CN110157733A - 重组mIL-22BP载体、脂质体复合物及其制备方法和用途 - Google Patents

重组mIL-22BP载体、脂质体复合物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于肿瘤基因治疗领域，具体涉及一种重组鼠源mIL‑22BP载体及其脂质体复合物的制备方法和用途。针对目前还未见有鼠源IL‑22BP基因的脂质体复合物相关报道的问题，本发明提供了一种重组鼠源IL‑22BP载体及其脂质体复合物，该载体含有编码小鼠IL‑22BP蛋白的基因，能在真核细胞中表达小鼠IL‑22BP蛋白，其与阳离子脂质体组成复合物，能够很好的抗结肠癌肿瘤组织生长，具有抗肿瘤生长的作用，能够用于制备诊断或治疗抗肿瘤的药物，为肿瘤的治疗提供了一种新的选择。

Description

重组mIL-22BP载体、脂质体复合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于肿瘤基因治疗领域，具体涉及一种重组mIL-22BP载体及其脂质体复合物，以及它们的制备方法和用途。
背景技术
基因治疗是肿瘤生物治疗的重要手段之一，多个基因治疗产品已在肿瘤的临床治疗中发挥作用。作为基因治疗药物的重要组成部分，用于肿瘤治疗的治疗性基因通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡以及调控抗肿瘤免疫等机制，实现抗肿瘤治疗效果。进一步寻找和开发具有良好治疗作用的基因是肿瘤基因治疗仍需解决的重要课题。
白细胞介素是公认的固有免疫及适应免疫相关疾病最重要的调节因子之一。白细胞介素-22(Interleukin-22,IL-22)主要由适应性免疫细胞(CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞等)和固有免疫细胞(LTi细胞、NK细胞等)分泌，属于IL-10细胞因子家族成员。自从2000年IL-22被发现以来，已被证实在众多组织的内皮细胞中发挥包括抗炎和免疫调节在内的重要作用。IL-22一方面可促进组织的增殖和再生以及调节宿主的黏膜屏障防御，另一方面也可能引起组织病理性的炎症反应。作为肿瘤微环境中的炎性细胞因子之一，IL-22在包括结肠癌、肝癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、口腔鳞状细胞癌、皮肤恶性肿瘤等恶性肿瘤的发生、发展、增殖、凋亡以及侵袭转移中发挥着重要作用。研究发现，IL-22及其跨膜受体IL-22R1在结肠癌组织中高表达，且表达量与肿瘤体积大小呈正相关；IL-22/IL-22R1可通过激活STAT3信号通路抑制肿瘤细胞的凋亡并促进肿瘤的生长和转移。此外，IL-22还能通过固有淋巴细胞的表达促进结肠癌的发生发展。因此，IL-22是肿瘤治疗的重要分子靶点之一。
IL-22结合蛋白(IL-22binding protein,IL-22BP)是IL-22除IL-22R1外的另一受体(IL-22R2)。该受体以可溶性蛋白的方式存在于细胞外，能与IL-22R1竞争性结合游离的IL-22因子，并阻断IL-22的相关生物学活性，从而阻止细胞因子下游的信号传导，是IL-22的可溶性拮抗剂。由于IL-22BP与IL-22的结合有高特异性和高亲和性,故IL-22BP在体内可以有效调节IL-22的生物活性。此外，IL-22BP在体内的表达与IL-22/IL-22R1功能呈高度相关性，当后者功能失衡时会大量表达，以起到控制和平衡作用。因此，IL-22BP在调节IL-22诱导的炎症和免疫反应方面具有重要作用。由于IL-22/IL-22R1可通过激活STAT3信号通路等方式抑制肿瘤细胞的凋亡并促进肿瘤的发生、生长和转移，促进恶性肿瘤的发生和发展。因此，通过促使肿瘤细胞对可溶性IL-22BP受体的分泌表达，提高对胞外游离IL-22因子的中和作用，阻断或减少IL-22与肿瘤细胞膜上的IL-22R1跨膜受体结合，进而弱化肿瘤细胞受IL-22调控的生长增殖信号，可实现对肿瘤细胞增殖的阻碍作用，达到治疗肿瘤的效果。
脂质体是一种定向药物非病毒载体，属于靶向给药系统的一种新剂型。利用其独有的特性，它可以将毒副作用大、在血液中稳定性差、降解快的药物包埋在直径为纳米级的脂质体微粒中，这种微粒具有类细胞结构，可以透过人体病灶部位血管内皮细胞间隙到达病灶部位，并改变被包封药物的体内分布，使药物在目标组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性，以达到定向给药的目的。
阳离子脂质体是一种经典的非病毒基因递送系统，具有低毒、高效和生物相容性高的多种特点，已被应用于多种治疗基因的体内外传递中。但目前还未见有鼠源IL-22BP基因的脂质体复合物相关报道。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供了一种重组mIL-22BP载体，该载体含有能表达鼠IL-22BP的编码基因。
进一步的，上述重组mIL-22BP载体为质粒载体。
更进一步的，所述质粒载体为pVAX1。
本发明选择pVAX1质粒载体的原因是：1)适合目的基因在真核生物细胞中表达；2)携带的卡那霉素抗性标签可避氨苄青霉素对机体产生的过敏反应；具有较高的目的基因表达效率。
进一步的，上述重组mIL-22BP载体中，所述鼠IL-22BP的编码核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
