的泌尿生殖道感染或炎症病症(包括阴道炎、尿路感染、阴道萎缩和术后炎症)的可能性。例如，益生菌阴道制剂可用于治疗、减轻、预防或减少受试者的阴道炎或其症状(如阴道干燥、灼热或瘙痒)的可能性的方法。在上述方法的背景下，阴道炎可能是各种病因，例如但不限于BV、酵母感染或阴道萎缩。阴道炎或与阴道炎相关或类似阴道炎的症状也可能是未知病因。在另一个实施方案中，益生菌阴道制剂可用于治疗、减轻、预防或减少各种病因的阴道干燥的可能性的方法，所述病因例如但不限于BV、酵母感染、创伤、药物副作用或阴道萎缩。在另一个实施方案中，益生菌阴道制剂可用于治疗、减轻、预防或降低泌尿生殖道炎症的可能性的方法，所述炎症包括各种病因的外阴阴道炎症，所述病因例如但不限于感染、刺激、创伤，例如手术后或分娩创伤。益生菌阴道制剂的一种或多种用途可被描述为适于改善、维持或实现阴道健康。

使用益生菌阴道制剂的过程或方法包括以有效量向受试者阴道施用益生菌的阴道制剂的步骤。有效量可根据预期效果、特定配方、剂型、给药方案和其他因素而变化。例如，胶囊单位剂型的制剂可以以每天1-5粒的量给药，包括例如每天1或2粒。给药时间可为至少1天、至少3天、至少6天，或按照医生的规定，或直到症状得到改善或减轻。

根据本发明的治疗方法包括将有效治疗量的本发明的生物材料或益生菌生物复合物施用给需要其的受试者。

本文使用的术语“有效治疗量”指的是本发明的细菌或培养物提供所需效果的足够量，通常由本发明的菌或培养物本身的特性和待达到的治疗效果等因素决定。它还将取决于待治疗的受试者、所述受试者所患疾病的严重程度、所选择的剂型等。因此，本发明中提到的剂量必须仅被视为本领域技术人员的指南，其必须根据上述变量调整剂量。在一个实施方案中，有效量导致正在治疗的疾病的一个或多个症状的改善，例如，受试者体内缺乏的金属水平的正常化。

术语“受试者”在此用于描述人或动物。在本产品、制剂和方法的实施方案中，“受试者”指经阴道施用组合物的雌性哺乳动物，如人。女性受试者可能患有或可能患上某种疾病或病症，例如泌尿生殖道感染，如阴道炎。例如，女性受试者可能因其病史、抗生素使用、杀精剂使用或生活方式(例如性习惯)而有复发泌尿生殖道感染或阴道炎的风险。女性受试者也可能有或希望预防泌尿生殖道感染或阴道炎或其症状、疑似泌尿生殖道传染或疑似阴道炎、以及泌尿生殖道类似感染或阴道炎类症状，即使没有正式诊断或全面性(full-blown)泌尿生殖道感染或阴道炎。

为了施用本发明的生物材料或生物复合材料，必须将其配制成适于阴道给药的产品，即阴道产品或阴道制剂。因此，在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包含根据本发明的生物材料和适于阴道给药的药学上可接受的赋形剂。

术语“阴道产品”或“阴道制剂”在本文中用于指适合阴道施用的剂型物质组合物。术语“阴道益生菌产品”和“阴道益生菌制剂”指适合阴道施用的剂型物质组合物，包括益生菌。阴道制剂的一些实例是栓剂(包括但不限于胶囊和片剂)、卫生棉条、溶液、粉末、软膏、乳膏和气雾剂泡沫。

