CN115300525B - 联硒透明质酸水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

联硒透明质酸水凝胶及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115300525B
CN115300525B CN202210794607.6A CN202210794607A CN115300525B CN 115300525 B CN115300525 B CN 115300525B CN 202210794607 A CN202210794607 A CN 202210794607A CN 115300525 B CN115300525 B CN 115300525B
Authority
CN
China
Prior art keywords
diselenide
hyaluronic acid
hydrogel
preparation
water
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210794607.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115300525A (zh
Inventor
聂广军
徐嘉琪
张银龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Center for Nanosccience and Technology China
Original Assignee
National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Center for Nanosccience and Technology China filed Critical National Center for Nanosccience and Technology China
Priority to CN202210794607.6A priority Critical patent/CN115300525B/zh
Publication of CN115300525A publication Critical patent/CN115300525A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115300525B publication Critical patent/CN115300525B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/04—Sulfur, selenium or tellurium; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供一种联硒透明质酸水凝胶及其制备方法与应用。所述联硒透明质酸水凝胶由透明质酸作为框架结构，内部由联硒键连接，可根据需求制备成不同载体或体系，也可根据需求载带至少一种活性成分。该体系本身具有清除ROS、抗氧化应激、抗炎的功能，该体系可上调Nrf‑2通路，还具有CD44靶向功能，同时还实现了氧化还原双重响应。在体内外炎症相关疾病实现了清除ROS，抗氧化功能，治疗炎症相关疾病，也可协同其他药物增强治疗。

Description

联硒透明质酸水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及一种新型的联硒透明质酸水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
活性氧(ROS)是重要的信号分子，在炎症性疾病的进展中发挥重要作用。ROS具有很强的氧化能力，包括超氧阴离子(O2·-)、羟基自由基(OH·)、过氧化氢(H2O2)和次氯酸(HOCl)等。在生理浓度下，ROS作为信号分子，调节细胞生长、细胞与其他细胞的粘附、分化、衰老和凋亡。但高浓度时对细胞有害，表现为氧化蛋白质和脂质细胞成分，并破坏DNA，缓慢或长期ROS的产生被认为是炎症疾病进展的核心，特别是炎症相关细胞内ROS的产生。如多态核中性粒细胞(PMNs)在炎症部位增加活性氧的产生，导致内皮间连接的打开，炎症细胞越过内皮屏障的迁移，最终导致内皮功能障碍和组织损伤。了解抗氧化在炎症相关疾病治疗中的重要作用，但在临床实践中还没有开发出抗氧化剂药物。可能由于氧化剂在细胞中具有稳态和良好信号传递功能，也有可能，抗氧化剂只在特定细胞的特定部位是有效的，而不是氧化还原平衡的普遍改变，那么非靶向的抗氧化疗法不仅无效，还会影响其他细胞的生理活性。
硒(Se)在元素周期表上位于第四周期VI A族，其物理性质类似于同族的硫(S)元素和碲(Te)元素，是人体必需的元素，其中硒蛋白具有很好的抗氧化能力。由于硒的电负性和原子半径，含硒化合物表现出独特的键能。这种较低的键能情况能轻易的在较为温和的条件下被打断，若将其利用在生物材料上，将对于药物的控制释放方面有很大利用价值。硒在体内的正常摄入量范围较窄，每日摄入量为40-400μg，集中摄入350-700μg的硒被认为可能具有潜在毒副作用，而体内研究多集中在含硒小分子上，针对含硒大分子聚合物的研究较少，而含硒聚合物纳米化后可有效的实现硒元素缓释与补充的功效，故探讨含硒大分子聚合物作为生物载体应用是十分有必要的。其中含联硒聚合物，因其良好的响应性(氧化还原响应、配位响应、放疗射线响应)，近些年来受到广泛关注。C-S键能约为272kJ/mol，S-S键能约为240kJ/mol，C-Se键能约为244kJ/mol，Se-Se键能约为172kJ/mol，可见Se-Se键能要远低于S-S键。而含硫的聚合物已经广泛应用于生物材料中，响应细胞中的谷胱甘肽，通过还原反应降解而释放药物，用于肿瘤等多种疾病的治疗。但是关于含硒化合物的应用却很少。现有的含硒聚合物一般分为两大类：一类为含有硒原子的聚合物，一种是含有联硒键的聚合物。含硒原子的聚合物中，Se与C结合形成C-Se-C键，可以被氧化剂氧化形成硒砜结构(O＝Se＝O)，响应效果好，在低浓度下即可降解，但其仅对氧化剂反应，对还原剂没有作用，而联硒键在两者中均有很好的响应性。通常情况下，Se-Se键在氧化剂存在下断裂氧化为硒酸(SeOOH)而Se-Se键在还原环境中可还原为硒醇(SeH)，而在生物体内(SeH)可以继续消耗O2，经过脱水回到Se-Se键的状态，达到体内循环利用。
水凝胶一直以来被大家认知为药物载体，药物通过范德华力，疏水性作用力或者化学键结合组装入其网络结构中，起到分子保护基地送的作用。而近些年，人们进一步开发本身具有功能活性的水凝胶以取代单纯的载体框架，从而实现治疗与药物缓控释等多重作用。其中天然高分子聚合物在构成水凝胶的材料中占很大比重，它们是构成细胞外基质的成分之一，与合成的聚合物水凝胶相比，通常会有更好的生物相容性。纳米水凝胶(nanogel)是一种有着纳米尺度的水凝胶，它属于纳米颗粒的一种，具有二者的优良特性。其由物理或者化学交联方法形成的三维立体的纳米凝胶结构，纳米水凝胶可以由一种或多种天然聚合物、合成聚合物或两者结合而构成。所以通过改变纳米凝胶的化学组成可以对其大小，电荷，孔隙率，两亲性，柔软性等进行调整，达到所需的目的，广泛应用于组织工程和再生医学方面作为新材料制造功能性组织。
透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)是一种线性糖胺聚糖，它是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺通过β(1,4)和β(1,3)糖苷键连接构成的二糖重复单位，因其结构特点以及方便易得被广泛使用。在生理条件下，HA是以钠盐的形式存在的，带负电荷，这阻止了网状内皮系统对他的清除。其天然存在于脊椎动物和细菌中，并且在关节的滑液、皮肤的真皮层和眼睛的玻璃体中尤为丰富。HA作为医用材料已经被广泛用于关节炎治疗、眼科手术、药物输送和组织工程等方面。此外HA本身是细胞表面蛋白CD44(Cluster Determinant 44)的配体，而CD44在许多实体瘤细胞与许多炎症细胞状态下均高表达，故利用HA作为载体的药物设计了很多利于靶细胞摄取药物递送体系，而减少对正常组织的伤害。综上，通过透明质酸制备的纳米水凝胶，作为一种生物相容性极好的仿生材料，对CD44蛋白有着主动靶向性，通过不同的修饰孵育纳米水凝胶本身以丰富的功能甚至治疗作用，同时也可以载带药物，实现药物的控制释放及靶向递送。
发明内容