SEQ ID No.1鼠IL-22BP的编码核苷酸序列
ATGATGCCTAAGCATTGCCTTCTAGGTCTCCTCATCATACTCTTGAGCAGTGCAACAGAAATACAACCAGCTCGTGTATCTCTGACGCCCCAGAAGGTCCGATTTCAGTCCAGAAATTTCCACAATATTTTGCACTGGCAAGCAGGGAGCTCTCTCCCCAGCAACAACAGCATCTACTTTGTGCAGTACAAGATGTATGGACAGAGCCAATGGGAAGATAAAGTTGACTGCTGGGGGACCACGGCGCTCTTCTGTGACCTGACCAATGAAACCTTAGACCCATACGAGCTGTATTACGGGAGGGTGATGACGGCCTGTGCTGGACGCCACTCTGCCTGGACCAGGACACCCCGCTTCACTCCATGGTGGGAAACAAAACTAGATCCTCCGGTCGTGACTATAACCCGAGTTAACGCATCTTTGCGGGTGCTTCTCCGTCCTCCAGAGTTGCCAAATAGAAACCAAAGTGGAAAAAATGCATCCATGGAAACTTACTACGGCTTAGTATACAGAGTTTTCACAATCAACAATTCACTAGAGAAGGAGCAAAAAGCCTATGAAGGAACTCAGAGAGCTGTTGAAATTGAAGGTCTGATACCTCATTCCAGCTACTGCGTAGTGGCTGAAATGTACCAGCCCATGTTTGACAGAAGAAGCCCAAGAAGCAAGGAGAGATGTGTGCACATTCCATGA。
进一步的，上述重组mIL-22BP载体中，所述鼠IL-22BP编码基因的5’端包含一段信号肽编码基因，所述信号肽基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.2信号肽的核苷酸序列
ATGATGCCTAAGCATTGCCTTCTAGGTCTCCTCATCATACTCTTGAGCAGTGCAACAGAA。
进一步的，上述重组mIL-22BP载体的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
SEQ ID No.3pVAX1-mIL-22BP载体的核苷酸序列
AAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGCCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAGCACGTGCTATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGTATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGAAATTGTAAGCGTTAATAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCTCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCTTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGAGCTTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCGAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGGTTCGCTTGCTGTCCATAAAACCGCCCAGTAGAAGCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCCCAATCCTCCCCCTTGCTGTCCTGCCCCACCCCACCCCCCAGAATAGAATGACACCTACTCAGACAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCACCTTCCAGGGTCAAGGAAGGCACGGGGGAGGGGCAAACAACAGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGCTGATCAGCGGGTTTAAACGGGCCCTCTAGaTCATGGAATGTGCACACATCTCTCCTTGCTTCTTGGGCTTCTTCTGTCAAACATGGGCTGGTACATTTCAGCCACTACGCAGTAGCTGGAATGAGGTATCAGACCTTCAATTTCAACAGCTCTCTGAGTTCCTTCATAGGCTTTTTGCTCCTTCTCTAGTGAATTGTTGATTGTGAAAACTCTGTATACTAAGCCGTAGTAAGTTTCCATGGATGCATTTTTTCCACTTTGGTTTCTATTTGGCAACTCTGGAGGACGGAGAAGCACCCGCAAAGATGCGTTAACTCGGGTTATAGTCACGACCGGAGGATCTAGTTTTGTTTCCCACCATGGAGTGAAGCGGGGTGTCCTGGTCCAGGCAGAGTGGCGTCCAGCACAGGCCGTCATCACCCTCCCGTAATACAGCTCGTATGGGTCTAAGGTTTCATTGGTCAGGTCACAGAAGAGCGCCGTGGTCCCCCAGCAGTCAACTTTATCTTCCCATTGGCTCTGTCCATACATCTTGTACTGCACAAAGTAGATGCTGTTGTTGCTGGGGAGAGAGCTCCCTGCTTGCCAGTGCAAAATATTGTGGAAATTTCTGGACTGAAATCGGACCTTCTGGGGCGTCAGAGATACACGAGCTGGTTGTATTTCTGTTGCACTGCTCAAGAGTATGATGAGGAGACCTAGAAGGCAATGCTTAGGCATCATaagctTAAGTTTAAACGCTAGCCAGCTTGGGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGATAAGCCAGTAAGCAGTGGGTTCTCTAGTTAGCCAGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCACCGTACACGCCTACCGCCCATTTGCGTCAATGGGGCGGAGTTGTTACGACATTTTGGAAAGTCCCGTTGATTTTGGTGCCAAAACAAACTCCCATTGACGTCAATGGGGTGGAGACTTGGAAATCCCCGTGAGTCAAACCGCTATCCACGCCCATTGATGTACTGCCAAAACCGCATCACCATGGTAATAGCGATGACTAATACGTAGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTCCCATAAGGTCATGTACTGGGCATAATGCCAGGCGGGCCATTTACCGTCATTGACGTCAATAGGGGGCGTACTTGGCATATGATACACTTGATGTACTGCCAAGTGGGCAGTTTACCGTAAATAGTCCACCCATTGACGTCAATGGAAAGTCCCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGGGCGGGGGTCGTTGGGCGGTCAGCCAGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTCAATAATCAATGTCAACGCGTATATCTGGCCCGTACATCGCGAAGAGTC。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种制备上述重组mIL-22BP载体的方法，包括以下步骤：
a、分别设计并合成能表达SEQ ID NO.1所示的鼠IL-22BP基因序列的表达框架序列；
b、将步骤a所得表达框架序列转入目标表达载体，使表达框架序列由启动子操作表达，扩增筛选即得。
本发明要解决的第三个技术问题为：提供一种含有上述重组mIL-22BP载体的脂质体复合物。
其中，上述重组mIL-22BP载体脂质体复合物中，所述重组mIL-22BP载体与脂质体的质量比的范围为1︰1～10。
其中，上述重组mIL-22BP载体脂质体复合物中，所述脂质体为由摩尔比为1︰1的DOTAP和胆固醇组成。基于该比例制备的脂质体具有较高的稳定性。
本发明要解决的第四个技术问题是提供一种上述重组mIL-22BP载体脂质体复合物的制备方法，包括以下步骤：
a、将DOTAP与胆固醇Chol按1:︰1的摩尔比进行混合，制成DOTAP/Chol阳离子脂质体混悬液；
b、将重组mIL-22BP载体包裹到DOTAP/Chol阳离子脂质体中形成表达载体-阳离子脂质体复合物，将该复合物稀释在葡萄糖溶液中，并调整使得葡萄糖浓度为5％并混合均匀，即得。
本发明要解决的第五个技术问题是提供了一种上述重组mIL-22BP载体、脂质体复合物在制备抗肿瘤药物中的用途。进一步的，所述的肿瘤为结肠癌。
本发明首次提出了应用基于mIL-22基因和脂质体导入系统的组合来实现治疗结肠癌的创新想法，为结肠癌的基因治疗提供了新的策略和基础。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种重组mIL-22BP载体，将核苷酸序列为SEQ ID No.1的mIL-22BP基因插入真核表达载体pVAX1的多克隆位点中构建得到，重组mIL-22BP载体的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。本发明的重组载体能够在真核细胞中表达IL-22结合蛋白，可用于制备抗肿瘤的药物，尤其是用于制备诊断或治疗结肠癌的药物，肿瘤抑制率约58.67％。
本发明还提供了一种脂质体/mIL-22BP复合物，通过对可溶性IL-22BP受体的分泌表达，提高对胞外IL-22配体分子的中和作用，阻断或减少IL-22与肿瘤细胞膜上的IL-22R1跨膜受体结合，进而弱化肿瘤细胞受IL-22调控的生长增殖信号，实现对肿瘤细胞增殖的阻碍作用，达到治疗肿瘤的效果。
附图说明
图1为pVAX1质粒载体结构图；
图2为pVAX1-mIL-22BP质粒结构示意图；
图3为pVAX1-mIL-22BP质粒用HindIII和XbaI双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中:M表示DNAMarker，1表示pVAX1-mIL-22BP质粒；2表示pVAX1-mIL-22BP的双酶切结果；
图4为动物腹腔治疗效果图；
图5为各组腹水体积统计结果图；
图6为各组肿瘤重量统计结果图。
具体实施方式
下面结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1 mIL-22BP基因表达质粒的构建
1.mIL-22BP基因的获得