术语“阴道给药”包括“经阴道给药”、“阴道内给药”，指的是给药途径，其中物质、组合物或制剂在阴道腔或外阴阴道区域内或通过阴道应用到泌尿生殖道的其他部分。

用于局部施用的益生菌组合物可以以乳膏或软膏的形式施用。因此，它们理想地包含源自植物、海洋或动物来源的油性物质。合适的液体油包括饱和、不饱和或多不饱和油。举例来说，不饱和油可以是橄榄油、玉米油、大豆油、菜籽油、棉籽油、椰子油、芝麻油、向日葵油、琉璃苣籽油、香菇籽油、血红素籽油、鲱鱼油、鱼肝油、鲑鱼油、亚麻籽油、小麦胚芽油、月见草油或其任何比例的混合物。这些乳膏或软膏可进一步包含多不饱和脂肪酸。在一个或多个实施方案中，所述不饱和脂肪酸选自ω-3和ω-6脂肪酸。这种多不饱和脂肪酸的实例是亚油酸和亚麻酸、γ-亚油酸(GLA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。已知这种不饱和脂肪酸具有皮肤调理作用，这有助于组合物的治疗益处。因此，组合物可包含至少6％的选自ω-3油、ω-6油及其混合物的油。精油也是可用的，其也被认为是治疗活性油，其含有活性生物发生的分子，并且在局部应用时发挥治疗作用，其可以设想与组合物中益生菌混合物的有益效果协同。另一类治疗活性油包括液体疏水植物衍生油，已知其在局部应用时具有治疗益处。也可以使用硅油，并且由于其已知的皮肤保护和闭塞特性，硅油是理想的。合适的硅油包括非挥发性硅氧烷，例如聚烷基硅氧烷、聚芳基硅氧烷和聚醚硅氧烷共聚物、聚二甲基硅氧烷(二甲基硅氧烷)和聚(二甲基硅氧烷)-(苯基硅氧烷)共聚物。这些选自含有约3至约9，优选约4至约5个硅原子的环状或线性聚二甲基硅氧烷。也可以使用挥发性硅氧烷如环甲硅氧烷。硅油也被认为是治疗活性油，因为它们具有阻隔性和保护性。

对于阴道应用，益生菌组合物可以是阴道胶囊或阴道片剂的形式。“胶囊”一词是指硬壳药物胶囊。胶囊由主体和盖组成，并且可以包括含有益生菌组合物的填充制剂。适用于根据本发明使用的胶囊包括但不限于可从Capsugel获得的含有普鲁兰多糖、卡拉奇多糖和氯化钾的NPcapsCR′，以及美国专利No.8105625号和美国专利申请公开No.2005/0249676中描述的胶囊，根据本发明使用的胶囊包含分子量在约50至500kDa、100至400kDa，约150至300kDa和优选约180至250kDa之间的普鲁兰多糖。在另一方面，根据本发明使用的胶囊包含以重量计约50％至约100％的普鲁兰多糖(未填充胶囊)。在其它方面，所述胶囊包含以重量计约60％至90％或70％至90％、或80％至90量％的普鲁兰多糖。优选地，所述胶囊包含以重量计约85％至90％的普鲁兰多糖。根据本发明使用的胶囊可进一步包括(除普鲁兰多糖外)一种或多种胶凝剂(例如，水胶体或多糖，如海藻酸钠、琼脂胶、瓜尔胶、角豆胶、卡拉胶、塔拉胶、阿拉伯胶、果胶、黄原胶等)；包含阳离子如K、Li、Na、NH4、Ca、Mg的盐；和/或表面活性剂，如十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠、苯扎氯铵、苯甲酰氯、十六烷基三甲基酯、脂肪酸糖酯、单油酸甘油酯、聚氧乙烯山梨醇酯脂肪酸酯、聚乙烯醇、二甲基聚硅氧烷、山梨醇酸酯或卵磷脂。

根据本发明使用的胶囊可进一步包含一种或多种增塑剂(例如甘油、丙二醇、聚乙烯醇、山梨醇、麦芽糖醇等)；溶解增强剂(例如麦芽糖、乳糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇等)；增强剂(例如聚葡萄糖、纤维素、麦芽糊精、明胶、树胶等)；在一个优选实施方案中，胶囊包含以重量计85％至90％的普鲁兰多糖、1.0％至1.5％的氯化钾、0.1％至0.4％的卡拉胶、量以重量计为0.1％至0.2％的一种或多种表面活性剂、量以重量计为10％至15％的水。