本发明的目的是提供一种联硒透明质酸水凝胶及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种联硒透明质酸水凝胶的制备方法，所述联硒透明质酸水凝胶是采用交联方法制备得到的，以透明质酸为骨架结构、内部由联硒键连接的水凝胶材料。
制备方法I包括：将透明质酸酸化后，溶于DMSO中，用EDC和NHS活化，向活化体系中加入两端为氨基含联硒键的分子或聚合物，然后经透析、冻干处理后得到联硒透明质酸单体；将联硒透明质酸单体溶于水或PBS中，配制成浓度为1-100mg/mL的溶液作为水相，与油相按比例混合，采用微流控、乳化法或自组装法(优选微流控、乳化法，更优选乳化法)制备得到油包水型(W/O)联硒透明质酸水凝胶。
或者，
制备方法II包括：将1-40mg透明质酸、0.1-200mg EDC、0.1-60mg NHS和0.1-168mg两端为氨基含联硒键的分子或聚合物溶于1-10-mL水或PBS中，作为水相，然后与油相按比例混合进行乳化，然后通过离心、旋蒸等方法得到油包水型联硒透明质酸水凝胶。
本发明中，所述两端为氨基含联硒键的分子或聚合物的结构通式如下：
NH2-R1-(R2-Se-Se-R3)n-R4-NH2
其中，1≤n≤500，且n为整数。
R1、R2、R3、R4各自独立地选自CH2、CH、CONH中的一种或几种的组合。
优选地，所述两端为氨基含联硒键的分子或聚合物为硒代胱胺。
进一步地，所述透明质酸的分子量为3-10000kD，优选10-1000kD，更优选20-400kD。
优选地，所述制备方法中，硒代胱胺的氨基与透明质酸的羧基的摩尔比为1:2～10:1。
优选地，所述油相为含有30-200mg/mL吐温80和30-200mg/mL司盘80的正己烷或植物油，动物油，脂肪酸。
优选地，水相与油相按1:8-1:2的体积比混合。
进一步地，所述制备方法I中，透明质酸酸化方法包括：将透明质酸溶于一定量水中，必要时超声，置于透析袋中，将透析袋在0.001-0.1M M HCl稀盐酸或冰醋酸中透析4-72小时。
第二方面，本发明提供按照所述方法制备得到的联硒透明质酸水凝胶。
所述水凝胶的粒径80nm-1mm，呈球形或不规则球形，且表面具有凹凸孔状。
水凝胶中联硒键的含量占所述水凝胶质量百分比为0.01-20％，优选0.01-10％。
第三方面，本发明提供所述水凝胶的以下任一应用：
1)用于制备清除ROS的生物制品；
2)用于制备抗氧化剂；
3)用于制备治疗炎症相关疾病的药物或组合物；其中，所述炎症相关疾病包括但不限于消化道炎症(IBD、感染性肠胃炎、慢性肠炎、放射性肠炎)、骨关节炎、动脉粥样硬化，优选肠炎与骨关节炎，更优选肠炎；
4)用作药物递送系统；
5)用于制备靶向CD44高表达的组织或细胞(包括炎症细胞、肿瘤细胞、泡沫细胞，优选炎症细胞，如巨噬细胞等)的制剂。
本发明的联硒透明质酸水凝胶作为抗氧化体系，该体系可上调细胞内Nrf-2/HO-1通路，增加胞内抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、抗氧化物酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽转移酶(GST)的含量。
联硒透明质酸水凝胶作为药物递送系统，所述药物可选自蛋白类药物、核酸药物、多肽类药物、小分子化合物等中的至少一种。优选地，活性药物成分为抗炎药物、免疫抑制药物、细胞生长因子等中的一种或几种。
所述药物占所述水凝胶的质量百分比为1-30％，优选1-10％。
所述系统可实现响应性释药或破裂，如氧化或还原响应、pH响应、温敏响应、酶响应，优选为氧化或还原响应。
所述药物递送系统可以是口服剂、静脉制剂、经皮剂、埋植剂或粘膜贴剂等。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供一种联硒透明质酸生物材料(抗氧化体系)及其制备方法与应用。该抗氧化体系由透明质酸作为框架结构，内部由联硒键连接，可根据需求制备成不同载体或体系，也可根据需求载带至少一种活性成分。所述体系本身具有清除ROS、抗氧化应激、抗炎的功能，该体系可上调Nrf-2通路，还具有CD44靶向功能，同时还实现了氧化还原双重响应。在体内外炎症相关疾病实现了清除ROS，抗氧化功能，治疗炎症相关疾病(肠炎、骨关节炎及动脉粥样硬化等疾病)，也可协同其他药物增强治疗。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中硒代胱胺(a)、透明质酸(b)及其HA-NH-(CH2)2-Se-Se-(CH2)2-NH-HA(Se-HA)偶联物(c)的1H-NMR谱。
图2为本发明较佳实施例中方法1制备联硒透明质酸(330kD)纳米水凝胶TEM和DLS图。
图3为本发明较佳实施例中方法1制备联硒透明质酸(6kD)纳米水凝胶TEM和DLS图。
图4为本发明较佳实施例中方法1制备透明质酸(330kD)纳米水凝胶TEM和DLS图。
图5为本发明较佳实施例中方法2制备联硒透明质酸纳米水凝胶1、联硒透明质酸纳米水凝胶2和联硫透明质酸纳米水凝胶TEM和DLS图。
图6为本发明较佳实施例中联硒透明质酸纳米水凝胶1包载OXA的TEM和DLS图。
图7为本发明较佳实施例中联硒透明质酸纳米水凝胶，透明质酸纳米水凝胶和联硒透明质酸纳米水凝胶1傅里叶变换红外光谱(FT-IR)(a)；联硒透明质酸纳米水凝胶与透明质酸纳米水凝胶X射线光电子能谱(XPS)中Se结合能分析(b)。
图8为本发明较佳实施例中联硒透明质酸纳米水凝胶于第10天和第30天在PBS中的TEM图像。
图9为本发明较佳实施例中在pH 1.2和pH 7.4的PBS溶液中孵育0.5小时后，联硒透明质酸纳米水凝胶(10mg/mL)的纳米粒径、尺寸分布、Zeta电位(a)和TEM图像(b)的变化。pH 1.2和pH 7.4PBS溶液处理联硒透明质酸纳米水凝胶后FT-IR光谱展示Se-Se伸缩振动峰(c)。
图10为本发明较佳实施例中联硒透明质酸纳米水凝胶在PBS、5mM GSH以及100μMH2O2中24小时的透射电镜形貌及粒径分布。
图11为本发明较佳实施例中联硒透明质酸纳米水凝胶1在PBS、5mM GSH、以及100μM H2O2中24小时的透射电镜形貌。
图12为本发明较佳实施例中联硒透明质酸纳米水凝胶1与联硫透明质酸纳米水凝胶在PBS、5mM GSH以及100μM H2O2在72小时内奥沙利铂的释放曲线。
图13为本发明较佳实施例中不同浓度(12.5、25、50、100、200、400、800、1600μg/mL)的联硒透明质酸纳米水凝胶对HcoEpiC、HT29和Raw264.7细胞24小时体外细胞毒性。
图14为本发明较佳实施例中CD44在不同类型细胞HcoEpiC、HT29和Caco2中表达(a)；Raw264.7静息型细胞诱导成激活型细胞(b)；静息型和激活型Raw264.7细胞中CD44的表达(c)。
图15为本发明较佳实施例中联硒透明质酸纳米水凝胶-cy5.5在HT29、HcoEpiC和Caco2细胞中孵卵2小时后流式细胞仪的内吞结果(a)；联硒透明质酸纳米水凝胶-cy5.5在静息型和激活型Raw264.7细胞中孵育2小时后流式细胞仪的内吞结果(b)。
图16为本发明较佳实施例中不同浓度联硒透明质酸纳米水凝胶在100μM和1000μMH2O2溶液对H2O2的清除能力。
图17为本发明较佳实施例中不同纳米水凝胶处理在过夜后，在100μM H2O2和20μg/mL LPS诱导的细胞内氧化应激模型中，检测HT29和Raw264.7胞内ROS水平。
图18为本发明较佳实施例中CCK-8法检测100μg/mL不同纳米水凝胶和100μM H2O2刺激HT29和Raw264.7 12小时后细胞活力。
图19为本发明较佳实施例中免疫印迹检测100μg/mL纳米水凝胶处理Raw264.7，LPS(50ng/mL)刺激培养6小时后，Raw264.7细胞中细胞核与胞浆中Nrf2及细胞中HO-1和iNOS总含量(a)。100μg/mL纳米水凝胶处理Raw264.7细胞核内Nrf2和细胞HO-1表达(无LPS刺激)(b)。
图20为本发明较佳实施例中不同纳米水凝胶(6.25、25和100μg/mL)刺激Raw264.7细胞6小时，检测胞内SOD、CAT、GSH、GST活性。
图21为本发明较佳实施例中100μg/mL不同纳米水凝胶处理Raw264.7，LPS(50ng/mL)刺激培养6小时后，上清中IL-6和TNF-α的含量。
图22为本发明较佳实施例中正常小鼠和结肠炎模型小鼠灌胃8小时后结肠组织中联硒透明质酸纳米水凝胶-cy5.5的体内荧光图像(a)和使用抗CD44抗体将结肠组织切片染色，共聚焦显微镜观察荧光信号与共定位情况(b)。