1)依据美国国立生物技术信息中心NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)数据库中mIL-22BP基因(Gene ID:237310，NM_178258)的编码序列(序列如SEQ ID NO.1所示)，合成含有全长mIL-22BP基因序列的cDNA质粒。
2)设计并合成相应的引物
上游引物：5’-GGGAAAGCTTATGATGCCTAAGCATTGCCTTCTAGG-3’，(SEQ ID NO.4)
设计引入了Hind III酶切位点；
下游引物5’-GGGATCTAGATCATGGAATGTGCACACATCTCTCC-3’，(SEQ ID NO.5)
设计引入了Xbal I酶切位点，通过PCR扩增得到mIL-22BP的DNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收该片段，得到mIL-22BP基因片段。
2.pVAX1-mIL-22BP质粒的克隆构建
1)使用Hind III和Xbal I限制性内切酶，在37°下双酶切真核表达载体pVAX1，琼脂糖凝胶电泳回收相应大小的线性化的pVAX1载体片段，与用相同条件酶切处理并胶回收的mIL-22BP基因片段于37℃水浴进行连接反应2小时，连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞并涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上。24小时后挑提取克隆，置于3mL含有卡那霉素的LB培养基中摇菌培养过夜，次日提取pVAX1-mIL-22BP质粒重组质粒。
2)使用序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的引物，对pVAX1-mIL-22BP质粒进行PCR鉴定，PCR产物电泳结果见图3，结果表明连接成功。所构建的pVAX1-mIL-22BP载体全长3618bp，全序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2重组mIL-22BP载体脂质体复合物的制备
1、DOTAP-Chol阳离子脂质体的制备
将阳离子脂质DOTAP与胆固醇(Chol)按1︰1的摩尔比进行混合，并将混合物用氯仿进行溶解，并置于旋转蒸发仪上以60℃旋蒸120min后成膜。所成的膜取出后溶解于5％的葡萄糖溶液中，然后在60℃水浴条件下震荡20min，混合物在0℃下经400w超声破碎10min，得到5mg/ml的阳离子脂质体混悬液。
2、制备mIL-22BP基因表达质粒
将pVAX1-mIL-22BP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上。24小时后挑提取克隆，置于3mL含有卡那霉素的LB培养基中摇菌培养过夜，次日提取pVAX1-mIL-22BP质粒重组质粒。经过检测所纯化的质粒能够符合体内外实验的要求。
3、IL-22BP质粒DNA/阳离子脂质体复合物的制备
将质粒pVAX1-mIL-22BP按一定比例稀释，再按脂质体:DNA以3︰1(W/W)的比例将脂质体溶液加入到pVAX1-mIL-22BP溶液中，之后立刻用移液枪吹打混匀，再在室温环境下孵育15分钟，即得本发明阳离子脂质体质粒DNA复合物。
实施例3重组mIL-22BP载体脂质体复合物抗肿瘤试验
为了研究pVAX1-mIL-22BP质粒阳离子脂质体复合物在体内的抗肿瘤效应，在Balb/C小鼠(6-8周龄，雌性)腹腔建立了小鼠结肠癌腹腔转移瘤模型，简言之，将体外培养的CT26小鼠结肠癌细胞用胰蛋白酶消化，并定容在无血清、无抗生素的1640培养基中，在每只小鼠的腹腔内接种2.5×105个细胞，细胞接种3天后，开始按以下进行随机分组治疗(每组5只)；
A)空白对照组：5％的葡萄糖溶液；
B)单纯阳离子脂质体组；
C)pVAX1-mIL-22BP治疗组:阳离子脂质体/pVAX1-mIL-22BP复合物置于5％的葡萄糖溶液中。
采取腹腔注射方式进行治疗，质粒DNA阳离子脂质体复合物配比如下:质粒DNA(5μg):阳离子脂质体(15μg)＝3:1(W/W)，并将质粒DNA阳离子脂质体复合物稀释在葡萄糖溶液中，并调整使得葡萄糖终浓度为5％。每次注射体积为200μL，每天治疗，共治疗7次。治疗结束后第3天将动物处死并解剖(见图4)，收集腹腔内的肿瘤组织并进行称重，收集腹腔内的腹水并测量体积。肿瘤生长抑制用方差分析，P<0.05则认为有统计学意义。
从以上各组动物的腹水体积(见图5)、肿瘤重量(见图6)的情况分析发现，pVAX1-mIL-22BP质粒阳离子脂质体复合物治疗组肿瘤生长缓慢，而对照组肿瘤生长较快，故pVAX1-mIL-22BP质粒阳离子脂质体复合物表现出极强的抑制肿瘤生长的作用，与对照组相比抑瘤率达到58.67％。由此结果可以看出，pVAX1-mIL-22BP质粒阳离子脂质体复合物具有较强的抗小鼠结肠癌的作用。
综上可知：本发明通过构建能表达鼠IL-22BP的编码基因的重组mIL-22BP载体，并制备了该载体与脂质体的复合物，能够抑制结肠癌细胞的生长，具有显著的抑癌效果，本发明为结肠癌的基因治疗提供了新的策略和基础。
序列表
<110> 四川大学
<120> 重组mIL-22BP载体、脂质体复合物及其制备方法和用途
<130> A180093K
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgatgccta agcattgcct tctaggtctc ctcatcatac tcttgagcag tgcaacagaa 60