益生菌阴道益生菌制剂的剂型适用于阴道给药，并被选择为递送有效量的阴道益生素制剂。在一些实施方案中，益生菌阴道制剂以粉末形式提供，并且可以通过合适的施用器施用。在这种情况下，益生菌阴道制剂可以作为包括施用器的试剂盒的组成部分提供。益生菌阴道制剂可预先包装在涂抹器中，或作为试剂盒的单独项目提供。在一些其他实施方案中，将益生菌阴道应用并入阴道卫生棉条中。包括卫生棉条的套件可选地包括一个或多个施用器。合适的剂型还包括阴道栓剂，包括胶囊和片剂，可通过使用或不使用合适的施用器施用。剂型的选择取决于多种因素。例如，所选择的剂型应确保制剂成分在储存期间的稳定性、方便的给药以及制剂在阴道环境中的快速递送。特别是，益生菌阴道制剂的剂型不应不利地影响活性或允许制剂的益生菌成分的过早(给药前)重建。为此，剂型不应含有水。同时，给药时，剂型应允许制剂成分在阴道环境中快速分散或溶解。例如，如果选择片剂或胶囊作为剂型，其配方应能在进入阴道时迅速分解。

此外，监督从业者认为适当时，特别是考虑到疾病状态的任何变化或任何不良副作用，给药可以是慢性或间歇性的。“慢性”给药是指以连续方式给药组合物，而“间歇”给药则是指中断治疗。组合物中菌株的菌落形成单位(CFU)的有效量将由本领域技术人员确定，并取决于最终配方。例如，当在没有任何其他活性剂的情况下口服给药时，本发明菌株的总量以单剂量存在于组合物中，根据当前立法，其有效日剂量为10⁷-10¹²CFU，优选10⁹-10¹¹CFU，并且当经阴道或直肠给药时，其量为10³至10¹²CFU、优选10⁵至10¹⁰CFU的有效日剂量。术语“菌落形成单位”(“CFU”)定义为琼脂平板上微生物计数显示的细菌细胞数。食品补充剂通常含有10⁷至10¹²CFU/g的益生菌菌株。在一个具体实施方案中，本发明的组合物是每日剂量的食品补充剂，包括10⁹-10¹¹cfu/g。术语“药物产品”在本说明书中具有广泛的含义，包括包含活性成分的任何组合物，在这种情况下，本发明的菌株优选为组合物形式，以及药学上可接受的赋形剂。术语“药物产品”不限于药物。本文中使用的术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合与受试者(例如人)的组织接触使用的化合物、材料、组合物和/或剂型，没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。每种载体、赋形剂等在与制剂的其他成分相容的意义上也必须是“可接受的”。合适的载体、赋形剂等可在标准药物文本中找到。

本发明通过以下方面来定义：

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下面通过以下示例来解释本发明，这些示例仅被解释为说明性的，而不是限制本发明的范围。

实施例

实验部分

试剂、细菌来源和胶原：高纯度试剂购自Sigma-Aldrich。所有溶液均用超纯去离子水(18MΩ·cm)制备。发酵乳杆菌(Lf，CECT5716)粉末从Biosearch Life S.A.获得。嗜酸乳杆菌(La，CECT903，Moro 1900)从CECT(Colección

de Cultivos Tipo)购买。De Man Rogosa-Sharpe(MRS)培养基购自Thermo Scientific。如Tampieri,A.等人(J.Biomed.Mater.Res.，2003，67A，618)所述，使用OPOCRIN S.p.A.(Corlo di Formine，摩德纳，意大利)的标准化制造方法从马腱中提取I型胶原。

乳酸杆菌细菌在胶原基质中的包埋：将La和Lf分别接种于100毫升MRS肉汤中，并在37℃下连续搅拌(180rpm)培养24小时。随后，通过离心(10000g，5分钟)收集细菌，用生理盐水(0.9％NaCl水溶液)洗涤，并再悬浮在磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中，以获得具有2·10⁹菌落形成单位(CFU)mL^-1的细菌悬浮液。然后，将3ml细菌悬浮液与1mL胶原溶液(1.5mgmL^-1，pH 3.0)混合，在益生菌存在下引发自组装胶原纤维的3D基质的形成。在37℃下，在连续搅拌(180rpm)下，将含有包埋细菌的胶原基质保持30分钟，然后用10mL生理盐水(0.9％NaCl水溶液)洗涤以除去未包埋细菌。

col-Lf和col-La生物复合物的制备：然后将含有包埋细菌的胶原基质在10mLMRS肉汤中在37℃下培养6小时。将所得材料(称为col-Lf和col-La)用生理盐水洗涤并储存，直到进一步的体外表征。