图23为本发明较佳实施例中联硒透明质酸纳米水凝胶治疗葡聚糖硫酸钠诱导的急性肠炎模型。(a)联硒透明质酸纳米水凝胶给予急性肠炎模型后小鼠体重变化。(b)8天治疗期间的疾病活动指数变化。(c-d)测定不同治疗组终点结肠长度。(e)不同治疗组结肠组织中ROS水平。代表性H&E图像(f)和(g)结肠损伤评分。检测不同治疗组对葡聚糖硫酸钠诱导的BALB/c结肠炎小鼠结肠组织中MPO(h)、MDA(i)、SOD(j)含量。
图24为本发明较佳实施例中联硒透明质酸纳米水凝胶治疗葡聚糖硫酸钠诱导的急性肠炎模型。(a)免疫蛋白印记分析细胞核内Nrf2和结肠组织总蛋白HO-1和iNOS表达。(b)不同治疗组处理结肠炎组织中Nrf2免疫组化图像。(c)检测不同治疗组对葡聚糖硫酸钠诱导的BALB/c结肠炎小鼠结肠组织中和IL-6、TNF-α、IL-1β细胞因子水平。
图25为本发明较佳实施例中不同分子量联硒透明质酸纳米水凝胶治疗评估。对照组或急性肠炎模型组Babl/c小鼠持续7天灌胃给予PBS或50mg/kg不同分子量联硒透明质酸纳米水凝胶后测定8天内体重变化(a)和疾病活动指数(b)变化。(c-d)测量终点结肠长度。结肠损伤评分(e)和代表的H&E图像(f)。
图26为本发明较佳实施例中含联硒小分子的治疗对照。(a)联硒小分子与联硒透明质酸纳米水凝胶治疗葡聚糖硫酸钠诱导BALB/c小鼠结肠炎模型8天中体重变化。(b)盲肠-结肠组织并测定其结肠长度。
图27为本发明较佳实施例中CD44中和抗体干预联硒透明质酸纳米水凝胶在DSS诱导急性结肠炎治疗的研究。(a-b)葡聚糖硫酸钠诱导BALB/c小鼠结肠炎模型的8天治疗期间体重变化和疾病活动指数。(c)盲肠-结肠组织并测定其结肠长度。
图28为本发明较佳实施例中联硒透明质酸纳米水凝胶治疗2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的急性肠炎模型。(a)BALB/c小鼠接受生理盐水和50mg/kg透明质酸纳米水凝胶或联硒透明质酸纳米水凝胶在2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的急性结肠炎的体重变化。(b-c)盲肠-结肠组织并测定结肠组织长度。H&E染色(d)和结肠组织学损伤评分(e)。(f)不同处理组小鼠处死后测定结肠组织ROS水平。检测不同治疗组对葡聚糖硫酸钠诱导的BALB/c结肠炎小鼠结肠组织中MPO(g)、MDA(h)、SOD(i)含量和IL-6(j)、TNF-α(k)、IL-1β(l)细胞因子水平。
图29为本发明联硒透明质酸纳米水凝胶清除ROS作用机理图。
具体实施方式
本发明提供一种联硒透明质酸水凝胶生物材料(抗氧化体系)及其制备方法与应用。所述体系本身具有CD44靶向功能，同时本身具有清除ROS、抗氧化应激、抗炎，可上调Nrf-2/HO-1通路。通过该材料制备的体系可实现氧化还原双重响应，可靶向炎症细胞，实现炎症相关疾病的治疗。
基于所述生物材料制备的体系具有精准抗氧化生物学功能，可以治疗如炎症性肠病等炎症相关疾病。
本发明基于联硒透明质酸生物材料制备的抗氧化体系，该体系由透明质酸作为框架结构，内部由联硒键连接，也可根据需求载带至少一种活性成分。
本发明的抗氧化体系中，所述透明质酸材料的分子量为3-10000kD，选用该区间分子量透明质酸中的一种或几种。本领域技术人员可根据实验目的选用不同分子量的透明质酸，优选10-1000kD，更优选20-400kD。
本发明的抗氧化体系中，框架分子由两端为氨基含联硒键的分子或聚合物(NH2—R1-R2-Se-Se—R3-R4-NH2)连接，或两端为氨基的联硒重复单元分子或聚合物NH2-R1-(R2-Se-Se-R3)n-R4-NH2，通式中，R1,R2,R3,R4具体指代CH2、CH、CONH中一种或几种的任意组合，本领域技术人员可根据实际需求选择不同两端为氨基、中间含联硒键的嵌段分子，优选硒代胱胺。
本发明的抗氧化体系，可通过透明质酸-CD44天然配体结合，实现靶细胞的靶向和内吞，靶向CD44高表达的组织或细胞，包括炎症细胞、肿瘤细胞、泡沫细胞；优选炎症相关细胞，如巨噬细胞。
本发明的抗氧化体系，本身可作为抗氧化剂，具有清除ROS，抗炎，抗氧化功能，可治疗炎症相关疾病，包括消化道炎症(IBD、感染性肠胃炎、慢性肠炎、放射性肠炎)、骨关节炎的治疗、动脉粥样硬化等；优选治疗肠炎与骨关节炎，更优选治疗肠炎。
本发明的抗氧化体系，可上调细胞内Nrf-2/HO-1通路，增加胞内抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、抗氧化物酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)的含量。
本发明的抗氧化体系，可载带至少一种活性成分，所述的活性成分选自蛋白类药物、核酸药物、多肽类药物、小分子化合物中的一种或几种；本领域技术人员可根据疾病需求，载带一种或几种药物加强治疗效果或协同治疗，达到更好的应用性能。
优选地，所述活性成分为抗炎药物，免疫抑制药物，细胞生长因子中的一种或几种。
也就是说，基于本发明生物材料的抗氧化体系本身即实现一定治疗功能，同时可根据治疗需求，载带药物加强治疗效果或协同治疗，达到更好的应用性能。
本发明的抗氧化体系，可实现响应性释药或破裂，如氧化或还原响应、pH响应、温敏响应、酶响应。优选氧化或还原响应。
本发明的抗氧化体系为静脉制剂、口服剂、经皮剂、埋植剂、粘膜贴剂中的一种；本领域技术人员可根据疾病的病灶部位以实现不同给药方式，如肠炎可选用口服剂，动脉粥样硬化、肿瘤治疗可选择静脉注射，关节炎可选用贴剂等。
本发明的抗氧化体系为药物递送体系，包括水凝胶，微米水凝胶或纳米水凝胶；优选纳米水凝胶。
本发明的抗氧化体系所制备纳米水凝胶，选以微流控制备，乳化法制备，自组装法制备；优选微流控制备和乳化法制备，更优选乳化法制备。
本发明的抗氧化体系所制备水凝胶，所述体系呈球形或不规则球形，且表面呈现凹凸孔状，所述纳米颗粒的粒径为80nm-1mm；优选为纳米水凝胶，粒径为80nm-1000nm。
本发明的纳米水凝胶的制备方法可通过不同交联方法制备。其方法本身对纳米体系联硒含量可能产生影响，可根据治疗目的选择不同制备方法。
I、方法1制备联硒透明质酸纳米水凝胶
1、取透明质酸溶于一定量水中，必要时超声，置于透析袋中，透析袋外环境0.01MHCl稀盐酸环境，透析4小时以上后，冻干后取出；
2、酸化后的透明质酸溶于DMSO中，称取EDC、NHS(EDC与NHS等摩尔，与透明质酸的羧基按2-10倍摩尔比过量)，羧基活化6-24小时；
3、称取硒代胱胺(硒代胱胺的氨基与透明质酸的羧基的摩尔比为1:2～10:1)，溶于步骤2中DMSO中，必要时超声，反应12-72小时；
4、将上述DMSO置于合适分子量透析袋中，3次水透析；
5、透析袋中溶液冻干后得含联硒透明质酸单体备用；
6、称取一定量联硒透明质酸单体原料，溶于水或PBS中(可在此处加入活性物质)；
7、取正己烷为油相(水相和油相体积比为1:8-1:2)，油相里面包含30-200mg/mL吐温80，30-200mg/mL司盘80；
8、探头超声，超声功率5-35％，5-10分钟；
9、超声好后，后离心，弃上清，用正己烷重悬洗一遍，重复离心，弃上清，用水相重悬；
10、旋蒸，除去有机溶剂；
11、高转速离心12000rpm以上，30分钟，弃上清，再用水洗一遍，即得联硒透明质酸纳米水凝胶。
本发明制备联硒透明质酸纳米水凝胶抗氧化剂，其内部联硒键含量所占纳米体系的质量百分比为0.01-20％，优选1-10％。
II、方法2制备联硒透明质酸纳米水凝胶
1、依次称取适量透明质酸，硒代胱胺(硒代胱胺的氨基与透明质酸羧基的摩尔比为1:2～10:1)，EDC和NHS(EDC与NHS等摩尔，与透明质酸的羧基按2-5倍摩尔比过量)，溶于1mL水或PBS中(可在此处加入活性物质)；
2、油相为含有30-200mg/mL吐温80，30-200mg/mL司盘80的正己烷，其中，水相和油相的体积比为1:8-1:2；
3、探头超声功率为5-35％，5-10分钟；
4、超声之后在圆底烧瓶中搅拌，使烧瓶内的反应稳定，转速尽量大使里面液体充分被搅起来，搅拌至少4小时；
5、搅拌后离心，弃上清，用正己烷重悬洗一遍。重复离心，弃上清，用水相重悬；
6、旋蒸，除去有机溶剂；
7、低速离心，去除未反应的硒代胱胺；
8、高转速离心12000rpm以上，30分钟，弃上清，再用水洗一遍，即得联硒透明质酸纳米水凝胶。
本发明还提供一种纳米水凝胶载带活性物质的制备方法；
1、取一定量的活性物质与制备好的一定浓度的联硒透明质酸纳米水凝胶混合与一定体积的水相中，室温孵育6小时以上；