atacaaccag ctcgtgtatc tctgacgccc cagaaggtcc gatttcagtc cagaaatttc 120
cacaatattt tgcactggca agcagggagc tctctcccca gcaacaacag catctacttt 180
gtgcagtaca agatgtatgg acagagccaa tgggaagata aagttgactg ctgggggacc 240
acggcgctct tctgtgacct gaccaatgaa accttagacc catacgagct gtattacggg 300
agggtgatga cggcctgtgc tggacgccac tctgcctgga ccaggacacc ccgcttcact 360
ccatggtggg aaacaaaact agatcctccg gtcgtgacta taacccgagt taacgcatct 420
ttgcgggtgc ttctccgtcc tccagagttg ccaaatagaa accaaagtgg aaaaaatgca 480
tccatggaaa cttactacgg cttagtatac agagttttca caatcaacaa ttcactagag 540
aaggagcaaa aagcctatga aggaactcag agagctgttg aaattgaagg tctgatacct 600
cattccagct actgcgtagt ggctgaaatg taccagccca tgtttgacag aagaagccca 660
agaagcaagg agagatgtgt gcacattcca tga 693
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgatgccta agcattgcct tctaggtctc ctcatcatac tcttgagcag tgcaacagaa 60
<210> 3
<211> 3618
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag cccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 60
gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 120
aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 180
gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 240
ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 300
cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 360
ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 420
actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 480
tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 540
gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 600
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ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 780
tttagcacgt gctattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 840
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 900
ccacctgtat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcagga 960
aattgtaagc gttaataatt cagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct 1020
gcgaatcggg agcggcgata ccgtaaagca cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa 1080
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gagaacctgc gtgcaatcca tcttgttcaa tcatgcgaaa cgatcctcat cctgtctctt 1800
gatcagagct tgatcccctg cgccatcaga tccttggcgg cgagaaagcc atccagttta 1860
ctttgcaggg cttcccaacc ttaccagagg gcgccccagc tggcaattcc ggttcgcttg 1920
ctgtccataa aaccgcccag tagaagccat agagcccacc gcatccccag catgcctgct 1980