通过场发射扫描电子显微镜(Field Emission Scanning Electron Microscopy，FESEM)对col-Lf和col-La生物复合物的体外表征：胶原基质(含和不含益生菌)以及col-La和col-Lf生物复合物在4℃下固定在1mL含有2.5％戊二醛的二甲胂酸缓冲液(0.1M，pH7.4)中。24小时后，用碳酸钙缓冲液洗涤样品3次(在4℃下30分钟)。样品在黑暗中用四氧化锇溶液(1％v/v)染色2小时，然后用Milli-Q水反复冲洗以除去过量的锇。然后在室温下用50％、70％、90％和100％(v/v)的乙醇/水混合物将样品脱水各20分钟，最后一次浓缩重复三次，并在CO₂临界点干燥。最后，用导电粘合剂将脱水样品安装在金属短柱上，覆盖一层薄碳膜，并使用FESEM(Zeiss Super40V，格拉纳达大学科学仪器中心)进行分析。

通过傅里叶变换红外光谱(Fourier-Transform Infrared，FTIR)对col-Lf和col-La生物复合物的非原位表征：在衰减全反射(Attenuated total reflection，ATR)配置下，在Bruker Tensor 27光谱仪上收集FTIR光谱，通过累积覆盖4000-400cm^-1光谱范围的100次扫描，分辨率为3cm^-1。

通过热重分析(Thermogravimetry analyses，TGA)对col-Lf和col-La生物复合物进行体外表征：使用Mettler–Toledo TGA/DSC1热天平(Mettler–Toledo，格拉纳达大学科学仪器中心)以5℃/min高达900℃的氮气流进行TGA。

通过同步辐射X射线衍射对col-Lf和col-La生物复合物的体外表征：在PaulScherrer Institut(Villigen，瑞士)瑞士光源(Swiss Light Source，SLS)的X04SA-MS光束线上，在直径为1.0mm的玻璃毛细管上收集数据，该毛细管填充干胶原或胶原/细菌基质。光束能量设置为16keV(工作波长，

)。借助位置敏感单光子计数MYTHEN II探测器收集数据。在FTIR、TGA和X射线衍射表征之前，将样品在-40℃(LyoQuest，Telstar)下冷冻干燥过夜。

EPS定量：标准苯酚-硫酸法用于EPS定量(DuBois等人，Anal.Chem.1956，28350)。将样品浸入含有500μL苯酚(5％在水中)和2.5mL硫酸的1mL的生理盐水中，并在30℃水浴中保持20分钟。在490nm处测量每个样品的吸光度。使用从校准曲线获得的吸收系数确定EPS浓度，并以mg糖/g胶原表示。使用葡聚糖和左旋糖的混合物进行校准曲线，它们是乳酸杆菌分泌的EPS的最具特征的成分。每个样品重复三次进行测试。

体外生存能力测定：按照制造商的说明，使用Baclight^TM细菌生存能力试剂盒(Thermo Fisher)对Col-Lf中的细菌生存能力进行定性评估。该检测包括将膜不透性DNA结合染色剂即碘化丙啶(propidium iodide，PI)与膜透性DNA结合复染色剂SYTO9组合，分别对死细菌、以及活的和死的细菌进行染色。使用配备60×油浸物镜的Nikon Eclipse Ti-EA1显微镜采集共焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscopy，CSLM)图像。使用NIS Elements软件分析图像。为了获取SYTO 9信号，使用488nm激光和505–550nm发射滤光片。对于PI，使用561nm激光器和575nm长通发射滤波器。用39个z截面获得三维图像的重建。

col-Lf和col-La在4℃下储存后的细菌活性：胶原-益生菌生物复合物和相应的对照物(裸益生菌)在4℃下储存2周、1个月和2个月。在此时间之后，将样品和对照分别添加到10mL MRS肉汤培养基中，并在37℃和180rpm下孵育1小时。然后，用生理盐水(0.9％NaCl水溶液)洗涤所有样品两次(3000g，5分钟)。随后，加入10mL 1/10稀释的MRS肉汤培养基，并在37℃和180rpm下培养。使用1/10稀释的MRS肉汤以避免非稀释MRS肉汁的自动还原能力。在预定时间：0、2、4、6、8和24小时，从每个培养物的上清液中依次收集1mL的等分试样。