2、高转速离心，去除上清，沉淀得载带活性物质的联硒链接的透明质酸纳米水凝胶。
本发明所制备的联硒透明质酸纳米水凝胶抗氧化剂载带活性物质，所载带的活性成分占所述纳米体系的质量百分比为1-30％，优选1-10％。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的超声波细胞粉碎仪(Scientz-IID)购自中国宁波新芝生物公司；
透明质酸(6kD，330kD)购自华熙福瑞达生物医药有限公司；硒代胱胺、1,4-二氨基丁烷购自麦克林公司。
实施例1方法1制备联硒透明质酸纳米水凝胶的方法
包括如下步骤：
1、透明质酸酸化
取330kD透明质酸HA100mg，溶于20mL水中，置于透析袋中，透析袋外环境0.01MHCl稀盐酸环境，透析过夜，24小时后，冻干后取出。
2、联硒透明质酸(Se-HA)原料制备
(1)冻干后，100mg酸化透明质酸溶于DMSO中，称取EDC 251mg，NHS 151mg，羧基活化过夜；
(2)24小时后称取硒代胱胺55mg，溶于上述DMSO，必要时超声，反应过夜。
(3)24小时后，将上述DMSO置于3000KD透析袋中，3次水透析，透析48小时，冻干，得到联硒透明质酸粉末。
取2mg联硒透明质酸粉末，与2mg相应分子量透明质酸，溶解于氘代水中，2mg硒代胱胺二盐酸盐溶解于氘代DMSO中，在298K条件下采集核磁1H谱。
3、联硒透明质酸纳米水凝胶制备
(1)称取20mg联硒透明质酸原料，溶于1mL PBS中(可根据需求在此处添加预载带活性物质)；
(2)取180mg吐温80，180mg司盘80，正己烷4mL，置于10mL管；
(3)探头超声功率30％，5分钟，开1s，关2s；
(4)超声后，12000rpm离心10分钟，弃上清，用正己烷重悬洗一遍；
(5)用15mL三次水重悬后，旋蒸20分钟，除去有机溶剂；
(6)15000rpm离心45分钟，弃上清，用三次水洗一遍后15000rpm离心45分钟，弃上清，1mL PBS重悬，即得联硒透明质酸纳米水凝胶颗粒。
图1(a～c)为联硒透明质酸的1H-NMR图谱，其中联硒透明质酸保留透明质酸多糖中3-4ppm特征的氢化学位移，由于Se-Se键引入，该图同时展示了3.2ppm的氢化学位移。
通过激光粒度仪测得联硒透明质酸纳米水凝胶颗粒粒径为195nm，Zeta电位分别为-7.86mV。分散度为0.21，通过透射电镜观察呈现出表面粗糙的球形形貌(图2)。
实施例2方法1制备载带荧光cy5.5的联硒透明质酸纳米水凝胶
包括如下步骤：
取实施例1中制备的联硒透明质酸粉末100mg、60mg EDC和50μg Cy5.5-NHS溶于10mL水中，室温搅拌24小时，再用蒸馏水透析1天，冻干后取出，得联硒透明质酸-cy5.5偶联物，注意全程避光处理。重复实施例1中联硒透明质酸纳米水凝胶制备中的步骤(2)-(6)，得cy5.5联硒透明质酸纳米水凝胶。
实施例3制备方法1制备透明质酸纳米水凝胶
包括如下步骤：
透明质酸纳米水凝胶制备方法参照实施例1，不同之处在于投料体系，在联硒透明质酸原料制备的步骤(2)中称取30mg 1,4-二氨基丁烷合成HA-NH-(CH2)4-NH-HA(C-HA)偶联物30mg，溶于含有羧基活化的透明质酸的DMSO中；其余步骤同实施例1。
通过激光粒度仪测得透明质酸纳米水凝胶颗粒粒径为182nm，Zeta电位分别为-3.66mV。分散度为0.18，通过透射电镜观察呈现出表面粗糙的球形形貌(图3)
实施例4方法1制备不同分子量联硒透明质酸纳米水凝胶
联硒透明质酸纳米水凝胶制备方法参照实施例1，不同之处在于投料体系，在透明质酸酸化步骤中称取100mg 6kD透明质酸酸化，其余步骤同实施例1。
图4展示了6kD联硒透明质酸纳米水凝胶表面粗糙多孔的形貌，粒径分别175.54nm，电位分别为-4.91mV，PDI为0.14。
实施例5方法2制备透明质酸纳米水凝胶的方法
(1)依次称取37kD透明质酸20mg，硒代胱胺8.4mg(对应于联硒透明质酸纳米水凝胶1)或4.2mg(对应于联硒透明质酸纳米水凝胶2)或5.9mg胱胺二盐酸盐(对应于联硫透明质酸纳米水凝胶)，EDC 20.24mg，NHS 6.07mg，溶于1mL水中(可根据需求在此处添加预载带活性物质)；
(2)称取4mL正己烷为油相，其中包含180mg吐温80和180mg司盘80；
(3)探头超声功率30％，5分钟；
(4)超声后在圆底烧瓶中搅拌，使烧瓶内的反应稳定，1000rpm转速充分被搅起来，搅拌6小时，也可过夜；
(5)搅拌后，12000rpm离心20分钟，弃上清，用正己烷重悬洗一遍；
(6)12000rpm离心20分钟，弃上清，用水重悬；
(7)旋蒸10分钟，除去有机溶剂；
(8)透析24小时，除掉EDC/NHS(可省略)；
(9)2000rpm低速离心，去除未反应的沉淀；
(10)12000rpm离心30分钟，弃上清，再用水洗一遍，即得联硒透明质酸纳米水凝胶。
通过激光粒度仪测得方法2制备联硒透明质酸纳米水凝胶1粒径为157.53nm，分散度为0.21，电位为-9.6mV，通过透射电镜观察纳米水凝胶分布均匀，大小一致。而联硒透明质酸纳米水凝胶2粒径为244.6nm，分散度为0.42，电位为-13.8mV，通过透射电镜观察纳米水凝胶颗粒大部分黏连在一起，说明其交联不充分，不彻底。联硫透明质酸纳米水凝胶与联硒透明质酸纳米水凝胶1粒径分布与相貌相似，交联充分。粒径为169.4nm，分散度为0.28，电位为-11.43mV(图5)。
实施例6载带活性物质的透明质酸纳米水凝胶的制备方法
包括如下步骤：
(1)以水溶性药物奥沙利铂(OXA)为例，分别取4mg，2mg，1mg奥沙利铂，用实施例1或实施例3或实施例5制备的20mg/mL纳米水凝胶溶液1mL溶解上述奥沙利铂，在摇床上孵育24小时，然后12000rpm离心30分钟，除去上清(没有载上的游离奥沙利铂分子)，沉淀得载带活性物质的联硒透明质酸纳米水凝胶；
(2)用高效液相色谱仪检测上清中的游离奥沙利铂的量，总投药量减去没有包载上的量即为载上的药量。载药率和包封率的计算公式如下：
包封率(％)＝纳米水凝胶载上药物的量/投入药物的总质量×100％
载药率(％)＝纳米水凝胶载上药物的量/载体的总质量(载体的质量+包载上的药物量)×100％
对实施例5制备的联硒透明质酸纳米水凝胶1载药后进行形貌和粒径表征，结果如图6所示。平均粒径为185.36nm，zeta电位值为-9.1mV，其形貌为规则球形水凝胶，较非载药纳米水凝胶相比粒径略微增大，Zeta电位负值略微减小。
通过HPLC结果可得，纳米水凝胶的网状结构对亲水性小分子药物有着良好的包载率，如表1所示，在不同的奥沙利铂投入量中，可以看到随着奥沙利铂量的增加，包封率和载药率都有所增加。
表1在不同的奥沙利铂含量下联硒透明质酸纳米水凝胶1的包封率和载药率
试验例1：Se-Se键表征
将实施例1、3和5中制备的联硒透明质酸纳米水凝胶、透明质酸纳米水凝胶和联硒透明质酸纳米水凝胶1至于冷冻干燥仪进行真空冷冻干燥24小时，得干燥的纳米颗粒。
将冻干后的联硒透明质酸纳米水凝胶、透明质酸纳米水凝胶和联硒透明质酸纳米水凝胶1各取5mg与50mg溴化钾粉末混匀，用玛瑙研钵将其充分研磨，放入烘干器中做最后的除水，然后用压片机进行压片，置于红外光谱仪中测定，观察红外图谱。
将冻干后的联硒透明质酸纳米水凝胶与透明质酸纳米水凝胶各取5mg干粉粘于铝箔上，进行X射线光电子能谱检测。
由图7(a)可得545cm-1出现了Se-Se的特征峰，740cm-1出现C-Se伸缩振动吸收峰。图7(b)在图XPS结果展示了Se-Se在联硒透明质酸纳米水凝胶中的结合能为55.2eV。
以上结果表明，不同方式制备的联硒透明质酸纳米水凝胶和联硒透明质酸纳米水凝胶1均交联成功，联硒键已被连接上。
试验例2：稳定性表征
将制备的10mg/mL的联硒透明质酸纳米水凝胶室温置于PBS中孵育30天，稀释至200μg/mL浓度在0、1、3、10、20、30天测定联硒透明质酸纳米水凝胶的大小和表面电荷，在第10、30天用透射电镜观察其形貌。
为了研究在模拟胃液中的稳定性，将1mL联硒透明质酸纳米水凝胶(10mg/mL)在1mL pH 1.2和pH 7.4PBS溶液中搅拌，孵育0.5小时后，18,516g离心30分钟收集成纳米凝胶，悬浮于水中进行DLS分析和TEM观察。然后将冷冻干燥的联硒透明质酸纳米水凝胶样品用于FT-IR分析，比较孵育前后化学特征峰的变化。
联硒透明质酸纳米水凝胶在PBS中室温放置30天，储存30天过程中DLS数据变化见表2，同时选择10天与30天为代表性时间点，观察其形貌变化(图8)，结果表明其稳定性良好，在1个月的观察过程中大小均匀，形貌完整。