attgtcttcc caatcctccc ccttgctgtc ctgccccacc ccacccccca gaatagaatg 2040
acacctactc agacaatgcg atgcaatttc ctcattttat taggaaagga cagtgggagt 2100
ggcaccttcc agggtcaagg aaggcacggg ggaggggcaa acaacagatg gctggcaact 2160
agaaggcaca gtcgaggctg atcagcgggt ttaaacgggc cctctagatc atggaatgtg 2220
cacacatctc tccttgcttc ttgggcttct tctgtcaaac atgggctggt acatttcagc 2280
cactacgcag tagctggaat gaggtatcag accttcaatt tcaacagctc tctgagttcc 2340
ttcataggct ttttgctcct tctctagtga attgttgatt gtgaaaactc tgtatactaa 2400
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aggacggaga agcacccgca aagatgcgtt aactcgggtt atagtcacga ccggaggatc 2520
tagttttgtt tcccaccatg gagtgaagcg gggtgtcctg gtccaggcag agtggcgtcc 2580
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caggtcacag aagagcgccg tggtccccca gcagtcaact ttatcttccc attggctctg 2700
tccatacatc ttgtactgca caaagtagat gctgttgttg ctggggagag agctccctgc 2760
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tagtgagtcg tattaatttc gataagccag taagcagtgg gttctctagt tagccagaga 3000
gctctgctta tatagacctc ccaccgtaca cgcctaccgc ccatttgcgt caatggggcg 3060
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggaaagctt atgatgccta agcattgcct tctagg 36
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggatctaga tcatggaatg tgcacacatc tctcc 35

Claims (12)

1.重组mIL-22BP载体，其特征在于：所述载体含有能表达鼠IL-22BP的编码基因。
2.根据权利要求1所述的重组mIL-22BP载体，其特征在于：所述重组mIL-22BP载体为质粒载体。
3.根据权利要求2所述的重组mIL-22BP载体，其特征在于：所述质粒载体为pVAX1。
4.根据权利要求1所述的重组mIL-22BP载体，其特征在于：所述鼠IL-22BP的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
5.根据权利要求1所述的重组mIL-22BP载体，其特征在于：所述重组mIL-22BP载体的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
6.制备权利要求1-5任一项所述的重组mIL-22BP载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、分别设计并合成能表达SEQ ID NO.1所示的鼠IL-22BP基因序列的表达框架序列；
b、将步骤a所得表达框架序列转入目标表达载体，使表达框架序列由启动子操作表达，扩增筛选即得。
7.含有权利要求1～5任一项所述的重组mIL-22BP载体的脂质体复合物。
8.根据权利要求7所述的重组mIL-22BP载体脂质体复合物，其特征在于：所述重组mIL-22BP载体与脂质体的质量比为1︰1～10。
9.根据权利要求8所述的重组mIL-22BP载体脂质体复合物，其特征在于：所述脂质体为由摩尔比为1︰1的DOTAP和胆固醇组成。
10.权利要求7～9任一项所述的重组mIL-22BP载体脂质体复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将DOTAP与胆固醇Chol按1︰1的摩尔比进行混合，制成DOTAP/Chol阳离子脂质体混悬液；
b、将重组mIL-22BP载体包裹到DOTAP/Chol阳离子脂质体中形成表达载体-阳离子脂质体复合物，将该复合物稀释在葡萄糖溶液中，并调整使得葡萄糖浓度为5％并混合均匀，即得。
11.权利要求1～5任一项所述的重组mIL-22BP载体、权利要求7～9任一项所述的重组mIL-22BP载体脂质体复合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：所述肿瘤为结肠癌。
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