离心等分试样(3000g，5min)以除去任何残留细菌。通过pH测量监测封装的活性物质和相应对照的发酵活性。为了证实胶原细菌系统相对于非包埋细菌具有更高的生存能力，我们应用了我们开发的程序，该程序将细菌增殖与其对电致变色多金属氧酸盐(POM)[P₂Mo^VI O₆2]^6-的还原能力相关联(González等人，Chem.Common.2015,51)。将190μL各等分试样加入含有10μL10mM POM溶液的孔中。样品在室温下置于黑暗中。然后，用UV光(365nm)照射它们10分钟，然后在Tecan的纳米量子板读取器中测量吸光度。在室温下储存的材料(新鲜样品)上进行相同的实验。此外，使用游离col的对照来确认该材料本身不能降低pH或降低POM。每个等分试样重复三次进行测试。

细菌粘附的体外测定：col-益生菌和益生菌的粘附根据先前报告的方法进行测定，但稍作修改[25,26]。简而言之，将Maxisorp板(Nunc，Roskilde，丹麦)的孔与100μL 5mgmL^-1猪粘蛋白(Sigma-Aldrich)在pH7.4的PBS溶液在4℃下孵育过夜。固定后，用PBS洗涤孔三次，并用PBS中的2％BSA封闭1小时。通过离心(6000g，5min)收集来自5mL细菌培养物部分的细菌颗粒，用PBS洗涤三次，并重悬于5mL PBS中。除去BSA溶液并用PBS洗涤三次孔后，加入细菌悬浮液(100μL，108CFU mL^-1)。对于胶原细菌基质样品，加入25μL胶原(50mg mL^-1，0.1M乙酸溶液)。将板与Lf或La在轨道振荡器上以180rpm在37℃下孵育2小时。通过用100μLPBS洗涤孔三次来去除未粘附的细菌，并将样品在60℃下固定20分钟。然后，在室温下用结晶紫(每孔100μL，0.1％溶液)对固定的细胞染色45分钟。最后，用150μL PBS洗涤孔两次，将与细菌结合的染色剂溶于50μL柠檬酸盐缓冲液(pH 4.3)中1小时。使用微量滴定板读数仪(NanoQuant)在590nm处测量吸光度。在一个孔中收集四个50μL的重复样品后，结果以总体积为200μL三份样品的平均值表示。对照组由粘蛋白和粘蛋白胶原组成，样品为粘蛋白-Lf、粘蛋白-La、粘蛋白-col-La和粘蛋白-col-Lf，用或不用BSA封闭。

col-Lf和col-La在模拟BV液体中的细菌活性：将胶原-益生菌样品和对照分别添加到10ml模拟BV液体中，并在37℃和180rpm下培养。根据先前报告的方案(D.H.Owen，D.F.Katz，Contraception 1999，59，91)制备并稍加修改的1升BV液含有NaCl 3.51g；KOH1.40g；Ca(OH)₂ 0.222g；牛血清白蛋白0.018克；尿素0.4克；甘油0.16g；葡萄糖10克；乳酸2g；pH为5.00。在预定时间：0、2、4、6、8和24小时，从每个培养物的上清液中依次收集1mL等分试样。离心等分试样(3000g，5分钟)，以除去任何残留细菌。测量包埋的活性材料和相应对照的pH，以证明恢复培养基pH的能力。每个等分试样重复三次进行测试。

统计分析：结果表示为平均值±标准差(S.E.M.)。使用GraphPad Prism软件(版本6.0)，使用单向ANOVA和Bonferroni的事后检验进行统计比较。p<0.05被认为是显著值。

实施例1：胶原基质作为益生菌支架

将含有胶原单体的酸性溶液与益生菌(Lf或La)在PBS缓冲液(pH 7.4)中混合。瞬时pH值的增加导致胶原自组装成高密度纤维基质，其长度为几百微米，直径为200至500nm(图1a，b)，显示出典型的D型条纹式样(67nm)。从扫描电子显微镜(SEM)显微照片(图1c-d)可以看出，使用这种简单的一锅法，Lf(图1c，d)和La(图2)益生菌被成功地包埋到胶原纤维网络中。此外，益生菌的存在不会改变pH诱导的胶原纤维结构和组装，这与在没有细菌的PBS中获得的胶原纤维类似(图1a，b)。