酸稳定性结果表明，联硒透明质酸纳米水凝胶的大小从183.12nm变化到206.83nm，但形态与pH 7.4时一致(图9，a-b)。FI-TR数据显示，所有的化学特征峰仍然存在，表明对强酸性具有良好的稳定性(图9c)。
表2联硒透明质酸纳米水凝胶室温PBS储存30天的稳定性
试验例3：联硒透明质酸纳米水凝胶氧化还原响应
将实施例1、3和5中制得的联硒透明质酸纳米水凝胶、透明质酸纳米水凝胶，联硒透明质酸纳米水凝胶1置于100μM H2O2 PBS与5mM GSH(MW＝307)PBS溶液中孵育24小时，通过DLS或TEM进行粒径、电荷及形貌分析。
通过图10和图11可以观察到，在100μM H2O2与5mM GSH作用下，透明质酸纳米水凝胶依然保持着良好的形貌与尺寸分布，而不同交联方式获得的联硒透明质酸纳米水凝胶和联硒透明质酸纳米水凝胶1发生了解聚。其中经过处理后，联硒透明质酸纳米水凝胶粒径分别显著增加至760.75nm和1287.44nm。
试验例4：联硒透明质酸纳米水凝胶1与联硫透明质酸纳米水凝胶响应性释药
利用实施例5制备的纳米水凝胶，按照实施例6中载体和药物5:1的比例，包载等量奥沙利铂，将联硫透明质酸纳米水凝胶作为对照组，进行药物释放效果的比较。在PBS、100μM H2O2以及5mM GSH这三种条件下进行药物释放测定。将两种纳米水凝胶每种均等分三份，分别置于3000D的透析袋中，透析袋分别放入装有10mLPBS、10mL 5mM GSH、10mL 100μM H2O2的15mL离心管中，使外面的液体完全浸没透析袋，使奥沙利铂从透析袋中置换到外面的液体中。放入恒温摇床，摇床参数设定为：37℃、180rpm，用于体外模拟药物体内释放。随后，分别在1、2、4、8、20、30、48、72小时取透析袋外的溶液1mL，再新补入1mL相应的溶液。将所有时间点取出的溶液用HPLC测定奥沙利铂的浓度，计算每个时间点的药物释放量。
联硒透明质酸纳米水凝胶1与联硫透明质酸纳米水凝胶在三种条件下的奥沙利铂释放结果如图12所示。在生理条件的PBS溶液中，两种纳米水凝胶的释放效果基本一致，72小时后的释放总量联硒透明质酸纳米水凝胶1组为40.99％，联硫透明质酸纳米水凝胶组为44.69％，无明显差异。在用于模拟高ROS环境的100μM H2O2中，联硒透明质酸纳米水凝胶1大量快速的释放出药物，72小时最终释放量为87.92％，并且4小时就已达到60.51％的释放量；而联硫透明质酸纳米水凝胶键对H2O2无响应性，最终释放量仅为52.12％，联硒透明质酸纳米水凝胶1的最终释放量为联硫透明质酸纳米水凝胶的1.69倍。在用于模拟高GSH条件下，联硒透明质酸纳米水凝胶1最终释放量91.72％，为联硫透明质酸纳米水凝胶最终释放量71.18％的1.28倍。尽管联硫键对GSH也有响应性，但Se-Se键能低，更易被打断，因此释放量更高。
综上，两种制备方法所得联硒透明质酸纳米水凝胶均显示了对氧化还原的响应。
试验例5：细胞毒性
分别培养人类正常结肠上皮细胞HcoEpiC细胞系、结肠癌细胞HT29细胞系、小鼠单核巨噬细胞白血病细胞Raw264.7细胞系，5000-8000个细胞每孔，铺板12小时后，加入实施例1中制备好的不同浓度(12.5、25、50、100、200、400、800、1600μg/mL)的联硒透明质酸纳米水凝胶，24小时后通过CCK8检测细胞活性。
结果发现，HT29细胞IC50为612μg/mL，Raw264.7细胞IC50为986μg/mL，而在HcoEpiC细胞IC50>1600μg/mL，提示联硒透明质酸纳米水凝胶安全性良好(图13)。
试验例6：联硒透明质酸纳米水凝胶CD44靶向性
1、高表达CD44细胞系
(1)将HT29、Caco2、HcoEpiC三种细胞1×105/每孔接种至6孔板中，培养24小时后，收集皿中细胞，按照美国Biolegend说明书使用抗CD44(PE)流式抗体染色，并使用流式细胞仪检测CD44的表达；
(2)将Raw264.7细胞以1×105细胞/孔接种于6孔板中，12小时后，用100ng/mL LPS和10ng/mL IFN-γ处理24小时，诱导Raw264.7巨噬细胞由静息型转化为激活型，按照美国Biolegend说明书使用抗CD80(Alexa Fluor 594)和抗CD86(APC)抗体染色，使用流式细胞仪检测Raw264.7表型；同时使用抗CD44(PE)流式抗体染色，并使用流式细胞仪检测CD44的表达；
2、联硒透明质酸纳米水凝胶对CD44表达细胞的靶向性
(1)将HcoEpiC、HT29、Caco2细胞按1×105细胞/孔接种于6孔板中，培养12小时，清除上清，置换为实施例2中50μg联硒透明质酸纳米水凝胶-cy5.5、50μg联硒透明质酸纳米水凝胶-cy5.5与100μg透明质酸、50μg联硒透明质酸纳米水凝胶-cy5.5与5μL CD44抗体的1640培养基，孵育2小时后，PBS洗三遍，消化细胞，流式检测。
(2)将静息型和激活型Raw264.7与含50μg联硒透明质酸纳米水凝胶-cy5.5或CD44抗体的培养基(不含FBS)4℃孵育2小时，收集细胞进行流式细胞术分析。
图14a结果表明HcoEpiC和HT29细胞CD44高表达，而Caco2几乎不表达。RAW 264.7细胞在脂多糖(LPS)和干扰素-γ(IFN-γ)诱导下呈现M1巨噬细胞标志物CD80或CD86，处于激活状态(图14b)。进一步获得了在巨噬细胞激活后CD44水平升高的现象(图14c)。
在CD44高表达的细胞HT29，HcoEpiC细胞中，透明质酸纳米水凝胶的胞内吞增强，且通过CD44介导实现的。而在低表达细胞Caco2中内吞无明显变化(图15a)。在炎症部位，激活的Raw264.7由高表达CD44受体介导了联硒透明质酸纳米水凝胶的内吞(图15b)。
试验例7：联硒透明质酸纳米水凝胶CD44 ROS清除
1、H2O2清除(非生物实验)
将实施例1中制备好的不同浓度(0.01、0.1、0.5、1、5、10mg/mL)的联硒透明质酸纳米水凝胶与不同浓度的1000μM，100μM的H2O2水溶液孵育1小时，后通过过氧化氢试剂盒检测H2O2浓度。
2、ROS清除(生物实验)
(1)将Raw264.7与HT29细胞以5000-8000个/孔接种至96孔板中，培养12小时后，加入含有实施例1、3中制备的联硒透明质酸纳米水凝胶与透明质酸纳米水凝胶(50μg/mL)培养基，24小时后，加入10mg/mL脂多糖(LPS)和100μM H2O2处理1小时，消化细胞，通过DCFH-DA荧光探针检测胞内ROS含量。
3、细胞保护
(3)将HT29细胞与Raw264.7细胞以每孔5000个细胞密度接种于96孔板中，培养12小时后，每孔加入含100μM H2O2和100μg/mL实施例1中的透明质酸纳米水凝胶处理12小时，CCK-8检测细胞活力。
通过不同浓度的联硒透明质酸纳米水凝胶在不同浓度的H2O2水溶液均可以清除一定浓度的H2O2，随着联硒透明质酸纳米水凝胶的升高，清除能力增强(图16)。
图17结果表明联硒透明质酸纳米水凝胶可显著降低LPS与H2O2引发的胞内ROS的产生。
图18结果表明联硒透明质酸纳米水凝胶表现出对过氧化氢引发HT29和Raw264.7细胞损伤的保护作用，而不含联硒键的却未呈现保护作用。
试验例8：抗氧化机制
1、调控Nrf2/HO-1通路
将Raw264.7细胞以1×105密度铺于6孔板，加入100μg/mL实施例1的联硒透明质酸纳米水凝胶和实施例3透明质酸纳米水凝胶处理12小时后，细胞加入或不加入50ng/mL LPS刺激孵育6小时。按照核蛋白提取北京索莱宝科技有限公司说明书提取胞质蛋白及核蛋白质，而细胞总蛋白由含有1％PMSF的RAPI缓冲液在4℃条件下提取，12000rpm离心10分钟，转移上清样本。所有样品的浓度按BCA检测试剂盒)美国Thermo说明书测定，然后进行免疫印迹分析。
2、抗氧化指标调控
将Raw264.7细胞以1×105密度铺于6孔板，12小时后，细胞加入6.25、25、100μg/mL透明质酸纳米水凝胶和联硒透明质酸纳米水凝胶，培养箱孵育6小时。根据SOD、CAT、GSH与GST产品北京索莱宝科技有限公司说明书检测Raw264.7胞内抗氧化指标变化。
3、炎症因子调控
将Raw264.7细胞以1×105密度铺于6孔板，12小时后，细胞中加入0、6.25、12.5、25、50、100μg/mL透明质酸纳米水凝胶或联硒透明质酸纳米水凝胶处理12小时后，使用50ng/mL LPS刺激培养6小时。收集培养基上清，根据美国eBioscience说明书步骤检测IL-6和TNF-α含量。
如图19所示，无论是否有LPS刺激，联硒键透明质酸纳米水凝胶均可以显著上调Raw细胞核中Nrf2的表达，同时上调胞内下游信号分子HO-1的表达水平。在LPS刺激细胞模型中，联硒键透明质酸纳米水凝胶还可以降低胞质内Nrf2的表达量，下调细胞整体iNOS表达水平。而单纯透明质酸纳米水凝胶未在Nrf2/HO-1通路中表现出调节作用。
图20结果显示联硒透明质酸纳米水凝胶处理后的细胞，在25μg/mL剂量下，通过Nrf2调节的重要抗氧化酶-超氧化物歧化酶SOD活性出现显著增加。而其他在抗氧化防御中起重要作用的抗氧化酶-过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽转移酶(GST)在100μg/mL联硒透明质酸纳米水凝胶处理后活性均明显升高，以上抗氧化酶的升高可进一步清除ROS，从而进行氧化还原调节。
图21结果显示即使在低浓度25μg/mL的情况下，与透明质酸纳米水凝胶处理组相比，联硒透明质酸纳米水凝胶也显著降低了LPS诱导分泌的IL-6和TNF-α。
试验例9：炎症结肠组织的分布
1、小鼠葡聚糖硫酸钠急性结肠炎模型的构建
体重20-22g的雄性BABL/c小鼠，适应性喂养7天，室温25℃，暗光循环12小时，自由进食饮水。第8天开始，根据实验需求随机分组，结肠炎组由3％DSS水代替正常饮水，连续喂养7天，建立急性结肠炎模型，对照组给予正常饮水。
2、联硒透明质酸纳米水凝胶在体结肠组织分布
提前6天建立葡聚糖硫酸钠急性结肠炎模型3只，于第7天同3只健康小鼠一同禁食24小时。灌胃给予2mg/mL的实施例2中联硒透明质酸纳米水凝胶-cy5.5体系，8小时后，脱颈处死小鼠，解剖结肠器官，PBS清洗2遍肠腔，通过小动物成像检测cy5.5荧光信号。取结肠组织，用4％多聚甲醛固定结肠器官12小时后，OTC包埋过夜，使用冷冻切片机切厚度为10μm的肠环切片。切片室温放置过夜，然后用含4％Triton-X 100的PBS溶液通透10分钟，山羊血清封闭2小时，后使用含10％山羊血清和5％BSA的一抗PBS溶液，4℃条件下，湿盒过夜孵育切片。次日早上，PBS清洗3次，使用含10％山羊血清和5％BSA的山羊抗兔IgG荧光二抗PBS溶液，在室温条件下，湿盒孵育1小时，后PBS清洗3次。最后用Hochest 33342PBS溶液对切片胞核染色10分钟，然后滴加抗荧光淬灭剂，盖玻片封片，用激光共聚焦荧光显微镜观察并拍照，Hochest激光通道：405nm，FITC激光通道：488nm，cy5.5激光通道：633nm。
与正常小鼠相比，联硒透明质酸纳米水凝胶-cy5.5纳米体系在结肠炎模型小鼠结肠组织中，表现出更强的荧光聚集(图22a)。通过激光共聚焦扫描显微镜观察结肠组织切片，我们同样发现结肠炎模型组结肠上皮cy5.5的荧光信号强度增强，同时也发现cy5.5信号与CD44+的上皮细胞共定位的现象(图22b)。这些结果表明，与正常结肠组织相比联硒透明质酸纳米水凝胶可以在小鼠结肠炎模型的结肠组织中表现更多的积累与渗透，且与炎症状态下CD44表达升高有关。
试验例10：联硒透明质酸纳米水凝胶对葡聚糖硫酸钠诱导溃疡性结肠炎治疗
本试验例提供实施例1、3制备的联硒透明质酸纳米水凝胶与透明质酸纳米水凝胶对小鼠葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎的治疗效果。
包括如下步骤：
1、动物实验
(1)将20只老鼠分为四组，适应性喂养7天后，实验组开始给予3％(w/v)DSS(36000-50000Da)水(含3％葡聚糖硫酸钠的水)，对照组给予普通饮用水即可。
(2)连续给药7天3％DSS水，同时每天给予实施例1、3所制备的两种透明质酸纳米水凝胶50mg/kg，每天记录其体重变化与疾病指数(DAI)变化。
疾病指数(DAI)＝(粪便硬度+便血情况)/2
粪便硬度(0：硬便，2：软便，4：腹泻)；
便血情况(0：阴性，2；隐血，4；便血)。
(3)于第8天处死老鼠，将盲结肠部位取出，测量结肠长度，取部分组织做HE染色。同时取200mg新鲜结肠组织用于活体ROS检测。剩余样品保存于-80℃，用于后续WesternBlot、氧化指标(MPO、MDA、SOD)和炎症因子(IL 6、IL-1β、TNF-α)检测。
2、结肠组织ROS含量检测
200mg新鲜组织在4℃的HBSS中清洗干净，以去除其内容物和黏液。将组织切成小块，滤掉多余的HBSS。取50mg结肠组织放入含有5mM EDTA的5mL 1640培养基中，37℃，200rpm振荡30分钟，剧烈震荡10秒。在该过程中，更换一次消化液。收集两次含结肠组织的消化液混合物，通过100mm尼龙网，其中主要包含结肠上皮细胞和上皮内淋巴细胞。分离消化液中的细胞，2000rpm离心10分钟，洗涤1次。利用ROS荧光探针DCFH-DA，通过流式细胞仪检测细胞内ROS含量。
3、结肠组织氧化指标含量检测
按照北京索莱宝科技有限公司说明书检测冻存结肠组织中MPO、MDA和SOD含量。
4、结肠组织Nrf2/HO-1检测
按照北京索莱宝科技有限公司说明书操作提取组织胞核蛋白质，组织总蛋白使用组织研磨仪提取，30mg结肠组织加入300μL含1％PMSF的RIPA缓冲液中，4℃，60Hz，1分钟/次，共研磨4次，然后12000rpm离心10分钟，转移上清样本，所有样品的浓度按BCA检测试剂盒说明书测定。
5、结肠组织Nrf2免疫组化
将各组4％多聚甲醛固定的结肠片段进行石蜡包埋，组织进行石蜡切片，脱蜡、修复、封闭等处理后，孵育Nrf2的单克隆抗体(1:50)2小时，随后DAB染色，脱水，封片，镜下观察拍照，观察Nrf2阳性区域所在位置。
6、结肠组织炎症因子含量检测
测定结肠组织中不同炎症因子的浓度，将50mg的结肠组织置于500μL含有1％PMSF的RAPI裂解液中，使用组织研磨仪研磨结肠组织，参数设置4℃，60Hz，1分钟/次，共研磨4次。取出研磨好的样品，12000rpm离心10分钟，收集上清用于Elisa分析。
图23表明联硒透明质酸纳米水凝胶可以显著保护有葡聚糖硫酸钠诱导肠炎导致的体重下降与疾病指数的升高(a-b)。改善了炎症导致的结肠长度变短(c-d)，通过HE染色可观察到联硒透明质酸纳米水凝胶缓解炎症，改善病变深度与范围，保护隐窝(f-g)。同时降低胞内ROS(e)，中性粒细胞浸润指标MPO(h)，组织过氧化损伤指标MDA(i)，增强体内O2-清除指标SOD(j)，更趋近于健康组。
联硒透明质酸纳米水凝胶处理组，组织细胞核内Nrf2含量增多并上调其下游信号分子HO-1，同时降低结肠组织总蛋白iNOS的表达(图24a)。而在图24b免疫组化染色切片可以观察到，联硒透明质酸纳米水凝胶的Nrf2棕色阳性区域主要与蓝色胞核染色重叠与PBS未经治疗组和透明质酸纳米水凝胶组对比明显(图24b)。同时降低葡聚糖硫酸钠诱导的促炎因子IL6、TNF-α、IL-1β的上调(图24c)。
试验例11：不同分子量联硒透明质酸纳米水凝胶治疗效果
本试验例中对照不同分子量联硒透明质酸纳米水凝胶治疗效果在葡聚糖硫酸钠诱导急性肠炎模型中的治疗效果。
使用实施例1和实施例4中制备的不同分子量的联硒透明质酸纳米水凝胶。将9只20-22g雄性Babl/c小鼠随机分为3组(n＝3)，每天给予3％DSS水，造急性肠炎模型，其中一组每天给予200μLPBS，其余两组肠炎模型组给予6kD联硒透明质酸纳米水凝胶(50mg/kg)、330kD(50mg/kg)，共7天。实验期间每天监测体重变化。第8天脱颈处死小鼠，切除盲肠结肠器官，测量结肠长度。
从图25可以看出，与6kD透明质酸纳米水凝胶相比，330kD的透明质酸纳米水凝胶呈现更好的治疗效果。该组小鼠治疗过程体重损失最小(a)，DAI炎症指数变化最少(b)，与未治疗PBS组相比，该组在抑制结肠缩短(c-d)与H&E组织学评分(e-f)中改善最为明显。
试验例12：联硒透明质酸纳米水凝胶与联硒小分子治疗效果对比
本试验例提供实施例1制备的联硒透明质酸纳米水凝胶与联硒小分子对小鼠葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎的治疗效果。
包括如下步骤：
1、动物实验
(1)将9只老鼠分为三组，适应性喂养7天后，实验组开始给予3％DSS水(36000-50000Da)，对照组给予普通饮用水即可。
(2)连续给药7天3％DSS水，同时一组每天给予实施例1透明质酸纳米水凝胶50mg/kg，另一组给予同等Se-Se剂量的硒代胱胺，每天记录其体重变化。
(3)于第8天处死老鼠，将盲结肠部位取出，测量结肠长度。
图26(a和b)结果显示，联硒小分子(硒代胱胺)并未在葡聚糖硫酸钠诱导肠炎鼠模型中(体重和结肠长度变化方面)，显现如联硒透明质酸纳米水凝胶一样的治疗效果。