有趣的是，当两种含益生菌的胶原材料在最佳益生菌培养基(如MRS)中培养时，细菌成功增殖并产生生物膜，该生物膜修饰胶原纤维(图1e-f和2)。值得注意的是，这些细菌分泌胞外多糖(EPS)。EPS在生物膜的形成中起着重要作用，这对于细菌在基质(本例中为胶原纤维)中创造有利于生长的微环境至关重要。从图1e-f中可以明显看出，细菌与胶原基质的良好整合(生物膜形成可证明)，显示了细菌如何通过其EPS粘附到胶原纤维上(图1f和图2)。这些材料(col-Lf和col-La，以下简称)实际上是由三种成分组成的混合生物复合物：胶原基质、益生菌及其细菌EPS，后者是其他两种成分的天然“胶”。这类生物复合物从未被报道过。

通过标准糖试验对生物复合物col-Lf和col-La中的EPS量进行定量(见实验部分)。col-Lf和col-La的值分别为98和93.3mg每克胶原。有趣的是，通过在PBS中培养益生菌和胶原获得的初始材料含糖量低得多(分别为10和18.6mg每克胶原)。最终生物复合物col-Lf和col-La中糖的急剧增加肯定地归因于最佳MRS培养基中的生物膜形成，与SEM图像一致。

通过红外光谱(FTIR)和热重分析(TGA)对生物复合物进行了宏观表征，并通过同步辐射X射线衍射(图3)在分子尺度上对其进行了进一步表征。col-Lf的FTIR光谱和TGA显示了胶原纤维的鉴别特征(fingerprint)，以及一些与细菌存在相关的信号(图3a和b)。胶原和col-Lf的衍射图案相似(图3c)，由于胶原纤维的漫散射，具有以约q＝13.25nm^-1为中心的宽峰。q＝5.46nm^-1处的布拉格峰对应于胶原三螺旋的平伏分子-分子平均分离(即分子间横向间距)。该峰值导致1.15nm的d间距，这与干燥非矿化生物组织中胶原的相应d间距非常一致，并证实细菌不会影响胶原纤维的大分子组装。

基于SYTO9(绿色)/碘化丙啶(红色)的标准活/死试验表明，在col-Lf和col-La材料中，Lf和La细菌是活的(图4)。如图4所示，大多数Lf益生菌仍然存活(绿色)，只有少数死亡细菌被发现(红色)。此外，侧视图图像(连续xy切片的总和)(图4a)显示，细菌渗透并侵入整个胶原基质，形成独特的混合生物材料。有趣的是，放大的顶视图共焦图像(图4b-c)显示了细菌沿着胶原支架的排列，表明存在胶原对益生菌的特异性识别。对于col-La也发现了类似的结果。

实施例2：胶原基质在恶劣条件下稳定益生菌并提高其代谢活性

胶原基质不仅充当益生菌的宿主支架，而且在恶劣条件下(例如在4℃下)储存期间为益生菌提供额外保护。活细菌向培养基分泌代谢产物，尤其是乳酸杆菌分泌乳酸，将pH值调节在4左右。我们测量pH值变化，以监测在苛刻条件下(4℃)储存后益生菌的代谢活性。新鲜Lf和col-Lf(未经热处理)以及在4℃下储存两周、四周和八周后的pH变化如图5所示。col-Lf诱导稀释MRS培养基中的pH值比Lf(图5a)的pH值下降得多，支持嵌入胶原基质中的益生菌保持其代谢活性和益生菌。在4℃下储存两周和四周后，观察到col-La/La对的类似行为。然而，储存8周的col-La显示出低得多的活性(图6a)。

此外，我们使用电致变色多金属氧酸盐(POM)，通过将细菌的还原能力与其代谢活性相关联的测定，评估了4℃下储存的col-Lf和col-La的代谢活性(González，N.等人，Chem.Common.2015，51)。一旦被还原，POM在紫外-可见光谱中呈现出以820nm为中心的吸收带。将来自col-Lf或Lf培养物上清液的等分试样与POM水溶液孵育后，监测该吸收带的演变(图5b)。与游离储存的细菌相比，当细菌嵌入胶原基质中时，MRS肉汤培养基中的POM还原活性增强(图5b)。储存两周、四周和八周的col-Lf最终值与新鲜样品(室温下储存)的结果相似。在两周或八周后，观察到col-La/La对的类似行为。储存2个月后的col-La样品显示出降低POM的能力要小得多(图6b)，这与它们较差的降低pH的能力(参见col-Lf)(图6b)一致。

这些观察结果支持胶原基质有助于维持益生菌的核心细胞活性，特别是Lf，即使其暴露于长期恶劣的储存条件下。保持高代谢和细胞活性是在无抗生素治疗中成功使用益生菌的关键参数。

实施例3：胶原基质改善益生菌的粘附性

胶原是体内各种结缔组织细胞外空间的主要结构蛋白。因此，使用胶原蛋白作为益生菌支架的另一个优点是这种蛋白质具有粘附生物组织的特殊能力。益生菌与阴道粘膜的粘附对于用益生菌有效治疗BV至关重要。事实上，如果含有高度增殖的益生菌的生物材料不能充分粘附到阴道粘膜上，它将不会为BV治疗提供太多价值。

我们使用猪粘蛋白评估了col-Lf/col-La和Lf/La对内皮细胞的粘附性能，猪粘蛋白是一种含有上皮组织产生的高度糖基化蛋白的材料，是一种成熟的粘附模型。col-Lf/col-La和Lf/La在固定化猪粘蛋白上的粘附通过用结晶紫标记的吸附细菌的间接光谱定量来测量(见实验部分)。如图7所示，col-Lf对粘蛋白的粘附明显高于Lf，支持胶原增强包埋益生菌粘附的能力。col-La制剂也表现出比单独的La益生菌更高的粘蛋白粘附性(图8)。在比较col-Lf和col-La与粘蛋白的粘附时，观察到col-Lf对应于结晶紫的更高信号。这可能是由于如上所述，与col-La相比，col-Lf的CFU值更高。

典型的粘附模型还包括在粘蛋白固定后用牛血清白蛋白(BSA)处理。在粘蛋白固定化后，BSA阻断蛋白敏感孔板的剩余游离位点。使用BSA的实验(图9)与不使用BSA(图9b)的相应实验没有显著差异。该对照实验使我们得出结论，吸光度的增加不是由于胶原对蛋白质结合板的潜在吸附，而是由于粘附的col-Lf的吸收增加。

与原始益生菌相比，col益生菌对粘蛋白的粘附性更高，这证明了胶原基质的作用，使包埋的益生菌能够在特定组织中安顿下来(nesting)，在BV引起的致病条件下，阴道粘膜也可能如此。如上所述，含益生菌材料与阴道粘膜的充分粘附对于实现BV治疗的效果至关重要。如果粘附不是最佳的，则益生菌不能在不利的微环境中有效地适应和排出乳酸，并且病原菌可能保持活性，从而进一步促进感染。

实施例4：用于BV治疗的col-Lf和col-La

确认col-Lf和col-La在BV治疗中功能性的决定性步骤是它们从模拟BV液体pH5.0恢复健康状况的能力。如图10所示，col-Lf和col-La都能够将BV培养基的pH 5转变为健康状况下的pH 4。这种pH转变肯定是由于益生菌分泌的乳酸，这与先前的证据一致，即细菌在被包埋到胶原基质中后保持存活和活性。有趣的是，使用Lf和不使用胶原的La的pH下降要慢得多，并且没有达到4.0的健康pH值(图10)。

从这些结果中值得强调的两个观察结果：i)两种材料，col-Lf和col-La，能够将pH从不健康的BV培养基(pH 5)转变为健康的阴道状况(pH 4)；和ii)col-Lf或col-La降低pH的能力高于Lf或La。这些观察结果表明，胶原基质稳定了益生菌，并使其更稳固，以抵抗恶劣环境中的冲击，和BV液体一样。这一点非常重要，因为它概述了原始的(pristine)益生菌作为潜在的BV治疗的低效性，并表明需要额外的具有高粘附性的生物相容性基质，例如使益生菌稳定以克服不利的BV培养基的胶原。

Claims (28)

1.一种制备包含I型胶原、益生菌和胞外多糖的生物材料的方法，其中所述方法包括：

i)使益生菌群与胶原单体接触，

ii)在足以使胶原单体自组装成胶原纤维的条件下孵育步骤i)中获得的混合物，从而获得含有包埋的益生菌的胶原纤维，以及

iii)将步骤ii)中获得的含有包埋的益生菌的胶原纤维保持在足以使益生菌形成胞外多糖(EPS)的条件下，直到生物材料中的EPS含量相对于生物材料的以糖含量测量的胶原含量为至少2％(w/w)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述胶原是I型胶原。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(ii)在4至9的pH下进行。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中进行步骤ii)直到形成胶原原纤维，所述胶原原纤维的直径在1至600nm之间和/或显示67nm周期性交错的D型条纹式样。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，步骤ii)在连续搅拌下进行。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤iii)通过在MRS培养基中孵育含有包埋益生菌的胶原纤维来进行。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述益生菌是乳酸杆菌或双歧杆菌。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述益生菌选自发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌和格氏乳杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌和齿双歧杆菌。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述益生菌是发酵乳杆菌和/或嗜酸乳杆菌，更具体为发酵乳菌CECT5716和/或嗜酸酸乳杆菌CECT903。

10.一种生物材料，所述生物材料通过权利要求1至9中任一项所述的方法获得。

11.一种包含胶原支架、益生菌和胞外多糖(EPS)的生物材料，其中所述胶原支架包括直径在100和500nm之间的纤维，并且其中所述生物材料中的糖含量相对于所述生物物质的胶原含量为至少2％(w/w)。

12.根据权利要求11所述的生物材料，其中所述胶原支架包括显示67nm周期性交错D型条纹式样的原纤维。

13.根据权利要求11或12所述的生物材料，其中所述胶原是I型胶原。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的生物材料，其中所述益生菌浓度为每克胶原至少6×10¹²CFU。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的生物材料，其中所述EPS选自同多糖(HoPS)和/或杂多糖(HepS)。

16.根据权利要求15所述的生物材料，其中所述HoPS选自α-葡聚糖、β-葡聚糖和β-果聚糖，和/或所述HePS包含选自N-乙酰基葡萄糖胺(GluNAc)、N-乙酰-半乳糖胺(GalNAc)、岩藻糖、葡萄糖醛酸、甘油和甘露糖的D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖和N-乙酰化单糖中的任一种。

17.根据权利要求16所述的生物材料，其中所述EPS选自葡聚糖、左聚糖、突变糖、交替糖、罗伊氏糖(reuteran)和菊粉类。

18.根据权利要求17所述的生物材料，其中所述EPS是葡聚糖、左聚糖或其组合。

19.根据权利要求10至18中任一项所述的生物材料，其中所述益生菌选自乳酸杆菌和/或双歧杆菌。

20.根据权利要求19所述的生物材料，其中所述乳酸杆菌选自发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌詹氏乳杆菌和格氏乳杆菌，或其中所述双歧杆菌选自短双歧杆菌、长双歧杆菌和齿双歧杆菌或其任何组合。

21.根据权利要求20所述的生物材料，其中所述益生菌是发酵乳杆菌和/或嗜酸乳杆菌，更具体地，是发酵乳杆菌CECT5716和/或嗜酸乳杆菌CECT903或其组合。

22.根据权利要求11至21中任一项的所述生物材料，用于医学的用途。

23.根据权利要求11至21中任一项所述的生物材料，用于治疗阴道感染的用途。

24.根据权利要求23所述用途的生物材料，其中所述感染由细菌、酵母或原生动物寄生虫引起。

25.根据权利要求24所述用途的生物材料，其中所述感染是细菌性阴道炎、滴虫性阴道炎或念珠菌病。

26.根据权利要求25所述用途的生物材料，其中所述感染是细菌性阴道炎。

27.根据权利要求26所述用途的生物材料，其中所述细菌性阴道炎是由选自阴道嗜血杆菌或移动杆菌属的正常阴道菌群过度生长引起的。

28.一种药物组合物，其包含权利要求10至21中任一项的生物材料和适于阴道给药的药学上可接受的赋形剂。

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