试验例13：CD44中和抗体干预
为了验证联硒透明质酸纳米水凝胶在结肠炎组织中积累增加的治疗效果与HA-CD44相互作用有关，本试验例比较了体内中和CD44抗体后实施例1的治疗效果。在给药前6小时静脉注射给予100μg/小鼠剂量In vivo mAb抗小鼠/人CD44中和抗体。每天记录体重减轻和DAI变化后，第8天处死小鼠，评估结肠长度。
试验发现在葡聚糖硫酸钠诱导的急性结肠炎中，CD44中和抗体的使用减弱了联硒透明质酸纳米水凝胶的治疗效果，表现为体重减轻和结肠长度缩短(图27，a-c)，表明联硒透明质酸纳米水凝胶在结肠炎组织中的积累和治疗效果与HA-CD44介导的相互作用有关。
试验例14：联硒透明质酸纳米水凝胶对2,4,6-三硝基苯磺酸诱导溃疡性结肠炎治疗
据报道葡聚糖硫酸钠诱导的肠炎模型以体重减轻、带血腹泻、中性粒细胞浸润和上皮细胞丢失为特征，适合模拟人类溃疡性结肠炎(UC)，而2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的以持续性固有层纤维化为特征的结肠炎更类似于克隆恩病(CD)。本试验例中我们还评估了联硒透明质酸纳米水凝胶在2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的结肠炎模型中的疗效。
1、动物实验
Babl/c小鼠12小鼠饥饿处理后，用医用级聚氨酯导管将2,4,6-三硝基苯磺酸分散于乙醇，形成2.5％2,4,6-三硝基苯磺酸含量的50％乙醇溶液注入异氟醚麻醉小鼠体内80μL。肠内喂养距离肛缘约为4cm，为避免回流，小鼠保持头朝下的姿势30秒。第1天体重减轻的结肠炎小鼠按平均体重减轻分为3组(n＝5)，每天用200μLPBS、实施例3的透明质酸纳米水凝胶(50mg/kg)和实施例1的联硒透明质酸纳米水凝胶(50mg/kg)处理，连续4天，健康小鼠注射和口服PBS作为对照组。每天监测体重。第5天处死所有小鼠后，按试验例10收集结肠组织。
图28结果可见，造模成功后，结肠炎小鼠经2,4,6-三硝基苯磺酸治疗后体重显著迅速恶化。只有联硒透明质酸纳米水凝胶在第4天时恢复了减轻的体重(a)，实验最终与模型组相比增加了结肠长度(b-c)。在代表性组织学图像中表现出较弱的溃疡和隐窝损伤(d-e)。联硒透明质酸纳米水凝胶显著降低了结肠ROS水平(f)。此外，与PBS组和透明质酸纳米水凝胶组相比，结肠炎小鼠经联硒透明质酸纳米水凝胶治疗后，结肠中MPO、MDA、TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著降低，SOD活性升高(g-l)。
本发明联硒透明质酸纳米水凝胶清除ROS作用机理见图29。
综上，联硒透明质酸纳米水凝胶可以通过CD44受体介导靶向炎症组织，清除ROS和调节氧化应激来有效缓解急性结肠炎。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.联硒透明质酸水凝胶在制备用于治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用；
所述联硒透明质酸水凝胶的制备方法如下：所述联硒透明质酸水凝胶是采用交联方法制备得到的，以透明质酸为骨架结构、内部由联硒键连接的水凝胶材料；
制备方法I包括：将透明质酸酸化后，溶于DMSO中，用EDC和NHS活化，向活化体系中加入硒代胱胺，然后经透析、冻干处理后得到联硒透明质酸单体；将联硒透明质酸单体溶于水或PBS中，配制成浓度为1-100 mg/mL的溶液作为水相，与油相按比例混合，采用微流控、乳化法或自组装法制备得到油包水型联硒透明质酸水凝胶；或者，
制备方法II包括：将1-40 mg透明质酸、0.1-200 mg EDC、0.1-60mg NHS和0.1-168mg硒代胱胺溶于1-10mL水或PBS中，作为水相，然后与油相按比例混合进行乳化，然后通过离心、旋蒸得到油包水型联硒透明质酸水凝胶；
所述透明质酸的分子量为3-400 kD；
所述制备方法I中，硒代胱胺的氨基与透明质酸的羧基的摩尔比为1:2~10:1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述油相为含有30-200 mg/mL吐温80和30-200 mg/mL司盘80的有机溶剂；
所述有机溶剂选自正己烷、植物油、动物油、脂肪酸中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，水相与油相按1:8-1:2的体积比混合。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制备方法I中，透明质酸酸化方法包括：将透明质酸溶于一定量水中，置于透析袋中，将透析袋在0.001-0.1M HCl稀盐酸或冰醋酸中透析4-72小时。
CN202210794607.6A 2022-07-05 2022-07-05 联硒透明质酸水凝胶及其制备方法与应用 Active CN115300525B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210794607.6A CN115300525B (zh) 2022-07-05 2022-07-05 联硒透明质酸水凝胶及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210794607.6A CN115300525B (zh) 2022-07-05 2022-07-05 联硒透明质酸水凝胶及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115300525A CN115300525A (zh) 2022-11-08
CN115300525B true CN115300525B (zh) 2024-05-10

Family

ID=83857574

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210794607.6A Active CN115300525B (zh) 2022-07-05 2022-07-05 联硒透明质酸水凝胶及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115300525B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117180182B (zh) * 2023-09-05 2024-02-27 上海交通大学医学院附属新华医院 一种口服硒化纳米水凝胶制剂的制备方法和用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108578772A (zh) * 2018-05-23 2018-09-28 西南交通大学 一种用于提升生物相容性的血液接触材料制备方法及血液接触材料
KR20200017744A (ko) * 2018-08-09 2020-02-19 부산대학교 산학협력단 결합체 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 및 진단용 조성물
CN110885455A (zh) * 2019-12-05 2020-03-17 浙江大学 一种活性氧响应水凝胶的制备及应用
CN114099696A (zh) * 2021-11-13 2022-03-01 广东暨创硒源纳米研究院有限公司 纳米硒海藻酸钠复合凝胶及制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11974982B2 (en) * 2020-04-03 2024-05-07 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Stimulus-responsive antioxidant crystals and method for their preparation

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108578772A (zh) * 2018-05-23 2018-09-28 西南交通大学 一种用于提升生物相容性的血液接触材料制备方法及血液接触材料
KR20200017744A (ko) * 2018-08-09 2020-02-19 부산대학교 산학협력단 결합체 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 및 진단용 조성물
CN110885455A (zh) * 2019-12-05 2020-03-17 浙江大学 一种活性氧响应水凝胶的制备及应用
CN114099696A (zh) * 2021-11-13 2022-03-01 广东暨创硒源纳米研究院有限公司 纳米硒海藻酸钠复合凝胶及制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
双硒键交联的双重氧化还原响应型纳米水凝胶用于肿瘤治疗的研究;王美方;中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑(第08期);第E072-54页，尤其是摘要，第17-24页，第27-34页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115300525A (zh) 2022-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nguyen et al. Highly retina-permeating and long-acting resveratrol/metformin nanotherapeutics for enhanced treatment of macular degeneration
Zhang et al. A smart cauliflower-like carrier for astaxanthin delivery to relieve colon inflammation
Chen et al. Orally deliverable sequence-targeted astaxanthin nanoparticles for colitis alleviation
Rajan et al. Formation and characterization of chitosan-polylacticacid-polyethylene glycol-gelatin nanoparticles: A novel biosystem for controlled drug delivery
Zamani et al. Antioxidant and anti-cancer activity of Dunaliella salina extract and oral drug delivery potential via nano-based formulations of gum Arabic coated magnetite nanoparticles
Kou et al. Opsonized nanoparticles target and regulate macrophage polarization for osteoarthritis therapy: A trapping strategy
Qi et al. pH/ROS dual-sensitive natural polysaccharide nanoparticles enhance “one stone four birds” effect of rhein on ulcerative colitis
Faramarzi et al. Synthesis and in vitro evaluation of tamoxifen-loaded gelatin as effective nanocomplex in drug delivery systems
CN115300525B (zh) 联硒透明质酸水凝胶及其制备方法与应用
Zhao et al. Improving drug utilization platform with injectable mucoadhesive hydrogel for treating ulcerative colitis
Li et al. Temperature-and pH-responsive injectable chitosan hydrogels loaded with doxorubicin and curcumin as long-lasting release platforms for the treatment of solid tumors
Wei et al. Bioprocess of uniform-sized crosslinked chitosan microspheres in rats following oral administration
Sun et al. Bio-adhesive and ROS-scavenging hydrogel microspheres for targeted ulcerative colitis therapy
Bhattacharya et al. Physicochemical characterization, in vitro and in vivo evaluation of chitosan/carrageenan encumbered with Imatinib mesylate-polysarcosine nanoparticles for sustained drug release and enhanced colorectal cancer targeted therapy
Wang et al. Research progress of colon-targeted oral hydrogel system based on natural polysaccharides
Shakouri et al. Nanoencapsulation of Hirudo medicinalis proteins in liposomes as a nanocarrier for inhibiting angiogenesis through targeting VEGFA in the Breast cancer cell line (MCF-7)
Zhang et al. Surface-anchored microbial enzyme-responsive solid lipid nanoparticles enabling colonic budesonide release for ulcerative colitis treatment
Moise et al. Double crosslinked chitosan and gelatin submicronic capsules entrapping aminoacid derivatives with potential antitumoral activity
Zeeshan et al. Dual pH and microbial-sensitive galactosylated polymeric nanocargoes for multi-level targeting to combat ulcerative colitis
Zhao et al. Visual foodborne nanoparticles for oral site-specific delivery of anthocyanins in the treatment of inflammatory bowel disease
CN109078184A (zh) 负载双药纳米颗粒及其制备方法与应用
Mohammadi et al. pH-sensitive polyacrylic acid/Fe3O4@ SiO2 hydrogel nanocomposite modified with agarose for controlled release of quercetin
CN115089561B (zh) 一种细胞膜包被的前药纳米粒、制备方法及应用
Peng et al. Efficacy of a novel glioma therapy based on ferroptosis induced by layered double hydroxide loaded with simvastatin
Jain et al. Development and characterization of nanolipobeads-based dual drug delivery system for H. pylori targeting

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant